WO2010003528A1 - Dimethylfumarat enthaltendes arzneimittel zur behandlung einer durch parasiten verursachten krankheit - Google Patents

Dimethylfumarat enthaltendes arzneimittel zur behandlung einer durch parasiten verursachten krankheit Download PDF

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WO2010003528A1
WO2010003528A1 PCT/EP2009/004359 EP2009004359W WO2010003528A1 WO 2010003528 A1 WO2010003528 A1 WO 2010003528A1 EP 2009004359 W EP2009004359 W EP 2009004359W WO 2010003528 A1 WO2010003528 A1 WO 2010003528A1
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WO
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dmf
erythrocytes
parasites
treatment
medicament
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PCT/EP2009/004359
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English (en)
French (fr)
Inventor
Mehrdad Ghashghaeinia
Kamran Ghoreschi
Martin Roecken
Florian Lang
Thomas Philipp Wieder
Original Assignee
Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
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Publication date
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    • A61P33/06—Antimalarials
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a novel medicament for the prophylaxis and / or treatment of a disease caused by parasites and to a method for the prophylaxis and treatment of such a disease in which the novel medicament is used.
  • Parasitic infections in humans are caused by protozoa or protista and worms. Malaria, trypanosomiasis or sleeping sickness and filariasis are among the most important parasitic diseases in humans.
  • WHO World Health Organization
  • Malaria is caused by unicellular parasites of the genus Plasmodium. So far, four pathogens that are dangerous to humans, namely Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale and Plasmodium malariae. The disease is transmitted by the bite of a female mosquito of the genus Anopheles, which represents the intermediate host.
  • the symptoms of malaria include high, recurring to periodic fever, chills, discomfort of the stomach and intestines and cramps. Especially in children, the disease can quickly lead to coma and death.
  • Malaria is currently mainly treated chemotherapeutically.
  • the best-known antimalarials include chloroquine and mefloquine.
  • numerous drug resistance agents have been described.
  • the antimalarial drug atovaquone-proguanil commonly used in the event of resistance (Malarone ®), doxycycline, artemether-lumefantrine (Coartem ®) have made a higher effectiveness against the pathogen, but are also characterized by strong side effects.
  • Trypanosomiasis also known as sheep disease, is a trypanosome-induced tropical disease transmitted by the tsetse fly. Sleeping sickness has an elusive regional distribution pattern across the tropical tropics in Africa. In total, WHO estimates that more than 500,000 people are affected. Due to the unstable political situation in many of these regions, the incidence rate has increased in recent years. The disease occurs in three stages: a few weeks after infection, fever, chills, edema, swelling of the lymph nodes as well as rash and itching. In the second stage after a few months, symptoms of the nervous system are in the foreground: confusion, coordination and sleep disorders as well as spasms. In the final stage, a twilight state, which gave the disease its name.
  • the therapy of sleeping sickness is also predominantly chemotherapeutic, in an early stage, for example, by the administration of suramin or pentamidine.
  • these drugs do not work on pathogens that are in the central nervous system because they do not cross the blood-brain barrier.
  • melarsoprol or eflornithine is administered.
  • both drugs work against pathogens in the central nervous system, they are neurotoxic.
  • Filariasis is a disease that is triggered in mammals by parasitic roundworms.
  • the pathogens include, for example, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi and Loa loa. This disease affects more than 150 million people annually and threatens over one billion people in three continents.
  • lymphatic filariasis is transmitted through the bite of Anopheles mosquitoes, which serve as an intermediate host.
  • the worms penetrate into the lymphatic system of the host and multiply there. When the disease becomes chronic, severe edema develops on the lymph.
  • the filariasis is usually treated with worm remedies.
  • the parasites are not in the intestine as in the usual worm infestation, but in the case of lymphatic filariasis in the slowly circulating lymphatic system, the treatment is very rich in side effects.
  • DMF dimethyl fumarate
  • the CAS number is 624-49-7.
  • Dimethyl fumarate has a molecular weight of 144.13.
  • DMF can be found, for example, as an active ingredient in the drug FUMADERM ®, which is used to treat psoriasis that psoriasis.
  • WO 00/30622 proposes the use of DMF for the treatment of host Versus graft reactions and autoimmune diseases.
  • DMF DMF is already approved as a medicine, namely for the treatment of psoriasis. So there are basically many years of experience with this substance. It therefore also requires no major logistical effort to provide the drug to the needy.
  • the inventors propose, for the first time, a therapeutic concept of providing DMF for the treatment or prophylaxis of a disease caused by parasites, in which the active ingredient, i. DMF, not directly directed against the parasite, but in cellular mechanisms of the host cells, especially the erythrocytes, intervenes. According to findings of the inventors, therefore, a resistance development of parasites is not to be feared.
  • the inventors have been able to demonstrate that DMFs simultaneously deplete reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) in erythrocytes infected by parasites. This further reduces the ability of infected erythrocytes to cope with oxidative stress and causes the underlying erythrocytes and parasite to die.
  • GSH reduced glutathione
  • GSSG oxidized glutathione
  • this activity of DMF observed by the inventors is highly selective for infected erythrocytes and is not found in uninfected erythrocytes. observed. These properties of the DMF largely prevent side effects and make the drug particularly well tolerated.
  • derivatives of DMF is meant derivatives of DMF formed by chemical modification of DMF. These modifications to DMF may have beneficial effects on the stability of the compound, its release in the organism, etc. However, the effect of the invention remains largely unchanged in the derivatives or is even enhanced by the modification.
  • the disease caused by parasites is selected from the group consisting of: malaria, trypanosomiasis and filariasis.
  • This measure has the advantage that the medicament is adapted for the treatment and prophylaxis of diseases which are among the most important diseases caused by parasites and for which no satisfactory therapeutic concepts have hitherto been described.
  • the parasites belong to the genus Plasmodium, more preferably to the species Plasmodium falciparum and / or Plasmodium berghi.
  • the drug is adapted in such a way that it is specifically directed against the pathogens that are often responsible for a disease of malaria.
  • the inventors were able to demonstrate exemplarily the effect of DMF recognized according to the invention on the two Plasmodium species mentioned above.
  • the medicament has another active ingredient suitable for the prophylaxis and / or treatment of a disease caused by parasites.
  • This measure has the advantage that such a combination preparation is provided which, in addition to DMF or a derivative thereof, additionally has an active ingredient which is currently used in the art in the therapy of malaria, trypanosomiasis and filariasis.
  • the effectiveness of the medicament of the invention can be further enhanced by a resulting synergistic effect.
  • the further active ingredient is selected from the group consisting of desipramine, chloroquine, mefloquine, atovaquone, proguanil, artemether, lumefantrine, doxycycline, primaquine, artemisinin, artesunate, arteflene, artemotile, dihydroartemisinin, arteether, halofantrine, Amodiaquine, sulfadoxine, pyrimethamine, tafenoquine, atovaquone, fosmidomycin, suramin, pentamidine, melarsoprol, eflornithine, doxycycline, diethylcarbamazine citrate, albendazole, ipermectin.
  • This measure has the advantage that as another active ingredient in the combination preparation finds such use, which is sufficiently available in the market and may already be approved.
  • the combination preparation can be prepared relatively inexpensively.
  • composition according to the invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers are extensively described in the art, for example in Bauer et al. (1999), Textbook of Pharmaceutical Technology,ticianliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, Kibbe et al. (2000), Handbook oi pharmaceutical excipients, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. The content of the aforementioned publications is the subject of the present disclosure.
  • DMF can be formulated according to experience good and stable in tablets.
  • the medicament is therefore preferably taken orally according to the invention, for example in the form of a tablet.
  • Another object of the present invention relates to a method for the prophylaxis and / or treatment of a disease caused by parasites in a living being, which comprises the administration of Dimethylfurnarat (DMF) and its derivatives in a living being.
  • DMF Dimethylfurnarat
  • the method comprises the steps of: (1) providing dimethyl fumarate (DMF) and / or its derivatives, (2) administering DMF and / or its derivatives to a subject to be treated, preferably a human, and (3) optionally, repeat of steps 1 and 2.
  • DMF dimethyl fumarate
  • Fig. 1 shows the apoptotic effects of DMF on erythrocytes.
  • FIG. 2 shows the abolition of the apoptotic effects induced by DMF in erythrocytes by addition of the antioxidant NAC.
  • Fig. 3 shows that the effects of DMF on the erythrocytes are additively enhanced by an additional stressor.
  • Fig. 5 shows the effects of antioxidants on the DMF-induced
  • Fig. 6 shows the effects of DMF on the calcium balance of the erythrocytes.
  • Figure 7 shows in fluorescence microscopy that the DMF-induced eryptosis is not associated with hemolysis of the erythrocytes.
  • Fig. 8 shows the effects of DMF on the formation of reactive oxygen species (ROS).
  • Figure 9 shows that DMF growth and DNA amplification of
  • Plasmodium falciparum in human erythrocytes inhibited in vitro.
  • Fig. 10 shows that DMF inhibits the proliferation of Plasmodium falciparum in human erythrocytes in vitro.
  • Figure 11 shows that DMF inhibits the proliferation of Plasmodium berghei in mice in vivo.
  • Figure 12 shows that DMF is a complete cure of over 60% of that of
  • Plasmodium berghei-in ⁇ make experimental mice in vivo.
  • Figure 13 shows that DMF causes both GSH and GSSG depletion simultaneously only in Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes.
  • HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid
  • the calcium ionophore ionomycin (0.1 ⁇ M), N-acetyl-L-cysteine (NAC) (1 mM) and dimethyl fumarate (DMF) (7-140 ⁇ M) were added.
  • the substances were dissolved in final concentrations of 0.2% dimethyl sulfoxide (DMSO) (ionomycin, DMF).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • NAC was dissolved in bidistilled water with final concentrations of the solvent of 0.2%.
  • Ionomycin, NAC and DMF were purchased from Sigma (Taufmün, Germany; DMF: # 47967).
  • red blood cell (RBC) apoptosis ie eryptosis
  • a flow cytometry analysis was performed as described in Andree et al. (1990). Erythrocyte concentrates (0.3% hematocrit) were treated with various concentrations of DMF. After incubation, 100 ⁇ l of the cells were washed in Annexin Binding Buffer containing (in mM): 125 NaCl, 10 HEPES (pH 7.4) and 5 CaCl 2 . The erythrocytes were supplemented with annexin-fluos (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) Stained in a 1:35 dilution and mixed gently on a vortex mixer.
  • FITC-annexin-V is able to bind to phosphatidylserine (PS), which is exposed to apoptosis on the outside of the plasma membrane.
  • PS phosphatidylserine
  • RT room temperature
  • the samples were diluted 1: 5, mixed gently to obtain single cell suspensions and measured by flow cytometry analysis (FACS-Calibur from Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).
  • FSC forward scatter
  • Free cytosolic Ca + * was measured by using the fluorescence Ca ++ indicator Fluo3 / AM; Andrews et al. (2002). Erythrocytes (0.3% hematocrit) suspended in 6 ml Fluo3 / AM buffer containing (in mM) 123 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO 4 , 25 HEPES (pH 7.4), 10 glucose, 10 sodium pyrovate and 2 CaCl 2 were loaded with 10 ⁇ l Fluo3 / AM (Calbiochem, Bad Soden, Germany) of a stock solution (2.0 mM in DMSO). The cells were incubated at 37 ° C for 20 min with shaking and protected from light.
  • Fluo3 / AM loaded erythrocytes were centrifuged at 1500 rpm for 5 min at 22 ° C. Excess staining solution was removed by rinsing the erythrocytes twice with Fluo3 / AM buffer and once with Ringer's solution.
  • FIuo3 / AM loaded erythrocytes were resuspended in Ringer's solution (0.1% hematocrit) containing DMF (140 ⁇ M), the calcium ionophore ionomycin (0.1 ⁇ M), as a positive control vehicle alone.
  • the Ca 2 -dependent fluorescence intensity in fluorescence channel FL-1 was measured. Since no changes in the cytosolic Ca ++ concentrations of the erythrocytes treated with DMF for up to 6 h were detected (data not shown), the cells were first tested with Pretreated DMF for 48 h, centrifuged and then resuspended in Fluo3 / AM buffer as described above. To determine if both the DMF and vehicle-treated erythrocytes have the same Fluo3 / AM loading capacity, additional ionomycin was used as the internal control.
  • ATP Bioluminescence Assay Kit HS II: Roche Diagnostics a firefly luciferase assay was used; Lang et al. (2004). Luciferase and ATP were obtained in lyophilized form (ATP Bioluminescence Assay Kit HS II: Roche Diagnostics). RBC concentrates (5% hematocrit) were incubated for 24 and 48 h at 37 ° C with standard Ringer's solution with and without 70 ⁇ M DMF. For ATP depletion (as a positive control), glucose (5 ⁇ M) was omitted in the standard Ringer's solution. After incubation, the cells were washed three times in PBS at 3600 rpm for 5 min at 4 ° C, and lysed in 700 ⁇ l distilled water (50 ⁇ l).
  • the proteins were precipitated by 500 ⁇ l of the chaotrophic reagent perchloric acid (6%). After incubation for 10 min on ice and centrifugation for 10 min at 14000 rpm at 4 ° C, an aliquot of the supernatant (400 ⁇ l) was neutralized by the addition of 45 ⁇ l of saturated KHCO3 solution. The precipitate was then removed by centrifugation at 10,000 rpm at 4 ° C for 8 min. The aliquot from the supernatant was diluted 20-fold with Ringer's solution (pH 7.8) and 100 ⁇ l of this extract was used.
  • ATP For the analysis of ATP, 100 ⁇ l of Ringer's solution (pH 7), sample extract or ATP standard solution was added to polystyrene test tubes, followed by the addition of 40 ⁇ l of luciferase solution. The luminescence signal was measured in a luminometer (Berthold Biolumat LB9500, Bad Wildbad, Germany) according to the manufacturer's instructions. The ATP concentrations are expressed in% of the Ringer-treated controls. 1.5 glutathione measurements
  • GSH refers to the reduced form of glutathione and GSSG on the oxidized disulfide dimer.
  • GSx refers to the tripeptide unit with unspecified oxidation status (GSH equivalents) and was quantitated in a microtiter plate according to the techniques of Dringen and Hamprecht (1996) using the method originally described by Tietze (1969) has been.
  • the samples (cell extracts) and standards were treated by exactly the same method. The samples and standards were kept on ice until they were placed in the microtiter plate.
  • Glutathione disulfide was quantitated after derivatization of reduced gutathione with 2-vinylpyridine (2VP) to conjugate GSH before measuring the residual GSSG; Griffith (1980). Briefly, 130 ⁇ l of the protein-free supernatant were mixed with 5 ⁇ l undiluted 97% 2VP and adjusted to pH 5 with 0.2 M Tris base (Sigma-Ultra); Griffith (1985). Standard quantities of GSSG were treated in the same way. After a 1 h incubation at room temperature, 10 ⁇ l of the 2VP treated samples were measured as described above using a calibration curve made between 0 and 100 pmol of GSSG per well. The absorbance at 405 nm was monitored over a period of 5 minutes at 30 second intervals.
  • 2VP 2-vinylpyridine
  • the fraction of the GSx Salary found as GSSG, not detected.
  • the erythrocyte concentrates (0.4% hematocrit) were treated with varying concentrations of DMF. After 24 hours of incubation, 1 ml of the cells were washed twice with PBS and examined as described above.
  • the BinH strain of Plasmodium falciparum was continuously cultured from cryopreservation, maintained in human erythrocytes and synchronized to the ring stage by sorbitol treatment, cf. Tanneur et al. (2006).
  • the culture medium consisted of RPMI 1640 supplemented with 0.5% serum-free AlbuMax II (Gibco, Düsseldorf, Germany), 25 mM HEPES / NaOH (pH 7.4), 2 mM glutamine and 20 ⁇ g per ml gentamycin.
  • the parasites were cultured in a vessel in a gas environment with approximately 3% O2, 6% CO2 and 91% N2 at 37 ° C.
  • DMF dimethyl fumarate
  • the ring-stage parasitic cultures were synchronized and re-synchronized, aliquotted (200 ml aliquots, 10% parasitemia, and 2% hemotocrit) after 6 hours of culture close to the parasite development stage, and for a further 16 h incubated in the presence or absence of DMF concentrations (1 to 140 ⁇ M).
  • Parasitemia was defined by the percentage of RBCs stained with the DNA / RNA-specific fluorescent dye Syto 16 (30 nM final concentration, Molecular Probes, Göttingen, Germany).
  • the DMF concentration causing 50% inhibition (IC 50 ) was obtained from the concentration-response curves.
  • the DMSO concentration in the cultures was never higher than 0.2% and did not affect parasite growth.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • ROS were prepared by an oxidatively sensitive dye, 5- (and 6 -) - chloromethyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetatoacetate (CM-).
  • CM-H2DCFDA a non- fluorescent molecule, which fluoresces after oxidation in the cytoplasm of the cells, is widely used to measure oxidative stress.
  • CM-H 2 DCFDA was dissolved in DMSO to obtain a 10 mM stock solution. Before loading erythrocytes (0.3% hematocrit), the stock solution was mixed in the dark with Ringer's solution to obtain a final CM-H 2 DCFDA concentration of 10 ⁇ M.
  • Loaded erythrocytes were incubated at 37 0 C for 40 min with gentle shaking and protected from light. The cells were rinsed twice, resuspended and incubated in Ringer's solution containing DMF (70 ⁇ M) or vehicle alone (DMSO as negative control). After the indicated time points, an aliquot (200 ⁇ l) of loaded red blood cells was removed, washed, resuspended in Ringer's solution and FACS analysis was performed directly. For H 2 O 2 -dependent oxidation of CM-H 2 DCFDA, an aliquot (200 ⁇ l) of loaded and vehicle-treated erythrocytes was exposed to 0.003% H 2 O 2 .
  • the fluorescence intensity was determined 7 min after the initiation of the reaction by H 2 O 2 addition. These samples served as a positive control. The mean fluorescence intensity was measured by flow cytometric analysis on a Becton Dickinson FACS Calibur. In a second approach, the cells were first pretreated with DMF for 24 h, centrifuged and resuspended in Ringer's solution and then loaded with CM-H 2 DCFDA as previously described.
  • the inventors were able to demonstrate that a 48-hour DMF treatment in the erythrocytes causes a very strong eryptosis; see. Fig. IA.
  • the eryptosis increases very rapidly with increasing concentrations after 24 and 48 hours treatment of the erythrocytes; see. Fig. IB.
  • a 70 ⁇ M treatment of erythrocytes with DMF causes an increase in cell shrinkage as time progresses (24 and 48 h); see.
  • Figure ID the 70 and 140 ⁇ M DMF concentrations correspond to the serum concentrations of DMF in patients with psoriasis).
  • Fig. 3A it is shown that glucose depletion (denoted as - DMF) in the erythrocytes triggers eryptosis and a combination of DMF treatment and glucose depletion in the erythrocytes causes increased (additive) eryptosis.
  • - DMF glucose depletion
  • FIG. 3B shows the results relating to annexin binding shown in FIG. 2A in a different form.
  • Glucose depletion contributes greatly to cell shrinkage and DMF can no longer increase glucose depletion-induced cell shrinkage; see. Fig. 3C. Because a cell, here the erythrocyte, can not shrink indefinitely. And if a single substance causes the maximum cell shrinkage, here the glucose depletion after 24 hours of incubation, another substance, here DMF, which also causes cell shrinkage, no longer provide for further cell shrinkage.
  • DMF by no means affects the ATP household of erythrocytes; see. Fig. 4A.
  • the erythrocytes were examined under the influence of glucose depletion, which leads to a massive ATP loss in the erythrocytes.
  • DMF can cause massive glutathione depletion in the erythrocytes; see. Fig. 4B.
  • FIG. 5D shows that a parallel measurement of the eryptosis and the glutathione level from a single experiment gives the same result as previously observed in two different experiments in FIGS. 2A-B and FIG. 4B.
  • FIG. 6A shows that DMF induces a massive influx of Ca 2+ into the erythrocytes, which is over 500% higher than that of control erythrocytes without DMF treatment.
  • a Ca ⁇ influx in the erythrocytes is directly associated with the eryptosis.
  • Fig. 6B the time-dependent Ca ⁇ influx is shown in the erythrocytes.
  • the DMF-induced erythrocyte shrinkage has no effect on the Fluo3 / AM loading capacity since both the DMF- and vehicle-treated erythrocytes have the same Fluo3 / AM loading capacity; see. Fig. 6C.
  • the massive Ca 2+ influx into the erythrocytes is DMF-specific.
  • the DMF-induced eryptosis is not associated with erythrocyte hemolysis
  • FIG. 7 qualitatively shows on the basis of fluorescence microscopy data that under the action of DMF the cell membrane integrity of the erythrocytes is completely retained and the DMF-induced eryptosis is not due to mechanical damage to the erythrocyte membrane. This qualitatively confirms the quantitative statement of the hemoglobin release assay of FIG. 2E.
  • DMF induces ROS formation, eg H 2 O 2 (hydrogen peroxide) formation, in the erythrocytes; see. Figure 8. It has been shown that ROS formation in erythrocytes triggers eryptosis.
  • Fig. 9 it is shown that DMF can completely inhibit the growth of Palsmodium fladparum (Pf) continuously cultured in human erythrocytes and synchronized to the ring stage by sorbitol treatment.
  • Pf Palsmodium fladparum
  • the DMF treatment does not give the parasite an opportunity to grow, as the double-stressed erythrocyte, due to Plasmodium infection and DMF treatment, can no longer serve as a suitable host for parasite propagation. Presumably, this erythrocyte of the highest can keep only provisionally alive or dies completely. An increase is not possible. 2.10 DMF inhibits the DNA amplification of Plasmodium falciparum in erythrocytes in vitro
  • Fig. 10 it is shown that DMF can completely inhibit the DNA amplification of Palsmodium flaäparum (Pf) continuously cultured in human erythrocytes and synchronized to the ring stage by sorbitol treatment.
  • Pf Palsmodium flaäparum
  • the parasite does not get an opportunity to amplify its genome, since the double-stressed erythrocyte, through Plasmodium infection and DMF treatment, can no longer serve as a suitable host for parasite propagation. This erythrocyte can survive, if at all, only makeshift.
  • FIG. 11 shows that a 10-day pre-treatment of the SVJ129 mice with DMF (50 mg / body weight in kg) prior to infection with Plasmodium berghei and the subsequent continuous treatment of the experimental mice with DMF for a total of six weeks, a massive decrease Parasitemia in the experimental mice causes. In contrast, all control mice (without DMF treatment) died with a steady increase in parasitemia after two weeks at the latest.
  • DMF 50 mg / body weight in kg
  • DMF causes a massive decrease in parasitemia in vivo.
  • Figure 12 shows that a ten day pretreatment of SVJ129 mice with DMF (50 mg / body weight in kg) prior to plasmodium infection berghei and the subsequent continuous treatment of the experimental mice with DMF for a total of six weeks causes a massive healing (over 60%) of the experimental mice with a simultaneous strong decrease in parasitemia, while 100% of control mice (mice without DMF treatment) at the latest for two weeks, with a constant increase in parasitemia.
  • DMF 50 mg / body weight in kg
  • DMF causes a massive decrease in parasitemia and associated healing of experimental mice in vivo infected with Plasmodium berghei.
  • DMF is shown to induce complete depletion of the reduced form of glutathione (GSH) in the Plasmodium falciparum-infected erythrocytes; see. the DMF concentrations of 50 and 70 ⁇ M.
  • GSH glutathione
  • FIG. 13B shows that DMF causes complete depletion of the oxidized form of glutathione (GSSG) in the Plasmodium falciparum-infected erythrocytes; see. the DMF concentrations of 50 and 70 ⁇ M.
  • GSSG glutathione
  • GSH glutathione

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit sowie ein Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung einer solchen Krankheit, in dem das neue Arzneimittel eingesetzt wird.

Description

DIMETHYLFUMARAT ENTHALTENDES ARZNEIMITTEL ZUR BEHANDLUNG EINER DURCH PARASITEN VERURSACHTEN KRANKHEIT
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit sowie ein Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung einer solchen Krankheit, in dem das neue Arzneimittel eingesetzt wird.
Parasitäre Infektionen beim Menschen werden durch Protozoen bzw. Protista und Würmer verursacht. Zu den wichtigsten durch Parasiten ausgelösten Krankheiten des Menschen zählen Malaria, Trypanosomiasis bzw. Schlafkrankheit und Filariose.
BESTATIGUNGSKOPIE Malaria ist eine Tropenkrankheit, die in etwa 100 Ländern endemisch auftritt. Etwa 40 % der Weltbevölkerung lebt in Malaria-Gebieten. Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation WHO erkranken weltweit jährlich etwa 500 Millionen Menschen. Bis zu 2,7 Millionen Menschen sterben an der Infektion, etwa die Hälfte davon sind Kinder unter fünf Jahren.
Malaria wird von einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium hervorgerufen. Bislang kennt man vier Erreger, die für den Menschen gefährlich sind, nämlich Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale und Plasmodium malariae. Die Krankheit wird durch den Stich einer weiblichen Stechmücke der Gattung Anopheles übertragen, die den Zwischenwirt darstellt.
Die Symptome der Malaria sind hohes, wiederkehrendes bis periodisches Fieber, Schüttelfrost, Beschwerden des Magen- und Darmtrakts und Krämpfe. Besonders bei Kindern kann die Krankheit rasch zu Koma und Tod führen.
Malaria wird derzeit vorwiegend chemotherapeutisch behandelt. Zu den bekanntesten Antimalariamitteln zählen Chloroquin und Mefloquin. Zu diesen Wirkstoffen sind jedoch zahlreiche Resistenzen beschrieben worden. Die im Falle von Resistenzen häufig verwendeten Antimalariamittel Atovaquon-Proguanil (Malarone®), Doxycyclin, Artemether-Lumefantrin (Coartem®) weisen eine höhere Wirksamkeit gegen den Erreger aus, zeichnen sich jedoch auch durch starke Nebenwirkungen aus.
Trypanosomiasis, auch als Schafkrankheit bezeichnet, ist eine durch Trypanosomen ausgelöste Tropenerkrankung, die von der Tsetsefliege übertragen wird. Die Schlafkrankheit kommt mit einem schwer erfassbaren regionalen Verteilungsmuster im gesamten Tropengürtel Afrikas vor. Insgesamt sind nach Schätzungen der WHO mehr als 500.000 Menschen betroffen. Durch die instabile politische Situation in vielen dieser Regionen hat die Erkrankungsrate in den letzten Jahren zugenommen. Die Erkrankung verläuft in drei Stadien: Einige Wochen nach der Infektion kommt es zu Fieber, Schüttelfrost, Ödemen, Lymphknotenschwellung sowie Hautausschlag und Juckreiz. Im zweiten Stadium nach einigen Monaten stehen Symptome des Nervensystems im Vordergrund: Verwirrtheit, Koordinations- und Schlafstörungen sowie Krampf anfalle. Im Endstadium kommt es zu einem Dämmerzustand, der der Krankheit ihren Namen gegeben hat.
Die Therapie der Schlafkrankheit erfolgt ebenfalls vorwiegend chemotherapeutisch, in einem frühen Stadium bspw. durch die Gabe von Suramin oder Pentamidin. Diese Arzneimittel wirken jedoch nicht auf Erreger, die sich im zentralen Nervensystem befinden, da sie die Bluthirnschranke nicht überwinden. In einem späteren Stadium wird Melarsoprol oder Eflornithin verabreicht. Beide Medikamente wirken zwar gegen Erreger im zentralen Nervensystem, sind jedoch neurotoxisch.
Filariose ist eine Krankheit, die in Säugetieren durch parasitische Fadenwürmer ausgelöst wird. Zu den Erregern gehören bspw. Wuchereria bancrofti, Brugia malayi und Loa loa. Diese Erkrankung befällt jährlich über 150 Millionen Menschen und in drei Kontinenten sind über eine Milliarde Menschen dadurch bedroht.
Die meisten Filariosen werden durch Insekten übertragen. Die lymphatische Filariose wird durch den Stich von Anopheles-Mücken übertragen, die als Zwischenwirt dienen. Die Würmer dringen in das Lymphsystem des Wirtes ein und vermehren sich dort. Wenn die Erkrankung chronisch wird, entstehen an den Lymphen schwere Ödeme.
Die Filariose wird in der Regel mit Wurmmitteln behandelt. Da sich die Parasiten jedoch nicht wie beim üblichen Wurmbefall im Darm, sondern im Falle der lymphatischen Filariose im langsam zirkulierenden Lymphsystem befinden, ist die Behandlung sehr reich an Nebenwirkungen.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Arzneimittel zur Behandlung von durch Parasiten verursachten Krankheiten bereitzustel- len, mit dem die Nachteile aus dem Stand der Technik gelindert oder vorzugsweise verhindert werden. Insbesondere soll ein solches Arzneimittel bereitgestellt werden, bei dem eine Resistenzentwicklung nicht zu befürchten ist. Ferner soll ein solches Arzneimittel bereitgestellt werden, das einfach und kostengünstig herzustellen ist.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Dimethylfumarat (DMF) und deren Derivate gelöst.
Dimethylfumarat weist die Formel CH3OCOCH=CHCOOCH3 auf. Die CAS-Nummer lautet 624-49-7. Dimethylfumarat hat ein Molekulargewicht von 144,13.
Die von den Erfindern erstmals erkannte Wirkung von DMF war überraschend und nicht zu erwarten. So wird nämlich DMF bislang im Stand der Technik in völlig anderem Zusammenhang beschrieben.
DMF findet sich beispielsweise als Wirkstoff in dem Arzneimittel Fumaderm®, das zur Behandlung von Psoriasis d.h. der Schuppenflechte eingesetzt wird.
In der US 7,320,999 wird die Verwendung von DMF zur Behandlung von Multipler Sklerose vorgeschlagen.
In der WO 00/30622 wird die Verwendung von DMF zur Behandlung von Host- Versus-Graft-Reaktionen und von Autoimmunerkrankungen vorgeschlagen.
In der US 2007/0027076 wird die Verwendung von DMF zur Behandlung von Herzinsuffizienz und Asthma vorgeschlagen.
Die Verwendung von DMF zur Behandlung bzw. Prophylaxe von durch Parasiten verursachten Krankheiten ist im Stand der Technik bislang nicht beschrieben. DMF ist bereits als Arzneimittel zugelassen, nämlich zur Behandlung von Psoriasis. Es gibt also bereits grundsätzlich langjährige Erfahrungen mit dieser Substanz. Es bedarf deshalb auch keines größeren logistischen Aufwandes, um das Arzneimittel Bedürftigen bereitzustellen.
Ferner liegen bereits Ergebnisse toxikologischer und pharmakologischer Untersuchungen zu DMF vor. Diese können bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels genutzt werden, so dass dieses für die neue Indikation kostengünstig herstellbar ist.
Die Erfinder schlagen mit der Bereitstellung von DMF zur Behandlung oder Prophylaxe einer durch Parasiten verursachten Krankheit erstmals ein Therapiekonzept vor, bei dem sich der Wirkstoff, d.h. DMF, nicht direkt gegen den Parasiten richtet, sondern in zelluläre Mechanismen der Wirtszellen, insbesondere der Erythrozyten, eingreift. Nach Erkenntnissen der Erfinder ist deshalb auch eine Resistenzentwicklung der Parasiten nicht zu befürchten.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass trotz des Eingriffs in den Metabolismus der Wirtszelle durch DMF der Wirt selbst nicht geschädigt wird sondern ausschließlich der Parasit. Die Erythrozytenparameter von mit DMF behandelten Probanden waren gegenüber denen von unbehandelten Probanden nahezu unverändert.
Die Erfinder konnten demonstrieren, dass DMF in durch Parasiten infizierten Erythrozyten gleichzeitig reduziertes Glutathion (GSH) als auch oxidiertes Glutathion (GSSG) depletieren. Dadurch wird die Fähigkeit der infizierten Erythrozyten, den oxidativen Stress zu bewältigen, zusätzlich reduziert und die infizierten Erythrozyten gehen samt Parasit zugrunde.
Überraschenderweise ist diese von den Erfindern beobachtete Aktivität von DMF für infizierte Erythrozyten hochselektiv und wird nicht bei nicht-infizierten Erythrocy- ten beobachtet. Durch diese Eigenschaften des DMF werden Nebenwirkungen weitgehend vermieden und machen das Arzneimittel besonders verträglich.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Unter "Derivaten von DMF" werden Abkömmlinge von DMF verstanden, die durch chemische Modifikationen an DMF gebildet werden. Diese Modifikationen an DMF können sich vorteilhaft auf die Stabilität der Verbindung, ihre Freisetzung im Organismus etc. auswirken. Die erfindungsgemäße Wirkung bleibt bei den Derivaten jedoch weitgehend unverändert oder wird durch die Modifizierung sogar verstärkt.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die durch Parasiten verursachte Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Malaria, Trypanosomiasis und Filariose.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel zur Behandlung und Prophylaxe solcher Krankheiten angepasst wird, die zu den wichtigsten durch Parasiten verursachten Krankheiten zählen und für die bislang keine zufriedenstellenden Therapiekonzepte beschrieben sind.
Weiter ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Parasiten der Gattung Plasmodium, weiter bevorzugt der Art Plasmodium falciparum und/oder Plasmodium berghi angehören.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel derart angepasst wird, dass es sich konkret gegen die Erreger richtet, die häufig für eine Erkrankung an Malaria verantwortlich sind. So konnten die Erfinder in ihren Experimenten exemplarisch an den beiden genannten Plasmodium-Arten die erfindungsgemäß erkannte Wirkung von DMF demonstrieren. Weiter ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Arzneimittel einen weiteren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit geeigneten Wirkstoff aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass so ein Kombinationspräparat bereitgestellt wird, welches neben DMF bzw. einem Derivat hiervon zusätzlich einen Wirkstoff aufweist, der im Stand der Technik derzeit in der Therapie der Malaria, Trypanosomiasis und Filariose Einsatz findet. Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Arzneimitteis kann durch eine sich ergebende synergistische Wirkung nochmals verstärkt werden.
Dabei ist es bevorzugt, wenn der weitere Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Desipramin, Chloroquin, Mefloquin, Atovaquon, Proguanil, Arte- mether, Lumefantrin, Doxycyclin, Primaquin, Artemisinin, Artesunat, Arteflene, Artemotil, Dihydroartemisinin, Arteether, Halofantrin, Amodiaquin, Sulfadoxin, Pyrimethamin, Tafenoquin, Atovaquon, Fosmidomycin, Suramin, Pentamidin, Melarsoprol, Eflornithin, Doxycyclin, Diethylcarbamazinecitrat, Albendazol, Iver- mectin.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass als weiterer Wirkstoff in dem Kombinationspräparat ein solcher Verwendung findet, der im Markt ausreichend zur Verfügung steht und ggf. bereits zugelassen ist. Das Kombinationspräparat kann dadurch relativ kostengünstig hergestellt werden.
So konnten die Erfinder mittels Experimenten demonstrieren, dass eine Kombination aus DMF und Desipramin, einem zugelassenen Arzneimittel, nicht nur additive sondern synergistische inhibierende Wirkungen auf die Parasitenvermehrung zeigt.
Es versteht sich, dass das Arzneimittel erfindungsgemäß einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen kann. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben, beispielsweise in Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, Kibbe et al. (2000), Handbook oi pharmaceutical excipients, American Pharmaceutical Association and Pharmaceu- tical Press. Der Inhalt der vorgenannten Publikationen ist Gegenstand der vorliegenden Offenbarung.
DMF lässt sich erfahrungsgemäß gut und stabil in Tabletten formulieren. Das Arzneimittel wird deshalb erfindungsgemäß vorzugsweise oral eingenommen, bspw. in Form einer Tablette.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit bei einem Lebewesen, das die Verabreichung von Dimethylfurnarat (DMF) und deren Derivate in ein Lebewesen umfasst.
Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (1) Bereitstellung von Dimethylfumarat (DMF) und/oder deren Derivate, (2) Verabreichung von DMF und/oder deren Derivate in ein zu behandelndes Lebewesen, vorzugsweise einen Menschen, und (3) ggf. Wiederholung der Schritte 1 und 2.
Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile, die für die erfindungsgemäße Verwendung bzw. das Arzneimittel beschrieben sind, gelten mutatis mutandis für das erfindungsgemäße Verfahren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, aus denen weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren. In denen ist folgendes dargestellt:
Fig. 1 zeigt die apoptotischen Wirkungen von DMF auf Erythrozyten.
Fig. 2 zeigt die Aufhebung der durch DMF in Erythrozyten induzierten apoptotischen Wirkungen durch Zugabe des Antioxidans NAC.
Fig. 3 zeigt, dass die Wirkungen von DMF auf die Erythrozyten durch einen zusätzlichen Stressfaktor additiv verstärkt werden.
Fig. 4 zeigt die Wirkungen von DMF im Hinblick auf den ATP- und GSH-
Haushalt der Erythrozyten.
Fig. 5 zeigt die Auswirkungen von Antioxidantien auf die DMF-induzierte
Eryptose und GSH-Depletion.
Fig. 6 zeigt die Auswirkungen von DMF auf den Calciumhaushalt der Erythrozyten.
Fig. 7 zeigt in der Fluoreszenzmikroskopie, dass die DMF-induzierte Eryptose nicht mit einer Hämolyse der Erythrozyten assoziiert ist.
Fig. 8 zeigt die Auswirkungen von DMF auf die Bildung von reaktiven Sauerstoff spezies (ROS).
Fig. 9 zeigt, dass DMF das Wachstum und die DNA-Amplifizierung von
Plasmodium falciparum in humanen Erythrozyten in vitro inhibiert. Fig. 10 zeigt, dass DMF die Proliferation von Plasmodium falciparum in humanen Erythrozyten in vitro inhibiert.
Fig. 11 zeigt, dass DMF die Proliferation von Plasmodium berghei in Mäusen in vivo inhibiert.
Fig. 12 zeigt, dass DMF eine vollständige Heilung von über 60% der von
Plasmodium berghei-inΑzierten Experimentalmäuse in vivo.
Fig. 13 zeigt, dass DMF ausschließlich in mit Plasmodium falciparum infizierten humanen Erythrozyten gleichzeitig sowohl eine GSH- als auch GSSG- Depletion bewirkt.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Erythrozyten und Lösungen
Über die Blutspendezentrale Tübingen wurden Erythrozytenkonzentrate von 50 gesunden Freiwilligen mit verschiedenen Blutgruppen erhalten. In den jeweiligen Experimenten wurden, sofern nicht anders angegeben, Aliquote der Erythrozytenkonzentrate bei 0,3 % Hämatokritwert entweder direkt verwendet, oder bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Die Experimente wurden bei 37°C in Ringerlösung durchgeführt, die Folgendes enthielt (in mM): 125 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO4, 32 N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES)/NaOH, 5 Glucose, 1 CaCl2, pH 7,4. Für die Energiedepletion wurde die Glucose in der Ringerlösung weggelassen. Sofern angegeben, wurden das Ca^-Ionophor Ionomycin (0,1 μM), N-Acetyl-L-cystein (NAC) (1 mM) und Dimethylfumarat (DMF) (7-140 μM) zugegeben. Die Substanzen wurden in Endkonzentrationen von 0,2 % Dimethylsulfoxid (DMSO) (Ionomycin, DMF) gelöst. NAC wurde in bidestilliertem Wasser mit Endkonzentrationen des Lösungsmittels von 0,2 % gelöst. Ionomycin, NAC und DMF wurden von Sigma (Taufkirchen, Deutschland; DMF: #47967) bezogen.
1.2 FACS-Analyse
Um die Apoptose der roten Blutzellen (RBC), d.h. die Eryptose zu evaluieren, wurde eine Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt, wie beschrieben in Andree et al. (1990). Erythrozytenkonzentrate (0,3 % Hämatokrit) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von DMF behandelt. Nach der Inkubation wurden 100 μl der Zellen in Annexinbindepuffer gewaschen, der folgendes enthielt (in mM): 125 NaCl, 10 HEPES (pH 7,4) und 5 CaCl2. Die Erythrozyten wurden mit Annexin-Fluos (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) bei einer 1:35-Verdünnung gefärbt und vorsichtig auf einem Vortex-Mischer gemischt. FITC-Annexin-V ist in der Lage, an Phosphatidylserin (PS) zu binden, das bei der Apoptose auf der Außenseite der Plasmamembran exponiert wird. Nach einer 20-minütigen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) wurden die Proben 1:5 verdünnt, vorsichtig gemischt, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, und mittels Durchflusszytometrieanalyse vermessen (FACS- Calibur von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Die Zellen wurden durch Vorwärts-Scatter (FSC) analysiert und die Annexinfluoreszenzintensität wurde im FL-I mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm gemessen.
1.3 Messung von freiem intrazellulärem Ca++
Freies zytosolisches Ca+* wurde durch Verwendung des Fluoreszenz Ca++- Indikators Fluo3/AM gemessen; Andrews et al. (2002). Erythrozyten (0,3 % Hämatokrit), suspendiert in 6 ml Fluo3/AM-Puffer, enthaltend (in mM) 123 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO4, 25 HEPES (pH 7,4), 10 Glucose, 10 Natriumpyrovat und 2 CaCl2, wurden mit 10 μl Fluo3/AM (Calbiochem, Bad Soden, Deutschland) einer Stammlösung (2,0 mM in DMSO) geladen. Die Zellen wurden bei 37°C für 20 min unter Schütteln und lichtgeschützt inkubiert. Weitere 12 μl Fluo3/AM wurden hinzugegeben, die Inkubation erfolgte für weitere 40 min ohne Schütteln. Fluo3/AM beladene Erythrozyten wurden bei 1500 rpm für 5 min bei 22°C zentrifugiert. Überschüssige Farblösung wurde entfernt, indem die Erythrozyten zweimal mit Fluo3/AM-Puffer und einmal mit Ringerlösung gewaschen wurden. Für die Durchflusszytometrie wurden FIuo3/AM belade- nen Erythrozyten in Ringerlösung (0,1 % Hämatokrit) resuspendiert, enthaltend DMF (140 μM), den Calciumionophor Ionomycin (0,1 μM), als Positivkontrolle den Vehikel allein. Nach der Inkubation für verschiedene Zeiträume bei 370C wurde die Ca^-abhängige Fluoreszenzintensität im Fluoreszenzkanal FL-I gemessen. Da keinerlei Veränderungen in den zytosolischen Ca++- Konzentrationen der Erythrozyten, die mit DMF für bis zu 6 h behandelt wurden, festgestellt wurden (Daten nicht gezeigt), wurden die Zellen zuerst mit DMF für 48 h vorbehandelt, zentrifugiert und dann in Fluo3/AM-Puffer resuspendiert, wie oben beschrieben. Um festzustellen, ob sowohl die DMF- als auch vehikelbehandelten Erythrozyten die gleiche Fluo3/AM-Ladekapazität haben, wurde zusätzlich lonomycin als interne Kontrolle verwendet.
1.4 Bestimmung der intrazellulären ATP-Konzentration
Zur Bestimmung der ATP-Konzentrationen wurde ein Firefly-Luciferase-Assay verwendet; Lang et al. (2004). Luciferase und ATP wurden in lyophilisierter Form erhalten (ATP Bioluminescence Assay Kit HS II: Roche Diagnostics). Erythrozytenkonzentrate (5 % Hämatokrit) wurden für 24 und 48 h bei 37°C mit Standard-Ringerlösung mit und ohne 70 μM DMF inkubiert. Für die ATP- Depletion (als Positivkontrolle), wurde Glucose (5 μM) in der Standard- Ringerlösung weggelassen. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal in PBS bei 3600 rpm für 5 min bei 4°C gewaschen, und in 700 μl destilliertem Wasser lysiert (50 μl). Die Proteine wurden durch 500 μl des chaotrophen Reagens Perchlorsäure (6 %) präzipitiert. Nach der Inkubation für 10 min auf Eis und der Zentrifugation für 10 min bei 14000 rpm bei 4°C wurde ein Aliquot des Überstandes (400 μl) durch die Zugabe von 45 μl gesättigter KHCO3- Lösung neutralisiert. Das Präzipitat wurde dann durch Zentrifugation bei 10000 rpm bei 4°C für 8 min entfernt. Das Aliquot aus dem Überstand wurde 20-fach mit Ringerlösung (pH 7,8) verdünnt und 100 μl dieses Extraktes wurden verwendet. Für die Analyse von ATP wurden 100 μl Ringerlösung (pH 7), Probenextrakt oder ATP-Standardlösung in Polysterolteströhrchen gegeben, gefolgt von der Zugabe von 40 μl Luciferaselösung. Das Lumineszenzsignal wurde in einem Luminometer (Berthold Biolumat LB9500; Bad Wildbad, Deutschland) gemäß der Angaben des Herstellers gemessen. Die ATP- Konzentrationen werden in % der Ringer-behandelten Kontrollen ausgedrückt. 1.5 Glutathionmessungen
GSH bezieht sich auf die reduzierte Form von Glutathion und GSSG auf das oxidierte Disulfid-Dimer. GSx bezieht sich auf die Tripeptideinheit mit unspe- zifiziertem Oxidationsstatus (GSH-Äquivalente) und wurde in einer Mikroti- terplatte gemäß der Techniken von Dringen und Hamprecht (1996) quantifiziert, in dem die Methode verwendet wurde, die ursprünglich von Tietze (1969) beschrieben wurde. Die Proben (Zellextrakte) und Standards wurden mit genau der gleichen Methode behandelt. Die Proben und Standards wurden auf Eis gehalten, bis diese in die Mikrotiterplatte gegeben wurden. 10 μl der Zelllysate oder Standards, enthaltend 0-100 pmol von GSx/10 μl, wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten überführt und mit 90 μl Wasser verdünnt, so dass sich eine Endkonzentration von 0,1 % Sulfosalicylsäure ergab. Nach der Zugabe von 100 μl Reaktionsmischung [0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) enthalten 1 mM EDTA, 0,3 mM 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), 0,4 mM NADPH und 1 U/ml Glutathionreduktase] wurde die Zunahme der Extinktion bei 405 nm in 30 s- Intervallen über einen Bereich von 5 min unter Verwendung eines Mikrotiterlesegerätes (Thermo Electron Corporation, Multiskan EX, Finnland) detektiert. Die Glutathiongehalte wurden eva- luiert, indem eine Kalibrierungskurve verwendet wurde, die mit Standardproben erstellt wurde. Glutathiondisulfid wurde quantifiziert nach der Derivati- sierung von reduziertem Gutathion mit 2-Vinylpyridin (2VP), um GSH zu konjugieren, bevor das verbleibende GSSG vermessen wurde; Griffith (1980). Kurz zusammengefasst, 130 μl des proteinfreien Überstandes wurden mit 5 μl unverdünntem 97 %-igem 2VP gemischt und mit 0,2 M Tris-Base (Sigma- Ultra) auf pH 5 eingestellt; Griffith (1985). Standardmengen von GSSG wurden auf die gleiche Art und Weise behandelt. Nach einer 1 -stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 10 μl der 2VP behandelten Proben, wie oben beschrieben, gemessen, indem eine Kalibrierungskurve verwendet wurde, die zwischen 0 und 100 pmol von GSSG pro Vertiefung erstellt wurde. Die Extinktion bei 405 nm wurde über einen Zeitraum von 5 min in 30 s-Intervallen verfolgt. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde die Fraktion des GSx- Gehaltes, der als GSSG gefunden wird, nicht detektiert. Die Erythrozytenkon- zentrate (0,4 % Hämatokrit) wurden mit variierenden Konzentrationen von DMF behandelt. Nach 24-stündiger Inkubation wurde 1 ml der Zellen zweimal mit PBS gewaschen und wie oben beschrieben untersucht.
1.6 Messung der Inhibition des Parasitenwachstums und der DNA-Amplifikation in vitro
Der Stamm BinH von Plasmodium falciparum wurde aus der Kryokonservierung heraus kontinuierlich kultiviert, in humanen Erythrozyten gehalten und auf das Ringstadium durch Sorbitolbehandlung synchronisiert, vgl. Tanneur et al. (2006). Das Kulturmedium bestand aus RPMI 1640, versetzt mit 0,5 % serumfreien AlbuMax II (Gibco, Karlsruhe, Deutschland), 25 mM HEPES/NaOH (pH 7,4), 2 mM Glutamin und 20 μg pro ml Gentamycin. Die Parasiten wurden in einem Gefäß in einer Gasumgebung mit etwa 3 % O2, 6 % CO2 und 91 % N2 bei 37°C kultiviert. Stammlösungen von Dimethylfumarat (DMF) wurden in DMSO (Applichem, Deutschland) hergestellt und in vollständigem Kulturmedium auf Endkonzentrationen von 1 bis 140 μM verdünnt. Der Wirkstoff wurde dann zu Sorbitol synchronisierten Parasitkulturen, die sich ausschließlich im Ringstadium befinden, in 96-Vertiefungen-Platten (200 μl Aliquote, 0,5-1 % Parasitämie und 1 % Endhämatokrit) hinzugegeben. Die Wachstumsinhibition für verschiedene DMF-Konzentrationen wurde bestimmt, indem die Parasitämie in der behandelten Kultur mit der in der Kontrollkultur (ohne DMF) auf der gleichen Platte zum Zeitpunkt 0 und nach 48 h durch Durch- flusszytometrie verglichen wurde. Um die DNA/RNA-Amplifizierung abzuschätzen, wurden die Parasitenkulturen im Ringstadium synchronisiert und nach 6-stündiger Kultivierung, nahe an dem Parasitenentwicklungsstadium, re-synchronisiert, aliquotiert (200 ml Aliquote, 10 % Parasitämie und 2 % Hämotokrit), und für weitere 16 h in Gegenwart oder Abwesenheit von DMF- Konzentrationen (1 bis 140 μM) inkubiert. Die Parasitämie wurde durch den prozentualen Anteil von RBCs definiert, gefärbt mit dem DNA/RNA- spezifischen Fluoreszenzfarbstoff Syto 16 (30 nM Endkonzentration; Molecular Probes, Göttingen, Deutschland). Die DMF-Konzentration, die 50 % Inhibition verursacht (IC50) wurde aus den Konzentrations-Wirkungs-Kurven erhalten. Die DMSO-Konzentration in den Kulturen lag in keinem Fall höher als 0,2 % und beeinflusste nicht das Parasitenwachstum.
1.7 Messung des Parasitenwachstums und der An ti -Malaria- Wirkung von DMF in vivo
Der Anti-Malaria-Test wurde mit adulten 129 SVJ-Mäusen (Körpergewicht 20 + 2 g) durchgeführt. Ein Aliquot (0,2 ml) enthaltend 4 x 10s P. berghei wurde intravenös (Tag Null) in Gruppen von Experimental- und Kontrollmäusen (jeweils n=6) injiziert. Die Experimentalmäuse wurden bei DMF-enthaltendem Wasser bei Dosen von 50 mg/kg Körpergewicht 10 Tage vor der Infektion für insgesamt 6 Wochen gehalten. Eine Heilung wurde definiert als Überleben bis zum 41. Tag nach der Behandlung (orale Dosierung). In den unbehandelten Kontrollmäusen stieg die Parasitämie regelmäßig auf 15 % ab dem 14. Tag nach der Infektion. Nicht behandelte Kontrollmäuse starben üblicherweise an den Tagen 13 bis 15 nach der Infektion. Blutabstriche wurden 8 Tage nach der Parasiteninokulation täglich entnommen und die Mortalität wurde für weitere 4 Wochen überwacht. Über die gesamten Experimente erhielten die Tiere au- toklaviertes Leitungswasser und Nahrung nach Belieben und wurden in einem klimatisierten Tierraum bei 22 bis 23°C gehalten.
1.8 Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
ROS wurden durch einen oxidativ-sensitiven Farbstoff, 5-(und 6-)- Chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetatacetyIester (CM-
H2DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR) gemäß der Techniken von Turturro et al. (2007) mit einigen Veränderungen detektiert, indem die Methode verwendet wurde, die ursprünglich von Keston und Brandt (1965) und von Royall und Ischiropoulos (1992) beschrieben wurde. CM-H2DCFDA, ein nicht- fluoreszierendes Molekül, das nach der Oxidation im Zytoplasma der Zellen fluoresziert, wird weitgehend verwendet, um oxidativen Stress zu messen. CM- H2DCFDA wurde in DMSO gelöst, um eine 10 mM-Stammlösung zu erhalten. Vor der Beladung von Erythrozyten (0,3 % Hämotokrit), wurde die Stammlösung im Dunkeln mit Ringerlösung gemischt, um eine CM-H2DCFDA- Endkonzentration von 10 μM zu erhalten. Beladene Erythrozyten wurden bei 370C für 40 min unter leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gespült, resuspendiert und in Ringerlösung enthaltend DMF (70 μM) oder Vehikel allein (DMSO als Negativkontrolle) inkubiert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurde ein Aliquot (200 μl) von beladenen Erythrozyten entfernt, gewaschen, in Ringerlösung resuspendiert und die FACS-Analyse wurde direkt durchgeführt. Für H2O2-abhängige Oxidation von CM-H2DCFDA wurde ein Aliquot (200 μl) von beladenen und Vehikelbehandelten Erythrozyten an 0,003 % H2O2 exponiert. Die Fluoreszenzintensität wurde 7 min nach der Initiierung der Reaktion durch H2O2-Zugabe bestimmt. Diese Proben dienten als Positivkontrolle. Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde durch Durchflusszytometrieanalyse auf einem FACS-Calibur von Becton Dickinson gemessen. In einem zweiten Ansatz wurden die Zellen zuerst mit DMF für 24 h vorbehandelt, zentrifugiert und in Ringerlösung resuspendiert und anschließend mit CM-H2DCFDA beladen, wie zuvor beschrieben.
1.9 Fluoreszenzmikroskopie
Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen erfolgten gemäß Standardprotokollen. 2. Ergebnisse
2.1 DMF induziert Eryptose
Die Erfinder konnten nachweisen, dass eine 48-stündige DMF-Behandlung in den Erythrozyten eine sehr starke Eryptose verursacht; vgl. Fig. IA.
Die Eryptose nimmt nach einer 24- sowie einer 48-stündigen Behandlung der Erythrozyten mit zunehmenden Konzentrationen sehr stark zu; vgl. Fig. IB.
Die Zellschrumpfung der Erythrozyten wird nach einer 24-stündigen Inkubation mit zunehmenden Konzentrationen von DMF gesteigert; vgl. Fig. IC.
Eine 70 μM Behandlung der Erythrozyten mit DMF verursacht mit fortschreitender Zeit (24 sowie 48 h) eine Zunahme der Zellschrumpfung; vgl. Fig. ID (die 70 sowie 140 μM DMF-Konzentrationen entsprechen den Serum- Konzentrationen von DMF in Patienten mit Psoriasis).
In Fig. IE wird gezeigt, dass unterschiedliche DMF-Konzentrationen (7-140 μM) keineswegs eine hämolytische Wirkung auf den Erythrozyten haben. Mit anderen Worten: Die Zellmembran-Integrität wird auf keinen Fall von DMF beeinträchtigt. Das deutet darauf hin, dass die DMF- Wirkung auf die Erythrozyten eine mechanistische und nicht eine mechanische Wirkung ist.
2.2 Antioxidantien inhibieren vollständig die in Erythrozyten durch DMF induzierten Wirkungen
Eine N-Acetyl-L-Cystein (NAC)-Vorbehandlung hebt die eryptotische Wirkung von DMF vollständig auf; vgl. Fig. 2A und 2B.
NAC hebt die DMF-induzierte Zellschrumpfung in den Erythrozyten vollständig auf; vgl. Fig. 2C. 2.3 Stressfaktoren verstärken die in Erythrozyten durch DMF induzierten Wirkungen
In Fig. 3A ist gezeigt, dass eine Glukose-Depletion (gekennzeicht als - DMF) in den Erythrozyten die Eryptose auslöst und eine Kombination von DMF- Behandlung und Glukose-Depletion in den Erythrozyten eine verstärkte (additive) Eryptose verursacht.
Sinn und Zweck dieses Versuches war, zu zeigen, dass ein von vornherein ge- stresster Erythrozyt, z.B. ein von Parasiten befallener Erythrozyt, unter Einwirkung von DMF, als einen weiteren zusätzlichen Stressfaktor, kein geeigneter Wirt für einen Parasit sein kann.
In Fig. 3 B werden die Fig. 2A gezeigten Ergebnisse hinsichtlich der Annexin- Bindung in anderer Form dargestellt.
Eine Glukose-Depletion trägt sehr stark zur Zellschrumpfung bei und DMF kann eine Glukose-Depletion-bedingte Zellschrumpfung nicht mehr erhöhen; vgl. Fig. 3C. Denn eine Zelle, hier der Erythrozyt, kann nicht unbegrenzt schrumpfen. Und wenn eine einzige Substanz die maximale Zellschrumpfung bewirkt, hier die Glukose-Depletion nach 24-stündiger Inkubation, kann eine weitere Substanz, hier DMF, die ebenso eine Zellschrumpfung bewirkt, nicht mehr für eine weitere Zellschrumpfung sorgen.
2.4 Auswirkungen von DMF auf den ATP- und GSH-Haushalt der Erythrozyten
DMF beeinträchtigt keineswegs den ATP-Haushalt der Erythrozyten; vgl. Fig. 4A. Als Positivkontrolle wurden die Erythrozyten unter dem Einfluss einer Glukose-Depletion untersucht, die zu einem massiven ATP-Verlust in den Erythrozyten führt. DMF kann eine massive Glutathion-Depletion in den Erythrozyten verursachen; vgl. Fig. 4B.
Das Resultat aus Fig. 4 Iässt die Schlussfolgerung zu, dass die DMF-induzierte Eryptose den ATP-Energiehaushalt der Erythrozyten nicht beeinträchtigt.
2.5 Auswirkungen von Antioxidantien auf die DMF-induzierte Eryptose und GSH- Depletion
Hier wurden die Daten aus der Fig. 2A-C übernommen. Es ist gezeigt, dass NAC die DMF-induzierte Eryptose vollständig hemmen kann; vgl. Fig. 5A bis 5C.
In Fig. 5 D ist gezeigt, dass eine parallele Messung der Eryptose und des GIu- tathion-Levels aus einem einzigen Experiment dasselbe Resultat ergibt wie zuvor in zwei verschiedenen Experimenten in Fig. 2A-B sowie Fig. 4B beobachtet.
2.6 Auswirkungen von DMF auf den Calciumhaushalt der Erythrozyten
In Fig. 6A ist gezeigt, dass DMF einen massiven Ca^-Einstrom in die Erythrozyten induziert, der über 500% über dem von Kontroll-Erythrozyten ohne DMF-Behandlung liegt. Ein Ca^-Einstrom in den Erythrozyten ist unmittelbar mit der Eryptose assoziiert.
In Fig. 6B ist der zeitabhängige Ca^-Einstrom in die Erythrozyten gezeigt.
Die DMF-bedingte Erythrozyten-Schrumpfung hat keinen Einfluß auf die Fluo3/AM-Ladekapazität, da sowohl die DMF- als auch vehikelbehandelten Erythrozyten die gleiche Fluo3/AM-Ladekapazität aufweisen; vgl. Fig. 6C. Mit anderen Worten: der massive Ca^-Einstrom in die Erythrozyten ist DMF- spezifisch. 2.7 Die DMF-induzierte Eryptose ist nicht mit einer Hämolyse der Erythrozyten assoziiert
In der Fig. 7 ist anhand von Fluoreszenz-Mikroskopie-Daten qualitativ gezeigt, dass unter Einwirkung von DMF die Zellmembranintegrität der Erythrozyten vollständig erhalten bleibt und die DMF-induzierte Eryptose nicht auf eine mechanische Schädigung der Erythrozyten-Membran zurückzuführen ist. Dadurch wird die quantitative Aussage des Hämoglobin-Release-Assays aus der Fig. 2E qualitativ bestätigt.
2.8 Auswirkungen von DMF auf die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
Hier wird gezeigt, dass DMF die ROS-Bildung, z.B. H2O2 (Wasserstoffperoixd)- Bildung, in den Erythrozyten induziert; vgl. Fig. 8. Es ist erwiesen, dass ROS- Bildung in den Erythrozyten die Eryptose auslöst.
2.9 DMF inhibiert vollständig das Wachstum von Plasmodium falciparum in Erythrozyten in vitro
In Fig. 9 ist gezeigt, dass DMF das Wachstum von in kontinuierlich kultiviertem, in humanen Erythrozyten gehaltenem und auf das Ringstadium durch Sorbitolbehandlung synchronisiertem Palsmodium fladparum (Pf) vollständig hemmen kann.
Mit anderen Worten: Unter DMF-Behandlung bekommt der Parasit keine Gelegenheit zu wachsen, da der doppelt gestresste Erythrozyt, durch die Plasmodium-Infektion und DMF-Behandlung, nicht mehr als ein geeigneter Wirt für die Parasitenvermehrung dienen kann. Vermutlich kann sich dieser Erythrozyt allerhöchstem nur notdürftig am Leben halten oder stirbt vollständig ab. Eine Vermehrung ist jedoch nicht möglich. 2.10 DMF inhibiert die DNA-Amplifizierung von Plasmodium falciparum in Erythrozyten in vitro
In Fig. 10 ist gezeigt, dass DMF die DNA-Amplifizierung von in kontinuierlich kultiviertem, in humanen Erythrozyten gehaltenem und auf das Ringstadium durch Sorbitolbehandlung synchronisiertem Palsmodium flaäparum (Pf) vollständig hemmen kann.
Mit anderen Worten: Unter DMF-Behandlung bekommt der Parasit keine Gelegenheit sein Genom zu amplifizieren, da der doppelt gestresste Erythrozyt, durch die Plasmodium-Infektion und DMF-Behandlung, nicht mehr als ein geeigneter Wirt für den Parasitvermehrung dienen kann. Dieser Erythrozyt kann sich, wenn überhaupt, höchstens selbst notdürftig am Leben halten.
2.11 DMF inhibiert die Proliferation von Plasmodium berghei in Mäusen in vivo
In Fig. 11 ist gezeigt, dass eine zehntägige Vorbehandlung der SVJ129-Mäuse mit DMF (50 mg/Körpergewicht in kg) vor der Infizierung mit Plasmodium berghei und die darauffolgende kontinuierliche Behandlung der Experimen- talmäuse mit DMF über insgesamt sechs Wochen eine massive Abnahme der Parasitämie in den Experimentalmäusen bewirkt. Im Gegensatz dazu, starben alle Kontrollmäuse (ohne DMF-Behandlung) unter ständiger Erhöhung der parasitämie nach spätestens zwei Wochen.
Mit anderen Worten: DMF bewirkt eine massive Abnahme der Parasitämie in vivo.
2.12 DMF begünstigt eine vollständige Heilung von über 60% der von Plasmodium berghei-infizieiten Experimentalmäuse in vivo
In Fig. 12 ist gezeigt, dass eine zehntägige Vorbehandlung der SVJ129-Mäuse mit DMF (50 mg/Körpergewicht in kg) vor der Infizierung mit Plasmodium berghei und die darauffolgende kontinuierliche Behandlung der Experimen- talmäuse mit DMF über insgesamt sechs Wochen eine massive Heilung (über 60%) der Experimentalmäuse unter gleichzeitig starker Abnahme der Parasi- tämie bewirkt, während 100% der Kontrollmäuse (Mäuse ohne DMF- Behandlung) spätestens nach zwei Wochen unter ständiger Erhöhung der Pa- rasitämie starben.
Mit anderen Worten: DMF bewirkt eine massive Abnahme der Parasitämie und damit assoziierte Heilung der Experimentalmäuse in vivo, die mit dem Plasmodium berghei infiziert wurden.
2.12 DMF bewirkt gleichzeitig eine GSH- als auch eine GSSG-Depletion
Als nächstes wurde im näheren Detail untersucht, welche selektiven Auswirkungen DMF auf mit Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten in Bezug auf den GSH- bzw. GSSG-Haushalt hat.
In Fig. 13A ist gezeigt, dass DMF eine vollständige Depletion der reduzierten Form von Glutathion (GSH) in den mit Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten herbei führt; vgl. die DMF-Konzentrationen von 50 sowie 70 μM. Hingegen kann DMF kann trotz einer starken GSH-Depletion in nicht- infizierten Erythrozyten keine vollständige GSH-Depletion bewirken.
Dieses Experiment belegt, dass doppelt-gestressten Erythrozyten, d.h. mit einer Infektion mit dem Parasit unter gleichzeitiger Behandlung mit dem DMF, konzentrationsabhängig den gesamten lebenswichtigen Glutathion-Spiegel verlieren. Die betroffenen Erythrozyten können dann nicht mehr als ein geeigneter Wirt für den Parasit zur Verfügung stehen. Dies hat zur folge, dass die infizierten Erythrozyten absterben. Dadurch bleibt eine Vermehrung der Parasiten sowie eine Infektionskette aus. In Fig. 13B ist gezeigt, dass DMF eine vollständige Depletion der oxidierten Form von Glutathion (GSSG) in den mit Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten herbei führt; vgl. die DMF-Konzentrationen von 50 sowie 70 μM. Dimethylfumart kann hingegen trotz einer starken GSSG-Depletion in nicht- infizierten Erythrozyten für die aufgezeigten Konzentrationen keine vollständige GSSG-Depletion bewirken.
Dieses Experiment demonstriert die einzigartige Eigenschaft von Dimethylfu- marat (DMF). Aus der Literatur ist bekannt, dass eine GSH-Abnahme mit der unmittelbaren Zunahme des GSSG-Spiegels assoziiert ist und umgekehrt. Hier können GSH und GSSG unter der Beteiligung der dazu gehörigen Enzyme ineinander umgewandelt werden.
Dieses Experiment zeigt jedoch, dass DMF gleichzeitig eine GSH- als auch eine GSSG-Depletion bewirkt. Ein mit Plasmodium falciparum infizierter Erythrozyt ist gezwungen, die reduzierte Form von Glutathion (GSH) mehr als normal zu produzieren, um zu überleben. Dimethylfumarat ist aber imstande, das intrazelluläre GSH durch Konjugatbildung zu depletieren. Unter diesen Umständen muss der betroffene Erythrozyt alles daran setzen, um die vorhandenen GSSG- Moleküle in GSH-Moleküle umzuwandeln.
Die neu gebildete reduzierte Form von Glutathion (GSH) wird wiederum intrazellulär von DMF durch Konjugatbildung aufgefangen. Letztendlich wird der betroffene Erythrozyt unter der Einwirkung von DMF weder über GSSG noch über GSH verfügen. Und das ist der sichere Tod für den sowohl betroffenen infizierten Erythrozyt als auch für den Parasit, der sich in diesem Erythrozyt befindet.
In Fig. 13C ist gezeigt, dass sowohl in infizierten (iRBC) als auch in nicht- infizierten Erythrozyten (RBC) die reduzierte Form von Glutathion (GSH) um vielfaches höher liegt, als die oxidierte Form (GSSG). Der GSH:GSSG-Quotient nimmt mit zunehmender DMF-Konzentration bis zur völligen GSH/GSSG- Depletion ab. Da bei 50 und 70 μM DMF-Konzentration kein GSH sowie GSSG-Molekϋl in den betroffenen infizierten Erythrozyten vorhanden war (d.h. GSH, GSSG = 0 pmol), waren wir gezwungen aus mathematischen Gründen die Kurve vorzeitig zu beenden.
Diese Experimente belegent, dass Dimethylfumarat konzentrationsabhängig eine völlige GSH-Depletion verursacht und den Erythrozyt zwingt, GSSG in GSH umzuwandeln. Das neu gebildete GSH wird wiederum mittels DMF durch Konjugatbildung abgefangen. Am Ende dieses Kreislaufes verfügt der betroffene Erythrozyt weder über GSH noch über GSSG. Dieser Erythrozyt und der sich darin befindende Parasit sind wegen einer vollständigen GSH-Depletion nicht mehr lebensfähig.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Dimethylfumarat (DMF) und deren Derivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Malaria, Trypanosomiasis, Filariose.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Parasiten der Gattung Plasmodium angehören.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Parasiten der Art Plasmodium falciparum und/oder Plasmodium berghei angehören.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen weiteren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit geeigneten Wirkstoff aufweist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Desipramin, Chloro- quin, Mefloquin, Atovaquon, Proguanil, Artemether, Lumefantrin, Doxycyclin, Primaquin, Artemisinin, Artesunat, Arteflene, Artemotil, Dihydroartemisi- nin, Arteether, Halofantrin, Amodiaquin, Sulfadoxin, Pyrimethamin, Tafeno- quin, Atovaquon, Fosmidomycin, Suramin, Pentamidin, Melarsoprol, Eflor- nithin, Doxycyclin, Diethylcarbamazinecitrat, Albendazol, Ivermectin.
7. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
8. Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit bei einem Lebewesen, das die Verabreichung von Dimethyl- fumarat (DMF) und deren Derivate umfasst.
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