DE102020006305A1

DE102020006305A1 - Stoffkombination zur Inhibierung von viralen Cysteinproteasen

Info

Publication number: DE102020006305A1
Application number: DE102020006305.5A
Authority: DE
Inventors: Monika Aparecida Coronado; Raphael Josef Eberle; Dieter Willbold
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-04-14
Also published as: WO2022078536A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Stoffkombination aus Suramin und Quinacrin zur Inhibierung von viralen Cysteinproteasen, insbesondere zur Inhibierung von viralen 3CL Proteasen, sowie die Verwendung dieser Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere 3CL Proteasen.Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Stoffkombination zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, sowie auf die Stoffkombination als Arzneimittel in der Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Stoffkombination aus Suramin und Quinacrin zur Inhibierung von viralen Cysteinproteasen, insbesondere zur Inhibierung von viralen 3CL Proteasen, sowie die Verwendung dieser Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere 3CL Proteasen.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Stoffkombination zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, sowie auf die Stoffkombination als Arzneimittel in der Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Stoffkombination als Arzneimittel sowie zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, und weiterhin auf ein Verfahren zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit Viren aus der Familie der Coronaviridae.
Stand der Technik
Suramin und Quinacrin sind bekannte Substanzen, die bereits als Arzneistoffe zugelassen sind. Suramin wird beispielsweise unter den Handelsnamen Antrypol®, Belganyl®, Fourneau 309®, Germanin® Moranyl®, Naganol®, Naginin® vertrieben und eingesetzt. Quinacrin wird beispielsweise unter dem Handelsnamen Mepacrin eingesetzt.
Für Suramin sind unterschiedliche Anwendungsgebiete bekannt. So wird es beispielsweise. als Antiprotozoikum gegen die Schlafkrankheit und Onchozerkose eingesetzt. Außerdem ist es bekannt als Therapeutikum gegen HIV, verschiedene Krebsarten und Autismus.
Quinacrin, synonym auch als Mepacrin bezeichnet, wurde in der Vergangenheit zur Malariaprophylaxe verwendet. Derzeit wird es beispielsweise bei Gardia- und Protozoen Infektionen eingesetzt.
Der genaue Wirkungsmechanismus von Suramin auf den bisher bekannten Anwendungsgebieten ist nicht bekannt. Ein wichtiger Effekt scheint jedoch die Hemmung von Enzymen zu sein, die an der Oxidation des reduzierten Nikotinamid-Adenin-Dinukleotids (NADH) beteiligt sind, das bei vielen zellulären Reaktionen wie Atmung und Glykolyse als Coenzym fungiert. Suramin kann als Antagonist von P2-Rezeptoren und DNA/RNA bindenden Proteinen wirken oder als Agonist von Ryanodin-Rezeptoren. Es kann auch follikelstimulierende Hormonrezeptoren hemmen.
Suramin kann auch die Zika Virus NS2B/NS3 Protease inhibieren [12].
Auch der genaue Wirkungsmechanismus von Quinacrin ist nicht bekannt, aber das Molekül scheint Translation und Transkription von DNA zu hemmen. Quinacrin wurde als Inhibitor der sauren Sphingomyelinase und Cholinesterase beschrieben.
Suramin oder Quinacrin enthaltende Medikamente werden bis jetzt nicht gegen SARS-CoV-2 Infektionen verwendet, allerdings konnte für Suramin [13] und Quinacrin [14] ein inhibierender Effekt gegen SARS-CoV-2 Zellkulturen beschrieben werden.
Beide Substanzen sind Hauptbestandteil bekannter und zugelassener Arzneistoffe. Dadurch bedingt sind zu diesen beiden Substanzen Informationen zur Aufnahme in den Körper, pharmazeutische Parameter, Membrantransfer und Stoffkonzentrationen, die schädlich sind, bereits bekannt.
Suramin wirkt gegen eine große Bandbreite von Parasiten, insbesondere gegen Protozoen. Durch seine extreme Giftigkeit kann es jedoch bei zu hoher Konzentration auch Körperzellen zerstören, weswegen mit erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen ist, die aber durch strikte Handhabung der Dosierung minimiert werden können. Als Nebenwirkungen sind Übelkeit, Erbrechen, Nesselsucht, Nierenschäden, Nebennierenrindeninsuffizienz bekannt.
Für Quinacrin sind Kopfschmerzen, Schwindel und Magen-Darm-Störungen als Nebenwirkungen bekannt.
Zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, wie beispielsweise SARS-CoV-2, ist es grundsätzlich wichtig, einen Arzneistoff einzusetzen, der sowohl eine komplette Bekämpfung der Infektion als auch eine gute Verträglichkeit des Arzneistoffs im zu behandelnden Organismus gewährleistet. Darüber hinaus ist es wichtig, genaue Kenntnisse über Wirkmechanismen von Wirkstoffen zu gewinnen, die auf die Bekämpfung von viralen Infektionen einen Einfluss haben können.
Aufgabe und Lösung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Target zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, ganz besonders von Infektionen mit SARS-COV-2 zu identifizieren und einen Wirkstoff zu diesem Target bereitzustellen und weiterhin auch einen Wirkstoff als Arzneimittel oder therapeutisches Mittel zur Behandlung von viralen Infektionen bereitzustellen.
Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch eine Stoffkombination mit den Merkmalen des Hautanspruchs sowie durch Verwendung dieser Stoffkombination und das Verfahren zur Behandlung gemäß nebengeordneter Ansprüche.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Stoffkombination, der Verwendung dieser Stoffkombination und des Verfahrens ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Ansprüchen.
Gegenstand der Erfindung:
Die Erfindung betrifft eine Stoffkombination enthaltend Suramin und Quinacrin. Diese Kombination von zwei bekannten Wirkstoffen hat die überraschende Wirkung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen. Im Folgenden wird für die Bezeichnung Cysteinprotease synonym auch die Bezeichnung Protease verwendet.
Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung dieser Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen. Die Stoffkombination wirkt vorteilhaft als Inhibitor für virale Cysteinproteasen, die in Viren aus der Familie der Coronaviridae vorkommen. Hier sind insbesondere Cysteinproteasen als Target für die erfindungsgemäße Stoffkombination geeignet, die in Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV vorkommen.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Stoffkombination zur Verwendung in der medizinischen Therapie. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Stoffkombination zur Vorbeugung oder Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, die als Wirkstoff einen Inhibitor der viralen Cysteinprotease, insbesondere einer viralen 3CL Protease, enthält, der aus einer Stoffkombination enthaltend Suramin und Quinacrin ausgewählt ist bzw. besteht.
Im Rahmen der Erfindung wurde herausgefunden, dass sowohl Suramin als auch Quinacrin eine virale Cysteinprotease, insbesondere eine virale 3CL Protease, effizient hemmen können und dass eine Kombination dieser beiden Moleküle, synonym auch als Wirkstoffe oder Wirkstoffkombination bezeichnet, diesen Effekt sogar noch verbessert.
Unter der Bezeichnung Suramin wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung eine Verbindung mit folgender Strukturformel (I) verstanden:
Suramin kann in Rahmen der Erfindung beispielsweise auch in Form eines Salzes oder anderer in Handel erhältlichen Formen eingesetzt werden.
Unter der Bezeichnung Quinacrin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung der folgenden Strukturformel (II) verstanden, die aus einem 1:1 Gemisch aus einer R-Form (oben) und einer S-Form (unten) besteht:
Quinacrin kann im Rahmen der Erfindung beispielsweise in Form seiner Hydrolysate oder anderer im Handel erhältlichen Formen eingesetzt werden.
Basierend auf Titrationsexperimenten der erfindungsgemäßen Inhibitoren in einem spezifischen Aktivitätstest konnten die IC₅₀ Werte von beiden Wirkstoffen sowohl einzeln als auch in Kombination bestimmt werden (siehe 2). Dabei zeigte Quinacrin einen IC₅₀ Wert von 7.8 ± 0.9 µmol/L und Suramin einen Wert von 6.3 ± 0.8 µmol/L. Durch die Kombination beider Wirkstoffe, konnte eine Reduzierung der IC₅₀ Wert um den Faktor 10 auf 0.46 ± 0.1 µmol/L nachgewiesen werden.
Zusätzliche Aktivitätstests, basierend auf klassischen Michaelis-Menten Annahmen, konnten zeigen, dass Quinacrin ein kompetitiver und Suramin ein nichtkompetitiver (allosterischer) Cysteinprotease Inhibitor, insbesondere 3CL Protease Inhibitor, ist (siehe 3). Dabei tritt der kompetitive Inhibitor in Konkurrenz mit dem Substrat, bindet also im aktiven Zentrum. Der nichtkompetitive Inhibitor dagegen bindet an einer allosterischen Bindestelle, die weiter entfernt vom aktiven Zentrum liegen kann. Diese Bindung induziert Konformationsänderungen des Cysteinprotease Proteins, insbesondere des 3CL Proteaseproteins, die auch das aktive Zentrum beeinflussen können und so die Enzymaktivität inhibieren. Zusätzlich durchgeführte Fluoreszenz Spektroskopie Experimente konnten diese Beobachtung unterstützen.
Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass Quinacrin und Suramin mit unterschiedlichen Proteinbereichen der 3CL Protease interagieren und darüber hinaus unterschiedlich starke Konformationsänderungen in diesem Protein anregen.
Die Interaktion von Quinacrin mit der SARS-CoV-2 3CL Protease führte zu einem sogenannten „blue edge excitation shift“. Dabei bewegte sich das Fluoreszenzmaximum um 10 nm von 330 nm nach 320 nm. Diese Bewegung des Fluoreszenzmaximums geht einher mit der Bewegung der Tryptophanreste in der Cysteinprotease in eine hydrophobe Umgebung.
Die Bindung von Suramin an die SARS-CoV-2 3CL Protease dagegen führte zu einem starken „red edge excitation shift“. Dabei bewegte sich das Fluoreszenz Maximum um 30 nm von 330 nm nach 360 nm. Dieser Vorgang ist definiert durch eine erhöhte Zugänglichkeit der Tryptophanreste mit dem Umgebungsmedium und ist typisch für Konformationsänderungen in der Proteinstruktur (siehe 4).
Die Fluoreszenz Spektroskopie Resultate unterstützen die Ergebnisse der Aktivitätstests, die belegen, dass das Suramin und Quinacrin verschiedene Typen der Enzyminhibition für die Cysteinproteasen, insbesondere 3CL Proteasen, besitzen und dadurch auch mit verschiedenen Proteinregionen interagieren.
Diese Beobachtungen wurden ebenfalls durch Molekulares Docking und computerbasierte Simulationen belegt. Dabei wurde die Kristallstruktur von SARS-CoV-2 3CL^pro Protease (PDB: 6M2Q) als Grundlage genommen, um den Einfluss der Quinacrin und Suramin Bindung auf die Proteinstruktur zu untersuchen. Während des Docking Prozesses wurde Quinacrin in das aktive Zentrum der Proteasestruktur gelagert und Suramin an eine Proteinregion des Dimers, das starke positive Oberflächenladungen besitzt. Danach wurde über eine Dauer von 300 ns eine computerbasierte Simulation gestartet, um zu beobachten, wie stabil die Interaktionen zwischen Proteinstruktur und Inhibitoren sind. Diese computerbasierten Experimente zeigten, dass Quinacrin stabil im aktiven Zentrum verbleibt und Suramin an einer möglichen allosterischen Bindestelle des Proteins (siehe 7 und 8) bindet, was wiederum im Einklang mit den vorherigen Ergebnissen des Aktivitätstests und der Fluoreszenz Spektroskopie war. Darüber hinaus konnten diese computerbasierten Dynamiken zeigen, dass die durch Suramin initiierte Konformationsänderung in der Proteinstruktur, auch zu einer Veränderung im aktiven Zentrum der Protease führt, was zu einer erhöhten Zugänglichkeit für die Interaktion mit Quinacrin führen kann.
Grundsätzlich konnte nachgewiesen werden, dass Quinacrin und Suramin an verschiedenen Regionen der Proteinoberfläche der viralen 3CL Protease interagiert und so bei einer kombinierten Gabe keine Konkurrenz um dieselbe Bindestelle im Protein auftreten kann. Suramin scheint dabei eine Konformationsänderung des 3CL Protease Proteins zu induzieren, die das aktive Zentrum zugänglicher für eine Quinacrin Bindung macht und dadurch zu einer weiteren, verbesserten Hemmung des Enzyms führt.
In einer vorteilhaften Ausführung der Stoffkombination liegt das Verhältnis der Stoffmengenkonzentrationen von Suramin zu Quinacrin bei (1-10) zu (1-10), wobei eine Stoffkombination mit einem Verhältnis der Stoffmengenkonzentrationen von Suramin zu Quinacrin von 1 zu 1 sich als vorteilhaft gezeigt hat.
Die erfindungsgemäße Stoffkombination ist als pharmazeutische Formulierung zur Verwendung in der medizinischen Therapie geeignet.
Dabei kann diese pharmazeutische Formulierung, umfassend die erfindungsgemäße Stoffkombination, ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen. Hier sind alle nach dem Stand der Technik bekannte Arzneiträgerstoffe geeignet.
Die Erfindung betrifft weiterhin Arzneimittel enthaltend die erfindungsgemäße Stoffkombination sowie eine pharmazeutisch akzeptierbaren Träger und die Verwendung der Stoffkombination in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viralen Infektionen in einem Organismus.
Die Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung oder das Arzneimittel ist insbesondere zur Verwendung in der anti-viralen Therapie oder zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus einsetzbar, wobei hier insbesondere die virale Infektion durch Viren aus der Familie der Coronaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV, Anwendung finden. Die Stoffkombination, die pharmazeutische Formulierung oder das Arzneimittel kann daher vorteilhaft zur Behandlung viraler Infektionen in einem Menschen oder Tier eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch Verfahren zur Inhibierung einer viralen Cysteinprotease, insbesondere einer viralen 3CL Protease, sowie zur Behandlung oder Verhinderung einer Virusinfektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer viralen Infektion durch Viren aus der Familie der Coronaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV, bei dem die erfindungsgemäße Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung eingesetzt wird. Bei diesem Verfahren, werden einem Organismus, der für die Virusinfektion empfänglich ist oder daran leidet, die Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung oder das Arzneimittel verabreicht.
Die Verabreichung erfolgt dabei vorzugsweise in einer therapeutisch wirksamen Menge einer Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung an den Organismus. Vorzugsweise ist hier der Organismus ein Mensch oder ein Tier.
Die erfindungsgemäße Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung kann dem Organismus beispielsweise oral, intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Stoffkombination enthaltend Suramin und Quinacrin als therapeutisches Mittel sowie in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion, insbesondere zur Behandlung einer Infektion durch Viren aus der Familie der Coronaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV In einer möglichen Ausgestaltung der Erfindung wird eine pharmazeutische Stoffkombination bereitgestellt, die ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel und eine therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Stoffkombination umfasst.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen.
Es wird angenommen, dass die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Stoffkombination, auf Viren aus der Familie der Coronaviridae darauf beruht, dass durch Hemmung der viralen Cysteinproteasen, insbesondere der viralen 3CL-Protease, die Polyproteinverarbeitung des translatierten, viralen Genoms in der Wirtszelle gestört oder verhindert wird, wodurch das Virus replikationsunfähig wird.
Dementsprechend ist ein Verfahren zur Behandlung einer Virusinfektion oder eines Virus aus der Familie der Coronaviridae vorgesehen, das für eine virale Cysteinprotease-Inhibierung, insbesondere virale 3CL-Protease-Inhibierung, in einem Säugetier empfänglich ist, einschließlich der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Stoffkombination oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Solvats oder Hydrats hiervon an das Säugetier, wobei das Säugetier ein Mensch oder ein Tier sein kann.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung der viralen Cysteinprotease, insbesondere der viralen 3CL-Protease, in einem Säugetier vorgesehen, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Stoffkombination oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Solvats oder Hydrats davon an das Säugetier einschließt. In einer Ausgestaltung ist das Säugetier ein Mensch oder ein Tier. Die Stoffkombination kann dabei oral, intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden.
Obwohl die Erfindung in den Figuren und der vorangegangenen Beschreibung ausführlich dargestellt und beschrieben wurde, sind diese Abbildungen und Beschreibungen als illustrativ oder exemplarisch und nicht einschränkend zu betrachten. Es versteht sich, dass Änderungen und Modifikationen durch gewöhnliche Fertigkeiten im Rahmen der folgenden Ansprüche vorgenommen werden können. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung weitere Ausführungsformen mit einer beliebigen Kombination von Merkmalen aus verschiedenen Ausführungsformen, die oben und unten beschrieben sind.
Spezieller Beschreibungsteil
Im Weiteren wird die Erfindung anhand von exemplarischen und experimentellen Untersuchungsergebnissen und einigen Figuren näher und detaillierter erläutert. Die Erfindung ist nicht auf die hier offenbarten exemplarischen Ausführungsbeispiele beschränkt. Alle beschriebenen und/oder bebilderten Merkmale können sich einzeln oder auch kombiniert in unterschiedlichen Ausführungsformen manifestieren. Die Merkmale der unterschiedlichen Ausführungsformen dieser Erfindung und ihre jeweiligen Vorteile werden beim Lesen der nachfolgend ausgeführten Ausführungsbeispiele in Zusammenhang mit den Figuren offenbart. Dabei zeigen:

1: Primäre Inhibitionstests von Quinacrin, Suramin und einer Kombination beider Moleküle gegen SARS-CoV-2 3CL^pro.
2: Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC₅₀-Bestimmung.
3: Lineweaver-Burk-Diagramme zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von Quinacrin und Suramin gegen SARS-CoV-2 3CL^pro.
4: Fluoreszenzspektroskopie von SARS-CoV-2 3CL^pro in Gegenwart von Suramin und Quinacrin.

I) Aktivitätstest und Inhibitionstest
Zum Nachweis der Wirkung von Quinacrin, Suramin und einer Kombination von Suramin und Quinacrin auf die virale Cysteinproteaseaktivität, insbesondere auf die SARS-CoV-2 3CL^pro Proteaseaktivität, wurden Inhibitionstests durchgeführt.
Dabei wurde beispielhaft der Einfluss der einzelnen Wirkstoffe und in Kombination beider Wirkstoffe miteinander auf die Enzym-Aktivität der SARS-CoV-2 3CL^pro untersucht.
Die Aktivitätstests wurden unter Verwendung eines fluorogenen Substrats DABCYL-KTSAVLQ↓SGFRKME-EDANS (Bachem, Schweiz) in einem Puffer mit 20 mmol/L Tris pH 7,2, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA und 1 mmol/L TCEP [1-3] durchgeführt. Diese Reaktionsmischung wurde in eine Corning 96-Well-Platte (Sigma Aldrich), enthaltend 0,5 µmol/L SARS-CoV-2 3CL^pro Protein, pipettiert, und der Assay wurde mit der Zugabe des zuvor genannten Substrats in einer Endkonzentration von 50 µmol/L gestartet.
Die Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL^pro-Aktivität durch Quinacrin und/oder Suramin wurde mit dem oben beschriebenen Aktivitätsassay untersucht. 10 µmol/L der Verbindungen wurden jeweils einzeln oder als Stoffkombination für einen ersten Screening-Test verwendet.
Für die anschließenden Inhibitionstests wurden 0,5 µmol/L des SARS-CoV-2 3CL^pro Proteins mit 0-100 µmol/L Suramin oder 0-150 µmol/L Quinacrin inkubiert. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Nach Zugabe des Substrats mit einer Endkonzentration von 50 µmol/L wurde die Zunahme/Änderung der Fluoreszenzintensitäten in 60 s-Intervallen über 30 Minuten mit einem Plattenlesegerät Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die Temperatur wurde auf 37 °C eingestellt. Sobald das fluorogene Substrat von der SARS-CoV-2 3CL^pro Protease gespalten wird, erhöht sich die messbare Fluoreszenz, da der FRET (Förster-Resonanzenergietransfer) Farbstoff des Substrats freigesetzt und damit messbar wird. Also entspricht eine hohe Fluoreszenzintensität einer hohen SARS-CoV-2 3CL^pro Aktivität. Eine Reduktion der Fluoreszenzintensität kann daher auf eine entsprechende Inhibierung dieser Protease zurückgeführt werden.
Die Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 360 nm bzw. 460 nm. Die Inhibitionstests wurden als Triplikate durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Auf der Abszisse (X-Achse) sind unterschiedliche Versuchsansätze (1 bis 4) dargestellt.
Versuchsansatz 1 zeigt Ergebnisse ohne Zusatz eines Wirkstoffs bzw. Inhibitors (dunkelgrauer Balken 1).
Versuchsansatz 2 zeigt Ergebnisse mit Zusatz von 10 µmol/L Quinacrin (hellgrauer Balken 2).
Versuchsansatz 3 zeigt Ergebnisse mit Zusatz von 10 µmol/L Suramin (hellgrauer Balken 3). Versuchsansatz 4 zeigt Ergebnisse mit Zusatz von 10 µmol/L der Stoffkombination Suramin plus Quinacrin (dunkelgrauer Balken 4).
Die Ordinate (Y-Achse) gibt die SARS-CoV-2 3CL^pro Proteaseaktivität in % wieder.
Jeder Versuchsansatz wurde mit frischem, gereinigtem SARS-CoV-2 3CL^pro Protein durchgeführt.
Die Hemmung der Protease-Aktivität wurde mit folgender Gleichung (1) berechnet: $\begin{array}{l} Protease - Aktivit \ddot{a} t in [%] = Fluoreszenz - Intensit \ddot{a} t der nach der Inhibition ver - \\ bleibenden Enzymaktivit \ddot{a} ts - Intensit \ddot{a} t/Fluoreszenz - Intensit \ddot{a} t der Enzymakti - \\ vit \ddot{a} t ohne Inhibition \end{array}$
Für den Quinacrin-Suramin-Kombinationstest wurde eine Stammlösung mit einem Verhältnis der Stoffmengenkonzentrationen von Suramin zu Quinacrin von 1:1 der beiden Wirkstoffe hergestellt. 0,5 µmol/L des SARS-CoV-2 3CL^pro Proteins wurden mit 0 bis 75 µmol/L dieser kombinierten Stammlösung (Quinacrin und Suramin) inkubiert. Es konnte gezeigt werden, dass Quinacrin oder Suramin die Proteaseaktivität, jeweils als alleiniger Wirkstoff, um mehr als 60% (Quinacrin 64% und Suramin 73%) und die Kombination von Quinacrin-Suramin die Proteaseaktivität um mehr als 90% (Quinacrin-Suramin Kombination: 91%) hemmen können (1). Eine 100%ige Hemmung der Proteaseaktivität konnte bei einer Inkubation mit 75 µmol/L mit der erfindungsgemäßen Kombination von Quinacrin und Suramin erreicht werden.

Die folgende Tabelle 1 zeigt Ergebnisse der Messungen der Proteaseaktivität bei unterschiedlichen Stoffmengenkonzentrationen von Quinacrin, Suramin und der Quinacrin-Suramin Kombination. Tabelle 1:

Suramin		Quinacrin		Suramin + Quinacrin
Stoffmengen Konzentra- tion [µmol/L]	S Aktivität SARS-CoV-2 3CL^pro [%]	Stoffmengen Konzentra- tion [µmol/L]	Aktivität SARS-CoV-2 3CL^pro [%]	Stoffmengen Konzentra- tion [µmol/L]	Aktivität SARS-CoV-2 3CL^pro [%]
0	100	0	100	0	100
0,25	98	0,25	98	0,02	98
0,5	92	0,5	92	0,05	93
1	83	1	81	0,1	80
2,5	74	2,5	72	0,25	65
5	58	5	61	0,5	48
7,5	41	7,5	46	1	36
10	27	10	36	2,5	28
20	12	30	21	5	19
40	4	60	13	10	9
60	2	90	6	25	5
80	0.5	120	2	50	1
100	0	150	0	75	0

II) ICso Bestimmung:
Um den Wert der halbmaximalen Inkubationskonzentration (IC₅₀ Wert) für die einzelnen Wirkstoffe und die Stoffkombination zu bestimmen, wurde die Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gegen verschiedene Konzentrationen der Wirkstoffe mit Hilfe einer Dosis-Wirkungs-Kurve in der Software GraphPad Prism5 aufgetragen.
In 2 ist auf der Ordinate (Y-Achse) die zeitliche Zunahme der Fluoreszenzintensität [%] von SARS-CoV-2 3CL^pro gegen den Logarithmus der Stoffmengenkonzentration in µmol/L (Abszisse X-Achse) von Quinacrin, Suramin und der Suramin-Quinacrin Kombination aufgetragen. Dabei zeigen die einzelnen Graphen folgendes:

2 Graph A: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin auf SARS-CoV-2 3CL^pro.
2 Graph B: Dosis-Wirkungs-Kurve von Suramin auf SARS-CoV-2 3CL^pro.
2 Graph C: Dosis-Wirkungs-Kurve der Suramin-Quinacrin Kombination auf SARS-CoV-2 3CL^pro.

Dabei zeigte Quinacrin einen IC₅₀ Wert von 7,8 ± 0,9 µmol/L, Suramin einen IC₅₀ Wert von 6,3 ± 0,8 µmol/L und die Kombination beider einen IC₅₀ Wert von 0,46 ±0,1 µmol/L.
III) Bestimmung von Inhibitionsmodus und Inhibitionskonstante
Basierend auf der bekannten Michaelis-Menten-Gleichung/ Kinetik wurden zusätzliche Proteaseaktivitätstests durchgeführt, um den Inhibitionsmodus von Quinacrin und Suramin auf die Proteaseaktivität näher zu untersuchen.
Dazu wurde bei verschiedenen Endkonzentrationen der beiden Inhibitoren, Quinacrin oder Suramin, und des zuvor genannten Substrats die Reaktionsgeschwindigkeit der SARS-CoV-2 3CL^pro bestimmt. 0,5 µmol/L SARS-CoV-2 3CL^pro wurde dazu mit dem jeweiligen Inhibitor Quinacrin oder Suramin in verschiedenen Konzentrationen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe der entsprechenden Konzentrationsreihe des Substrats eingeleitet und die Reaktionsgeschwindigkeit durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität gemäß den zuvor unter I) beschriebenen allgemeinen Versuchsbedingungen bestimmt. Die Datenanalyse wurde mit Hilfe eines Lineweaver-Burk-Plots durchgeführt. Dabei wurde der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit (1/V) gegen den Kehrwert der Substratkonzentration (1/[S]) aufgetragen [4,5].
Alle Messungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Inhibitionskonstante (K_i) wurde mit der folgenden Gleichung (2) ermittelt: $K_{i} = {IC}_{50} / (([S] / KM) + 1))$
Der K_i Wert gibt die Affinität des Enzyms bzw. der Protease zum jeweiligen Inhibitor an.
Der IC₅₀ Wert wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. Der KM Wert wurde aus einer Datenbank (BRENDA-Datenbank) gewonnen und [S] ist die Konzentration des in den Versuchsansätzen verwendeten Substrats [6].
In 3 ist auf der Abszisse (X-Achse) der Kehrwert der Substratkonzentration [1/S] angegeben. Auf der Ordinate (Y-Achse) ist der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit [1/V] aufgetragen. Die beiden Graphen A und B in 3 zeigen:

A: Lineweaver-Burk-Diagramm zur SARS-CoV-2 3CL^pro Hemmung durch Quinacrin bei unterschiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0, 0,5, 1,0, 2,5 µmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph A durch unterschiedliche Symbole (•, ■, ▲, ♦) dargestellt.
B: Lineweaver-Burk-Diagramm zur SARS-CoV-2 3CL^pro Hemmung durch Suramin bei unterschiedlichen Endkonzentrationen von Suramin und zwar 0, 0,5, 1,0, 2,5 µmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Suramin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph B durch unterschiedliche Symbole (•, ■, ▲, ♦) dargestellt.

IV) Fluoreszenz-Spektroskopie
Um die zuvor gewonnenen Ergebnisse zu verifizieren, wurden Fluoreszenz-Spektroskopie Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurde eine intrinsische Trp-Fluoreszenz von SARS-CoV-2 3CL^pro unter dem Einfluss von Quinacrin und Suramin gemessen. Auf der Grundlage dieses Experiments konnte die Dissoziationskonstante zwischen dem Protein und Quinacrin und Suramin bestimmt werden [7]. Die Proteinprobe lag kurzzeitig in 25 mmol/L Tris-HCI pH 8,0, 150 mmol/L NaCl mit einer Endkonzentration von 10 µmol/L/50 µl vor. Die Proteinlösung in der Küvette (1 cm Schichtdicke) wurde schrittweise mit einer Wirkstoffstammlösung von 0 bis 48 µmol/L Quinacrin oder Suramin titriert (um eine Proteinverdünnung zu vermeiden, wurde die Molekülstammlösung mit dergleichen Proteinkonzentration - 10 µmol/L Protein + 500 µmol/L Molekülstamm - behandelt). Nach jeder Titration wurde eine Messung durchgeführt. Das Quenching der Protease-Fluoreszenz, ΔF (F_max-F), bei 330 nm jedes Titrationspunktes wurde zur Anpassung einer Sättigungsbindungskurve mit Hilfe eines nichtlinearen Verfahrens zur Anpassung der kleinsten Quadrate verwendet, das an anderer Stelle [8] auf der Grundlage der folgenden Gleichung (3) [9] ausführlich diskutiert wurde: $Y = B_{max} [Q] / K_{D} + [Q]$
wobei [Q] die Ligandenkonzentration in Lösung ist, die als Quencher wirkt, Y die spezifische Bindung ist, die durch Messung der Fluoreszenzintensität abgeleitet wird, Bmax die maximale Menge des Protease-Liganden-Komplexes bei Sättigung des Liganden ist und K_D die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante ist. Der Prozentsatz der gebundenen Protease, d.h. Y, der sich aus dem Fluoreszenzintensitätsmaximum ergibt, wird gegen die Ligandenkonzentration aufgetragen (Siehe 4 Graph B und D). Zusätzlich wurden die Daten mit einer modifizierten Hill-Gleichung angepasst, die folgende Beziehung ergibt (4) [10,11]: $Log (F - F_{min}) / (F) = {m log K}_{D} + n log [Q]$
wobei Fmin die minimale Fluoreszenzintensität in Gegenwart des Liganden und K_D die Gleichgewichtskonstante für den Protein-Ligand-Komplex ist. Die „Bindungskonstante“ K ist definiert als der Kehrwert von K_D.
4 (A und C) zeigt eine Anzahl von Fluoreszenzspektren von SARS-CoV-2 3CL^pro, die unter Einfluss von unterschiedlichen Stoffkonzentrationen von Suramin (Graph A) und Quinacrin (Graph C) aufgenommen wurden. 4 zeigt ebenfalls, jeweils dazu erstellte Bindungssättigungskurven zur Ermittlung der jeweiligen Dissoziationskonstante K_D.
Die Abszissen (X-Achsen) der Fluoreszenzspektren geben die Wellenlängen in nm an, zu denen die Fluoreszenzintensitäten gemessen wurden. Der von oben nach unten verlaufende Pfeil in den Graphen A und C der 4, gibt zu den einzelnen, aufgenommenen Fluoreszenzspektren die jeweils zugehörige, zugefügte Stoffkonzentration (0 bis 48 µmol/L) des Wirkstoffs Quinacrin/Suramin an. Die Ordinaten (Y-Achsen) geben die jeweils gemessenen Fluoreszenzintensitäten in relativen Fluoreszenzeinheiten an. Die in den Graphen A und C parallel zur Abszisse verlaufenden, mit Stern markierten Pfeile kennzeichnen die jeweils durch den Wirkstoff hervorgerufene Verschiebung des Fluoreszenzmaximums.
Die Interaktion von Quinacrin mit der SARS-CoV-2 3CL Protease führte, wie schon zuvor erwähnt, zu einem sogenannten „blue edge excitation shift“. Dabei bewegte sich das Fluoreszenzmaximum um 10 nm von 330 nm nach 320 nm. Diese Bewegung des Fluoreszenzmaximums geht einher mit der Bewegung der Tryptophanreste im Protein in eine hydrophobe Umgebung.
Die Bindung von Suramin an die SARS-CoV-2 3CL Protease dagegen führte zu einem starken „red edge excitation shift“. Dabei bewegte sich das Fluoreszenz Maximum um 30 nm von 330 nm nach 360 nm. Dieser Vorgang ist definiert durch eine erhöhte Zugänglichkeit der Tryptophanreste mit dem Umgebungsmedium und ist typisch für Konformationsänderungen in der Proteinstruktur.
4 Graph A: Fluoreszenzspektren von SARS-CoV-2 3CL^pro unter Einfluss der Suramintitration. Suramin bewirkt einen „red edge excitation shift“ des sichtbaren Trp (*).
4 Graph B: Mit Hilfe einer Bindungssättigungskurve und einer modifizierten Hill-Gleichung konnte eine Dissoziationskonstante (K_D) ermittelt werden. Sie beträgt 4,5 ± 1,2 uM für die SARS-CoV-2 3CL^pra-Suramin-Wechselwirkung.
4 Graph C: Fluoreszenzspektrum von SARS-CoV-2 3CL^pro unter Einfluss der Quinacrintitration. Quinacrin bewirkt einen „blue edge excitation shift“ des sichtbaren Trp (*).
4 Graph D: Mit Hilfe einer Bindungssättigungskurve und einer modifizierten Hill-Gleichung konnte ein K_D Wert ermittelt werden. Er beträgt 6,0 ± 1,8 uM für die SARS-CoV-2 3CL^pro-Quinacrin-Wechselwirkung.
Der KD Wert liefert zunächst keinen direkten Hinweis auf den Wirkmechanismus von Suramin und /oder Quinacrin auf virale Cysteinproteasen. Indirekt sagt der K_D Wert jedoch etwas über die Qualität der Interaktion zwischen der Cysteinprotease und den beiden Molekülen Suramin und Quinacrin aus.
Wenn die Interaktion schwach wäre, könnten die Inhibitoren einfach wieder von der Bindestelle der Cysteinproteasen diffundieren und die Hemmung würde wieder aufgehoben werden.
In kombinierter Betrachtungsweise des K_D Werts mit den Resultaten aus den Inhibitor Tests kann jedoch zum einen aus den gute IC₅₀ Werten, die auf eine deutliche Hemmung der Protease hinweisen und zum anderen aus den K_D Werten, die im unteren µM Bereich liegen, was für eine solide Interaktion für unsere Moleküle spricht (ein Peptid kann im nM oder pM Bereich liegen), auf eine nachweisbare Hemmung und Interaktion der Molekülkombination Suramin und Quinacrin auf die Aktivität der viralen Cysteinproteasen, insbesondere SARS-CoV-2 3CL^pro Proteinase geschlossen werden.
Während die Erfindung anhand von besonderen Ausführungsbeispielen im vorangehenden Teil der Anmeldung eingehend beschrieben und bebildert wurde, sollen diese Beschreibung und die Figuren lediglich als Beispiel gelten, ohne dadurch einschränkend zu wirken. Es ist davon auszugehen, dass ein Fachmann im Rahmen seines Fachwissens selbst weitere Änderungen und Modifikationen der nachfolgenden Ansprüche vornehmen würde und könnte, die durch den Schutzbereich der Ansprüche mit abgedeckt sind. Insbesondere sind im Rahmen der Erfindung weitere Ausführungsformen mit jeder Art von Kombinationen der erwähnten Merkmale einzelner Ausführungsbeispiele mit umfasst.
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Claims

Stoffkombination zur Inhibierung viraler Cysteinproteasen, insbesondere viraler 3CL Proteasen, enthaltend Suramin und Quinacrin.
Stoffkombination nach vorhergehendem Anspruch, wobei das Verhältnis der Stoffmengenkonzentration von Suramin zu Quinacrin das Verhältnis (1 - 10) zu (1 bis 10) ist.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Inhibierung viraler Cysteinproteasen, die in Viren der Familie der Coronaviridae vorkommen.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Inhibierung viraler Cysteinproteasen, die in Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV vorkommen.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung viraler Infektionen in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Arzneimittel in der Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung einer Infektion in einem Organismus mit Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV.
Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung viraler Infektionen in einem Menschen oder Tier.
Stoffkombination gemäß den vorhergehenden Ansprüchen in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern.
Arzneimittel enthaltend eine Stoffkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 11 sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
Verwendung einer Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae.
Verwendung einer Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 in der Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere virale 3CL Proteasen.