ES2232935T3

ES2232935T3 - Obtencion de imagenes de tejidos dispersores de la luz con agentes de contraste fluorescentes.

Info

Publication number: ES2232935T3
Application number: ES98907392T
Authority: ES
Inventors: Eva Sevick-Muraca; Tamara L. Troy; Jeffrey S. Reynolds
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-02-06
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2018-02-06
Also published as: EP1011422B1; EP1011422A4; WO1998034533A1; DE69827505T2; JP3958798B2; DE69827505D1; JP2002511778A; EP1011422A1; AU6320798A

Abstract

Método que comprende los pasos de: seleccionar un agente de contraste fluorescente en función de un tiempo de vuelo predeterminado para un tejido del que deben ser obtenidas imágenes de acuerdo con una expresión matemática que modeliza el comportamiento de la luz múltiplemente dispersa que viaja a través del tejido, teniendo el agente de contraste fluorescente un tiempo de vida de la fluorescencia situado dentro de un factor de diez del tiempo de vuelo predeterminado; y prever el agente de contraste fluorescente seleccionado para su introducción en el tejido.

Description

Obtención de imágenes de tejidos dispersores de la luz con agentes de contraste fluorescentes.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la obtención espectroscópica de imágenes de tejido heterogéneo dispersor de la luz, y más en particular pero no exclusivamente se refiere a la obtención de imágenes in vivo transformando una característica de fluorescencia del tejido.

La detección temprana de la enfermedad permite que sea de esperar que resulte más eficaz la intervención terapéutica. En los últimos años han sido desarrolladas técnicas no invasivas que han hecho que mejore la capacidad de establecer una diagnosis fiable y temprana de varias afecciones a base de detectar cambios bioquímicos sobrevenidos en el tejido de un paciente. Por ejemplo, la Obtención de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI) ha venido sirviendo para supervisar con éxito la relajación de los estados de los espines de los núcleos paramagnéticos a fin de lograr una obtención de imágenes biomédicas y una espectroscopia bioquímica de los tejidos. Desgraciadamente, la complejidad y el coste de la diagnosis mediante MRI limitan su disponibilidad, especialmente como medio de control rutinario de las enfermedades.

Otra potente técnica analítica que cuenta con una número creciente de aplicaciones en las ciencias biológicas es la espectroscopia de fluorescencia. Las aplicaciones de la espectroscopia de fluorescencia incluyen la diagnosis biomédica, la secuenciación genética y la citometría de flujo. Como ejemplifican las Patentes U.S. Núms. 5.421.337 concedida a Richards-Kortum et al. y 5.452.723 concedida a Wu et al., varios investigadoras han sugerido varios procedimientos que sirven para diferenciar los tejidos enfermos de los normales y están basados en las emisiones de fluorescencia y se ejecutan mediante mediciones externas no invasivas o técnicas de medición endoscópica mínimamente invasivas. Por desgracia, estos procedimientos no logran en general proporcionar un procedimiento viable de obtención de imágenes espaciales. Una razón por la cual la obtención de imágenes basada en la fluorescencia ha seguido siendo difícil de lograr es la de que resulta difícil obtener de un medio aleatorio múltiplemente dispersor tal como un tejido significativas mediciones relacionales de características de fluorescencia. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia, que es función de la concentración o "captación" de compuesto fluorescente (o fluoróforo), es una posible candidata para la obtención de imágenes; si bien, cuando esta propiedad es usada en un medio ópticamente denso, tal como una suspensión de particulado (células), un polvo o un tejido, las propiedades de absorción y dispersión local confunden las intensidades de fluorescencia medidas.

Además de la intensidad, otras propiedades de los fluoróforos seleccionados, tales como el tiempo de vida y el rendimiento cuántico de la fluorescencia, son también sensibles al entorno bioquímico local. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "rendimiento cuántico de la fluorescencia" significa el número fraccionario de fotones de fluorescencia emitidos para cada fotón de excitación absorbido, o la fracción de eventos de desintegración que redundan en la emisión de un fotón de fluorescencia. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "tiempo de vida de la fluorescencia" está definida como el tiempo medio de supervivencia del fluoróforo activado, o el tiempo medio que transcurre entre la absorción de un fotón de excitación y la emisión de un fotón de fluorescencia. Al igual como la intensidad, la medición de estas características de fluorescencia se ve a menudo limitada a aplicaciones in vitro perfectamente definidas en el laboratorio de investigación o en citometría de flujo, donde pueden controlarse o medirse cuestiones tales como la dispersión, la absorción y las concentraciones de fluoróforo variables. Además, estas limitaciones excluyen en general la posibilidad de lograr una significativa obtención de imágenes basada en la fluorescencia para heterogeneidades tisulares ocultas tales como tumores u otras regiones tisulares enfermas que no pueden ser detectados o detectadas mediante inspección visual.

Con el desarrollo de técnicas para interrogar tejidos usando fluorescencia en el régimen de longitudes de onda del infrarrojo cercano (NIR), puede ser también posible la detección no invasiva de tejidos enfermos situados en profundidad dentro de tejidos normales puesto que la luz de emisión y de excitación del NIR puede recorrer considerables distancias hasta y desde la zona interfacial entre el tejido y el aire. Se citan como adicionales antecedentes relativos a la interrogación por NIR las Patentes U.S. Números 5.213.105 concedida a Gratton et al. y 5.353.799 concedida a Chance. Como en el caso de las modalidades de obtención de imágenes por MRI, rayos X, tomografía computerizada y ultrasonidos, hay posibilidad de mejorar las técnicas de obtención de imágenes por fluorescencia de NIR con agentes de contraste. Típicamente, los agentes de contraste para la obtención de imágenes in vivo han venido dependiendo de la captación preferente en el tejido enfermo para proporcionar el deseado mejoramiento de la obtención de imágenes mediante la absorción de la radiación de interrogación. El tejido absorbedor de la luz proporciona una acrecentada variación espacial de la intensidad medida de la radiación para así mejorar el contraste de imagen. En el caso de un agente de contraste fluorescente, la intensidad de luz fluorescente emitida en respuesta a la absorción puede proporcionar esta variación de intensidad. En general, cuanto mayor es la diferencia de variación espacial que viene impuesta artificialmente por un agente de contraste, tanto más mejorada es la imagen reconstruida de los tejidos interiores. Sin embargo, la eficacia de los agentes de contraste exógenos depende en gran medida de la selectividad del agente para con la región tisular de interés. Desgraciadamente, el suministro dirigido a un objetivo y específico de sitio de drogas y agentes de contraste ha venido siendo históricamente un factor limitativo tanto en la terapéutica como en la obtención de imágenes para diagnosis. En consecuencia, serían ventajosos mecanismos adicionales para inducir el contraste que no dependan exclusivamente de la selectividad tisular del agente.

La publicación de patente WO 36/26431 se ocupa de un método que comprende los pasos de seleccionar un agente de contraste fluorescente que tenga un tiempo de vida de la fluorescencia situado dentro de un factor de diez de un tiempo de vuelo predeterminado, y prever el agente de contraste fluorescente seleccionado para su introducción en el tejido.

Por consiguiente, sigue habiendo necesidad de una técnica que pueda ser utilizada para obtener de manera no invasiva imágenes de tejido múltiplemente dispersor sobre la base de una o varias características de fluorescencia. Preferiblemente, esta técnica incluye la implementación de agentes de contraste exógenos con propiedades de mejoramiento de las imágenes que van más allá de la absorción preferencial de la radiación de interrogación. La presente invención satisface esta necesidad y aporta otras ventajas.

Breve exposición de la invención

La presente invención se refiere a la obtención de imágenes espectroscópicas de materiales heterogéneos dispersores de la luz. Varios aspectos de la invención son novedosos y no obvios, y aportan varias ventajas. Si bien lo que es de hecho la naturaleza de la invención de la que aquí se trata puede determinarse tan sólo haciendo referencia a las reivindicaciones adjuntas, se describen brevemente a continuación determinadas características que son distintivas de la presente invención.

Una característica de la presente invención es una técnica para la obtención de imágenes de un material heterogéneo dispersor de la luz. Esta técnica incluye los pasos de exponer la superficie de un material a la luz procedente de una fuente luminosa y detectar una emisión producida en respuesta a ello. Se determina con un procesador como función de la emisión una variación espacial de una característica de fluorescencia del material. La variación espacial puede estar caracterizada por un conjunto de valores representativos de la característica de fluorescencia como función de posición. Es generada una imagen de acuerdo con la variación espacial que corresponde a la composición heterogénea del material. Esta técnica puede ser aplicada in vivo a tejido biológico usando instrumentación externa o endoscópica para detectar heterogeneidades indicativas de enfermedad. La técnica puede incluir la introducción de un agente de contraste fluorescente en el material. La característica de fluorescencia detectada puede ser el tiempo de vida de la fluorescencia, el rendimiento cuántico de la fluorescencia, el coeficiente de absorción de un fluoróforo, la producción de fluorescencia (que es función del rendimiento cuántico de la fluorescencia y de la absorción del fluoróforo) u otra característica de fluorescencia que sea conocida para los expertos en la materia.

Otra característica incluye la introducción de un agente de contraste fluorescente en una tejido biológico. Este agente de contraste tiene un tiempo de vida predeterminado, y el tejido dispersa múltiplemente la luz con un tiempo de vuelo medio entre eventos de dispersión. El tiempo de vida y el tiempo de vuelo medio están dentro de un factor de aproximadamente diez uno de otro. El tejido es expuesto a una luz de excitación con una predeterminada intensidad variable en el tiempo, y es detectada una emisión de luz producida desde el tejido en respuesta a esta exposición. Es generada una imagen del tejido transformando la variación espacial de un nivel de una característica de fluorescencia del tejido a partir de la emisión de luz de acuerdo con una relación matemática que modeliza el comportamiento de dispersión múltiple de la luz del tejido.

En una característica adicional, el agente puede ser seleccionado de acuerdo con una relación predeterminada entre el grado de contraste de imagen y al menos uno de los miembros del grupo que consta de la producción de fluorescencia y del tiempo de vida de la fluorescencia. Preferiblemente, el tiempo de vida está situado dentro de una gama de tiempos de vida que va desde aproximadamente 0,1 hasta 10 nanosegundos (nseg.). Una gama más preferida es la que va desde 0,5 hasta 5 nseg. Una gama aún más preferida es la que va desde aproximadamente 0,2 hasta 2 nseg. Un valor preferido en grado sumo para el tiempo de vida es el de aproximadamente 1 nseg.

Una característica adicional incluye la evaluación de la capacidad de los de una serie de agentes fluorescentes para proporcionar contraste de imagen entre distintos tipos de tejido. Esta evaluación incluye el paso de determinar una relación entre el grado de contraste de imagen y al menos uno de los miembros del grupo que consta del tiempo de vida de la fluorescencia y de la producción de fluorescencia del agente. Se selecciona uno de los agentes sobre la base de la evaluación. Se prevé el agente seleccionado para su introducción en un tejido biológico para mejorar la obtención de imágenes llevada a cabo de acuerdo con una expresión matemática que modeliza el comportamiento de la luz dispersada múltiplemente que pasa a través del tejido.

En otra característica adicional, se expone un tejido biológico a una primera luz de excitación y se detecta una primera emisión del tejido en respuesta a la primera luz de excitación. Se introduce un agente de contraste fluorescente en el tejido después de esta detección, y se expone entonces al tejido a una segunda luz de excitación. Se detecta una segunda emisión en respuesta a la segunda luz de excitación. Los datos correspondientes a la primera emisión se comparan con los datos correspondientes a la segunda emisión para evaluar el contraste proporcionado por el agente. El contraste puede ser determinado como función de al menos uno de los miembros del grupo que consta del tiempo de vida de la fluorescencia, la producción de fluorescencia o el rendimiento cuántico. Para una forma de dominio de frecuencia de esta evaluación, el contraste de imagen puede ser evaluado en términos del contraste de fase o del contraste de modulación. Además, la longitud de onda de la primera luz de excitación puede ser seleccionada para que sea en general la misma como la longitud de onda de la luz fluorescente emitida por el agente en respuesta a la segunda luz de excitación.

En consecuencia, un objeto de la presente invención consiste en transformar una propiedad de fluorescencia de un material dispersor de luz que varía con la composición heterogénea del material para generar una imagen correspondiente.

Otro objeto de la presente invención es el de aportar una técnica espectroscópica para controlar de manera no invasiva propiedades de fluorescencia de volúmenes tisulares ocultos en un organismo viviente y para controlar metabolitos seleccionados de un organismo in vivo.

Otro objeto adicional es el de aportar una técnica para seleccionar y diseñar agentes de contraste fluorescentes que mejoran el contraste para la obtención de imágenes basada en la migración de fotones. Esta técnica puede incluir la selección de propiedades de acrecentamiento del contraste que no dependen exclusivamente de la captación.

A la luz de los dibujos y de la descripción que están contenidos en la presente quedarán de manifiesto adicionales objetos, características, aspectos, beneficios y ventajas de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una ilustración esquemática de un sistema de una realización de la presente invención.

La Fig. 2 es un diagrama de flujo de un proceso que utiliza el sistema de la Fig. 1.

La Fig. 3 es una representación esquemática de un sistema que constituye un fantasma de tejido y es usado para demostrar varios aspectos de la presente invención.

Las Figs. 4-7 ilustran gráficamente propiedades seleccionadas de ecuaciones usadas en la presente invención.

Las Figs. 8 y 9 ilustran gráficamente la convergencia de determinaciones simuladas de la variación espacial del tiempo de vida y de la producción de fluorescencia, respectivamente, utilizando una realización de la presente invención.

Las Figs. 10-14 son imágenes en escala de grises generadas por ordenador obtenidas de los ejemplos experimentales 1-3 de la presente invención.

La Fig. 15 es una ilustración esquemática de un sistema de una realización alternativa de la presente invención.

La Fig. 16 es una vista esquemática de otro sistema que constituye un fantasma de tejido de la presente invención.

La Fig. 17A es un gráfico de mediciones simuladas del desplazamiento de fase (eje vertical) en función de la posición angular del detector (eje horizontal) para comparar un agente de contraste con un tiempo de vida de 1 nanosegundo (nseg.) (línea continua con símbolos en blanco) con un agente de contraste con un tiempo de vida de 1 milisegundo (mseg.) (línea de trazos con símbolos en negro); siendo los agentes de contraste selectivos para con una heterogeneidad y correspondiendo cada uno de los distintos tipos de línea a posiciones de la heterogeneidad de 10 milímetros (mm), 20 mm, 30 mm, 40 mm y 50 mm.

La Fig. 17B es un gráfico de mediciones simuladas de la amplitud de modulación (eje vertical) en función de la posición angular del detector (eje horizontal) para comparar un agente de contraste con un tiempo de vida de 1 nseg. (línea continua con símbolos en blanco) con un agente de contraste con un tiempo de vida de 1 mseg. (línea de trazos con símbolos en negro); siendo los agentes de contraste selectivos para con una heterogeneidad y correspondiendo cada uno de los distintos tipos de línea a posiciones de la heterogeneidad de 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm y 50 mm.

La Fig. 18A es un gráfico de mediciones simuladas del contraste de fase (eje vertical) en función de la posición del detector (eje horizontal) y de la ubicación de una heterogeneidad (correspondiendo los distintos tipos de línea a las posiciones de 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm y 50 mm); conteniendo la heterogeneidad un agente de contraste emisor de luz que tiene una captación en la heterogeneidad de 100:1 y un tiempo de vida 1 nseg.

La Fig. 18B es un gráfico de mediciones simuladas del contraste de fase (eje vertical) en función de la posición del detector (eje horizontal) y de la ubicación de una heterogeneidad (correspondiendo los distintos tipos de línea a las posiciones de 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm y 50 mm); conteniendo la heterogeneidad un agente de contraste emisor de luz que tiene una captación en la heterogeneidad de 100:1 y un tiempo de vida de 1 mseg.

La Fig. 18C es un gráfico de mediciones simuladas del contraste de modulación (eje vertical) en función de la posición del detector (eje horizontal) y de la ubicación de una heterogeneidad (correspondiendo los distintos tipos de línea a las posiciones de 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm y 50 mm); conteniendo la heterogeneidad un agente de contraste emisor de luz que tiene una captación en la heterogeneidad de 100:1 y un tiempo de vida de 1 nseg.

La Fig. 18D es un gráfico de mediciones simuladas del contraste de modulación (eje vertical) en función de la posición del detector (eje horizontal) y de la ubicación de una heterogeneidad (correspondiendo los distintos tipos de línea a las posiciones de 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm y 50 mm); conteniendo la heterogeneidad un agente de contraste emisor de luz que tiene una captación en la heterogeneidad de 100:1 y un tiempo de vida de 1 mseg.

La Fig. 19A es un gráfico de mediciones experimentales del contraste de fase (eje vertical) de la luz de emisión en función de la posición del detector (eje horizontal) y de la ubicación de la heterogeneidad (correspondiendo los distintos tipos de línea a 10 mm, 20 mm, 30 mm y 40 mm) para una captación de 100:1 de un agente de contraste de ICG (ICG = verde de indocianina) en la heterogeneidad.

La Fig. 19B es un gráfico de mediciones experimentales del contraste de fase (eje vertical) de la luz de emisión en función de la posición del detector (eje horizontal) y de la ubicación de la heterogeneidad (correspondiendo los diferentes tipos de línea a 10 mm, 20 mm, 30 mm y 40 mm) para una captación de 100:1 de un agente de contraste de Ru(bpy)_{3}^{2+} en la heterogeneidad.

La Fig. 20A es un gráfico que compara mediciones de absorción (símbolos en blanco) y mediciones de fluorescencia (símbolos en negro) en términos del contraste de fase (eje vertical) referido a la situación de la heterogeneidad (objeto) en centímetros (cm) (eje horizontal) para un agente de contraste de ICG a frecuencias de modulación de 80 y 160 megahertzios (MHz) (diferentes formas de los símbolos).

La Fig. 20B es un gráfico que compara mediciones de absorción (símbolos en blanco) y mediciones de fluorescencia (símbolos en negro) en términos del contraste de modulación (eje vertical) referido a la situación de la heterogeneidad (eje horizontal) para un agente de contraste de ICG a frecuencias de modulación de 80 y 160 megahertzios (MHz) (diferentes formas de los símbolos).

La Fig. 20C es un gráfico que compara mediciones de absorción (símbolos en blanco) y mediciones de fluorescencia (símbolos en negro) en términos del contraste de fase (eje vertical) referido a la situación de la heterogeneidad (eje horizontal) para un agente de contraste de DTTCI (DTTCI = yoduro de 3-3'-dietiltiatricarbocianina) a frecuencias de modulación de 80 y 160 megahertzios (MHz) (diferentes formas de los símbolos).

La Fig. 20D es un gráfico que compara mediciones de absorción (símbolos en blanco) y mediciones de fluorescencia (símbolos en negro) en términos del contraste de modulación (eje vertical) referido a la situación de la heterogeneidad (eje horizontal) para un agente de contraste de DTTCI a frecuencias de modulación de 80 y 160 megahertzios (MHz) (diferentes formas de los símbolos).

Las Figs. 21A-21D son imágenes en escala de grises generadas por ordenador formadas a partir de mediciones experimentales que ilustran la variación espacial para un fantasma de tejido que incluye heterogeneidades por ICG y DTTCI separadas en términos de desplazamiento de fase de modulación, amplitud de modulación de c.a., intensidad de c.c. media y relación de modulación (c.a./c.c.), respectivamente.

Las Figs. 22A-22D son imágenes en escala de grises generadas por ordenador que ilustran la variación espacial para la obtención de imágenes de tejido in vivo de un perro tratado con un agente de contraste de ICG en términos de desplazamiento de fase de modulación, relación de modulación (c.a./c.c.), intensidad de c.c. media y amplitud de modulación de c.a., respectivamente.

Descripción de realizaciones preferidas

A efectos de facilitar la comprensión de los principios de la invención, se hará a continuación referencia a las realizaciones que están ilustradas en los dibujos, y se usará un lenguaje específico para describirlas. Se entenderá sin embargo que no se pretende con ello establecer limitación alguna del alcance de la invención. Se contemplan todas aquellas alteraciones y adicionales modificaciones de las técnicas, los métodos, los sistemas y los dispositivos que se describen y todas aquellas adicionales aplicaciones de los principios de la invención aquí descrita que se le ocurrirían normalmente a un experto en la materia a la que se refiere la invención.

La Fig. 1 ilustra el sistema 110 de la presente invención para la obtención de imágenes por fluorescencia del tejido 100. El tejido 100 tiene la superficie 101 y una composición heterogénea como la representada por las zonas 102, 103 que subyacen bajo la superficie 101. Las heterogeneidades 102, 103 no son en general detectables mediante una inspección visual de la superficie 101.

El sistema 110 incluye la fuente de luz modulada 120 para suministrar una luz de excitación de intensidad modulada de una predeterminada frecuencia y longitud de onda al tejido 100 a través de la fibra óptica 123. Preferiblemente, la fuente 120 es un diodo láser de diseño convencional con una salida modulada dentro de la gama de frecuencias de 1-500 MHz y una salida monocromática situada dentro de la gama de longitudes de onda de 100 a 1000 nanómetros (nm). La longitud de onda específica es seleccionada para excitar un fluoróforo designado en el tejido 100. Puede emplearse el divisor de haz 126 para dirigir una pequeña parte de la señal de excitación al sensor de referencia 128 a efectos de procesamiento.

El sistema 110 también incluye el subsistema de detección 140, que tiene fibras ópticas 143 para detectar los fotones emitidos desde el tejido 100 desde los de una serie de correspondientes sitios de detección. El subsistema 140 incluye uno o varios sensores de emisión 148. El subsistema de detección 140 también incluye un filtro de interferencia para obtener una longitud de onda de emisión seleccionada correspondiente a la emisión de un fluoróforo designado en el tejido 100. En una realización, el subsistema 140 incluye un solo sensor 148, y las señales de las fibras 143 son multiplexadas. Preferiblemente, los sensores 128, 148 son Tubos Fotomultiplicadores (PMTs) o detectores de fotodiodos, pero se contemplan también otras variedades de sensores tales como los intensificadores de imagen y los dispositivos de acoplo de carga.

Los sensores 128, 148 y la fuente 120 están acoplados operativamente al subsistema heterodino 130. El subsistema 130 está configurado para obtener información acerca de la fase y de la intensidad de c.a. y de c.c. de la luz detectada con el sensor 128 en relación con la luz detectada con el sensor 148 usando técnicas de heterodinación convencionales. En una realización, el subsistema heterodino 130 incluye un sintetizador de señales que está en enganche de fase con la frecuencia de repetición de un láser usado para la fuente 120. Para esta realización, el subsistema 130 incluye un amplificador para modular la ganancia de los sensores 128, 148 a una armónica de una frecuencia de repetición del láser (cuando se use un láser pulsante) o a la frecuencia de modulación (cuando se use un diodo láser modulado) más una desviación para lograr la heterodinación deseada. En una variante de esta realización, una frecuencia de repetición del láser pulsante de 80 MHz es dividida hasta los 10 MHz e introducida en el sintetizador, y una desviación de heterodinación de 100 kHz es introducida en los amplificadores para los sensores 128, 148.

Los sensores 128, 148 están acoplados operativamente al procesador 160. El procesador 160 incluye el dispositivo de control/entrada 162, el dispositivo de salida 164 y la memoria 166. El procesador 160 puede ser un circuito electrónico que conste de uno o varios componentes. Análogamente, el procesador 160 puede constar de circuitería digital, circuitería analógica o ambas. Asimismo, el procesador 160 puede ser programable, una máquina de estado integrado, o una combinación híbrida de ambos. Preferiblemente, el dispositivo de entrada 162 es un teclado o control de entrada de una variedad convencional, y el dispositivo de salida 164 es una pantalla de vídeo basada en Tubo de Rayos Catódicos (CRT), una impresora u otro sistema de visualización de imágenes conocido para los expertos en la materia. La memoria 166 es preferiblemente de la variedad electrónica (p. ej. de estado sólido), magnética u óptica del tipo de las que están fácilmente disponibles para ser usadas con controladores o procesadores electrónicos. Además, la memoria 166 puede incluir una memoria de disco óptico (CD) (CD = disco compacto), soportes realizados en forma de disco flexible o disco duro electromagnético, o una combinación de éstos.

La Fig. 2 ilustra un modo de funcionamiento del sistema 110 como el proceso 210. El proceso 210 incluye los pasos de transformar la variación espacial de la producción de fluorescencia y del tiempo de vida de la fluorescencia con el procesador 160 y generar una señal de imagen de acuerdo con la transformación. El dispositivo de salida 164 está configurado para visualizar una imagen en respuesta a la señal de imagen. El proceso 210 comienza con el paso de introducir un agente de contraste fluorescente en el tejido 100 en la etapa 212. Este agente proporciona una fuente de emisión de fluorescencia para la detección por parte del subsistema 240. La configuración de la fuente luminosa 120 emisora de luz modulada, del subsistema heterodino 130 y del subsistema de detección 140 está diseñada para adaptarse a las propiedades de excitación y emisión del agente fluorescente seleccionado. En otras configuraciones pueden emplearse como alternativa o bien adicionalmente fluoróforos endógenos, y el sistema 110 se ajustará de acuerdo con ello.

En la etapa 214, la fuente luminosa 120 configurada de acuerdo con el fluoróforo seleccionado excita el tejido 100. En la etapa 216 son determinados a la frecuencia heterodina (o de desviación) la fase, el \theta_{obs} y el log de la intensidad de c.a., M_{obs}, de la emisión en cada sitio de detección "i" en relación con la luz de excitación de la fuente 120. Para un número "Di" de sitios de detección, se añade respectivamente el subíndice "i" a la intensidad de c.a. y a la fase detectada u observada: (\theta_{obs})_{i} y (M_{obs})_{i}. El procesador 160 almacena en la memoria 166 la correspondiente información de la fase y de la intensidad de c.a.

En la etapa 218 se establece una rejilla bidimensional para un área de tejido 100 seleccionada para la obtención de imágenes, y se establece con el subíndice "j" una matriz de puntos de rejilla. Se asigna en cada punto de rejilla j un valor de siembra uniforme para la producción de fluorescencia, y_{j}= (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}, y para el tiempo de vida de la fluorescencia, (\tau)_{j}. Estos valores son una suposición homogénea inicial de los valores de la producción y del tiempo de vida, que son modificados en etapas posteriores. La expresión "\eta" es el rendimiento cuántico del fluoróforo, que varía con la naturaleza del entorno del fluoróforo. La expresión "\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}}" es el coeficiente de absorción para el fluoróforo, y es el producto del coeficiente de extinción del fluoróforo sobre la base del log natural y la concentración del fluoróforo. Como resultado de ello, la producción, y = \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}}, se ve influenciada por el metabolismo circundante y por la captación del fluoróforo. La captación de determinados fluoróforos conocidos varía con el tipo y el estado del tejido huésped, proporcionando otra característica de fluorescencia que resulta útil para detectar la enfermedad. El contraste que es proporcionado por estas propiedades es en gran medida independiente de la concentración de fluoróforo. La estimación inicial de la producción de fluorescencia y del tiempo de vida de la fluorescencia es almacenada en la memoria 166 por el procesador 160 para ser usada más adelante.

Tras haber sido establecida esta estimación inicial de las características de fluorescencia de la producción, \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}}, y del tiempo de vida, \tau, se entra en el bucle de procesamiento 220 en la etapa 230. Preferiblemente, las etapas del bucle de procesamiento 220 son ejecutadas por el procesador 160 por medio de un soporte lógico informático preprogramado, de un soporte físico dedicado, o de una combinación de ambos según sea apropiado. Para ayudar a comprender los diversos aspectos matemáticos del proceso 210 y del bucle 220, véase la siguiente enumeración de las variables seleccionadas:

c: velocidad de la luz en el vacío;

D(r): coeficiente de difusión óptica;

Di: número de sitios de detección;

f: frecuencia de modulación;

l: matriz de identidad;

i: índice para sitio de detección;

J: matriz jacobiana que relaciona la sensibilidad en cada punto de rejilla, j, con la respuesta en cada sitio de detección;

j: índice para punto de rejilla;

J_{j,i}: elementos individuales de la matriz jacobiana J;

k: índice para fuente;

M: log de la intensidad de c.a. de la posición de luz fluorescente modulada;

m: índice para frecuencias de modulación múltiples;

n: índice de refracción medio;

r: situación (en dos o tres dimensiones);

Sk: número de fuentes luminosas emisoras de luz modulada;

S(r, \omega): término de la fuente para la luz modulada en la posición r y a la frecuencia \omega;

Letras griegas

\chi^{2}: función de mérito que representa el error de los mínimos cuadrados;

\Phi_{x}(r, \omega): número complejo que representa el flujo de fotones en el dominio de Frecuencia en la posición r y a la frecuencia \omega;

\eta: rendimiento cuántico de la sonda o del colorante fluorescente;

\mu_{a}: coeficiente de absorción medio;

\mu_{a_{m}}: coeficiente de absorción de la luz de fluorescencia por parte tanto de los cromóforos no fluorescentes como del fluoróforo;

\mu_{a_{x}}: coeficiente de absorción de la luz de excitación por parte tanto de los cromóforos no fluorescentes como del fluoróforo;

\mu_{a_{x \rightarrow c}}: coeficiente de adsorción debida a los cromóforos no fluorescentes

\mu_{a_{x \rightarrow m}}: coeficiente de adsorción de la luz de excitación por parte de los fluoróforos;

\mu'_{s}: coeficiente de dispersión efectivo;

\theta: desplazamiento de fase de una onda de luz modulada con respecto a otra;

\tau: tiempo de vida de la sonda activada o del colorante activado en el sitio r;

\omega: frecuencia de modulación angular, que viene dada por 2\pif;

Subíndices

obs: datos observados o experimentales;

x: luz de excitación; y

m: luz de emisión o fluorescencia.

En la etapa 230 se calcula la fase y la intensidad de c.a. relativa en cada sitio de detección "i" como función de las estimaciones iniciales de la producción y del tiempo de vida para cada punto de rejilla j. La intensidad y fase calculadas son representadas en cada sitio de detección i como (\theta_{m})_{i} y (M_{m})_{i}, respectivamente. Los valores para (\theta_{m})_{i} y (M_{m})_{i} son determinados usando la aproximación de la ecuación de difusión de la ecuación de transporte radiativo. La aproximación de la ecuación de difusión describe el transporte espacial y temporal de la luz en tejidos o medios múltiplemente dispersores. Puede usarse una ecuación de difusión en el dominio de la frecuencia acoplada para predecir las tasas de fluencia de excitación y de emisión, \Phi_{x}(r, \omega) y \Phi_{m}(r, \omega), respectivamente, en cualquier sitio r dentro de la rejilla seleccionada de tejido 100 por medio de las ecuaciones (1) y (2):

(1)\triangledown \cdot [D_{x} (r) \triangledown\Phi_{x} (r,\omega)]- [\mu_{a_{x}}(r)+i\omega/c_{n}]\Phi_{x} (r, \omega)+S_{x} (r, \omega) = 0

(2)\triangledown \cdot [D_{m} (r) \triangledown\Phi_{m} (r,\omega)]- [\mu_{a_{m}}(r)+i\omega/c_{n}]\Phi_{m} (r, \omega)+S_{m} (r, \omega) = 0

El término de la fuente para la luz de excitación S_{x}(r,\omega) es debido a la luz modulada sinusoidalmente a una frecuencia angular \omega = 2\pif, donde f está situada típicamente en la gama de frecuencias de los MHz. El primer término en ambas ecuaciones de difusión (1) y (2) representa el transporte difusivo o "de recorrido aleatorio" de la luz múltiplemente dispersada, siendo D_{x,m} el coeficiente de difusión óptica de la ecuación (3) que se indica a continuación:

(3)D_{x,m}=[3(\mu_{a_{x,m}} + \mu'_{s_{x,m}})]^{-1}

y \mu_{a} y \mu'_{s} son los coeficientes de absorción y de dispersión isotrópica, respectivamente, para el tejido 100, que es el medio de interés. Tiene lugar una dispersión múltiple de la luz cuando \mu'_{s} >> \mu_{a}; donde \mu_{a} indica la capacidad para absorber luz y \mu'_{s} indica la capacidad para dispersar la luz para un material determinado a una determinada longitud de onda. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "luz múltiplemente dispersada" hace referencia a la luz que recorre al menos cinco (5) veces el recorrido medio de dispersión isotrópica, definido como 1/\mu'_{s}.

Debido al hecho de que estas propiedades ópticas son dependientes de la longitud de onda de la luz, los coeficientes difieren en general para la luz de excitación procedente de la fuente 120 (subíndice x) y para la emisión de fluorescencia detectada con el subsistema 140 (subíndice m). El coeficiente de absorción total a la longitud de onda de excitación, \mu_{a_{x}}, es debido a las contribuciones de los cromóforos no fluorescentes así como de los fluoróforos que responden a la longitud de onda de excitación. El coeficiente de absorción total viene dado por la suma de los coeficientes de absorción que son debidos a los cromóforos no fluorescentes, \mu_{a_{x \rightarrow c}}, y a los fluoróforos \mu_{a_{x \rightarrow m}}. Puede suponerse en general que la absorción experimentada a la longitud de onda de fluorescencia es debida primariamente a los cromóforos no fluorescentes. La velocidad de la luz en el tejido es c_{n}=c/n, donde n es el índice de refracción medio. El término de la fuente para la emisión de fluorescencia es dependiente de la fluencia de la luz de excitación, \Phi_{x}(r, \omega), y viene dado por la ecuación (4) que se indica a continuación:

(4)S_{m} (r, \omega)=\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} (r) \Phi_{x} (r,\omega)[(1-i\omega\tau (r))/(1+\omega^{2}\tau (r)^{2})]

Este término surge de la transformada de Fourier del término del decaimiento de la fluorescencia en el dominio temporal a continuación de un impulso incidente de luz de excitación, donde: \tau es el tiempo de vida del fluoróforo, \eta es el rendimiento cuántico, y el coeficiente de absorción, \mu_{a_{x \rightarrow m}}, es el producto del coeficiente de extinción basado en el log natural y de la concentración del fluoróforo en el estado fundamental. Como se ha indicado anteriormente, el producto combinado, \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}}, recibe el nombre de producción de fluorescencia, y, y es proporcional a la fluencia de fluorescencia generada. La sustitución de la ecuación (4) en la ecuación (2) facilita la determinación de \Phi_{m} para cada punto de rejilla "j". La resolución de las ecuaciones de difusión (1) y (2) para el área bidimensional definida por los puntos de rejilla "j" puede ser fácilmente ampliada a tres dimensiones para estimar la variación espacial de una o varias características de fluorescencia en un volumen seleccionado, correspondiendo "r" a la situación en tres dimensiones.

Ambas ecuaciones de difusión (1) y (2) son ecuaciones elípticas complejas lineales que pueden ser resueltas como problemas de valores límite para las cantidades complejas \Phi_{x}(r, \omega) y \Phi_{m}(r, \omega). Esta resolución emplea el método de las diferencias finitas para crear correspondientes ecuaciones de diferencias finitas. Estas ecuaciones de diferencias son utilizadas para obtener una solución aproximada en cada punto de rejilla j. Este método de resolución está descrito en otros contextos en Fulton et al., Multigrid Method for Elliptic Problems, A Review, 114 American Meteorological Society pp. 943-59 (mayo 1986); y B.W. Pogue et al., Initial Assessment of a Simple System for Frequency Domain Diffuse Optical Tomography, 40 Physics in Medicine and Biology pp. 1709-1729 (1995). Un método preferido para llevar a cabo esta resolución es el de utilizar las rutinas MUDPACK descritas en Adams, J.C., MUDPACK: Multigrid Portable Fortran Software for the Efficient Solution of Linear Elliptic Partial Differential Equations, 34 App. Math Comp. p. 133 (1989). Para la resolución de las ecuaciones de difusión, se supone que \Phi_{m,x}(r, \omega) = 0 en la superficie 101 del tejido 100, siendo éste conocido como el estado del límite con fluencia cero. Hay que tener presente que pueden seleccionarse otros estados del límite, y que puede variarse en consecuencia el método de resolución.

Las ecuaciones de difusión (1) y (2) pueden ser resueltas para un número complejo para \Phi_{m} en cada punto de rejilla j. La señal detectada en la superficie es proporcional a la componente normal del gradiente de la fluencia de fotones. Para lograr una aproximación de la señal en el sitio detector "i" situado en la superficie 101 del tejido 100, se selecciona el valor \Phi_{m} en un punto de rejilla interno que es el más cercano al sitio, lo cual se sigue de la relación de que la componente normal del gradiente de la fluencia de fotones es proporcional a \Phi_{m} justo dentro de la superficie 101. El retardo de fase calculado, \theta_{m}, y el log de la intensidad de c.a., M_{m}, en los sitios de detección "Di" son calculados a partir de las partes imaginaria y real del valor complejo \Phi_{m} con respecto a la fase y a la intensidad de c.a. de la fuente 120.

Las ecuaciones de difusión (1) y (2) dan idea de la sensibilidad con la que una variación de las propiedades ópticas de fluorescencia del tejido 100 repercute en los valores \theta_{m} y M_{m} medidos en los sitios detectores i. Esta noción es el resultado de una serie de cálculos fijando varios parámetros de las ecuaciones de difusión (1) y (2). Estos cálculos suponen un fantasma de tejido circular 300 con una heterogeneidad 302 embebida en el mismo oculta en el fondo fantasma 303 como se ilustra en la Fig. 3. Se establece una rejilla bidimensional para el fantasma 300, y la misma puede ser fácilmente ampliada a tres dimensiones. Bajo estas condiciones simuladas, es asignado un gran valor a los coeficientes de absorción para la luz tanto de excitación como fluorescente en todos los puntos de rejilla fuera del fantasma de tejido simulado. Las cuatro fuentes S1-S4 de la Fig. 3 (Sk = 4) son simuladas asignando un número complejo arbitrario en un punto de rejilla cerca de la superficie más cercana a cada fuente. Los veinte sitios de detección D1-D20 de la Fig. 3 (Di = 20) son simulados usando los valores calculados determinados a partir de \Phi_{m} en el punto de rejilla "j" más cercano al sitio de detección. Las soluciones simuladas a las ecuaciones de difusión (1) y (2) fueron obtenidas en dos dimensiones para una rejilla de 65 x 65 que cubría un fantasma de tejido circular 300 de 100 mm de diámetro con una heterogeneidad circular embebida que tenía un diámetro de 30 mm y estaba situada en el centro del fantasma de tejido 300 (esta situación difiere ligeramente de la configuración de la heterogeneidad 302 de la Fig. 3). Se indican para 20 sitios de detección D1-D20 equidistantes y situados circunferencialmente las mediciones simuladas del desplazamiento de fase de fluorescencia y de la intensidad de c.a. Se estableció la frecuencia de modulación f igual a 150 MHz. Están indicadas en la siguiente Tabla 1 las propiedades ópticas de la heterogeneidad y del fondo:

TABLA 1

1

A fin de evaluar la influencia de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}}, fueron computados \theta_{m} y M_{m} en cada sitio de detección D1-D20 al ser el valor de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} en la heterogeneidad incrementado pasando de ser de 10^{-4} mm^{-1} a ser de 10^{-1} mm^{-1} y manteniéndose constante el valor de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} en el fondo 303. Se estableció el tiempo de vida \tau igual a 1 nseg. tanto para el objeto como para el fondo que ocasiona contraste debido a las diferencias en \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}}. Se muestran en las Figs. 4 y 5 respectivamente para una fuente activa S1 los registros gráficos de \theta_{m} y M_{m}. Al aumentar \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} de la heterogeneidad 102 alcanzando valores más altos, la intensidad de c.a. se acerca a un límite superior análogamente a lo que es de esperar en las soluciones diluidas no dispersoras. La Fig. 5 muestra cómo el desplazamiento de fase de la fluorescencia, \theta_{m}, disminuye al disminuir de 10 a 100 veces el fondo el coeficiente de absorción debido al fluoróforo, \mu_{a_{x \rightarrow m}}. A partir de estas simulaciones, M_{m} parece ser directamente dependiente de las variaciones de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} de una heterogeneidad de tejido simulada 102, mientras que \theta_{m} es indirectamente dependiente de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} debido a las variaciones de la migración de fotones.

A fin de evaluar la influencia de \tau, fueron calculados \theta_{m} y M_{m} en cada sitio de detección D1-D20 al variar los valores de \tau en la heterogeneidad pasando de 10^{-1} nseg. a 10^{3} nseg. y al mantenerse en 1 nseg. el valor de \tau en el fondo. Para \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} del fondo se estableció un valor de 10^{5} mm^{-1} y para \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} para la heterogeneidad se estableció un valor de 10^{-3} mm^{-1}. Como se muestra en la Fig. 6, la intensidad de c.a. detectada aumentada al disminuir \tau. La Fig. 7 ilustra los valores del desplazamiento de fase de fluorescencia en cada sitio de detección al ser el tiempo de vida de la heterogeneidad variado pasando de ser de 0,1 nseg. a ser de 1000 nseg. A una determinada frecuencia de modulación (de 150 MHz en este cálculo), \theta_{m} primeramente aumenta, alcanza un máximo y entonces disminuye a continuación al ser el \tau incrementado pasando de ser de 0,1 nseg. a ser de 1000 nseg. Por consiguiente, tanto \theta_{m} como M_{m} en cada sitio de detección D1-D20 parecen ser directamente influenciados por el valor del tiempo de vida en la heterogeneidad.

Haciendo de nuevo referencia a la Fig. 2, en la etapa 240 la fase y la intensidad de emisión calculadas, (\theta_{m})_{i} y (M_{m})_{i}, son comparadas con la fase y la intensidad de emisión medidas, (\theta_{obs})_{i} y (M_{obs})_{i}, para cada sitio de detección "i" para identificar una diferencia o "error" entre los valores medidos y los valores calculados. Debido al hecho de que (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j} incide en (M_{m})_{i}, esta comparación es formulada en forma de la función de mérito \chi_{\mu}^{2} de la ecuación (5) que se indica a continuación:

(5)\chi_{\mu}{}^{2}=(1/Sk) \sum\limits_{k=1}^{Sk} (1/Di) \sum\limits_{i=1}^{Di} [((M_{obs})_{i}-(M_{m})_{i}/\sigma_{M}]^{2}

donde \sigma_{M} es la típica desviación estándar del ruido en M_{m}, que se considera que es de 0,01; Sk = número de sitios de fuente de excitación con el índice k; y Di = número de sitios de detección con el índice i. La finalidad del algoritmo es la de minimizar \chi_{\mu}^{2} mediante las apropiadas actualizaciones de (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}. Tras una actualización inicial de (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}, otra función de mérito en términos de (\tau)_{j} participa en la comparación de la etapa 240. Esta función de mérito, \chi_{\mu}^{2}, es presentada como la ecuación (6) que se indica a continuación:

(6)\chi_{\tau}{}^{2}=(1/Sk) \sum\limits_{k=1}^{Sk}(1/Di) \sum\limits_{i=1}^{Di} [((M_{obs})_{i}-(M_{m})_{i}/\sigma_{M}]^{2} + [((\theta_{obs})_{i}- (\theta_{m})_{i})/\sigma_{\theta}]^{2}

donde \sigma_{\theta} es la típica desviación estándar del ruido en (\theta_{m})_{i}, que se considera que es de 1 grado; Sk = número de sitios de fuente de excitación con el índice k; y Di = número de sitios de detección con el índice i. Puesto que el tiempo de vida influencia tanto a (\theta_{m})_{i} como a (M_{m})_{i}, se usan en la ecuación (6) la fase y la intensidad de c.a.

Tras haber sido llevada a cabo la comparación de la etapa 240 calculando las funciones de mérito \chi_{\mu}^{2} y \chi_{\tau}^{2}, el control pasa a la etapa condicional 250 para comprobar si la comparación de los valores observados, (\theta_{obs})_{i} y (M_{obs})_{i},
con los valores calculados (\theta_{m})_{i} y (M_{m})_{i} por medio de las funciones de mérito satisface un criterio de convergencia seleccionado. Este criterio corresponde al grado de error tolerable en la determinación de los valores de la producción y del tiempo de vida. Para una realización, se alcanza la convergencia cuando cualquiera de las tres cantidades siguientes: (I) \chi^{2}, (II) variación de \chi^{2} en sucesivas iteraciones del bucle 220, o (III) variación relativa de \chi^{2} en sucesivas iteraciones del bucle 220 es menor que un predeterminado valor umbral de 1,0 x 10^{-5}. En otras realizaciones puede emplearse un distinto cálculo comparativo y una correspondiente comprobación condicional como los que se le ocurrirían a un experto en la materia. Si se satisface la condicional 250, el control pasa a la etapa 270, y se sale del bucle 220; pero sin embargo, si no se satisfacen los criterios, continua la ejecución del bucle 220 en la etapa 260.

En la etapa 260 son actualizados la producción, (y)_{j}= (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}, y el tiempo de vida, (\tau)_{j}, para cada punto de rejilla j para que estos valores puedan alcanzar el error mínimo correspondiente a la etapa de comparación 240 y a la comprobación condicional 250. A fin de actualizar estos valores se usan matrices jacobianas que describen la sensibilidad de la respuesta en cada sitio de detección i a las variaciones de (y)_{j}= (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}, y del tiempo de vida, (\tau)_{j}, en cada punto de rejilla j. Se emplean tres matrices jacobianas:

\overline{\upbar{J}}(M,\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}});

\hskip1.5cm

\overline{\upbar{J}}(M,\tau);

\hskip1.5cm

\overline{\upbar{J}}(\theta,\tau);

donde los elementos Ji, j de estas matrices jacobianas vienen dados por Ji,j = [\partialM_{i}/\partial(\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}]; Ji,j = [\partialM_{i}/\partial\tau_{j}]; y Ji,j = [\partial\theta/\partial\tau_{j}], respectivamente. Estos elementos pueden ser calculados resolviendo la difusión (1) y (2) cuatro veces para cada punto de rejilla j para obtener M_{m,i} y \theta_{m,i} calculados con (\tau)_{j} y (\tau+\partial\tau)_{j} y con (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j} y (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} + \partial\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}. A partir de la minimización de los mínimos cuadrados se calcula la actualización para la producción y el tiempo de vida. En una realización preferida, este algoritmo de actualización es adaptado a partir de un algoritmo que es usado para reconstruir imágenes obtenidas mediante tomografía por impedancia eléctrica y es análogo al algoritmo sugerido por Yorkey et al., Comparing reconstruction Algorithms for Electrical Impedance Tomography, 34 Transactions in Biomedical Engineering pp. 843-52 (1987). Las matrices jacobianas son usadas para resolver para los vectores de actualización [\overline{\Delta\eta\mu}_{a_{x \rightarrow m}}] y [\overline{\Delta\tau}] para la obtención de los vectores de producción y tiempo de vida estimados [\overline{\eta\mu}_{a_{x \rightarrow m}}] y [\overline{\tau}], respectivamente. Estos vectores son de una dimensión correspondiente al número de puntos de rejilla. En cada iteración mediante el bucle 220, las siguientes ecuaciones jacobianas (7) y (8) son resueltas para determinar la actualización para los vectores de producción y tiempo de vida estimados:

3

4

\overline{M}_{m_{obs}} y \overline{M}_{m} son los vectores observados y calculados del log de la intensidad de c.a. en cada uno de los i sitios de detección, respectivamente. \overline{\theta}_{m_{obs}} y \overline{\theta}_{m} son los vectores observados y calculados del retardo de fase en cada uno de los i sitios de detección, respectivamente. Debido a la naturaleza mal acondicionada de las matrices jacobianas, se añaden los términos \lambda_{1}I o \lambda_{2}I como parte de un sistema de minimización de Marquardt donde I es una matriz de identidad. Los parámetros \lambda_{1} o \lambda_{2} son ajustados mediante un algoritmo tipo Maquardt-Levenberg del tipo descrito en Press et al., Numerical Recipes: The Art of Scientific Computing, (Cambridge University Press, 1992). Se emplean métodos numéricos convencionales para resolver las ecuaciones algebraicas lineales simultáneas que resultan de las ecuaciones de matriz jacobiana (7) y (8). Las matrices jacobianas son recalculadas en cada iteración mediante el bucle 220. Se ha comprobado que las ecuaciones (7) y (8) proporcionan una manera de seleccionar las apropiadas variaciones de las estimaciones de la producción y del tiempo de vida; si bien se contemplan asimismo otros enfoques numéricos como los que se le ocurrirían a un experto en la materia para iterar recursivamente para la obtención de estimaciones aceptables. Una vez completada la actualización, el control regresa a la etapa 230,

Si los criterios de convergencia se satisfacen en la condicional 250, la estimación de la producción y del tiempo de vida para los puntos de rejilla ha alcanzado entonces un mínimo aceptable, y el control pasa a la etapa 270. En la etapa 270 es generada por el procesador 160 una imagen de señal a partir de la variación espacial de las características de fluorescencia en materia de producción y/o tiempo de vida. Esta imagen de señal es enviada al dispositivo de salida 164, que visualiza una imagen en respuesta a ello. Debido al hecho de que las características de fluorescencia de la producción y del tiempo de vida varían típicamente con el entorno biológico del fluoróforo, esta imagen es en general indicativa de una variación del tejido y proporciona la capacidad de detectar heterogeneidades 102, 103. Por ejemplo, pueden usarse para lograr un sistema de obtención de imágenes viable diodos láser capaces de suministrar luz del Infrarrojo Cercano (NIR) que puede atravesar varios centímetros el tejido, y agentes de contraste fluorescentes que respondan a la luz del NIR. En una realización, este sistema está adaptado para ser usado con un endoscopio.

Además de la producción y del tiempo de vida, puede ser transformada usando las ecuaciones de difusión (1) y (2) la variación espacial de otras características de fluorescencia que son útiles para distinguir los tejidos enfermos. Sin quedar limitadas a las mismas, tales características de fluorescencia que pueden ser usadas como alternativa incluyen el rendimiento cuántico \eta y/o el coeficiente de absorción de fluorescencia \mu_{a_{x \rightarrow m}} determinados como propiedades aparte que son independientes del producto de la producción.

Debe entenderse que la obtención de imágenes según la presente invención, tal como el proceso 210, incluye los pasos de exponer al tejido biológico en la zona interfacial entre el tejido y el aire a una luz de excitación y detectar la luz que se ha propagado hasta un detector situado a cierta distancia de la fuente en la zona interfacial entre el tejido y el aire. Se miden las características de propagación en dependencia del tiempo de la luz múltiplemente dispersa emitida en respuesta a esta exposición. Como se ha descrito en conexión con el proceso 210, para las mediciones en el dominio de frecuencia puede emplearse una fuente luminosa emisora de luz de intensidad modulada. La onda de propagación de la luz de intensidad modulada es de amplitud atenuada y tiene desplazamiento de fase en relación con la luz de excitación debido a la distribución espacial de las propiedades de fluorescencia. A partir de las mediciones exteriores del retardo de fase y de la modulación de la amplitud, se determinan las propiedades de fluorescencia interior usando una relación matemática que modeliza el comportamiento del tejido en materia de la múltiple dispersión de la luz, tales como las ecuaciones de difusión (1) y (2). Estas propiedades de fluorescencia pueden ser transformadas para obtener una correspondiente imagen interior del tejido que facilita la identificación de las heterogeneidades ocultas.

En una realización alternativa, las mediciones pueden ser efectuadas en el dominio temporal. Para esta realización, en la zona interfacial entre el tejido y el aire puede lanzarse un impulso de luz que es ensanchado durante su propagación en los tejidos debido a la variación espacial de las propiedades de fluorescencia dentro del tejido. Se mide el impulso ensanchado que es emitido desde la zona interfacial entre el tejido y el aire. Para esta realización, para calcular las características de fluorescencia puede utilizarse la ecuación de difusión en la forma correspondiente al dominio temporal, o aquella otra relación matemática que pudiera ocurrírsele a los expertos en la materia para caracterizar la propagación de la luz múltiplemente dispersa a través del tejido. Estas características pueden ser entonces transformadas para generar una correspondiente imagen de la manera que se ha descrito en conexión con el proceso 210.

Tanto la solución en el dominio de frecuencia como la solución en el dominio temporal dan cuenta de la propagación en el tiempo de la luz a través del tejido debido a múltiples eventos de dispersión. Para un fotón determinado, el tiempo de recorrido a través de un medio múltiplemente dispersor aumenta con el número de colisiones o "eventos de dispersión", lo cual corresponde a un recorrido de dispersión más largo. Este tiempo de recorrido es conocido como "tiempo de vuelo". Típicamente, el tiempo de vuelo es del orden de una fracción de un nanosegundo a unos pocos nanosegundos en tejido biológico. Para el caso habitual de muchos fotones que viajan cada uno siguiendo distintos recorridos de dispersión, puede determinarse a partir de las mediciones en el dominio de frecuencia o en el dominio temporal un "tiempo de vuelo" medio de los fotones. Estas mediciones basadas en el tiempo son utilizadas con el correspondiente modelo matemático para transformar las características de fluorescencia.

La transformación de las características de fluorescencia proporciona una imagen del tejido que puede estar basada tan sólo en los fluoróforos intrínsecos del tejido o puede ser mejorada mediante la introducción de un agente de contraste que sea selectivo para con los volúmenes de tejido de interés. Este agente de contraste puede absorber radiación como en el caso de los agentes de contraste para la obtención de imágenes por rayos X y por tomografía computerizada para producir un correspondiente oscurecimiento de las zonas de imagen para los volúmenes de tejido de interés. Desgraciadamente, el contraste que se logra mediante la absorción selectiva es limitado. En consecuencia, en otra realización de la presente invención se aporta una técnica para seleccionar agentes de contraste exógenos que aumenten los mecanismos de contraste convencionales. Se ha descubierto que las propiedades de fluorescencia que varían con el entorno bioquímico local a menudo proporcionan mayor contraste para la reconstrucción de volúmenes de tejido enfermo que puede lograrse mediante solamente el contraste basado en la absorción. Entre las propiedades que ofrecen este mecanismo de contraste con el entorno local se encuentran el tiempo de vida de la fluorescencia \tau, o sea el tiempo medio que transcurre entre la absorción de un fotón de excitación y la emisión de un fotón de fluorescencia; el rendimiento cuántico de la fluorescencia \eta, o sea el número de fotones de fluorescencia emitidos por fotón de excitación absorbido; y la producción cuántica de fluorescencia y.

Se ha descubierto que los agentes de contraste fluoróforos que tienen un tiempo de vida de la fluorescencia situado dentro de un orden de magnitud - o factor de diez (10) - del "tiempo de vuelo" de los fotones del tejido que se interroga resultan sorprendentemente ventajosos para proporcionar contraste para la obtención de imágenes basada en la migración de fotones. Una manera de aprovechar esta sorprendente ventaja es la de seleccionar un agente que tenga un tiempo de vida de la fluorescencia situado dentro de un factor de diez (10) del tiempo de vuelo medio predicho para el tejido del que deben ser obtenidas las imágenes. Típicamente, aplicando este principio se obtiene como resultado una gama de valores preferida para el tiempo de vida del agente de contraste de aproximadamente 0,1 a 10 nseg. Más preferiblemente, la gama de valores para el tiempo de vida de la fluorescencia del agente de contraste va desde aproximadamente 0,5 hasta 5 nseg. Una gama de valores aún más preferida para el tiempo de vida de la fluorescencia del agente es la que va desde aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 2 nseg. Un valor preferido en grado sumo para el tiempo de vida es el de aproximadamente 1 nseg.

Se ha descubierto también que las características de fluorescencia pueden influenciar la resolución de las mediciones de la emisión de luz detectada. Por ejemplo, en el dominio de frecuencia se ha comprobado que la amplitud de la luz fluorescente de intensidad modulada que emana de una heterogeneidad oculta que contiene el agente aumenta en general con la producción cuántica y o el rendimiento cuántico \eta. Además, al aumentar en relación con su entorno el tiempo de vida de la fluorescencia \tau dentro de la heterogeneidad, aumenta el contraste de fase. A la inversa, la amplitud de la luz de intensidad modulada detectada disminuye al aumentar dentro de la heterogeneidad en relación con su entorno el tiempo de vida de la fluorescencia \tau. Gracias a estos descubrimientos, puede seleccionarse o formularse un agente fluorescente que proporcione una deseada resolución de medición y un contraste del tiempo de vida de la fluorescencia adecuado para la interrogación de un sistema heterogéneo de tejido mediante migración de fotones. Estos descubrimientos están más ampliamente descritos en conexión con los Ejemplos 4-7 al final de esta descripción.

En general, como ilustran los Ejemplos 4-7, la selección o formulación de un adecuado agente de contraste es llevada a cabo a base de determinar la relación entre el contraste de imagen y propiedades de fluorescencia tales como el tiempo de vida, la producción o el rendimiento cuántico en función de la situación de una heterogeneidad selectiva para con el determinado agente de contraste. Estas relaciones pueden ser evaluadas para los de una serie de distintos agentes para seleccionar un agente preferido para un determinado problema de contraste. Para una evaluación basada en el dominio de frecuencia, el contraste de imagen pueden ser caracterizado en términos de la variación del desplazamiento de fase, de la variación de la modulación o de ambas. Además, el contraste de imagen puede ser acrecentado midiendo la respuesta de una muestra a una primera luz de excitación sin el agente para obtener una línea base (el caso de "ausencia"), y midiendo a continuación la respuesta a una segunda luz de excitación tras la introducción del agente (el caso de "presencia"). Los datos correspondientes a estas dos respuestas son comparados para evaluar la capacidad de contraste del agente. La longitud de onda de la primera luz de excitación puede ser seleccionada para estimular la respuesta fluorescente intrínseca del tejido a la misma longitud de onda que se prevé que estimule la fluorescencia del agente. Como alternativa, la longitud de onda de la primera luz de excitación puede ser la misma como para la luz de fluorescencia emitida por el agente para acrecentar la separación entre la fluorescencia intrínseca del tejido y la fluorescencia del agente. Pueden ser asimismo llevadas a cabo múltiples comparaciones usando distintas longitudes de onda, para así mejor evaluar la influencia del agente de contraste.

En otra realización de la presente invención, el proceso de estimación jacobiana y la ecuación de la fluencia de fotones son adaptados para determinar una transformación de una concentración de la captación del fluoróforo designado. Para esta realización se determina una primera aproximación de los coeficientes de adsorción del cromóforo \mu_{a_{x \rightarrow c}} y de los coeficientes de dispersión \mu'_{s} en ausencia del fluoróforo designado estimando el coeficiente de adsorción del cromóforo \mu_{a_{x \rightarrow c}} y el coeficiente de dispersión \mu'_{s} en cada punto de rejilla j en lugar de las estimaciones de la producción y del tiempo de vida. Para crear esta primera aproximación puede usarse la ecuación de difusión (1) para \Phi_{x}(r, \omega) en conjunción con las ecuaciones jacobianas modificadas (7) y (8). La modificación aplica los coeficientes de dispersión y adsorción del cromóforo en lugar de la producción y tras la adaptación para acomodar estas nuevas características de la manera siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

5

y

6

\vskip1.000000\baselineskip

Los elementos de las cuatro matrices jacobianas empleadas, \overline{\upbar{J}}(M_{x}, \mu_{a_{x \rightarrow c}}), \overline{\upbar{J}}(M_{x}, \mu_{s}), \overline{\upbar{J}}(\theta_{x}, \mu_{a_{x \rightarrow c}}), y \overline{\upbar{J}}(\theta_{x}, \mu_{x}) vienen dados por j_{i,j} = \frac{\partial M_{xi}}{\partial (\mu_{a_{x \rightarrow c}})_{j}}, j_{i,j} = \frac{\partial M_{xi}}{\partial\mu_{sj}}, j_{i,j} = \frac{\partial\theta_{xj}}{\partial (\mu_{s})_{j}} y j_{i,j} = \frac{\partial\theta_{xi}}{\partial (\mu_{a_{x \rightarrow c}})_{j}}, respectivamente. Fueron llevadas a cabo actualizaciones para la transformación de la dispersión y adsorción para minimizar la función de mérito \chi^{2}:

7

donde n_{s} = Sk y n_{d} = Di.

Tras haber sido generada la primera transformación, se introduce el agente de contraste fluorescente designado y se determina el coeficiente de adsorción total \mu_{a_{x}} aplicando \mu_{a_{x}} en lugar de \mu_{a_{x \rightarrow c}} en las ecuaciones (9)-(11) para obtener una segunda transformación del coeficiente de adsorción total. Tomando nota de que \mu_{a_{x}} = \mu_{a_{x \rightarrow m}} + \mu_{a_{x \rightarrow c}}, y de que la captación del agente de contraste fluorescente es directamente proporcional a \mu_{a_{x \rightarrow m}}, la concentración de la captación puede ser transformada determinando una diferencia entre las variaciones del coeficiente de adsorción para las transformaciones primera y segunda. Esta "transformación de la diferencia" puede ser entonces usada para generar una imagen correspondiente a la concentración de la captación.

Otra realización alternativa mide la emisión en respuesta a cada una de las de una serie de frecuencias f de modulación de la fuente luminosa. Se designa como Mf el número total de distintas frecuencias empleado. Para obtener estos datos adicionales, es llevada a cabo una iteración del bucle 220 para cada frecuencia f con el índice m. El número de fuentes Sk y de sitios de detección Di llevan los índices k e i, respectivamente. Estos datos adicionales pueden ser usados para mejorar los resultados de obtención de imágenes obtenidos con el sistema 110 o para permitir una reducción del número de sitios de detección o de sitios de fuente de excitación en la evaluación. Se presenta en la siguiente ecuación (12) una función de mérito representativa que corresponde a estos datos adicionales:

(12)\chi_{\tau}{}^{2}=(1/Mf) \sum\limits_{m=1}^{Mf} (1/Sk) \sum\limits_{k=1}^{Sk} (1/Di) \sum\limits_{i=1}^{Di} [((M_{obs})_{i}-(M_{m})_{i}/\sigma_{M}]^{2}+[((\theta_{obs})_{i}-(\theta_{m})_{i})/\sigma_{\theta}]^{2}

Además de la producción y del tiempo de vida de la fluorescencia, el método de multifrecuencia puede ser empleado para transformar otras características ópticas de interés. Además de para una fuente luminosa emisora de luz modulada sinusoidalmente, la presente invención puede ser adaptada para operar con una fuente luminosa emisora de luz de excitación pulsante o de otro de tipo variable con el tiempo en realizaciones alternativas.

La Fig. 15 ilustra un sistema óptico 410 de otra realización de la presente invención. Este sistema incluye la fuente luminosa 420 emisora de luz modulada con el excitador láser 422, el diodo láser 424 acoplado operativamente y el generador de frecuencia de referencia 426. La fuente 420 está configurada para suministrar luz modulada al fantasma de tejido 400, y la luz emitida desde el fantasma es enfocada sobre un intensificador de imagen de ganancia modulada con la lente 432 de 50 mm a través del filtro 433. El filtro 433 puede ser un sistema que constituya un filtro de banda o un filtro de paso bajo seleccionado para permitir el paso de una longitud de onda seleccionada. Típicamente, el filtro 433 está configurado para pasar al menos la longitud de onda de emisión fluorescente prevista, y puede estar adicionalmente o bien como alternativa configurado para pasar la longitud de onda de la luz de excitación. El intensificador 430 incluye una superficie de fotocátodo, que convierte los fotones en electrones, una Placa Multicanal (MCP) que multiplica la señal electrónica por multiplicación en avalancha, y una pantalla fosforescente que convierte los electrones en una imagen óptica. Preferiblemente, el intensificador 430 es un intensificador rápido, de la variedad fabricada por la Litton Electronics, Inc., que activa la modulación aplicando una polarización de c.c. y una señal de RF desde el amplificador 428 entre el fotocátodo y la MCP. Para este ejemplo, la modulación de la imagen del intensificador 430 es puesta en enganche de fase con el diodo láser 424 por medio de una señal de salida de 10 MHz del sintetizador 426. Modulando el diodo láser 424 y el intensificador de imagen 430 a la misma frecuencia, se obtiene como resultado de ello una imagen de estado estacionario en la pantalla de fósforo. La Patente U.S. Nº 5.213.105 concedida a Gratton et al. aporta antecedentes adicionales relativos a determinados aspectos de esta técnica. La imagen de la pantalla de fósforo es enfocada a través del filtro de interferencia 433 sobre una cámara 434 del tipo de un Dispositivo de Acoplo de Carga (CCD) por medio de la macrolente 436 de 150 mm. La cámara 434 tiene un conjunto de 512 x 512 detectores tipo CCD configurados para proporcionar una correspondiente imagen pixelada. La cámara 434 está acoplada operativamente al procesador 460, cuya configuración es similar a la del procesador 160 anteriormente descrito.

A continuación de cada imagen adquirida, es inducido un retardo de fase entre el intensificador de imagen 430 y el diodo láser 424 escalonando la fase del intensificador de imagen 430 a valores de entre 0 y 360 grados con el sintetizador de frecuencia 452 bajo el control del procesador 460. Puesto que la modulación de ganancia del intensificador de imagen 430 y del diodo láser 424 tiene lugar a la misma frecuencia, la homodinación redunda en una imagen fosforescente estacionaria en el intensificador 430 la cual es dependiente de la fase. Preferiblemente, el control entre el sintetizador 452 y el procesador 460 es obtenido mediante una interfaz tipo GPIB (GPIB = enlace común universal de acoplamiento mutuo) convencional. Las imágenes de la pantalla fosforescente del intensificador de imagen 430 son entonces reunidas en cada retardo de fase. Las imágenes con retardo de fase incremental son entonces usadas para generar una transformación de la relación de desplazamiento de fase y modulación de intensidad entre las luces de excitación y emitida del fantasma 400. Aplicando filtros de interferencia o apropiados filtros ópticos, la luz de emisión puede ser separada selectivamente de la luz de excitación y medida. La salida de la cámara 434 puede ser procesada por el procesador 460 usando el proceso 210.

En otras realizaciones se prefiere una fuente de iluminación de gran área para proporcionar una mayor iluminación frontal más uniforme en una geometría reflectiva. Esta forma de iluminación facilita una más rápida obtención de imágenes de múltiples vistas y una correlación física más natural entre las imágenes de migración de fotones y la patología. Asimismo se contempla una cámara que tenga un acoplador de fibra óptica de sección decreciente del intensificador de imagen al sistema CCD para incrementar la eficiencia del acoplamiento de la luz del intensificador al sistema CCD y reducir las dimensiones físicas y el peso del dispositivo de obtención de imágenes.

Se describe más ampliamente a continuación la presente invención haciendo referencia a los siguientes Ejemplos específicos 1-8. Se entenderá que estos ejemplos son de naturaleza ilustrativa y no limitativa. Los Ejemplos 1-4 suponen la simulación del proceso 210 por ordenador. Las simulaciones de este tipo, incluyendo la simulación del tejido, constituyen unos medios aceptables para demostrar a los expertos en la materia el comportamiento de la obtención de imágenes espectroscópicas por fluorescencia. Los Ejemplos 1-3 usan valores simulados obtenidos resolviendo las ecuaciones de difusión (1) y (2) para \theta_{m} y M_{m} bajo las condiciones de la siguiente tabla 2:

TABLA 2

8

Los ejemplos simulan el fantasma de tejido 300 de la Fig. 3 que tiene un diámetro de 100 mm. Los valores de \theta_{m} y M_{m} fueron computados en cada uno de los sitios de detección D1-D20 de la Fig. 3 en respuesta a las 4 fuentes luminosas S1-S4 emisoras de luz modulada situadas en la periferia. La frecuencia de modulación f de la luz de excitación fue simulada como de 150 MHz. Fueron resueltas las ecuaciones de difusión (1) y (2) para obtener 80 valores simulados de \theta_{m} y M_{m} correspondientes a las distintas combinaciones de sitios de detección y de fuente (Sk * Di = 4x20 = 80). Fueron superpuestos sobre las soluciones de las ecuaciones de difusión ruidos gausianos con una desviación estándar de 0,1 grados (o generosamente de 1 grado) en \theta_{m} y de un 1% en M_{m}. Se usaron rutinas MUDPACK adaptadas para resolver las ecuaciones de difusión (1) y (2) en un ordenador SunSparc10. Estos conjuntos de datos obtenidos fueron usados como datos de entrada simulados para ejecutar el proceso 210 para los Ejemplos
1-3. Los resultados están indicados en las Tablas 3 y 4 y son los siguientes:

TABLA 3

9

TABLA 4

10

Ejemplo 1

El Ejemplo 1 reconstruye la producción y el tiempo de vida de la fluorescencia sin absorción debido a los cromóforos no fluorescentes. Para simular los datos experimentales para este ejemplo, la producción de fluorescencia, (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}, para el fondo y la heterogeneidad 302 fue elegida como de 1 x 10^{-5} mm^{-1} y de 1 x 10^{-3} mm^{-1} respectivamente, y el tiempo de vida de la fluorescencia, (\tau)_{j}, para el fondo y la heterogeneidad fue elegido como de 10 nseg. y de 1 nseg., respectivamente. Durante la ejecución del bucle 220 se supuso que no se tenía un conocimiento a priori de la situación de la heterogeneidad 302 ni de las propiedades de fluorescencia del fondo, y se estableció una suposición uniforme de 1 x 10^{-5} mm^{-1} y de 10 nseg. para la producción de fluorescencia, (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j}, y el tiempo de vida, (\tau)_{j}, respectivamente. Se alcanzó la convergencia en menos de 50 iteraciones del Bucle 220 (tiempo de computación en un SunSparc10: 2 horas) para un rejilla bidimensional de 17 x 17. Los valores medios de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} y de \tau en los puntos de rejilla que ocupan el objeto simulado convergen en 50 iteraciones llegando a ser de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} = 0,93 x 10^{-3} mm^{-1} y de \tau = 1,03 nseg. como se ilustra en las Figs. 8 y 9, respectivamente. Las Figs. 10 y 11 ilustran las imágenes reconstruidas a partir de los valores transformados de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} [mm^{-1}] y \tau [nseg.], respectivamente, y son representativas de las imágenes previstas. Las imágenes fueron filtradas por interpolación en los ejemplos 1-3 para eliminar los puntos espurios que presentaban valores altos físicamente inalcanzables pero estaban rodeados por valores situados dentro de una gama de valores físicamente alcanzable. Estos valores espurios fueron sustituidos por la producción y el tiempo de vida de la fluorescencia medios del fondo obtenidos de la simulación del bucle 220.

Los valores medios de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} en los puntos de rejilla que ocupan el fondo simulado convergen en 50 iteraciones llegando a ser de 9 x 10^{-5} mm^{-1}. El valor del fondo converge llegando a ser de 5,4 nseg. La dependencia de las imágenes finales con respecto a la elección de la suposición inicial fue examinada estableciendo una suposición inicial uniforme de 1 x 10^{-4} mm^{-1} y de 10 nseg. para (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j} y el tiempo de vida (\tau)_{j}, respectivamente. Esto redundó en imágenes similares a las obtenidas en las Figs. 10 y 11.

El sitio de heterogeneidad 302 fue identificado como el sitio consistente en todos los puntos de rejilla con un valor \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} de más de un 35% (elegido arbitrariamente) del valor de pico de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} (Fig. 10). La media de las coordenadas de todos los puntos de rejilla del objeto identificado era el punto (60,8, 58,5), que es cercano al punto (60, 60) que fue usado para simular los datos experimentales. Como se indica en la Tabla 3, el área de la heterogeneidad basada en nuestra definición arbitraria para la identificación era de 72 mm^{2}, que se aproxima a la usada para generar nuestros datos experimentales simulados.

Ejemplo 2

El Ejemplo 2 reconstruye la producción de fluorescencia y el tiempo de vida de la fluorescencia con una absorción de cromóforo simulada configurada para imitar el tejido. Fueron usados la misma heterogeneidad oculta, los mismos parámetros ópticos y el mismo equipo de simulación como los descritos en el Ejemplo 1, exceptuando el hecho de que se usó para generar los datos experimentales simulados un coeficiente de absorción del cromóforo del fondo uniforme \mu_{a_{x \rightarrow}} de 1 x 10^{-3} mm^{-1}. Si bien no se empleó para la reconstrucción de la imagen la propagación de la luz de excitación, consideramos que esta propiedad óptica era conocida para estimar el mejor comportamiento posible para la reconstrucción de imagen inversa bajo condiciones fisiológicas. Se muestran respectivamente en las Figs. 12 y 13 las transformaciones espaciales reconstruidas bidimensionales de la producción de fluorescencia, (\eta\mu_{a_{x \rightarrow m}})_{j} [mm^{-1}], y del tiempo de vida, (\tau)_{j} [nseg.]. Como se indica en la Tabla 3, el valor medio de situación del objeto según nuestro criterio basado en \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} se dio como el punto (59,4, 58,3) en consonancia con las condiciones usadas para simular los datos experimentales. Las dimensiones de la heterogeneidad basadas en nuestra definición arbitraria para la identificación (todos los puntos de rejilla que tienen un valor \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} de más de un 35% del máximo) eran de 703 mm^{2}, el cual es un valor cercano al usado para generar nuestros datos experimentales simulados. Los valores medios de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} y de \tau en los puntos de rejilla que ocupan el objeto simulado convergen en 50 iteraciones llegando a ser los valores de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} = 0,8x10^{-3} mm^{-1} y de \tau = 0,7 nseg. en consonancia con los valores usados para generar los datos experimentales simulados (véase la Tabla 3). Los valores medios de \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} y de \tau en los puntos de rejilla que ocupan el fondo simulado convergen en 50 iteraciones llegando a ser valores similares a los indicados para el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

El Ejemplo 3 simuló dos heterogeneidades ocultas en el fantasma de tejido (no ilustrado en la Fig. 3). En este caso fueron usados los mismos parámetros ópticos como los que se describen en el Ejemplo 1, exceptuando el hecho de que la producción de fluorescencia \eta\mu_{a_{x \rightarrow m}} para los objetos 1 y 2 fue elegida como de 1 x 10^{-3} mm^{-1} y de 2 x 10^{-3} mm^{-1} respectivamente y el tiempo de vida \tau para las heterogeneidades fue elegido como de 1 nseg. y de 2 nseg., respectivamente. Fue empleada una rejilla de 33 x 33 en lugar de una rejilla de 17 x 17. Está ilustrada en la Fig. 14 una imagen correspondiente a la transformación de la producción.

Ejemplo 4

El Ejemplo 4 demuestra la inesperada ventaja de utilizar un agente de contraste fluorescente con un tiempo de vida de la fluorescencia situado dentro de un orden de magnitud del tiempo de vuelo medio de los fotones de interrogación. Este ejemplo compara por simulación por cálculo el contraste ofrecido por un agente fosforescente con un tiempo de vida de aproximadamente 1 milisegundo con el ofrecido por un agente fluorescente con un tiempo de vida de aproximadamente 1 nanosegundo. Haciendo referencia a la Fig. 16, esta simulación supone un fantasma de tejido circular 500 con una heterogeneidad 502 embebida en el mismo. Está indicada una fuente S1 única, y están distanciados aproximadamente en torno a la mitad de la periferia circular a intervalos en general iguales detectores D1 a D11. Para esta comparación \omega\tau = 1 tanto para la heterogeneidad como para su entorno. Se supuso una captación de la heterogeneidad de 100 veces la del entorno (fondo), siendo establecido en 0,1 cm^{-1} un correspondiente coeficiente de absorción de fluoróforos en la heterogeneidad frente al de 0,001 cm^{-1} para el entorno. El coeficiente de absorción para los cromóforos no fluorescentes fue establecido como de 0,001 cm^{-1} tanto para la heterogeneidad como para el entorno. En el gráfico de la Fig. 17A están registradas gráficamente las mediciones del desplazamiento de fase (eje vertical) referido a la situación angular del detector en torno a la circunferencia del fantasma de tejido 500 (eje horizontal). Las líneas con símbolos en blanco ilustran la variación del desplazamiento de fase de un agente de contraste con un tiempo de vida de 1 nseg. con la situación del detector y los cambios de situación de una heterogeneidad que contiene el agente de contraste (distintas formas de los símbolos en blanco). Los símbolos en negro corresponden al desplazamiento de fase referido a la situación del detector para un agente de contraste en la heterogeneidad que tiene un tiempo de vida de 1 mseg. El gráfico de la Fig. 17B compara estos agentes de contraste en términos de la Modulación (eje vertical) referida a la situación angular del detector (eje horizontal) y a la situación de la heterogeneidad que contiene agente (distintas formas de los símbolos en blanco). Estas ilustraciones indican que al aumentar el tiempo de vida se reduce la sensibilidad del agente de contraste a las diferencias espaciales, y apuntan además al desarrollo de agentes de contraste fluorescentes con cinéticas de relajación intrínsecas (caracterizadas por el tiempo de vida de la fluorescencia) situadas dentro de un orden de magnitud de los tiempos de migración de los fotones (es decir, de los tiempos de vuelo) para la obtención de imágenes basada en el comportamiento de la luz múltiplemente dispersa.

Las Figs. 18A y 18B son simulaciones calculadas usando el mismo tejido fantasma y los mismos parámetros, comparando los tiempos de vida de 1 nseg. y de 1 mseg., respectivamente, en función de la posición de los detectores y de la situación de una heterogeneidad selectiva para con el correspondiente agente de contraste. El eje vertical de las Figs. 18A y 18B representa el contraste de fase \Delta\theta. El contraste de fase \Delta\theta es la diferencia entre el desplazamiento de fase en presencia de la heterogeneidad y el desplazamiento de fase en ausencia de la heterogeneidad, (\Delta\theta = \theta_{presencia} - \theta_{ausencia}). Las Figs. 18C y 18D son simulaciones calculadas usando el mismo tejido fantasma y los mismos parámetros como en las Figs. 18A y 18B para comparar los mismos tiempos de vida del agente de contraste en términos del contraste de modulación, \DeltaM (eje vertical). El contraste de modulación \DeltaM viene dado como la relación de la relación de modulación (c.a./c.c.) de la luz detectada en presencia de la heterogeneidad a la relación de modulación (c.a./c.c.) de la luz detectada en ausencia de la heterogeneidad, (\DeltaM = M_{presencia}/M_{ausencia}). Para todas las Figs. 18A-18D, el eje horizontal corresponde al número de detector, y los distintos tipos de línea corresponden a distintas situaciones de la heterogeneidad que tiene agente de contraste.

Ejemplo 5

Las conclusiones de la simulación del Ejemplo 4 han sido además demostradas empíricamente mediante la experimentación del Ejemplo 5. La disposición del equipo experimental para el Ejemplo 5 es equiparable al sistema 110. Se prepara un fantasma de tejido llenando un envase cilíndrico de plexiglas que tiene un diámetro de 20 cm y una altura de 30,5 cm con una solución de intralípido al 0,5% (suministrado por la Kabi Parmacia, de Clayton, NC). Se prevé una heterogeneidad poniendo un envase cilíndrico de vidrio con un diámetro interior de 9 mm en el envase de plexiglas y llenando el cilindro de vidrio con la solución de intralípido y un agente de contraste. La situación de la heterogeneidad dentro del envase de plexiglas es ajustada con una platina de traslación x-y del modelo número PMC200-P suministrado por la Newport de Irivine, CA.

El Ejemplo 5 confirma experimentalmente el contraste de fase simulado en el Ejemplo 4 comparando el contraste de fase \Delta\theta con un agente de contraste fosforescente de Ru(bpy)_{3}^{2+} en el envase de vidrio interior (Fig. 19B) con un agente de contraste fluorescente de Verde de Indocianina (ICG) (suministrado por la ACROS Organics, de Fairlawn, NJ) en el envase de vidrio interior (Fig. 19A). Los agentes de contraste fueron añadidos a la solución de intralípido en el envase de vidrio interior (la "heterogeneidad") para simular una relación de captación de 100:1. El Ru(bpy)_{3}^{2+} tiene un tiempo de vida que es del orden de microsegundos. El ICG tiene un tiempo de vida de aproximadamente 0,58 nseg. Como puede observarse, al comparar las Figs. 19A y 19B el contraste de fase (eje vertical) que es proporcionado por un agente fluorescente con su tiempo de vida más corto es considerablemente mayor que el contraste de fase que es proporcionado por el agente fosforescente Ru(bpy)_{3}^{2+} de vida más larga en función del número de detector (eje horizontal) y de la situación de la heterogeneidad (distintos tipos de línea).

Ejemplo 6

La disposición del equipo experimental para el Ejemplo 6 es equiparable a la del Ejemplo 5, exceptuando el hecho de que fueron utilizados una sola fuente y un solo punto de detección. La fuente y el detector fueron colocados a lo largo de la circunferencia distanciados unos pocos grados, y el envase interior fue situado en general en la línea media definida entre la fuente y el detector. La platina de posicionamiento según los ejes x-y fue usada para ajustar la situación del envase interior a lo largo de esta línea media para observar las correspondientes variaciones del desplazamiento de fase \theta y de la amplitud.

En el Ejemplo 6 fue detectada la respuesta de dos distintos agentes de contraste fluorescentes que consistían en ICG y yoduro de 3-3'-dietiltiatricarbocianina (aquí llamado de manera abreviada "DTTCI" y suministrado por la ACROS Organics, de Fairlawn, NH) a una luz de excitación de intensidad modulada que tenía una longitud de onda de aproximadamente 780 nm. La luz de excitación fue modulada a 80 MHz y 160 MHz en distintas pruebas correspondientes a las líneas que tienen las distintas formas de los símbolos. El ICG es un agente que está homologado para pruebas de diagnosis hepática y retiniana y tiene un tiempo de vida medido de aproximadamente 0,58 nanosegundos, y el DTTCI es un colorante lasérico común que tiene un tiempo de vida de aproximadamente 1,18 nanosegundos.

El desplazamiento de fase y la relación de modulación del fantasma de tejido en ausencia de la heterogeneidad fueron medidos para prever el caso de "ausencia" necesario para calcular el contraste de fase \Delta\theta y el contraste de modulación \DeltaM. A continuación se preparó un agente de contraste de ICG añadiendo aproximadamente una concentración de 2,0 \mumoles de ICG a una solución de intralípido al 0,5% en el envase interior. La muestra con ICG fue entonces expuesta a la luz de excitación de la fuente, y fue detectada la respuesta. Esta detección incluía la medición de la absorción a una longitud de onda de 780 nm y la fluorescencia a 830 nm. El contraste de fase \Delta\theta resultante y la longitud de onda de absorción (símbolos en blanco) y para la longitud de onda de fluorescencia (símbolos en negro) para la muestra con ICG fue registrado gráficamente en el eje vertical del gráfico de la Fig. 20A, indicando el eje horizontal la posición relativa de la heterogeneidad ("objeto") en centímetros al ser la misma desplazada hacia el detector y la fuente a lo largo de la línea media. El contraste de modulación \DeltaM resultante a la longitud de onda de absorción (símbolos en blanco) y a la longitud de onda de fluorescencia (símbolos en negro) para la muestra con ICG fue registrado gráficamente en el eje vertical del gráfico de la Fig. 20B, indicando el eje horizontal la posición relativa del objeto en centímetros al ser el mismo desplazado hacia el detector y la fuente a lo largo de la línea media.

Tras haber sido sometida a ensayo la muestra con ICG, fue añadida una concentración de 4,2 \mumoles del agente de contraste de DTTCI a la solución de intralípido al 0,5% en el envase interior para prever una muestra con DTTCI. Las distintas concentraciones de los agentes de contraste de ICG y de DTTCI fueron seleccionadas para obtener una sección fluorescente que es en general la misma tanto para la muestra con ICG como para la muestra con DTTCI. El contraste de fase \Delta\theta resultante a la longitud de onda de absorción (símbolos en blanco) y a la longitud de onda de fluorescencia (símbolos en negro) para la muestra con DTTCI está registrado en el eje vertical del gráfico de la Fig. 20C, indicando el eje horizontal la posición relativa del objeto en centímetros al ser el mismo desplazado hacia el detector y la fuente a lo largo de la línea media. El contraste de modulación \DeltaM resultante a la longitud de onda de absorción (símbolos en blanco) y para la longitud de onda de fluorescencia (símbolos en negro) para la muestra con DTTCI está registrado gráficamente en el eje vertical del gráfico de la Fig. 20D, indicando el eje horizontal la posición relativa del objeto en centímetros al ser el mismo desplazado hacia el detector y la fuente a lo largo de la línea media.

Para ambas muestras, el proceso de decaimiento de la fluorescencia es uniexponencial, presentando un tiempo de vida, pero el análisis y el procedimiento pueden extenderse a colorantes y agentes de contraste con más de un tiempo de vida. Comparando la fase de fluorescencia y la modulación de amplitud generadas por los dos agentes de contraste fluorescentes, puede observarse fácilmente la influencia del tiempo de vida de la fluorescencia \tau en la absorción. Se ha comprobado por cierto que está presente un considerable contraste cuando la captación es tan sólo de 10:1 con respecto al entorno o fondo.

Ejemplo 7

Para el Ejemplo 7 se prepara un tejido fantasma colocando en un envase de plexiglas una solución de intralípido que imita un tejido. La fuente luminosa emisora de la luz de excitación transilumina el fantasma de tejido desde detrás a lo largo de una distancia en línea recta de aproximadamente 8 centímetros. Se utilizó para detectar la respuesta un sistema de detección con dispositivo de acoplo de carga/intensificador de imagen. El sistema experimental utilizado para el Ejemplo 7 era equiparable al sistema 410 que está ilustrado en la Fig. 15.

Estaban embebidas dentro de la parte central del fantasma de tejido del envase de plexiglas dos soluciones micromolares de intralípido de 0,5 ml que se encontraban en envases separados y tenían cada una un distinto agente de contraste fluorescente. Un recipiente incluía un agente de contraste de ICG, y el otro recipiente incluía un agente de contraste de DTTCI. Fueron llevadas a cabo en el frente del tejido fantasma mediciones del desplazamiento de fase de fluorescencia, de la amplitud de c.a., de la intensidad de c.c. y de la modulación (c.a./c.c.) en respuesta a una luz de excitación de 780 nm modulada a 100 MHz. Las Figs. 21A-21D son imágenes bidimensionales que ilustran la variación espacial de las mediciones del desplazamiento de fase, de la amplitud de c.a., de la intensidad de c.c. y de la modulación, respectivamente, en términos de una correspondiente escala de grises. Estas imágenes confirman la variación del contraste con las diferencias del tiempo de vida de la fluorescencia y del parámetro que se mide.

Ejemplo 8

El ejemplo 8 es un estudio con tejido vivo efectuado con tejido mamario de un perro Sugar Limburg, que era un caniche miniatura (de 10 años de edad y de un peso de 12,5 libras). Fue tomada una imagen in vivo de la quinta glándula mamaria derecha tras una inyección in vivo con 1,3 cm^{3} de una concentración de un 5% de agente de contraste fluorescente de ICG. La interrogación fue llevada a cabo con un sistema experimental equiparable al del Ejemplo 7, con una longitud de onda de la luz de excitación de 789 nm y detección a una longitud de onda de 830 nm. La frecuencia de modulación era de 100 MHz.

Una sección congelada de la quinta mamaria derecha reveló dos manchas oscuras que estaban situadas a una profundidad de aproximadamente 1 cm desde la superficie del tejido y fueron clasificadas histológicamente como nódulos linfáticos inguinales regionales reactivos sin signos de propagación metastática. El tejido restante fue clasificado como hiperplasia lobular sin evidencia de tumor. Las Figs. 22A-22D son imágenes bidimensionales que ilustran la variación espacial en términos de la medición in vivo a partir de la luz de emisión para la modulación de fase, la relación de modulación, la intensidad media y la amplitud de modulación, respectivamente, en relación con las correspondientes escalas de grises. La línea blanca que aparece en las imágenes de las Figs. 22A-22D es el límite entre el tejido y el aire. El desplazamiento de fase en el tejido es pequeño debido a la pequeña cantidad de tejido mamario presente. Asimismo, la relación de modulación contiene una gran cantidad de ruido de fondo. Sin embargo, se cree que las dos manchas de luz en el fondo tanto de la intensidad media como de la amplitud de modulación corresponden a una incrementada captación de ICG dentro del tejido linfático ampliado.

Claims

1. Método que comprende los pasos de:

seleccionar un agente de contraste fluorescente en función de un tiempo de vuelo predeterminado para un tejido del que deben ser obtenidas imágenes de acuerdo con una expresión matemática que modeliza el comportamiento de la luz múltiplemente dispersa que viaja a través del tejido, teniendo el agente de contraste fluorescente un tiempo de vida de la fluorescencia situado dentro de un factor de diez del tiempo de vuelo predeterminado; y

prever el agente de contraste fluorescente seleccionado para su introducción en el tejido.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además los pasos de:

evaluar la capacidad de los de una serie de agentes de contraste fluorescentes para proporcionar contraste de imagen entre distintos tipos de tejido, incluyendo dicha evaluación la determinación de una relación entre un grado de contraste de imagen y una característica de fluorescencia de los agentes de contraste fluorescentes;

seleccionar uno de los agentes de contraste fluorescentes sobre la base de dicha evaluación.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la característica de fluorescencia incluye al menos uno de los miembros del grupo que consta del tiempo de vida de la fluorescencia, la producción de fluorescencia y el rendimiento cuántico de los agentes de contraste fluorescentes.

4. El método de la reivindicación 2, en el que la característica de fluorescencia incluye el tiempo de vida de la fluorescencia de los agentes de contraste fluorescentes.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 4, en el que la característica de fluorescencia incluye una producción de fluorescencia de los agentes de contraste fluorescentes.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 ó 5, en el que la característica de fluorescencia incluye un rendimiento cuántico del agente de contraste fluorescente.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el tiempo de vida de la fluorescencia está situado dentro de una gama de tiempos de vida de la fluorescencia que va desde aproximadamente 0,1 hasta 10 nanosegundos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el tiempo de vida de la fluorescencia está situado dentro de una gama de tiempos de vida de la fluorescencia que va desde aproximadamente 0,5 hasta 5 nanosegundos.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el tiempo de vida de la fluorescencia está situado dentro de una gama de tiempos de vida de la fluorescencia que va desde aproximadamente 0,2 hasta 2 nanosegundos.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la expresión matemática corresponde a una aproximación de la ecuación de difusión de la luz múltiplemente dispersa.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende además el paso de:

aplicar la aproximación de la ecuación de difusión en una forma de dominio de frecuencia.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en el que el contraste de imagen es obtenido en términos de al menos uno de los miembros del grupo que consta del contraste de desplazamiento de fase y el contraste de modulación.