KR20040012844A - 신체영역내의 표적 깊이, 휘도 및 크기의 결정 방법 및 장치 - Google Patents

신체영역내의 표적 깊이, 휘도 및 크기의 결정 방법 및 장치 Download PDF

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KR20040012844A
KR20040012844A KR10-2003-7014990A KR20037014990A KR20040012844A KR 20040012844 A KR20040012844 A KR 20040012844A KR 20037014990 A KR20037014990 A KR 20037014990A KR 20040012844 A KR20040012844 A KR 20040012844A
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라이스브래들리더블유.
스테안스다니엘지.
트로이타마라엘.
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제노젠 코퍼레이션
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Abstract

대상자에서의 발광원의 위치 및 크기를 조사하는 방법이 개시된다. 방법의 실행에서, 첫째로 광검출기 장치를 사용하여 제 1투시로부터 (i) 발광원으로부터 유래하고, (ii) 대상자의 혼탁한 생물학적 조직을 통하여 이동하고, (iii) 대상자의 관심있는 제 1 표면 영역으로부터 방출되는 광자를 측정함으로써 광 강도 프로파일을 얻는다. 광-강도 프로파일을 파라미터-기초한 생체광자 함수에 대응시켜 깊이 및 크기와 같은 함수 파라미터를 계산한다. 이렇게 결정된 파라미터를 제 1측정된 광 강도 프로파일이외의 데이터를 사용하여 세분하여 대상자내 발광원의 대략의 깊이 및 크기를 얻는다. 또한, 방법을 수행하기 위한 장치가 개시된다.

Description

신체영역내의 표적 깊이, 휘도 및 크기의 결정 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR DETERMINING TARGET DEPTH, BRIGHTNESS AND SIZE WITHIN A BODY REGION}
생물의학적 연구에서뿐만 아니라, 다양한 의학 진단 및 치료 환경에서, 대상자 신체 영역내의 표면하 표적 또는 구역을 영상화하는데 바람직하다. 예를 들어, 고형 종양의 일부 또는 전체, 심근 허혈 구역, 대상자에 투여된 치료 화합물의 분포, 또는 질병의 진행에 대한 비침습적 정위 및 영상은 유용한 연구 또는 진단 정보를 제공할 수도 있다. 이상적으로, 영상화 방법은 신체 영역내에서 관심있는 표적의 위치를 알아낼 수 있고, 신체 영역의 표면 아래 표적의 모양, 크기, 세포수, 및 깊이에 대한 정보를 제공할 수 있다. 그러나, 지금까지, 표면하 신체 표적 영상을 위해 사용되거나 및/또는 제안된 방법은 일반적으로 X선과 같은 이온화 방사선과, 자기 공명 영상(MRI)와 같은 비싸고 부피가 큰 장비, 또는 초음파를 사용하는 것들에 한정되었다.
X선은 우수한 조직 투과력을 가지며, 전산화 단층촬영술(CT) 또는 전산화 축단층촬영술(CAT)과 함께 사용될 때, 우수한 영상화질을 생성할 수 있다. 그러나, X-선은, X선에의 노출이 길어질 경우 잠재적으로 위험하기 때문에, 질병 진행을 모니터링하는데 제한된 용도를 갖는다. X-선은 신체 영역내의 표적에 위치하는 조성물의 위치를 찾아내고 영상화하는데 사용될 수 있지만, X-선 방사와 관련한 잠재적인 위험에 항상 노출되어 있다. 그러나, X-선은 생체내 유전자 산물의 발현을 영상화하고, 그 같은 유전자 산물을 발현하는 표적의 깊이 및/또는 모양을 결정하는데 용이하게 사용될 수 없다.
MRI는 또한 대상자의 신체 영역내의 표적, 구역 및 구조를 영상화하기 위한 우수한 방법이다. MRI는 이온화 방사선과 관련한 것들과 같은 위험한 성질을 갖는 것으로는 생각되지 않지만, MRI를 사용하는데 필요한 비싸고 부피가 큰 장비는 많은 적용 또는 상황에 비실용적이다. MRI는 대상자의 신체 영역내의 표적에 대한 2차 및 3차원적인 정보를 제공할 수 있지만, 표적과 관련한 생리적 활성의 영상화에는 덜 효과적이다.
초음파 또는 초음파 촬영술은 인체내의 구조에 대한 영상을 생성하기 위한 고주파수의 음파(초음파)의 사용이다. 초음파는 인간이 들을 수 있는 소리 범위보다 높은 음파이다. 초음파는 압전성 결정의 전기적인 자극에 의해 생성되며, 그 같은 파는 특정 신체 영역을 겨냥할 수 있다. 파가 신체 영역내의 신체조직을 통해 이동할 때, 예를 들어 신체의 다른 두 기관 사이의 경계에서와 같은, 조직 밀도에서 변화가 있는 어떤 지점에서 반향된다. 초음파는 방사선 또는 방사성 재료를 사용하지 않는데 잇점이 있으며, MRI에 비해 덜 비싸고 부피가 작은 장비를 사용하지만, 기본적 조직 및 구조의 밀도차를 지각하는 것에만 제한된다. 따라서, 감염이 표적조직의 밀도에서의 판별가능한 변화를 초래하지 않을 경우, 감염의 진행을 효과적으로 추적하고 모니터링할 수 없다. 초음파는 조직 또는 기관의 생리적 기능을 영상화하거나 또는 검출할 수 없다.
지금까지, 양전자 방출 단층촬영술 또는 P.E.T는, 기관 또는 조직 기능에 대한 영상을 생성하기 때문에 영상 기술로선 유일하다. X-선, CT, MRI, 및 초음파 촬영술과 같은 다른 영상 기술은 기관 또는 조직 해부적 구조를 묘사하지만, 그들내의 생리적 활성은 식별할 수 없다. 기관의 특정한 생화학적 활성을 영상화하기 위해, 방사선 추적자 또는 방사성 약물이라 불리는 방사성 물질이 신체내에 주사되거나 흡입된다. 추적자는 통상적으로 물 또는 설탕과 같이 신체내에서 자연스럽게 발생하는 당량의 방사성 물질이다. 방사성 동위원소는 그 원자가 다른 중성자의 수를 갖는 것을 제외하고는 신체내의 비방사성 동위원소와 동일하다. 그러므로, 대상자의 신체는 방사성 재료, 그 같은 재료와 관련한 잠재적인 위험을 지고 있다. P.E.T는 형질전환 조직, 기관 또는 형질전환 유기체로부터의 비-동위원소 발현 산물을 검출할 수 없다. 방사성 동위원소의 사용에 의해 신체의 방사선 발광원에 대한 2차원 영상을 얻는 신티그래피, 진단기술이 또한, 구조 및 그들의 기능을 영상화하는데 사용될 수도 있다. 그러나, 신티그래피는 대상자 신체 영역내의 표적의 깊이를 결정하는데 적절하지 않다.
대상자의 신체 영역내의 표적의 정위 및 영상화를 위한 상기 언급된 기술들에 비추어, 방사성, 방사선 또는 비싸고 부피가 큰 장비의 사용없이 그같은 표적의깊이 및/또는 모양 및/또는 세포수를 결정하기 위한 방법과 장치에 대한 요구가 있다. 여기에 개시된 본 발명은 이들 요구를 충족시킨다.
본 발명은 비침습적 의학 영상, 의학 연구, 병리학, 및 약물의 발견 및 개발 분야를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
도1A는 대상자에서 발광원의 위치 및 크기를 조사하는데 사용하기 위한 본 발명에 따라 구성된 장치의 단면도이다.
도1B는 도1A의 장치의 특징을 개략적 형태로 예시한다.
도2는 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서 장치에 의해 수행될 수 있는 일반적 단계들의 흐름도이다.
도3A는 동물 대상자에서 발광원으로부터의 표면 광 강도 영상이다.
도3B는 측정된 방출 프로파일(실선)과 확산 모델로부터 계산된 광 방출 프로파일간의 곡선 적합을 나타내는, 도3A에서 동물 대상자로부터의 광방출 프로파일이다.
도4A 및 도4B는 표시한 바와 같이 마우스 대퇴부에서 여러 깊이에서 시험관내(실선) 및 생체내(점선)에서 세균성 루시페라제의 방출 스펙트럼의 도시인데, 이때 도4B에서의 도시는 600-700nm사이의 영역에서 생체내 피크 강도를 나타내기위해 축척으로 되어 있다.
도5는 투과 스펙트럼이 얻어진 동물에서의 여러 위치들을 나타낸다.
도6A 및 도6B는 도5에 나타낸 여러가지 동물 위치에서의 살아있는 실험동물을 통한 투과 스펙트럼을 나타낸다.
도6C는 샘플, 예를 들면, 조직의 광학적 성질을 측정하기위해 유용한 이중 적분구 장치를 예시한다.
도6D는 생체내 조직의 광학적 성질을 측정하기 위해 유용한 방사상 섬유 프로브의 실험용 기구를 예시한다.
도7A 및 도7B는 흡수계수의 도시이다.
도7C 및 도7D는 파장의 함수로서 여러가지 조직들의 등방성 또는 감소된 산란계수의 도시이다.
도8A는 절대 검정 결정에 대해 사용된 장치의 구성요소들을 예시한다.
도8B는 절대 검정이 어떻게 동물 대상자로부터 세포 수의 결정을 허용하는지를 예시한다.
도9A 및 도9B는 광자가 어떻게 조직의 표면에 확산하는지(도9A)와 조직의 표면에 확산하는 광자가 어떻게 본 발명에서 포획되는지(도9B)를 예시한다.
도10A는 혼탁 조직을 통해 "랜덤 웍(random walk)"을 통한 광자를 따르는 몽테 카를로 시뮬레이션을 나타낸다.
도10B는 몽테 카를로 시뮬레이션("+" 기호)을 가지고 확산 모델(실선)로부터 4mm 깊이에서 광원에 대해 계산한 계산된 광 강도 공간 프로파일을 예시한다.
도11A 및 도11B는 광원 깊이의 함수로서 피크 강도(도11A) 및 점 폭(FWHM)(도10B)를 나타내는 확산 모델로부터 계산된 도시들이다.
도12A는 대상자에서 발광원으로부터의 표면 광 강도 영상이고 광 강도 프로파일이 측정된 수평 및 수직 프로파일 라인을 나타낸다.
도12B 및 도12C는 도12A에 나타낸 수평 및 수직 프로파일 라인을 따라 측정된 광 강도 프로파일이다.
도13A는 시험관내(실선)에서, 도13B에 나타낸 피하 영역으로부터(사각표시), 그리고 도13C에 나타낸 폐 영역(다이아몬드 표시)으로부터 획득된 루시페라제 발광원의 스펙트럼 영상 도시를 나타낸다.
도13B 및 도13C는 피하 발광원(도13B)과 폐에서의 발광원(도13C)으로 동물로부터의 표면 광 강도 영상이다.
발명의 개요
한 관점에서, 본 발명은 대상자에서 발광원의, 세포의 위치, 크기 및 수를 조사하는 방법을 포함한다. 발명을 실시하는 데 있어서, 처음에는 광검출기 장치로 제1 투시로부터 (i) 발광원으로부터 유래하고, (ii) 대상자의 혼탁한 생물학적 조직을 통해 이동하고, (iii) 대상자의 관심있는 제1 표면 영역으로부터 방출되는 광자를 측정함으로써 구성된 제1의 측정된 광 강도 프로파일을 얻는다. 광 강도 프로파일을 파라미터에 기초한 생체광자 함수에 대응시켜 깊이 및 크기와 같은 함수 파라미터를 측정한다. 이렇게 결정된 파라미터들을 제1의 측정된 광 강도 프로파일이외의 테이터를 사용하여 세분하여 대상자에서 발광원의 대략의 깊이 및 크기를 얻는다. 추가의 데이터는 대상자로부터 측정된 데이터, 모델링 분석으로부터의 데이터, 또는 대상자의 표면으로부터 방출된 광자의 파장에 관한 데이터일 수 있다. 예로서:
방법은 전형적으로 대상자에서 발광원의 대략의 깊이 및 형태를 사용하여 발광원의 2-D 또는 3-D 시각 표현을 발생시키는 단계, 그리고 대상자의 2-D 또는 3-D 상 위에 시각 표현을 겹치는 단계를 포함한다.
추가의 데이터는 혼탁 매질에서 발광원으로부터 광의 확산의 컴퓨터 시뮬레이션으로부터 얻어질 수도 있다. 하나의 바람직한 시뮬레이션 접근법은 (i) 생물학적 조직과 유사한 흡수 및 산란 성질을 갖는 혼탁 매질을 통해 다수의 크기 및 형태 중 한가지를 갖는 다수의 깊이 중 하나에서 위치된 발광원으로부터 광자 확산의 모델에 기초하여 다수의 이론적 광 강도 프로파일을 발생시키는 단계, (ii) 다수의 이론적 광 강도 프로파일 각각과 제1의 측정된 광 강도 프로파일간의 적합의 질을 비교하는 단계, (iii) 제1의 측정된 광 강도 프로파일에 제공하는 이론적 광 강도 프로파일을 선택하는 단계, 그리고 (iv) (iii)에서 선택된 이론적 광 강도 프로파일로부터 파라미터를 사용하여 대상자에서 발광원의 대략적 깊이, 형태, 및 휘도를 얻는 단계를 포함한다. 방법은 광자 산란 모델에서 광자가 이동하는 조직에 해당하는 한가지 이상의 지정된 조직-특이적 광 산란 계수를 사용하는 것을 포함할 수도 있다.
또 다른 일반적인 구체예에서, 추가의 데이터는 약 400nm 와 약 1000nm사이의 두가지 이상의 다른 파장에서 대상자로부터 광 방출을 측정하고, 다른 파장에서 측정된 상대 광 강도를 결정하고, 결정된 상대 광 강도를 조직 깊이의 함수로서 다른 파장에서의 기지의 상대 신호 강도와 비교함으로써 얻어진다. 또 다르게는, 광 강도의 스펙트럼이 약 400-1000nm사이의 선택적 파장 범위에 걸쳐 측정되고, 측정된 스팩트럼은 조직내 여러 깊이에 놓인 발광원으로부터 측정된 다수의 스펙트럼과 비교하여 측정된 스펙트럼을 기지의 스펙트럼과 대응시키는 것으로부터 발광원의 깊이를 결정한다.
발광원에 대한 여러가지 구체예에서, 발광원은 광 방출 부분 또는 형광 부분이고; 발광원은 대상자에 투여되고 선택된 표적에 결합하거나 대상자에서 달리 편재된 후 측정되고; 발광원은 대상자의 생물학적 세포 또는 대상자에 투여된 생물학적 세포에 의해 발현된 광발생 단백질과 같은 광발생 단백질(예를 들면, 루시페라제, 녹색 형광 단백질, 등)이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 대상자에서 발광원의 위치 및 크기를 조사하는데 사용하기 위한 장치를 포함한다. 장치는 대상자로부터의 광 방출 사건이 검출될 수 있는 광밀 엔클로져와 엔클로져내의 제1의 투시로부터 (i) 발광원으로부터 유래하고, (ii) 대상자의 혼탁한 생물학적 조직을 통해 이동하고, (iii) 대상자의 관심있는 제1 표면 영역으로부터 방출되는 광자를 측정함으로써 구성된 제1의 광 강도 프로파일을 발생시키는데 사용하기 위한 엔클로져와 연관된 광학 시스템을 포함한다. 광 검출기에 조작가능하게 연결된 계산 장치는 (i) 제1의 측정된 광 강도 프로파일을 파라미터 기초의 생체광자 함수과 적합시키고; (ii) 제1의 측정된 광 강도 프로파일이외의 데이터를 사용하여 생체 광자 함수의 변수를 세분하여 대상자에서 발광원의 대략적 깊이 및 형태를 발생시키도록 기능한다.
광학 시스템은 바람직하게는 강화된 또는 냉각된 전하-커플링된 장치(CCD) 및 CCD 위에 광을 집중하기 위한 렌즈를 포함한다. 광학 시스템은 대상자의 관심있는 다수의 다른 선택된 표면 영역으로부터 방출된 광자를 검출하도록 하는 방식으로 구성될 수 있다. 시스템은 다른 선택된 파장 범위내에서, 예를 들면, 600nm 위 및 아래에서 광자를 투과하기 위한 하나 이상의 필터를 포함할 수도 있다.
계산 장치는 제1의 공간 프로파일과 대응하는 곡선에 대하여 여러 깊이에서 여러 크기의 발광원을 나타내는 모델 생체광자 함수들의 데이터 파일을 포함할 수도 있다.
광학 시스템이 파장 판별을 위한 필터를 포함하는 경우에, 계산 장치는 다음의 파라미터 세분 연산중 적어도 한가지를 수행하도록 조작가능하다:
(i) 다른 파장에서 측정된 상대 광 강도를 결정하고, 결정된 상대 광 강도를 조직 깊이의 함수로서 다른 파장에서의 기지의 또는 계산된 상대 신호 강도와 비교하는 단계와;
(ii) 측정된 스펙트럼을 조직내 여러 깊이에 놓인 발광원으로부터 측정된 다수의 스펙트럼과 비교하고, 측정된 스펙트럼을 기지의 스펙트럼과 대응시키는 것으로부터 발광원의 깊이를 결정하는 단계.
또 다른 구체예에서, 계산 장치는 강도패턴 영상을 평균내어 단일 강도 값으로 하고, 또한 특정 크기 및 형태의 발광원의 함수로서 발생된 적분된 광 강도 값들에 의해 광원 크기를 결정하도록 조작가능하다.
계산 장치는 생물학적 조직과 유사한 흡수 및 산란 성질을 갖는 혼탁 매질을 통해, 다수의 크기 및 형태 중 한가지를 갖는 다수의 깊이 중 한가지에 위치된 발광원으로부터 광자 확산의 모델을 기초로 한 다수의 이론적 광 강도 프로파일을 함유하는 데이터 베이스를 가질 수도 있다. 여기서 계산 장치는 (i) 다수의 이론적 광 강도 프로파일 각각과 제1의 측정된 광 강도 프로파일간의 적합의 질을 비교하고, (ii) 제1의 측정된 광 강도 프로파일에 최상의 적합을 제공하는 이론적 광 강도 프로파일을 선택하고, 그리고 (iii) (ii)에서 선택된 이론적 광 강도 프로파일로부터 파라미터를 사용하여 대상자에서 발광원의 대략적 깊이 및 형태를 얻도록조작가능하다.
게다가, 계산 장치는 대상자에서 발광원의 대략적 깊이 및 형태를 사용하고, 대상자의 2- 또는 3-차원 영상 위에 시각적 표현을 겹쳐서 발광원의 시각 2-, 또는 3-차원 표현을 발생시키도록 조작가능하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 대상자에서 발광원의 깊이를 결정하는 방법을 제공한다. 방법을 실시하는데 있어서, 약 400과 약 1000nm 사이의 두가지 이상의 다른 파장들에서 대상자로부터의 광 방출 강도를 측정한다. 발광원의 깊이는 대상자의 조직의 광학적 성질들, 예를 들면, 대상자에서 지연 및 확산 계수들에 관련된 측정된 광 강도 및 정보를 사용하여 결정한다.
광학적 성질들, 예를 들면, 대상자에서 지연 및 확산 계수들에 관한 정보는 대상자와 같거나 유사한 물질에서의 계수들의 직접 측정에 의해 얻어질 수도 있다.
또 다르게는, 광학적 성질 정보를, 두가지 이상의 다른 파장들에서, 조직 또는 대상자의 것과 대응하는 물질의 다수의 깊이의 각각에 위치된 발광원으로부터의 광 강도를 결정함으로써 간접적으로 얻어질 수도 있다. 다음에 원하는 깊이의 결정은 측정된 광 강도를 다수의 깊이의 각각에서 결정된 광 강도와 대응시킴으로써 수행된다.
후자의 접근법에서는, 발광원으로부터의 광 강도의 스펙트럼 프로파일을 다수의 깊이의 각각에서의 발광원으로부터의 광 강도의 다수의 스펙트럼 프로파일의 각각과 비교할 수도 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징들은 다음의 상세한 설명을 첨부 도면과 연관하여 읽을 때 더욱 충분히 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
Ⅰ. 정의
특별하게 지시되지 않은 한, 아래의 용어들은 다음과 같이 정의된다:
"생체광자 함수"란, 광 방출 프로파일, 분광 강도 분포, 또는 적분된 광 강도와 같은 측정가능한 광자 출력을 발광원 깊이, 크기 및 모양, 광-방출 세포의 수, 특정 타입의 조직에 대한 파장-의존적 산란 및 흡수 계수, 및 광-방출기의 분광 특성와 같은 발광원 변수의 용어로 설명하는 수학적 함수이다. 광자 함수는 예를 들어 광자-확산 모델, 아래 설명된 바와 같은 몽테 카를로 시뮬레이션 또는 유한 요소 해석(finite element analysis)에 대한 토대가 될 수 있다.
"혼탁 조직"이란, 광 산란 및 광 흡수 성질 둘 모두를 갖는 대상자내의 비-투과성 조직이다.
"표적 영역"이란, 표면하 조직 또는 기관, 고형 종양, 또는 감염 영역과 같이 대상자의 내부 표면하 영역으로, (i) 대상자내에 국소화되고, (ii) 혼탁 조직에 의해 대상자의 표면 영역으로부터 분리되고, (iii) 조직 또는 기관-특이적 항원,유전자 또는 유전자 산물, mRNA 또는 발현 단백질로서, 세포, 기관, 또는 조직의 활성화, 비활성화, 또는 조절로 인한 산물과 같은, 구별가능한 특징을 바람직하게는 하나 이상 포함한다.
발광원이란 표적 영역에서의 발광원이다. 발광원은, 특정 유전자가 어떤 활성화 수단에 의해 발현될 때 표적 조직이 유전적으로 변형되어 재조합 광-방출 단백질을 생성할 때와 같이, 스스로 가시광선을 방출할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 생물발광 단백질(예를 들면, 루시페라제) 및 형광 단백질(예를 들면, GFP, dsRed, 및 YFP)와 같은 여러 타입의 광-발생 단백질이 사용된다. 예시적인 발광원은 광-생성 세포 뿐만 아니라, 광-발생 단백질로 트랜스포메이션되어 동물 대상자에 투여되는 원핵성 및 진핵성 세포를 포함하며, 이들은 본질적으로 광-발생 정보제공 유전자로 형진 전환된 동물의 일부분이다.
선택적으로, 발광원은 형광 또는 전자기 방사선에 의해 여기되어 가시광을 방출할 수 있는 다른 분자들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 표적에서의 광 방출을 야기하는데 유효한 조성물이 대상자에 투여되고 표적 위치에서 국소화되도록 될 수 있으며, 여기에서 조성물은 이어서 광을 방출하거나, 또는 표적 내 또는 인접의 일부 다른 부분에서의 광 방출을 야기할 것이다. 예를 들어, 투여되는 조성물은 표적 내 또는 인접의 세포를 활성화하거나, 반대로, 그 같은 세포에서의 광 방출을 야기하는 화합물일 수 있으며, 결과, 국소화된 세포가 대상자의 신체 영역내의 표적이다. 그러나 다른 구체예에서, 감염 세포가 대상자에 투여되고, 질병의 진행 및 위치가 결정된다. 이 구체예에서, 표적은 대상자의 신체 영역내에 위치하는 소정의지점에서의 세포군이다. 발명의 다른 구체예에서, 신체 영역은 다중 표적을 가질 수도 있으며, 대상자는 다중 신체 영역을 가질 수도 있고, 각 영역은 잠재적으로 표적을 갖는다.
"형광 색소" 또는 "형광 발색단"은 여기 최대치들에서 또는 유효하게 근처에서 여기되고, 장 파장에서 광을 방출하거나 또는 형광발광하는 분자들이다. 형광 색소의 여기 최대치와 형광 색소의 방출 최대치 사이의 차는 스토크스 이동(Stokes sfift)이라고 알려져 있다. 소정의 형광 색소의 스토크스 이동이 클수록, 여기 스펙트럼 또는 형광 색소를 여기하는 파장 범위, 및 방출 스펙트럼 또는 형광 발광시 형광 색소에 의해 방출되는 광의 파장 범위 사이의 차가 더 커지게 된다. 발명의 특정 구체예는, 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, Cy3, Cy5, Cy7, 및 기타 심 원적외(deep, far red) 또는 근적외 (NIRF) 형광 색소와 같은 큰 스토크스 이동을 갖는 형광 색소를 사용한다. 특히 바람직한 형광 색소는 약 600 나모미터 보다 긴 파장에서 광을 방출한다. 다른 바람직한 형광 색소는 600 나노미터보다 짧은 범위에서 광을 방출할 것이다. 특히, 루시페라제와 같은, 단백질은 표적 또는 표적에 인접하거나 또는 관련되는 세포, 또는 예를 들어 감염에서와 같이 표적에서 국소화하는 세포에 의해 합성될 수도 있기 때문에, 그 각각이 다양한 방출 스펙트럼을 갖는 "녹색 형광 단백질"(GFP)이 특히 유용하다. GFP는 또 다른 단백질 또는 표적에서 국소화하는 생물학적 재료 또는 표적에 대한 접합체로서 더 투여될 수도 있다.
발명의 바람직한 구체예에서, 기지의 광-방출 조건하에서 각각의 발광원은 기지의 방출 스펙트럼을 갖는다. 각각의 방출 스펙트럼은 바람직하게는 검출단계내내 일정하다. 특히, 각각의 광 파장에서의 광 방출의 상대적인 광도는, 스펙트럼 변화에 대한 전체 강도로써, 발광원에 대한 방출 스펙트럼내의 모든 다른 광 파장에서의 광 방출 강도에 비례한다. 발명의 일부 구체예는 최소한으로 둘 이상의 구별가능한 파장 범위의 방출 광을 필요로 한다. 보다 바람직하게는, 발명의 특정 구체예는, 광이 신체 영역을 통해 이동하는 거리 또는 깊이에 대한 함수로써, 각 파장 범위의 광이 대상자의 선택 신체 영역을 통해 이동할 때 다른 범위들과는 다르게 움직이는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 제 1파장 범위의 광의 강도는 광이 이동하는 신체 영역의 매 센티미터마다 절반으로 줄어드는 반면, 제 2파장 범위의 광은 광이 이동하는 신체 영역의 매 센티미터마다 3분의 4로 줄어든다. 각각의 범위가 동일한 강도를 갖는, 둘 모두의 파장 범위를 갖는 광의 강도는, 조직 1센티미터통과 후, 제 1범위에서 2분의 1로, 제 2범위에서 4분의 3으로 감소할 것이다. 조직깊이 0에서의 초기 1:1 비율의 강도와 결과로 얻어진 2:1 비율의 강도를 비교하면, 광이 조직을 통해 1센티미터 이동할 때 감소될 수 있다.
발명은 다른 루시페라제 효소와 같은 여러 발광원을 사용하여 실행될 수도 있다. 예를 들어, 한천 위에서 발현된 "청색" 세균 루시페라제 (Photorhabdus luminescens)로부터의 광 방출을 분광계로 분석한 결과 약 485nm에 집중된 스펙트럼을 나타내었다. PBS 용액중의 PC-3M 세포에서 발현된 "녹색" 개똥벌레 루시페라제(Photinus pyralis)는 약 570nm에 집중된 스펙트럼을 보이는 광을 방출하였다. PBS 용액중에 현탁된 PC-3M 세포에서 발현된 "적색" 루시페라제는 약 620nm에 집중된 스펙트럼을 보였다.
Ⅱ 장치 및 방법
도 1A는 본 발명에 따른, 대상자내의 발광원의 위치 및 크기를 조사하는데 사용될 수 있는 장치(20)의 단면도이다. 장치는 일반적으로, 광밀 엔클로져 또는 챔버(22)를 포함하며, 그 안에서 대상자로부터의 광-방출 사건이 검출될 수 있다. 광-패쇄 상자(22)는, 여기에 참고로 그 전체가 포함된 공동-소유의 PCT 공개 번호 WO 200163247에서 설명된 바와 같이 구성될 수 있다. 간단히, 챔버는 뒷벽(21)과 같은, 뒤 및 측벽으로 한정되며, 전면 열림부(도시하지 않음)을 가지며, 이는 챔버 내부로 접근할 수 있도록 열리고, 광-패쇄 밀봉을 제공할 수 있도록 닫혀질 수 있다. 광 패쇄 박스(22)가 작은 동물용으로 고안되었지만, 기술은 인간을 포함한 큰 포유동물에 대해서도 또한 적용될 수 있다.
챔버 내에는 대상자가 놓여지며 광-방출 검출 동안에 바람직하게 고정되는 단(24)이 포함된다. 여기에 설명된 많은 실시예들이 작은 포유동물 대상자, 대표적으로 마우스 또는 랫트와 관련이 있지만, 챔버 크기를 적절하게 확대하고 필요한 경우, 표적 영역내에 발광기의 크기와 수를 적절하게 증가시켜 사용함으로써, 동일한 원칙과 방법을 인간 대상자를 포함한 다른 동물들에게도 적용할 수 있음이 명백해질 것이다. 나타낸 장치내의 단은, 일반적으로 26에서 나타낸 통상적인 웜나사 기계장치에 의해 그리고 사용자의 제어하에서, 챔버내의 선택된 수직 위치로 상승 및 하강할 수 있도록 고안된다. 챔버내의 단 위치는 가시광 신호를 필요로 하지 않는 다수의 기지의 추적 장치중 어떤 것에 의해 모니터링될 수도 있다.
관측 렌즈는 두개의 일반적인 구성요소를 포함한다. 첫번째는 광검출기(32)의 검출 스크린상의 대상자의 표면으로부터의 광-방출 사건에 집중시키는 역활을 하는 렌즈 조립물(28)로, 이는 대표적으로 서늘한 조건에서 작동하여 고유의 소음 수준을 최소화하도록 할 수 있는 전하 촬상 소자(Charged-Coupled Divice)의 광검출기 화소 배열이다. 렌즈 조립물의 구성 및 검출기에의 그 광학적 결합은 통상적인 것이다. 하나의 바람직한 CCD는 분광기기에서 상업적으로 입수가능한 모델 620 CCD이다.
두번째의 선택적인 광학 시스템의 구성요소는, 선택된 범위의 가시광 파장을 제외한 모든 광 투과를 차단하도록 고안된 다수의 광학 주파수폭 필터를 포함하는 파장 필터 휠(30)이다. 하나의 표준 설비는 3개의 필터; 510nm 미만의 파장에 대한 단파장 주파수폭 필터(30a)(청색 광 필터), 500-570nm범위의 주파수폭을 갖는 중간파장 주파수폭 필터(30b)(녹색 광 필터), 및 590nm보다 큰 파장에 대한 장파장 주파수폭 필터(적색 광 필터)를 포함한다. 일부 적용에서, 필터는 예를 들면 매 20nm의 보다 정확한 주파수역을 제공할 있다. 단지 설명된 관측 렌즈 및 검출기가 광학 시스템으로써, 집합적으로 여기에서 또한 언급되었다.
장치는 또한 제어기(34)를 포함한다. 단 높이, 방향, 및 이동 위치와 같은 다양한 사용자 제어 설정, 주파수폭 필터, 및 검출기 모드가 장치내 제어 입력 판벽널(36)을 통해 이루어진다.
도 1B는 마우스(38)과 같은, 작은 포유동물 대상자를 영상화하는데 사용하기 위한 규모로 여기서 나타낸 장치(20)에 대한 보다 개략적인 표현을 나타낸다. 렌즈 조합은 여기서 단일 렌즈(28), 필터 휠(30) 및 CCD 검출기(32)로서 표현된다. 검출기 출력은 데이터 파일을 위한 중앙연산처리장치(40) 및 기억장치(42)를 포함하는 제어기 계산기(34)내의 계산기에 공급된다. 검출기(32)에서의 고안들에서의 광-검출 신호에 반응하여, 데이터 파일의 콘텐츠, 및 계산기의 연산은 아래에서 설명될 것이다. 제어기는 컴퓨터 모니터와 같이, 사용자에세 정보 및 영상을 보여주기 위한 디스플레이/출력 소자(44)에 기능적으로 연결되어 있다.
계산기의 연산은 장치에 의해 수행된 발명의 방법으로부터 명백해질 수 있으며, 이는 도 2에 대해 요약되고, 아래에서 보다 상세화될 것이다. 방법에서 제 1단계는 제 1의 측정된 광-강도 프로파일을 얻는 것이다. 이것은 첫째 대상자내의 발광원을 국소화하는 것으로 행해진다. 이것은 상기에서 설명한 것과 같이 루시페라아제와 같은 광-방출 단백질을 생성하는데 유효한 유전자를 대상자내에 도입하는 것 또는 표적 발광원에 형광 화합물을 국소화하는 것을 포함하는 다양한 방법으로 행해질 수 있으며, 둘 모두는 예를 들면 공동-소유의 PCT 출원 W099US/30078, WO00US/7296, W099US30080, 및 W097US6578에서 설명된 바와 같은 공지된 방법에 따른 것으로, 모두는 여기에 참고로 포함되어 있다.
따라서 준비된 대상자는 광-패쇄 챔버내에 놓여지고, 도 2의 52에서와 같이, 표적 영역에서의 광-방출 사건에 기인하는 대상자 표면으로부터의 광 방출이 측정되고, 계수화되고 계산기에 놓여진다. 계산기는 이 데이터를 사용하여 54에서와 같이 광 방출에 대한 공간 프로파일을 발생시킨다. 이 프로파일은 도 1A의 단에 평행한 면에서의 x(수평) 및 y(수직)축에 따라 프로파일을 나타내는 검출기내의 검출기 구성요소에 대한 선택 행 및 선택 단에 따라 취할 수 있다. 즉, 프로파일은 검출기구성요소에 대한 선택 열 및 단에 따른 측정 강도값에 대한 플롯으로, 검출기 배열상의 대상자 표면으로부터의 집중된 광 강도값의 분포를 나타낸다. 대상자로부터 측정된 예시적인 광-강도값은 도 3B에서 실선으로 나타내어졌다. 도 3A는 방출 윤곽을 나타내며, 도 3B는 그들 위치에 대응하는 검출기 화소에서 측정된 대로, 수직 프로파일을 나타낸다.
다시 도 2로 돌아와서, 공간 프로파일 또는 결과로 얻어진 프로파일은, 기지의 크기 및 깊이에 대한 발광원으로부터 측정되거나, 또는 깊이 및 크기 파라미터, 및 아래에 설명되는 것과 같은 다른 파라미터를 선택적으로 사용하는 광자 확산 모델로부터 계산되는 경험 함수인 파라미터계 광자 함수의 데이터 베이스(58)에 저장된 프로파일에 대응대거나 또는 적합화된다.
최적 곡선 대응으로부터, 프로그램은 발광원의 깊이 및/또는 크기 및/또는 휘도, 바람직하게는 셋 모두에 대한 초기 계산된 결정을 할 수 있다. 발명의 특징에 따라서, 방법은 이제 추가의 광-강도 데이터, 및/또는 추가의 모델링 데이터의 형태가 될 수 있는 추가의 데이터에 의해 깊이 및 크기 결정이 세분되는 방식으로 수행된다. 예를 들어, 도 2에서 지적된 바와 같이, 데이터는
(a) (62)에서와 같이, 2차 관찰 각도로부터 대상자를 관측하여 얻어진 광-강도 데이터, 대표적으로 공간 프로파일 데이터를 의미하는 2차-관찰 데이터. 대표적으로, 장치에서 대상자는 광학 시스템에 대해 기울어져 결과 대상자 표면의 제 2영역으로부터 광 방출된다;
(b) (64)에서와 같이, 하나 이상의 주파수역 범위, 예를 들면 청색-광,녹색-광 또는 적색-광 분광 범위에서 얻어진 광-강도 데이터를 의미하는 분광 데이터;
(c) (66)에서와 같이, 관심있는 대상자에 가까운 대상자의 선택 위치에서의 파장에 대한 함수로서 대표적으로 얻어진 예정-광 강도값을 의미하는 투과도 데이터;
(d) (68)에서와 같이, 광이 발산하는 대상자 조직에 대응하는 감소된 산란 계수 μ's, 흡수 계수 μa또는 유효 계수 μeff와 같은, 조직 파라미터에 대한 예정 값을 의미하는 조직 성질 데이터. 이 데이터는, 예를 들어 확산 모델에 의해 발생된 공간 프로파일 곡선을 세분하는데 사용된다;
(e) (70)에서와 같이, 대상자 표적 영역 및 인접 표면을 나타내는 모델내의, 또는 대상자에 가까운 실제 대상자내의 선택 위치에서 기지의 강도 및 크기를 갖는 발광원을 놓아두어 얻은, 예정 광-강도값, 대표적으로 공간 프로파일 데이터를 의미하는 시뮬레이션 데이터; 및
(f) (72)에서와 같이, 전체 공간 프로파일 또는 전체 검출기 배열에 대해 합계되거나 또는 적분된 총 광 강도를 의미하는 총 강도 데이터의 형태가 될 수도 있다. 계산 소자에 의해 실행된 프로그램은 (60)에서 추가의 정보를 받고, 아래에서 고려되는 것과 같이, (74)에서 정보를 사용하여 발광원의 깊이 및 크기 결정을 세분되게 한다. 마지막으로, 발광원 깊이, 크기 및 선택적으로 모양 및 발광원내의 세포수에 대한 세분된 결정이 데이터 및/또는 발광원의 위치 및 강도를 나타내는하나 이상의 대상자 영상의 형태로 사용자에게 디스플레이된다.
(g) (73)에서와 같은, 절대 보정 광 강도. 절대 강도에 대한 보정은 CCD중의 수/초/화소를 방사값 광자수/s/cm2/sr(sr=스테라디안)으로 변환시킨다. 도 8A는 보정 방법에서 사용된 광 조립(100)을 예시한다. 조립은 CCD검출기(102)외에 렌즈(104)(상기와 같이 렌즈 조립을 나타낸다), 주파수역 필터(106) 및 옵트로닉 라보라토리(Optronic Laboratories)로부터 입수가능한 OL 시리즈 425 구(OL Series 425 sphere)와 같은, 저-광-수준 적분구를 포함하며, 기지의 광-강도에 대한 발광원으로써 작용한다. 광자수/초/cm2/sr로 측정된, 구에서의 기지의 방사값는 두 수를 관련시키는 보정 인자를 계산하도록 한다.
도 8B는 절대 측정 강도를 발광원내의 총 세포수를 계산하는데 어떻게 사용하는지를 예시한다. 각 세포는 광자 유동Φc 광자수/초/세포를 생성할 것으로 추측된다. 검출기(102)에 의해 측정된 바와 같이, 대상자(112)내의 발광원(110)으로부터의 방사값은 광자수/s/cm2/sr의 수로 측정한다. 다음으로 측정된 방사값은 관심있는 영역에 대해 적분되어 발광원 유동Φs광자수/초로 변환된다. 기지의 유동값으로부터, 발광원내의 세포수는Φs/Φc로서 용이하게 계산된다.
Ⅲ. 광 방출 데이터 및 파라미터
이 부분은 본 발명을 실행하는중에 수집될 수 있는 다양한 타입의 광 방출 데이터를 고찰하고, 데이터가 광자-확산 모델링에서, 및/또는 모델 확산 곡선과 대응하는 곡선을 토대로 발광원의 깊이 또는 크기를 결정하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 설명한다.
광-강도 공간 프로파일. 측정된 기초 광 방출 데이터는 도 3B에 대해, 상기에서 설명된 광-강도 공간 프로파일이다. 측정된 광-강도 공간 프로파일은 대상자의 표면 영역으로부터 방출된 광 강도의 공간 분포를 나타낸다. 광-강도 공간 프로파일은 실선을 따라, 2이상의 선(예를 들면, 대상자를 지지하는 단에 대해 x 및 y 방향에 따라)을 따라 얻어질 수도 있다. 광에 대한 전체 2D 표면 분포가 또한 사용될 수도 있다. 모델링된 공간 프로파일은 혼탁 조직을 통한 광자 확산 모델로부터 계산된 예측된 광-강도 공간 분포를 나타낸다. 측정된 프로파일과 모델링된 프로파일과의 대응에 의해, 발광원의 대략적인 깊이 및/또는 크기가 결정될 수 있다.
총 광 강도.총 광 강도는 검출기내의 모든 검출기 구성요소에 대해 합계되거나 또는 적분된 총 광 강도이다. 총 광 강도는 발광원, 위치 및 휘도를 결정하는데 사용된 적합화 모델에 대한 추가의 제한으로써 사용될 수 있다.
절대 보정 광 강도.상기 도 8B에 대해 상기 설명된 바와 같이, 절대 광-강도 유동은 발광원으로부터의 총 유동을 측정하는데 사용될 수 있다. 이 발광원은 각각이 평균 세포 유동Φc를 방출하는 세포로 이루어진다는 것을 가정하여, 발광원을 이루는 광 방출 세포의 총 수가 결정될 수 있다. 반대로 이 결정은, 알려졌거나 또는 계산된 조직 발광원에 대한 세포 질량비를 토대로, 총 발광원 질량 또는 부피 결정을 세분하는데 사용될 수 있다.
분광 데이터. 분광 데이터는 상기에서 언급된 청색-광, 녹색-광 및 적색-광 파장 범위와 같은 특정 파장 범위에서 수집된 광-강도 데이터이다. 광은 우선적으로 단파장에서 대상자 조직에 의해, 특히 대상자 조직내의 헤모글로빈에 의해 흡수되기 때문에, 다른 파장들에서의 광의 상대적인 광도는 발광원 깊이에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 파장-의존적 조직 산란 및 흡수 계수를 토대로, 세분된 파장-의존적 공간 프로파일을 생성하는데 사용될 수 있다.
도 4A 및 4B는 다른 파장 또는 파장 범위에서, 신체 영역의 조직을 통해 이동하는 광에 따라 거리 또는 깊이는 특징적인 효과를 가짐을 나타낸다. 그래프는 y-축에 대한 광 강도의 증가 및 x-축에 대한 광 파장의 증가를 나타낸다. 도 4A에서의 실선은, 약 495nm에 집중된 폭 넓은 단일 피크를 포함하는 영-깊이 방출 스펙트럼과 관련시킨 발광원에 대한 시험관내 방출 스펙트럼을 나타낸다. 폭 넓은 파선은 조직(생체내) 약 1밀리미터 통과 후의 발광원의 방출 스펙트럼을 나타낸다. 약 495nm에서의 이전의 큰 피크가 상대적인 강도에서 감소하기 시작함에 따라, 약 600nm에서, 1밀리미터 깊이 방출 스펙트럼은 작은 피크를 전개한다. 중간 파선은 조직(생체내) 약 2밀리미터 통과 후의 발광원의 방출 스펙트럼을 나타낸다. 495nm 피크는 강도에서 더 작지만, 600nm 피크는 증가하여 보다 현저하게 된다. 마지막으로, 점선은 조직(생체내) 약 4 밀리미터 통과 후의 발광원의 방출 스펙트럼을 나타내며, 여기에서 495 nm 피크는 더욱 감소된다.
도 4B는 영 조직 깊이 방출 스펙트럼에 대해 기준화한 4밀리미터 깊이의 조직에서의 방출 스펙트럼을 나타낸다. 600nm 피크가 이전의 우세한 495nm 피크보다 우세하다. 이 예에서, 600nm 피크 대 495nm 피크의 비는 발광원의 깊이에 대한 정보를 제공한다.
발명의 바람직한 방법은 자가-척도 계산법을 사용하여 결과 발광원의 깊이가 그것의 전체 강도에 대해 독립적으로 결정될 수도 있다. 이 목적을 달성하기 위해, 함수는 공식화되어 둘 이상의 파장 점위에 대한 비를 사용하며, 여기에서 신체 영역의 표면으로부터의 표적의 깊이에 대한 함수로써, 각각의 범위의 파장은 다른 비율로 신체 영역내의 조직을 통해 이동한다.
전-신체 투과도. 전-신체 투과도은, 기지의 강도 발광원을 대상자에 접하거나 또는 내부의 선택 위치에 두고, 다중 표면위에서 대상자를 통해 투과된 광 강도를 측정하는 것으로 측정된다. 투과도은 다른 조직들의 산란 및 흡수 계수에 대한 강한 분광 의존성으로 인해, 강한 분광 구성요소를 가질 것이다(아래 참조). 대표적으로, 투과도값은 모델 대상자를 사용하여, 다양한 선택 위치에서 및 다수의 분광 범위 각각에서의 총 투과도을 측정함으로써 예정된다.
도 5는 1-16의 수로 지적된 복수의 신체 영역을 갖는 대상자에 대한 상부 관찰을 나타낸다. 이 예에서, 대상자는 고정된 마우스이고, 각 신체 영역은 예정된 관심있는 영역에 대응한다. 발명의 방법의 실행에 의한 깊이 결정에 앞서, 대상자는 각 신체 영역에 대한 광학 특징의 데이터 파일을 전개하기 위해 광학적으로 분석된다. 이 예에서, 각 신체 영역은 분광 발광원과 분광 검출기사이에 놓여진다. 광 투과 스펙트럼이 각 신체 영역에 대해 얻어진다. 결과는 각 신체 영역을 분광 광도계 큐벳에 두고 다른 파장 및 파장 범위에서 각 영역에 대한 분광 프로파일을 측정하여, 광이 다른 신체 영역 및 그같은 영역내의 조직을 통해 어떻게 투과하는지에 대한 데이터 파일을 생성하는 것과 비슷하다. 도 1의 장치는 검출기에 대해,장치가 시험되는 각 신체 영역에서 대상자를 트랜스-방사하도록 조절되는 경우 특정 파장 범위에 대한 유사 데이터를 전개하도록 하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 도 1의 장치는 필수적으로 전 동물 분광광도계가 된다.
도 6A 및 6B는 상기에서 직접적으로 설명된 분광 분석에 의해 수집된 경험적인 분광 데이터를 나타낸다. 아래 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 전 스펙트럼으로써 이 데이터, 또는 각 스펙트럼내의 특정 범위는 검출된 강도 정보와 비교를 위한, 또는 표적 깊이를 계산하기 위한 함수를 개발하기 위한 데이터 파일을 생성하는데 사용될 수도 있다.
보다 상세화된 시도로, 장치는 대상자 전체 또는 그 일부를 스캐닝하기 위한 전신 스캐너를 제공하며, 대상자 신체를 스캐닝하기 위한 스캐닝 2-색상 레이저를 더 포함한다. 스캐너는 동시에 또는 순차적으로 2 이상의 색상의 아크 레이져(arc laser) 광을 통해 이동한다. 레이져 광이 위로 비추면, 회전 관내에 놓여진 대상자의 신체를 투과한다. 레이저 발광원의 반대편에 놓여진 검출기는 그것이 아크 경로를 통해 이동할 때 레이져 광을 받아 측정하도록 조정된다.
조직 광학 성질. 광자 확산 모델링에 사용되는 대상자 조직에 대한 두가지 중요한 광학 성질이 존재한다. 첫째는 조직의 흡수 계수 μa로, 단위 경로당 흡수되는 투사광의 분획과 관련된다. 가시광 스펙트럼에 대한 다양한 타입의 조직의 흡수 계수를 플롯한 도 7A 및 도 7B에서 보여지는 것과 같이, 흡수 계수는 조직의 성질 및 광 파장에 대해 매우 의존적이며, 각각의 조직은 500-600nm 범위에서 피크흡수를 나타낸다. 약 600nm 이상의 상대적으로 낮은 흡수 계수는 도 13A에서 보여진 분광 데이터, 도 6A 및 6B에서 나타난 총 투과도 데이터에 일치한다.
두번째 중요한 광학 성질은 조직의 감소된 산란 계수 μ's로, 큰 각도의 광 산란으로 인해 광 투과에 대한 단위 길이당 강도에서 부분적으로 감소한다. 가시광 스펙트럼에 대해 동일 조직의 감소된 산란 계수를 플롯팅한 도 7C 및 7D에서 나타낸 바와 같이, 산란 효과는 다른 조직들에서 상대적으로 달라질 수 있다. 일반적으로, 감소된 산란 계수는 장 파장에서 약간 감소된다.
이중 적분구(DIS) 시스템은, 확산 반사도 Rd및 확산 투과도 Td을 용이하게 측정할 수 있기 때문에, 조직 또는 어떤 혼탁 매질의 광학 성질을 측정하기 위한 도구로써 널리 사용된다. 도 6C는 흡수 계수 μs, 및 감소된 산란 계수μ's와 같은 광학 성질을 얻기 위해 이들 값들을 측정하는데 사용된 이중 적분구 장치(74)를 예시한다(Prahl, S. A.,et al.,Applied Optics32: 559-568 (1993); Pickering, J. W.,et al., Applied Optics32: 399-410 (1993)). 샘플(76)은 직접 반사 또는 투과된 광에 대한 측정을 막기 위해 위치된 내부 배플(82)와 함께, 두개의 적분구(78 및 80)사이에 놓여진다. 구는 광의 흡수를 최소화하기 위해 고 반사성 재료로 코팅된다. 광은 검출기(84)로 검출되며, 바람직하게는 컴퓨터(86)을 사용하여 분석된다. 광학 섬유 케이블(90) 및 렌즈(92)를 통해, 단색화 장치(88)에 연결된 아크 램프를 사용하여 400-1000nm사이의 샘플 조도를 얻는다.
확산 반사도 Rd및 확산 투과도 Td, 값들로부터, 역 첨가-이중화프로그램(inverse adding-doubling program)(http://omic.ogi. edu/software/iad/index.html)을 사용하여 흡수 및 감소된 산란 계수를 얻는다. 이 프로그램은 일 속도 방사성 전송식에 대한 수젓인 해답으로, 산란 매질 중의 안정 상태에서의 광 전파를 설명한다(Prahl, S. A., et al., Applied Optics 32: 559-568 (1993)). 프로그램은 반복 과정으로, 계산된 반사도 및 투과도가 측정값에 대응할 때까지의 한 세트의 광학상의 파라미터로부터 반사도와 투과도를 계산한다.
DIS 시스템의 특징은 조직이 측정전에 추출될 필요가 있다는 사실이다. 결과, 측정 조건하에서 조직 생존력을 유지하는 것이 바람직하다. 특히 헤모글로빈과 물의 흡수가 높은 파장에서 헤모글로빈의 혈관 배출 및 조직 수화가 필요할 것으로 생각된다. 앞서의 관찰에서 부분적으로, 조직 광학 성질을 측정하기 위한 바람직한 방법은 다음과 같은 비 침습적 생체내 측정이다.
바빌라쿠아(Bevialcqua, F., et al., Applied Optics 38: 4939-4950 (1999))에 의해 설명된 것과 유사한 방사상 섬유 탐색자가 비침습적으로 또는 최소의 침습력으로 생체내 광학 성질을 측정하는데 사용될 수도 있다. 도 6D는 방사상 섬유 탐색자(94)에 대한 시험 설정을 예시한다. 섬유 탐색자(94)는 조명 발생원(95), 하나이상의 조명 섬유(96) 및 1-2mm 거리내에 일반적으로 여러 (예를 들면, 6개)의 검출 섬유(97)을 포함한다. 다음으로 탐색자는 바람직하게는 최소 접촉 압력으로 관심있는 조직(99)위에 수직으로 놓여진다. 검출 섬유(97)의 출력은 한 세트의 대응하는 검출기(98)에 공급된다. 광학 성질은 발생원으로부터의 방사상 거리에 대한 강도로 공간적으로 설명된다. 발생원-대-검출기의 작은 분리에서, 확산 근사값과같은 간단한 분석적인 모델이 시스템을 설명하는데는 매우 적당하지 않아 결과, 몽테 카를로 방법이 데이터를 분석하는데 대표적으로 사용된다.
Ⅳ. 광자 전송 모델
이 부분은 표면아래 발광원으로부터 신체 표면에서 광자 방출을 시뮬레이션하고 혼탁 매질을 통해 이동하도록하기 위한 광자-전송 모델을 고려한다. 특히, (i) 발광원의 깊이, (ii) 발광원의 크기 및 (iii) 광-흡수 및 광 산란 계수를 근거로한 시뮬레이션된 광-강도 공간 프로파일을 발생시키는 것이 바람직하다. 광-흡수 및 광-산란 계수는 파장 및 광자가 확산하는 조직의 성질 둘 모두에 의존적이기 때문에, 모델은 선택 파장에서 조직의 성질 및 공간 프로파일을 특이적으로 고려하도록 세분될 수도 있다.
여기에서 사용된 광자-확산 모델은 부분 Ⅴ에서 고려되는 것과 같이, 초기 발광원-깊이 및 발광원-크기 정보가 발생될 수 있는 것으로부터 초기 광-강도 공간 프로파일을 발생시킬 목적으로 다수의 간략화된 가정들을 만든다. 다음으로 모델은 측정된 공간 프로파일의 곡선 적합을 개선시킬 목적으로, 추가의 조직-의존적 및/또는 파장 의존적 정보를 고려하여 확장될 수도 있다. 선택적으로, 초기 깊이 및 크기 정보는 다른 타입의 곡선 또는 데이터 대응에 의해 세분될 수 있다. 초기 깊이/크기 근사값을 세분하기 위한 두 시도 모두 아래 부분 Ⅴ에서 고려될 것이다.
도 9A는 세포기관(113)을 포함하는 세포(111)과 같은, 세포를 형성하는 혼탁 조직을 통해 확산할때의 광자 경로는 나타낸다. 나타난 바와 같이, 대표적으로 20-30 미크론 크기 범위내의 세포 크기는, 약 0.4 내지 0.6 미크론 사이에 있는 파장(λ) 광에 비해 상대적으로 크다. 산란은 막에서의 단절적인 불연속(≪λ)에 인한 것으로, 약 10-20 mm-1의 역 길이 산란 계수, μs인 것을 특징으로 한다. 산란 이방성 g는 약 0.9이며, 감소된 산란 계수 μ's=μs(1-g), 또는 약 2mm-1을 나타낸다. 흡수 계수 μa(λ)는 약 0.01과 1mm-1이내이며, 상기에서 나타난 바와 같이, 강한 파장 의존성을 갖는다. 흡수 및 산란 계수는 파장-의존적이나, 조직내에서 λ>-600nm에서는 일반적으로 μa≪ μ's이다.
신체내의 표적 위치로부터 신체 표면에 인접하여 위치한 광 검출기로의 광 전송에 대한 정량적인 설명은 적당한 경계 조건과 함께 광에 대한 방사성 이동 확산식의 해답에 의해 이루어질 수 있다(예를 들어, R. C. Haskel; et al in "boundary conditions for the diffusion equation in radiative transfer", J. Optical Soc Am., 11A : 2727 (1994)). 예를 들어, 한가지 접근은 도 9B에서 개략적으로 나타낸 외삽법에 의해 추정된 경계 조건을 사용하며, 여기에서 광학적 플루언스는 물리적 경계에서의 광의 프레스넬(Fresnel) 반사를 고려한 거리 Zb에서 물리적 경계로부터 대체된 평면의 표면에서 없어진다.
제 1근사값와 같이, 발광원이 위치되는 신체는 산란과 흡수 둘 모두가 일어나는 반-무한, 균일 혼탁 매질로 대표된다. 근사값은 도 9B에 예시되며, 슬랩 표면아래 슬랩(116a) 거리(d)에서의 점 발광원(114)을 나타낸다. 확산식은
이고, 피크 법칙(Fick's law)은
이고, 여기에서 φ는 이방성 플루언스(watts/m2)이고, j는 소방향 유동(watts/m2)이고, S는 동력 밀도(watts/m2)이고, r은 반경이고,
점 발광원 P(watts)에 대한 그린 함수값(Green's function solution)은
이고, 여기에서이다.
외삽법에 의해 추정된 경계 조건을 사용하는 슬랩 기하학에서의 확산식에 대한 값은 발광원(114) 더하기 영상 발생원(118)으로부터의 부분값을 합계하여 얻어지며(도 9B에 나타난 것과 같음), 깊이 (d)에서 점 발광원 (P)(watts)에 대한표면(표면에 수직한 관측)에서의 다음의 방사 식을 얻는다.
여기에서,이고, ρ는 슬랩 표면위의 반경이고,
이고, Reff는 유효 반사 계수로 조직에 대해 약 0.43이다.
표면 방사값을 ρ에 대한 함수로써 플롯팅하는 것은 도 10B에서 실선으로 나타낸 플롯을 제공하며, 도 3B에서의 점선으로 나타낸 광-강도 프로파일 플롯과 동일하게 유도된다.
혼탁 매질중의 발광점에 대한 공간 프로파일 곡선은 또한 계산적으로 훨씬 더 강한 몽테 카를로 시뮬레이션을 사용하여 계산될 수 있으며, 도 10A에서 예시한 바와 같이 램덤 웍을 통한 각각의 광자를 뒤따른다. 도 10B에서 "+" 기호로 나타낸 몽테 카를로 시뮬레이션은 환산 식으로부터 계산된 공간 프로파일에 가깝게 대응된다.
확산식이 다양한 조직 및 다양한 깊이를 통해 광자 확산을 모델링하는데 어떻게 사용되는지를 예시하기 위해, 공간 프로파일은 다양한 값 μeff을 계산하고,μeff=11cm-1에 대해 μs및 μ's는 각각2.0 및 20cm-1; μeff=3.5cm-1에 대해 각각 0.4 및 10cm-1에; μeff=0.87cm-1에 대해 0.05 및 5cm-1에 대응한다. μa에 대한 세 값은 청색, 녹색 및 적색 파장에 대한 조직 흡수와 대략적으로 대응한다.
도 11A 및 11B에서의 플롯은 강도가 감소하고 깊이 증가와 함께 점 폭이 증가함을 나타내며, 큰 μeff값은 보다 좁은 점 폭과 함께 피크강도의 큰 감소를 야기한다.
V.깊이 및 크기 정보 결정
발명의 방법을 실행할 때, 상기에서 상세화된 바와 같이 대상자를 먼저 처리하여 표적 발광원에 광 방출 분자를 국소화시키도록 한다. 다음으로 대상자는 장치(20)의 광-패쇄 챔버내의 선택 위치에 놓여지며(대상자 크기로 적당하게 축적됨), 광학 시스템을 조정하여 발광원과 검출 렌즈사이에서의 대상자의 표면 영역에서 발광원으로부터의 광 방출 사건을 측정하도록 한다. 선택된 광학상의 투시에서 고정된 대상자로, 역시 상기에서 설명한 바와 같이, 표면 광 방출에 대한 광-강도 공간 프로파일을 얻는다. 도 3A는 표면하 발광원으로부터 측정된 광 강도에 대한 표면 맵으로, 이어서 도 3B에서 나타낸 공간 프로파일을 발생시키는데 사용된다.
다음으로 공간 프로파일(s)은 파라미터-기초한 생체광자 함수에 대응되며, 발광원의 깊이(일부 경우에, 발광원 크기)와 광 방출 강도를 관련시켜 발광원 깊이(일부 경우에, 발광원 크기)에 대한 초기 결정을 얻는다. 하나의 바람직한 생체광자 함수는 상기 부분 Ⅳ에서 설명된 간략화된 확산 모델로부터 유도된 것으로, 여기에서 점 발광원, 또는, 한정된 구 또는 타원체 부피를 갖는 발광원으로부터의 광 강도는 발광원 깊이, 고정된 산란 및 흡수 계수, 및 발광원으로부터의 표면 거리 r에 대한 함수로써 계산된다. 레벤버그 마르콰르트("Numerical Recipes in C", Press et a/., eds, Cambridge Press, NY, 1989)와 같은, 종래의 비-선형 최소 제곱 곡선 적합 기술이 곡선 적합에 적당하다. 곡선 적합은 도 3에 나타난 바와 같이, 단일 1차원("1-D") 프로파일, 복수의 그같은 프로파일, 또는 전체 2-D 공간 분포(예를 들면, 도 12A에서 나타난 바와 같음)을 사용하여 행해질 수 있다. 도 3B(파선)에서 나타낸 데이터에 대한 곡선 적합 계산값은 2.7mm의 깊이를 나타내며, 계산된 실제 깊이 2.2mm와 매우 잘 비교된다.
도 12A-12C는 공간 프로파일로부터 깊이 및 크기 정보를 어떻게 결정하는지에 대한 또 다른 예이다. 여기서 발광원은 수평 및 수직 방향으로 각각 2.7mm 및 3.2mm의 실제 치수 및 종양 두께 1.5mm를 갖는 피하 타원형 종양이다. 수평 및 수직 프로파일(각각 도 12 B 및 12C)은 각각 1.3 및 2.4의 수평 및 수직 치수, 1.5mm의 두께, 및 0.4mm의 깊이를 갖는 타원형 발광원에 대해 발생된 곡선과 적합된다.
초기 곡선 적합으로부터 발광원 깊이(선택적으로, 발광원 크기) 결정은 세분될 수 있으며, 추가의 데이터를 사용하여 발광원 크기는 근사화되며, 그 영향은 생체광자 함수의 파라미터를 세분하는 것이다. 세분된 깊이 및 발광원-크기 정보를 제공하는, 추가의 데이터의 성질 및 예를 들어, 깊이 및 크기와 같은 생물 광자 함수의 파라미터를 세분하는 방법은, 이제 도 2에 대해, 상기의 부분 Ⅱ에서 강조된정보 타입 각각에 대해 고려될 것이다.
A. 2차-관찰 정보. 2차-관찰 데이터를 얻기위해 대상자는 또 다른 투시로부터 발광원을 관찰하기 위한 관찰 및 검출 렌즈에 대해 회전된다. 이 제 2투시로부터, 제 2광 강도 프로파일이 얻어지며, 이는 제 2 대상자 표면 영역에 대해 제 2깊이 결정을 제공한다. 두개의 다른 표면 위치에서 발광원 깊이에 대한 교차점을 결정함으로써, 보다 정확한 깊이 및/또는 발광원 크기가 결정될 수 있다. 얻어지는 관찰이 많을 수록 보다 정확한 깊이 및 발광원 크기가 결정될 수 있다.
B. 분광 데이터.각 파장범위에서의 광은 깊이에 대한 함수로써 다른 파장 범위에서의 광과는 다르게 신체 영역을 통해 투과할 때, (i) 둘 이상의 파장 범위에서 표적이 광을 방출하도록 야기하고, (ii)신체 영역의 표면에서, 신체 영역을 통한 각각의 범위의 광투과에서의 차이와 비교함으로써 신체 영역내의 표적의 깊이가 결정되거나, 또는 표적 깊이가 세분될 수 있다.
(지시된 파장에서 총 광 강도를 나타내는)전형적인 분광 곡선은 발광원 깊이에 대한 함수로써 도 4A에 나타내어져 있으며, 상기 설명되었다. 특히 도 4B에서 나타난 바와 같이(여기에서 피크는 시험관내 분광 곡선에 축적된다), 약 600nm이상, 예를 들면 620nm에서의 피크 높이대 시험관내(0-깊이) 피크 높이, 예를 들면 500nm에서의 비는 깊이에 대한 함수로써 급격하게 증가한다. 따라서, 분광 곡선을 발생시키고 피크 높이에 대한 비를 결정함으로써, 대표적으로 600nm이상 및 이하, 예를 들면 620nm: 500nm, 혼탁 조직에서의 강도의 파장-의존적 손실에 근거한 정확한 깊이 정보가 결정될 수 있다.
분광 측정기로부터 근사적인 깊이를 결정하는데 유용한 식은 다음과 같이 식 4로부터 유도될 수 있다:
여기에서, d는 깊이를 나타내고, φ는 측정된 광 강도를 나타내고, μeff는 경험적으로 결정된 유효 계수의 감소를 나타내며, D는 경험적으로 결정된 확산 계수이다. 상기 식에서 아래첨자 1 및 2는 측정이 이루어진 두개의 분리 파장을 말한다.
상기 식을 사용하여, 깊이는 다른 파장 또는 파장 범위에서의 둘 이상의 광 강도 측정으로부터 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 깊이는 다음의 일련의 단계: (1) 두 파장에서 생체내(동물에서) 뿐만 아니라 시험관내에서 생물발광 세포를 영상화하는 단계; (2) 각각의 영상에 대해 예를 들면 피크 강도 또는 평균(적분된)강도를 측정함으로써 영상을 정량화하는 단계; (3) 각각의 파장에서 생체내 영상 데이터 대 시험관내 영상 데이터의 비를 계산하는 단계; 및 (4) 식 7과, 예를 들어 조직 성질 측정으로부터 얻어진 유효 산란 계수 μeff를 사용하여 깊이를 계산하는 단계를 실행함으로써 얻어질 수 있다. 이 시도의 적용은 실시예 1에 예시되어 있다.
일 구체예에서, 각각의 μeff에 대해 현저하게 다른 값을 갖는 것이 바람직하다. 동물 조직은 헤모글로빈의 존재로 인해 μeff에서의 그 같은 차를 제공하며, 이는 600nm이하에만 큰 흡수 피크를, 600nm 이상에서 상대적으로 낮은 흡수를 갖는다.
선택적으로, 추가의 분광 데이터는 하나 이상의 선택 파장 또는 파장 범위에서 얻어진 하나 이상의 공간 프로파일을 포함할 수도 있다. 다음으로 프로파일(s)은 도 3B에 대해 상기에서 설명된 바와 같이, 흡수, 산란, 및/또는 유효 계수에 대한 파장-특정 값을 사용하여, 예를 들어 상기의 광자 확산 모델로부터 발생된 모델 강도 함수와 비교된다.
그러나, 또다른 적용에서, 강도값은 매 20nm로 일정한 간격을 유지한 불연속의 파장에서 측정될 수 있다. 도 13A에서의 분광 플롯은 PBS 용액중의 세포에서의 녹색 루시페라제와, 도 13B에서 지적된 피하의 위치에서 및 도 13C에서 나타난 바과 같은 폐에서 국소화된 녹색 루시페라제에 대한 분광 곡선을 나타낸다. 모든 곡선은 700nm에서 1의 값으로 표준화된다. 560nm 대 620nm에서의 강도비는 깊이에 대한 표시이다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명에 대한 관련 양태는 대상자에서의 발광원의 깊이를 결정하는 방법을 제공한다. 방법을 실행하는데, 대상자에서의 광 방출 강도는 약 400 및 약 1000nm 사이의 둘 이상의 다른 파장에서 이루어진다. 발광원의 깊이는 측정된 광-방광 강도, 및 대상자의 광학 성질에 관련된 정보, 예를 들면, 대상자에서 지연 및 확산 계수를 사용하여 결정된다.
대상자에서의 지연 및 확산 계수와 같은 광학 성질에 관련한 정보는 대상자의 것과 동일하거나 유사한 재료에서의 계수의 직접 측정으로 얻어질 수도 있다.이 정보는 시험관내(0깊이) 및 생체내(측정되는 깊이)에서 두 파장에서의 측정된 강도와 조합하여 식 7에 적용되어, 상기에서 설명하고 실시예 1에서 예시한 바와 같이, 광 발광원의 깊이를 결정하도록 한다.
선택적으로, 광학 성질 정보는 둘 이상의 다른 파장에서의 대상자의 것에 해당하는 조직 또는 재료에서 두 이상의 복수의 깊이 각각에 위치한 발광원으로부터의 광 강도를 측정함으로써 간접적으로 얻어질 수 있다. 다음으로 원하는 깊이 결정은 측정된 광 강도 예를 들면, 다른 파장에서의 강도 비를 복수의 깊이 각각에서 결정된 광 강도와 대응시킴으로써 이루어진다. 보다 특이적인 시도에서, 발광원으로부터의 광 강도에 대한 분광 프로파일은 복수의 깊이 각각에서 발광원으로부터의 광 강도에 대한 복수의 분광 프로파일 각각과 비교(대응)될 수도 있다.
C. 전신 투과도 데이터. 전신 투과도 데이터는 상기에서 설명된 바와 같이, 그리고 작은 동물 대상자에 대한 도 5, 6A 및 6B에서 예시된 바와 같이 얻어진다. 상기에서 언급된 바와 같이, 정보는 선택 조직 또는 기지의 두께를 갖는 조직을 통한 파장 의존적 광-투과 값을 제공한다. 대상자에서 다수의 선택 위치에서의 예정된 투과도 데이터는, 측정된 공간 프로파일에 곡선을 대응시키는데 사용되는, 전체 가시광 스펙트럼에 대해 또는 선택 파장에서 모델링된 공간 프로파일을 세분할 목적으로, 다른 대상자 위치들에서의 평균 전신 산란 및 흡수 계수를 계산하는데 사용될 수 있다.
D. 조직 성질 데이터.도 7A-7D에서 나타난 것과 같이, 조직 특성 데이터는 주요 신체 조직 각각에 대해 대표적으로 파장 의존적 흡수 및 산란 계수를 포함한다. 이 데이터는 예를 들어, 광자 확산에 대한 상기 모델에 사용되어, 소정의 파장, 대표적으로 적색 파장에서 소정의 조직을 통한 광투과에 의해 생성되는 공간 프로파일을 세분한다. 따라서, 예를 들어, 대상자에서 발광원이 근육일 경우, 공간 프로파일은 적색 파장에서 얻어지고, 조직-특이적 및 파장-특이적 흡수 계수와 함께 발생된 세분된 공간 프로파일은 측정된 곡선과 곡선 적합을 위해 세분된 공간 프로파일 곡선을 제공할 것이다.
E. 시뮬레이션 데이터.또다른 구체예에서, 시험 점 또는 반대로 기지-모양 발광원이 혼탁 조직을 시뮬레이션하는 블록 또는 슬랩내로 도입될 수도 있다. 블록은 대상자에서 발광원 조건을 시뮬레이션하도록 다양한 산란 및 확산 계수, 및 다양한 모양으로 준비될 수 있다. 시험 점에 대한 위치에 따라, 분광 프로파일이 시험 점이 놓여지는 신체 영역의 외부 표면으로부터 얻어질 수도 있다. 다음으로, 이 데이터는 시험 점의 실제 깊이 및 위치와 관련된다. 블록내에서 점에서 점으로 시험 점을 이동함으로써, 일련의 분광 측정이 이루어질 수 있다. 일련의 분광측정으로부터, 데이터 파일이 대상자내의 다른 영역들에 대응하는 분광 반응을 모델링하도록 조립될 수 있다.
F. 적분된 광 강도
상기에서 언급한 바와 같이, 합계되거나 또는 적분된 광-강도는 검출기 배열의 전체 또는 일부 한정된 구역에 대해 합계된 광 강도를 말한다. 적분된 광 강도는 식 5의 적분과 비교되어 발광원 깊이 및 휘도에 대한 또 다른 계산값을 제공할 수 있다. 이 정보는 프로파일 정보와 함께 사용될 수 있다. 적분된 광 강도는 또한다중 파장에 대해서도 계산될 수 있다.
G. 보정-강도 데이터. 보정 강도 데이터의 부재시에, 강도 측정은 카메라에서 카메라로 다양화될 수도 있고, 측정된 값은 관찰 분야, 상자에 넣기(binning), 시간 및 f-정지와 같은 변수들에 의존할 것이다.
절대 보정 강도(상기 부분 Ⅲ)는, 실제 피크 값에 대한 곡선 적합을 근거로, 깊이-대-발광원 결정을 세분하도록 하고 상기 부분 Ⅲ에서 설명된 바와 같은, 조직에서 생물 발광 세포수를 계산하도록 한다.
다른 구체예에서, 발명은 다른 영상 데이터들를 강도 및 공간 분포 데이터와의 적분을 제공하여, 대상자 및 그 안에 위치한 표적에 대한 보다 상세한 3차원 지도를 생성하도록 한다. 예를 들어, 상기에서 설명한 바와 같은 수집된 특징적인 광 투과 데이터는, 3차원 계수화된 "영상" 또는 적분 시스템을 형성하는 MRI 영상의 적층된 슬라이스와 같은 다른 3차원 영상 시스템으로부터 유도된 적분 시스템과 얽혀질 수도 있다. 다음으로 그같은 적분 시스템은 표적을 확인하기 위한 대상자의 해부적 구조를 보다 양호하게 예시하기 위해 사용될 수도 있다. 대상자가 랫트와 같은 연구용 동물인 경우, 그 같은 동물은 소정의 변형에 대해 서로 구조적으로 매우 동일하다. 그러므로, 적분 데이터, 분광 데이터 및 공간 강도 패턴 파일은 상업적인 매각인에 의해 개발될 수도 있고, 도 1에서 나타난 바와 같은 간략화된 검출기와 함께 사용을 위해 팔릴 수도 있다. 3차원 정보가 데이터 파일로서 공급되는 경우, 다음으로 사용자 장치는 3차원 스캐닝 및 지도화를 위해 장착될 필요가 없다. 상기 설명된 방법 및 장치에서 고려된 2차원 영상은 매각인에 의해 제공된 3차원 데이터와 조합되어 대상자 내의 표적의 크기, 모양, 깊이, 국소 해부학 및 위치에 대한 완전한 3차원 정보를 얻을 수 있다.
다음의 실시예는 예시이지, 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1
두개의 파장 분광 영상을 사용한 광 방출 대상자의 깊이 계산하기.
도 13A에 나타난 분광 정보를 세포에 대해 피하 주사된 동물(도 13B) 및 그것의 폐에 표지된 세포를 갖는 동물(도 13C)에서 루시페라제-표지 세표의 깊이를 계산하는데 사용하였다. 분석은 다음의 단계: (i) 생물 발광 세포를 생체내 및 시험관내에서 600nm 및 640nm에서 영상화하는 단계; (ii) 각각의 영상에 대한 평균 강도를 측정하여 영상을 정량화하는 단계; (iii) 각 파장에서 생체내 영상 데이터 대 시험관내 영상 데이터의 비를 측정하는 단계; 및 (iv) 식 7 및 도 7에서의 흡수 및 산란 계수로부터 평균 유효 산란 계수 μeff를 사용하여 깊이를 계산하는 단계를 사용하여 600nm 및 640nm와 동일한 파장에서의 데이터를 사용하여 수행하였다
피하 세포에 대해, 생체내 대 세험관내 강도(상대적인 강도 또는 φ)의 비는 600nm 및 640nm에서 각각 0.35 및 0.75 이었다. 폐 신호에 대해, 이들 동일한 비는 0.05 및 0.47이었다. 600nm에서 μa=0.25mm-1및 μs'=1.0mm-1, 640nm에서 μa=0.05mm-1및 μs'=1.0mm-1를 사용하여 600nm에서 μeff=0.97mm-1및 640nm에서 0.4mm-1가 되었다. 확산 계수 D값은 600 nm 및 640 nm에서 각각 0.27 mm 및 0.32mm었다. 아래에서 재생성된 식 6내에 이들 수를 치환하여,
(이 경우에, 아래첨자 1은 600nm를 말하고 아래첨자 2는 640nm를 말한다)
피하 및 폐 깊이에 대해 각각 d = 1.6 mm 및 d = 4.0 mm가 되었다.
본 발명은 특징적인 구체예 및 적용에 대해 설명되어 있지만, 본 발명을 벗어남없이 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음은 명백할 것이다.

Claims (35)

  1. (a) 광검출기 장치로 제1 투시로부터 (i) 발광원으로부터 유래하고, (ii) 대상자의 혼탁한 생물학적 조직을 통해 이동하고, (iii) 대상자의 관심있는 제1 표면 영역으로부터 방출되는 광자를 측정함으로써 구성된 제1의 측정된 광 강도 프로파일을 얻는 단계;
    (b) 상기 제1의 측정된 광 강도 프로파일을 파라미터에 기초한 생체광자 함수에 적합시키는 단계; 및
    (c) 상기 제1의 측정된 광 강도 프로파일 이외의 데이터를 사용하여 생체광자 함수의 파라미터를 세분하여 대상자에서 발광원의 대략의 깊이 및 크기를 얻는 단계
    를 포함하는, 대상자에서 발광원의 위치 및 크기를 조사하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세분하는 단계는 대상자의 표면으로부터 방출된 광자의 파장에 관한 데이터의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 대상자에서 발광원의 깊이를 조사하는데 사용하며, 여기서 상기 세분하는 단계는 (a) 약 400nm와 약 1000nm 사이의 두가지 이상의 다른 파장에서 대상자로부터 광 방출 강도를 측정하는 단계, (b) 대상자의 조직에서 광학 성질에 관한 정보를 얻는 단계, 및 (c) 측정된 광 강도 및 얻어진 정보를 사용하여발광원의 깊이를 세분하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (a), (b), 및 (c)는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 프로토콜에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
    A. 단계 (b)는 대상자의 것에 해당하는 조직 또는 물질에서 지연 및 확산 계수를 측정하는 것을 포함하고, 단계 (c)는 공식에서 상기 계수들을 사용하여 상기 발광원의 깊이를 추정하는 것을 포함한다;
    B. 단계 (b)는 대상자의 것에 해당하는 조직 또는 물질에서 다수의 깊이 각각에 위치된 발광원으로부터 광 강도를 두가지 이상의 다른 파장에서 결정함으로써 수행되고, 단계 (c)는 측정된 광 강도를 다수의 깊이 각각에서 결정된 광 강도와 대응시킴으로써 수행된다;
    C. 단계 (a)는 발광원으로부터 광 강도의 스펙트럼 프로파일을 측정하는 것을 포함하고, 단계 (b)는 다수의 깊이 각각에서 발광원으로부터 광 강도의 스펙트럼 프로파일을 결정함으로써 수행되며, 단계 (c)는 측정된 프로파일을 결정된 프로파일과 적합시킴으로써 수행되고, 이로써 최상의 곡선 적합을 확인한다; 및
    D. 단계 (a)는 다른 파장에서 광 강도 프로파일을 측정하는 것을 포함한다.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세분하는 단계는 상기 대상자로부터 측정된 데이터의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 세분하는 단계는 제2의 측정된 광 강도 프로파일로부터 얻어진 데이터의 사용을 포함하며, 상기 제2의 프로파일은 상기 광검출기 장치로 제2 투시로부터 (i) 발광원으로부터 유래하고, (ii) 대상자의 혼탁한 생물학적 조직을 통해 이동하고, (iii) 대상자의 관심있는 제2 표면 영역으로부터 방출되는 광자를 측정함으로써 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 데이터를 얻는 단계는 (i) 관심있는 제1 표면 영역으로부터의 총 광 강도를 측정하는 단계, (ii) 측정된 광 강도 값을 점-발광원의 깊이의 함수로서 발생된 총 발광값과 비교함으로써 조직-영역 깊이, 크기, 및 휘도를 추정하는 단계를 포함하며, 여기서 총 발광값은 신체 표면 아래에 있는 한정된 크기, 형태 및/또는 깊이의 광원으로부터의 광자-확산의 모델로부터 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 세분하는 단계는 혼탁 매질에서 발광원으로부터 광의 확산에 대한 컴퓨터 시뮬레이션으로부터 얻어진 데이터의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 컴퓨터 시뮬레이션은 광자 확산 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세분하는 단계는 (i) 생물학적 조직의 것들과 유사한 흡수 및 산란 성질을 갖는 혼탁 매질을 통해, 다수의 크기 및 형태 중 한가지를 갖는 다수의 깊이 중 한가지에 위치된 발광원으로부터 광자 확산의 모델을 기초로 한 다수의 이론적 광 강도 프로파일을 발생시키는 단계, (ii) 상기 다수의 이론적 광 강도 프로파일 각각과 제1의 측정된 광 강도 프로파일간의 적합의 질을 비교하는 단계, (iii) 제1의 측정된 광 강도 프로파일에 최상의 적합을 제공하는 이론적 광 강도 프로파일을 선택하는 단계, 및 (iv) (iii)에서 선택된 이론적 광 강도 프로파일로부터 파라미터를 사용하여 대상자에서 발광원의 대략적 깊이, 형태 및 휘도를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 적합의 질을 비교하는 단계는 최소 자승 알고리듬을 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 적합의 질을 비교하는 단계는 유전적 알고리듬을 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 발생시키는 단계는 광자 산란 모델에서 상기 광자가 이동하는 조직에 해당하는 하나 이상의 정해진 조직-특이적 광 산란 계수를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 발광원은 발광 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 발광원은 형광 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 발광원은 상기 측정 단계 전에 대상자에 투여되고 대상자의 선택된 표적에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 발광원은 광발생 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 광발생 단백질은 상기 대상자의 생물학적 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 광발생 단백질은 상기 대상자에 투여된 생물학적 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 대상자에서 발광원의 대략적 깊이 및 형태를 사용하고, 대상자의 영상 위에 시각적 표현을 겹쳐서, 상기 발광원의 시각적 표현을 발생시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 영상은 2-차원 영상인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 영상은 3-차원 영상인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 대상자로부터의 광 방출 사건이 검출될 수 있는 광밀 엔클로져,
    엔클로져내의 제1의 투시로부터 (i) 발광원으로부터 유래하고, (ii) 대상자의 혼탁한 생물학적 조직을 통해 이동하고, (iii) 대상자의 관심있는 제1 표면 영역으로부터 방출되는 광자를 측정함으로써 구성된 제1의 광 강도 프로파일을 얻는데 사용하기 위한 엔클로져내에 함유된 광학 시스템; 및
    (i) 상기 제1의 측정된 광 강도 프로파일을 파라미터 기초의 생체광자 함수와 적합시키고; (ii) 상기 제1의 측정된 광 강도 프로파일 이외의 데이터를 사용하여 생체광자 함수의 파라미터를 세분하여 대상자에서 발광원의 대략적 깊이, 형태, 및 휘도를 발생시키기 위한 광 검출기에 조작가능하게 연결된 계산 장치
    를 포함하는, 대상자에서 발광원의 위치 및 크기를 조사하는데 사용하기 위한 장치.
  24. 제 23 항에 있어서, 광학 시스템은 냉각 조건에서 조작될 수 있는 전하-커플링된 장치(CCD), 및 CCD 위에 광을 집중하기 위한 렌즈를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  25. 제 24 항에 있어서, 광학 시스템은 대상자의 관심있는 다수의 다른 선택된 표면 영역으로부터 방출된 광자를 검출하도록 설계된 것을 특징으로 하는 장치.
  26. 제 23 항에 있어서, 광학 시스템은 약 400nm에서 800nm 사이의 두가지 이상의 다른 선택된 파장 범위내에서 광자-방출 강도를 측정하는데 사용하기 위한, 다른 선택된 파장 범위내에서 광자를 투과하기 위한 하나 이상의 파장 필터를 포함하며, 계산 장치는 다음의 파라미터 세분 연산들 중 적어도 한가지를 수행하도록 조작가능한 것을 특징으로 하는 장치.
    (i) 다른 파장에서 측정된 상대 광 강도를 결정하고, 결정된 상대 광 강도를 조직 깊이의 함수로서 상기 다른 파장에서의 기지의 상대 신호 강도와 비교하는 단계; 및
    (ii) 측정된 스펙트럼을 조직내 여러 깊이에 놓인 발광원으로부터 측정된 다수의 스펙트럼과 비교하고, 측정된 스펙트럼을 기지의 스펙트럼과 대응시키는 것으로부터 광 방출 표적 영역의 깊이를 결정하는 단계.
  27. 제 23 항에 있어서, 상기 계산 장치는 모델 대상자의 모델 신체 영역내의 모델 표적의 광 방출의 크기, 형태, 및/또는 깊이의 함수로서 선택된 파장 범위들내에서 방출된 광의 공간 분포에 관한 정해진 공간 분포 정보를 함유하는 데이터 파일을 포함하며, 이 장치는 (i) 제1의 광 강도 프로파일의 스펙트럼 특징들을 데이터베이스에 함유된 것들과 비교하는 일을 수행하는데서 기능하는 것을 특징으로 하는 장치.
  28. 제 23 항에 있어서, 계산 장치는 강도패턴 영상을 단일 강도 값으로 적분하고, 특정 크기 및 형태의 발광원의 함수로서 발생된 적분된 광 강도 값들에 의해 광원 크기를 추정하도록 조작가능한 것을 특징으로 하는 장치.
  29. 제 23 항에 있어서, 상기 계산 장치는 생물학적 조직의 것들과 유사한 흡수 및 산란 성질을 갖는 혼탁 매질을 통해, 다수의 크기 및 형태 중 한가지를 갖는 다수의 깊이 중 한가지에 위치된 백열광원으로부터 광자 확산의 모델을 기초로 한 다수의 이론적 광 강도 프로파일을 함유하는 데이터 베이스를 포함하며, 이 장치는 (i) 상기 다수의 이론적 광 강도 프로파일 각각과 제1의 측정된 광 강도 프로파일간의 적합의 질을 비교하고, (ii) 제1의 측정된 광 강도 프로파일에 최상의 적합을 제공하는 이론적 광 강도 프로파일을 선택하고, 그리고 (iii) (ii)에서 선택된 이론적 광 강도 프로파일로부터 파라미터를 사용하여 대상자에서 발광원의 대략적 깊이 및 형태를 얻도록 조작가능한 것을 특징으로 하는 장치.
  30. 제 23 항에 있어서, 계산 장치는 대상자에서 발광원의 대략적 깊이 및 형태를 사용하고, 대상자의 2- 또는 3-차원 영상 위에 시각적 표현을 겹쳐서, 상기 발광원의 시각 2-, 또는 3-차원 표현을 발생시키도록 조작가능한 것을 특징으로 하는 장치.
  31. 제 1 항에 있어서, 상기 얻는 단계는 절대 강도 값을 얻는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. (a) 약 400과 약 1000nm 사이의 두가지 이상의 다른 파장들에서 대상자로부터의 광방출 강도를 측정하는 단계;
    (b) 대상자의 조직의 광학적 성질들에 관한 정보를 얻는 단계; 및
    (c) 측정된 광 강도 및 얻어진 정보를 사용하여 발광원의 깊이를 결정하는 단계
    를 포함하는, 대상자의 조직에서 발광원의 깊이를 결정하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 단계 (a)는 두가지 다른 파장 각각에서 광 강도를 측정함으로써 수행되고, 단계 (b)는 대상자의 것에 해당하는 조직 또는 물질에서 지연 및 확산 계수를 측정하는 것을 포함하며, 단계 (c)는 공식에서 상기 계수들을 사용하여 상기 발광원의 깊이를 추정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 단계 (b)는 대상자의 것에 해당하는 조직 또는 물질에서 다수의 깊이 각각에 위치된 발광원으로부터 광 강도를 두가지 이상의 다른 파장에서 결정함으로써 수행되고, 단계 (c)는 측정된 광 강도를 다수의 깊이 각각에서 결정된 기준 광 강도와 대응시킴으로서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 단계 (a)는 발광원으로부터 광 강도의 스펙트럼 프로파일을 측정하는 것을 포함하고, 단계 (b)는 다수의 깊이 각각에서 발광원으로부터 광 강도의 스펙트럼 프로파일을 결정함으로써 수행되며, 단계 (c)는 측정된 프로파일을 결정된 프로파일과 대응시킴으로써 수행되며, 이로써 최상의 곡선 적합을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
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