DE60036690T2

DE60036690T2 - Verwendung von epoxyhydrolasekomplexe zur behandlung von hypertension

Info

Publication number: DE60036690T2
Application number: DE60036690T
Authority: DE
Inventors: Bruce D. Davis HAMMOCK; Christophe H. One Shields Ave. Davis MORISSEAU; Jiang Northeastern University Boston ZHENG; Marvin H. Winters GOODROW; Tonya One Shields Ave. Davis SEVERSON; James Sacramento SANBORN
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1999-02-18
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2020-02-11
Also published as: ATE375153T1; DE60036690D1; US6150415A; AU3360800A; EP1844767A2; JP2002540767A; CA2362331C; CA2362331A1; WO2000048593A1; EP1844767A3; DK1154764T3; EP1154764B1; EP1154764A1; EP1154764A4; ES2291196T3; EP1844767B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen gemäß der Formel von Anspruch 1, wie Harnstoffe, welche einen Komplex mit Epoxidhydrolase bildet, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Bluthochdruck.
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der US-Regierung unter Grant ES02710, erhalten vom Nationalen Gesundheitsinstitut, gemacht. Die Regierung hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Diese Anmeldung ist eine Teilfortführung der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der fortlaufenden Nummer 08/909,523, eingereicht am 12. August 1997, Hammock et al., von gemeinsamem Aufgabengebiet, die auf der vorläufigen Anmeldung mit der fortlaufenden Nummer 60/023,397, eingereicht am 13. August 1996, jetzt fallengelassen, beruht.
Hintergrund der Erfindung
Epoxidhydrolasen (EH, E.C. 3.3.2.3) sind Enzyme, welche die Hydrolyse von Epoxiden, einschließlich Arenoxiden, zu deren entsprechenden Diolen durch Anlagern von Wasser katalysieren. EHs spielen eine wichtige Rolle im Metabolismus einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Hormonen, Fettsäurederivaten, Chemotherapeutika, Karzinogenen, Umweltschadstoffen, Mykotoxinen und anderen schädlichen fremden Verbindungen.
Mehrere Mitglieder dieser ubiquitären Enzymunterfamilie wurden aufgrund der Substratspezifität und der subzellulären Lokalisierung beschrieben. Solche Säuger-EHs umfassen Cholesterinepoxidhydrolase, Leukotrien A₄-Hydrolase, Hepoxilinhydrolase, mikrosomale Epoxidhydrolase (mEH) und lösliche Epoxidhydrolase (sEH). Die letzten zwei Enzyme wurden ausführlich untersucht und es wurde gefunden, dass diese eine breite und komplementäre Substratselektivität aufweisen. Es ist bekannt, dass die mikrosomalen und löslichen Formen mutagene, toxische und karzinogene xenobiotische Epoxide entgiften, bei der physiologischen Homöostase beteiligt sind, und beide Mitglieder der α/β-Hydrolase-Faltungsfamilie sind.
Das US-Patent 5,445,956 , erteilt am 29. August 1995, Erfinder Hammock et al., offenbart rekombinante lösliche Epoxidhydrolase aus Mensch und Maus. Das Maus-Enzym stellt ein Nagetieruntersuchungsmodell im Hinblick auf die therapeutische Entwicklung von Inhibitoren für lösliche humane Epoxidhydrolysen bereit.
Die Suche nach guten sEH-Inhibitoren wurde während etwa der letzten zwanzig Jahre aktiv betrieben, wie durch Hammock et al., Comprehensive Toxicology, (Guengerich, F. P., Herausgeber), Pergamon, Oxford, Band 3, Kapitel 18, Seiten 283–305 (1997) im Rahmen eines Reviews dargestellt. Zahllose Reagenzien, welche selektiv Thiole, Imidazole und Carboxyle modifizieren, inhibieren sEH irreversibel. Mullin und Hammock, Arch. Biochem. Biophys., 216, Seiten 423–429 (1982) offenbart, dass Chalkonoxide wirksame Inhibitoren von sEH sind, und Dietze et al., Corp. Biochem. Physiolo., 1048, Nr. 2, Seiten 309–314 (1993) offenbart, dass trans-3-Phenylglycidole wirksame chirale Inhibitoren von sEH sind.
Die ebenfalls anhängige US-Anmeldung mit der fortlaufenden Nummer 08/909,523, eingereicht am 12, August 1997, Hammock et al., schlägt die Behandlung von Lungenerkrankungen mit Epoxidhydrolase-Inhibitoren, wie Chalkonoxiden, vor und beschreibt Assays für Epoxidhydrolase-Inhibitoren. Unter den beschriebenen Epoxidhydrolase-Inhibitoren sind alternative Enzymsubstrate, wie das Epoxid von Methyloleat und andere Fettsäuren und Ester oder Methylepoxyoctadecenoat und Phenylglycidiole, sowie Chalkonoxide.
Es wurde beschrieben, dass EH-Enzyme in einer großen Vielzahl von Spezien, einschließlich Bakterien, Hefe, Pilzen, Pflanzen, Nematoden, Insekten, Vögeln, Fischen und Säugetieren, vorkommen. Sie scheinen tatsächlich in den meisten, wenn nicht allen, Organismen vorzukommen und dienen verschiedenen Zwecken. Epoxid hydrolasen aus Pflanzen sind ebenfalls bekannt. Es wurden beispielsweise Fettsäureepoxidhydrolasen aus Apfelhaut, Sojabohnensämlingen und Reispflanzen beschrieben. Die cDNAs, welche Epoxidhydrolase aus Kartoffel, Kresse und Tabak codieren, wurden isoliert und kloniert. Stapleton et al., Plant J., 6, Seiten 251–258 (1994); Kiyosue et al., Plant J., 6, Seiten 259–269 (1994); Guo et al., Plant J., 15, Seiten 647–656 (1998). Diese Epoxidhydrolasen aus Pflanzen weisen eine hohe Homologie mit löslicher Säuger-Epoxidhydrolase auf, sind jedoch am N-Terminus 30% kürzer.
Die Epoxidhydrolasen in Insekten und anderen Arthropoden wirken im Metabolismus von endogenen chemischen Mediatoren, wie dem Juvenilhormon, und beim Abbau von Pflanzenallelochemikalien mit, welche die Pflanze gegen Insekten schützt. Diese Enzyme in Pflanzen katalysieren die Hydratation von Epoxystearinsäure zu den entsprechenden α,β-Diolen, die wichtige Zwischenprodukte in der Biosynthese von Cutin sind und eine gewisse antimykotische Wirkung aufweisen.
Epoxide und Diole sind synthetische Schlüsselzwischenprodukte bei der Herstellung von organischen Massen- als auch Spezialchemikalien. Biosynthetische Mechanismen zur Umwandlung von Epoxiden in Diole unter sanften, regio- und stereospezifischen Bedingungen sind folglich sehr wichtig. Die Fähigkeit durch die Verwendung eines selektiven Inhibitors zu testen, ob ein biosynthetischer Weg ein Epoxid einschließt, kann wichtig sein bei der Suche nach neuen biosynthetischen Enzymen, und die Verwendung von hochaffinen Bindungsagenzien bei der schnellen Affinitätsreinigung von Epoxidhydrolasen hat sich als sehr wichtig beim Untersuchen von löslichen Säuger-Epoxidhydrolasen erwiesen.
Die gegenwärtig bekannten hochaffinen Bindungsagenzien für die Affinitätsreinigung von löslichen Säuger-Epoxidhydrolasen umfassen Thiole, wie Benzylthiol, Alkyl- oder Terpenoidthiole, die mit Epoxy-aktiviertem SEPHAROSE-Trennmedium (SEPHAROSE ist von Pharmacia erhältlich) umgesetzt wurden. Diese Affinitätschromatographiesäulen binden eine Vielzahl von Proteinen, wobei viele derselben ein lipophiles aktives Zentrum aufweisen. Die lösliche Epoxidhydrolase kann allgemein wie durch Prestwich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, Seiten 1663–1667 (1985) und Wixtrom et al., Analyt. Biochem., 169, Seiten 71–80 (1988) beschrieben, selektiv mit Chalkonoxiden von diesen Säulen eluiert werden. Zur Zeit gibt es jedoch keine Affinitätsreinigungssysteme für andere Epoxidhydrolasen, welche für eine erste Isolierung und Klonierung dieser Enzyme sowie für die Isolierung von Epoxidhydrolasen für industrielle Zwecke verwendet werden könnten. Neue hochaffine Bindungsagenzien für verschiedene Epoxidhydrolasen, insbesondere für lösliche Säuger-Epoxidhydrolasen, bleiben eine wertvolle Zielsetzung. Auch Eluierungsmittel, die kompetitive statt irreversible Inhibitoren sind, können nützlich sein.
FR-A-1403699 beschreibt asymmetrische 1,3-Dincloarylharnstoffe und deren Verwendung bei der Verringerung des Wachstums von Unkräutern. US-A-3347658 beschreibt Herbizidzusammensetzungen und Verfahren unter Einsatz von Dicycloarylharnstoffen. Beaune, PH et al., Journal of Chromatography, 426 (1998): 169–176, beschreibt ein Verfahren zur Reinigung einer mikrosomalen Epoxidhydrolase aus menschlicher Leber. EP-A-4011903 beschreibt die Verwendung von Vanilloiden für die Behandlung von Atemwegserkrankungen oder -krankheiten. EP-A-446699 beschreibt Verbindungen, die geeignet sind als Inhibitoren der Biosynthese von Nitritoxid. Usha, R. et al., Protein Expression and Purification, 15 (1999): 48–56, beschreibt die Reinigung eines multi-katalytischen Proteasekomplexes aus sich entwickelnden Goabohnensamen durch indirekte Immunaffinitätschromatographie. Riley, R.J. et al., Br. J. Clin. Pharmac. (1989), 28:482–487, beschreibt die strukturellen Voraussetzungen für die Bioaktivierung von Antikrampfgiften durch cytotoxische Metaboliten in vitro. WO 98/06261 beschreibt Verfahren zum Behandeln von Lungenerkrankungen, vermittelt durch polyungesättigte Lipidmetabolite, und Assays für Epoxidhydrolase-Inhibitoren.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Verfahren wird beschrieben, jedoch nicht beansprucht, das nützlich ist zum Reinigen, Isoliern oder Inhibieren der Ziel-Epoxidhydrolase durch Komplexbildung mit einer Verbindung in freier Form oder einer immobilisierten Verbindung, so dass die Aktivität der komplexierten Epoxidhydrolase gegenüber einer enzymatisch aktiven, nicht-komplexierten Epoxidhydrolase modifiziert ist. Bei der Ausführung dieser Erfindung zur Bildung von Komplexen mit Epoxidhydrolasen geeignete Verbindungen umfassen Epoxidhydrolase-Übergangszustandsmimetika. Harnstoffe, Amide und Carbamate können beispielsweise den Enzymübergangszustand oder andere transiente Intermediate entlang der Reaktionskoordinate nachahmen, falls diese Verbindungen stabil mit dem aktiven Zentrum des Enzyms wechselwirken.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Klasse von Verbindungen mit dieser Komplexbildungsfähigkeit, welche die in Formel 1 gezeigte Struktur aufweisen, FORMEL 1
wobei X und Y jeweils unabhängig voneinander Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, und X außerdem Kohlenstoff sein kann, und mindestens einer von R₁-R₄ Wasserstoff ist, R₂ Wasserstoff ist, wenn X Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist, R₄ Wasser ist, wenn Y Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R₁ und R₃ jeweils unabhängig voneinander substituiertes oder nicht substituiertes Alkyl, Haloalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl oder ein Heterozyklus sind, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Bluthochdruck in einem Säuger.
Falls die modifizierte Aktivität der komplexierten Epoxidhydrolase eine Enzym-Inhibierung ist, weisen besonders bevorzugte Ausführungsformen von Verbindungen einen IC₅₀ (Inhibierungsvermögen oder, per Definition, die Konzentration des Inhibitors, welche die Enzymaktivität um 50% verringert) von weniger als 500 μM auf. Wir haben beispielsweise entdeckt, dass die fünf Verbindungen, die in der Tabelle 1 aufgelistet sind, einen IC₅₀ für die lösliche Maus-Epoxidhydrolase von weniger als 0,1 µM und weniger als 0,8 µM für die lösliche humane Epoxidhydrolase aufweisen.
TABELLE 1
In der Tabelle 1 ist die Verbindung 187 ein Amid und zeigt, dass der Pharmacophor allgemeiner sein kann als Harnstoffe oder Carbamate.
Die Enzyme, die für diese Erfindung von Interesse sind, sind üblicherweise in der Lage, Enantiomere zu unterscheiden. Folglich ist es bei der Wahl eines Inhibitors zur Verwendung in einer Anwendung gemäß der Erfindung bevorzugt, verschiedene optische Isomere des Inhibitors mit dem ausgewählten Enzym mittels Routine-Assays zu screenen, um ein besseres optisches Isomer für die bestimmte Anwendung auszuwählen, falls zweckdienlich. Die vorliegend beschriebenen Pharmacophore können verwendet werden, um dem aktiven Zentrum eine reaktive Funktionalität zuzuführen. Diese könnte Alkylierungsmittel, wie Halogene oder Epoxide oder Michael-Akzeptoren, die mit Thiolen und Aminen reagieren, umfassen. Diese reaktiven Funktionalitäten können auch verwendet werden, um dem aktiven Zentrum des Enzyms Fluoreszenz- oder Affinitätsmarkierungen zum Enzymnachweis zuzuführen.
Die Inhibierung von löslicher Epoxidhydrolase kann therapeutisch wirksam sein, um eine Entzündungserkrankung zu behandeln, wie das Atemnotsyndrom der Erwachsenen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass geeignete Epoxidhydrolase-Inhibitoren eine Entzündungsantwort in einem Patienten über eine Inhibierung der Bildung einer oder mehreren polyungesättigten Lipidmetaboliten, wie die Inhibierung der Bildung von Dihydroxyoxyeicosadienoaten, oder DiHOxyEDEs in der Arachidonsäurereihe von Oxylipinen, verzögert oder verhindert. Arachidonsäureepoxide (EETs) und in einigen Fällen die entsprechenden Diole (DHETs) sind allgemein bekannt, auch biologisch aktiv zu sein. Man glaubt, dass diese am Verlauf und Schwere von Fieber beteiligt sind (Kozak, 1998); die Erzeugung von Prostaglandin E2 in vaskulärem glattem Muskel inhibieren (Fang, 1998), die Bradykinin-induzierte Vasodilation des Herzens vermitteln (Fulton, 1998), die Vasodilation induzieren (Oltman, 1998; Imaoka, 1998), und andere physiologische Wirkungen haben. Die lösliche Epoxidhydrolase scheint einen von einer Entzündung abstammenden Mediator biologisch zu aktivieren, was die Notwendigkeit hinsichtlich wirksamer und ortsspezifischer Inhibitoren von Epoxidhydrolase, wie die hier beschriebenen, nahe legt. Der Inhibitor von Epoxidhydrola se kann auch therapeutisch verwendet werden, um Fieber, entzündliche Erkrankungen und Bluthochdruck zu behandeln. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren wirken folglich durch Verringerung der Umwandlung der Lipidepoxide in die entsprechenden Diole, wie die Umwandlung von EEP's in DHET's.
Die Bildung eines Epoxidhydrolase-Komplexes ist nützlich bei der Reinigung oder Isolierung der Ziel-Epoxidhydrolase. Die Verbindung der Formel 1 kann beispielsweise so derivatisiert werden, dass diese an einen wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist. Wenn man den Träger mit enzymatisch aktiver Epoxidhydrolase kontaktiert, beispielsweise bei der Eluierung einer wässrigen Lösung mit Epoxidhydrolase durch den Träger, führt die Komplexbildung dann zu einer selektiven Abtrennung der Epoxidhydrolase.
Inhibitoren, wie bestimmte Analoga und aktive Derivate der Verbindung der Formel 1, können auch verwendet werden, um Epoxidhydrolasen von diesen und anderen Trägern zu eluieren. Wie zuvor angemerkt, umfassen nützliche Verbindungen, die einen Komplex mit Epoxidhydrolasen eingehen, Epoxidhydrolaseübergangszustand-Dicyclohexylmimetika, wie Harnstoffe und Carbamate, welche den Enzymübergangszustand nachahmen können, falls diese stabil mit dem aktiven Zentrum des Enzyms wechselwirken. Wir haben gefunden, dass Analoga der Verbindung der Formel 1, die auch als selektive Inhibitoren von löslicher Epoxidhydrolase fungieren können, Verbindungen mit der Struktur der Formel 2 umfassen (wobei X, Y, R₁, R₂, R₃ und R₄ wie für Formel 1 beschrieben sein können), wobei Z jedoch Sauerstoff oder Schwefel ist, und W Kohlenstoff, Phosphor oder Schwefel ist. Eine Darstellung mehrerer solcher beispielhaften Inhibitorverbindungen der Struktur der Formel 2 sind in der Tabelle 2 gezeigt. Die Verbindung 12 kann zu dem entsprechenden Carbodiimid (Verbindung 1) und anschließend zu dem entsprechenden Harnstoff (Verbindung 2) umgewandelt werden.
Die Verbindungen der Formel 2 sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung, außer diejenigen Verbindungen der Formel 2, die durch die Formel 1 erfasst sind. FORMEL 2
TABELLE 2
Ein Thioharnstoff kann chemisch und biochemisch in ein Carbodiimid umgewandelt werden und das Carbodiimid kann sich zu Harnstoff hydrolysieren. Wenn die N- und N'-Substituenten Cyclohexyl sind, dann ist die Verbindung Dicyclohexylcarbodiimid (Verbindung 1).
Wir glauben, dass die hierin beschriebenen Inhibitoren die ersten biologisch stabilen Inhibitoren für alle Epoxidhydrolasen sind. Die Inhibitoren können auf Epoxidhydrola sen in Säugern, Pflanzen, Insekten und wahrscheinlich auf alle Organismus mit einer Epoxidhydrolase angewendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B stellen graphisch die Wirkung der Zeit auf die Inhibierung von löslicher Maus-EH bzw. löslicher humaner EH durch die Verbindungen 1 und 2 dar; und
die 2 stellt graphisch die Wirkung der Verbindung 2 auf die lösliche Kartoffel-EH (22,5 nM) und lösliche Kresse-EH (35 nM) dar.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegenden Verbindungen sind Inhibitoren von Epoxidhydrolase, vorzugsweise selektive Inhibitoren. Dies bedeutet, dass ein Inhibitor eine größere inhibitorische Wirkung auf ein EH-Enzym als auf andere EH-Enzyme aufweist, und hat eine höhere Selektivität für EH als für Nicht-EH-Enzyme.

Bei der Ausführung dieser Erfindung ist es besonders bevorzugt, lösliche EH selektiv zu inhibieren. Das Beispiel 5 zeigt den Assay, der zur Bestimmung der selektiven Inhibierung von löslicher EH für eine Anzahl von Verbindungen, die gemäß dieser Erfindung nützlich sind, verwendet wurden, wobei deren Inhibitordaten in der Tabelle 4 gezeigt sind. Die Selektivität ist in der Tabelle 3 dargestellt, wobei der verwendete Inhibitor die Verbindung 2 war. TABELLE 3

Enzyme	% Inhibierung durch 100 µM von 2
cytosolische EH	99,3 ± 0,8
Peroxisom-EH	99,6 ± 0,6
mikrosomale EH	0,5 ± 0,8
cytosolische GST	0,8 ± 1,1
mikrosomales P-450	1,7 ± 2,3
mikrosomale Carboxylesterase	3,5 ± 4,7
Pepsin	0,1 ± 0,1

Wie durch die Daten der Tabelle 3 gezeigt, inhibierte die Verbindung 2 bei einer Konzentration von 100 µM die cytosolische und die Peroxisom-EH-Aktivität vollständig, während keine signifikante Inhibierung für die anderen getesteten Enzymaktivitäten beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen die selektive Inhibierung von löslicher EH, die im Cytosol vorliegt, und Peroxisom-Enzymen, durch gemäß der Erfindung nützlichen Verbindungen. Eine Schlussfolgerung aus diesen Daten besteht darin, dass die Verbindung 2 ein wirksamer Inhibitor der cytosolischen und peroxisomalen EH, jedoch nicht der anderen getesteten Enzyme ist. Der für die Verbindung 2 für Maus-sEH berechnete K_i betrug 22 ± 3 nM.
Geeignete Inhibierung
Ein Verfahren wird beschrieben, das geeignet ist zum Reinigen, Isolieren oder Inhibieren der Ziel-Epoxidhydrolase durch Komplexbildung mit einer Verbindung in freier Form oder einer immobilisierten Verbindung, so dass die Aktivität der so komplexierten Epoxidhydrolase gegenüber enzymatisch aktiver, nicht-komplexierter Epoxidhydrolase modifiziert ist.
Verbindungen mit dieser Komplexbildungsfähigkeit zur Verwendung gemäß der Er findung weisen die in der Formel 1 gezeigte Struktur auf. FORMEL 1
wobei X und Y jeweils unabhängig voneinander Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, und X außerdem Kohlenstoff sein kann, mindestens einer von R₁-R₄ Wasserstoff ist, R₂ Wasserstoff ist, wenn X Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist, R₄ Wasserstoff ist, wenn Y Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R₁ und R₃ jeweils unabhängig voneinander H, C_1-20 substituiertes oder nicht substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl oder ein Heterozyklus sind.
Zusätzlich zu den Verbindungen der Formel 1, welche aufgrund des Inhibitors, der einen Enzym-Substrat-Übergangszustand oder ein Reaktionsintermediat nachahmt, mit dem Enzym in reversibler Weise wechselwirkt, sind andere Verbindungen irreversible Inhibitoren des Enzyms. Die aktiven Strukturen, wie diejenigen der Tabellen oder der Formel 1, können den Inhibitor zu dem Enzym leiten, wo eine reaktive Funktionalität im aktiven Zentrum des Enzyms eine kovalente Bindung mit dem Inhibitor ausbilden kann. Eine Gruppe von Molekülen, die so Wechselwirken könnten, hätten eine Abgangsgruppe, wie ein Halogen oder ein Tosylat, die durch ein Lysin oder ein Histidin gemäß S_N2 angegriffen werden könnte. Alternativ könnte die reaktive Funktionalität ein Epoxid oder ein Michael-Akzeptor sein, wie ein α/β-ungesättigter Ester, ein Aldehyd, ein Keton, ein Ester oder ein Nitril.
Wie in 1 gezeigt, erhöht sich die Inhibierung der Maus-sEH durch die Verbindung 1 mit der Zeit, während die Inhibierung durch die Verbindung 2 über die Zeit stabil ist. Diese Beobachtung könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass das Carbodiimid 1 in einer Wasserlösung langsam zu dem Harnstoff 2 hydrolysiert wird. Diese Ergebnisse stützten die Hypothese, dass die Harnstoffe, Carbamate, Amide und verwandte Verbindungen, die in dieser Erfindung diskutiert werden, direkt wirken. Diese Ergebnisse zeigen auch die Möglichkeit auf, Carbodiimide als Vorläuferformen der in der Erfindung nützlichen Harnstoff-Verbindungen zu verwenden. Thioharnstoffe andererseits wurden kommerziell als Vorläuferformen von Carbodiimiden verwendet.
Dicyclohexylthiolharnstoff kann zu Dicyclohexylcarbodiimid oxidiert werden, das, mit Enzym oder einer wässrigen Säurelösung (physiologische Salzlösung), einen aktiven Dicyclohexylharnstoff bilden wird. Alternativ können die sauren Protonen der Carbamate oder Harnstoffe durch eine Vielzahl von Substituenten ersetzt werden, welche nach Oxidation, Hydrolyse oder Angriff durch ein Nukleophil, wie Glutathion, die entsprechende Stammstruktur ergeben wird. Diese Materialien sind als Prodrugs oder Protoxine bekannt (Gilman et al., 1985, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. Auflage, MacMillan Publishing Company, New York, Seite 16). Ester sind beispielsweise verbreitete Prodrugs, welche freigesetzt werden, um enzymatisch die entsprechenden Alkohole und Säuren zu ergeben (Yoshigae et al., Chirality, 9, Seiten 661–666, 1997). Die Prodrugs können für eine höhere Spezifität chiral sein. Diese Derivate wurden umfassend in der Medizin- und Agrochemie verwendet, um die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen zu verändern, wie beispielsweise zum Erhöhen der Wasserlöslichkeit, zum Verbessern der Formulierungschemie, zum Verändern des Gewebe-Targetings, zum Verändern des Verteilungsvolumens und zum Verändern des Penetrationsvermögens. Sie wurden auch verwendet, um toxikologische Profile zu verändern.
Es gibt viele mögliche Prodrugs, wobei jedoch der Ersatz eines oder beider der zwei aktiven Wasserstoffe in den hier beschriebenen Harnstoffen oder des einzigen aktiven Wasserstoffs, das in Carbamaten vorkommt, ist jedoch besonders günstig. Solche Derivate wurden ausführlich durch Fukuto und Mitarbeiter beschrieben. Diese Derivate wurden ausführlich beschrieben und werden allgemein in der Agro- und Medizinchemie verwendet, um die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen zu verändern (Black et al., "Selective Toxicity of N-Sulfenylated Derivatives of Insecticidal Methylcarbamate Esters", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 21(5), Seiten 747–751, 1973; Fahmy et al., "Selective Toxicity of N,N'-thiodicarbamates", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 26(3), Seiten 550–556, 1978; Jojima et al., "Sugar, Glyceryl, and (Pyridylalkoxy)Sulfinyl Derivatives of Methylcarbamates Insecticides", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 31(3), Seiten 613–620, 1983; und Fahmy et al., "N-Sulfinylated Derivative of Methylcarbamate Esters", Journal of Agricultural and Food Chemistry", 29(3), Seiten 567–572, Mai-Juni 1981).
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, glauben wir, das geeignete erfindungsgemäße Inhibitoren den Enzymübergangszustand nachahmen, so dass eine stabile Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms besteht. Die Inhibitoren scheinen Wasserstoffbindungen mit der nukleophilen Carbonsäure und einem polarisierenden Tyrosin des aktiven Zentrums zu bilden.
Falls die modifizierte Aktivität der komplexierten Epoxidhydrolase eine Enzyminhibierung ist, weisen besonders bevorzugte Ausführungsformen von Verbindungen einen IC₅₀ (Inhibierungsvermögen oder, per Definition, die Konzentration des Inhibitors, welche die Enzymaktivität um 50% verringert) von weniger als 500 µM auf.
Isolation oder Reinigung von Epoxidhydrolasen durch Affinitätstrennung
Affinitätsreinigungssysteme sind für Enzyme beschrieben, die ein Oxyanion-Loch und eine nukleophile Säure im aktiven Zentrum aufweisen, insbesondere im Falle, dass das Enzym eine Epoxidhydrolase ist. Wir glauben, dass es wahrscheinlich ist, dass die Inhibitoren, für die hierin gezeigt wurden, dass sie lösliche EH inhibieren, auch ein breites Spektrum an Enzymen der α/β-Hydrolase-Faltungsfamilie, die eine nukleophile Säure im aktiven Zentrum aufweisen, inhibieren werden. Ein Reinigungsverfahren für eine Epoxidhydrolase wird demzufolge beschrieben durch Immobilisieren einer Verbindung mit der Struktur der Formel 2 an einen wasserunlöslichen Träger. FORMEL 2
wobei Z Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ist, W Kohlenstoff, Phosphor oder Schwefel ist, X und Y jeweils unabhängig voneinander Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, und X außerdem Kohlenstoff sein kann, R₁-R₄ Wasserstoff ist, R₂ Wasserstoff ist, wenn X Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist, R₄ Wasserstoff ist, wenn Y Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R₁ und R₃ jeweils unabhängig voneinander H, C_1-20 substituiertes oder nicht substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl oder ein Heterozyklus sind.
Geeignete wasserunlösliche Träger, an welche die Verbindung der Formel 2 geeigneterweise immobilisiert sind, umfassen Epoxy-aktivierte SEPHAROSE, Aminopropyl- oder -hexyl-SEPHAROSE oder Carboxyl-SEPHAROSE. Eine Vielzahl von festen Trägermatrices, einschließlich Glaskügelchen, Polyvinylkügelchen oder Agarose, kann verwendet werden.
Die so immobilisierten Verbindungen stellen ein geeignetes Packungsmaterial für Affinitätstrennungen dar, wobei die immobilisierten Verbindungen einen Komplex mit Epoxidhydrolase bilden können, wenn eine wässrige Lösung durch eine mit dem Trennpackungsmaterial gepackte Säule eluiert wird, oder in einem Batchverfahren.
Die Immobilisierung der Verbindung erfolgt typischerweise durch Derivatisieren von einem von R₁ oder R₃ mittels gut bekannter Verfahren. Pharmacia Fine Chemicals verkauft beispielsweise Aminopropyl- oder andere aminoterminale Affinitätsmaterialien (üblicherweise unter der Handelsbezeichnung "SEPHAROSE") und BioRad Laboratories verkauft Agarosegele und -kügelchen für verschiedene Erfordernisse der Affinitätschromatographie (üblicherweise unter der Handelsbezeichnung "AFFI-GEL"). Diese Materialien können beispielsweise mit Isocyanaten behandelt werden, um stabile immobilisierte Harnstoffderivate gemäß der Erfindung zu erhalten, welche mit Epoxidhydrolasen einen Komplex bilden. Alternativ können die Verbindung der Formel 1 verwendet werden, um Epoxidhydrolasen von gebräuchlicheren Affinitätssäulen zu eluieren, wie in dem Fall, in dem ein Thiol (z. B. Benzylthiol) mit Epoxyaktivierter "SEPHAROSE" (entweder Gel oder Kügelchen), hergestellt durch Umsetzen von Butanglycoldiglycidylether, umgesetzt wird. Die Epoxidhydrolasen in einer wässrigen Lösung können dann selektiv mit den derivatisierten Harnstoffen der Formel 1 oder den derivatisierten Verbindungen der Formel 2 gemäß der vorliegenden Erfindung eluiert werden.
Inhibierung von Epoxidhydrolase zur Behandlung einer Entzündungserkrankung
(nicht Teil der Erfindung)
Die Entzündungsantwort ist eine der wichtigsten physiologischen Mechanismen für die Aufrechterhaltung der menschlichen Gesundheit. Entzündungsstörungen oder eine nicht adäquate Entzündungsantwort kann jedoch zu Gewebeschäden, Morbidität oder Mortalität führen.
Atemnotsyndrom der Erwachsenen (ARDS) ist eine Lungenerkrankung, welche eine Sterblichkeitsrate von 50% hat und auf Lungenläsionen zurückzuführen ist, welche durch eine Vielzahl von Zuständen verursacht sind, die in Trauma-Patienten und in Opfern starker Verbrennungen gefunden werden. Ingram, R. H. Jr., "Adult Respiratory Distress Syndrome", Harrisons's Principals of Internal Medicine", 13, Seite 1240, 1995. Mit der eventuellen Ausnahme von Glucocorticoiden gab es keine Therapeutika, von denen bekannt war, dass sie wirksam sind bei der Prävention oder Linderung von Gewebeschäden, wie eine mit einer akuten Entzündung assoziierte mikrovaskuläre Schädigung, welche während der frühen Entwicklung von ARDS auftritt.
ARDS, das teilweise durch die Entstehung eines alveolären Ödems definiert ist, stellt eine klinische Manifestation einer Lungenerkrankung dar, die sowohl aus einer direkten als auch einer indirekten Lungenschädigung resultiert. Während in früheren Studien eine scheinbar zusammenhangslose Vielzahl von verursachenden Agenzien ausführlich beschrieben wurden, sind die initialen Vorgänge, welche der Pathophysiologie von ARDS zugrunde liegen, nicht gut verstanden. ARDS wurde ursprünglich als Einzelorganversagen angesehen, wird nun jedoch als Komponente des Multisystem-Organversagungssyndroms (MOFS) betrachtet. Die pharmakologische Intervention oder Prävention der Entzündungsantwort wird gegenwärtig als vielversprechenderes Verfahren zum Kontrollieren des Krankheitsverlaufs als Atemunterstützungstechniken angesehen, siehe beispielsweise Demling, Annu. Rev. Med., 46, Seiten 193–203, 1995.
Eine andere Erkrankung (oder Gruppe von Erkrankungen), die mit einer akuten Entzündung einhergeht, ist das systemische Entzündungsantwortsyndrom, oder SIRS, wobei dies die Bezeichnung ist, die kürzlich von einer Gruppe von Forschern eingeführt wurde, um verwandte Zustände zu beschreiben, die beispielsweise aus einer Sepsis, einer Pankreatitis, multiplen Traumata, wie einer Hirnschädigung, und einer Gewebeschädigung, wie einem Muskelriss, einer Hirnoperation, einem hämorrhagischer Schock und einer immunvermittelten Organschädigung resultieren. Bone, JAMA, 268:24, Seiten 3452–3455, 1992.
Die Lunge mit ihrer ausgedehnten Oberfläche, die direkt der Umgebung ausgesetzt ist, ist besonders anfällig für eine oxidative Schädigung und Entzündungsprodukte. Da der gesamte Herzausstoß durch die Lungenarterie fließt, können die Lungen auch durch Agenzien im Blut geschädigt werden. Die zelluläre Heterogenität von Säugetierlungen verkompliziert die direkte Untersuchung dieser Lungenzellen, die am anfälligsten für eine Schädigung sind. Des Weiteren macht es die komplexe Lungenanatomie schwierig, genau zu unterscheiden, wo biologische Agenzien im Lungengewebe metabolisiert werden. Das Zielgewebe und die Abfolge von Ereignissen, welche einem alveolären Ödem zugrunde liegen, sind nicht abschließend festge stellt; deshalb bleiben die wechselseitigen Beziehungen und die jeweiligen Beiträge von endothelialen versus epithelialen versus inflammatorischen Kompartimenten bei der Verbesserung einer Schädigung der Luft-Blut-Schranke fraglich.
Die ARDS-Beschwerden werden bei einer Vielzahl von Patienten mit schweren Verbrennungen oder Sepsis beobachtet. Sepsis ist andererseits eines der SIRS-Symptome. In ARDS gibt es eine akute Entzündungsreaktion mit einer hohen Anzahl an Neutrophilen, welche in das Interstitium und die Alveolen wandern. Falls dies fortschreitet, ergibt sich eine verstärkte Entzündung, verstärkt Ödeme, eine verstärkte Zellproliferation und das Endergebnis ist eine beeinträchtigte Fähigkeit, Sauerstoff zu entziehen. ARDS ist folglich eine verbreitete Komplikation in einer Vielzahl von Erkrankungen und Traumata. Die einzige Behandlung ist unterstützend. Es treten geschätzte 150000 Fälle pro Jahr auf und die Mortalität liegt im Bereich von 10% bis 90%.
Die genaue Ursache von ARDS ist nicht bekannt. Es wurde jedoch die Hypothese aufgestellt, dass die Überaktivierung von Neutrophilen zur Freisetzung von Linolsäure in hohen Konzentrationen über eine Phospholipase A₂-Aktivität führt. Linolsäure wiederum wird enzymatisch durch Cytochrom P-450-Epoxygenase von Neutrophilen und/oder einem Burst von aktivem Sauerstoff zu 9,10-Epoxy-12-octadecenoat umgewandelt. Dieses Lipidepoxid, oder Leukotoxin, wird in hohen Konzentrationen in verbrannter Haut und im Serum und der Bronchial-Lavage von Verbrennungspatienten gefunden. Des Weiteren führt es bei der Injektion in Ratten, Mäuse, Hunde und andere Säugetiere zu ARDS. Der Wirkmechanismus ist nicht bekannt. Das Leukotoxindiol, das durch die Wirkung von löslicher Epoxidhydrolase erzeugt wird, scheint jedoch ein spezifischer Induktor der Permabilitätstransition der Mitochondrieninnenmembran (MPT) zu sein. Diese Induktion durch Leukotoxindiol, die diagnostische Freisetzung von Cytochrom c, die Kernkondensation, die DNA-Leiterbildung und die CPP32-Aktivierung, welche zum Zelltod führen, wurden alle durch Cyclosporin A inhibiert, was diagnostisch ist für den MPT-induzierten Zelltod. Die Wirkungen auf mitochondrialem und zellulärem Niveau stehen im Einklang mit diesem Wirkmecha nismus, was nahe legt, dass die hierin beschriebenen Inhibitoren mit Verbindungen, die MPT blockieren, therapeutisch verwendet werden könnten.
In der Erfindung nützliche therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Inhibitoren enthalten, können durch irgendeines der verschiedenen, gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Üblicherweise wird der Inhibitor so formuliert, dass dieser für die orale oder parenterale Verabreichung geeignet ist und ist üblicherweise in einem physiologisch tolerierbaren Träger oder Verdünnungsmittel gelöst oder dispergiert. Ein Inhibitor kann beispielsweise in einer flüssigen Zusammensetzung, wie einer sterilen Suspension oder einer Lösung gelöst oder dispergiert werden, oder als eine isotonische Zubereitung,. Besonders gut geeignet sind injizierbare Medien, die mit gepufferten oder nicht gepufferten isotonischen und sterilen Salz- oder Glucoselösungen formuliert sind. Für die in vitro-Verwendung kann die Inhibierung der Aktivität der Ziel-Epoxidhydrolase, wie gut bekannt, anhand der Abnahme des Enzündungsgrads verfolgt werden. Die Menge des verabreichten therapeutischen Inhibitors kann eine einzelne Verabreichung oder ein Teil der Gesamtmenge sein. Ferner sind mehrere Verabreichungen über eine Zeitspanne von mehreren Tagen, Wochen oder Monaten denkbar.
Der Wirkstoff kann auch in Zusammensetzung, wie Tabletten oder Pillen, die vorzugsweise eine Einheitsdosis enthalten, verwendet werden, und können mit herkömmlichen Tablettierungsbestandteilen vermischt sein. Die tatsächlichen Dosierungen des Epoxidhydrolase-Inhibitors können variiert werden, um die gewünschte therapeutische Antwort für eine bestimmte Zusammensetzung und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren zu erhalten. Die verabreichte tägliche Gesamtdosis kann von 0,001 bis 100 mg pro kg Körpergewicht sein. Bei der Ausführung der Erfindung sollte allerdings ein Wirkstoff, wie Clofibrat, der dafür bekannt ist, die lösliche Epoxidhydrolase und Cytochrom P-450 zu induzieren, und ein Wirkstoff, wie Acetaminophen, der zu einer Verarmung an Glutathion führt, vermieden werden. Der Grund hierfür besteht darin, dass wir experimentelle Daten haben, welche darauf hinweisen, dass, wenn die Glutathionkonzentrationen vermindert sind, Leukotoxin toxischer wird. Im Gegensatz dazu sollten parallele Therapien gefördert werden, die entwickelt wurden, um alternative Wege des Leukotoxin-Metabolismus zu verstärken, wie die Verabreichung von N-Acetylcystein und Glutathion und deren Ethylester.
Das Beispiel 1 veranschaulicht eine in vivo Anwendung der Inhibitor-Ausführungsform 2, um den durch Leukotoxine/Isoleukotoxine induzierten Tod eines Tieres blockieren oder das Leben von Mäusen zu verlängern.
REFERENZBEISPIEL 1
Männliche Swiss-Webster-Mäuse (25–28 g) wurden von Simonsen, Gilroy, Kalifornien, gekauft. Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Die Mäuse (drei in jeder Gruppe) wurden i. p. mit in Maisöl suspendiertem Dicyclohexylharnstoff (Verbindung 2) (400 mg/kg, 7 ml/kg) oder mit Maisöl als Positivkontrollen vorbehandelt. Nach 30 Minuten der Vorbehandlung wurden die Mäuse über die Schwanzvene intravenös mit einer 1:1-Mischung von Leukotoxin/Isoleukotoxinmethylester in Ethanol (700 mg/kg, 1,0 ml/kg) behandelt.
Die Mäuse starben nach Aussetzen gegenüber Leukotoxin/Isoleukotoxin an respiratorischer Insuffizienz. Die tödlichen Reaktionen erfolgten nacheinander durch beschleunigtes Atmen, Öffnen des Mundes zur Unterstützung der Atmung, und dem Austreten von Körperflüssigkeit aus der Nase. Die Vorbehandlung mit N,N'-Dicyclohexylharnstoff 2 blockierte jedoch entweder den durch Leukotoxin/Isoleukotoxin induzierten Tod der Tiere oder verlängerte das Leben der Mäuse.
Andere Anwendungen für die Inhibierung von Epoxidhydrolase
Eine Inhibierung von Epoxidhydrolase kann für Forschungszwecke nützlich sein, beispielsweise um die mikrosomale Epoxidhydrolase im Ames-Assay und anderen Toxizitätassays zu inhibieren, bei denen man die Sensitivität des Assays für Epoxid enthaltende Mutagene und Karzinogene erhöhen kann und die Hypothese, dass das Epoxid bei der Toxinwirkung beteiligt ist, überprüfen kann.
Die Tabelle 4 zeigt eine Vielzahl von Inhibitoren zusammen mit Inhibierungsdaten. TABELLE 4
Die Daten der Tabelle 4 zeigen, dass lösliche EH selektiv inhibiert werden kann, und die Verbindungen 19 und 101 zeigen, dass auch mikrosomale EH inhibiert werden kann. Wir glauben, dass diese Verbindungen ein breites Spektrum von Enzymen der α/β-Hydrolase-Faltungsfamilie, die eine nukleophile Säure im aktiven Zentrum aufweisen, inhibieren werden. Diese Verbindungen sollten es der Computerchemie ermöglichen, weitere aktive Materialien vorherzusagen.
Ferner stellt Verbindung 2 einen sehr wirksamen Inhibitor (bevorzugte Ausführungsform) der EHs dar. Die Verbindungen 19, 101, 204 und 238 stellen wirksame selektive Inhibitoren der mikrosomalen EH dar. Die Verbindung 225 zeigt, dass chirale Verbindungen verwendet werden können, um die Wirksamkeit und Selektivität zu erhöhen.
Wie zuvor erwähnt, können auch Metabolite oder Abbauprodukte der Inhibitoren der Formel 1 oder Formel 2 Inhibitorkomplexe mit EH bilden und nützlich bei der Ausführung der Erfindung sein. So ist beispielsweise die Verbindung 32 der Tabelle 4 ein bekannter Metabolit des Herbizids Diuron, und die Verbindung 32 inhibiert lösliche Epoxidhydrolase aus Mensch und Maus. Die Verbindung 303 (ein Abbauprodukt der Verbindung 28) ist ein besserer Inhibitor der mikrosomalen Ratten-Epoxidhydrolase.
Die therapeutischen Anwendungen der Inhibierung von Epoxidhydrolyse gemäß der Erfindung können auch in Verbindung mit einer Krebstherapie nützlich sein. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Epoxidhydrolase-Expression in malignen Tumoren ein möglicher Mechanismus ist, der für die Antikrebsmittel-Resistenz vorgeschlagen wurde. Murray et al., "The Expression of Cytochrome P-450, Epoxide Hydrolase, and Glutathione S-Transferase in Hepatocellular Carcinoma", Cancer, 71, Seiten 36–43, 1993; Theyer et al., "Role of the MDR-1-Encoded Multiple Drug Resistance Phenotype in Prostate Cancer Cell Line", J. of Urology, 150, Seiten 1544–1547, 1993; Murray et al., "The Immunohistochemical Localization of Drug-Metabolizing Enzymes in Prostate Cancer", J. of Pathology, 177, Seiten 147–152, 1995.

Tabelle 5 zeigt beispielsweise die mEH-Aktivität für cis-Stilbenoxid (Wixtrom und Hammock, 1985, Biochemical Pharmacology and Toxicology, Band 1: Methodological Aspect of Drug Metabolizing Enzymes (Zakin und Versey, Hrgb.), John Wiley & Sons, Inc., New York, Seiten 1–93) mit verschiedenen Krebszelllinien, welche mikrosomale EH exprimieren. Es ist gut bekannt, dass dieses Enzym im Leber-Metabolismus des Wirkstoffs mitwirkt. Die Inhibierung dieses Enzyms durch Verbindungen der Formeln 1 oder 2 sollte deshalb den Metabolismus von Epoxid enthaltenden Krebsmitteln verringern und folglich deren Wirksamkeit erhöhen. Tabelle 5

Zelllinie	mEH-Aktivität (nMol.min^–1.mg^–1)
Prostatakrebszellen
PC-3	0,67
DU 145	1,80
LNCaP	1,37
Lungenkrebszellen
CaLu-1	1,53
A-549	0,66
Kopf- und Halskrebszellen
SQ-20B	0,37
Eierstockkrebszellen
ES-2	0,10
SK-OV3	1,11

Wie aus den Daten der Tabelle 5 ersichtlich, ist die mikrosomale EH-Aktivität in mehreren Krebslinien signifikant exprimiert und könnte im Metabolismus von Krebsmedikamenten, wie Cyclohexendiepoxid, in malignen Tumoren mitwirken. Eine Vielzahl von antineoplastischen Wirkstoffen wurden entwickelt, deren Wirkung auf den alkylierenden Eigenschaften von Epoxiden und Diepoxiden beruht. Die Inhibitoren von Epoxidhydrolase könnten diese Verbindungen stabilisieren und deren antineoplastische Aktivität verstärken.
Die Herstellung von beispielhaften Inhibitoren und eines Assays, der zur Bestimmung der Inhibierung nützlich ist, wird nun näher durch die Beispiele 2–5 beschrieben.
BEISPIEL 2
Synthese von 1-Octyl-3-penylharnstoff
Zu 0,262 g (3,00 mmol) Pentylamin in 20 ml Hexan werden 0,53 ml (0,47 g, 3,0 mmol) Octylisocyanat unter Rühren gegeben, um letztendlich einen weißen kristallinen Feststoff zu erzeugen. Nach Stehenlassen über Nacht wird die Mischung gekühlt, das feste Produkt gesammelt und mit kaltem Hexan gewaschen. Durch Trocknen an der Luft werden 0,705 g (2,91 mmol, 97%) 1-Octyl-3-pentylharnstoff als sehr feine weiße Nadeln, Schmp. 65,0–65,5°C, erhalten. Dieses Material zeigt ein ¹³C-NMR-Spektrum und ein Massenspektrum, das mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt. ¹³C-NMR (CDCl₃): δ 159,0 (C=O), 40,47 und 40,45 (C-1 und C-1'), 31,8 (C-6 und C-3'), 30,4 (C-2), 30,1 (C-2'), 29,3 (C-4), 29,2 (C-5), 27,0 (C-3), 22,5 (C-7), 22,4 (C-4'), 13,9 (C-8 und C-5'); wichtige Infrarotbanden (KBr-Scheiben) sind vorhanden bei 3334 (s, N-H), 1617 (vs, C=O) und 1579 (vs, Amid II) cm^–1.
BEISPIEL 3
Synthese von 1-Cyclohexyl-3-cyclooctylharnstoff
Cyclooctylamin, 0,382 g (3,00 mmol), 0,40 ml (0,39 g, 3,1 mmol) Cyclohexylisocyanat in 20 ml Hexan, nach Stehenlassen für einen Tag, liefert 0,664 g (88%) 1-Cyclohexyl-3-cyclooctylharnstoff als weiße Nadeln, Schmp. 194,0–194,5°C. Ein Infrarotspektrum [3344 (s, NH), 3334 (s, NH), 1624 (vs, C=O), 1564 (vs. Amid II) cm^–1] und ein Massenspektrum [FAB-MS m/z berechnet für C₁₅H₂₈N₂O: 252, beobachtet:
253 (M + H⁺)] bestätigen die Identität dieses Materials.
BEISPIEL 4
Cyclohexylcarbamothionsäure-5-cyclohexylester
Zu einer Lösung von 0,61 ml (0,58 g, 5,0 mmol) Cyclohexylthiol in 25 ml Hexan wurde langsam eine Lösung von 0,626 g (5,00 mmol) Cyclohexylisocyanat in 5 ml Hexan zugegeben. Die Zugabe eines Tropfens 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en initiiert die Bildung eines weißen kristallinen Produkts. Nach mehreren Tagen bei Umgebungstemperatur wird die Mischung gekühlt, der Cyclohexylcarbamothionsäure-S-cyclohexylester gesammelt, mit eiskaltem Hexan gewaschen und getrocknet, wodurch 1,15 g (4,76 mmol, 95%) eines Produkts erhalten wurde, das bei 117,0–118,0°C schmilzt. Ein bestätigendes ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃) wird für dieses Material beobachtet: δ 165,9 (C=O), 50,3 (C-1), 43,4 (C-1'), 33,8 (C-2', 6'), 33,1 (C-2, 6), 26,0 (C-3', 5'), 25,5 (C-4'), 25,4 (C-4), 24,7 (C-3, 5). Unterstützende Infrarotbanden (KBr) werden bei 3343 (s, N-H), 1649 (vs, C=O) und 1206 (m, C-N) cm^–1 beobachtet.
REFERENZBEISPIEL 5
Assay zur Bestimmung der Inhibibierung von löslicher EH
Rekombinante Maus-sEH (MsEH) und humane sEH (HsEH) wurden in einem Baculovirus-Expressionssystem, wie zuvor beschrieben, erzeugt. Grant et al., 3. Biol. Chem., 268, Seiten 17628–17633 (1993); Beetham et al., Arch. Biochem. Biophys., 305, Seiten 197–201 (1993). Die exprimierten Proteine wurden aus dem Zelllysat durch Affinitätschromatographie gereinigt. Wixtrom et al., Anal. Biochem., 169, Seiten 71–80 (1988). Die Proteinkonzentration wurde durch den Pierce BCA-Assay unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Kalibrierungsstandard quantifiziert. Die Präparationen waren wenigstens 97% rein, beurteilt durch SDS-PAGE und Scanning-Densitometrie. Sie enthielten keine nachweisbare Esterase- oder Glutathiontransferase-Aktivität, welche den Assay stören kann. Der Assay wurde mit ähnlichen Ergebnissen auch in rohen Zelllysaten oder Gewebehomogenaten evaluiert.
Der IC₅₀ für jeden Inhibitor wurde mittels des spektrophotometrischen Assays von Dietze et al. (Dietze et al., "Spectrophotometric Substrates for Cytosolic Epoxide Hydrolase", Anal. Biochem., 216, Seiten 176–187, 1994) bestimmt unter Verwendung von klonierten Epoxidhydrolase-Genen, die im Baculovirus-System unter Verwendung von racemischem 4-Nitrophenyl-trans-2,3-epoxy-3-phenylpropylcarbonat (NEP2C) als Substrat exprimiert wurden. In einer 96-Well-Styrol-Mikroplatte wurden 20 µl der Enzympräparation und 2 µl der Inhibitorlösung in DMF ([I]_ENDE: 0,05 bis 500 µM) zu 180 µl Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,4), enthaltend 0,1 mg/ml BSA, gegeben. Die Mischung wurde für 5 Minuten bei 30°C inkubiert. Eine Substratkonzentration von 40 µM wurde dann erhalten, indem 4 µl einer 2 mM Lösung zugegeben wurde. Die Aktivität wurde bestimmt durch Messen des Auftretens des 4-Nitrophenolats bei 405 nm bei 30°C für 1 Minute (Spectramax 200; Molecular Device Inc., USA). Die Assays wurden vierfach durchgeführt. Per Definition ist der IC₅₀ die Konzentration des Inhibitors, welche die Enzymaktivität um 50% verringert. Die IC₅₀ wurden mittel Regression von wenigstens fünf Datenpunkten mit einem Minimum von zwei Punkten im linearen Bereich der Kurve auf jede Seite des IC₅₀ bestimmt. Die Kurve wurde aus wenigstens vier separaten Läufen generiert, um die Standardabweichung zu erhalten. In wenigstens einem Lauf wurden Verbindungen mit vergleichbarer Wirksamkeit einbezogen, um die Rangfolge sicherzustellen. Eine weitere Rangfolge unter sehr guten Verbindungen wurde bestimmt mit dem ³H-trans-Stilbenoxid-Assay, der in Wixtrom und Hammock (unten) beschrieben ist, oder einem verwandten Assay, der auf Borhan et al., "Improved Radiolabeled Substrates for Soluble Epoxide Hydrolase", Anal. Biochem., 231, Seiten 188–200, 1995, beruht. Ein ähnlicher auf ³H-cis-Stilbenoxid beruhender Verteilungsassay ist in Wixtrom und Hammock, "Membrane-Bound and Soluble-Fraction Epoxide Hydrolases: Methodological Aspects", Biochemical Pharmacology and Toxicology, Band 1, (Zakim und Vessey, Hrgb.), John Wiley & Sons, Inc., New York, Seiten 1–93, 1985, beschrieben.
REFERENZBEISPIEL 6
Wirkung auf andere Enzyme
Mikrosomale Säuger-EH wurde untersucht unter Verwendung von ³H-cis-Stilbenoxid, mikrosomale Insekten-EH wurde untersucht mit ³H-Juvenilhormon III und ³H-trans-Diphenylpropenoxid, cytosolische und peroxisomale Säuger- und Pflanzen-EHs wurden untersucht unter Verwendung von ³H-trans-Diphenylpropenoxid, P-450 wurde untersucht unter Verwendung von ³H-Testosteron, der Carboxylesterase-Assay verwendete para-Nitrophenylacetat und der Glutathion-S-Transferase-Assay verwendete Chlordinitrobenzol. Pepsin wurde unter Verwendung von Hämoglobin als Substrat untersucht.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Struktur
bei der X und Y jeweils unabhängig voneinander Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind und X außerdem Kohlenstoff sein kann und mindestens einer von R₁-R₄ Wasserstoff ist, wobei R₂ Wasserstoff ist wenn X Stickstoff ist, aber nicht vorhanden ist, wenn X Schwefel oder Sauerstoff ist, R₄ Wasserstoff ist wenn Y Stickstoff ist aber nicht vorhanden ist wenn Y Schwefel oder Sauerstoff ist, R₁ und R₃ jeweils unabhängig voneinander H, C_1-20 substituiertes oder nichtsubstituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Acyl oder ein Heterozyklus ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Bluthochdruck in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament in Verbindung mit einer Krebstherapie verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine wirksame therapeutische Menge der bereitgestellten Verbindung eine tägliche Gesamtdosis zwischen 0,001 mg/kg und 100 mg/kg Körpergewicht des Säugers ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Umwandlung von Lipidepoxiden in die entsprechenden Diole verringert.