DE2832204A1

DE2832204A1 - Mittel zur behandlung von nervenerkrankungen, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2832204A1
Application number: DE19782832204
Authority: DE
Inventors: Murray J Dr Sanders
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-07-22
Filing date: 1978-07-21
Publication date: 1979-02-01
Also published as: GB2001244B; CA1108533A; GB2001244A; JPS5455711A; US4126676A

Description

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BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Nervenerkrankungen, insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen, wie der amyotrophisehen Lateralsklerose, ein Verfahren zur Herstellung dieses Mittels und seine Verwendung bei der Bekämpfung von solchen Nervenerkrankungen »

In der US-PS 3 8&8 977 des Anmelders sind ein Mittel und ein unter Verwendung dieses Mittels durchgeführtes Behandlungsverfahren beschrieben. Die Patentschrift lehrt, daß Tiere, einschließlich Menschen, gegen progressive degenerative neurologische Erkankungen, wie die amyotrophen Lateralsklerose, behandelt werden können, indem man ihnen ein modifiziertes Schlangengiftneurotoxin verabreicht, das von dem Gift entweder von -Tieren der Gattung Bungarus (einschließlich der Gattung Crotalus) oder dem Gift von Tieren der Gattung Bungarus und der Gattung Naja abgeleitet ist, das heißt daß in beiden Fällen das verwendete therapeutische Mittel mindestens zum Teil ein modifiziertes Neurotoxin enthalten muß, das von Tieren der Gattung Bungarus gewonnen worden ist.

Wie in dieser Patentschrift angegeben wird, verlaufen degenerative Nervenerkrankungen chronisch und führen zu schweren physischen Störungen, wie Paralyse_fund sogar zum Tod. Es wird angenommen, daß viele dieser neurologischen Erkrankungen oder Nervenerkrankungen durch spezifische Infektionen, beispielsweise Virusinfektionen oder durch das Eindringen von Proteinen mit potentiell schädlichen Wirkungen verursacht werden. Es wird ferner angenommen,

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daß diese schädlichen Wirkungen durch das Virus oder das Protein verursacht werden, das sich an die Nervenzellenrezeptoren bindet oder mit diesen zusammenwirkt. Diese Nervenzellenrezeptoren können diskrete anatomisehe Strukturen sein oder können lediglich theoretische biophysikalische Modelle darstellen, die eine der Funktionen der Nervenzellen beschreiben. Unabhängig von theoretischen Überlegungen ist es bekannt, daß Nervenzellen so funktionieren, als ob körperliche Rezeptoren vorliegen würden.

Wegen seines neurotropen Charakters erreicht das injizierte neurotrope Schlangengift bei den Tieren ein breites Spektrum von Nervenzellenrezeptoren. Die oben angesprochene US-PS 3 888 977 lehrt, daß das Gift seinen neurotropen Charakter selbst dann beibehalten kann, wenn es entgiftet wird. Durch Behandeln von Patienten,die an degenerativen Nervenerkrankungen leiden, mit entgiftetem neurotropem Schlangengift können die Nervenzellenrezeptoren durch das entgiftete Gift blockiert werden, wodurch die weiteren schädlichen Wirkungen der eindringenden pathogenen Bakterien, Viren oder Proteine verhindert werden.

Somit muß das in der genannten US-PS 3 888 977 beschriebene modifizierte Neurotoxin den neurotropen Charakter des Schlangengifts beibehalten und dennoch entgiftet sein, da die normalerweise erforderliche Dosis bei weitem dazu ausreichen würde, den Patienten zu töten, wenn das Gift in der toxischen Form verbliebe. Wenn das Entgiftungsverfahren jedoch zu harte Bedingungen anwendet oder zu lange durchgeführt wird, erfolgt eine Beeinträchtigung des neurotropen Charakters des entgifteten Schlangengiftes, wodurch die therapeutische Wirkung des modifizierten Neurotoxins erheblich vermindert

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wird oder sogar völlig verloren geht. Wenn andererseits das Entgiftungsverfahren nicht bis zur Ungiftigkeit durchgeführt wird, bleibt stets die Möglichkeit einer toxischen Reaktion bei einem Teil der Patienten, die mit dem unvollständig entgifteten Schlangengift behandelt werden.

Die US-PS 3 888 977 nimmt Bezug auf frühere Arbeiten des Erfinders, bei denen modifizierte Neurotoxlne verwendet wurden, die lediglich von dem Naja-Gift (Kobra-Gift) abgeleitet worden sind, wobei erhebliche Vorteile mit diesem früheren modifizierten Neurotoxin erzielt worden sind. Die Patentschrift gibt jedoch auch an, daß das von dem Naja-Gift abgeleitete modifizierte Neurotoxin nicht dazu in der Lage ist, das Fortschreiten der Nervenerkrankungen vollständig zu unterbinden, im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit dem in dieser Patentschrift beschriebenen Mittel erzielt worden sind, das ein von Tieren der Gattung Bungarus gewonnenes Material enthält. Weiterhin, und was wichtiger ist, konnte das lediglich aus dem Naja-Gift bereitete modifizierte Neurotoxin nicht vollständig entgiftet werden, da angenommen wurde, daß hierdurch die Wirkung und der gewünschte therapeutische Effekt verloren gehen würden. Somit konnte eine biologische Prüfung niemals die völlige Entgiftung zeigen, so daß stets ein Risiko bei der Verabreichung des nicht völlig entgifteten Mittels blieb.

Zur Vermeidung der Schwierigkeiten des früheren mofifizierten Neurotoxins gibt die US-PS 3 888 977 an, daß man das modifizierte Neurotoxin von einem Gift breiter Wirkung oder breiter Penetration ableiten muß, das heißt von einem von Tieren der Gattung Bungarus (einschließlich der Gattung Crotalus) gewon-

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nenen Gift ausgehen muß. Wenngleich das Bungarus-Gift dem Naja-Gift ähnlich ist, unterscheiden sich die Gifte hinsichtlich der Intensität und des Wirkungsorts der physiologischen Wirkung und hinsichtlich der Zeit, bis zu der oder während der die physiologische Wirkung ausgeübt wird. Die US-PS 3 888 977 gibt jedoch an, daß man das Naja-Gift verwenden kann, wenn man es mit Bungarus-Gift kombiniert, wobei sogar die Kombination aus Bungarus-Gift und Naja-Gift überlegene Ergebnisse liefert im Vergleich zu den mit Bungarus-Gift allein erzielten Ergebnissen. Somit lehrt dieser Stand der Technik, daß man zwar das Bungarus-Gift in wirksamer Weise alleine verwenden kann, daß man jedoch das Naja-Gift zusammen mit Bungarus-Gift einsetzen muß.

Nun ist jedoch das Bungarus-Gift leider nicht so gut verfügbar wie das Naja-Gift, ist unregelmäßiger zu erhalten und ist wesentlich teurer als das Naja-Gift.

Es wäre daher eine erhebliche Bereicherung der Technik, wenn man Naja-Gift derart anpassen könnte, daß es ein mindestens ebenso gut geeignet modifiziertes Neurotoxin liefert, wie es gemäß der US-PS 3 888 977 angegeben wird. Hierdurch würde die Versorgung mit einem mindestens ebenso guten therapeutischen Mittel sichergestellt werden und dies bei erheblichen Kosteneinsparungen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Mittel zur Behandlung von progressiv degenerativen neurologischen Erkrankungen anzugeben, dessen therapeutisch wirksames modifiziertes Neurotoxin lediglich aus Tieren der Gattung Naja gewonnen worden ist und welches Mittel in einer verabreichbaren Form vorliegt, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses

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Mittels und die Verwendung dieses ein atoxisches modifiziertes Neurotoxin enthaltenden Mittels anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung von progressiv degenerativen neurologischen Erkrankungen von den motorischen Nervenaustritten bis zu den neuromuskulären Synapsen, den Axonen bzw. Achsenzylindern und den Nervenmyelinscheiden oder Nervenmarkscheiden gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine verabreichbare Form eines entgifteten und neurotrop aktiven Schlangengiftneurotoxins enthält, das von dem Gift einer Spezies der Gattung Naja abgeleitet ist, und daß es bei dem Semliki-Forest-Virustest eine mindestens 30%ige Inhibierung der Plaques ergibt und sich bei der biologischen Prüfung als atoxisch erweist, indem es bei den behandelten Laboratoriumstieren und bei dem Semliki-Forest-Virustest im wesentlichen keine Anzeichen der Toxizität zeigt. Vorzugsweise bewirkt das Mittel eine mindestens 50%ige Inhibierung der Plagues.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung dieses Mittels bei der Behandlung bzw. Bekämpfung von progressiv degenerativen neurologischen Erkrankungen oder Nervenerkrankungen von Tieren einschließlich Menschen, der oben angegeben Art, wozu das angegebene Mittel in einer die Erkrankung lindernden, mildernden oder heilenden Dosis verabreicht wird. Die an einen Menschen mit einem Körpergewicht von 68 kg (150 lbs) verabreichte Dosis des Mittels beträgt etwa 0,1 bis 10 ml einer 1%igen Lösung (bezogen auf das rohe Gift) des modifizierten Neurotoxins. Das Mittel kann auf subkutanem, intramuskulärem oder intravenösem Wege durch Injektion verabreicht werden, wenngleich man auch bei geringerer Wirkung eine orale Verabreichung

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anwenden kann. Für andere Tiere oder bei anderen Gewichten muß die Dosis entsprechend angepaßt werden.

Das erfindungsgemäße Mittel ist besonders geeignet für die Behandlung von progressiv degenerativen Nervenerkrankungen, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der multiplen Sklerose, der Kuru-Krankheit, der PoIymyositis, der Meningitis, der Muskeldystrophie und der Polyomyositis.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels bzw. des in diesem Mittel enthaltenen Wirkstoffs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Schlangengift bei einem pH-Wert von mehr als 7 und bei einer Temperatur von 15 bis 40⁰C oxidiert, bis das Gift sich bei dem modifizierten Semliki-Forest-Virustest als atoxisch erweist, und dann die Oxidationsreaktion beendet.

Die vorliegende Erfindung gibt somit auch ein Verfahren an, gemäß dem die Entgiftungsreaktion schlagartig unterbrochen wird, indem man den Ablauf der Reaktion mit Hilfe eines modifizierten Semliki-Forest-Virustests überwacht.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die früheren Arbeiten des Erfinders mit lediglich Naja-Gift, die gezeigt haben, daß eine Spur der Toxizität des modifizierten Neurotoxins vorhanden sein muß, um die Wirkung zu ermöglichen, nicht gezeigt haben, daß ein relativ enger Bereich bei derEntgiftungsreaktion des Naja-Gifts vorliegt, innerhalb dessen das Gift entgiftet ist, jedoch neurotrop aktiv bleibt. Wenn keine präzise Steuerung der Reaktion durchgeführt wird, kann die Entgiftungsreaktion diesen engen Bereich

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durchlaufen, so daß ein erhebliches Maß des neurotropen Charakters verloren geht.

Wie in der US-PS 3 888 977 angegeben ist, kamen die früheren Arbeiten zu dem Schluß, daß das Naja-Gift seinen neurotropen Charakter im wesentlichen verliert, wenn es völlig entgiftet ist, so daß eine Spur der Toxizität bewußt beibehalten wurde, um einen entsprechenden neurotropen Charakter aufrechtzuerhalten. Wie nunmehr erkannt worden ist, war das damals notwendig erachtete Erfordernis der geringen Toxizität eine Voraussetzung dafür, die Entgiftungsreaktion vor dem Erreichen der Ungiftigkeit zu unterbrechen, um zu verhindern, daß die Reaktion weiterläuft und der neurotrope Charakter verloren geht.

Diese Schwierigkeit wurde weiter dadurch verschärft, daß gewisse Reagenzien, die bei diesen früheren Arbeiten verwendet wurden, die Entgiftungsreaktion zu einem Zeitpunkt tatsächlich weiterlaufen ließen, zu dem angenommen wurde, daß die Reaktion zum Ende gekommen war. Dies hatte zur Folge, daß das entgiftete Neurotoxin langsam weiterreagieren konnte und daß ein erheblicher Anteil des neurotropen Charakters langsam zerstört wurde.

Aus diesen Gründen beließ man ein gewisses Maß der Toxizität in dem alleine verwendeten Naja-Gift, so daß dessen Verabreichung stets ein gewisses Risiko mit sich brachte. Da äie Reaktion weiterlief,, wie nicht bekannt war und auch nicht bemerkt wurde,

veränderte sich auch, äie Wirkung des modifizierten Heurotoxins mit der Zeit.

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Demzufolge wurde angenommen, wie es in der US-PS 3 888 977 angegeben ist, daß das allein verwendete Naja-Gift wegen der Notwendigkeit, eine geringe Spur der Toxizität beizubehalten, nicht das Ausgangsmaterial eines für die Praxis geeigneten und an

Menschen zu verabreichenden therapeutischen Mittels darstellen kann.

Es ist nunmehr bekannt, daß unter anderem das für die Entgiftung des Naja-Gifts verwendete Peroxid nicht, wie erwartet, durch die Zugabe von Katalase völlig deaktiviert wird. Diese unvollständige Deaktivierung durch die Katalase ist teilweise eine Folge der Anwesenheit des bei den früheren Verfahrensweisen angewandten Formalins. Es ist nunmehr bekannt, daß

Formalin die vollständige Desaktivierung durch die Katalase beeinträchtigt und eine sehr langsame Weiterreaktion des Naja-Gifts ermöglicht. Es wird angenommen, daß die zur üngiftigkeit führende Oxidationsreaktion lediglich auf die Schwefelbindungen der gefalteten Hauptkette des Schlangengifts einwirkt und daß nach Erreichen der üngiftigkeit eine weitere Oxidation zu einer Spaltung der entfalteten Kette führt. Wenn diese Weiterreaktion erfolgt, wird die neurotrope Wirkung des entgifteten Giftes vermindert, wobei dann, wenn die Reaktion weiterläuft, der neurotrope Charakter ernsthaft beeinträchtigt wird.

Demzufolge wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das Naja-Gift mit Katalase desaktiviert, jedoch nicht in Gegenwart von Formalin. Weiterhin wird die Reaktion genau mit Hilfe einer neu entwickelten Technik verfolgt, so daß der enge Bereich der Reaktion, bei der die üngiftigkeit und der neurotrope Charakter vorliegen, erreicht, jedoch nicht durchlaufen werden

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kann. Alternativ kann man die Oxidation mit Hilfe eines andersartigen Oxidationsmxttels (das heißt eines von Peroxid verschiedenen Oxidationsmittels) bewirken, so daß man die Oxidation scharf an der Stelle unterbrechen kann, bei der die Ungiftigkeit und der neurotrope Charakter vorliegen.

Die neu entwickelte Methode oder Technik zur Verfolgung der Reaktion umfaßt eine Modifizierung des in der US-PS 3 888 977 beschriebenen Semliki-Forest-Virustests, welcher Test nachfolgend näher beschrieben wird. Mit Hilfe dieses Testverfahrens kann die Entgiftungsreaktion bis zum Erreichen der Ungiftigkeit durchgeführt werden, ohne daß eine wesentliche Beeinträchtigung des neurotropen Charakters des modifizierten Naja-Neurotoxins erfolgt, wobei gleichzeitig die Entgiftungsreaktion völlig unterbrochen werden kann, ohne daß sie, wie bisher, eine langsame Weiterreaktion ermöglicht. Aufgrund dieser Verbesserungen wird es möglich, lediglieh Naja-Gift dazu zu verwenden, ein wirksames modifiziertes Neurotoxin herzustellen, das heißt ein Mittel zu schaffen, das im wesentlichen aus dem modifizierten Neurotoxin des Naja-Gifts als Wirkstoff besteht. Wenngleich dieses Neurotoxin nicht so wirksam ist wie eine Kombination aus den Giften der Tiere der Gattungen Bungarus und Naja oder aus dem Bungarus-Gift als solchem, stellt dieses Neurotoxin ein in angemessener Weise modifiziertes Neurotoxin dar, das aus einem billigeren und leichter verfügbaren Ausgangsmaterial gebildet werden kann.

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Das erfindungsgemäße Mittel wird somit durch eine gesteuerte Entgiftung des mindestens teilweise neurotoxischen Naja-Schlangengifts hergestellt. In dieser Hinsicht ist zu bemerken, daß das Gift der meisten Schlangen gewisse neurotoxische Komponenten und eine gewisse hämatoxische Komponenten besitzt, wobei die verschiedenen Schlangenarten im wesentlichen in eine erste Gruppe von Schlangen, deren Gift überwiegend durch einen Eingriff in die Blutchemie wirkt, und eine zweite Gruppe von Schlangen, deren Gift überwiegend durch eine Zerstörung von Nervenzellbestandteilen wirkt, eingeteilt werden können. Vertreter von Schlangen mit neurotoxischem Gift sind Naja (Kobra), Krait (Giftnatter), zum Beispiel Blue Krait, die Korallenschlange und Crotalus terrificus terrificus.

Im Rahmen er vorliegenden Erfindung steht der Ausdruck "neurotoxisches Schlangengift" für ein Schlangengift, das überwiegend, jedoch nicht ausschließlich, für die Nervenzellen und, wie oben angegeben, die damit verbundenen Einrichtungen bzw. Organe toxisch wirkt.

Das Gift der Schlangen enthält eine Vielzahl von chemischen Verbindungen, einschließlich verschiedener Enzyme. Das erfindungsgemäße Mittel kann aus vollständigem Gift gewonnen werden, wenngleich viele der Bestandteile des Gifts für den erfindungsgemäßen Zweck inert sind und von den aktiven Bestandteilen des Giftes abgetrennt werden könnten. Somit steht der hierin verwendete Ausdruck "Schlangengift" für das vollständige Gift oder lediglich den toxischen Anteil dieses Gifts. Diese Definition trifft auch auf den Begriff "Schlangengiftneurotoxin" zu.

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Um eine Entgiftung des Giftes zu bewirken, wird das Gift vorzugsweise in der schonendsten und vorsichtigsten Weise umgesetzt. Wenngleich verschiedene Entgiftungsverfahren bekannt sind, wie die Umsetzung mit Formaldehyd, Fluoresceinfarbstoffen, Ultraviolettlicht und dergleichen, ist eine schonende und langsame Oxidation bei relativ niedrigen Temperaturen bevorzugt, wenngleich die tatsächlich angewandte Entgiftungsmethode nicht kritisch ist. Demzufolge kann man eine modifizierte Boquet-Entgiftungsmethode anwenden, wie sie nachfolgend näher erläutert wird.

Eine genaue Beschreibung des modifizierten Semliki-Forest-Virustests ist in der bereits besprochenen US-PS 3 888 977 angegeben. Diese Methode wird nach einer späteren Anmeldung des Anmelders verbessert, indem bestimmte Testzellen angewandt und bestimmte Verfahrensänderungen vorgenommen werden. Prinzipiell besteht das verbesserte Verfahren darin, daß man eine dünne Schicht von Embryozellenm, Kükenzellen oder Tierzellen auf einem Wachstumssubstrat aufbringt, beispielsweise Zellen, der Nieren von frisch geborenen Hamstern, wobei die Zellen dazu in der Lage sein müssen, mindestens 10 Plaques des Semliki-Forest-Virus zu bilden; die Zellen mit dem zu prüfenden entgifteten modifizierten Neurotoxin behandelt (vorzugsweise durch Inkubieren der behandelten Zellen bei 37°C bis zum Auftreten des Virenwachstums); und Beobachten der Zellen unter dem Mikroskop, um festzustellen, ob das modifizierte Neurotoxin noch eine Toxizität entfaltet, die sich durch eine Zellzerstörung manifestiert. Anschliessend werden die behandelten Zellen mit dem Semliki-Forest-Virus der American Type Culture Collection angeimpft (welches Virus man vorzugsweise durch Serienpassage durch die Zellen an die Zellen angepaßt hat/

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wobei man vorzugsweise die Kultur bei 37⁰C inkubiert, um ein Wachstum der Virus-Plaques zu bewirken). Der neurotrope Charakter des untersuchten modifizierten Neurotoxins zeigt sich in einer Verminderung der Virus-Plaques bei den angeimpften Zellen. Bequemerweise wird diese Verminderung durch einen Vergleich mit einem Kontrollversuch bestimmt, der in gleicher Weise durchgeführt wird, mit dem Unterschied, daß man' die Behandlung mit dem zu prüfenden modifizierten Neurotoxin wegläßt. Eine mindestens 30%ige Verminderung derVirus-Plaques bei den angeimpften Zellen weist auf ein ausreichendes Maß der Wirkung hin, wenngleich eine Verminderung um 5O% und vorzugsweise eine Inhibierung der Plaques-Bildung um mindestens 70% bis 75% bevorzugt sind.

Bei diesem Test zeigt sich irgendwelche restliche Toxizität des geprüften modifizierten Neurotoxins an den behandelten Zellen, insbesondere nach der Inkubation. In dem untersuchten modifizierten Neurotoxin noch vorhandene Toxine üben drastische negative Wirkungen auf die Zellen aus, wobei die zerstörten Zellen ohne weiteres, insbesondere bei einer mikroskopischen Untersuchung, erkannt werden können. Diese Testmethode kann somit dazu herangezogen werden, genau den engen Bereich festzustellen, der zwischen der Ungiftigkeit, die sich dadurch manifestiert, daß die Zellen nicht zerstört werden, und einer hohen Wirkung erstreckt, die sich in einer mindestens 30%igen Verminderung oder Inhibierung der Virus-Plaques zeigt.

Zusätzlich zu dem Semliki-Forest-Virustest sollte man eine biologische Prüfung des entgifteten Giftes durchführen, um die Nichttoxizität zu bestätigen. Somit wird die Toxizität des erfindungsgemäßen Mittels an

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damit behandelten Laboratoriumstieren, wie Mäusen, Ratten und Meerschweinchen, untersucht, wenngleich man gewünschtenfalls auch Hunde und Affen verwenden kann, wobei die untersuchten Laboratoriumstiere im wesentliehen keine Anzeichen der Toxizität zeigen sollten.

Wenn das angewandte Entgiftungsverfahren die oben angegebenen Standards, nämlich den modifizierten Semliki-Forest-Virustest und die biologische Prüfung, erfüllt, ist es für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet.

Ein geeignetes Entgiftungsverfahren ist eine Modifikation der bekannten Boquet-Methode (Ann. Inst. Pasteur

(1941) 379 bis 396). Man bildet hierzu eine Lösung des Giftes in einem geeigneten Lösungsmittel, insbesondere in Wasser. Da die Konzentration des Giftes in der Lösung nicht kritisch ist, kann man bequem eine bis zu 3 gew.-%ige Lösung herstellen. Man kann die Lösung mit einem Antischaummittel versetzen, da die Schlangengifte im allgemeinen schäumende Lösungen ergeben. Hierzu kann man irgendein nicht-toxisches, inertes Antischaummittel verwenden, die dem Fachmann bekannt sind, wozu man insbesondere die für Nahrungsmittel zugelassenen Siliconverbindungen einsetzt. Zu dieser Lösung gibt man eine Sauerstoff-bildende Verbindung, wenngleich man auch sauerstoffhaltige Gase und insbesondere naszierenden Sauerstoff enthaltende Gase durch die Lösung leiten kann. Alternativ kann man Mechanismen anwenden, die in situ Sauerstoff bilden, wie ultraviolettes Licht oder Fluoresceinfarbstoffe, um in der wäßrigen Lösung Sauerstoff zu bilden. Bequemerweise gibt man jedoch CP Wasserstoffperoxid (30%ige Lösung) zusammen mit einem Katalysator zum Aktivieren des Wasserstoffperoxids, wie Kupfersulfat, zu. Da die Entgiftungsreaktion

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im basischen Bereich abläuft, wird der pH-Wert mit Hilfe einer geeigneten Base, wie einem Alkalimetalloder Erdalkalimetall-hydroxid, -carbonat oder dergleichen, beispielsweise Natriumhydroxid, auf einen pH-Wert von mehr als 7 und vorzugsweise weniger als 10 eingestellt. Alternativ kann man auch gasförmiges Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder ein anderes nichttoxisches Amin oder eine ähnliche Verbindung verwenden.

Die Lösung wird mit Hilfe irgendeines geeigneten Puffers, wie einem Alkalimetallphosphatpuffer oder einem Acetatpuffer, auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert. Wenn, kein Puffer verwendet wird oder bei Verwendung eines Puffers nach längerer Zeitdauer, kann der pH-Wert absinken. Dann können zusätzliche Mengen der Base erforderlich sein, um den geeigneten pH-Wert aufrechtzuerhalten.

Die Lösung wird bei mäßigen Temperaturen, beispielsweise bei Temperaturen zwischen etwa 15 und 40⁰C, gehalten, wenngleich der obere Abschnitt dieses Bereiches, das heißt ein Bereich von 20 bis 40⁰C, bevorzugt ist. Man kann Temperaturen außerhalb dieses Bereiches anwenden, wenngleich niedrigere Temperaturen die für die Entgiftung erforderliche Zeit verlängern und höhere Temperaturen zu einer unannehmbaren Denaturierung des Giftes führenkönnen. Die Mischung wird je nach Wunsch entweder gelegentlich oder ständig gerührt. Nach etwa bis zu 30 Tagen, insbesondere zwischen 2 und 16 Tagen, der Behandlung unter den angegebenen Bedingungen, und in Abhängigkeit von der Temperatur und des eingesetzten Giftes ist die Entgiftung erreicht und das Gift in der erfindungsgemäßen Weise modifiziert. Man kann jedoch kürzere oder längere Zeiten anwenden, vorausgesetzt, daß der modifizierte Semliki-Forest-Virustest und die

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biologische Prüfung, wie sie oben angesprochen worden sind, in angemessener Weise erfüllt werden.

Die Entgiftungsreaktion wird dann unterbrochen, indem man einen Katalysatordesaktivator zusetzt, der eine weitere Wirkung des Katalysators auf das Wasserstoffperoxid verhindert« Viele solche Reaktionsdesaktivatoren sind bekannt; erfindungsgemäß verwendet man jedoch vorteilhafterweise Katalase (CP).

Bei dem erfindungsgemäßen Entgiftungsverfahren wird in der Lösung kein Formalin verwendet, was im Gegensatz zu der Verwendung dieses Substanz bei den früheren Arbeiten des Erfinders an Naja-Gift steht, da, wie bereits angegegen wurde, Formalin die Desaktivierung des Kupferkatalysatörs durch Katalase (oder andere Wasserstoffperoxid-Desaktivatoren) verhindert.

Das modifizierte Neurotoxin kann unerwünschte Ionen enthalten, die während des Entgiftungsverfahrens gebildet worden sind. Diese Ionen kann man in irgendeiner gewünschten Weise von dem modifizierten Neurotoxin abtrennen, wenngleich man vorzugsweise eine übliche Dialyse unter Verwendung von semipermeabler Membranen durchführt. Somit bringt man die entgiftete Lösung in eine semipermeable Membran, wie eine Celluloseacetatmembran, ein und taucht die Membran in eine phosphatgepufferte Natriumchloridlösung (die beispielsweise einen pH-Wert von 6,8 aufweist und bei einer Temperatur von 0 bis 50⁰C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 20°C gehalten und während 1 Stunde bis zu 2 Tagen angewandt wird), um eine überführung der unerwünschten Ionen aus der Lösung des modifizierten Neurotoxins in die Salzlösung zu bewirken. Es versteht sich jedoch, daß einige der aktiven

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Moleküle ein Molekulargewicht von 6000 oder weniger besitzen und daß es schwierig ist, diese niedrigmolekularen Verbindungen mit der semipermeablen Membran zurückzuhalten. Somit können diese aktiven Verbindungen verloren gehen, so daß diese Methode nicht angewandt werden sollte, wenn die lonenentfernung nicht als vorteilhaft anzusehen ist.

Das modifizierte Neurotoxin wird vorzugsweise filtriert, beispielswweise durch eine Reihe von Membranen mit graduiertem, durchschnittlichem Porendurchmesser, insbesondere durch eine Reihe von Filtermembranen, die einen (durchschnittlichen) Endporendurchmesser von 0,22 μπι aufweisen^ um die Sterilität sicherzustellen.

Man kann ein Konservierungsmittel in das Produkt einbringen, beispielsweise Merthiolat in einer Konzentration von 1 Gew.-Teil pro 10 000 Gew.-Teile. Weiterhin itfird der pH-Wert vorzugsweise auf einen Wert zwischen 7 und 4, beispielsweise auf einen Wert von 6,8 eingestellt, wozu man nichttoxische, für Nahrungsmittel geeignete Säuren, wie Mineralsäuren, Essigsäure, Milchsäure und dergleichen, vorzugsweise zusammen mit einem geeigneten Puffer, verwendet. Der letztlich eingestellte saure pH-Wert ist nicht kritisch? jedoch ist ein pH-Wert des Mittels von weniger als 4 im allgemeinen für gewisse Verabreichungsweisen, beispielsweise die subkutane Injektion, unbequem.

Die normale Dosis, in der das erfindungsgemäße modifizierte Neurotoxin verabreicht wird, hängt von dem zu behandelnden Tier, einschließlich Menschen, ab. Als Standard ist su sagen, daß ein erwachsener Mann mit einem Gewicht von etwa 68 kg (150 lbs) normalerweise etwa 0,5 bis 6 ml des Mittels verabreicht bekommt, das aus einer 1 gew.-£igen Lösung des Schlangengiftes her-

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gestellt worden ist. Die Dosierungen werden für andere Behandlungssubjekte, beispielsweise jüngere oder ältere Patienten, und für Patienten mit größerem oder geringerem Körpergewicht, entsprechend eingestellt. Im allgemeinen sind Dosierungen zwischen 0,05 und 10 ml des Mittels, das aus einer 1 gew.-%igen Lösung des Giftes hergestellt worden ist, geeignet, wenngleich Dosierungen zwischen 0,4 und 3 ml bevorzugt sind. Die Dosierungen werden auch entsprechend der Mittel angepaßt, die von anderen als 1%igen Lösungen des Giftes abgeleitet worden sind. Obwohl man den Patienten das modifizierte Neurotoxin alle zwei Wochen verabreichen. kann, ist es bevorzugt, das Mittel mindestens wöchentlich,vorzugsweise alle zwei Tage oder täglich, das heißt drei- bis siebenmal wöchentlich, zu geben. Die Lösung kann entsprechend dem angestrebten Verabreichungsweg in geeigneter Weise formuliert werden, beispielsweise zu üblichen Verabreichungsformen, wie Tabletten, Pulvern. Elixieren und Lösungen. Hierzu können übliche Bindemittel, Streckmittel, Verdünnungsmittel., Konservierungsmittel und/oder Hilfsstoffe etc. verwendet werden. Für Injektionszwecke ist jedoch eine einfache physiologische Salzlösung oder dergleichen bevorzugt.

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Es ist jedoch festzuhalten, daß das erfindungsgemäße Mittel nicht prophylaktisch wirkt und die Infektion von pathogenen Viren etc. nicht zerstört oder verhindert. Demzufolge muß das erfindungsgemäße Mittel unbegrenzt lange verabreicht werden. Die ständige Behandlung bringt jedoch keine größeren Schwierigkeiten, da keine Kontraindikationen für die gleichzeitige Verabreichung des erfindungsgemäßen Mittels mit irgendwelchen anderen Arzneimitteln, außer vielleicht Vitamin ^B12' t^st^⁶¹¹· ^Es scheint so zu sein, daß Vitamin B₁₂

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als neuroaktives Material in gewisser Weise die Funktion des erfindungsgemäßen Mittels beeinflußt, so daß es demzufolge bevorzugt ist, Vitamin B₁₂ nicht in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Mittel zu verabreichen. 5

Wie bereits erwähnt, muß das Gift, aus dem das erfindungsgemäße Mittel hergestellt wird, ein neurotoxisches Gift sein, das von Tieren der Gattung Naja gewonnen worden ist, wie Naja naja, Naja haja, Naja flava, Naja hannah, Naha tripudians und Naja naja siamensis. Das Mittel kann jedoch auch andere neurotoxische Gifte enthalten. Somit kann das erfindungsgemäße Mittel auch andere neurotoxische Gifte enthalten, die von denen verschieden sind, die von Tieren der Gattung Bungarus gewonnen worden sind (das heißt die der Lehre der US-PS 3 888 977 entsprechen), vorausgesetzt, daß die Kombination den wesentlichen Charakter des modifizierten Neurotoxins aufweist, das lediglich aus Tieren der Gattung Naja gewonnen worden ist. Vorzugsweise soll jedoch die Menge der gegebenenfalls zusätzlich verwendeten Gifte so groß sein, daß sie die grundlegenden und neuen Eigenschaften des von dem Gift von Tieren der Gattung Naja abgeleiteten modifizierten Neurotoxins nicht beeinträchtigt. Dies bedeutet normalerweise, daß das von Naja abgeleitete Neurotoxin mindestens 75% des modifizierten Neurotoxins und insbesondere mindestens 85% bis 95% davon ausmacht.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1

Man gibt 40 g getrocknetes Naja naja-Gift zu 3 600 ml einer wäßrigen Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5. Dann gibt man eine Spurenmenge eines Silicon-Antischaummittels (Dow Corning) zu und rührt die Mischung, um das Gift aufzulösen. Dann gibt man unter Rühren 2 ml einer 1%igen Kupfersulfatlösung CP (chemisch rein) zu und versetzt die Lösung mit 80 ml 30%igem Wasserstoffperoxid. Man überführt die Lösung 'in einen Meßkolben und füllt mit der wäßrigen Phosphatpufferlösung auf 4000 ml auf. Man inkubiert die Lösung bei 37°C und überwacht dabei den pH-Wert. Man hält den pH-Wert bei etwa 7,5, indem man erforderlichenfalls 1n Natriumhydroxidlösung zusetzt. Man verfolgt den Ablauf der Entgiftung mit Hilfe des oben beschriebenen modifizierten Semliki-Forest-Virustest und prüft die "üngiftigkeit über die Zerstörung bzw. Nichtzerstörung der Nierenzellen. Man überwacht die Nichttoxizität auch durch Verabreichen von 5,0 ml der unverdünnten Lösung auf intraperitonealem Wege an eine Reihe von Meerschweinchen mit einem Gewicht von 350 g. Nach Ablauf einer Entgiftungsdauer von etwa 7 Tagen läßt sich die üngiftigkeit mit Hilfe des Semliki-Forest-Virustests feststellen, so daß man 3 mg Katalase pro Milliliter der Lösung zusetzt, um die Entgiftungsreaktion zu unterbrechen. Die Üngiftigkeit wird mit Hilfe von vier Meerschweinchen geprüft, die bei der oben angegebenen Behandlungsdosis keinerlei Todesfall in 24 Stunden zeigen.

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Dann versetzt man die Lösung mit Merthiolat (2-(Äthylmercurithio)-benzoesäure-natriumsalz) in einer Menge von 1 Gew.-Teil pro 10 000 Gew.-Teile der Lösung und stellt den pH-Wert durch Zugabe von 1n Chlorwasser- stoffsäure auf 6,8 ein. Dann filtriert man die Lösung

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durch Klärmembranen und schließlich durch ein Sterilisationsfilter mit einer (durchschnittlichen) Porenweite von 0,22 μπι. Der modifizierte Semliki-Forest-Virustest zeigt die üngiftigkeit und eine 75%ige Verminderung der Plaques bildenden Einheiten.

Die schließlich in Flaschen abgefüllten und beschrifteten Produkte werden dann bezüglich der Anforderungen der Amerikanischen Gesundheitsbehörde (FDA) an die Sicherheit und die Sterilität geprüft, das heißt durch Behandeln von jeweils zwei Tieren von zwei Nagetierarten und durch Beobachten während 7 Tagen. Weiterhin werden auch die erforderlichen FDA-Kulturen hergestellt.

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Beispiel 2

Man verwendet das gemäß Beispiel 1 hergestellte Mittel bei klinischen Untersuchungen, wie sie in der US-PS 3 888 977 beschrieben sind. Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Mittel zeigt die gleichen allgemeinen Wirkungen wie das entgiftete neurotoxische Schlangengift der US-PS 3 888 977. Jedoch wird nach einer ausreichenden Behandlung mit dem Mittel gemäß Anspruch 1 zum Nachweis seiner Wirksamkeit und Sicherheit die Behandlung mit dem Mittel gemäß der US-PS 3 888 977 fortgesetzt, da die Langzeitwirkung dieses Mittels gut bekannt ist. Bei jeder Untersuchung wird die Verschlechterung des klinischen Zustandes des Patienten nach der Klassifikation der US-PS 3 888 977 untersucht, das heißt den Klassen I bis V, wobei die Klasse I einen geringen Befall und die Klasse V den Endbefall oder ein kurz davorstehendes Stadium bedeuten

TER MEER · MÖLLER · STEINMEISTER

Sanders

2-GER

Patient 1 :

Die Diagnose des Neurologen, die durch eine neurologische klinische Untersuchung bestätigt wird, weist den Patienten als klassischen Fall der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) aus. Wegen des überwiegenden Befalls der Arme und Beine mit deutlichen und allgemeinen Zuckungen wird dieser Patient als Befall III klassifiziert. Die anfängliche Behandlung besteht in zwei Injektionen von jeweils 1,0 ml alle 2 Tage, 6 Injektionen von 1,2 ml alle 2 Tage und dann alle 2 Tage eine Injektion von 1,4 ml, worauf die Verabreichung des Mittels auf 1,7 ml alle 2 Tage nach und nach ansteigt. Nach einer Behandlung von 3 Monaten hat sich die Verschlechterung des Zustandes stabilisiert, wobei der Grad und das Ausmaß der Zuckungen vermindert sind.

Patient 2:

Die Diagnose der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) wird von verschiedenen Klinikärzten erstellt und bestätigt. Der Gang des Patienten ist beeinträchtigt. Der Patient kann nur mit Schwierigkeiten gehen und verwendet kanadische Krücken. Die Zuckungen sind auffallend, ständig und deutlich, überwiegend sind die Beine und Arme befallen. Der Patient leidet weiterhin an Sprachstörungen und wird als Fall II bis III klassifiziert. Der Patient erhält zwei Injektionen von 1,0 ml, vier Injektionen von 1,2 ml, zwei Injektionen von 1,3 ml und dann von 1,4 ml des erfindungsgemäßen Mittels, wobei die Verabreichungen alle 2 Tage erfolgen. Der Zustand des Patienten verbessert sich temporär (zunehmende Körperstärke und Verminderung der Zuckungen) während der ersten 3 Wochen, wonach der Patient leicht ermüdet und die Zuckungen wiederkehren. Die Dosierung wird auf 1,2 ml alle 2 Tage während 6 Wochen vermindert, wobei 5 sich gute Ergebnisse einstellen.

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Sanders TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER 2-GER

Patient 3:

Die Diagnose wird durch einen Neurologen gestellt und von einem zweiten bestätigt. Die Hauptstörungen sind geringfügige Zuckungen in den Beinen. Der Patient zeigt einen spastischen Zustand, wobei sich das Sprechvermögen in den 6 Monaten verschlechtert hat, die der klassischen undeutlichen Aussprache der an amyotrophischer Lateralsklerose (ALS) leidenden Patienten vorausgehen. Der Befall des Patienten wird als IV klassifiziert. Der Patient erhält eine Injektion von 1,0 ml des erfindungsgemäßen Mittels alle 2 Tage, dann während drei Injektionen jeweils

1.2 ml alle 2 Tage und schließlich alle 2 Tage jeweils

1.3 ml des erfindungsgemäßen Mittels. Nach einem Monat ist der Patient gestärkt, es zeigen sich die Zuckungen als vermindert und das Sprechvermögen als verbessert.

Der Patient wird während weiterer 2 Monate stabilisiert.

Patient 4:

Die Diagnose wird durch einen Neurologen gestellt und in einer neurologischen Klinik bestätigt. Es ist ein Bulbusfall mit undeutlicher Stimme, Schluckschwierigkei ten und gewiesen Atmungsschwierigkeiten festzustellen. Di· Aussprache ist undeutlich. Beide Arme zeigen die Wirkung von amyotrophischer Lateralskleroae (ALS), wobei auch die Beine befallen sind. Der Patient kann die Beine mit Schwierigkeiten kreuzen, zeigt jedoch einen spastischen Zustand. Die Zuckungen sind ziemlich konstant, allgemein und deutlich erkennbar. Der Patient leidet bei Belastung auch an Beinkrämpfen und verliert erheblich an Gewicht. Der Patient wird als Befall IV klassifiziert. Der Patient wird mit zwei Injektionen von 1,0 ml, einer Inj ektion von 1,2 ml und dann alternierend mit Inj ektionen von 1,2 ml bzw. 1,3 ml behandelt. Samtliche Injek tionen werden alle 2 Tage gegeben. Der Patient zeigt

IOSMf/101·

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eine gewisse Besserung und eine Stabilisierung während 3 Monaten.

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Claims

PATENTANWÄLTE

TER MEER - MÜLLER - STEINMEiSTER

D-80OO München 22 D-4800 Bielefeid

Triftslraße 4 Siekerwaii 7

*· Juli

Case 2-GER
tM/th

Dr.Murray J. Sanders, 3009 Spanish Trail Road, Delray Beach, Florida 33444, U.S.A.

Mittel zur Behandlung von Nervenerkrankungen, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung .

Priorität: 22. Juli 1977, USA, Nr. 818 152

PATENTANSPRÜCHE

Mittel zur Behandlung von progressiv degenerativen neurologischen Erkrankungen der motorischen Nervenaustritte, der neuromuskulären Synapsen, der Axonen und der Nervenmyelinscheiden, dadurch gekennzeichnet, daß es eine verabreichbare Form eines entgifteten "und neurotrop aktiven Schlangengiftneurotoxins enthält, das von dem Gift einer Spezies der Gattung Naja abgeleitet ist, und daß es bei dem Semliki-Forest-Virustest eine mindes-

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OAiGINAL INSPECTED'

Sanders TER MEER · MÜLLER · STEINMEISTER 2-GER

tens 30%ige Inhibierung der Plaques ergibt und sich bei der biologischen Prüfung als atoxisch erweist, indem es bei den behandelten Laboratoriumstieren und bei dem Semliki-Forest-Virustest im wesentlichen keine Anzeichen der Toxizität zeigt.
2. Mittel nach Anspruch 1,dadurch gekenn-· ζ e ic hnet, daß es eine mindestens 50%ige Inhibierung der Plaques bewirkt.
3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Schlangengiftneurotoxin

im wesentlichen aus einem Material besteht, das von dem Gift eines Tiers der Gattung Naja abgeleitet ist. 15
4. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Schlangengift bei einem pH-Wert von mehr als 7 und bei einer Temperatur von 15 bis 40⁰C oxidiert, bis das Gift bei dem modifizierten Semliki-Forest-Virustest atoxisch ist, und dann die Oxidationsreaktion beendet.
5. Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 1 bis 3

bei der Bekämpfung von progressiv degenerativen neurologischen Erkrankungen der motorischen Nervenaustritte, der neuromuskulären Synapsen, der Axonen und der Nervenmyelinscheiden.
6. Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 1 bis 3 bei der Behandlung von amyotrophischer Lateralsklerose, multipler Sklerose, der Kuru-Krankheit, der PoIymyositis, der Meningitis, der Muskeldystrophie und der Polyomyositis.

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