WO2024128841A1 - 구강 마이크로바이옴을 이용한 턱관절 질환의 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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temporomandibular joint
joint disease
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PCT/KR2023/020700
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김윤지
정진용
김은실
백운봉
김욱
장정권
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재단법인 아산사회복지재단
울산대학교 산학협력단
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/18—Dental and oral disorders

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic biomarker for temporomandibular joint disease using the oral microbiome and its use. More specifically, the present invention relates to a specific oral microorganism (relevance) for which a specific correlation to temporomandibular joint disease has been newly identified.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing temporomandibular joint disease containing an agent for detecting oral microbiome, a kit containing the same, and a method of providing information for diagnosing temporomandibular joint disease.
  • Temporomandibular joint disease has characteristics that are different from other joint diseases. For example, in temporomandibular arthritis, a representative temporomandibular joint disease, arthritis in other parts of the body mainly occurs in older people, but temporomandibular arthritis is not concentrated in a specific age group due to structural and functional differences.
  • temporomandibular arthritis degenerative arthritis of the temporomandibular joint
  • temporomandibular arthritis is different from other arthritis, such as rheumatoid arthritis, and it is known that autoimmune abnormalities are the main cause of rheumatoid arthritis.
  • temporomandibular joint disease Even if temporomandibular joint disease occurs, it is difficult for patients to recognize the disease in the early stages, so it is often overlooked, and only when the disease progresses significantly and the patient feels direct pain or significant discomfort do they visit the hospital. When the disease progresses significantly, the mouth cannot be opened, chewing becomes uncomfortable, and eating becomes difficult. In addition, temporomandibular joint pain is also associated with head, neck, and shoulder pain. Even temporomandibular joint disease symptoms often appear in the wrong places. In other words, even though temporomandibular joint disease develops, symptoms do not appear as discomfort and pain in the temporomandibular joint, but symptoms appear as headaches, tinnitus, neck and shoulder pain, etc.
  • temporomandibular joint disease is primarily diagnosed by listening directly to a person using a stethoscope and analyzing it subjectively.
  • the above-mentioned diagnostic method has low objectivity because the analysis of the disease must depend entirely on the doctor's experience, and it is not easy to visually observe or store and manage the records generated during treatment, so it may be difficult to analyze them during the treatment period.
  • a general diagnosis can be made with a general radiograph, but in order to observe the condition of the joint more accurately, a computerized tomography (CT) scan is required. Even through these test results, it is difficult to determine whether temporomandibular joint disease has developed in the early stages, unlike in cases where the disease has progressed considerably.
  • CT computerized tomography
  • the present inventors discovered for the first time that diagnosing temporomandibular joint disease was possible using the oral microbiome.
  • the present invention was completed by identifying 46 types of biomarker microorganisms specific for diagnosing temporomandibular joint disease and confirming that their use has a significant diagnostic effect with very high sensitivity and specificity.
  • the purpose of the present invention is to provide information for the diagnosis of temporomandibular joint disease, comprising measuring the presence level of one or more microbiome microorganisms from a biological oral sample isolated from a subject and comparing it with a normal control group. It provides a method.
  • Another object of the present invention is Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum , Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum , SR1 Phylum , Bacteroidia Class, Haemophilus genus, Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus , TM7x genus , Atophor Atopobium genus, [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus saccharimonas genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus, Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus, Cent
  • Another object of the present invention is Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum , Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum, SR1 Phylum ), Bacteroidia Class, Haemophilus genus, Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus , TM7x genus , Ato Atopobium genus, [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus saccharimonas Genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus ), Conchiformibius genus, Mycoplasma genus , Centiped
  • Another purpose of the present invention is to provide information on whether temporomandibular joint disease occurs by using a machine learning-based temporomandibular joint disease diagnosis model that inputs information on the presence level of microbiome microorganisms in biological oral samples isolated from subjects.
  • a method of providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease including the step of obtaining.
  • the present invention provides a method for diagnosing temporomandibular joint disease, comprising measuring the presence level of one or more microbiome microorganisms from a biological oral sample isolated from a subject and comparing it with a normal control group. Provides a way to provide information.
  • the biological oral sample may be one or more selected from the group consisting of saliva (saliva), oral plaque, and oral epithelial cells, but is not limited thereto.
  • the temporomandibular joint disease includes temporomandibular joint disease, temporomandibular joint murmur, recurrent dislocation and subluxation of the temporomandibular joint, temporomandibular joint pain, temporomandibular joint stiffness, temporomandibular joint degenerative joint disease, and masticatory muscles. It may be, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of disorders, and idiopathic condylar resorption (ICR).
  • ICR idiopathic condylar resorption
  • the measurement of the presence level of the microorganism may be by measuring the amount of the genome specific to each microorganism.
  • the amount of the genome (gene) may be measured using next generation sequencing (NGS), but is not limited thereto.
  • NGS next generation sequencing
  • the next-generation sequencing method is not limited thereto, but in the present invention, it may be performed on 16S rRNA of the microbial genome, and may be characterized by using a universal primer set including the following primers. It may be: a primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, and a primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amount of the genome (gene) is measured using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real-time Real-time RT-PCR (RT-PCR), Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR (Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), Digital PCR, Droplet Digital PCR, in situ hybridization, fluorescence in situ hybridization (FISH), RNase protection assay (RPA), Northern blotting ( It may be measured using one or more methods selected from the group consisting of northern blotting, Southern blotting, RNA sequencing, DNA chip, and RNA chip, but is not limited thereto. .
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • RT-PCR real-time Real-time RT-PCR
  • Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR
  • Digital PCR Droplet Digital PCR, in situ hybridization, fluorescence in situ hybridization (FISH
  • the method of providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease of the present invention by measuring the amount of genome (gene) is specifically performed including the following steps. You can:
  • step (c) may be performed through polymerase chain reaction (PCR). It may also further include comparing the amount of the amplification product in step (c) with the amplification product in the normal control group.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the microbiome microorganisms include Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum, and SR1 Phylum .
  • SR1 Phylum Bacteroidia Class, Haemophilus genus, Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus, TM7x Genus , Atopobium genus , [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus, Candidatus Candidatus Saccharimonas genus, Solobacterium genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus ( Butyrivibrio genus), Conchiformibius genus , Mycoplasma
  • the temporomandibular joint disease is a degenerative joint disease of the temporomandibular joint
  • the microbiome microorganisms when the temporomandibular joint disease is a degenerative joint disease of the temporomandibular joint, the microbiome microorganisms
  • Actinobacteria Phylum Bacteroidetes Phylum , Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum , SR1 Phylum , Bacteroidia Class), Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species, Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ( One or more selected from the group consisting of Staphylococcus aureus species, Streptococcus salivarius species , JX294356_s species, PAC001345_s species, and Prevotella pallens species. may, but is not limited to this.
  • the microbiome microorganisms when the temporomandibular joint disease is idiopathic condylar absorption, the microbiome microorganisms
  • Actinobacteria Phylum Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum or Bacteroidia Class are used in patients with temporomandibular joint disease .
  • the presence level was reduced compared to the normal control group,
  • SR1 Phylum is not detected in patients with temporomandibular joint disease.
  • Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species , Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ) or Streptococcus salivarius species is only detected in patients with temporomandibular joint disease,
  • JX294356_s species JX294356_s species
  • PAC001345_s species PAC001345_s species
  • Prevotella pallens species may not be detected in patients with temporomandibular joint disease, but are not limited thereto.
  • the 46 types of microorganism groups of the present invention described above may be used in combinations of two or more, but are not limited thereto, for example, Actinobacteria Phylum and Bacteroidetes Phylum) combination can be used, but is not limited to this.
  • Haemophilus genus Granulicatella genus, Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Cardiobacterium genus , Dialister genus ( Dialister genus), Centipeda genus, Fretibacterium genus , Family XIII UCG- 001 (Family XIII UCG-001 ), Lentimicrobium genus, Olsenella genus ( At least one selected from the group consisting of Olsenella genus, Acinetobacter genus, and conserveatibacter genus has an increased presence level in patients with temporomandibular joint disease compared to normal controls,
  • Rothia genus Alloprevotella genus , TM7x genus, Atopobium genus , [ Eubacterium ] nodatum group , Candidatus sacchari Monas genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus, Actinomyces genus , Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus ( In the group consisting of Mycoplasma genus , Mobiluncus genus, Weissella genus , Alloscardovia genus , and Lachnospiraceae UCG - 004 The presence of one or more selected substances is reduced in patients with temporomandibular joint disease compared to the normal control group,
  • Bacillus genus is not detected in patients with temporomandibular joint disease.
  • One or more selected from the group consisting of Scardovia genus, Diaphorobacter genus, and Cryptobacterium genus may be detected only in patients with temporomandibular joint disease, but are not limited thereto . No.
  • the method of providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease of the present invention by using the above combination may be performed specifically including the following steps:
  • the method includes:
  • It may further include, but is not limited to, comparing the Actinobacteria Phylum and Bacteroidetes Phylum microorganism content in the biological oral sample isolated from the subject with the derived cutoff value . No.
  • the cut-off is ROC curve analysis (receiver operating characteristic curve analysis), linear or non-linear regression analysis method; Linear or non-linear classification analysis method; Analysis of variance (ANOVA) method; Hierarchical analysis or clustering analysis method; Hierarchical algorithm using decision tree, kernel principal components analysis method; Markov Blanket analysis method; RFE (recursive feature elimination) analysis method; forward or backward floating search (FS) analysis method; t-test analysis method; Chi-square analysis method; Random forest; Gradient Boosting Machine family algorithm; and combinations of two or more thereof, but is not limited thereto.
  • ROC curve analysis receiver operating characteristic curve analysis
  • linear or non-linear regression analysis method Linear or non-linear classification analysis method
  • ANOVA Analysis of variance
  • Hierarchical analysis or clustering analysis method Hierarchical algorithm using decision tree, kernel principal components analysis method
  • Markov Blanket analysis method Markov Blanket analysis method
  • RFE recursive feature elimination
  • FS forward or backward floating search
  • the cut-off may be 7188 for the Actinobacteria Phylum and 6061 for the Bacteroidetes Phylum.
  • the measurement of the presence level of the microorganism in the method of providing information for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention may be by measuring the amount of protein specific to each microorganism.
  • the measurement of the presence level of the microorganism may be characterized by detection using a substance that specifically binds to a biomarker protein specific to each microorganism.
  • the amount of the protein is measured, for example, Western blot, ELISA (enzyme linked immunoassay), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Radioimmunodiffusion method, Ouchterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunofluorescence staining, immunoaffinity purification, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation analysis, complement fixation analysis, flow cytometry (FACS) It may be measured using one or more methods selected from the group consisting of protein chips, but is not limited thereto.
  • FACS flow cytometry
  • the present invention Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum, SR1 Phylum , Bacteroidia Class, Haemophilus genus , Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus , TM7x genus, Atopobium genus , [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus, Candidatus Saccharimonas genus, Solobacterium genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus, Butyri Vibrio genus, Conchiformibius genus , Mycoplasma genus, Centipeda genus , Fretibacterium gen
  • the present invention Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum , SR1 Phylum, Bacteroidia Class, Haemophilus genus , Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus ), TM7x genus, Atopobium genus , [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus Saccharimonas genus, Solobacterium genus, Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus , Buty .
  • a composition for diagnosing temporomandibular joint disease comprising a detection agent for one or more oral microorganisms selected from the group consisting of Prevotella pallens species (hereinafter also referred to as the '46 types of microorganism group of the present invention') And, it provides a kit for diagnosing temporomandibular joint disease using oral microorganisms containing the composition.
  • the microorganism detection agent may be one or more selected from the group consisting of primers, probes, antisense oligonucleotides, aptamers, and antibodies specific for the microorganism, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the primer may be a primer capable of amplifying 16S rRNA of a microorganism, but is not limited thereto.
  • the antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a chimeric antibody, but is not limited thereto.
  • composition for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention may be provided in the form of an immunoassay kit or chip, but is not limited thereto.
  • the kit for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention includes an RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) kit, a DNA chip kit, an ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) kit, a protein chip kit, and a rapid ( It may be, but is not limited to, a rapid) kit, a multiple reaction monitoring (MRM) kit, a digital polymerase chain reaction (PCR) kit, or a droplet digital polymerase chain reaction (PCR) kit.
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • DNA chip kit an ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) kit
  • a protein chip kit a rapid ( It may be, but is not limited to, a rapid) kit, a multiple reaction monitoring (MRM) kit, a digital polymerase chain reaction (PCR) kit, or a droplet digital polymerase chain reaction (PCR) kit.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • PCR digital polymerase chain reaction
  • PCR droplet digital polyme
  • the kit for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention may include instructions teaching a method of providing information for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention, but is not limited thereto. No.
  • the present invention obtains information on the occurrence of temporomandibular joint disease using a machine learning-based temporomandibular joint disease diagnosis model that inputs information on the presence level of microbiome microorganisms in biological oral samples isolated from subjects.
  • the microbiome microorganisms are Haemophilus genus , Rothia genus , Granulicatella genus, Alloprevotella genus, TM7x Genus , Atopobium genus , [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus, Candidatus Candidatus Saccharimonas genus, Solobacterium genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus ( Butyrivibrio genus), Conchiformibius genus, Mycoplasma genus, Centipeda genus, Fretibacterium genus , Family XIII UCG- 001 (Family XIII UCG ) -001 ) , Lentimicrobium genus, Ol
  • the machine learning may be one or more selected from the group consisting of Extra Trees Classifier, Ensemble, and Stacked Ensemble, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a use for diagnosing temporomandibular joint disease of a composition containing as an active ingredient one or more oral microorganism detection agents selected from the 46 types of microorganism groups of the present invention.
  • the present invention provides the use of a composition for detecting one or more oral microorganisms selected from the 46 types of microorganism groups of the present invention for manufacturing (producing) a preparation for diagnosing temporomandibular joint disease.
  • temporomandibular joint disease diagnosis By using the microbial biomarker unique to the present invention, not only can the onset of temporomandibular joint disease be diagnosed quickly and easily even in the early stages of the disease when the patient does not feel any discomfort, but also excellent diagnostic capabilities (temporomandibular joint disease diagnosis) are possible with very high sensitivity and specificity. ability to provide information). In addition, it is expected that the occurrence of temporomandibular joint disease can be diagnosed with high accuracy using machine learning models such as Extra Trees Classifier, Ensemble, or Stacked Ensemble.
  • Figure 1a shows the phylum composition within the microbial community satisfying 'relative abundance > 1%' in temporomandibular joint disorders (TMJD) and healthy controls (HC).
  • Figure 1b is table data showing the relative abundance (%) of the phylum composition of Figure 1a in specific numbers.
  • Figure 1c shows the species composition within the microbial community satisfying 'relative abundance > 1%' in the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) and normal control group (HC).
  • Figure 1d is table data showing the relative abundance (%) of the species composition in Figure 1c in specific numbers.
  • Figure 2a shows the comparison results of the ACE (Abundance-based coverage estimators) index, an alpha-diversity index, in the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) and the normal control group (HC).
  • ACE Abundance-based coverage estimators
  • Figure 2b shows the comparison results of the Chao 1 index, an alpha-diversity index, in the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) and the normal control group (HC).
  • Figure 2c shows the comparison results of the Shannon index, an alpha-diversity index, in the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) and the normal control group (HC).
  • Figure 2d shows the comparison results of the Simpson index, an alpha-diversity index, in the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) and the normal control group (HC).
  • Figure 3 shows the results of principal coordinate analysis (PCoA) based on UniFrac distance to compare beta-diversity in temporomandibular arthritis patient group (TMJD) and normal control group (HC).
  • PCoA principal coordinate analysis
  • Figure 4 is a PCoA 3D plot showing the PCoA analysis results generated with UniFrac in Figure 3 in three dimensions.
  • Figure 5 shows the results of comparing the number of abundances of each microbial community showing significant differences between the normal control group (HC) and the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) (corrected p-value ⁇ 0.05).
  • Figure 7 is a diagram showing the data structure for statistical analysis using microbial communities identified in normal controls and patients with idiopathic condylar absorption.
  • Figure 8a is a diagram showing microorganisms showing significant level differences (p-value ⁇ 0.05) between normal controls and patients with idiopathic condylar absorption using an independent two-sample t-test method.
  • Figure 8b is a diagram showing microorganisms showing significant level differences (p-value ⁇ 0.05) between normal controls and patients with idiopathic condylar absorption using the Mann-Whitney U test method.
  • Figure 9a is a diagram showing microorganisms showing significant level differences (p-value ⁇ 0.1) between normal controls and patients with idiopathic condylar absorption using an independent two-sample t-test method.
  • Figure 9b is a diagram showing microorganisms showing significant level differences (p-value ⁇ 0.1) between normal controls and patients with idiopathic condylar absorption using the Mann-Whitney U test method.
  • Figure 10 is a diagram showing selected variables visualized in a Venn diagram, as shown in Figures 8a and 8b.
  • Figure 11 is a diagram showing selected variables visualized in a Venn diagram, as shown in Figures 9a and 9b.
  • Figure 12 is a diagram showing the results of verification of temporomandibular joint disease diagnosis using the Extra Trees Classifier model.
  • Figures 13a and 13b show the results of verifying the diagnosis of temporomandibular joint disease using an ensemble model.
  • Figure 13a shows the results using variables with a p-value ⁇ 0.1
  • Figure 13b shows the results using variables with a p-value ⁇ 0.05. This is a drawing showing the case.
  • Figure 14 is a diagram showing the results of verification of diagnosis of temporomandibular joint disease when variables with p-value ⁇ 0.05 were used using the Stacked Ensemble model.
  • TMJ temporary joint
  • the temporomandibular joint acts as the central axis for all jaw movements and is supported by jaw muscles and ligaments.
  • the articular disk (disc) between the temporomandibular joints serves to cushion the friction and irritation that occurs between bones.
  • temporomandibular joint When abnormalities in the function of the temporomandibular joint occur due to various factors, it is referred to as temporomandibular joint. It is called a disability or temporomandibular joint disorder.
  • the term 'temporomandibular joint disease' has the same meaning as is known in the art, and as long as it is a disease whose main condition is temporomandibular joint disorder, the type is not particularly limited in the present invention.
  • the temporomandibular joint disease is not limited thereto, but is preferably temporomandibular joint disease, temporomandibular joint murmur, recurrent dislocation and subluxation of the temporomandibular joint, temporomandibular joint pain, temporomandibular joint stiffness, and temporomandibular joint disease. It may be one or more selected from the group consisting of degenerative joint disease, masticatory muscle disorder, and idiopathic condylar resorption (ICR).
  • ICR idiopathic condylar resorption
  • the temporomandibular joint disease of the present invention may be, for example, temporomandibular arthritis, and in particular, may be degenerative temporomandibular arthritis (i.e., degenerative joint disease of the temporomandibular joint). Additionally, the temporomandibular joint disease of the present invention may be idiopathic condylar resorption.
  • idiopathic condylar resorption also known as idiopathic mandibular condylar resorption
  • mandibular condylar resorption is a disease of unknown cause that occurs in people in their teens and twenties, and is a disease in which bone destruction of the mandibular condyle progresses due to inflammation of the temporomandibular joint.
  • the type of " Actinobacteria Phylum" microorganism is not limited as long as it is a bacterium known in the art or determined (classified) as Actinobacteria Phylum by a genome analysis method known in the art.
  • Bacteroidetes Phylum microorganism
  • the type of " Bacteroidetes Phylum" microorganism is not limited as long as it is a bacteria known in the art or determined (classified) as Bacteroidetes Phylum by genome analysis means known in the art. .
  • the type of " Firmicutes Phylum" microorganism is not limited as long as it is a bacterium known in the art or determined (classified) as Firmicutes Phylum by a genome analysis method known in the art.
  • Saccharibacteria Phylum microorganism is also known in the art as TM7 Phylum, and is determined (classified) as Saccharibacteria Phylum by one known in the art or by a genome analysis means known in the art. There are no restrictions on the type of bacteria that can be used.
  • the "SR1 Phylum" microorganism is also known in the art as Absconditabacteria Phylum, and is a bacterium known in the art or determined (classified) as SR1 Phylum by genome analysis means known in the art.
  • the types of ramen are not limited.
  • Bacteroidia Class microorganism is not limited as long as it is a bacteria known in the art or determined (classified) as a Bacteroidia Class by a genome analysis method known in the art.
  • Haemophilus genus Haemophilus genus , Rothia genus, Granulicatella genus , Alloprevotella genus , TM7x genus , Atopobium genus, [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus Saccharimonas genus, solo Solobacterium genus , Cardiobacterium genus, Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus , Conchformibius genus ( Conchiformibius genus ) , Mycoplasma genus, Centipeda genus , Fretibacterium genus , Family XIII UCG- 001 (Family XIII UCG-001 ), Lentimicrobium genus ), Olsenella genus, Scardovi
  • the " Fusobacterium nucleatum species" microorganism is any bacteria known in the art or determined (classified) as a Fusobacterium nucleatum species by genome analysis means known in the art.
  • the specific strain is not limited, and in the present invention, the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 3 is preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.9% or more, or 99.99% or more. It may be a general term for bacteria (strains) containing 16S rRNA with more than % sequence homology.
  • the " Lautropia mirabilis species" microorganism is any bacteria known in the art or determined (classified) as Lautropia mirabilis species by genome analysis means known in the art.
  • the strain is not limited, and in the present invention, the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 4 is preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.9% or more, or 99.99%. It may be a general term for bacteria (strains) containing 16S rRNA having more than one sequence homology.
  • the " Prevotella nanceiensis species" microorganism refers to a specific strain of bacteria known in the art or determined (classified) as a Prevotella nanceiensis species by genome analysis means known in the art. (strain) is not limited, and in the present invention, the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 5 is preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.9% or more, or 99.99% or more. It may be a general term for bacteria (strains) containing 16S rRNA with sequence homology.
  • a " Staphylococcus aureus species" microorganism refers to a bacterium known in the art or determined (classified) as a Staphylococcus aureus species by genome analysis means known in the art.
  • the strain is not limited, and in the present invention, the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 6 is preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.9% or more, or 99.99%. It may be a general term for bacteria (strains) containing 16S rRNA having more than one sequence homology.
  • Streptococcus salivarius species is a specific strain of bacteria known in the art or determined (classified) as a Streptococcus salivarius species by genome analysis means known in the art. (strain) is not limited, and in the present invention, the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 7 is preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.9% or more, or 99.99% or more. It may be a general term for bacteria (strains) containing 16S rRNA with sequence homology.
  • the specific strain of the "JX294356_s species" microorganism is not limited if it is a bacterium known in the art or determined (classified) as a JX294356_s species by genome analysis means known in the art.
  • 16S preferably has at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, at least 99.9%, or at least 99.99% sequence homology with the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 8. It may be a general term for bacteria (strains) containing rRNA.
  • the specific strain of the "PAC001345_s species" microorganism is not limited as long as it is a bacterium known in the art or determined (classified) as a PAC001345_s species by genome analysis means known in the art.
  • 16S preferably has at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, at least 99.9%, or at least 99.99% sequence homology with the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 9. It may be a general term for bacteria (strains) containing rRNA.
  • the " Prevotella pallens species" microorganism is a specific strain of bacteria known in the art or determined (classified) as a Prevotella pallens species by genome analysis means known in the art. (strain) is not limited, and in the present invention, the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 10 and 95% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.9% or more, or 99.99% or more It may be a general term for bacteria (strains) containing 16S rRNA with sequence homology.
  • the 16S rRNA (16S rDNA) base sequence of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10 is a 16s rRNA base sequence fragment commonly present in the microbial population at the species level.
  • antibody specific to a microorganism refers to a specific protein molecule directed against the antigenic site (or a marker protein that distinguishes it from other entities) of the desired microorganism (bacteria).
  • the antibody refers to an antibody that specifically binds to an antigenic site (or antigenic substance) of a microorganism (bacteria), and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • the antibody may be a monoclonal antibody, which is a group of antibodies in which the amino acid sequences of the heavy and light chains of the antibody are substantially identical.
  • Polyclonal antibodies can be produced by a method well known in the art, which involves injecting an antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • These polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows and dogs.
  • Monoclonal antibodies can be produced using the hybridoma method or phage antibody library technology well known in the art.
  • Antibodies in the present invention also include intact forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that retains at least an antigen-binding function, and preferably, the fragment has a binding affinity for the antigen of the parent antibody of at least 50% or 60%. Hold 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more. Specifically, it may be in the form of Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, diabody, scFv, etc.
  • Fab fragment antigen-binding is an antigen-binding fragment of an antibody, consisting of one variable domain and one constant domain of each heavy and light chain.
  • F(ab')2 is a fragment produced by hydrolyzing an antibody with pepsin, and consists of two Fabs connected by a disulfide bond at the heavy chain hinge.
  • F(ab') is a monomeric antibody fragment in the form of a heavy chain hinge added to Fab, which is separated by reducing the disulfur bond of the F(ab')2 fragment.
  • Fv (variable fragment) is an antibody fragment composed only of the variable regions of each heavy and light chain.
  • scFv single chain variable fragment is a recombinant antibody fragment in which the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) are connected by a flexible peptide linker.
  • a diabody refers to a fragment in which the VH and VL of an scFv are connected by a very short linker and cannot bind to each other, and form a dimer by combining with the VL and VH of another scFv of the same type, respectively.
  • the antibody applied in the present invention is not limited thereto, but may be, for example, selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD.
  • the term “probe” refers to a typically labeled oligonucleotide that has the sequence of a target nucleic acid and forms a duplex structure by complementary base pairing.
  • the probe will comprise a “hybridization region” corresponding to a region of the target sequence, preferably consisting of at least 30 nucleotides and, in some cases, at least 50 nucleotides. “Corresponding” means identical to or complementary to the designated nucleic acid.
  • the probe may preferably not contain a sequence complementary to the sequence(s) used to prepare the PCR. Typically, the 3' end of the probe will be "blocked" to inhibit integration of the probe into the primer extension product.
  • Blocking can serve a dual purpose by using non-complementary bases or chemical moieties such as biotin, phosphate groups, or fluorophores to act as a label for subsequent detection or capture of the nucleic acid attached to the label, depending on the moiety selected. It can be obtained by adding a base to the 3' hydroxyl of a nucleotide. Blocking can be achieved by removing the 3'-OH or using a 3'-OH-free nucleotide such as dideoxynucleotide.
  • the term "primer” refers to a base sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and copies the template strand. refers to a short sequence that serves as a starting point for
  • a sense primer and an antisense primer may be provided as a pair (set).
  • Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature.
  • the occurrence (or risk) of colon adenoma or colon cancer can be determined (predicted) by performing PCR amplification and determining whether the desired product is produced or/and whether the amount of the product increases.
  • PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
  • antisense oligonucleotide is defined as an oligonucleotide capable of controlling the expression of a target gene by hybridizing to a target nucleic acid, especially a continuous sequence on the target nucleic acid. and modified or substituted oligomers comprising non-naturally occurring monomers or portions thereof that function similarly in the present invention. Incorporation of substituted oligomers is based on factors including increased cellular uptake or increased nuclease resistance and can be selected as known in the art. It may contain an oligomer in which the entire oligonucleotide or a portion thereof is substituted.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention are oligomeric mimetics, for example, modified by methods known in the art to increase affinity for their targets and provide resistance to mismatches in the target sequence. It may include peptide nucleic acids (PNA) and locked nucleic acids (LNA).
  • the antisense oligonucleotides include natural oligonucleotides, phosphorothioate-type oligodeoxyribonucleotides, phosphorodi thioate-type oligodeoxyribonucleotides, methylphosphonate-type oligodeoxyribonucleotides, and phosphoramidate.
  • Type oligodeoxyribonucleotide H-phosphonate type oligodeoxyribonucleotide, triester type oligodeoxyribonucleotide, alpha-anomeric type oligodeoxyribonucleotide, peptide nucleic acid, other artificial nucleic acids and nucleic acid-modified compounds. It may be in the form of a modified oligonucleotide, but is not limited thereto.
  • the length of the antisense oligonucleotide is not particularly limited, but may preferably be 6 to 100 bases, more preferably 8 to 60 bases, and even more preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense oligonucleotide may be synthesized in vivo or in vitro and administered into the body according to a common method used in the art.
  • a non-limiting example of a method for synthesizing antisense RNA in vivo is a method of allowing antisense RNA to be transcribed using a vector with the origin of the multi-cloning site (MCS) in the opposite direction.
  • MCS multi-cloning site
  • a non-limiting example of a method for synthesizing antisense RNA in vitro includes a method using RNA polymerase I.
  • aptamer refers to single-stranded DNA (ssDNA) or RNA that has high specificity and affinity for a specific substance. Aptamers have very high affinity for specific substances, are stable, can be synthesized in a relatively simple way, can be modified in various ways to increase binding force, and can serve as target substances for cells, proteins, and even small organic substances. Its specificity and stability are very high compared to antibodies that have already been developed. Without being limited thereto, for example, aptamers may be small nucleic acids 15-50 bases long that fold into defined secondary and tertiary structures, such as stem-loop structures, as known in the art.
  • aptamers may be desirable for the aptamer to bind the target molecule with a kd of less than 10 6, 10-8, 10-10, or 10-12. Aptamers can bind target molecules with a very high degree of specificity. Additionally, aptamers may be composed of multiple ribonucleotide units, deoxyribonucleotide units, or a mixture of both types of nucleotide residues. The aptamer may further comprise one or more modified base, sugar or phosphate backbone units.
  • 'subject suspicious object, subject
  • 'individual' refers to a subject who has developed a disease (temporomandibular joint disease in the present invention) or is suspected of having a disease, and who subsequently requires treatment for the disease.
  • the term 'measurement' includes all meanings such as analysis and detection, and in the present invention, the measurement can be performed without limitation, including both qualitative and quantitative methods.
  • the term 'microorganism presence level' refers to methods other than directly measuring the presence level of microorganisms as known in the art (for example, analysis of saliva samples with an optical microscope after specific staining of each microorganism, cell counting, (cytometry, etc.), direct and indirect methods of comparing the presence level of microorganisms are possible by identifying (measuring) the presence level indirectly through the presence level of the microorganism-specific genome (gene) or protein.
  • 'DNA amplification product amount DNA amplification level, measurement value, etc.
  • 'protein specific marker protein for each microorganism in the present invention
  • detection level detection amount, measurement value, etc.
  • the type of measurement of genome amount is not particularly limited as long as it is known in the art to be used to measure (analyze) the genetic level (quantity), and as an example, the next generation Next generation sequencing (NGS), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real-time RT-PCR ), Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR, Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR, Digital PCR, Droplet Digital PCR (Droplet Digital PCR), in situ hybridization, fluorescence in situ hybridization (FISH), RNase protection assay (RPA), northern blotting, Southern blotting ), RNA sequencing, DNA chip, and RNA chip. It may be measured using one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited to.
  • the type of protein amount measurement is not particularly limited as long as it is known in the art to be used for protein level (amount) measurement (analysis), for example, Western blot, ELISA (enzyme linked immunoassay), capture -ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Ouchterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunofluorescence staining, immunoaffinity. It may be measured using one or more methods selected from the group consisting of purification, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation analysis, complement fixation analysis, flow cytometry (FACS), and protein chip.
  • protein level (amount) measurement for example, Western blot, ELISA (enzyme linked immunoassay), capture -ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, radioimmunoassay, radioimmunoassay
  • the present invention provides a method or diagnostic method for providing information for diagnosing temporomandibular joint disease, comprising measuring the presence level of one or more microbiome microorganisms from a biological oral sample isolated from a subject and comparing it with a normal control group. provides.
  • the 'biological oral sample' is not particularly limited as long as it is a sample that can be separated and obtained from the subject's oral cavity, but for example, it is selected from the group consisting of saliva, oral plaque, and oral epithelial cells. You can use more than one.
  • the biological oral sample may be saliva.
  • the saliva may be collected by stimulated collection method and/or non-stimulated collection method, including, but not limited to, draining method, spitting method, suction method. ) and swabbing method.
  • the draining method is a method in which saliva passively drips from the lower lip into a sterile tube while the subject lowers his head and opens his mouth. It is a non-irritating collection method and is stable.
  • the spitting method is a method in which the subject collects saliva in the mouth and spits it into a sterile tube, and may have a slight irritating effect. This is recommended for both stimulated and unstimulated saliva collection methods.
  • the suction method is a method in which saliva accumulated on the floor of the subject's mouth is continuously suctioned using a suction device and collected into a sterile tube. This may not be appropriate for non-stimulated sampling methods.
  • the swabbing method is a method of inserting a sponge, gauze, cotton pad, etc. that can absorb saliva into the mouth and then recovering it. This may not be appropriate for non-stimulated sampling methods.
  • the saliva may be obtained by a non-irritating collection method, but is not limited thereto, and may be obtained by, for example, a draining method or a spitting method.
  • the saliva may be obtained by a draining method.
  • the measurement of the presence level of the microorganism may be performed by measuring the amount of the genome or gene specific to each microorganism or by measuring the amount of protein specific to each microorganism (for example, Detection using a substance that specifically binds to a microorganism-specific biomarker protein), for each method, refer to the specific descriptions elsewhere in this specification.
  • the method of providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease of the present invention by measuring the genome or gene amount is measured by next generation sequencing (NGS).
  • NGS next generation sequencing
  • the next-generation sequencing method is not limited thereto, but in the present invention, it may be performed on 16S rRNA of the microbial genome, and may be characterized by using a universal primer set including the following primers. It may be: a primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, and a primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the 16S rRNA genetic information of microorganisms in biological oral samples isolated from subjects is analyzed to identify microbial biomarkers (one or more selected from the 46 microbial groups of the present invention), and the oral microbial community is identified. Perform microbial community analysis to obtain their respective occupancy rates or abundance ratios.
  • the 16S rRNA genetic information of oral microorganisms can be obtained by performing target sequencing on the genomic DNA of oral microorganisms using the PCR primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for 16S rRNA. You can.
  • the microbial community analysis uses 16S rRNA genetic information in biological oral samples isolated from subjects and a 16S rRNA database (a database known in the art) to classify microorganisms into species, genus, and family. , identifying and classifying at the order, class, or phylum level, and analyzing the population or abundance of the identified and classified microorganisms in the intestinal microbial community. You can.
  • the method or diagnostic method for providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease of the present invention by measuring the genome or gene amount is specifically performed including the following steps. It could be:
  • genomic DNA meaning including genomic RNA
  • step (c) may be performed through polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the type is not particularly limited, and reference is made to examples of the types specifically described in other parts of this specification.
  • the present invention provides an information providing method or diagnostic method for diagnosing temporomandibular joint disease comprising the following steps:
  • the present invention provides an information providing method or diagnostic method for diagnosing temporomandibular joint disease comprising the following steps:
  • the microbiome microorganisms include Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum, and SR1 Phylum .
  • SR1 Phylum Bacteroidia Class, Haemophilus genus, Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus, TM7x Genus , Atopobium genus , [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus, Candidatus Candidatus Saccharimonas genus, Solobacterium genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus ( Butyrivibrio genus), Conchiformibius genus, Mycoplasma
  • the temporomandibular joint disease is a degenerative joint disease of the temporomandibular joint
  • Actinobacteria Phylum Bacteroidetes Phylum , Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum , SR1 Phylum , Bacteroidia Class), Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species, Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ( One or more selected from the group consisting of Staphylococcus aureus species, Streptococcus salivarius species , JX294356_s species, PAC001345_s species, and Prevotella pallens species. You can.
  • Actinobacteria Phylum Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum or Bacteroidia Class are used in patients with temporomandibular joint disease . The presence level was reduced compared to the normal control group,
  • SR1 Phylum is not detected in patients with temporomandibular joint disease.
  • Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species , Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ) or Streptococcus salivarius species is only detected in patients with temporomandibular joint disease,
  • JX294356_s species, PAC001345_s species, or Prevotella pallens species may not be detected in patients with temporomandibular joint disease.
  • the Actinobacteria Phylum In the subject's biological oral sample , the Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum, or Bacteroidia Class were identified . ) is reduced (low) in the presence level (ex. detection amount, amount of DNA amplification product) compared to the normal control group, it is predicted that temporomandibular joint disease may occur, or it is determined (determination, instruction, meaning) can be done.
  • SR1 Phylum is not detected in the subject's biological oral sample (absence of DNA amplification product, essentially 0 (zero)), it is predicted that temporomandibular joint disease may occur or it is determined that temporomandibular joint disease has occurred ( judgment, instruction, meaning) can be made.
  • Fusobacterium nucleatum species, Lautropia mirabilis species , Prevotella nanceiensis species, and Staphylococcus aureus were detected. If Staphylococcus aureus species or Streptococcus salivarius species is detected (DNA amplification product present), it is predicted that temporomandibular joint disease may occur or it is determined (determined) that temporomandibular joint disease has occurred. , instruction, meaning) can be done.
  • JX294356_s species, PAC001345_s species, or Prevotella pallens species are not detected in the subject's biological oral sample (absence of DNA amplification product, essentially 0 (zero)). In this case, it can be predicted that temporomandibular joint disease may occur, or it can be determined (judgment, indication, meaning) that temporomandibular joint disease has occurred.
  • the microbiome microorganisms when the temporomandibular joint disease is idiopathic condylar absorption, the microbiome microorganisms
  • Haemophilus genus Granulicatella genus, Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Cardiobacterium genus , Dialister genus ( Dialister genus), Centipeda genus, Fretibacterium genus , Family XIII UCG- 001 (Family XIII UCG-001 ), Lentimicrobium genus, Olsenella genus ( At least one selected from the group consisting of Olsenella genus, Acinetobacter genus, and conserveatibacter genus has an increased presence level in patients with temporomandibular joint disease compared to normal controls,
  • Rothia genus Alloprevotella genus , TM7x genus, Atopobium genus , [ Eubacterium ] nodatum group , Candidatus sacchari Monas genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus, Actinomyces genus , Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus ( In the group consisting of Mycoplasma genus, Mobiluncus genus , Weissella genus , Alloscardovia genus , and Lachnospiraceae UCG - 004 The presence of one or more selected substances is reduced in patients with temporomandibular joint disease compared to the normal control group,
  • Bacillus genus is not detected in patients with temporomandibular joint disease.
  • One or more selected from the group consisting of Scardovia genus, Diaphorobacter genus , and Cryptobacterium genus may be detected only in patients with temporomandibular joint disease.
  • Haemophilus genus In the biological oral samples of the subjects , Haemophilus genus, Granulicatella genus , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , and Cardiobacterium genus ), Dialister genus, Centipeda genus, Fretibacterium genus , Family XIII UCG - 001 ( Family XIII UCG-001 ), Lentimicrobium genus , Olsenella genus, Acinetobacter genus, and conserveatibacter genus .
  • the presence level (ex. detection amount, DNA amplification product) compared to the normal control group . If the amount) is increased (low), it can be predicted that temporomandibular joint disease may occur, or it can be determined (judgment, indication, meaning) that temporomandibular joint disease has occurred.
  • detection amount amount of DNA amplification product
  • the Bacillus genus is not detected in the subject's biological oral sample (absence of DNA amplification product, essentially 0 (zero)), it is predicted that temporomandibular joint disease may occur or it is determined that temporomandibular joint disease has occurred ( judgment, instruction, meaning) can be made.
  • the 46 types of microbial groups of the present invention described above may be used in combination of two or more.
  • a combination of Actinobacteria Phylum and Bacteroidetes Phylum may be preferably used.
  • the method of providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease of the present invention by using the above combination may be specifically performed including the following steps:
  • the presence level (ex. detection amount, amount of DNA amplification product) of Actinobacteria Phylum and Bacteroidetes Phylum in the biological oral sample of the subject compared to the normal control group . If it is reduced (low), it can be predicted that temporomandibular joint disease may occur, or it can be determined (judgment, indication, meaning) that temporomandibular joint disease has occurred.
  • the method includes:
  • It may further include, but is not limited to, comparing the Actinobacteria Phylum and Bacteroidetes Phylum microorganism content in the biological oral sample isolated from the subject with the derived cutoff value . No.
  • the statistically significant difference in content is determined by the false discovery rate (FDR) through independent two-sample t-test and Benjamini-Hochberg (BH) correction.
  • FDR false discovery rate
  • BH Benjamini-Hochberg
  • the p-value corrected is less than 0.05.
  • the p-value is less than 0.1, less than 0.05, less than 0.1, or less than 0.05 when analyzed by independent two sample t-test or Mann-Whitney U test. .
  • the cut-off value can be derived by using any cut-off determination method known in the art without limitation, but is not limited thereto.
  • ROC curve analysis (receiver operating characteristic curve analysis) , linear or non-linear regression analysis methods; Linear or non-linear classification analysis method; Analysis of variance (ANOVA) method; Hierarchical analysis or clustering analysis method; Hierarchical algorithm using decision tree, kernel principal components analysis method; Markov Blanket analysis method; RFE (recursive feature elimination) analysis method; forward or backward floating search (FS) analysis method; t-test analysis method; Chi-square analysis method; Random forest; Gradient Boosting Machine family algorithm; And it may be determined by any one method selected from the group consisting of a combination of two or more thereof.
  • ANOVA Analysis of variance
  • Hierarchical analysis or clustering analysis method Hierarchical algorithm using decision tree, kernel principal components analysis method
  • Markov Blanket analysis method Markov Blanket analysis method
  • RFE recursive feature elimination
  • FS forward or backward floating search
  • the cut-off may be 7188 for the Actinobacteria Phylum and 6061 for the Bacteroidetes Phylum .
  • temporomandibular joint disease when the detected amount of Actinobacteria Phylum is less than 7188 and the detected amount of Bacteroidetes Phylum is less than 6061 in the biological oral sample of the subject, temporomandibular joint disease It can be predicted that this may occur, or it can be determined (judgment, indication, meaning) that temporomandibular joint disease has occurred.
  • the abundance ratio of each microorganism can be calculated through the above comparison.
  • the abundance ratio may preferably mean a relative abundance ratio.
  • the present invention measures the presence level of microbiome microorganisms in biological oral samples isolated from subjects suspected of having temporomandibular joint disease and controls,
  • Actinobacteria Phylum Bacteroidetes Phylum, Firmicutes Phylum , Saccharibacteria Phylum or Bacteroidia Class ) is reduced compared to the normal control group, or
  • Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species , Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ) or Streptococcus salivarius species is detected,
  • JX294356_s species, PAC001345_s species, or Prevotella pallens species is not detected, it is considered to indicate that the subject is at high risk of developing temporomandibular joint disease.
  • the present invention measures the presence level of microbiome microorganisms in biological oral samples isolated from subjects suspected of having temporomandibular joint disease and controls,
  • Haemophilus genus Granulicatella genus, Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Cardiobacterium genus , Dialister genus ( Dialister genus), Centipeda genus, Fretibacterium genus , Family XIII UCG- 001 (Family XIII UCG-001 ), Lentimicrobium genus, Olsenella genus ( The presence level of one or more selected from the group consisting of Olsenella genus, Acinetobacter genus, and conserveatibacter genus is increased compared to the normal control group, or
  • Rothia genus Alloprevotella genus , TM7x genus, Atopobium genus , [ Eubacterium ] nodatum group , Candidatus sacchari Monas genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus, Actinomyces genus , Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus ( In the group consisting of Mycoplasma genus , Mobiluncus genus, Weissella genus , Alloscardovia genus , and Lachnospiraceae UCG - 004 The presence level of one or more selected items is reduced compared to normal controls, or
  • Bacillus genus is not detected, or
  • the subject is at high risk of developing temporomandibular joint disease .
  • the present invention includes the steps of (a) extracting DNA (including RNA) from a biological oral sample isolated from a subject (subject);
  • Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species , Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ) or Streptococcus salivarius species is detected,
  • the subject is determined to have temporomandibular joint disease (i.e., temporomandibular joint disease is determined to have occurred). (judgment) step; and
  • a method of treating temporomandibular joint disease including the step of treating the subject's temporomandibular joint disease.
  • the present invention includes the steps of (a) extracting DNA (including RNA) from a biological oral sample isolated from a subject (subject);
  • Rothia genus Alloprevotella genus , TM7x genus, Atopobium genus , [ Eubacterium ] nodatum group , Candidatus sacchari Monas genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus, Actinomyces genus , Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus ( In the group consisting of Mycoplasma genus, Mobiluncus genus , Weissella genus , Alloscardovia genus , and Lachnospiraceae UCG - 004 The presence level of one or more selected ones is reduced compared to normal controls, or
  • Bacillus genus is not detected, or
  • the subject is determined to have temporomandibular joint disease ( That is, determining that temporomandibular joint disease has occurred);
  • a method of treating temporomandibular joint disease including the step of treating the subject's temporomandibular joint disease.
  • the treatment step may include drug treatment (administration of a treatment for temporomandibular joint disease) and physical therapy, but is not limited thereto.
  • the present invention is a method for characterizing responders to a temporomandibular joint disease therapeutic agent for the treatment of temporomandibular joint disease
  • Fusobacterium nucleatum species , Lautropia mirabilis species , Prevotella nanceiensis species, Staphylococcus aureus species ) or Streptococcus salivarius species is detected,
  • JX294356_s species, PAC001345_s species, or Prevotella pallens species is not detected, determining the person as a responder to the treatment for temporomandibular joint disease.
  • the present invention is a method for characterizing responders to a temporomandibular joint disease therapeutic agent for the treatment of temporomandibular joint disease
  • Rothia genus Alloprevotella genus , TM7x genus, Atopobium genus , [ Eubacterium ] nodatum group , Candidatus sacchari Monas genus ( Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus, Actinomyces genus , Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus ( In the group consisting of Mycoplasma genus, Mobiluncus genus , Weissella genus , Alloscardovia genus , and Lachnospiraceae UCG - 004 The presence level of one or more selected ones is reduced compared to normal controls, or
  • Bacillus genus is not detected, or
  • the patient is determined to be a responder to the treatment for temporomandibular joint disease . step.
  • the treatment for temporomandibular joint disease may include drugs used in the art for treating temporomandibular joint disease, including painkillers, anti-inflammatory agents, muscle relaxants, etc., and there is no limitation to the types thereof.
  • the present invention relates to Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum , Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum , SR1 Phylum, and Bacteroidea .
  • Bacteroidia Class Haemophilus genus, Rothia genus , Granulicatella genus, Alloprevotella genus , TM7x genus , Atopobium genus), [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus Saccharimonas genus ) , Solobacterium genus , Cardiobacterium genus, Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus , Conchformi Conchiformibius genus, Mycoplasma genus, Centipeda genus ,
  • the present invention relates to Actinobacteria Phylum , Bacteroidetes Phylum , Firmicutes Phylum, Saccharibacteria Phylum, SR1 Phylum, and Pak .
  • Bacteroidia Class Haemophilus genus , Rothia genus , Granulicatella genus , Alloprevotella genus , TM7x genus , Atopobium genus ( Atopobium genus), [Eubacterium] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus saccharimonas genus Saccharimonas genus, Solobacterium genus , Cardiobacterium genus, Actinomyces genus , Dialister genus , Butyrivibrio genus , Con Conchiformibius genus, Mycoplasma gen
  • a composition for diagnosing temporomandibular joint disease comprising a detection agent for one or more oral microorganisms selected from the group consisting of (hereinafter also referred to as '46 types of microorganism groups of the present invention'), and oral microorganisms containing the composition
  • a detection agent for one or more oral microorganisms selected from the group consisting of hereinafter also referred to as '46 types of microorganism groups of the present invention'
  • oral microorganisms containing the composition We provide a kit for diagnosing temporomandibular joint disease using .
  • the type of the microorganism detection agent is not particularly limited as long as it is a microorganism detection agent known in the art, but for example, primers and probes specific for each of 46 types of microorganisms , antisense oligonucleotides, aptamers, and antibodies (specific examples include, but are not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or chimeric antibodies), but are not limited thereto. .
  • the detection agent may target (specifically bind) a specific nucleic acid molecule (nucleotide) or protein (polypeptide) that can distinguish each microorganism
  • a specific nucleic acid molecule nucleotide
  • protein polypeptide
  • the primer may be a primer capable of amplifying 16s rRNA of a microorganism.
  • the detection agent for microorganisms can also be used in the present invention as a universal measurement agent as long as it can distinguish each microorganism.
  • a universal primer set, etc. may be used, and for this, refer to the details described elsewhere in this specification.
  • the detection agents may be labeled with a detectable label to facilitate their identification, detection, measurement, and quantification under given conditions.
  • the detectable label may include a chemical label (e.g., biotin), an enzyme label (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase, alpha-glucuronidase). ), alpha-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, ⁇ galactosidase and ⁇ glucosidase), radioactive labels (e.g. 14 C, 125 I, 32 P and 35 S), fluorescent labels (e.g.
  • the detectable group may be a substrate, cofactor, inhibitor, or affinity ligand.
  • Identification, detection, measurement, and quantification of the detection agent can be analyzed by detecting a signal from the label.
  • a signal from the label For example, when alkaline phosphatase is used as a label, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-ASB1-phosphate (naphthol-AS-B1-phosphate), and Signals are detected using a chromogenic substrate such as enhanced chemifluorescence (ECF).
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • naphthol-ASB1-phosphate naphthol-AS-B1-phosphate
  • Signals are detected using a chromogenic substrate such as enhanced chemifluorescence (ECF).
  • ECF enhanced chemifluorescence
  • the kit for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention includes, separately from the detection agent for one or more oral microorganisms selected from the 46 types of microorganism group of the present invention, one or more other types suitable for the analysis method.
  • Component compositions, labels as described above, materials used for their detection, and devices may be included.
  • the composition for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention may be provided in the form of an immunoassay kit or chip, but is not limited thereto.
  • the kit for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention is not particularly limited in its specific type as long as it is a type of genome analysis kit or protein analysis kit known in the art, for example, RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) kit, DNA chip kit, enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit, protein chip kit, rapid kit, multiple reaction monitoring (MRM) kit, digital polymerase chain reaction (digital polymerase chain reaction) kit, or droplet digital polymerase chain reaction (DM) kit.
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • DNA chip kit enzymelinked immunosorbent assay
  • ELISA enzymelinked immunosorbent assay
  • protein chip kit protein chip kit
  • rapid kit multiple reaction monitoring (MRM) kit
  • MRM multiple reaction monitoring
  • digital polymerase chain reaction digital polymerase chain reaction
  • DM droplet digital polymerase chain reaction
  • the kit may be a kit characterized by including essential elements required to perform a reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes each primer pair specific for the marker gene.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and may be about 7 bp to 50 bp in length, more preferably about 10 bp to 30 bp in length. Additionally, it may include primers specific to the nucleic acid sequence of the control (ex. internal control) gene.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, and the RNAse inhibitor DEPC.
  • -Can include DEPC-water, sterilized water, etc.
  • a DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for producing a fluorescent probe. Additionally, the substrate may include cDNA or oligonucleotides corresponding to a control (ex. internal control) gene or fragment thereof.
  • ELISA kits contain specific antibodies against marker proteins. Antibodies have high specificity and affinity for each marker protein and almost no cross-reactivity to other proteins, and are either monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Additionally, ELISA kits may include antibodies specific for control proteins. Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g. conjugated with antibodies) and their substrates or those capable of binding to antibodies. It may contain other substances, etc.
  • kit of the present invention may include a washing solution or eluent that can retain only the bound protein marker while removing the substrate and unbound protein that will undergo a color reaction with the enzyme.
  • the kit for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention may include instructions teaching a method of providing information for diagnosing temporomandibular joint disease of the present invention, but is not limited thereto. No.
  • the present invention obtains information on the occurrence of temporomandibular joint disease using a machine learning-based temporomandibular joint disease diagnosis model that inputs information on the presence level of microbiome microorganisms in biological oral samples isolated from subjects.
  • a method or diagnostic method for providing information for diagnosing a temporomandibular joint disease, including steps, is provided.
  • the present invention provides an information providing method or diagnostic method for diagnosing temporomandibular joint disease comprising the following steps:
  • information on the presence level of microbiome microorganisms can be input as a variable in the machine learning-based temporomandibular joint disease diagnosis model, for example , Haemophilus genus and Rothia genus as the variable .
  • Granulicatella genus Alloprevotella genus, TM7x genus, Atopobium genus , [ Eubacterium ] nodatum group , Lachnoanaerobaculum genus , Peptostreptococcus genus , Candidatus Saccharimonas genus , Solobacterium genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus, Dialister genus, Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Mycoplasma genus , Centipeda genus ( Centipeda genus, Fretibacterium genus, Family XIII UCG - 001 , Lentimicrobium genus, Olsenella genus , Scardobia genus ( Scardovia genus) , Mobiluncus genus, Weissella genus, Alloscardovia genus
  • the above 32 microorganisms were selected as variables satisfying a p-value ⁇ 0.1 as microorganisms showing a significant presence level in patients with temporomandibular joint disease compared to normal controls.
  • variables satisfying p-value ⁇ 0.05 include Rothia genus, TM7x genus, and Atopobium genus ( Atopobium genus), [Eubacterium ] nodatum group, Peptostreptococcus genus , Candidatus Saccharimonas genus , Cardiobacterium genus , Actinomyces genus , Dialister genus, Butyrivibrio genus , Conchiformibius genus , Centipeda genus , Olsenella genus ( Olsenella genus, Scardovia genus , Weissella genus, Alloscardovia genus , conserveatibacter genus , and Bacillus genus Microorganisms were selected.
  • the machine learning may be one or more selected from the group consisting of Extra Trees Classifier, Ensemble, and Stacked Ensemble, but is not limited thereto.
  • Extra Trees Classifier is an extremely randomized machine learning method, and the number of data samples and feature settings are random, and it uses the same principle as a random forest, so it has many features. Share. Extra Tree is faster than Random Forest and has slightly higher performance, and instead of using Bootstrap sampling, some of the overall characteristics are randomly selected and used for node division. In other words, it is a method of randomly partitioning using candidate characteristics and then selecting the best partition among them.
  • the “Ensemble” refers to a method of generalizing multiple individual models into an optimal model by combining weak classifiers to create a strong classifier.
  • a model with good overfitting is basically used, and tree-based models (Boosting, Random Forest) are often used.
  • Boosting tree-based models
  • the decision tree is generally used as the basic algorithm for ensembles. Ensembles have the effect of reducing overfitting, and performance can be improved by using ensemble learning when individual model performance is poor. Types of ensemble learning traditionally include voting, bagging, and boosting.
  • the “Stacked Ensemble” has something in common with Bagging and Boosting in that it derives prediction results by combining several individual algorithms.
  • the biggest difference is that predictions are made again based on data predicted by individual algorithms.
  • the prediction result dataset of each algorithm is created as a final meta dataset, final learning is performed using a separate ML algorithm, and final prediction is performed again based on test data.
  • the method of learning and predicting based on the predicted dataset of an individual model is called a meta model. Scatting requires individual base models and a final meta model.
  • temporomandibular joint diseases include temporomandibular joint disease, temporomandibular joint murmur, recurrent dislocation and subluxation of temporomandibular joint, temporomandibular joint pain, temporomandibular joint stiffness, and temporomandibular joint disease. It may be one or more selected from the group consisting of degenerative joint disease, masticatory muscle disorder, and idiopathic condylar resorption (ICR), and according to one embodiment of the present invention, may be idiopathic condylar resorption, but is not limited thereto.
  • ICR idiopathic condylar resorption
  • the method of providing information for diagnosis of temporomandibular joint disease using the machine learning-based temporomandibular joint disease diagnosis model may have an accuracy of 80% or more for diagnosing temporomandibular joint disease, for example, 80 to 100%, 80%. It may be, but is not limited to, 95% to 95%, 80 to 90%, 80 to 85%, 80 to 82%, 80%, 81%, or 81.82%.
  • Saliva was collected from 58 study subjects using the same draining method by placing their mouths on a sterile tube and letting the saliva drip passively.
  • the dripping method involves having the subject lower their head and open their mouth and allow saliva to passively drip from the lower lip into a sterile tube. It is a non-irritating collection method and is stable. 1 mL of collected saliva was placed in a 1.5 mL microtube and stored in a -80°C freezer until testing.
  • Saliva samples from 58 people were extracted using the FastDNA ® SPIN Kit for Soil (MP BIO, Cat. No: 6560-200) according to the manufacturer's instructions.
  • PCR amplification was performed with primers 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) and 805R (5′-GGACTACHVGGGTTWTCTAAT-3′) targeting the V4 region of the 16S rRNA gene.
  • the amplification process consisted of initial denaturation at 95°C for 3 min, followed by 25 cycles of denaturation at 95°C for 30 s, primer binding at 55°C for 30 s, extension steps at 72°C for 3 min, and 5 min at 72°C. This was performed as a final extension step.
  • Nextera XT Index kit V2 (illumine, Cat. No: 15052163) was tested as an index primer for library preparation. PCR products were confirmed using 1% agarose gel electrophoresis and visualized on the Gel Doc system. The amplification product was purified with HiAccuBead (AccuGene, Cat. No: ACN01.50). Purified products at equal concentrations were pooled together and short fragments (non-target products) were removed with HiAccuBead. Mixed amplicons were pooled and sequenced at Asan Institute for Life Sciences (Seoul, Korea) using the Illumina iSeq100 Sequencing system (Illumina, USA) according to the manufacturer's instructions. All analyzes were performed on EzBioCloud 16S-based MTP, ChunLab's bioinformatics cloud platform.
  • Adjusted p-value existing p-value ⁇ (total number of p-values / ascending order of existing p-values)
  • the microbial communities showing statistically significant differences selected between the temporomandibular arthritis patient group and the healthy control group were subjected to logistic regression analysis using the "stats" package, and statistically significant microbial communities were selected again, and "pROC” was created based on these.
  • a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve was created using the package, and the model with the highest AUC (Area Under the Curve) value was selected.
  • Variance inflation factors (VIF) were derived using the “car” package, and odds ratio (odds ratio) was derived using the “moonBook” package.
  • TMJD temporomandibular arthritis patient group
  • HC normal control group
  • Proteobacteria accounted for the highest relative abundance at 25.53% in the normal control group and 27.56% in the temporomandibular arthritis patient group, followed by Firmicutes in the normal control group. 23.00%, 25.21% in the temporomandibular arthritis patient group, Actinobacteria was 18.97% in the normal control group, 19.10% in the temporomandibular arthritis patient group, Bacteroidetes was 19.26% in the normal control group, and 17.45% in the temporomandibular arthritis patient group, and these were the main phyla accounting for more than 86% on average. It was (phylum).
  • the species constituting more than 5% on average were Haemophilus parainfluenzae group, KV831974_s group, and Neisseria subflava group in the temporomandibular arthritis group, and Haemophilus parainfluenzae group, KV831974_s group, Neisseria subflava group, and Prevotella melaninogenica in the normal control group.
  • microorganisms with high relative abundance, distinguish microorganisms that appear only in diseased or normal populations
  • the microbial communities detected only in temporomandibular arthritis with a relative abundance exceeding 1% were Fusobacterium nucleatum group, Lautropia mirabilis group, Prevotella nanceiensis group, Pseudomonas brassicacearum group, Staphylococcus aureus group, and Streptococcus salivarius group at the species level.
  • the microbial community detected only in the normal control group with a relative abundance exceeding 1% was SR1 at the phylum level, and JX294356_s, PAC001345_s group, and Prevotella pallens at the species level.
  • Table 1 shows that the microbial community that satisfies 'relative abundance > 1%' and was specifically detected only in the temporomandibular arthritis patient group (TMJD) or normal control group (HC) is divided into phylum and species, respectively. It is shown.
  • TJD Phylum Temporomandibular arthritis patient group
  • HC SR1 Species Temporomandibular arthritis patient population
  • TJD Fusobacterium nucleatum group, Lautropia mirabilis group
  • Prevotella nanceiensis group Pseudomonas brassicacearum group, Staphylococcus aureus group, Streptococcus salivarius group
  • Normal control HC
  • JX294356_s PAC001345_s group
  • Beta-diversity ( ⁇ ), an indicator for determining diversity between samples and groups, was confirmed through UniFrac, a distance measurement method used to compare biological communities.
  • the UniFrac analysis results are shown in Figures 3 and 4, and the principal coordinate analysis ( Principal Coordinate Analysis (PCoA) confirmed that there was no significant difference visually.
  • PCoA Principal Coordinate Analysis
  • Example 2 Specific microorganism selection
  • microorganisms showing statistically significant differences between the temporomandibular arthritis patient group and the normal control group were identified using the independent two sample t-test method. Among various microorganisms, those that could specifically function as markers were selected.
  • Table 2 below comparatively presents measurement and statistical data for the microbial community specifically selected in the present invention and showing significant differences between the temporomandibular arthritis patient group and the normal control group at the phylum level.
  • Actinobacteria at the phylum level, Actinobacteria , Bacterioidetes , Firmicutes , and Saccharibacteria _TM7 show significant differences with p-values of less than 0.05, as well as the corrected values obtained through BH correction that corrects FDR. The p-value was also less than 0.05, indicating a significant difference (Table 2). It can be seen that the microbial communities of the phylum listed in Table 2 below show significant differences in both the p-value and the adjusted p-value corrected for FDR.
  • Table 3 below comparatively presents measurement and statistical data for microbial communities specifically selected in the present invention and showing significant differences between the temporomandibular arthritis patient group and the normal control group at the class level.
  • Bacteroidia shows a significant difference with a p-value of less than 0.05, and in addition, the corrected p-value obtained through BH correction that corrects FDR is also less than 0.05.
  • a significant difference was shown (Table 3). It can be seen that the microbial community of the Bacteroidia class shown in Table 3 below shows significant differences in both the p-value and the adjusted p-value corrected for FDR.
  • Example 2 the p-value was tested using an independent two-sample t-test using R, a statistical analysis program, and the p-value corrected through Benjamini-Hochberg correction was tested to determine the statistical difference between the normal control group and the temporomandibular arthritis patient group.
  • Microorganism groups with significant differences were selected, the average and standard deviation for each group of the selected microbial groups were analyzed, and simple logistic regression analysis (Table 4) and multiple logistic regression analysis (Table 5) were performed on the selected microbial groups. ) was carried out.
  • Logistic regression analysis was used to select the odds ratio for each microbial group and the microbial groups with statistically significant differences between each group, and calculate the AUC (Area Under the Curve) to select a regression model with high diagnostic predictive power.
  • Simple logistic regression analysis showed significant results with p-values of Actinobacteria , Bacteroidetes , Firmicutes , and Saccharibacteria_TM7 being less than 0.05 (Table 4).
  • Actinobacteria the number of people suffering from temporomandibular arthritis increases by 0.993 times, and the 95% confidence interval is 0.9989 to 0.9998.
  • Bacteroidetes the number of people suffering from temporomandibular arthritis increases by 0.9996 times, and the 95% confidence interval is 0.9993 to 0.9999.
  • Saccharibacteria _TM7 Every time Saccharibacteria _TM7 increases by 1, the number of people suffering from temporomandibular arthritis increases by 0.9995, and the 95% confidence interval is 0.9990 to 1.0000. For each increase in Bacteroidia , the number of people suffering from temporomandibular arthritis increases by 1.0001 times, and the 95% confidence interval is 0.9998 to 1.0003. All variance inflation factors are less than 10, so there is little chance of multicollinearity. Table 5 below shows the results of multiple logistic regression analysis for microbial communities specifically selected as factors (markers) affecting temporomandibular arthritis in the present invention.
  • Example 4 Construction of a machine learning model for diagnosing temporomandibular joint disease
  • Variables satisfying a p-value ⁇ 0.05 were selected through the independent two-sample t-test method and the Mann-Whitney U test method, and as a result, as shown in Figure 8a (independent two-sample t-test method), Rothia , TM7x , [Eubacterium] nodatum group, Peptostreptococcus , Candidatus Saccharimonas , Cardiobacterium , Actinomyces , Dialister , Butyrivibrio , Centipeda , Alloscardovia , and conserveatibacter genus bacteria levels showed significant differences, and 8b (Mann-Whitney U test method) As shown, there was a significant difference in the levels of bacteria of the genus Rothia , TM7x , Atopobium , [Eubacterium] nodatum group, Peptostreptococcus , Actinomyces , Dialister , Conchiformibius
  • a machine learning model for temporomandibular joint disease diagnosis was developed using the variables selected in 4-1 above.
  • the healthy control group and disease group within the train data and test data are also maintained in proportion
  • the train data is data for learning the model
  • the test data is data that ultimately verifies the performance of the model.
  • SMOTE Synthetic Minority Over-sampling Technique
  • temporomandibular joint disease can be diagnosed with high sensitivity and specificity, and using a machine learning model, the onset of temporomandibular joint disease can be diagnosed with high accuracy, allowing industrial applicability. There is.

Landscapes

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Abstract

본 발명은 구강 마이크로바이옴을 이용한 턱관절 질환의 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에서 턱관절 질환에 대한 특이적인 상관성(관련성)을 신규하게 규명한 특정 구강 미생물(oral microbiome)들을 검출하는 제제를 포함하는 턱관절 질환 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명 특유의 미생물 바이오마커를 이용하면, 환자가 불편감을 느끼지 못하는 질환 초기에도 신속하고 간편하게 턱관절 질환의 발병을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 매우 높은 민감도 및 특이도로 우수한 진단 능력(턱관절 질환 진단 정보 제공 능력)을 가진다. 또한, 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier), 앙상블(Ensemble), 또는 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)과 같은 머신 러닝 모델을 이용하여 높은 정확도로 턱관절 질환의 발병 여부를 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

구강 마이크로바이옴을 이용한 턱관절 질환의 진단용 바이오 마커 및 이의 용도
본 발명은 구강 마이크로바이옴을 이용한 턱관절 질환의 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에서 턱관절 질환에 대한 특이적인 상관성(관련성)을 신규하게 규명한 특정 구강 미생물(oral microbiome)들을 검출하는 제제를 포함하는 턱관절 질환 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2022년 12월 14일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0174492호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
턱관절은 우리 몸에서 유일하게 좌우 양쪽의 관절이 동시에 운동하는 관절이며, 가동성이 큰 복잡한 관절이다. 음식을 씹거나 말을 하고 하품을 하는 등 여러 가지 동작뿐만 아니라 삶의 질과 연관된 중요한 역할을 하며, 안면비대칭과도 밀접한 관련이 있다. 턱관절 질환은 타 관절 질환과는 다른 특성을 갖는다. 일례로 대표적 턱관절 질환인 턱관절염에 있어서, 신체 다른 부위의 관절염은 주로 노년층에 호발하지만, 턱관절염은 구조적 및 기능적 차이로 인해 특정 연령에 집중되지 않는다. 여러 연구에서 밝혀진 바에 따르면 턱관절염(턱관절 퇴행성관절염)은 20대 젊은 연령에서도 흔히 나타날 수 있다. 또한 턱관절염은, 일례로 류마티스 관절염과 같은 다른 관절염과도 다르며, 상기 류마티스 관절염은 자가면역이상이 주요 원인인 것으로 알려져 있다.
턱관절 질환은, 이것이 발생되어도 초기에 환자가 병을 알아차리기 어려워 소홀히 넘기고, 병증이 상당히 진행되어 환자가 직접적인 통증이나 상당한 불편을 느끼면 비로소 병원에 방문하는 경우가 많다. 병증이 상당히 진행되면, 입이 벌어지지 않고, 씹는 것이 불편해 음식물 섭취가 어려워진다. 뿐만 아니라 턱관절의 통증은 머리, 목 및 어깨 통증과도 연관된다. 심지어 턱관절 질환은 종종 엉뚱한 곳에서 증상이 나타난다. 즉, 턱관절 질환이 발병했음에도 턱관절의 불편감 및 통증으로 증상이 나타나지 않고, 두통, 이명, 목 및 어깨 통증 등으로 증상이 나타나는 것이다. 이러한 경우 환자가 원인 모를 두통, 이명, 목 및 어깨의 통증 등에 이비인후과, 신경과, 내과 등을 방문해도 검사 결과에는 이상이 없어 원인 질환을 찾지 못하게 된다.
턱관절 질환을 진단하기 위해 기존에 사용되어오고 있는 방법들이 몇가지 있는데, 먼저 1차적으로 턱관절 질환은 주로 청진기를 이용해 사람이 직접 듣고 이것을 주관적으로 분석함으로써 진단된다. 그러나, 상기한 진단 방법은 질환에 대한 분석을 전적으로 의사의 경험에 의존해야 하므로 객관성이 떨어지고, 진료시 발생된 기록을 시각적으로 관찰하거나 저장 및 관리가 용이하지 않아 진료기간 동안 이를 분석하는데 어려움이 있을 뿐만 아니라 객관적인 신뢰도 역시 떨어지는 문제점이 있다. 일반 방사선　사진으로도　대략　진단할　수　있지만,　관절　상태를　더　정확히　관찰하기　위해선　전산화　단층촬영(CT촬영)을　해야　한다.　이러한　검사　결과를 통해서도, 상당히 진행된 병증과는 달리, 초기에 턱관절 질환 발병여부를 판단하기에는 어려움이 있는 실정이다.
따라서, 턱관절 질환의 발병 초기에도 간편하고 신속하게 진단이 가능한 새로운 방법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은, 환자가 불편감을 느끼지 못하는 질환 초기에도 신속하고 간편하게 턱관절 질환의 발병을 진단할 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, 구강 마이크로바이옴을 이용해 턱관절 질환 진단이 가능함을 최초로 규명하였을 뿐만 아니라, 턱관절 질환 진단에 특이적인 46개 종류의 바이오마커 미생물을 규명하고 이들을 이용하면 매우 높은 민감도 및 특이도로 진단 효과가 현저함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은, 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물을 포함하는 턱관절 질환 진단용 마커(바이오마커) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제를 포함하는, 턱관절 질환 진단용 조성물 및, 상기 조성물을 포함하는 턱관절 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준 정보를 입력으로 하는 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델을 이용하여 턱관절 질환의 발생 여부에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 생물학적 구강 시료는 타액(saliva), 구강 내 치태 및 구강 내 상피세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 턱관절 질환은, 턱관절내장증, 턱관절잡음, 턱관절의 재발성 탈구 및 아탈구, 턱관절의 통증, 턱관절의 경직, 턱관절의 퇴행성 관절병, 저작근 장애, 및 특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption, ICR)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 미생물의 존재 수준의 측정은, 각 미생물 특이적인 유전체 양을 측정하는 것일 수 있다.
이러한 본 발명의 구체적 일 구현예에서, 상기 유전체(유전자) 양의 측정은, 차세대 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS)으로 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 차세대 염기서열 분석법은, 이에 제한되지 않으나 본 발명에서 미생물 유전체의 16S rRNA를 대상으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 하기의 프라이머를 포함하는 유니버셜 프라이머 세트(Universal primer set)를 이용하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다: 서열번호 1의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 2의 서열을 포함하는 프라이머.
또한 본 발명의 다른 구체적 일 구현예에서, 상기 유전체(유전자) 양의 측정은, 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 디지털 PCR(Digital PCR), 액적 디지털 PCR(Droplet Digital PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), 형광 인 시투 하이브리드화(FISH), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그리고 본 발명의 또 다른 구체적 일 구현예에서, 유전체(유전자) 양을 측정하는 방식으로 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 구체적으로 하기의 단계를 포함하여 수행되는 것일 수 있다:
(a) 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계.
이에 제한되지 않으나, 상기 (c) 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 수행되는 것일 수 있다. 또한 상기 (c) 단계의 증폭산물의 양을 정상 대조군에서의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 마이크로바이옴 미생물은, 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군(이하에서, '본 발명의 46개 종류 미생물군'으로도 칭함)에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 턱관절 질환이 턱관절의 퇴행성 관절병인 경우, 상기 마이크로바이옴 미생물은
액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 턱관절 질환이 특발성 과두 흡수증인 경우, 상기 마이크로바이옴 미생물은
헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적 일 구현예에서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 감소된 것이고,
SR1 문(SR1 Phylum)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않고,
퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)은 턱관절 질환 환자에서만 검출되는 것이고,
JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 본 발명의 46개 종류 미생물군은 2개 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 일례로 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 조합을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적 일 구현예에서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 증가된 것이고,
로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 감소된 것이고,
바실러스 속(Bacillus genus)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않고,
스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서만 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 본 발명의 구체적 일 구현예에서, 상기 조합을 이용하는 방식으로 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 구체적으로 하기의 단계를 포함하여 수행되는 것일 수 있다:
(a) 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계;
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계; 및
(d) 상기 DNA 증폭산물의 서열분석을 통하여, 정상 대조군과 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물의 함량을 비교하는 단계.
상기 구체적 일 구현예에서, 상기 방법은,
(e) 턱관절 질환 환자와 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서 통계적으로 유의한 함량 차이를 보이는 미생물군을 선별하고, 상기 선별된 미생물군 중 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물 함량의 컷오프(cut-off) 값을 도출하는 단계; 및
상기 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물 함량을 상기 도출된 컷오프 값과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 구체적 일 구현예에서, 상기 컷오프(cut-off)는, ROC 곡선 분석(receiver operating characteristic curve analysis), 선형 또는 비선형 회귀분석방법; 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법; 분산분석(ANOVA) 방법; 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 커넬 원리요소(Kernel principal components) 분석방법; 마코브 블랜킷(Markov Blanket) 분석방법; RFE(recursive feature elimination) 분석방법; 전방 또는 후방 FS(floating search) 분석방법; t검정(t-test) 분석방법; 카이제곱검정(chi-square) 분석방법; 랜덤 포레스트(Random forest); 그래디언트 부스팅 머신(Gradient Boosting Machine) 계열 알고리즘; 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 결정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 구체적 일 구현예에서, 상기 컷오프(cut-off)는 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum)의 경우 7188이고, 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)의 경우 6061인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 중 상기 미생물의 존재 수준의 측정은, 각 미생물 특이적인 단백질 양을 측정하는 것일 수 있다. 이러한 본 발명의 구체적 일 구현예에서 상기 미생물의 존재 수준의 측정은 각 미생물 특이적인 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이러한 본 발명의 다른 구체적 일 구현예에서, 상기 단백질 양의 측정은, 일례로 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 방사선면역분석법, 방사능면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역형광염색, 면역친화성정제, 방사능면역침전, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물을 포함하는 턱관절 질환 진단용 마커(바이오마커) 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군(이하에서, '본 발명의 46개 종류 미생물군'으로도 칭함)에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제를 포함하는, 턱관절 질환 진단용 조성물 및, 상기 조성물을 포함하는 구강 미생물을 이용하는 턱관절 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 미생물의 검출 제제(미생물 측정 제제)는, 상기 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 본 발명의 구체적 일 구현예에서, 상기 프라이머는 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 본 발명의 다른 구체적 일 구현예에서, 상기 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 조성물은 면역분석용 키트(kit) 또는 칩(chip) 형태로 제공되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 키트는, RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트, 디지털 PCR(digital polymerase chain reaction) 키트 또는 액적 디지털 PCR(droplet digital polymerase chain reaction) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 키트는, 전술한 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 교시하는 설명서를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준 정보를 입력으로 하는 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델을 이용하여 턱관절 질환의 발생 여부에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마이크로바이옴 미생물은 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 머신 러닝은 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier), 앙상블(Ensemble), 및 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은, 상기 본 발명의 46개 종류 미생물군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 턱관절 질환 진단 용도를 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 본 발명의 46개 종류 미생물군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제의 조성물의 턱관절 질환 진단용 제제를 제조(생산)하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명 특유의 미생물 바이오마커를 이용하면, 환자가 불편감을 느끼지 못하는 질환 초기에도 신속하고 간편하게 턱관절 질환의 발병을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 매우 높은 민감도 및 특이도로 우수한 진단 능력(턱관절 질환 진단 정보 제공 능력)을 가진다. 또한, 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier), 앙상블(Ensemble), 또는 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)과 같은 머신 러닝 모델을 이용하여 높은 정확도로 턱관절 질환의 발병 여부를 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 턱관절염 환자군(TMJD, Temporomandibular joint disorders)과 정상 대조군(HC, healthy control)에서 '상대적 풍부도> 1%'를 만족하는 미생물 군집 내 문(phylum) 구성을 나타낸다.
도 1b는 도 1a의 문(phylum) 구성의 상대적 풍부도(Relative abundance (%))를 구체적 수치로 나타낸 표 자료이다.
도 1c는 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 '상대적 풍부도> 1%'를 만족하는 미생물 군집 내 종(species) 구성을 나타낸다.
도 1d는 도 1c의 종(species) 구성의 상대적 풍부도(Relative abundance (%))를 구체적 수치로 나타낸 표 자료이다.
도 2a는 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 알파-다양성(alpha-diversity) 지표인 ACE(Abundance-based coverage estimators) index의 비교 결과를 나타낸다.
도 2b는 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 알파-다양성(alpha-diversity) 지표인 Chao 1 index의 비교 결과를 나타낸다.
도 2c는 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 알파-다양성(alpha-diversity) 지표인 Shannon index의 비교 결과를 나타낸다.
도 2d는 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 알파-다양성(alpha-diversity) 지표인 Simpson index의 비교 결과를 나타낸다.
도 3은 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 베타-다양성(beta-diversity)을 비교하기 위하여, UniFrac distance 기반의 주좌표 분석(PCoA)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3의 UniFrac으로 생성된 PCoA 분석결과를 삼차원으로 나타낸, PCoA 3D plot이다.
도 5는 정상 대조군(HC)과 턱관절염 환자군(TMJD) 사이에서 유의한 차이를 보이는 미생물 군집별 풍부도의 수를 비교한 결과를 나타낸다(보정된 p-값 < 0.05).
도 6은 Actinobacteria 및 Bacteroidetes의 OTUs 기반 ROC 곡선을 나타낸다(AUC= 0.913, cut-off value = 7188(Actinobacteria Phylum), 6061(Bacteroidetes Phylum), 민감도 = 93.5%, 특이도 = 85.2%).
도 7은 정상 대조군과 특발성 과두 흡수증 환자에서 식별된 미생물 군집을 이용한 통계적 분석을 위한 데이터 구조를 나타낸 도면이다.
도 8a는 독립 이표본 t-검정방법을 이용하여 정상 대조군과 특발성 과두 흡수증 환자에서 유의미한 수준 차이(p-값<0.05)를 나타내는 미생물을 나타낸 도면이다.
도 8b는 맨-휘트니 U 검정방법을 이용하여 정상 대조군과 특발성 과두 흡수증 환자에서 유의미한 수준 차이(p-값<0.05)를 나타내는 미생물을 나타낸 도면이다.
도 9a는 독립 이표본 t-검정방법을 이용하여 정상 대조군과 특발성 과두 흡수증 환자에서 유의미한 수준 차이(p-값<0.1)를 나타내는 미생물을 나타낸 도면이다.
도 9b는 맨-휘트니 U 검정방법을 이용하여 정상 대조군과 특발성 과두 흡수증 환자에서 유의미한 수준 차이(p-값<0.1)를 나타내는 미생물을 나타낸 도면이다.
도 10은 도 8a 및 8b와 같이 선별된 변수들을 벤다이어그램으로 시각화하여 나타낸 도면이다.
도 11은 도 9a 및 9b와 같이 선별된 변수들을 벤다이어그램으로 시각화하여 나타낸 도면이다.
도 12는 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier) 모델을 이용하여 턱관절 질환 진단에 대해 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13a 및 13b는 앙상블(Ensemble) 모델을 이용하여 턱관절 질환 진단에 대해 검증한 결과로서, 도 13a는 p-값<0.1인 변수를 사용한 경우, 도 13b는 p-값<0.05인 변수를 사용한 경우를 나타낸 도면이다.
도 14는 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble) 모델을 이용하여 p-값<0.05인 변수를 사용한 경우 턱관절 질환 진단에 대해 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 용어 "턱관절(Temporomandibular Joint, TMJ)"이란 아래턱뼈(하악골)와 옆머리뼈(측두골) 사이에 위치하여 두 뼈를 연결하는 관절로, 양쪽 광대뼈 밑, 귀 바로 앞쪽에 위치한다. 턱관절은 모든 턱 운동의 중심축으로 작용하고 턱근육과 인대에 의해 지지된다. 턱관절 사이에 있는 관절원판(디스크)은 뼈와 뼈 사이에 발생할 마찰과 자극을 완충해주는 역할을 한다. 이러한 근육과 인대, 관절원판, 턱뼈가 입 벌리기(개구), 씹는 행위(저작), 말하기, 삼키기 등과 같은 다양한 움직임을 담당하는데, 여러 요인에 의해 이러한 턱관절 기능에 이상이 생길 경우, 이를 턱관절 장애 또는 악관절 장애라고 칭한다. 본 발명에서 용어 '턱관절 질환'은 당업계에 공지된 바와 같은 의미로, 턱관절 장애를 주요 병태로 하는 질환이라면 본 발명에서 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 턱관절 질환은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 턱관절내장증, 턱관절잡음, 턱관절의 재발성 탈구 및 아탈구, 턱관절의 통증, 턱관절의 경직, 턱관절의 퇴행성 관절병, 저작근 장애, 및 특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption, ICR)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 본 발명의 상기 턱관절 질환은 예를 들어, 턱관절염 일 수 있으며, 특히 퇴행성 턱관절염(즉, 턱관절의　퇴행성 관절병) 일 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 턱관절 질환은 특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption) 일 수 있다.
본 발명에서 “특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption)”이란 특발성 하악 과두 흡수증이라고도 하며 10-20대에 발생하는 원인 불명의 질환으로 턱관절 염증으로 인한 하악 과두의 골 파괴가 진행되는 질환이다.
본 발명에서 "액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Actinobacteria Phylum으로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 "박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Bacteroidetes Phylum으로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 "피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Firmicutes Phylum으로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 "사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum)" 미생물은, 당업계에 TM7 Phylum으로도 알려져 있으며, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Saccharibacteria Phylum으로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 "SR1 문(SR1 Phylum)" 미생물은, 당업계에 Absconditabacteria Phylum으로도 알려져 있으며, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 SR1 Phylum으로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 "박테로이디아 강(Bacteroidia Class)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Bacteroidia Class로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus) 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 각각의 속(genus)으로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명에서 "퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Fusobacterium nucleatum species로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 3의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 발명에서 "라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Lautropia mirabilis species 로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 4의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Prevotella nanceiensis species 로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 5의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Staphylococcus aureus species 로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 6의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Streptococcus salivarius species로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 7의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "JX294356_s 종(JX294356_s species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 JX294356_s species로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 8의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "PAC001345_s 종(PAC001345_s species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 PAC001345_s species로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 9의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
본 발명에서 "프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)" 미생물은, 당업계에 공지된 것 또는 당업계에 공지된 유전체 분석 수단에 의해 Prevotella pallens species로 판정(분류)되는 박테리아라면 그 구체적 균주(strain)가 제한되지 않으며, 본 발명에서는 바람직하게 서열번호 10의 16S rRNA 염기서열과 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 99.99% 이상의 서열 상동성을 갖는 16S rRNA을 포함하는 박테리아(균주)를 총칭하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 3 내지 서열번호 10의 16S rRNA(16S rDNA) 염기서열은 상기 종(species) 수준의 미생물 집단에 공통으로 존재하는 16s rRNA 염기서열 단편이다.
본 발명에서 "미생물에 특이적인 항체" 또는 "미생물에 대한 항체"는 목적하는 미생물(박테리아)의 항원성 부위(또는 다른 개체와 구별되는 마커 단백질 등)에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 미생물(박테리아)의 항원성 부위(또는 항원성 물질)에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다.
상기한 바와 같은 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method), 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
또한 본 발명에서 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 바람직하게 상기 단편은 모(母)항체의 항원에 대한 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL 및 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명에 적용되는 항체는 이에 제한되지 않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 표적 핵산의 서열을 가지고, 상보적 염기쌍에 의해 이중 구조를 형성하는, 통상적으로 표지화된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 표적 서열의 지역에 해당하는, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드 및 일부 경우에, 50개 이상 뉴클레오티드로 이루어진 "혼성화 지역"을 포함할 것이다. "상응하는"은 지정된 핵산과 동일하거나 상보적인 것을 의미한다. 프로브는, 바람직하게는, PCR을 준비하는데 사용된 서열(들)에 상보적인 서열을 함유하지 않을 수 있다. 일반적으로, 프로브의 3' 말단은 프라이머 신장 생성물 속으로 프로브의 일체화를 억제하도록 "차단될" 것이다. "차단"은 비-상보적 염기를 사용하거나 비오틴, 인산염기 또는 형광체와 같은 화학적 모이어티를 선택된 모이어티에 따라, 표지에 부착된 핵산의 후속 탐지 또는 포획을 위한 표지로서 작용함으로써 이중 목적을 만족시킬 수 있는 염기 뉴클레오티드의 3' 하이드록실에 첨가함으로써, 얻을 수 있다. 차단은 3'-OH를 제거하거나 다이데옥시뉴클레오티드와 같은 3'-OH가 없는 뉴클레오티드를 사용함으로써 성취될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(시발체)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 한쌍(세트)으로 제공될 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부 또는/및 생성물 양의 증가 현상 여부를 통해 본 발명에서 대장선종 또는 대장암의 발생 여부(또는 위험도)를 판정(예측)할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 연속 서열에 하이브리드화됨으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 본 발명에서 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택될 수 있다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가 시 키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디 티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 6 내지 100 염기일 수있고, 보다 바람직하게는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내 (in vivo)에서 합성되거나, 시험관 내 (in vitro)에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위 (Multi-cloning site; MCS)의 기원 (origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 용어 "압타머 (aptamer)"는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다. 이에 제한되지 않으나, 일례로 압타머는 당업계에 공지된 바와 같이 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 압타머는 10 6, 10-8, 10-10, 또는 10 -12 보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 압타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 압타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 압타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 '피험자(의심 개체, 피검체)' 또는 '개체' 란 질병(본 발명에서, 턱관절 질환)이 발생되었거나 질병 발생이 의심되는 대상으로서, 후속하여 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 포함하는 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 '측정'은, 분석, 검출 등의 의미를 모두 포함하며, 본 발명에서 상기 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어 '미생물 존재 수준'은, 당업계에 알려진 바와 같이 미생물 존재 수준을 직접적으로 측정하는 방식 이외(일례로, 각 미생물 특이적 염색 후 광학현미경으로 타액 시료 분석, 세포계수(cell counting, cytometry 등)에도, 해당 미생물 특이적인 유전체(유전자) 또는 단백질의 존재 수준을 통해 간접적 방식에 의해서 존재 수준을 파악(측정)하여 비교(대조)가 가능하다. 미생물 존재 수준을 비교하는 직접적 방식 및 간접적 방식들에 대해서는 당업계에 주지되어 있다. 따라서 본 명세서에서 'DNA 증폭산물 량(DNA 증폭 수준, 측정값 등)'또는 '단백질(본 발명에서 각 미생물 특이적인 마커 단백질) 검출 수준(검출량, 측정값 등)'의 용어가, 미생물 존재 수준을 나타내는 것임이 당업자에게 자명하게 이해될 것이며, 본 명세서에서는 상기 기재한 표현에 준하여 당업계에 미생물 존재 수준을 나타낼 수 있는 측정치 또는 표현으로, 본원 발명의 기술사상이 기술될 수 있다.
본 발명에서 유전체 양(유전체 존재 수준, 유전자 존재량)의 측정은, 당업계에 유전제 수준(양) 측정(분석)에 사용될 수 있는 것으로 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 일례로 차세대 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS), 역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 디지털 PCR(Digital PCR), 액적 디지털 PCR(Droplet Digital PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), 형광 인 시투 하이브리드화(FISH), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 단백질 양의 측정은, 당업계에 단백질 수준(양) 측정(분석)에 사용될 수 있는 것으로 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 일례로 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 방사선면역분석법, 방사능면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역형광염색, 면역친화성정제, 방사능면역침전, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 '생물학적 구강 시료'는 피험자의 구강 내에서 분리 수득할 수 있는 시료라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 타액(saliva), 구강 내 치태 및 구강 내 상피세포로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 생물학적 구강 시료는 타액(saliva)일 수 있다. 당업계에 공지된 것과 같이, 상기 타액은 자극 채취법 또는/및 비자극 채취법으로 채취될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 일례로 흘림 방식(draining method), 뱉는 방식(spitting method), 흡인 방식(suction method) 및 도말 방식(swabbing method)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 채취될 수 있다.
상기, 흘림 방식(draining method)은 피험자가 머리를 숙이고 입을 벌린 상태로 아랫입술에서 멸균튜브로 타액이 수동적으로 떨어지게 하는 방식이며, 비자극 채취법이고 안정적이다.
상기 뱉는 방식(spitting method)은 피험자가 타액을 입 안에서 모은 후 멸균튜브에 침을 뱉는 방식이며, 약간의 자극 효과가 있을 수 있다. 이는 타액의 자극 채취법과 비자극 채취법 모두에서 권장된다.
상기 흡인 방식(suction method)은 피험자의 구강 바닥에 쌓인 타액을 흡인 장치를 이용하여 지속적으로 흡인하여 멸균튜브에 채취하는 방식이다. 이는 비자극 채취법에는 적절하지 않을 수 있다.
상기 도말 방식(swabbing method)은 타액을 흡수할 수 있는 스펀지, 거즈, 면 패드 등을 입에 삽입 후 회수하는 방식이다. 이는 비자극 채취법에는 적절하지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 상기 타액은 비자극 채취법으로 수득되는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 일례로 흘림 방식(draining method) 또는 뱉는 방식(spitting method)으로 수득될 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 일 실시양태에서, 상기 타액은 흘림방식(draining method)으로 수득되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 미생물의 존재 수준의 측정은, 각 미생물 특이적인 유전체 또는 유전자 양을 측정하는 방식 또는 각 미생물 특이적인 단백질 양을 측정하는 방식으로 수행될 수 있으며(일례로, 각 미생물 특이적인 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 검출), 각각의 방식에 대해서는 본 명세서의 다른 부분에 구체적으로 기술한 바를 참조로 한다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 유전체 또는 유전자 양을 측정하는 방식으로 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 차세대 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS)으로 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 차세대 염기서열 분석법은, 이에 제한되지 않으나 본 발명에서 미생물 유전체의 16S rRNA를 대상으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 하기의 프라이머를 포함하는 유니버셜 프라이머 세트(Universal primer set)를 이용하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다: 서열번호 1의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 2의 서열을 포함하는 프라이머.
이의 구체적인 일 실시양태에서, 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료 내 미생물의 16S rRNA 유전 정보를 분석하여, 미생물 바이오마커(본 발명의 46개 미생물군에서 선택된 하나 이상의 것)를 동정하고, 구강 내 미생물 군집들의 각 점유율 또는 존재비율을 얻는, 미생물 군집 분석을 수행한다. 이때 구강 내 미생물의 16S rRNA 유전 정보는, 16S rRNA에 대한 서열번호 1 및 서열번호 2의 PCR 프라이머쌍을 이용하여, 구강 내 미생물의 게놈 DNA에 대한 표적 서열분석(target sequencing)을 수행하여 수득될 수 있다. 상기 미생물 군집 분석은, 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료 내 16S rRNA 유전 정보와 16S rRNA 데이터베이스(당업계에 공지된 데이터베이스)를 이용하여, 미생물을 종(Species), 속(Genus), 과(Family), 목(Order), 강(Class), 또는 문(Phylum) 수준으로 동정 및 분류하는 단계와, 상기 동정 및 분류된 미생물의 장내 미생물 군집 내 점유율(population) 또는 존재비율을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일 실시양태에서, 유전체 또는 유전자 양을 측정하는 방식으로, 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 또는 진단 방법은, 구체적으로 하기의 단계를 포함하여 수행되는 것일 수 있다:
(a) 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 게놈 DNA(게놈 RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물(본 발명의 46개 종류 미생물군에서 선택된 하나 이상의 것)에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계.
이에 제한되지 않으나, 상기 (c) 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 수행되는 것일 수 있다. 상기 PCR은, 미생물의 게놈 DNA에 대한 표적 서열분석(target sequencing)에 있어서, 가장 잘 알려진 대표적인 방법이다.
상기 PCR 방법은 당업계에 공지된 것이라면, 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 본 명세서의 다른 부분에 구체적으로 기술된 종류 예시들을 참조로 한다.
또한 상기 (c) 단계의 증폭산물의 양을 정상 대조군에서의 증폭산물(양)과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 턱관절 질환의 진단을 위한 정보 제공방법 또는 진단 방법을 제공한다:
(a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 미생물의 16S rDNA(16s rRNA를 포함하는 의미)에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행한 후, 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재 수준을 산출하고 정상대조군(정상인 유래 생물학적 구강 시료)과 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준의 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 턱관절 질환의 진단을 위한 정보 제공방법 또는 진단 방법을 제공한다:
(a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재수준을 산출하고 정상대조군(정상인 유래 생물학적 구강 시료)과 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준의 증감을 비교하는 단계.
본 발명에서, 상기 마이크로바이옴 미생물은, 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군(본 명세서에서 '본 발명의 46개 종류 미생물군'으로도 칭함)에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 턱관절 질환이 턱관절의 퇴행성 관절병인 경우, 상기 마이크로바이옴 미생물은
액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 마이크로바이옴 미생물 중,
액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 감소된 것이고,
SR1 문(SR1 Phylum)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않고,
퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)은 턱관절 질환 환자에서만 검출되는 것이고,
JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않을 수 있다.
따라서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중,
피험자의 생물학적 구강 시료에서 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)이 정상 대조군 대비 존재 수준(ex. 검출량, DNA 증폭산물의 양)이 감소되어 있는 경우(낮은 경우), 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
또한 피험자의 생물학적 구강 시료에서 SR1 문(SR1 Phylum)이 검출되지 않는(DNA 증폭산물 부재, 실질적으로 0(zero)) 경우, 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
또한 피험자의 생물학적 구강 시료에서 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)이 검출되는 경우(DNA 증폭산물 존재), 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
또한 피험자의 생물학적 구강 시료에서 JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)이 검출되지 않는(DNA 증폭산물 부재, 실질적으로 0(zero))는 경우, 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
본 발명에서, 상기 턱관절 질환이 특발성 과두 흡수증인 경우, 상기 마이크로바이옴 미생물은
헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 마이크로바이옴 미생물 중
헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 증가된 것이고,
로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 감소된 것이고,
바실러스 속(Bacillus genus)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않고,
스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서만 검출되는 것일 수 있다.
따라서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중,
피험자의 생물학적 구강 시료에서 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 정상 대조군 대비 존재 수준(ex. 검출량, DNA 증폭산물의 양)이 증가되어 있는 경우(낮은 경우), 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
또한, 피험자의 생물학적 구강 시료에서 로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 정상 대조군 대비 존재 수준(ex. 검출량, DNA 증폭산물의 양)이 감소되어 있는 경우(낮은 경우), 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
또한 피험자의 생물학적 구강 시료에서 바실러스 속(Bacillus genus)이 검출되지 않는(DNA 증폭산물 부재, 실질적으로 0(zero)) 경우, 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
또한 피험자의 생물학적 구강 시료에서 스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우(DNA 증폭산물 존재), 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 전술한 본 발명의 46개 종류 미생물군은 2개 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
이러한 구체적 실시양태에 있어서, 이에 제한되지 않으나, 일례로 바람직하게 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 조합을 사용할 수 있다. 상기 조합을 이용하는 방식으로 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 구체적으로 하기의 단계를 포함하여 수행되는 것일 수 있다:
(a) 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계;
(c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계; 및
(d) 상기 DNA 증폭산물의 서열분석을 통하여, 정상 대조군과 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물의 함량을 비교하는 단계.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 피험자의 생물학적 구강 시료에서 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)이 정상 대조군 대비 존재 수준(ex. 검출량, DNA 증폭산물의 양)이 감소되어 있는 경우(낮은 경우), 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 방법은,
(e) 턱관절 질환 환자와 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서 통계적으로 유의한 함량 차이를 보이는 미생물군을 선별하고, 상기 선별된 미생물군 중 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물 함량의 컷오프(cut-off) 값을 도출하는 단계; 및
상기 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물 함량을 상기 도출된 컷오프 값과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 정상 대조군 대비 미생물의 함량이 증가 또는 감소한 경우, 이때 통계적으로 유의한 함량 차이는 독립 이표본 t-검정 및 Benjamini-Hochberg(BH) 교정을 통해 false discovery rate(FDR)을 보정한 p-값이 0.05 미만인 것을 의미한다. 또는 독립 이표본 t-검정(independent two sample t-test) 또는 맨-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)으로 분석하여 p-값이 0.1 이하, 0.05 이하, 0.1 미만, 또는 0.05 미만인 것을 의미한다.
상기 컷오프(cut-off)는, 당업계에 알려진 컷오프 결정 방법이라면 그 종류가 제한없이 사용되어 상기 컷오프 값이 도출될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 일례로, ROC 곡선 분석(receiver operating characteristic curve analysis), 선형 또는 비선형 회귀분석방법; 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법; 분산분석(ANOVA) 방법; 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 커넬 원리요소(Kernel principal components) 분석방법; 마코브 블랜킷(Markov Blanket) 분석방법; RFE(recursive feature elimination) 분석방법; 전방 또는 후방 FS(floating search) 분석방법; t검정(t-test) 분석방법; 카이제곱검정(chi-square) 분석방법; 랜덤 포레스트(Random forest); 그래디언트 부스팅 머신(Gradient Boosting Machine) 계열 알고리즘; 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 결정되는 것일 수 있다.
구체적 일 실시양태에서, 상기 컷오프(cut-off)는 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum)의 경우 7188이고, 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)의 경우 6061인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 피험자의 생물학적 구강 시료에서 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum)의 검출량이 7188 미만일 경우, 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)의 검출량이 6061 미만일 경우, 턱관절 질환이 발생 가능한 것으로 예측하거나 또는 턱관절 질환이 발생한 것으로 결정(판정, 지시, 의미)할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 비교를 통해 각 미생물의 존재비를 산출할 수 있다. 상기 존재비는 바람직하게 상대적 존재비를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 턱관절 질환으로 의심되는 피험자와 대조군에서 분리된 생물학적 구강 시료에서 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준을 측정한 후,
상기 마이크로바이옴 미생물 중 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)의 존재 수준이 정상 대조군 대비 감소하거나,
SR1 문(SR1 Phylum)이 검출되지 않거나,
퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)이 검출되거나,
JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)이 검출되지 않을 경우, 턱관절 질환의 발병 리스크가 큰 피험자임을 가리키는 것으로 보는, 턱관절 질환 발병에 대한 감수성이 높은 피험자인지 결정/분석하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 턱관절 질환으로 의심되는 피험자와 대조군에서 분리된 생물학적 구강 시료에서 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준을 측정한 후,
헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 존재 수준이 정상 대조군 대비 증가하거나,
로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 존재 수준이 정상 대조군 대비 감소하거나,
바실러스 속(Bacillus genus)이 검출되지 않거나,
스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 턱관절 질환의 발병 리스크가 큰 피험자임을 가리키는 것으로 보는, 턱관절 질환 발병에 대한 감수성이 높은 피험자인지 결정/분석하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재수준을 산출하고 정상대조군(정상인 유래 생물학적 구강 시료)과 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준의 증감을 비교하는 단계;
(d) 상기 마이크로바이옴 미생물 중 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)의 존재 수준이 정상 대조군 대비 감소하거나,
SR1 문(SR1 Phylum)이 검출되지 않거나,
퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)이 검출되거나,
JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)이 검출되지 않을 경우 상기 피험자가 턱관절 질환을 가진 것으로 판정(즉, 턱관절 질환이 발병한 것으로 판단)하는 단계; 및
(e) 상기 피험자가 턱관절 질환을 가진 것으로 판정된 경우, 피험자의 턱관절 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재수준을 산출하고 정상대조군(정상인 유래 생물학적 구강 시료)과 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준의 증감을 비교하는 단계;
(d) 상기 마이크로바이옴 미생물 중 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 존재 수준이 정상 대조군 대비 증가하거나,
로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 존재 수준이 정상 대조군 대비 감소하거나,
바실러스 속(Bacillus genus)이 검출되지 않거나,
스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우 상기 피험자가 턱관절 질환을 가진 것으로 판정(즉, 턱관절 질환이 발병한 것으로 판단)하는 단계; 및
(e) 상기 피험자가 턱관절 질환을 가진 것으로 판정된 경우, 피험자의 턱관절 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 치료 단계에서는, 약물 치료(턱관절 질환 치료제 투여) 및 물리 치료 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 턱관절 질환의 치료를 위한 턱관절 질환 치료제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
(a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재수준을 산출하고 정상대조군(정상인 유래 생물학적 구강 시료)과 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준의 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 상기 마이크로바이옴 미생물 중 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)의 존재 수준이 정상 대조군 대비 감소하거나,
SR1 문(SR1 Phylum)이 검출되지 않거나,
퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)이 검출되거나,
JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)이 검출되지 않을 경우, 턱관절 질환 치료제에 대한 반응자로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 턱관절 질환의 치료를 위한 턱관절 질환 치료제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
(a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재수준을 산출하고 정상대조군(정상인 유래 생물학적 구강 시료)과 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준의 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 상기 마이크로바이옴 미생물 중 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 존재 수준이 정상 대조군 대비 증가하거나,
로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 존재 수준이 정상 대조군 대비 감소하거나,
바실러스 속(Bacillus genus)이 검출되지 않거나,
스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 턱관절 질환 치료제에 대한 반응자로 판정하는 단계.
상기 턱관절 질환 치료제는 진통 소염제, 근이완제 등을 포함하여 당업계에서 턱관절 질환의 치료를 위해 사용되는 약물을 사용할 수 있으며, 이의 종류에 제한은 없다.
본 발명은 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물을 포함하는 턱관절 질환 진단용 마커(바이오마커) 조성물을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군(이하에서, '본 발명의 46개 종류 미생물군'으로도 칭함)에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제를 포함하는, 턱관절 질환 진단용 조성물 및, 상기 조성물을 포함하는 구강 미생물을 이용하는 턱관절 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 미생물의 검출 제제(미생물 측정 제제)는, 당업계에 공지된 미생물 검출 제제라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 46 종류 각각의 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체(이에 제한되지 않으나, 구체적 일례로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭(chimeric) 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 본 발명의 구체적 일 실시양태에서, 상기 검출 제제는 각 미생물을 구별할 수 있는 특이적인 핵산 분자(뉴클레오타이드) 또는 단백질(폴리펩타이드)를 표적(특이적으로 결합)하는 것일 수 있고, 이러한 표적의 구체적 종류는 각 미생물 별로 공지된 것을 당업자가 적절하게 임의 선택하여 사용할 수 있다. 일례로, 이에 제한되지 않으나, 본 발명에서 상기 프라이머는 미생물의 16s rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 것일 수 있다.
또한 미생물의 검출 제제는, 각 미생물을 구별할 수 있는 한, 유니버셜(universal)한 측정제제도 본 발명에서 사용 가능하다. 일례로 유니버셜 프라이머 세트 등이 사용될 수 있으며, 이에 대해서는 본 명세서 다른 부분에 구체적으로 기술한 내용을 참조로 한다.
상기 검출 제제(측정 제제)들은 주어진 조건에서 이의 확인, 검출, 측정 및 정량을 용이하게 하기 위하여 검출 가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출 가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, β갈락토시다아제 및 β글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다. 유사하게, 상기 검출가능한 그룹은 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다.
상기 검출 제제(측정 제제)의 확인, 검출, 측정 및 정량은 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 키트는, 본 발명의 46개 종류 미생물군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제와 별도로, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 전술한 표지, 이의 검출에 사용되는 물질, 및 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 조성물은 면역분석용 키트(kit) 또는 칩(chip) 형태로 제공되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 키트는, 당업계에 공지된 유전체 분석 키트 또는 단백질 분석 키트 종류라면 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으며, 일례로 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트, 디지털 PCR(digital polymerase chain reaction) 키트 또는 액적 디지털 PCR(droplet digital polymerase chain reaction) 키트일 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있다. 또한 대조군(ex. 내부 대조군) 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군(ex. 내부 대조군) 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 턱관절 질환 진단용 키트는, 전술한 본 발명의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 교시하는 설명서를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준 정보를 입력으로 하는 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델을 이용하여 턱관절 질환의 발생 여부에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 턱관절 질환의 진단을 위한 정보 제공방법 또는 진단 방법을 제공한다:
(a) 피험자(피검자)로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 DNA(RNA를 포함하는 의미)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 피험자의 마이크로바이옴 미생물 존재 수준을 산출하는 단계; 및
(d) 상기 산출된 마이크로바이옴 미생물 존재 수준 정보를 입력으로 하는 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델을 이용하여 턱관절 질환의 발생 여부에 대한 정보를 획득하는 단계.
본 발명에서, 상기 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델에서 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준 정보를 변수로 입력할 수 있으며, 예를 들어 상기 변수로 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상 또는 이들 모두의 존재 수준 정보를 입력할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 정상 대조군과 비교하여 턱관절 질환 환자에서 유의미한 존재 수준을 나타내는 미생물로서 p-값<0.1을 만족하는 변수로 상기 32개의 미생물을 선별하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 정상 대조군과 비교하여 턱관절 질환 환자에서 유의미한 존재 수준을 나타내는 미생물로서 p-값<0.05를 만족하는 변수로 로치아 속(Rothia genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 및 바실러스 속(Bacillus genus) 미생물을 선별하였다.
본 발명에서, 상기 머신 러닝은 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier), 앙상블(Ensemble), 및 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 “엑스트라 트리(Extra Trees Classifier)”는 극도로 무작위화(Extremely Randomized)된 머신 러닝 방법으로, 데이터 샘플 수와 특성 설정까지 랜덤이며, 랜덤 포레스트와 동일한 원리를 이용하기 때문에 많은 특성을 공유한다. 엑스트라 트리는 랜덤 포레스트에 비해 속도가 빠르고 성능도 미세하게 높으며, Bootstrap 샘플링을 사용하지 않고 전체 특성 중 일부를 랜덤하게 선택해 노드 분할에 사용한다. 즉, 후보 특성을 이용해 랜덤하게 분할한 다음 그 중에서 최상의 분할을 선택하는 방법이다.
본 발명에서, 상기 “앙상블(Ensemble)”은 여러 개의 개별 모델을 조합하여 최적의 모델로 일반화하는 방법으로, weak classifier 들을 결합하여 strong classifier 를 만드는 것을 의미한다. Test 데이터에 대해 다양한 의견(예측값)을 수렴하기 위해 overfitting이 잘 되는 모델을 기본적으로 사용하며, Tree 기반 모델(Boosting, Random Forest)을 자주 사용한다. 즉, 앙상블의 기본 알고리즘으로 일반적으로 사용하는 것은 결정트리이다. 앙상블은 과적합(overfitting) 감소 효과가 있으며, 개별 모델 성능이 잘 안 나올 때 앙상블 학습을 이용하면 성능이 향상될 수 있다. 앙상블 학습의 유형은 전통적으로 보팅(Voting), 배깅(Bagging)과 부스팅(Boosting)이 있다.
본 발명에서, 상기 “스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)”은 개별적인 여러 알고리즘을 서로 결합해 예측 결과를 도출한다는 점에서 배깅(Bagging) 및 부스팅(Boosting)과 공통점을 가지고 있다. 하지만 가장 큰 차이점은 개별 알고리즘으로 예측한 데이터를 기반으로 다시 예측을 수행한다는 점이다. 즉, 개별 알고리즘의 예측 결과 dataset을 최종적인 메타 dataset으로 만들어 별도 ML 알고리즘으로 최종 학습을 수행하고 테스트 데이터를 기반으로 다시 최종 예측을 수행하는 방식이다. 개별 모델의 예측된 dataset을 기반으로 학습하고 예측하는 방식을 메타 모델이라고 한다. 스캐팅엔 개별적인 기반 모델과 최종 메타 모델이 필요하다.
본 발명에서, 상기 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델에서 턱관절 질환은 턱관절내장증, 턱관절잡음, 턱관절의 재발성 탈구 및 아탈구, 턱관절의 통증, 턱관절의 경직, 턱관절의 퇴행성 관절병, 저작근 장애, 및 특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption, ICR)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 특발성 과두 흡수증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델을 이용한 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 턱관절 질환 진단에 대한 정확도가 80 % 이상일 수 있으며, 예컨대 80 내지 100 %, 80 내지 95 %, 80 내지 90 %, 80 내지 85 %, 80 내지 82 %, 80 %, 81 %, 또는 81.82 %일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 대상자 모집 및 타액 채취
턱관절 불편감을 주소로 치과에 내원한 한국인 58명(턱관절염 환자: 27명, 정상 대조군: 31명)을 대상으로 연구를 진행하였으며, 연구대상의 선정 기준은 턱관절 불편감을 동반하며 방사선 사진상에서 턱관절의 골관절염 양상을 보이는 경우였으며, 제외기준은 두개안면 증후군이 동반되었거나 턱의 외상을 받은 경우이다.
타액은 연구 대상자 58명이 동일하게 흘림 방식(draining method)을 통해 멸균튜브에 입을 대고 타액이 수동적으로 떨어지게 하여 채취하였다. 흘림 방식은 피험자가 머리를 숙이고 입을 벌린 상태로 아랫입술에서 멸균튜브로 타액이 수동적으로 떨어지게 하는 방식이며, 비자극 채취법이고 안정적이다. 채취한 타액 1mL을 1.5mL microtube에 담아 검사 전까지 -80℃냉동고에 보관하였다.
2. DNA 추출, 16S rRNA 시퀀싱(NGS sequencing) 및 생물정보학 분석
FastDNA® SPIN Kit for Soil(MP BIO, Cat. No: 6560-200)를 제조사의 지침에 따라 사용하여, 58명의 타액 검체가 추출되었다.
PCR 증폭은 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 표적으로 하는 515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') 및 805R(5'-GGACTACHVGGGTTWTCTAAT-3') 프라이머로 수행되었다. 증폭 과정은, 95℃에서 3분 동안 초기 변성 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 프라이머 결합, 72℃에서 3분 동안 연장 단계의 25주기 조건과 72℃에서 5분 동안 최종 연장 단계로 수행되었다.
Nextera XT Index kit V2(illumine, Cat. No: 15052163)는 라이브러리 준비용 인덱스 프라이머로 테스트되었다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인하고 Gel Doc 시스템에서 시각화하였다. 증폭 산물은 HiAccuBead(AccuGene, Cat. No: ACN01.50)로 정제하였다. 동일한 농도의 정제된 산물을 함께 모으고 HiAccuBead로 짧은 단편(비표적 산물)을 제거했다. 혼합 앰플리콘을 풀링하고 제조사의 지침에 따라 Illumina iSeq100 Sequencing system(Illumina, USA)을 사용하여 아산생명과학연구원(Seoul, Korea)에서 시퀀싱을 수행했다. 모든 분석은 천랩(ChunLab)의 생물정보학 클라우드 플랫폼인 EzBioCloud 16S 기반 MTP에서 수행되었다.
3. 통계 분석
천랩(ChunLab)의 EzBioCloud로 정제된 데이터를 R(version 4.0.5)을 이용하여 분석하였다. 상대적풍부도(relative abundance) 분석은 "dplyr", "reshape2" 패키지로 상대적 풍부도가 1% 초과인 미생물 군집을 선별하여 "ggplot2", "ggpubr" 패키지로 결과를 시각화하였다. 다양성(diversity) 분석의 경우, 생물정보학 분석으로 나온 알파-다양성(α-diversity) 지수는 "ggplot2", "ggpubr" 패키지를 사용하여 결과를 시각화하였으며, 베타-다양성(β지수는 "ggplot2", "scatterplot3d" 패키지를 사용하여 결과를 시각화하였다. false discovery rate(FDR)는 하기 수학식 1에 의해 산출되었다. 독립 이표본 t-검정 및 Benjamini-Hochberg(BH) 교정을 통해 false discovery rate(FDR)을 보정한 p-값(하기 수학식 2 참조)을 이용하여 "reshape2", "rstatix" 패키지로 결과를 도출하였으며, 이를 통해 통계적으로 유의한 미생물 군집을 확인하였다.
[수학식 1]
FDR = 위양성(false positive)/{위양성 + 참양성(true positive)}
[수학식 2]
교정된 p-값(adjusted p-value) = 기존의 p-값 × (전체 p-값의 수/기존의 p-값의 오름차순 시 순서)
상기 수학식 2에서, 기존의 p-값 ≤ 교정된 p-값(adjusted p-value)
턱관절염 환자군과 건강 대조군 사이에서 선정된 통계적으로 유의한 차이를 보이는 미생물 군집은 "stats" 패키지로 로지스틱 회귀분석을 수행하여, 다시한번 통계적으로 유의한 미생물 군집을 선별하였고, 이들을 기반으로 "pROC" 패키지로 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve를 만들고 AUC(Area Under the Curve)의 값이 가장 큰 모형을 선별하였다. 분산팽창요인(variance inflation factors, VIF)은 "car", 오즈비(odds ratio)는 "moonBook" 패키지를 통해 결과를 도출하였다.
실시예 1. 미생물 군집 분석
1-1. 상대적 풍부도(Relative abundance) 분석
총 58개의 타액 시료에서 1043개의 종(species) 및 24개의 문(Phylum)에 속하는 미생물 군집을 식별했다. 턱관절염 환자군(TMJD)과 정상 대조군(HC)에서 각각 상대적 풍부도(relative abundance)가 1% 초과인 문(phylum)과 종(species)을 확인하여, 이를 그래프 및 표로 나타낸 것을 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다.
도 1a 및 도 1b에서 보는 바와 같이, 문(phylum) 수준에서는 Proteobacteria가 정상 대조군에서 25.53%, 턱관절염 환자군에서 27.56%로 Relative abundance가 가장 많은 비율을 차지하였으며, 그 다음으로는 Firmicutes가 정상 대조군에서 23.00%, 턱관절염 환자군에서 25.21%, Actinobacteria가 정상 대조군에서 18.97%, 턱관절염 환자군에서 19.10%, Bacteroidetes가 정상 대조군에서19.26%, 턱관절염 환자군에서 17.45% 였으며, 이들이 평균 86% 이상을 차지하는 주요 문(phylum)이었다.
도 1c 및 도 1d에서 보는 바와 같이, 종(species) 수준에서는 턱관절염군에서 22종이 평균 미생물 군집의 68% 이상을 구성했으며, 정상 대조군에서 19종이 평균 미생물 군집의 70% 이상을 구성했다. 이 중에서 평균 5% 이상을 구성하는 종은, 턱관절염군에서 Haemophilus parainfluenzae group, KV831974_s group, Neisseria subflava group이었으며, 정상 대조군에서는 Haemophilus parainfluenzae group, KV831974_s group, Neisseria subflava group, Prevotella melaninogenica였다.
1-2. 상대적 풍부도가 높은 미생물들 중, 질환 모집군 또는 정상 모집군에서만 나타나는 미생물 구별
상대적 풍부도가 1% 초과이면서 턱관절염에서만 검출된 미생물 군집은 종(species) 수준에서는 Fusobacterium nucleatum group, Lautropia mirabilis group, Prevotella nanceiensis group, Pseudomonas brassicacearum group, Staphylococcus aureus group, Streptococcus salivarius group이었다.
상대적 풍부도가 1% 초과이면서 정상 대조군에서만 검출된 미생물 군집은 문(phylum) 수준에서는 SR1이었고, 종(species) 수준에서는 JX294356_s, PAC001345_s group, Prevotella pallens였다.
하기 표 1은 '상대적 풍부도> 1%'를 만족하며, 턱관절염 환자군(TMJD) 또는 정상 대조군(HC)에서만 특이적으로 검출된 미생물 군집을 각각 문(phylum) 및 종(species)으로 구별하여 나타낸 것이다.
생물 분류 단계 모집군 검출된 미생물 군집
문(Phylum) 턱관절염 환자군(TMJD) -
정상 대조군(HC) SR1
종(Species) 턱관절염 환자군(TMJD) Fusobacterium nucleatum group, Lautropia mirabilis group,
Prevotella nanceiensis group, Pseudomonas brassicacearum group, Staphylococcus aureus group, Streptococcus salivarius group
정상 대조군(HC) JX294356_s,
PAC001345_s group,
Prevotella pallens
1-3. 다양성(Diversity) 분석
종의 풍부도를 판단하는 지표인 알파-다양성(α-diversity)의 ACE, Chao1, Shannon, Simpson은 통계적으로 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 2a 내지 도 2d 참조). 하지만 도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이, 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하는 ACE와 Chao1에서, 턱관절염 환자군이 정상 대조군보다 1, 3사분면과 중위수가 상대적으로 아래에 위치하는 것을 확인할 수 있었다.
시료 및 그룹간의 다양성을 판단하는 지표인 베타-다양성(β을, 생물학적 군집을 비교하는데 사용되는 거리측정법인 UniFrac을 통해 확인하였다. UniFrac 분석 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었으며, 주좌표 분석(Principal Coordinate Analysis, PCoA)에서 육안상 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되었다.
실시예 2. 특이적 미생물 선별
식별된 전체 미생물 군집에 대해 풍부도의 수를 기반으로 턱관절염 환자군과 정상 대조군 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 보이는 미생물을 독립 이표본 t-검정방법(independent two sample t-test)으로 확인하였고, 다양한 미생물들 중에서도 특이적으로 마커로서 기능할 수 있는 것들을 선별하였다.
하기 표 2는, 본 발명에서 특이적으로 선별된, 문(Phylum) 수준에서 턱관절염 환자군과 정상 대조군 사이에서 유의한 차이를 나타내는 미생물 군집에 대한 측정 및 통계 데이터를 비교적으로 나타낸다. 하기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 문(Phylum) 수준에서 Actinobacteria, Bacterioidetes, Firmicutes, Saccharibacteria_TM7가 p-값이 0.05미만으로 유의미한 차이를 나타내며, 뿐만아니라 FDR을 보정하는 BH 교정을 통해 나온 보정된 p-값도 0.05 미만으로 유의한 차이를 나타내었다(표 2). 하기 표 2에 기재된 문(Phylum)의 미생물 군집은 p-value와 FDR을 보정한 adjusted p-value 모두에서 유의한 차이를 나타냄을 확인할 수 있다.
독립변수 평균(표준편차) p-값* 보정된 p-값*
정상 대조군 턱관절염 환자군
Actinobacteria 8150.39 (2554.87) 6064.07 (2202.74) 0.0015 0.0209
Bacteroidetes 8278.23 (3294.20) 5541.81 (2503.25) 0.0007 0.0209
Firmicutes 9881.42 (2442.96) 8003.04 (1969.72) 0.0020 0.0209
Saccharibacteria_TM7 2536.68 (2062.59) 1205.59 (1294.12) 0.0044 0.0339
* : 소수점 다섯자리에서 반올림
하기 표 3은, 본 발명에서 특이적으로 선별된, 강(Class) 수준에서 턱관절염 환자군과 정상 대조군 사이에서 유의한 차이를 나타내는 미생물 군집에 대한 측정 및 통계 데이터를 비교적으로 나타낸다. 하기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 강(Class) 수준에서 Bacteroidia가 p-값이 0.05 미만으로 유의미한 차이를 나타내며, 뿐만 아니라 FDR을 보정하는 BH 교정을 통해 나온 보정된 p-값도 0.05 미만으로 유의한 차이를 나타내었다(표 3). 하기 표 3에 기재된 Bacteroidia 강(Class)의 미생물 군집은 p-value와 FDR을 보정한 adjusted p-value 모두에서 유의한 차이를 나타냄을 확인할 수 있다.
독립변수 평균(표준편차) p-값* 보정된 p-값*
정상 대조군 턱관절염 환자군
Bacteroidia 7726.84 (3334.83) 5044.85 (2554.93) 0.0011 0.0483
* : 소수점 다섯자리에서 반올림
보정된 p-값이 0.05 미만으로 선별된 미생물 군집별 풍부도의 수를 비교한 결과를 도 5에 나타내었으며, Actinobacteria, Bacterioidetes, Firmicutes, Saccharibacteria_TM7, Bacteroidia가 모두 육안상 턱관절염 환자군에서 정상 대조군보다 적게 검출됨을 확인할 수 있다.
실시예 3. 본 발명에 따른, 진단 예측력이 뛰어난 회귀모형
상기 실시예 2와 같이 통계 분석 프로그램인 R을 이용하여 독립 이표본 t-검정으로 p-값을 검정하고 Benjamini-Hochberg 교정을 통해 보정한 p-값을 검정하여 정상 대조군과 턱관절염 환자군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 나는 미생물군을 선별하였고, 선별된 미생물군의 각 군별 평균과 표준편차를 분석하였으며, 선정된 미생물 군집을 대상으로 단순 로지스틱 회귀분석(표 4)과 다중 로지스틱 회귀분석(표 5)을 실시하였다.
로지스틱 회귀분석으로 미생물군별 오즈비(Odds ration)와 각 군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 나는 미생물군을 선별하고, AUC(Area Under the Curve)를 구하여 진단 예측력이 높은 회귀모형을 선별하였다.
단순 로지스틱 회귀분석에서는 Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Saccharibacteria_TM7의 p-값이 0.05 미만으로 유의한 결과를 나타내었다(표 4). Actinobacteria가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.993배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9989~0.9998이다. Bacteroidetes가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9996배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9993~0.9999이다. Firmicutes가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9996배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9993~0.9999이다. Saccharibacteria_TM7가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9995배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9992~0.9999이다. Bacteroidia가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9999배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9997~1.0000이다. 하기 표 4는, 본 발명에서, 턱관절염에 영향을 미치는 요인(마커)으로서 특이적으로 선별된 미생물군집에 대한 단순 로지스틱 회귀분석 결과를 나타낸다.
독립변수 OR CI(2.5%) CI (97,5%) p-값*
Actinobacteria 0.9996 0.9993 0.9999 0.0044
Bacteroidetes 0.9997 0.9995 0.9999 0.0028
Firmicutes 0.9996 0.9993 0.9999 0.0054
Saccharibacteria_TM7 0.9995 0.9992 0.9999 0.0112
Bacteroidia 0.9999 0.9997 1.0000 0.1350
* : 소수점 다섯자리에서 반올림
다중 로지스틱 회귀분석에서는 Actinobacteria와 Bacteroidetes의 p-값이 0.05미만으로 유의한 결과를 나타내었다(표 5). Actinobacteria가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.993배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9989~0.9998이다. Bacteroidetes가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9996배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9992~0.9999이다. Firmicutes가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9998배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9994~1.0001이다. Saccharibacteria_TM7가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 0.9995배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9990~1.0000이다. Bacteroidia가 1 증가할 때마다 턱관절염에 걸리는 인원은 1.0001배가 되며, 95% 신뢰구간은 0.9998~1.0003이다. 분산팽창요인은 모두 10 이하로 다중공선성이 있을 확률이 적다. 하기 표 5는, 본 발명에서, 턱관절염에 영향을 미치는 요인(마커)로서 특이적으로 선별된 미생물군집에 대한 다중 로지스틱 회귀분석 결과를 나타낸다.
독립변수 OR CI(2.5%) CI (97,5%) VIF* p-값*
Actinobacteria 0.9993 0.9989 0.9998 1.8176 0.0033
Bacteroidetes 0.9996 0.9992 0.9999 1.5455 0.0084
Firmicutes 0.9998 0.9994 1.0001 1.2083 0.2036
Saccharibacteria_TM7 0.9995 0.9990 1.0000 1.2423 0.0729
Bacteroidia 1.0001 0.9998 1.0003 1.2558 0.6026
* : 소수점 다섯자리에서 반올림
또한 다중 로지스틱 분석에서 통계적으로 유의한 결과를 도출한 Actinobacteria 및 Bacteroidetes를 조합하여 사용하여, 이들을 대상으로 ROC 곡선을 나타내었을 때(도 6 참조), AUC가 0.913으로 진단 예측력이 뛰어남을 확인하였으며, 컷오프 값(cut-off value)이 7188(Actinobacteria Phylum), 6061(Bacteroidetes Phylum) 일 때 민감도와 특이도가 최대가 됨을 확인하였다(민감도 = 93.5%, 특이도 = 85.2%).
실시예 4. 턱관절 질환 진단을 위한 머신 러닝 모델 구축
4-1. 통계적 분석을 통한 턱관절 질환 진단 바이오마커 선정
특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption, ICR) 환자 71명과 정상 대조군 31명으로부터 타액을 채취한 후, 상기 실험방법 및 실시예 1에 기재된 방법으로 식별된 전체 미생물 군집(194개)에 대해 풍부도의 수를 기반으로 ICR 환자군과 정상 대조군 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 보이는 미생물을 독립 이표본 t-검정방법(independent two sample t-test) 및 맨-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)으로 확인하였고, 다양한 미생물들 중에서도 특이적으로 마커로서 기능할 수 있는 것들을 선별하였다. 이러한 실험군 102명 및 미생물 군집 194개를 대상으로 통계적 분석을 수행하였으며, 이들의 데이터 구조를 도 7에 나타내었다.
독립 이표본 t-검정방법 및 맨-휘트니 U 검정방법을 통해 p-값<0.05 미만을 만족시키는 변수를 선별하였으며, 그 결과 도 8a(독립 이표본 t-검정방법)에 나타낸 바와 같이 Rothia, TM7x, [Eubacterium] nodatum group, Peptostreptococcus, Candidatus Saccharimonas, Cardiobacterium, Actinomyces, Dialister, Butyrivibrio, Centipeda, Alloscardovia, 및 Conservatibacter 속(genus) 세균의 수준이 유의미한 차이를 나타내었고, 8b(맨-휘트니 U 검정방법)에 나타낸 바와 같이 Rothia, TM7x, Atopobium, [Eubacterium] nodatum group, Peptostreptococcus, Actinomyces, Dialister, Conchiformibius, Centipeda, Olsenella, Scardovia, Weissella, Alloscardovia, Conservatibacter, 및 Bacillus 속(genus) 세균의 수준이 유의미한 차이를 나타내었다.
또한, p-값<0.1 미만을 만족시키는 변수를 선별한 결과, 도 9a(독립 이표본 t-검정방법)에 나타낸 바와 같이 Haemophilus, Rothia, Granulicatella, Alloprevotella, TM7x, [Eubacterium] nodatum group, Peptostreptococcus, Candidatus Saccharimonas, Solobacterium, Cardiobacterium, Actinomyces, Dialister, Butyrivibrio, Centipeda, Lentimicrobium, Olsenella, Scardovia, Weissella, Alloscardovia, Conservatibacter, 및 Bacillus 속(genus) 세균의 수준이 유의미한 차이를 나타내었고, 9b(맨-휘트니 U 검정방법)에 나타낸 바와 같이 Haemophilus, Rothia, Granulicatella, TM7x, Atopobium, [Eubacterium] nodatum group, Lachnoanaerobaculum, Peptostreptococcus, Candidatus Saccharimonas, Actinomyces, Dialister, Butyrivibrio, Conchiformibius, Mycoplasma, Centipeda, Fretibacterium, Family XIII UCG-001, Olsenella, Scardovia, Mobiluncus, Weissella, Alloscardovia, Diaphorobacter, Cryptobacterium, Acinetobacter, Conservatibacter, Lachnospiraceae UCG-004, 및 Bacillus 속(genus) 세균의 수준이 유의미한 차이를 나타내었다.
상기와 같이 선별된 변수들을 벤다이어그램으로 시각화하여 p-값<0.05 미만인 경우 도 10에 나타내었고, p-값<0.1 미만인 경우 도 11에 나타내었다.
4-2. 머신 러닝 모델 구축
상기 4-1에서 선별된 변수들을 이용하여 턱관절 질환 진단에 대한 머신 러닝 모델을 개발하였다.
우선 샘플 수에 따라 데이터를 train data : test data = 9:1 비율로 분리하였다. 이때, train data와 test data 내의 건강 대조군과 질환군도 비율적으로 유지되며, 상기 train data는 모델을 학습하는 데이터이고, test data는 모델의 성능을 최종적으로 검증하는 데이터이다.
데이터 분리 후 train data에 대하여 SMOTE(Synthetic Minority Over-sampling Technigue)를 적용하여 부족한 건강 대조군을 oversampling하여 질환군의 샘플 수와 동일하게 만들었다. 상기 SMOTE 처리된 train data로 Pycaret을 이용하여 최적의 정확도를 지니는 모델을 도출하였으며, test data로 최종 검증하였다.
그 결과, 도 12 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier)(도 12), 앙상블(Ensemble)(도 13a 및 13b), 및 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)(도 14)의 3가지 머신 러닝 모델에서 test data의 진단 정확도가 80 % 이상으로 나타나는 것을 확인하였다.
구체적으로, 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier) 모델의 경우, p-값<0.05를 만족하는 변수들로 모델링하였으며, 도 12에 나타낸 바와 같이 train data 정확도(accuracy)가 0.9386으로 나타났으며, test data 정확도는 0.8182로 나타난 것을 확인하였다.
앙상블(Ensemble) 모델의 경우, test data 정확도가 바로 도출되었으며, p-값<0.1 및 p-값<0.05를 각각 만족하는 변수들로 모델링한 결과, 도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이 모두 test data의 정확도가 0.8182로 나타난 것을 확인하였다.
스태킹 앙상블(Stacked Ensemble) 모델의 경우, p-값<0.05를 만족하는 변수들로 모델링하였으며, 학습을 하면서 만들어졌던 다양한 모델들(GBM(Gradient Boosting Algorithm) 모델 1개, 딥러닝(Deeplearning) 모델 1개, DRF(Distributed Random Forest) 모델 2개)을 메타(meta) 학습 시켜서 최종 결과를 도출하였다. 그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 train data 정확도는 0.9386, AUC는 0.962646이었으며, test data 정확도는 0.8182로 나타난 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명 특유의 미생물 바이오마커를 이용할 경우 높은 민감도 및 특이도로 턱관절 질환을 진단할 수 있고, 머신 러닝 모델을 이용하여 높은 정확도로 턱관절 질환의 발병 여부를 진단할 수 있는 바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (45)

  1. 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계
    를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 구강 시료는, 타액(saliva), 구강 내 치태 및 구강 내 상피세포로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 턱관절 질환은 턱관절내장증, 턱관절잡음, 턱관절의 재발성 탈구 및 아탈구, 턱관절의 통증, 턱관절의 경직, 턱관절의 퇴행성 관절병, 저작근 장애, 및 특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption, ICR)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물의 존재 수준의 측정은,
    각 미생물 특이적인 유전체 또는 유전자 양을 측정하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유전체 또는 유전자 양의 측정은,
    차세대 염기서열 분석법(Next Generation sequencing, NGS)으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 차세대 염기서열 분석법은, 미생물 유전체의 16S rRNA를 대상으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 차세대 염기서열 분석법은,
    하기의 프라이머를 포함하는 유니버셜 프라이머 세트(Universal primer set)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    서열번호 1의 서열을 포함하는 프라이머, 및
    서열번호 2의 서열을 포함하는 프라이머.
  8. 제4항에 있어서, 상기 유전체 양의 측정은,
    역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semiQuantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 디지털 PCR(Digital PCR), 액적 디지털 PCR(Droplet Digital PCR), 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization), 형광 인 시투 하이브리드화(FISH), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(Southern blotting), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 게놈 DNA에 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계는 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 수행되는 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭산물의 양을 정상 대조군에서의 증폭산물과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물은
    액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 턱관절 질환이 턱관절의 퇴행성 관절병인 경우, 상기 마이크로바이옴 미생물은
    액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종(Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 턱관절 질환이 특발성 과두 흡수증인 경우, 상기 마이크로바이옴 미생물은
    헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum) 또는 박테로이디아 강(Bacteroidia Class)은,
    턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 감소된 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    SR1 문(SR1 Phylum)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species),
    라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species),
    프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species),
    스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species) 또는
    스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species)은
    턱관절 질환 환자에서만 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    JX294356_s 종(JX294356_s species),
    PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 또는
    프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)은
    턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물은 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    헤모필루스 속(Haemophilus genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 및 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 증가된 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    로치아 속(Rothia genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 및 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서 정상 대조군 대비 존재 수준이 감소된 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    바실러스 속(Bacillus genus)은 턱관절 질환 환자에서는 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제14항에 있어서, 상기 마이크로바이옴 미생물 중
    스카르도비아 속(Scardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 및 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상은 턱관절 질환 환자에서만 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 방법은,
    (a) 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 게놈 DNA에 1개 이상의 마이크로바이옴 미생물에 특이적인 프라이머를 반응시키는 단계;
    (c) 상기 반응물을 증폭시키는 단계; 및
    (d) 상기 DNA 증폭산물의 서열분석을 통하여, 정상 대조군과 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물의 함량을 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법은,
    (e) 턱관절 질환 환자와 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서 통계적으로 유의한 함량 차이를 보이는 미생물군을 선별하고, 상기 선별된 미생물군 중 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물 함량의 컷오프(cut-off) 값을 도출하는 단계; 및
    상기 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 및 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum) 미생물 함량을 상기 도출된 컷오프 값과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 컷오프(cut-off)는,
    ROC 곡선 분석(receiver operating characteristic curve analysis), 선형 또는 비선형 회귀분석방법; 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법; 분산분석(ANOVA) 방법; 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 커넬 원리요소(Kernel principal components) 분석방법; 마코브 블랜킷(Markov Blanket) 분석방법; RFE(recursive feature elimination) 분석방법; 전방 또는 후방 FS(floating search) 분석방법; t검정(t-test) 분석방법; 카이제곱검정(chi-square) 분석방법; 랜덤 포레스트(Random forest); 그래디언트 부스팅 머신(Gradient Boosting Machine) 계열 알고리즘; 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 결정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 컷오프(cut-off)는
    액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum)의 경우 7188이고,
    박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum)의 경우 6061인 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 미생물의 존재 수준의 측정은,
    각 미생물 특이적인 단백질 양을 측정하는 것인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 미생물의 존재 수준의 측정은,
    각 미생물 특이적인 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 미생물 단백질 양의 측정은,
    웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 방사선면역분석법, 방사능면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역형광염색, 면역친화성정제, 방사능면역침전, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것인, 방법.
  31. 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물을 포함하는 턱관절 질환 진단용 마커 조성물.
  32. 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제를 포함하는, 턱관절 질환 진단용 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 미생물의 검출 제제는,
    상기 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환 진단용 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 프라이머는 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환 진단용 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭(chimeric) 항체인, 턱관절 질환 진단용 조성물.
  36. 제32항에 있어서, 상기 조성물은 면역분석용 키트(kit) 또는 칩(chip) 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환 진단용 조성물.
  37. 제32항의 조성물을 포함하는, 구강 미생물을 이용하는 턱관절 질환 진단용 키트.
  38. 제37항에 있어서, 상기 키트는
    RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트, 디지털 PCR(digital polymerase chain reaction) 키트 또는 액적 디지털 PCR(droplet digital polymerase chain reaction) 키트인 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환 진단용 키트.
  39. 제37항에 있어서, 상기 키트는,
    제1항의 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 교시하는 설명서를 포함하는, 키트.
  40. 피험자로부터 분리된 생물학적 구강 시료에서의 마이크로바이옴 미생물의 존재 수준 정보를 입력으로 하는 머신 러닝 기반의 턱관절 질환 진단 모델을 이용하여 턱관절 질환의 발생 여부에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 마이크로바이옴 미생물은 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 및 바실러스 속(Bacillus genus)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 머신 러닝은 엑스트라 트리(Extra Trees Classifier), 앙상블(Ensemble), 및 스태킹 앙상블(Stacked Ensemble)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  43. 제40항에 있어서,
    상기 턱관절 질환은 턱관절내장증, 턱관절잡음, 턱관절의 재발성 탈구 및 아탈구, 턱관절의 통증, 턱관절의 경직, 턱관절의 퇴행성 관절병, 저작근 장애, 및 특발성 과두 흡수증(idiopathic condylar resorption, ICR)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 턱관절 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  44. 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 턱관절 질환 진단 용도.
  45. 액티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum), 박테로이데테스 문(Bacteroidetes Phylum), 피르미쿠테스 문(Firmicutes Phylum), 사카리박테리아 문(Saccharibacteria Phylum), SR1 문(SR1 Phylum), 박테로이디아 강(Bacteroidia Class), 헤모필루스 속(Haemophilus genus), 로치아 속(Rothia genus), 그라눌리카텔라 속(Granulicatella genus), 알로프레보텔라 속(Alloprevotella genus), TM7x 속, 아토포비움 속(Atopobium genus), [에우박테리움] 노다툼 그룹([Eubacterium] nodatum group), 라크노아나에로바큘럼 속(Lachnoanaerobaculum genus), 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus genus), 칸디다투스 사카리모나스 속(Candidatus Saccharimonas genus), 솔로박테리움 속(Solobacterium genus), 카디오박테리움 속(Cardiobacterium genus), 액티노마이세스 속(Actinomyces genus), 디알리스터 속(Dialister genus), 부티리비브리오 속(Butyrivibrio genus), 콘치포르미비우스 속(Conchiformibius genus), 미코플라스마 속(Mycoplasma genus), 센티페다 속(Centipeda genus), 프레티박테리움 속(Fretibacterium genus), 패밀리 XIII UCG-001(Family XIII UCG-001), 렌티마이크로비움 속(Lentimicrobium genus), 올세넬라 속(Olsenella genus), 스카르도비아 속(Scardovia genus), 모빌룬쿠스 속(Mobiluncus genus), 웨이셀라 속(Weissella genus), 알로스카르도비아 속(Alloscardovia genus), 디아포로박터 속(Diaphorobacter genus), 크립토박테리움 속(Cryptobacterium genus), 아시네토박터 속(Acinetobacter genus), 콘세르바티박터 속(Conservatibacter genus), 라크로스피라시에 UCG-004(Lachnospiraceae UCG-004), 바실러스 속(Bacillus genus), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 종(Fusobacterium nucleatum species), 라우트로피아 미라빌리스 종(Lautropia mirabilis species), 프레보텔라 난세이엔시스 종(Prevotella nanceiensis species), 스타필로코커스 아우레우스 종(Staphylococcus aureus species), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 종 (Streptococcus salivarius species), JX294356_s 종(JX294356_s species), PAC001345_s 종(PAC001345_s species) 및 프레보텔라 팔렌스 종(Prevotella pallens species)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 구강 내 미생물의 검출 제제의 턱관절 질환 진단용 제제를 제조하기 위한 용도.
PCT/KR2023/020700 2022-12-14 2023-12-14 구강 마이크로바이옴을 이용한 턱관절 질환의 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 WO2024128841A1 (ko)

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