WO2013133472A1 - 독성 예측 및 치료 타겟으로서의 ａctivating transcription factor 3(atf 3) - Google Patents

독성 예측 및 치료 타겟으로서의 ａctivating transcription factor 3(atf 3) Download PDF

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최상돈
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아주대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a novel cytotoxic marker capable of predicting the toxicity of a general drug to cells, including an anticancer agent, a method for predicting cytotoxicity using the toxic marker, and a composition for alleviating the toxicity of a substance exhibiting cytotoxicity.
  • Drug therapy, surgical therapy, and radiation therapy are mainly performed as a method of treating cancer, and various methods have been attempted.
  • current therapeutic agents such as doxorubicin (anticancer and antibiotics) or cisplatin (cisplatin, anticancer agents), which have excellent therapeutic effects, attack not only cancer cells but also normal cells, and cyclosporin (immunosuppressants). It is an antifungal agent, and immunosuppressive agents such as rheumatoid arthritis drugs) cause various side effects in patients.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the activity of ATF3 is significantly increased in the case of anticancer drugs and immunosuppressants that show side effects that are toxic to normal cells.
  • an object of the present invention is to measure the amount of ATF3 (Activating Transcription Factor 3) gene or the amount of ATF3 protein present in a biological sample, and the measurement results of the ATF3 gene or the amount of ATF3 protein in the control sample.
  • ATF3 Active Transcription Factor 3
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for alleviating the toxicity of an anticancer agent comprising an ATF3 (Activating Transcription Factor 3) expression inhibitor.
  • the present invention measures the amount of ATF3 (Activating Transcription Factor 3) gene present in the biological sample or the amount of ATF3 protein and the measurement results of the step of the control sample
  • ATF3 Activating Transcription Factor 3
  • Provided are methods for predicting cytotoxicity comprising comparing the expression level of ATF3 gene or the amount of ATF3 protein.
  • the ATF3 gene expression amount measurement is to use a primer that can amplify the ATF3 gene.
  • the measurement is selected from the group consisting of reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real time-polymerase chain reaction and Northern blot. Will be.
  • the ATF3 protein amount is measured using an antibody that specifically recognizes the ATF3 protein.
  • the measurement is Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoprecipitation assay and immunohistochemical It is selected from the group consisting of an immunoohistochemical analysis.
  • the cytotoxicity is caused to normal cells by a substance showing cytotoxicity.
  • the cytotoxic substance is selected from the group consisting of anticancer agents, antibiotics, immunosuppressive agents, antifungal agents, and rheumatoid arthritis therapeutic agents.
  • the present invention provides a composition for alleviating the toxicity of a substance exhibiting cytotoxicity, including an ATF3 (Activating Transcription Factor 3) expression inhibitor.
  • ATF3 Active Transcription Factor 3
  • the cytotoxic substance is selected from the group consisting of anticancer agents, antibiotics, immunosuppressive agents, antifungal agents and therapeutic agents for rheumatoid arthritis.
  • ATF3 according to the present invention is confirmed to increase the activity by anti-cancer chemotherapy drugs cisplatin (cisplatin), doxorubicin, and the immunosuppressant cyclosporin (cyclosporin or cyclosporin A), etc. by these chemotherapeutic agents
  • ATF3 can be used as a predictive marker of toxicity in various human organs, and the anti-cancer drug that can prevent cytotoxic side effects by inhibiting ATF3 by confirming that toxic substances and drugs are alleviated when the expression of ATF3 is inhibited or There is an effect that can be used as a target for the development of therapeutic agents that do not have other cytotoxic side effects.
  • Figure 1 shows the HK-2 cell proliferation according to the amount of doxorubicin treatment.
  • Figure 2 shows the results of observing the cell cycle during doxorubicin treatment, (A) control (doxorubicin not treated), (B) doxorubicin 1 ⁇ M treatment, (C) doxorubicin 2 ⁇ M treatment, (D) doxorubicin 4 ⁇ M treatment , (E) is the result of treatment with 8 ⁇ M of doxorubicin.
  • Figure 3 shows the results of measuring the concentration of nitric oxide (NO) during doxorubicin treatment.
  • Figure 4 is a graph measuring the concentration of TNF- ⁇ during doxorubicin treatment.
  • Figure 5 shows the results of measuring the amount of protein expressed after the treatment for each concentration of (A) doxorubicin and (B) the amount of protein expression over time after treatment with doxorubicin.
  • Figure 6 shows the results of measuring the amount of mRNA and protein of ATF3 upon treatment of the concentration of doxorubicin, cisplatin, cyclosporin A.
  • FIG. 7 shows the results of measuring cell proliferation when ATF3 knockout cells were treated with (A) doxorubicin, (B) cisplatin and (C) cyclosporine.
  • Figure 8 shows the results of measuring the cell cycle in (A) wild-type, (B) doxorubicin-treated wild type, (C) ATF3 knockout control and (D) doxorubicin-treated ATF3 knockout cells after doxorubicin treatment.
  • Figure 9 is a graph measuring the concentration of interleukin-6 according to the concentration-specific treatment of doxorubicin in wild-type and ATF3 knockout cells.
  • Figure 10 shows the results of treatment with cytotoxic anticancer drug doxorubicin and protein expression in lung cancer induced mice.
  • the present invention is to determine the relationship between ATF3 and cytotoxicity, and more particularly, it provides a marker for predicting cytotoxicity consisting of ATF3 gene or ATF3 protein encoded from the gene.
  • ATF3 Activating Transcription Factor 3 (ATF3) is induced in macrophages by bacterial lipopolysaccharides (LPS) and is one of the ATF / cAMP responsive element-binding (CREB) protein families. It is known to have the function of inhibiting NO, interleukin-6 (IL-6) and IL-12 produced by macrophages.
  • LPS bacterial lipopolysaccharides
  • CREB cAMP responsive element-binding
  • doxorubicin, cisplatin, or cyclosporin which is known to have side effects indicating cytotoxicity, is treated with human kidney proximal tubule cell line HK-2, and induces cell accumulation on S and G2 / M. , ATF3 gene and protein expression level was found to increase.
  • the present invention may provide a method for predicting cytotoxicity comprising the following steps:
  • step (b) comparing the measurement result of step (a) with the amount of ATF3 gene expression or the amount of ATF3 protein in the control sample.
  • the method for measuring the expression level or ATF3 protein level of the ATF3 gene in the above may be carried out including a known process for separating mRNA or protein from a biological sample using known techniques.
  • the "biological sample” refers to a sample taken from a living body for comparing the expression level or protein level of the ATF3 gene treated with a substance suspected to have cytotoxic side effects with a normal control group. Examples include, but are not limited to, tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, and the like.
  • Determination of the expression level of the ATF3 gene is preferably to measure the level of mRNA, the method of measuring the level of mRNA reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection assay, Northern blots and DNA chips, and the like, but is not limited thereto.
  • the measurement of the ATF3 protein level may use an antibody, in which case the ATF3 marker protein in the biological sample and the antibody specific to it form a binding, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formation is detected.
  • Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal on the label.
  • a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • Analytical methods for measuring protein levels include, but are not limited to, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, Complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like.
  • the present invention can determine the amount of ATF3 mRNA expression or protein of the control group and the amount of ATF3 mRNA expression or protein in a biological sample treated with a substance that exhibits cytotoxicity, through the detection methods as described above. By comparing the degree of with the control group, it is possible to predict the cytotoxicity of the anticancer drug to normal cells.
  • nucleotide sequence of the ATF3 gene according to the present invention is shown in SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence of the ATF3 protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the marker for predicting cytotoxicity detects a substance exhibiting cytotoxicity that increases the expression level of an ATF3 gene or protein.
  • the cytotoxic substance includes all substances exhibiting toxicity to normal cells. Although not limited thereto, it may be preferably an anticancer agent, an antibiotic, an immunosuppressive agent, an antifungal agent, or a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, more preferably doxorubicin, Cisplatin, or cyclosporin.
  • the present invention also provides a method for predicting cytotoxicity comprising measuring the level of ATF3 gene or the level of ATF3 protein.
  • the level of the ATF3 gene preferably means the mRNA level, that is, the amount of mRNA expressed in the ATF3 gene
  • the material capable of measuring the level may include a primer or probe specific for the ATF3 gene.
  • the primer or probe specific for the ATF3 gene may be a primer or a probe capable of specifically amplifying the entire ATF3 gene or a specific region of the gene represented by SEQ ID NO: 1, wherein the primer or probe is known in the art. You can design it through the method.
  • primer refers to a single which can serve as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions and in suitable buffers (ie four different nucleoside triphosphates and polymerases). -Refers to stranded oligonucleotides. Suitable lengths of primers can vary depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. In addition, the sequence of the primer need not have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, it is sufficient to have sufficient complementarity within the range that can hybridize with the template to perform the primer-specific action.
  • the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the ATF3 gene, which is a template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to the gene sequence to act as a primer.
  • the primer according to the present invention can be used for gene amplification reactions.
  • the “amplification reaction” refers to a reaction for amplifying a nucleic acid molecule, and amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction, reverse transcriptase chain reaction, and reverse transcriptase.
  • polymerase chain reaction real time-polymerase chain reaction, ligase chain reaction (LCR), electron mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence substrate amplification (NASBA), northern blot Etc.
  • LCR ligase chain reaction
  • TMA electron mediated amplification
  • NASBA nucleic acid sequence substrate amplification
  • northern blot Etc may be included.
  • the term "probe” refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and may specifically hybridize to a target nucleotide sequence, and naturally It exists or artificially synthesized.
  • the probe according to the invention may be single chain, preferably oligodioxyribonucleotides.
  • Probes of the invention can include natural dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogues or derivatives.
  • the probes of the present invention may also comprise ribonucleotides.
  • the probes of the present invention can be used in the backbone modified nucleotides such as peptide nucleic acid (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, phosphoramidate DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-0-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-0-methyl RNA, 2'-fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alkyl DNA, 2'-0-allyl DNA, 2'-0-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohex Tall DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines (substituents are fluoro-, bromo-, chloro-, iodo--
  • the substance capable of measuring the level of the ATF3 protein in the present invention may include "antibodies” such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies that can specifically bind to ATF3 protein.
  • ATF3 protein has been identified as a marker protein capable of predicting cytotoxicity as described above, a method for producing an antibody using the protein uses techniques known to those skilled in the art. It can be manufactured easily.
  • the ATF3 antigen can be produced by methods well known in the art that inject the animals and collect blood from the animals to obtain serum comprising the antibodies, which polyclonal antibodies are goats, rabbits, sheep. Can be produced from any animal species host such as, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • Monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma methods (Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976), which are well known in the art, or may contain phage antibody libraries ( Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
  • the antibodies according to the invention may comprise functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • HK-2 cells which are human kidney proximal tubule cell lines.
  • HK-2 a proximal tubule cell line derived from normal kidney, was purchased from the American Cell Line Bank (ATCC, Manassas, VA, USA), and recommended by Cell Line Bank, antibiotics (1% penicillin / streptomycin) and 10% fever.
  • ATCC American Cell Line Bank
  • FBS inactivated fetal bovine serum
  • Cell proliferation was performed using a colorimetric MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) solution (Cell Titer 96 ® , Promega, Madison, WI, USA), cells (1 ⁇ 10 4 cells / well) were distributed in 96-well plates, stabilized for 24 hours and then treated with 1, 2, 4 and 8 ⁇ M doxorubicin for 24 hours, and exposed. At the end, cells were incubated at 37 ° C. for 3 hours with the addition of MTS solution (20 ⁇ l / well). Cell growth was then observed by measuring the optical density of each well at 490 nm using a microplate spectrometer (VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA).
  • the cell cycle was stained using 500 ⁇ l propidium iodide (PI) and RNase purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), followed by FACS Calibur system and CellQuest software (BD Biosciences, Flanklin Lakes). , NJ, USA) to determine the DNA content.
  • PI propidium iodide
  • RNase purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)
  • FACS Calibur system and CellQuest software BD Biosciences, Flanklin Lakes. , NJ, USA
  • doxorubicin When doxorubicin is treated with HK-2 cells, cells are seeded at 1x10 6 cells / ml in 96-well plates containing 1, 2, 4 and 8 ⁇ M of doxorubicin. And incubated for 24 hours. At this time, the control group was used to divide cells without dispensing doxorubicin in 96-well plate. After the wells 100 ⁇ l of each supernatant was transferred to a new 96-well plate and nitric oxide detection kit (Nitric Oxide Detection Kit, iNtRON Biotech, Gyeonggi-do, Korea) was used. The concentration of nitric oxide was calculated by measuring the absorbance at 540 nm using a microplate spectrometer (VersaMax, Molecular Devices).
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor-alpha
  • doxorubicin is treated by concentration (1, 2, 4, 8 ⁇ M) and using an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kit. As a control, cells not treated with doxorubicin were used.
  • control cells secrete 6.7 ⁇ 0.2 pg / ml, compared to the treatment of doxorubicin 1, 2, 4 and 8 ⁇ M TNF- ⁇ is 6.5 ⁇ 0.2, 7.6 ⁇ 0.3, It can be seen that 9.9 ⁇ 1.4 and 11.5 ⁇ 1.1 pg / ml secreted.
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • Western blot analysis was performed.
  • RT-PCR for measuring mRNA expression was first isolated from total RNA using RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), and total RNA by micro UV-Vis fluorescence spectrometer (Malcom, Tokyo, Japan). The concentration was detected.
  • Total RNA (1 ⁇ g) was converted to cDNA using cDNA Synthesis Master Mix (GenynPOT; Barker, TX, USA) and PCR was performed using GoTaq Green Master Mix (Promega). It was.
  • PCR conditions are shown in Table 1, primer sequences are shown in Table 2, and amplification was carried out in Veriti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystems). PCR products were isolated on 1% agarose gel stained with EtBr (Ethidium Bromide).
  • Primary antibodies include p-STAT3 (S), p-ERK, p-p38, p-JNK, p-p53, p-STAT (Y) (Cell Signaling Technology, Inc, Beverly, MA, USA), ATF3 (Santa) Rabbit bioclonal antibodies and BAD against Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA), p-CREB (Upstate com., Temcula, CA, USA) and BID (Chemicon International, Inc.
  • Temecula, CA, USA Rabbit monoclonal antibodies against p-PKA (Upstate com., Temecula, CA, USA), Apaf-1 and BAX (Millipore, Billerica, MA, USA) and Bcl-2 (Upstate com., Temecula, CA, USA) ), Mouse monoclonal antibodies against Cytochrome C (Chemicon International, Inc. Temecula, Calif., USA), MDM2 and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Calif., USA) were used.
  • the expression of p-PKA and Bcl-2 decreases in inverse proportion to the amount of doxorubicin, and the expression of p-STAT3 and ATF3 increases depending on the amount of doxorubicin.
  • anticancer agents and immunity such as doxorubicin, cisplatin and cyclosporin, in which the expression of ATF3 mRNA or protein is cytotoxic, It can be seen that the increase by the inhibitor.
  • the MTT assay was carried out by dehydrogenase to convert the yellow water-soluble MTT tetrazolium into a blue-purple non-aqueous MTT formazan (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide).
  • the absorbance of MTT formazan is maximum at a wavelength of 540 nm, and the absorbance measured at this wavelength refers to the concentration of live and metabolizing cells.
  • FIG. 7A As a result of MTT analysis for cell proliferation, as shown in FIG. 7A, ATF3 knockout cells were more resistant to the toxicity of doxorubicin, and cell proliferation was increased compared to wild type cells. In addition, as shown in FIGS. 7B and 7C, the toxicity of cisplatin and cyclosporin was further alleviated in ATF3 knockout cells, indicating that the cells grew well.
  • the ATF3 of the present invention can be used as a toxic marker, and is a good data showing a decisive role in toxic expression or toxicity control.
  • the cell cycle was measured in the same manner as in ⁇ Example 1-1>, and the percentage was calculated using Fluorescence Activated Cell Sorting (FACs). .
  • FACs Fluorescence Activated Cell Sorting
  • doxorubicin was shown to induce cell cycle arrest on cell cycle S phase and G2 / M in both wild type and knockout cells.
  • the cell distribution on sub G1 was shown to be the most reduced in the knockout control.
  • cytokine analysis was performed. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (eBioscience) were used to commercialize each cytokine concentration in the supernatant and serum of the culture medium. First, each well of the microplate was coated with 100 ⁇ l coating buffer. And incubated overnight at 4 ° C. The next day the microplates were washed, blocked with assay dilutions, and then bronchial alveolar lavage fluid, serum, or standard antibodies were added to individual wells and incubated at room temperature for 2 hours.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the interleukin-6 level of the control group was 4.1 ⁇ 0.2 pg / ml and 4.9 ⁇ 0.0 pg / ml in wild-type and ATF3 knockout cells, respectively, 166.4 ⁇ 24 hours treatment with 8 ⁇ M doxorubicin It can be seen that they increase to 3.8 pg / ml and 328.8 ⁇ 24.3 pg / ml.
  • the concentration of interleukin-6 in both wild-type and ATP3 knockout cells has been shown to increase depending on the amount of doxorubicin, but it can be seen that it is more markedly increased in ATF3 knockout MEF cells than in wild-type MEF cells.
  • mice were injected with 5 ⁇ 10 5 A549 cells (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) into the bronchus. Three weeks later, doxorubicin 2.5, 5, 10 mg / kg intraperitoneally injected into the mouse, sacrificed after 24 hours, kidney and liver tissue was extracted and Western blot was performed in the same manner as in ⁇ Example 1-4> Protein expression was measured.
  • apoptosis-related proteins including Apaf-1, BAD (Bcl-2-associated death promoter), cytochrome C, and p-p53, as shown in FIG. Significant increase was observed.
  • the expression level of ATF3 showed a significant increase in all doxorubicin doses tested, whereas the I ⁇ B ⁇ protein appeared to increase only after 10 mg / kg of doxorubicin.
  • the expression of MAP kinase-related proteins did not appear to change at all doxorubicin doses tested.
  • ATF3 of the present invention can be used as a marker for predicting toxicity by anticancer drugs, immunosuppressants, drugs or toxic substances in various human organs including the kidney, and when the expression of ATF3 is inhibited, the toxicity of toxic substances and drugs is alleviated. Therefore, it can be used as a target for the development of anticancer drugs, immunosuppressants and other drugs that can inhibit ATF3 and prevent cytotoxic side effects.
  • ATF3 Activating Transcription Factor 3 (ATF3) as a Novel Therapeutic

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Abstract

본 발명은 독성을 예측하거나 치료 타겟으로 사용되는 Activating Transcription Factor 3 (ATF3)에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명의 ATF3는 독성을 나타내는 부작용이 있는 항암 화학요법 치료제인 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 또는 면역억제제인 사이클로스포린(cyclosporin)이 처리된 세포에서 발현이 현저하게 증가하는 특징이 있으므로, 항암제나 면역억제제 또는 독성물질의 독성을 예측하거나 치료 타겟으로 사용될 수 있는 효과가 있다. 이에 따라, 신장을 비롯한 각종 인체 장기에서 항암제, 면역억제제, 약물 또는 독성물질들에 의한 독성 예측 마커로 ATF3를 활용할 수 있으며, ATF3의 발현을 억제할 경우 독성물질 및 약물들의 독성이 완화됨을 확인함에 따라 ATF3를 억제하여 세포 독성 부작용을 막을 수 있는 항암 치료제, 면역억제제 및 기타 약물 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

독성 예측 및 치료 타겟으로서의 Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ３（ＡＴＦ３）
본 발명은 항암 치료제를 포함하여 일반적 약물의 세포에 대한 독성을 예측할 수 있는 신규한 세포 독성 마커, 상기 독성 마커를 이용한 세포 독성의 예측 방법 및 세포 독성을 나타내는 물질의 독성 완화용 조성물에 관한 것이다.
최근 들어 현대인의 생활환경 개선과 식생활 변화에 따른 각종 성인병 질환이 급증하고 있으며, 과다 영양섭취 또는 불균형적인 식생활로 인하여 암, 동맥경화, 뇌졸중, 당뇨병, 고혈압 등의 만성적인 성인병 질환이 크게 증가되고 있는 추세이다. 특히 암은 과거부터 지금까지 주요 사망 원인으로 집계되고 있다.
암을 치료하는 방법으로 약물 요법, 수술 요법 및 방사선 요법 등이 주로 시술되고 있으며, 그 외에도 다양한 방법들이 시도되고 있다. 그러나 현재 사용되고 있는 암 치료제, 독소루비신(doxorubicin; 항암제이며 항생제)이나 시스플라틴(cisplatin; 항암제)과 같은, 치료 효과가 우수한 치료제는 암 세포 뿐만 아니라 정상 세포도 공격하는 문제점이 있고, 사이클로스포린(cyclosporin; 면역억제제이자 항진균제이며 류마티스 관절염 치료제)과 같은 면역억제제도 환자에게 각종 부작용을 유발시키는 문제점이 발생하고 있다.
따라서, 항암제를 비롯한 다양한 약물 또는 물질에서 세포 독성을 예측하거나 부작용을 감소시키기 위한 물질의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 정상 세포에 독성을 끼치는 부작용을 나타내는 항암치료제 및 면역억제제의 경우 ATF3의 활성이 현저하게 증가한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생물학적 시료에 존재하는 ATF3(Activating Transcription Factor 3) 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양을 측정하는 단계 및 상기 단계의 측정결과를 대조군 시료의 ATF3 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 세포 독성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ATF3(Activating Transcription Factor 3) 발현 억제제를 포함하는 항암 치료제의 독성 완화용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 ATF3(Activating Transcription Factor 3) 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양을 측정하는 단계 및 상기 단계의 측정결과를 대조군 시료의 ATF3 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 세포 독성을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 ATF3 유전자 발현양 측정은 상기 ATF3 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하는 것 이다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction) 및 노던 블럿(Northern blot)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ATF3 단백질 양을 측정은 상기 ATF3 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 측정은 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포 독성은 세포 독성을 나타내는 물질에 의해 정상세포에 야기되는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포 독성을 나타내는 물질은 항암제, 항생제, 면역억제제, 항진균제 및 류마티스 관절염 치료제로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
이에 더하여, 본 발명은 ATF3(Activating Transcription Factor 3) 발현 억제제를 포함하는 세포 독성을 나타내는 물질의 독성 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 세포 독성을 나타내는 물질은 항암제, 항생제, 면역억제제, 항진균제 및 류마티스 관절염 치료제로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
본 발명에 따른 ATF3는 항암 화학요법 치료제인 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin), 및 면역 억제제인 사이클로스포린 (cyclosporin 또는 cyclosporin A) 등에 의해 활성이 증가하는 것으로 확인됨에 따라 이들 화학요법제들에 의한 신장을 비롯한 각종 인체 장기에서의 독성 예측 마커로 ATF3를 활용할 수 있고, ATF3의 발현을 억제할 경우 독성물질 및 약물들의 독성이 완화됨을 확인함에 따라 ATF3를 억제하여 세포 독성 부작용을 막을 수 있는 항암 치료제 또는 기타 세포 독성 부작용이 없는 치료제 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 독소루비신 처리 양에 따른 HK-2 세포증식을 나타낸 것이다.
도 2는 독소루비신 처리 시 세포주기를 관찰한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 대조군(독소루비신 처리안함), (B)는 독소루비신 1μM 처리, (C)는 독소루비신 2μM 처리, (D)는 독소루비신 4μM 처리, (E)는 독소루비신 8μM을 처리한 결과이다.
도 3은 독소루비신 처리 시 산화질소 (NO)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 독소루비신 처리 시 TNF-α 의 농도를 측정한 그래프이다.
도 5는 (A) 독소루비신의 농도 별 처리 후 발현되는 단백질 양 및 (B) 독소루비신 처리 후 시간에 따른 단백질 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 독소루비신, 시스플라틴, 사이클로스포린 A의 농도별 처리 시 ATF3의 mRNA 및 단백질량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ATF3 녹아웃(knock-out) 세포에 (A)독소루비신, (B) 시스플라틴 및 (C) 사이클로스포린을 처리하였을 때 세포 증식을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 독소루비신 처리 후 (A)야생형(wild-type), (B) 독소루비신 처리 야생형, (C) ATF3 녹아웃 대조군 및 (D) 독소루비신 처리 ATF3 녹아웃 세포에서의 세포주기를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 야생형 및 ATF3 녹아웃 세포에서 독소루비신의 농도별 처리에 따른 인터루킨-6의 농도를 측정한 그래프이다.
도 10은 폐암이 유도된 마우스에 세포 독성이 있는 항암치료제 독소루비신을 처리하고 단백질 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 ATF3와 세포 독성의 관련성을 규명한 것으로서, 보다 구체적으로 ATF3 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 ATF3 단백질로 이루어진 세포 독성 예측용 마커를 제공함에 그 특징이 있다.
Activating Transcription Factor 3 (ATF3) 는 세균들의 lipopolysaccharides (LPS)에 의해서 대식세포에서 유도되며, ATF/cAMP responsive element-binding (CREB) 단백질 family 중의 하나이다. 대식세포에 의해서 생성되는 NO와 interleukin-6 (IL-6), IL-12를 억제하는 기능이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 세포 독성을 나타내는 부작용이 있는 것으로 알려져 있는 독소루비신, 시스플라틴, 또는 사이클로스포린을 인간 신장 근위세뇨관 세포주 HK-2에 처리한 결과, S 및 G2/M 상에서 세포 축적을 유도하며, ATF3 유전자 및 단백질 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포 독성을 예측하는 방법을 제공할 수 있다:
(a) 생물학적 시료에 존재하는 ATF3(Activating Transcription Factor 3) 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 ATF3 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양과 비교하는 단계.
상기에서 ATF3 유전자의 발현수준 또는 ATF3 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 세포 독성 부작용이 의심되는 물질을 처리한 ATF3 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준을 정상 대조군과 비교하기 위한, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 ATF3 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 ATF3 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 ATF3 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 ATF3 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 세포 독성을 나타내는 물질을 처리한 생체 시료에서의 ATF3 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 항암 치료제의 정상세포에의 세포 독성을 예측할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 ATF3 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었고, ATF3 단백질의 아미노산서열은 서열번호 2에 나타내었다.
본 발명에서 제공하는 세포 독성 예측용 마커는 ATF3 유전자 또는 단백질의 발현양을 증가시키는 세포 독성을 나타내는 물질을 탐지하는 것으로서, 상기 세포 독성을 나타내는 물질이란 정상 세포에 독성을 나타내는 물질을 모두 포함하며, 이에 한정되지는 않으나 바람직하게는 항암제, 항생제, 면역억제제, 항진균제 또는 류마티스 관절염 치료제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 독소루비신(Doxorubicin), 시스플라틴(Cisplatin) 또는 사이클로스포린(Cyclosporin)일 수 있다.
또한, 본 발명은 ATF3 유전자의 수준 또는 ATF3 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 세포 독성을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 ATF3 유전자의 수준은, 바람직하게 ATF3 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 ATF3 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 ATF3 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 ATF3 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 ATF3 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하고, 바람직하게는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 가지는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction), 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA), 노던 블럿(Northern blot) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "프로브"라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 ATF3 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 ATF3 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 세포 독성을 예측할 수 있는 마커 단백질로서 ATF3 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 ATF3 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
세포 독성을 가지는 약물이 HK-2 세포에 미치는 영향
<1-1> 세포 증식 및 세포 주기 측정
독소루비신이 신장독성을 야기하는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 인간 신장 근위세뇨관 세포주인 HK-2 세포에 독소루비신을 처리하여 세포증식을 관찰하였다. 정상 신장에서 유래한 근위세뇨관 세포주인 HK-2는 미국세포주은행 (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 세포주은행에서 추천하는 배지인, 항생제 (1% 페니실린/스트렙토마이신) 및 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS)을 사용하여 10 mm 플레이트에서, 5% CO2를 함유한 37℃ 습윤 배양기를 이용하여 배양하였다.
세포증식은 비색식 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 용액 (Cell Titer 96®, Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 결정하였는데, 세포 (1x104 cells/well)를 96-웰 플레이트에 분배하고, 24 시간 안정화 시킨 다음 1, 2, 4 및 8 μM 독소루비신으로 24 시간 처리하였으며, 노출 말기에 MTS 용액 (20 μl/well)을 첨가하여 세포를 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 후, 490 nm에서 각 웰의 광학 밀도를 마이크로플레이트 분광계 (VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정함으로써 세포증식을 관찰하였다.
세포주기는 시그마알드리치 (St. Louis, MO, USA)에서 구입한 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI) 500μl 및 RNase를 사용하여 세포를 염색한 다음 FACS Calibur 시스템 및 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences, Flanklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 DNA 함량을 측정함으로써 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 세포증식은 독소루비신 처리 양에 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있고, 8 μM 독소루비신 처리군에서는 대조군의 62.5 ± 5.3 % 수준까지 세포증식이 감소하는 것으로 나타났다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 모든 실험군에서 농도와 상관없이 독소루비신의 처리 시 세포주기 S 및 G2/M 상의 세포수가 증가되는 것을 알 수 있다(도 2A: 대조군, 도 2B: 독소루비신 1μM, 도 2C: 독소루비신 2μM, 도 2D: 독소루비신 4μM, 도 2E: 독소루비신 8μM).
<1-2> 산화질소(NO) 분비 측정
HK-2 세포에 독소루비신을 처리할 경우, 산화질소를 분비하는지 여부를 알아보기 위해, 1, 2, 4 및 8 μM의 독소루비신을 분주한 96-웰 플레이트에 세포를 1x106 cells/ml 밀도로 분주하고 24시간동안 배양하였다. 이 때, 대조군으로는 96-웰 플레이트에 독소루비신을 분주하지 않고 세포를 분주한 것을 이용하였다. 웰 이후 각 웰의 상층액 100 μl를 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고 산화질소 검출 키트 (Nitric Oxide Detection Kit, iNtRON Biotech, 경기도, 한국)를 사용하였다. 그리고 마이크로플레이트 분광기 (VersaMax, Molecular Devices)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정함으로써 산화질소의 농도를 계산하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 1, 2, 4 및 8 μM 처리시 각각 대조군에 비해 125.8 ± 7.9, 135.0 ± 16.1, 171.6 ± 20.6, 및 271.8 ± 53.7%의 값을 나타내는 것을 확인하고, 독소루비신 처리 양에 의존적으로 산화질소 (NO)의 농도가 증가되는 것을 알 수 있었다.
<1-3> 종양괴사인자-알파(TNF-α) 분비 측정
HK-2 세포에 독소루비신을 처리할 경우 TNF-α 를 분비하는지 여부를 알아보기 위해, 독소루비신을 농도별(1, 2, 4, 8μM)로 처리하고, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 사용하여 분석하였으며, 대조군으로는 독소루비신을 처리하지 않은 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군 세포에서는 6.7±0.2 pg/ml가 분비되는 데 비해, 독소루비신 1, 2, 4 및 8 μM 처리 시, TNF-α가 각각 6.5 ± 0.2, 7.6 ± 0.3, 9.9 ± 1.4 및 11.5 ± 1.1 pg/ml 분비되는 것을 알 수 있다.
상기로부터, 본 발명자들은 독소루비신 처리 양에 비례하여 TNF-α의 분비가 증가한다는 것을 알 수 있었다.
<1-4> 세포 독성 약물 처리에 따른 단백질 및 mRNA 발현 측정
HK-2 세포에 세포 독성을 나타내는 약물 독소루비신, 시스플라틴 및 사이클로스포린 mRNA 및 단백질의 발현을 알아보기 위해, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)과 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. mRNA의 발현을 측정하기 위한 RT-PCR은, 우선 RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 총 RNA를 분리하고, 마이크로 UV-Vis 형광 분광계 (Malcom, Tokyo, Japan)로 총 RNA 농도를 검출하였다. 총 RNA (1 μg)는 cDNA 합성 마스터 믹스 (Synthesis Master Mix, GenDEPOT; Barker, TX, USA)를 이용하여 cDNA로 전환하고, GoTaq 그린 마스터 믹스(GoTaq Green Master Mix, Promega)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 하기 표 1과 같고, 프라이머 서열은 하기 표 2와 같으며, 증폭은 Veriti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystems)에서 실시하였다. PCR 산물은 EtBr(Ethidium Bromide)으로 염색된 1% 아가로즈 겔에서 분리하였다.
표 1
Initially Denatured 2 min at 95℃
Denatured 30 sec 95℃ 30 cycle
Annealing 30 sec at 55℃
Extension 1 min at 72℃
Final Extension 5 min 72℃
표 2
프라이머 서열 서열번호
DLX2 Forward 5'-ATGCACTCGACCCAGATCG-3' 3
Reverse 5'-GGCTTGGTACTGGTAGGAACC-3' 4
ATF3 Forward 5'-GAGGATTTTGCTAACCTGACGC-3' 5
Reverse 5'-CTACCTCGGCTTTTGTGATGG-3' 6
GAPDH Forward 5'-GGGGTGAGGCCGGTGCTGAGTAT-3' 7
Reverse 5'-TGGGGGTAGGAACACGGAAGG-3' 8
또한, 단백질 발현을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 실시하였는데, 세포 펠렛을 단백질 추출 용액 (PRO-PREPTM, Cat. No. 17081, iNtRON Biotechnology)으로 균질화하고, 분쇄물을 13000 rpm에서 10 분간 원심 분리하였다. 수득한 단백질 농도는 브래드포드 법 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)으로 측정하고, 40μg으로 단백질 양을 동일하게 하여 1% 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤(SDS-PAGE gel) 상에서 분리한 후 니트로셀룰로즈 막 (Nitrocellulose membrane, Hybond ECL; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 그리고 5% (w/v) 탈지유-TTBS 완충액(0.05% Tween-20, 10 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl)에서 2 시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)한 다음 상기 막은 1/1000로 희석한 일차 특이 항체로 면역 블랏 시켰다. 일차항체로는 p-STAT3(S), p-ERK, p-p38, p-JNK, p-p53, p-STAT(Y) (Cell Signaling Technology, Inc, Beverly, MA, USA), ATF3 (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA), p-CREB (Upstate com., Temcula, CA, USA) 및 BID (Chemicon International, Inc. Temecula, CA, USA)에 대한 토끼 다중클론성 항체와 BAD, p-PKA (Upstate com., Temecula, CA, USA), Apaf-1 및 BAX (Millipore, Billerica, MA, USA)에 대한 토끼 단일클론성 항체와 Bcl-2 (Upstate com., Temecula, CA, USA), Cytochrome C (Chemicon International, Inc. Temecula, CA, USA), MDM2 및 β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)에 대한 마우스 단일클론성 항체를 사용하였다. 이차항체로는 1/2000로 희석시킨 항-마우스, 항-토끼, 또는 항-염소 면역글로불린 G-양고추냉이 페록시다제 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 사용하여 반응시켰다. 반응 후에는 TTBS 완충액으로 세척하고, ECL 웨스턴 블라팅 검출 시스템을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 독소루비신의 양에 반비례하여 p-PKA 및 Bcl-2의 발현은 감소하고, 독소루비신의 양에 의존적으로 p-STAT3와 ATF3의 발현은 증가한다는 것을 알 수 있다.
또한, 독소루비신 처리 후 시간에 따라 MDM2와 Bcl-2의 발현을 측정한 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, 2시간 경과하였을 때 정점을 가지며 이후로는 감소하는 것으로 나타났고, p-PKA 및 p-p38의 발현은 처리 후 6시간에 정점을 가지는 것으로 나타났다.
이에 더하여, 독소루비신, 시스플라틴 및 사이클로스포린 처리에 따른 ATF3 mRNA 및 단백질의 발현을 측정한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, ATF3 mRNA 또는 단백질의 발현이 세포 독성을 나타내는 독소루비신, 시스플라틴 및 사이클로스포린과 같은 항암제 및 면역억제제에 의해 증가하는 것을 알 수 있다.
<실시예 2>
약물 부작용으로 유도된 신장독성에서 ATF3의 역할 분석
본 발명의 ATF3가 신장 독성에서 어떠한 역할을 하는지 규명하기 위해, ATF3가 녹아웃 된 세포를 이용하여 다음과 같은 반증실험을 수행하였다.
<2-1> 야생형 및 ATF3 녹아웃 MEF 세포에서의 세포 증식 및 단백질 발현
야생형(wild-type) 및 ATF3 유전자 녹아웃(knock-out) MEF(mouse embryonic fibroblasts, 마우스 배아 섬유아세포)를 이용하여, 독소루비신(Doxorubicin), 시스플라틴(Cisplatin) 및 사이클로스포린(Cyclosporin)을 각각 농도별로 세포에 처리하고, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) 분석을 통해 세포 증식을 비교하였다. MTT 분석은 탈수소 효소작용에 의해, 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로써, MTT formazan의 흡광도는 540nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 활발한 세포의 농도를 의미한다.
세포 증식을 알아보기 위해 MTT 분석을 수행한 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, 야생형 세포에 비해 ATF3 녹아웃 세포가 독소루비신의 독성에 대해 내성을 가지며, 세포 증식도 더 증가되는 것으로 나타났다. 또한, 도 7B 및 7C에 나타난 바와 같이, 시스플라틴과 사이클로스포린의 독성도 ATF3 녹아웃 세포에서 더 완화되어 세포가 잘 자라는 것으로 나타났다.
상기로부터, 본 발명의 ATF3가 독성마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있으며, 독성 발현, 또는 독성 제어에 결정적 역할을 보여주는 좋은 자료이다.
<2-2> 야생형 및 ATF3 녹아웃 MEF에서의 세포주기
MEF세포에서 ATF3가 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 <실시예 1-1>과 같은 방법으로 세포주기를 측정하였으며, 형광 유세포 분석기(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACs)를 이용해 %를 계산하였다.
표 3
(Unit: %)
야생형(대조군) 야생형(독소루비신 8 μM) 녹아웃(대조군) 녹아웃(독소루비신 8 μM)
Sub G1 7.6 ± 1.8 5.3 ± 1.6 17.7 ± 6.1 5.4 ± 0.6
G1 55.2 ± 3.6 34.2 ± 9.9 41.9 ± 0.0 31.1 ± 2.1
S 14.6 ± 1.3 20.6 ± 5.0 13.6 ± 0.4 26.6 ± 1.3
G2 22.8 ± 3.2 40.0 ± 6.4 26.8 ± 5.7 37.0 ± 4.1
**P < 0.01, *P < 0.05.
그 결과, 도 8 및 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 독소루비신은 야생형 및 녹아웃 세포 모두에서 세포주기 S 상과 G2/M 상에서 세포주기 정지를 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, sub G1 상에서의 세포 분포는 녹아웃 대조군에서 가장 감소하는 것으로 나타났다.
<2-3> 야생형 및 ATF3 녹아웃 MEF 세포에서 인터루킨-6 농도 측정
MEF 세포에서 독소루비신 처리에 따른 인터루킨-6의 농도를 측정하기 위해, 사이토카인 분석을 실시하였다. 배양 배지의 상층액 및 혈청 내의 각 사이토카인 농도를 시판되고 있는 효소 면역특정 키트 (enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit, eBioscience)를 사용하였는데, 우선 마이크로플레이트의 각 웰을 100 μl 코팅 완충액으로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날 마이크로플레이트를 세척하고, 분석 희석액으로 블로킹(blocking)한 다음, 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid), 혈청, 또는 표준 항체를 개별 웰에 첨가하여 실온에 2 시간 배양하였다. 이후 플레이트를 세척하고, 비오틴화시킨 인터루킨-6 검출 항체를 각 웰에 첨가하여 다시 실온에서 1시간 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 다시 세척하고 아비딘-양고추냉이 페록시다제(avidin-horseradish peroxidase)로 30분간 처리한 후 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘 용액으로 검출하였다. 마지막으로, 1 M H3PO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, ELISA 판독기 (Molecular Devices)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 사이토카인의 양은 표준 곡선의 직선으로부터 계산하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군의 인터루킨-6 수준은 야생형 및 ATF3 녹아웃 세포에서 각각 4.1 ± 0.2 pg/ml 및 4.9 ± 0.0 pg/ml이었고, 8μM 독소루비신으로 24시간 처리 시에는 각각 166.4 ± 3.8 pg/ml 및 328.8 ± 24.3 pg/ml로 증가하는 것을 알 수 있다.
야생형 및 ATP3 녹아웃 세포 모두에서 인터루킨-6의 농도는 독소루비신 양에 의존적으로 증가하는 것으로 나타났지만, 야생형 MEF 세포에서 보다 ATF3 녹아웃 MEF 세포에서 더욱 두드러지게 증가하는 것을 알 수있다.
<실시예 3>
동물모델에서 독소루비신 주입 후 단백질 발현 측정
독소루비신에 의해 야기된 신장독성과 관계된 단백질을 알아보기 위해, 동물모델에서 단백질 발현을 측정하였다. 5주령 ICR 마우스 (25±2 g)를 Orient Bio Inc (경기도, 한국)에서 구입하여 1주일 동안 실험 환경 조건에 순응시켰다. 환경조건은 23±1℃의 항온, 55±5%의 상대습도, 12 시간 명암 주기에서 조절하였다. 동물실험은 국립수의과학검역원(NVRQS)의 동물실험윤리위원회에서 간행된 “실험 동물의 관리와 사용에 관한 가이드”에서 개시된 원칙에 따라서 관리되었다. 마우스에 5x105개의 A549 세포 (아데노암종 인간 폐포 기저 상피세포, adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells)를 기관지 내로 주입하였다. 3주 후 독소루비신 2.5, 5, 10 mg/kg을 마우스에 복강내 주사하고, 24시간 후에 희생시킨 다음 신장과 간 조직을 추출하여 상기 <실시예 1-4>와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 발현을 측정하였다.
폐암이 유도된 마우스에 독소루비신을 처리한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, Apaf-1, BAD (Bcl-2-associated death promoter), cytochrome C, p-p53을 포함한 세포자살 관련 단백질의 발현이 눈에 띄게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이에 더하여, ATF3의 발현 수준은 시험된 모든 독소루비신 용량에서 현저한 증가를 나타낸 반면, IκBα 단백질은 독소루비신을 10 mg/kg 처리했을 경우에만 증가하는 것으로 나타났다. 또한, MAP 키나아제 관련 단백질의 발현은 시험된 모든 독소루비신 용량에서 변하지 않는 것으로 나타났다.
상기로부터, 암을 유발시킨 동물모델에서 항암제인 독소루비신을 투여했을 때, ATF3의 발현이 현저하게 증가할 뿐 아니라 세포독성을 나타내는 것을 세포실험 뿐만 아니라 동물실험에서도 확인하였으며, 이는 본 발명의 ATF3가 세포 독성 마커로 사용될 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 ATF3는 신장을 비롯한 각종 인체 장기에서 항암제, 면역억제제, 약물 또는 독성물질들에 의한 독성 예측 마커로 이용할 수 있으며, ATF3의 발현을 억제할 경우 독성물질 및 약물들의 독성이 완화되는 효과가 있으므로 ATF3를 억제하여 세포 독성 부작용을 막을 수 있는 항암 치료제, 면역억제제 및 기타 약물 개발을 위한 표적으로 이용할 수 있다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Activating Transcription Factor 3(ATF3) as a Novel Therapeutic
Target and for Predicting Toxicity
<130> PCT01424
<150> KR 10-2012-0022806
<151> 2012-03-06
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 546
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgatgcttc aacacccagg ccaggtctct gcctcggaag tgagtgcttc tgccatcgtc 60
ccctgcctgt cccctcctgg gtcactggtg tttgaggatt ttgctaacct gacgcccttt 120
gtcaaggaag agctgaggtt tgccatccag aacaagcacc tctgccaccg gatgtcctct 180
gcgctggaat cagtcactgt cagcgacaga cccctcgggg tgtccatcac aaaagccgag 240
gtagcccctg aagaagatga aaggaaaaag aggcgacgag aaagaaataa gattgcagct 300
gcaaagtgcc gaaacaagaa gaaggagaag acggagtgcc tgcagaaaga gtcggagaag 360
ctggaaagtg tgaatgctga actgaaggct cagattgagg agctcaagaa cgagaagcag 420
catttgatat acatgctcaa ccttcatcgg cccacgtgta ttgtccgggc tcagaatggg 480
aggactccag aagatgagag aaacctcttt atccaacaga taaaagaagg aacattgcag 540
agctag 546
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Met Leu Gln His Pro Gly Gln Val Ser Ala Ser Glu Val Ser Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ile Val Pro Cys Leu Ser Pro Pro Gly Ser Leu Val Phe Glu
20 25 30
Asp Phe Ala Asn Leu Thr Pro Phe Val Lys Glu Glu Leu Arg Phe Ala
35 40 45
Ile Gln Asn Lys His Leu Cys His Arg Met Ser Ser Ala Leu Glu Ser
50 55 60
Val Thr Val Ser Asp Arg Pro Leu Gly Val Ser Ile Thr Lys Ala Glu
65 70 75 80
Val Ala Pro Glu Glu Asp Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Arg Asn
85 90 95
Lys Ile Ala Ala Ala Lys Cys Arg Asn Lys Lys Lys Glu Lys Thr Glu
100 105 110
Cys Leu Gln Lys Glu Ser Glu Lys Leu Glu Ser Val Asn Ala Glu Leu
115 120 125
Lys Ala Gln Ile Glu Glu Leu Lys Asn Glu Lys Gln His Leu Ile Tyr
130 135 140
Met Leu Asn Leu His Arg Pro Thr Cys Ile Val Arg Ala Gln Asn Gly
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Asp Glu Arg Asn Leu Phe Ile Gln Gln Ile Lys Glu
165 170 175
Gly Thr Leu Gln Ser
180
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLX2 Forward Primer
<400> 3
atgcactcga cccagatcg 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLX2 Reverse Primer
<400> 4
ggcttggtac tggtaggaac c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF3 Forward Primer
<400> 5
gaggattttg ctaacctgac gc 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATF3 Reverse Primer
<400> 6
ctacctcggc ttttgtgatg g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward Primer
<400> 7
ggggtgaggc cggtgctgag tat 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse Primer
<400> 8
tgggggtagg aacacggaag g 21

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 세포 독성을 예측하는 방법:
    (a) 생물학적 시료에 존재하는 ATF3(Activating Transcription Factor 3) 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 ATF3 유전자의 발현양 또는 ATF3 단백질의 양과 비교하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 ATF3 유전자 발현양 측정은 상기 ATF3 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 및 노던 블럿(Northern blot)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 ATF3 단백질 양을 측정은 상기 ATF3 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 측정은 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 독성은 세포 독성을 나타내는 물질에 의해 정상세포에 야기되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 세포 독성을 나타내는 물질은 항암제, 항생제, 면역억제제, 항진균제, 및 류마티스 관절염 치료제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. ATF3(Activating Transcription Factor 3) 발현 억제제를 포함하는, 세포 독성을 나타내는 물질의 독성 완화용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 세포 독성을 나타내는 물질은 항암제, 항생제, 면역억제제, 항진균제, 및 류마티스 관절염 치료제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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