DE60023034T2

DE60023034T2 - Cd45 hemmer

Info

Publication number: DE60023034T2
Application number: DE60023034T
Authority: DE
Inventors: Jerome Marc CHAPDELAINE; Katherine Knappenberger; Gary Steelman; Suzanne Suchard; Linda Sygowski; Rebecca Urbanek; Allan Chris VEALE
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2020-12-19
Also published as: WO2001045680A2; EP1242086A2; US20030130298A1; AU2202301A; JP2003518039A; EP1242086B1; DE60023034D1; WO2001045680A3; ATE305785T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder einer Organtransplantatabstoßungsreaktion.
Stand der Technik
Es ist bekannt, daß das Immunsystem aktiv an immunologisch assoziierten Erkrankungen und Störungen, wie z.B. Autoimmunkrankheiten und der Abstoßung von Organtransplantaten (organ graft rejection, „OGR") beteiligt ist. Dabei spielen hämatopoetische, aus dem Thymus stammende Zellen (sogenannte „T-zellen") eine wichtige und alles durchdringende Rolle als Regulatoren und Effektoren der Funktionen des Immunsystems. Hämatopoetische Zellen sowie T-Zellen im besonderen weisen auf ihrer Oberfläche ein bedeutendes Transmembran-Glycoprotein mit der Bezeichnung CD45 auf, das durch einen Cluster von antigenen Determinanten gekennzeichnet ist. CD45 ist auch als „LCA" (leukocyte common antigen) bekannt. Der cytosoliche Teil von CD45 weist Protein-Tyrosinphosphatase („PTP")-Aktivität auf, wobei bekannt ist, daß die CD45-Aktivität für die TCR-initiierte T-Zellaktivierung wesentlich ist. Untersuchungen in Zellinien mit CD45-Mangel zeigten, daß es sich bei CD45 um einen positiven Regulator des „TCR" (T-Cell Receptor) handelt und daß die CD45-Funktion bei der TCR-Regulation in der Dephosphorylierung der SRC-Kinasen p56^lck und p59^fyn besteht, die die Autophosphorylierung der positiven Regulationsstelle auf diesen Enzymen gestattet; diese Reaktionen führen zu nachgeschalteten Ereignissen und letztendlich zur T-Zellaktivierung.
Verfügbare Behandlungen von Autoimmunkrankheiten und OGR weisen therapeutische Nachteile auf. So ist beispielsweise Cyclosporin A, der am häufigsten zur Behandlung von OGR verwendete Arzneistoff, für die Niere und das ZNS toxisch.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es wurden wirkungsvolle CD45-Inhibitoren entdeckt. Solche Inhibitoren eignen sich zur Behandlung verschiedener Autoimmunkrankheiten ebenso wie zur Behandlung von OGR. Es konnte gezeigt werden, daß die Phosphataseaktivität von CD45 durch Verbindungen der vorliegenden Erfindung gehemmt wird, indem der cytosoliche Teil von CD45 mit den Verbindungen sowie mit p-Nitrophenylphosphat (pNPP), einem Phosphatasesubstrat, inkubiert wurde. Durch spektrophotometrische Beobachtung konnte gezeigt werden, daß die Freisetzung von p-Nitrophenol aus dem Substrat durch CD45 in Gegenwart der hier offenbarten Verbindungen gehemmt wird. Ebenso konnte unter Verwendung eines carboxyterminal phosphorylierten Peptids p56^lck als Substrat gezeigt werden, daß die Phosphataseaktivität von CD45 durch Verbindungen der vorliegenden Erfindung gehemmt wird. Ebenso konnte gezeigt werden, daß Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Proliferation von T-Zellen in einem T-Zellen-Proliferationstest hemmen.
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um heterozyklische Verbindungen, ausgewählt aus
Benzo[f]chinolin-5,6-dion;
Benzo[h]chinolin-5,6-dion;
Naphtho[1,2-b]furan-4,5-dion und
Naphthol[1,2-b]thiophen-4,5-dion
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Liganden von CD45, die im gebundenen Zustand die Aktivität der Protein-Tyrosinphosphatase (PTP)-Aktivität des cytosolichen Teils von CD45 hemmen. Die Bindung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an CD45 hemmt die für die TCR-initiierte T-Zellaktivierung wesentliche CD45-Aktivität. Somit wird durch erfindungsgemäße Verbindungen die positive Regulation des TCR, die zu nachgeschalteten Ereignissen sowie zur T-Zellaktivierung führt, gehemmt. Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich zur Unterdrückung der Wirkung des Immunsystems bei Störungen, wie z.B. Autoimmunkrankheiten und der Abstoßung von Organtransplantaten sowie zur Hemmung der Wirkung von T-Zellen als funktionelle Regulatoren und Effektoren des Immunsystems.
Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung hier beschriebener Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder einer Organtransplantatabstoßungsreaktion.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Beispiele
Beispiele 1 bis 4:
Die Verbindungen der Beispiele 1 bzw. 2, Benzo[f]chinolin-5,6-dion bzw. Benzo[h]chinolin-5,6-dion, wurden im wesentlichen wie von Braven, J.; Hanson, R.W.; Smith, N.G. J. Heterocyclic Chem. 1995, 32, 1051–1056 offenbart hergestellt. Die Verbindungen der Beispiele 3 bzw. 4, Naphtho[1,2-b]furan-4,5-dion bzw. Naphtho[1,2-b]thiophen-4,5-dion, wurden im wesentlichen wie von Brandao, M. A. F.; deOliveira, A. B.; Snieckus, V. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2437–2440 offenbart hergestellt.
Tests für biologische Aktivität
Verfahren A:
Phosphatase-Test mit pNPP als Substrat:
CD45-Enzym wurde von BIOMOL (Plymouth Meeting, PA, USA) erhalten. Die Phosphataseaktivität wurde in einem Puffer mit Endkonzentrationen von 25 mM an Imidazol bei pH 7,0, 50 mM NaCl, 2,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure („EDTA"), 5 mM Dithiothreitol („DTT") und 10 μg/ml Rinderserumalbumin („BSA") mit pNPP als Substrat getestet. Die Verbindungen wurden in einem Bereich von 30 bis 0,01 μM getestet, wobei je nach Löslichkeit der Verbindung eine Endkonzentration von 1 oder 5% Dimethylsulfoxyd („DMSO") vorlag. Die Aktivität wurde durch Verfolgen des Anstiegs der Absorption bei 405 nm unter Verwendung eines spektrophotometrischen Plattenablesegeräts SpectraMax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) gemessen.
Verfahren B:
Cytotoxizitätstest:
Die Aufnahme von Calcein-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wurde als quantitatives Maß der Zellviabilität verwendet, um die toxische Wirkung von Verbindungen auf T-Zellen zu beurteilen. In Kürze: PBMC wurde 3–7 Tage mit 3–10 μg/ml PHA, einem wirkungsvollen T-Zellmitogen, behandelt, um vorzugsweise die T-Zellpopulation zu expandieren (Bradley, Linda M. Cell Proliferation in Selected Methods in Cellular Immunology, Hrsg. Mishell, B.B. und Shiigi, S.M., W.H. Freeman and Co., San Francisco, 1980.).
Die T-Zelllymphoblasten wurden durch Trennung über Lymphoprep gereinigt, bei 2 × 10⁵/Loch in einer 96-Loch-Platte mit Rundboden, die RPMI mit der Verbindung enthielt, ausplattiert und in einem Inkubator mit 5% CO₂ über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Verdünnungsschema und die Kulturmedien waren mit denen, die im TZ-Zellproliferationstest verwendet wurden, identisch. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Dulbecco's phosphate-buffered saline, D-PBS) gewaschen und mit 1 μM Calcein-AM 30–45 min. in D-PBS inkubiert, wie in dem mit den „LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit" von Molecular Probes gelieferten technischen Informationsblatt beschrieben. Die prozentuale Viabilität wurde mit einem Fluoreszenz-Plattenablesegerät (Excitationsfilter 485/20 nm; Emissionsfilter 530/25 nm) bewertet, wobei es sich bei dem 100%-Kontrollwert um die in Abwesenheit der Testverbindung beobachtete Fluoreszenzintensität handelt.
Verfahren C:
Phosphatasetest mit 1ck 10-mer als Substrat:
Die Phosphataseaktivität wurde in 96-Loch-Platten in einem Puffer mit Endkonzentrationen von 25 mM HEPES bei pH 7,2, 5 mM DTT und 10 μg/ml BSA unter Verwendung des lck-carboxyterminalen Peptids TEGQpYQPQP als Substrat getestet (Cho, H., Krishnaraj, R., Itoh. M., Kitas, E., Bannwarth, W., Saito, H., Walsh, C.T. 1993. „Substrate specificities of catalytic fragments of protein tyrosine phosphatases (HPTPb, LAR, and CD45) toward the phosphotyrosylpeptide substrates and thiophosphotyrosylated peptides as inhibitors". Protein Science 2:977–984). Die Verbindungen wurden in einem Bereich von 30 bis 0,01 μM bei einer Endkonzentration von 5% DMSO getestet. Das Enzym wurde mit Substrat sowie mit oder ohne Verbindung bei Raumtemperatur 1,5 h inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Löcher jeweils mit BIOMOL „Green Reagent" (BIOMOL, Plymouth Meeting, PA, USA) versetzt, die Platten 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei 620 nm abgelesen.
Verfahren D:
Zellisolierung und T-Zellproliferationstest:
Vollblut wurde gesunden menschlichen Blutspendern entnommen. Periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells, „PBMC") wurden mit Lymphoprep-Dichtegradientenzentrifugation (Nycomed Amersham, Oslo, Norwegen) isoliert, gewaschen, gezählt und bei 2 × 10⁶ Zelle/ml in RPMI-1640-Medium mit Glutamin, 0,1 mg/ml Gentamycin und 10% hitzeinaktiviertem menschlichem Serum resuspendiert. Die PBMC wurden in 96-Loch-Platten, die die Verbindung oder eine Vehikelkontrolle enthielten, wobei die Endkonzentration an DMSO nicht über 0,3% lag, überführt (2 × 10⁵ Zellen/Platte) und 1 Stunde inkubiert, wonach der aktivierende Anti-CD3-Antikörper OKT3 (30 ng/ml) zugegeben wurde. Nach 24 Stunden in Kultur wurden die Zellen mit [³H]-Thymidin (1 μCi/Loch) über Nacht gepulst und am nächsten Tag auf 96-Loch-Packard-GF/C-Filterplatten unter Verwendung eines Packard Cell Harvester-Geräts (Packard Instruments, Meriden, CT, USA) geerntet. Die Filterplatte wurde getrocknet, der Boden der Platte versiegelt, die Löcher jeweils mit 25 μl Microscint 20-Szintillationsflüssigkeit versetzt, der obere Teil der Platte mit TopSeal-A verschlossen und die Platte in einem Packard TopCount-Gerät gezählt. Die Daten vom TopCount-Gerät werden in Excel 5 (Microsoft, Redmond, WA, USA) übertragen und zur EC₅₀-Bestimmung mit der Software Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) formatiert.
In der Tabelle 1 ist die Hemmung der CD45-Aktivität im pNPP-Test und dem lck-Test bestimmter Verbindungen der vorliegenden Erfindung gezeigt. Dabei sind sowohl die Hemmung im T-Zellproliferationstest als auch die Ergebnisse aus dem T-Zellen-Cytotoxizitätstest gezeigt.
Tabelle 1:

Claims

Verwendung einer Verbindung, ausgewählt aus: Benzo[f]chinolin-5,6-dion; Benzo[h]chinolin-5,6-dion; Naphtho[1,2-b]furan-4,5-dion und Naphtho[1,2-b]thiophen-4,5-dion oder Tautomeren davon oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder einer Organtransplantatabstoßungsreaktion.