WO2023191264A1 - O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법 - Google Patents

O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법 Download PDF

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acetyl homoserine
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polypeptide
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김주은
김예은
이재민
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01001—Amino-acid N-acetyltransferase (2.3.1.1)

Definitions

  • the present application relates to microorganisms with weakened GNAT family N-acetyltransferase protein activity; Method for producing O-acetyl homoserine and L-methionine using this; A composition for producing O-acetyl homoserine containing the above microorganisms; and the use of said microorganism for producing O-acetyl homoserine or L-methionine.
  • O-acetyl homoserine acts as a precursor for methionine, a type of essential amino acid in vivo.
  • Methionine is a type of essential amino acid in living organisms and is widely used not only as feed and food additives but also as a synthetic raw material for infusion solutions and pharmaceuticals.
  • Methionine is produced through biological and chemical synthesis.
  • a two-step process for producing L-methionine through an enzymatic conversion reaction from an L-methionine precursor produced through fermentation has been known (International Publication No. WO2008/013432).
  • O-succinyl homoserine and O-acetyl homoserine can be used as methionine precursors. Accordingly, it is very important to produce O-acetylhomoserine in high yield for economical mass production of methionine.
  • the present inventors completed the present application by developing a microorganism of the genus Corynebacterium that produces O-acetyl homoserine and a method for producing O-acetyl homoserine or L-methionine using the same.
  • One purpose of the present application is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium with weakened GNAT family N-acetyltransferase protein activity and the ability to produce O-acetyl homoserine.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing O-acetyl homoserine comprising culturing the microorganism in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing L-methionine comprising culturing the microorganism in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a composition for producing O-acetyl homoserine containing the above microorganism.
  • Another object of the present application is to provide a use of the microorganism of the present application for producing O-acetyl homoserine or L-methionine.
  • the microorganism producing O-acetyl homoserine of the present application can produce O-acetyl homoserine in an environmentally friendly and highly efficient manner compared to chemical synthesis.
  • the produced O-acetyl homoserine can be used as a precursor for the synthesis of methionine and acetic acid by O-acetyl homoserine sulfhydrylase to bioconvert L-methionine with high efficiency, and the converted L-methionine can be used in animals. It can be widely used in the production of human food or food additives, as well as feed or animal feed additives.
  • One aspect of the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium having weakened GNAT family N-acetyltransferase protein activity and the ability to produce O-acetyl homoserine.
  • GNAT family N-acetyltransferase refers to an N-acetyltransferase belonging to the GNAT (Gcn5-Related N-Acetyltransferases) family.
  • the GNAT family N-acetyltransferase is known in the art, and protein and gene sequences of the GNAT family N-acetyltransferase can be obtained from known databases, such as NCBI's GenBank, etc. However, it is not limited to this. More specifically, the GNAT family N-acetyltransferase may have and/or include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or may essentially consist of or be composed of the amino acid sequence.
  • the protein consisting of SEQ ID NO: 1 may refer to a protein that is inherently present in microorganisms of the genus Corynebacterium encoded by the known NCgl0959 gene, but is not limited thereto, and specifically refers to a protein of the genus Corynebacterium.
  • GNAT family N-acetyltransferase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that is endogenously present in microorganisms, more specifically, GNAT family N-acetyltransferase of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 encoded by the NCgl0959 gene. It may refer to a transferase, but is not limited thereto.
  • the GNAT family N-acetyltransferase of the present application has not only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but also at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% of SEQ ID NO: 1. It may include an amino acid sequence having more than %, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity.
  • polypeptide or protein comprising an amino acid sequence described in a specific sequence number
  • polypeptide or protein composed of an amino acid sequence described in a specific sequence number or ‘polypeptide or protein having an amino acid sequence described in a specific sequence number’.
  • a protein with an amino acid sequence in which part of the sequence is deleted, modified, substituted, conservatively substituted, or added can also be used in the present application.
  • the amino acid sequence may have a sequence added to the N-terminus and/or C-terminus that does not change the function of the protein, a naturally occurring mutation, a silent mutation, or a conservative substitution. .
  • conservative substitution means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. These amino acid substitutions may generally occur based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • Negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartate
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan, and tyrosine
  • hydrophobic amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan.
  • amino acids can be classified into amino acids with electrically charged side chains and amino acids with uncharged side chains.
  • Amino acids with electrically charged side chains include aspartic acid, glutamic acid, lysine, Amino acids that include arginine and histidine and have uncharged side chains can be further classified as nonpolar amino acids or polar amino acids.
  • Nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine. Methionine, phenylalanine. Tryptophan, proline, and polar amino acids can be classified to include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • conservative substitutions have little or no effect on the activity of the resulting polypeptide.
  • conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
  • GNAT family N-acetyltransferases may contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • a polypeptide can be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of a protein that is involved in protein transfer, co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and may be used with a default gap penalty established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing to all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with a polynucleotide containing a common codon or a codon taking codon degeneracy into account.
  • Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity, or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: It can be determined using a known computer algorithm such as the "FASTA” program using default parameters as in 2444. Or, as performed in the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: Weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) permutation matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a recited position in a polypeptide, or to an amino acid residue that is similar, identical, or homologous to a recited residue in a polypeptide. Identifying the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid in the sequence that refers to the specific sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
  • an arbitrary amino acid sequence can be aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue in the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue in SEQ ID NO: 1.
  • sequence alignment algorithms such as those described in this application can identify the positions of amino acids or where modifications such as substitutions, insertions, or deletions occur compared to a query sequence (also referred to as a “reference sequence”).
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), etc. may be used, but are not limited thereto, and sequence alignment programs and pairwise sequence comparison algorithms known in the art may be appropriately used.
  • O-acetylhomoserine refers to a specific intermediate material in the microbial methionine biosynthetic pathway and an acetyl-derivative of L-homoserine.
  • the O-acetyl homoserine can be produced by enzyme activity that transfers the acetyl group of acetyl-CoA to homoserine using homoserine and acetyl-CoA as substrates.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and can be caused by insertion of foreign genes or enhanced or inactivated activity of intrinsic genes. It is a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein, or product.
  • microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine refers to a prokaryotic or eukaryotic microbial strain capable of producing O-acetyl homoserine within a living organism, and the parent strain that does not have the ability to produce O-acetyl homoserine is O-. Includes microorganisms endowed with the ability to produce acetylhomoserine, or microorganisms that inherently have the ability to produce O-acetylhomoserine. O-acetylhomoserine production capacity can be imparted or enhanced by species improvement.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine may be a strain producing L-lysine, L-threonine, L-isoleucine or L-methionine, or may be derived from a strain thereof, but is not limited thereto.
  • the microorganism producing O-acetylhomoserine is characterized in that the activity of the GNAT family N-acetyltransferase protein is weakened compared to the intrinsic activity, and the desired O-acetylhomoserine production ability is increased. It may be a genetically modified microorganism or a recombinant microorganism, but is not limited thereto.
  • the recombinant strain with increased O-acetylhomoserine production ability has an increased O-acetylhomoserine production ability compared to a natural wild-type microorganism or an unmodified microorganism with intrinsic activity of the GNAT family N-acetyltransferase protein. It may be a microorganism, but is not limited thereto.
  • the microorganism that produces O-acetylhomoserine is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 of SEQ ID NO: 1. It may be a microorganism that inherently contains a protein consisting of an amino acid sequence with %, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% or more homology or identity.
  • the microorganism that produces O-acetylhomoserine is a polynucleotide sequence capable of encoding a protein containing an amino acid sequence with at least 80% homology to SEQ ID NO: 1, the base sequence of SEQ ID NO: 2, or Homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 2 is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and 100%. It may be a microorganism that inherently contains a base sequence that is less than .
  • the microorganism with increased production capacity is about 1% or more, specifically about 1%, compared to the O-acetyl homoserine production capacity of the parent strain before mutation or an unmodified microorganism with intrinsic activity of the GNAT family N-acetyltransferase protein.
  • the recombinant strain with increased production capacity has an O-acetyl homoserine production capacity of about 1.1 times or more, about 1.2 times or more, about 1.21 times or more, or about 1.22 times or more, compared to the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
  • the increase may be 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, about 2 times or less, about 1.5 times or less, or about 1.4 times or less), but is not limited thereto.
  • non-modified microorganism does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is either a wild-type strain or a natural strain itself, or a strain that has a genetic mutation caused by natural or artificial factors. It may refer to the strain before change.
  • the unmodified microorganism may refer to a strain in which the GNAT family N-acetyltransferase protein activity described herein is not weakened or is not weakened compared to the intrinsic activity.
  • non-modified microorganism may be used interchangeably with “pre-transformed strain”, “pre-transformed microorganism”, “non-mutated strain”, “non-modified strain”, “non-mutated microorganism” or “reference microorganism”.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but may specifically be a prokaryotic cell.
  • the prokaryotic cells are, for example, Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., and Corynebacterium genus.
  • Corynebacteria sp. Pseudomonas sp., Leptospira , Salmonella sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacter Microorganism strains belonging to the genus Chromobacterium sp. and Norcardia sp., or fungi or yeast may be included. Specifically, they are microbial strains and yeast of the genus Escherichia, Corynebacterium, and Leptospira. More specifically, it may be a microbial strain of the genus Corynebacterium .
  • microorganisms of the genus Corynebacterium may include all microorganisms of the genus Corynebacterium. Specifically, Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium crudilactis ( Corynebacterium deserti ), Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae , Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans , Corynebacterium Corynebacterium striatum , Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , Corynebacterium testudino It may be Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens , and more specifically, it may be Corynebacterium glutamicum.
  • the unmodified microorganism may be a microorganism containing an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 2.
  • the microorganisms of the Corynebacterium genus that produce O-acetyl-homoserine in the present application are natural wild-type microorganisms themselves, improved O-acetyl-homoserine by strengthening or weakening the activity of genes related to the O-acetyl-homoserine production mechanism.
  • the term “weakening” of polypeptide activity is a concept that includes both reduced activity or no activity compared to the intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, and attenuation.
  • the weakening may be, but is not limited to, inactivation.
  • the inactivation may mean that the protein is not expressed at all compared to the parent strain or a strain in which the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO. 1 is not modified, or even if expressed, its activity is absent or reduced.
  • the weakening occurs when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide originally possessed by the microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, inhibition of expression of the gene of the polynucleotide encoding the polypeptide, or translation into a polypeptide.
  • the overall polypeptide activity level and/or concentration (expression amount) in the cell is lower than that of the natural strain due to (translation) inhibition, etc., when the polynucleotide is not expressed at all, and/or when the polynucleotide expression is low Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
  • the “intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain, wild type, or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before modification.”
  • activity before modification The fact that the activity of a polypeptide is "inactivated, depleted, reduced, downregulated, reduced, or attenuated” compared to the intrinsic activity means that it is lowered compared to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation.
  • Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by applying various methods well known in the art (e.g., Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • Deletion of part or all of the gene encoding the polypeptide may be removal of the entire polynucleotide encoding the target polypeptide endogenous in the chromosome, replacement with a polynucleotide with some nucleotides deleted, or replacement with a marker gene.
  • the above 2) modification of the expression control region is a mutation in the expression control region (or expression control sequence) caused by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, or a weaker mutation. It may be replacement with an active sequence.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide.
  • a combination thereof may result in a mutation in the sequence, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • gene expression can be inhibited or weakened by introducing a mutation in the polynucleotide sequence to form a stop codon, but is not limited thereto.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon with a lower polypeptide expression rate compared to the internal start codon. It may be a substitution by sequence, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide e.g., antisense RNA
  • antisense RNA binds complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • the microorganism having O-acetyl homoserine production ability of the present application may be one with inactivated GNAT family N-acetyltransferase protein activity, but is not limited thereto.
  • a method of deleting part or all of the gene encoding the protein can be used. Specifically, it can be performed by replacing the polynucleotide encoding the target protein endogenous in the chromosome with a polynucleotide or marker gene in which some nucleotide sequences have been deleted through a vector for insertion into a microorganism's chromosome.
  • a method for deleting part or all of a polynucleotide a method for deleting a polynucleotide by homologous recombination may be used, but is not limited thereto.
  • the method of deleting part or all of the gene can be performed by inducing a mutation using light such as ultraviolet rays or chemicals, and selecting a strain lacking the target gene from the obtained mutant.
  • the gene deletion method includes a method using genetic recombination technique. For example, this can be achieved by injecting a polynucleotide sequence or vector containing a polynucleotide sequence homologous to the target gene into the microorganism to cause homologous recombination. Additionally, the injected polynucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker. However, it is not limited to this.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or more, which is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the variant. refers to a polynucleotide fragment.
  • the GNAT family N-acetyltransferase may be encoded by a gene containing the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. More specifically, the GNAT family N-acetyltransferase has and/or includes the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, is essentially composed of, or is produced by a gene consisting of the polynucleotide sequence. It may be encrypted, but is not limited to this.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a gene or polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • it can be used in combination with polynucleotide.
  • the polynucleotide of the present application has various variations in the coding region within the range of not changing the amino acid sequence of the variant of the present application, taking into account codon degeneracy or preferred codons in organisms intended to express the variant of the present application. Transformations can occur.
  • the polynucleotide of the present application is included in the scope of the present application if it is a polynucleotide sequence capable of encoding a protein containing an amino acid sequence with at least 80% homology to SEQ ID NO: 1, and the base sequence of SEQ ID NO: 2 or more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 85%, more than 90%, more than 95%, more than 96%, more than 97%, more than 98%, and more than 100% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • It has or includes a base sequence of less than %, or has at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% homology or identity with the base sequence of SEQ ID NO: 2 or the sequence of SEQ ID NO: 2. % or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% base sequences, or may consist essentially of base sequences, but are not limited thereto.
  • polynucleotide of the present application is without limitation any probe that can be prepared from a known genetic sequence, for example, a sequence that can hybridize under strict conditions with a complementary sequence to all or part of the polynucleotide sequence of the present application. may be included.
  • the “stringent condition” refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, Or, conditions in which polynucleotides with 99% or more homology or identity hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize with each other, or 60°C, which is the washing condition of normal southern hybridization, Washing once, specifically 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature equivalent to 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS. Conditions can be listed.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases may be possible depending on the stringency of hybridization.
  • the term “complementary” is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity with the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the conditions described above. Additionally, the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose.
  • the appropriate stringency to hybridize the polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, variables that are well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • the microorganism having O-acetyl homoserine production ability of the present application may be a microorganism with inactivated GNAT family N-acetyltransferase protein activity, but is not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine in the present application may be a microorganism lacking a polynucleotide encoding a GNAT family N-acetyltransferase, but is not limited thereto. More specifically, the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine in the present application may be a microorganism lacking the nucleic acid base sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the microorganism may contain an expression vector for inactivating the GNAT family N-acetyltransferase protein in the host cell, thereby inactivating the GNAT family N-acetyltransferase protein activity. , but is not limited to this.
  • the vector of the present application may include a DNA preparation containing the base sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) to enable expression of the target polypeptide in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in this application is not particularly limited, and any vector known in the art can be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors can be used.
  • pBluescriptII series pGEM series
  • pTZ series pCL series
  • pSK series pSKH series
  • pET series pET series
  • pDZ pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, etc.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into a chromosome using a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker may be additionally included to confirm whether the chromosome has been inserted. The selection marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to confirm the insertion of the target nucleic acid molecule, and to display selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides. Markers that provide may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or show other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term “transformation” refers to introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoding the polynucleotide can be expressed within the host cell.
  • the transformed polynucleotide can include both of these, regardless of whether it is inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding the polypeptide of interest.
  • the polynucleotide can be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide can be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic structure containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may typically include a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the target variant of the present application.
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion into the microorganism or genome editing using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by, but is not limited to, light and/or chemical treatment, such as ultraviolet rays and radiation.
  • the method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to the gene of interest is injected into the microorganism to cause homologous recombination, thereby causing deletion of part or all of the gene.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include, but is not limited to, a dominant selection marker.
  • the term “enhancement” of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include showing an activity that it did not originally have, or showing improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the trait change.
  • the activity of a polypeptide is “enhanced,” “upregulated,” “overexpressed,” or “increased” compared to its intrinsic activity. This means that the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change in character. and/or means improved compared to concentration (expression amount).
  • the enhancement can be achieved by introducing an exogenous polypeptide or enhancing the activity and/or concentration (expression amount) of the endogenous polypeptide. Whether the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed by increasing the activity level of the polypeptide, the expression level, or the amount of product released from the polypeptide.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be done by applying various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to that of the microorganism before modification.
  • genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which are routine methods of molecular biology, may be used, but are not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the reinforcement of the polypeptide of the present application is
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide e.g., modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to enhance the activity of the polypeptide;
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by the introduction into the host cell of a vector capable of replicating and functioning independently of the host to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked. It may be possible. Alternatively, this may be achieved by introducing one or two or more copies of the polynucleotide encoding the polypeptide into the chromosome of the host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited to this.
  • the vector is the same as described above.
  • the expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but the method is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include CJ1 to CJ7 promoters (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13. (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base sequence encoding another start codon with a higher polypeptide expression rate than the internal start codon. It may be a substitution, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide.
  • the combination of these may result in a mutation in the sequence, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may additionally include a selection marker to check whether chromosome insertion has occurred. The selection marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide showing the activity of the polypeptide may be introduction into the host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide showing the same/similar activity as the polypeptide. There are no restrictions on the origin or sequence of the foreign polynucleotide as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and by expressing the introduced polynucleotide in the host cell, a polypeptide can be produced and its activity can be increased.
  • Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the native polynucleotide to increase transcription or translation within the host cell, or optimized transcription and translation of the foreign polynucleotide within the host cell. It may be that the codons have been optimized to allow this.
  • Analyzing the tertiary structure of a polypeptide and selecting exposed sites to modify or chemically modify the sequence information for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database storing the sequence information of known proteins to determine the degree of sequence similarity. Accordingly, a template protein candidate may be determined, the structure confirmed based on this, and an exposed site to be modified or chemically modified may be selected and modified or modified.
  • Such enhancement of polypeptide activity means that the activity or concentration of the corresponding polypeptide is increased based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild type or unmodified microbial strain, or the amount of the product produced from the polypeptide is increased. However, it is not limited to this.
  • the microorganism having O-acetyl homoserine production ability of the present application may be one with enhanced L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH protein activity, but is not limited thereto.
  • L-methionine/branched-chain amino acid exporter YjeH refers to the Amino Acid-Polyamine-Organocation of a transporter. It is one of the Amino Acid Efflux (AAE) proteins in the APC) superfamily, and is a protein that mediates the export of O-acetyl homoserine and/or homoserine out of the cell. It is predicted to contain 12 transmembrane ⁇ helices, 10 of which can form the inverted repeat fold characteristic of the APC superfamily.
  • AAE Amino Acid Efflux
  • the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH protein and gene sequences can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto. Additionally, as an example, it may be derived from Escherichia coli ( E. coli ), but is not limited thereto.
  • the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH protein is an inner membrane protein, an O-acetyl homoserine export protein, a protein with O-acetyl homoserine export ability, and an O-acetyl homoserine export activity. It can be used interchangeably with a protein having, YjeH protein, or YjeH.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine of the present application may further include, but is not limited to, a variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH, and more specifically, the O of the present application.
  • -Microorganisms with the ability to produce acetyl homoserine may be those in which a variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH is introduced to enhance the protein activity of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH, but are not limited thereto. .
  • the variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH can increase the production capacity of O-acetyl homoserine by increasing the O-acetyl homoserine emissions of microorganisms, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. It may have and/or comprise, or consist essentially of, the amino acid sequence.
  • the variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH is not only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, but also has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of SEQ ID NO: 10, It may include an amino acid sequence having more than 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, or 99.9% homology or identity.
  • the amino acid sequence has such homology or identity and has the same or corresponding biological activity as the variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH of the present application, some of the sequences may be deleted, modified, substituted, conservatively substituted, or added. It is obvious that cases with an amino acid sequence are also included within the scope of the present application.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine of the present application is further a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% of SEQ ID NO: 10. , 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% or more, including proteins consisting of amino acid sequences with homology or identity, are specifically introduced, O-acetyl homoserine It may be a microorganism with additionally increased production capacity.
  • introduction of a protein refers to the expression of a gene in a microorganism that did not originally exist in the microorganism, thereby causing the activity of a specific protein to appear or an increase or improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification of the protein. It means to appear.
  • a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into a chromosome within a microorganism, or a vector containing a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into the microorganism to exhibit its activity.
  • the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH is used in microorganisms that naturally have weak O-acetyl homoserine excretion ability. It may mean a microorganism with an increased ability to excrete O-acetyl homoserine due to the introduction of a mutant.
  • the microorganism has an increased production capacity of O-acetyl homoserine by introducing a variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH, which increases the extracellular excretion of O-acetyl homoserine compared to the wild type or unmodified microorganism. It can be characterized as: This is because wild-type or unmodified microorganisms cannot excrete O-acetyl homoserine, or can produce trace amounts even if they excrete O-acetyl homoserine, by introducing a variant of the L-methionine/branched chain amino acid exporter YjeH. By increasing the amount of O-acetyl homoserine emissions, the production capacity of O-acetyl homoserine can be increased.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine of the present application may additionally have enhanced homoserine acetyl transferase (MetX) activity, but is not limited thereto.
  • MethodX homoserine acetyl transferase
  • MetX refers to homoserine acetyl transferase. Specifically, most microorganisms existing in nature use O-succinyl homoserine or O-acetyl homoserine as an intermediate to biosynthesize methionine. MetA generally uses O-succinyl homoserine and homoserine O-acetyl homoserine. The transferase produces O-acetyl homoserine. Unlike MetA, MetX is not subject to feedback inhibition and has high enzyme stability. The protein and gene sequences of MetX can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto. In this application, the term “homoserine acetyltransferase” may be used interchangeably with “MetX” and “homoserine O-acetyltransferase.”
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine of the present application may be one in which the expression of the metX gene encoding O-acetyl homoserine transferase is amplified, but is not limited thereto.
  • the base sequence of the metX gene can be obtained from NCBI's GenBank, a known database.
  • the polynucleotide encoding the MetX is included in the scope of the present application as long as it is a polynucleotide sequence capable of encoding a protein containing an amino acid sequence with at least 80% homology to the MetX, and is the base sequence of SEQ ID NO. 26 or SEQ ID NO.
  • Bases with at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and less than 100% with the sequence of 26 Has or includes a sequence, or has at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% homology or identity with the base sequence of SEQ ID NO: 26 or the sequence of SEQ ID NO: 26, It may consist of or essentially consist of 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% nucleotide sequence, but is not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine of the present application may have additional aspartokinase activity, but is not limited thereto.
  • the aspartokinase activity may be further enhanced compared to non-mutated microorganisms, especially the gene encoding aspartokinase ( lysC ). It may be that a mutation (L377K) (Korean Patent Publication No. 10-2019-0003019) was introduced to relieve feedback inhibition of L-Lysine and L-Threonine. Not limited.
  • the nucleotide sequence of lysC can be obtained from a known database, and the nucleotide sequence encoding a protein with aspartokinase activity may be included without limitation, for example, it may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the microorganism having O-acetyl homoserine production ability of the present application may additionally have weakened cystathionine gamma synthase activity, but is not limited thereto.
  • the weakening may be, but is not limited to, inactivation.
  • cystathionine gamma synthase may be reduced or inactivated compared to that of non-mutated microorganisms, and in particular, the gene encoding cystathionine synthase ( metB ) may be defective, but is not limited to this.
  • cystathionine gamma synthase may be used interchangeably with “cystathionine synthase.”
  • the nucleotide sequence of metB can be obtained from a known database, and the nucleotide sequence encoding a protein with cystathionine synthase activity may be included without limitation, for example, it may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the microorganism having O-acetyl homoserine production ability of the present application may additionally have weakened O-acetylhomoserine (thiol)-lyase activity, but is not limited thereto.
  • the weakening may be, but is not limited to, inactivation.
  • the activity of the O-acetyl homoserine thiol lyase may be reduced or inactivated compared to that of non-mutated microorganisms, and in particular, the gene ( metY ) encoding O-acetyl homoserine thiol lyase may be defective. It is not limited to this.
  • the nucleotide sequence of metY can be obtained from a known database, and the nucleotide sequence encoding a protein with O-acetyl homoserine thiol lyase activity may be included without limitation, but may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, for example. .
  • Another aspect of the present application provides a method for producing O-acetyl homoserine comprising culturing the microorganism in a medium.
  • the microorganism O-acetyl homoserine, is as described above.
  • any culture conditions and culture methods known in the art can be used to culture microorganisms.
  • This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the term “culture” means growing the microorganism of this application under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the strain selected. Specifically, the culture may be batch, continuous, or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material that is mainly mixed with nutrients necessary for cultivating the microorganisms of this application, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and development.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the microorganisms of the present application can be any medium used for cultivating ordinary microorganisms without particular restrictions, but the microorganisms of the present application can be grown with an appropriate carbon source, nitrogen source, personnel, and inorganic substances. It can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins, while controlling temperature, pH, etc.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc. may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e. converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in an appropriate amount can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source includes inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its decomposition products, defatted soybean cake or its decomposition products, etc. can be used These nitrogen sources may be used individually or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract,
  • the agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt.
  • Inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, and calcium carbonate, and may also include amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors. These components or precursors can be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited to this.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture. Additionally, during culturing, foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the culture, or to maintain the anaerobic and microaerobic state, nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection, but is limited to this. It doesn't work.
  • the temperature of the culture may be 25°C to 40°C, and more specifically, 28°C to 37°C, but is not limited thereto.
  • the culturing period may continue until the desired amount of useful substance is obtained, and may specifically be from 1 hour to 100 hours, but is not limited thereto.
  • O-acetyl homoserine produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain within the cell.
  • the method for producing O-acetyl homoserine of the present application includes preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (in any order), for example For example, before the culturing step, it may be additionally included.
  • the method for producing O-acetyl homoserine of the present application may further include the step of recovering O-acetyl homoserine from the culture medium (medium in which the culture was performed) or from microorganisms.
  • the recovering step may be additionally included after the culturing step.
  • the recovery is to collect the desired O-acetyl homoserine using a suitable method known in the art according to the microorganism culture method of the present application, such as a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art such as a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • Various chromatography such as chromatography, HPLC, or a combination of these methods can be used, and the desired O-acetyl homoserine can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the method for producing O-acetyl homoserine of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification can be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed sequentially or discontinuously regardless of the order, simultaneously, or in one step. It may be integrated and performed, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application includes culturing the microorganism in a medium, producing O-acetyl homoserine from the cultured microorganism or the medium, and converting the O-acetyl homoserine to L-methionine. It provides a method for producing L-methionine, including:
  • microorganisms O-acetyl homoserine and L-methionine, are as described above.
  • the two-step process uses O-acetyl homoserine and methyl mercaptan produced by the L-methionine precursor production strain as substrates and uses an enzyme having O-acetyl homoserine sulfhydrylase activity or It includes a process of producing L-methionine and organic acids through an enzymatic reaction using a strain containing the above enzyme.
  • the present application provides a method of producing L-methionine using enzymatic reactions such as O-acetylhomoserine sulfhydrylase using O-acetylhomoserine accumulated by the above method as a substrate.
  • O-acetyl homoserine is used as an L-methionine precursor in the above two-step process, specifically, Leptospira sp., Chromobacterium sp., and Hyphomonas sp. Derived from microbial strains belonging to, more specifically, Leptospirameyeri , Pseudomonas aurogenosa , Hyphomonas Neptunium, and Chromobacterium Violaceum . O-acetyl homoserine sulfhydrylase can be used.
  • Another aspect of the present application provides a composition for producing O-acetyl homoserine containing the above microorganism.
  • the microorganism O-acetyl homoserine, is as described above.
  • compositions of the present application may further comprise any suitable excipients commonly used in compositions for the production of O-acetyl homoserine, such as preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or It may be a topical topic, etc., but is not limited to this.
  • Another aspect of the present application is to provide a use of the microorganism for producing O-acetyl homoserine or L-methionine.
  • Example 1 Construction of an endogenous gene (NCgl0959) deletion strain and evaluation of O-acetyl homoserine and homoserine production ability
  • Example 1-1 Construction of deletion vector for NCgl0959 deletion
  • NCgl0959 which is an endogenous gene in Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • a deletion vector was constructed in which the gene NCgl0959 (SEQ ID NO: 2) was deleted.
  • a pair of primers (SEQ ID NOs: 3 and 4) to amplify the 5' upper region centered on the NCgl0959 gene location in SEQ ID NO: 2 and a pair of primers to amplify the 3' lower region. (SEQ ID NOs: 5 and 6) were designed. Primer sequences were as shown in Table 1 below.
  • sequence number sequence name order SEQ ID NO: 3 0959 _del up F TGAATTCGAGCTCGGTACCCATCCACAGACGGTCATCGTG SEQ ID NO: 4 0959 _del up R TTTGGTGgatatcCATGCACGCAATTGTCCTGG SEQ ID NO: 5 0959 _del down F GTGCATGgatatcCACCAAATGGCAAGGATGCC SEQ ID NO: 6 0959 _del down R GTCGACTCTAGAGGATCCCCGCAGAGATCGTTGATTCAAT
  • PCR was performed using the ATCC13032 wild type (WT) chromosome as a template and using primers of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6.
  • PCR conditions were denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 1476 bp DNA fragment at the 5' upper region and a 1456 bp DNA fragment at the 3' lower region were obtained, centered on the deletion site of the NCgl0959 gene.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6.
  • PCR conditions were denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 90 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 2912 bp DNA fragment containing a region where the NCgl0959 gene could be deleted was amplified.
  • the pDCM2 vector (SEQ ID NO: 7, Republic of Korea Publication No. 10-2020-0136813) was treated with SmaI, and the PCR product (2912 bp DNA fragment) obtained above was treated with the SmaI restriction enzyme, using the pDCM2 vector and the Infusion HD Cloning Kit (In Fusion cloning was performed using Fusion® HD Cloning Kit, Clontech).
  • the cloned vector was transformed into E. coli DH5 ⁇ , and the transformed E. coli was plated on LB solid medium containing 25 mg/l of kanamycin. After selecting the colonies transformed with the plasmid on the LB solid medium, the plasmid was obtained using the plasmid extraction method (US Publication No. US 5981235 A) , and finally, the pDCM2- ⁇ NCgl0959 recombinant vector in which the NCgl0959 deletion cassette was cloned was constructed.
  • the constructed pDCM2- ⁇ NCgl0959 was transformed into the ATCC13032 strain using the electric pulse method, and through a second crossing process, ATCC13032 ⁇ NCgl0959, which had the NCgl0959 gene deleted on the chromosome, was obtained.
  • the inactivation of the NCgl0959 gene was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 8 and 9, and then compared with ATCC13032, in which the NCgl0959 gene was not inactivated.
  • sequence number sequence name order SEQ ID NO: 8 0959 _del F GTGAAAAACACTGGCAAAACAAGC
  • SEQ ID NO: 9 0959 _del R ATAAGAGGCACTCCCACAGATCACA
  • O-acetyl homoserine O-AH; O-Acetyl Homoserine
  • Example 2 Construction of NCgl0959 deletion strain in a strain with increased O-acetyl homoserine production ability and evaluation of O-acetyl homoserine and homoserine production ability - 1
  • the pDCM2- ⁇ NCgl0959 vector constructed in Example 1-1 was transformed into the KCCM12634P (KR 10-2182497, ATCC13032 ⁇ NCgl2335::PCJ7-yjeH(eco,F351L)) strain with increased O-acetyl homoserine production ability by the electric pulse method. And through a second crossing process, KCCM12634P ⁇ NCgl0959, in which the NCgl0959 gene was deleted on the chromosome, was obtained. The inactivation of the NCgl0959 gene was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 8 and 9, and then compared with ATCC13032, in which the NCgl0959 gene was not inactivated.
  • O-acetyl homoserine O-AH; O-Acetyl Homoserine
  • KCCM12634P strain and KCCM12634P ⁇ NCgl0959 strain produced in Example 2-1 they were cultured in the following manner to produce O-acetyl homoserine in the culture medium. was analyzed.
  • Example 3 Construction of NCgl0959 deletion strain in a strain with increased O-acetyl homoserine production ability and evaluation of O-acetyl homoserine and homoserine production ability - 2
  • Example 3-1 Strain production - 1
  • the metB gene encoding cystathionine gamma-synthase of the O-acetyl homoserine degradation pathway was obtained.
  • Base sequence information (NCBI registration number Ncgl2360, SEQ ID NO. 11) of the metB gene was obtained from the U.S. National Institutes of Health's Gene Bank (NIH GenBank), and based on this, primers (sequences) containing the N-terminal part and linker part of the metB gene were obtained. No. 12 and 13), primers containing the C-terminal portion and the linker portion (SEQ ID No. 14 and 15) were synthesized. Primer sequences are listed in Table 5 below.
  • sequence number sequence name order SEQ ID NO: 12 metB_N_del F GGCTTCGGAGTTGGAGCG SEQ ID NO: 13 metB_N_del R GCCAAATAGTTTcccgggGGTAGATCAACTCCTGTAATCA SEQ ID NO: 14 metB_C_del F CAGGAGTTGATCTACCcccgggAACTATTTGGCGGCAAG SEQ ID NO: 15 metB_C_del R TCGCGTCTGGGTGCGCATC
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of ATCC13032 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 12 and 13 and SEQ ID NOs: 14 and 15.
  • the polymerase used was PfuUltra TM high-reliability DNA polymerase (Stratagene), and the PCR conditions were denaturation at 96°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • PfuUltra TM high-reliability DNA polymerase (Stratagene)
  • the PCR conditions were denaturation at 96°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • a 558bp amplified gene including the N-terminal portion and linker portion of the metB gene and a 527bp amplified gene including the C-terminal portion and linker portion of the metB gene were obtained, respectively.
  • PCR was performed using the two amplified genes obtained above as templates, and the PCR conditions were denaturation at 96°C for 60 seconds, annealing at 50°C for 60 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 10 times, followed by SEQ ID NO: 12 and 15 was added and the polymerization reaction was repeated 20 more times.
  • SEQ ID NO: 12 and 15 was added and the polymerization reaction was repeated 20 more times.
  • the pDCM2 vector (SEQ ID NO: 7, Republic of Korea Publication No. 10-2020-0136813) was processed with SmaI, and the PCR product (1064 bp) obtained above was processed with the SmaI restriction enzyme, using pDCM2 vector and Infusion HD cloning kit (In-Fusion®). Fusion cloning was performed using HD Cloning Kit, Clontech).
  • the cloned vector was transformed into E. coli DH5 ⁇ , and the transformed E. coli was plated on LB solid medium containing 25 mg/l of kanamycin.
  • the plasmid was obtained using the plasmid extraction method (US Registered Publication US 5981235 A) , and finally, the pDCM2- ⁇ metB recombinant vector in which the metB gene deletion cassette was cloned was constructed.
  • the constructed pDCM2- ⁇ metB vector was transformed into the KCCM12634P strain using the electric pulse method, and through a second crossover process, KCCM12634P ⁇ metB with the metB gene inactivated on the chromosome was obtained.
  • the inactivated metB gene was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 12 and 15, and then compared with ATCC13032, in which the metB gene was not inactivated.
  • sequence number sequence name order SEQ ID NO: 17 metY_N_del F CCAAAGACAAGGAGACCA SEQ ID NO: 18 metY_N_del R AGTCTATTTAAAGcccgggTTGGAGGTCCTTAAGAGTTTT SEQ ID NO: 19 metY_C_del F TAAGGACCTCCAAcccgggCTTTAAATAGACTCACCCCAG SEQ ID NO: 20 metY_C_del R ATGCCGAGTGCGTCGAGG
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of ATCC13032 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 17 and 18 and SEQ ID NOs: 19 and 20.
  • the polymerase used was PfuUltra TM high-reliability DNA polymerase (Stratagene), and the PCR conditions were denaturation at 96°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • PfuUltra TM high-reliability DNA polymerase (Stratagene)
  • the PCR conditions were denaturation at 96°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • a 548bp amplified gene including the N-terminal portion and linker portion of the metY gene and a 550bp amplified gene including the C-terminal portion and linker portion of the metY gene were obtained.
  • PCR was performed using the two amplified genes obtained above as templates, and the PCR conditions were denaturation at 96°C for 60 seconds, annealing at 50°C for 60 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 10 times, followed by SEQ ID NOs: 17 and 20. was added and the polymerization reaction was repeated 20 more times. As a result, a 1077 bp inactivation cassette containing the N-terminus, linker-C-terminus of the metY gene was obtained.
  • pDCM2 vector (SEQ ID NO: 7, Republic of Korea Publication No. 10-2020-0136813) was processed with SmaI, and the PCR product (1077 bp) obtained above was processed with SmaI restriction enzyme, pDCM2 vector and In-Fusion HD cloning kit (In-Fusion). Fusion cloning was performed using ® HD Cloning Kit, Clontech). The cloned vector was transformed into E. coli DH5 ⁇ , and the transformed E. coli was plated on LB solid medium containing 25 mg/l of kanamycin. After selecting the colonies transformed with the plasmid in the LB medium, the plasmid was obtained using the plasmid extraction method (US Publication No. US 5981235 A) , and finally, the pDCM2- ⁇ metY recombinant vector in which the metY gene deletion cassette was cloned was constructed.
  • the constructed pDCM2- ⁇ metY vector was transformed into the strain KCCM12634P ⁇ metB constructed in Example 3-1 by the electric pulse method, and through a second crossover process, KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY, in which the metY gene was additionally inactivated on the chromosome, was obtained.
  • the inactivated metY gene was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 17 and 20, and then compared with ATCC13032, in which the metY gene was not inactivated.
  • lysC gene (SEQ ID NO: 21) encoding aspartokinase derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and L-Lysine and L-Threonine
  • L377K Long Term Evolution
  • a pair of primers for amplification (SEQ ID NOs: 22 and 23) and a pair of primers for amplifying the 3' bottom region (SEQ ID NOS: 24 and 25) were designed. Primer sequences were as shown in Table 7 below.
  • sequence number sequence name order SEQ ID NO: 22 lysC_L377K_5 F CAGAAGCTGGAAAAGCTCA SEQ ID NO: 23 lysC_L377K_5 R ATCTCAGAGGTGGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT SEQ ID NO: 24 lysC_L377K_3F TGTCAACGTGAACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATT SEQ ID NO: 25 lysC_L377K_3 R TCCTTGTCGGAAGGGTTCA
  • PCR was performed using the chromosome of ATCC13032 as a template and using primers of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25.
  • PCR conditions were denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 512 bp DNA fragment in the 5' upper region and a 522 bp DNA fragment in the 3' lower region were obtained, focusing on the mutation of the lysC gene.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 25. PCR conditions were denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes. As a result, a 1011 bp DNA fragment containing the mutant lysC(L377K) gene encoding an aspartokinase variant in which leucine at position 377 was replaced with lysine was amplified.
  • the pDCM2 vector (SEQ ID NO: 7, Republic of Korea Publication No. 10-2020-0136813) was processed with SmaI, and the PCR product (1011 bp) obtained above was processed with the SmaI restriction enzyme, using the pDCM2 vector and In-Fusion HD cloning kit (In-Fusion Fusion cloning was performed using ® HD Cloning Kit, Clontech).
  • the cloned vector was transformed into E. coli DH5 ⁇ , and the transformed E. coli was plated on LB solid medium containing 25 mg/l of kanamycin.
  • the plasmid was obtained using the plasmid extraction method (US Registered Publication US 5981235 A) , and finally, the cassette with the lysC (L377K) gene substituted was cloned into pDCM2-lysC ( L377K) recombinant vector was constructed.
  • the constructed pDCM2-lysC(L377K) vector was transformed into the strain KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY produced in Example 3-2 by the electric pulse method, and then through a second crossover process, a nucleotide mutation was introduced into the lysC gene on the chromosome.
  • L. glutamicum KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY lysC (L377K) was obtained.
  • the gene into which the nucleotide mutation was introduced was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 22 and 25, followed by sequencing and comparison with the sequence of the wild-type lysC gene.
  • Example 3-4 Construction of endogenous gene NCgl0959 deletion strain - 1
  • the pDCM2- ⁇ NCgl0959 vector constructed in Example 1-1 was transformed into the strain KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) constructed in Example 3-3 using the electric pulse method, and then subjected to secondary crossing.
  • KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) ⁇ NCgl0959 in which the NCgl0959 gene was deleted on the chromosome, was obtained.
  • the inactivation of the NCgl0959 gene was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 8 and 9, and then compared with ATCC13032, in which the NCgl0959 gene was not inactivated.
  • Example 3-5 Construction of endogenous gene NCgl0959 deletion strain - 2
  • the base sequence information of the metX gene was obtained from the U.S. National Institutes of Health's Gene Bank (NIH GenBank). And, based on this, it was designed by inserting BamHI restriction enzyme sites at both ends of a primer pair (SEQ ID NOs: 27 and 28) for amplification from the promoter region (about 300 bp above the start codon) to the terminator region (about 100 bp below the stop codon). .
  • PCR conditions were denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 90 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • the pECCG117 (KR 10-0057684) vector and the metX DNA fragment were treated with the restriction enzyme BamHI, ligated using a DNA conjugation enzyme, and cloned to obtain a plasmid, which was named pECCG117-metX WT.
  • Primer sequences were as shown in Table 8 below.
  • sequence number sequence name order SEQ ID NO: 27 metX F GGATCCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC SEQ ID NO: 28 metX R GGATCCCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
  • the constructed pECCG117-metX WT vector was introduced into the strain KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) constructed in Example 3-3 and the strain KCCM12634P ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) ⁇ NCgl0959 constructed in Example 3-4 using the electric pulse method, respectively, followed by kanamycin.
  • the production ability of the target amino acid can be further improved when the endogenous gene NCgl0959 is deleted or inactivated in the strain with increased O-acetyl-L homoserine production ability.

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Abstract

본 출원은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된 미생물; 이를 이용한 O-아세틸 호모세린 및 L-메치오닌의 생산방법; 상기 미생물을 포함하는 O-아세틸 호모세린 생산용 조성물; 및 상기 미생물의 O-아세틸 호모세린 또는 L-메치오닌 생산 용도에 관한 것이다.

Description

O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 O-아세틸 호모세린 또는 L-메치오닌 생산 방법
본 출원은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된 미생물; 이를 이용한 O-아세틸 호모세린 및 L-메치오닌의 생산방법; 상기 미생물을 포함하는 O-아세틸 호모세린 생산용 조성물; 및 상기 미생물의 O-아세틸 호모세린 또는 L-메치오닌 생산 용도에 관한 것이다.
O-아세틸　호모세린(O-acetyl homoserine)은 생체 내 필수 아미노산의 한 종류인 메치오닌의 전구체로 작용한다. 메치오닌은, 생체 내 필수 아미노산의 한 종류로 사료 및 식품 첨가제뿐만 아니라 수액제, 의약품의 합성 원료로도 널리 사용되고 있다.
메치오닌은 생물학적 합성과 화학 합성을 통해 생산된다. 이와 관련하여, 발효를 통해 생산한 L-메치오닌 전구체로부터 효소전환 반응에 의하여 L-메치오닌을 생산하는 이단계 공법(국제공개공보 WO2008/013432)이 공지되었다.
상기의 이단계 공법에서는 메치오닌 전구체로 O-숙시닐 호모세린(O-succinyl homoserine)과　O-아세틸　호모세린(O-acetyl homoserine)이 사용될 수 있다. 이에 따라, 메치오닌의 경제적인 대량 생산을 위하여　O-아세틸　호모세린을 고수율로 생산하는 것이 매우 중요하다.
본 발명자들은 O-아세틸 호모세린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 O-아세틸 호모세린 또는 L-메치오닌 생산 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된, O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 O-아세틸 호모세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-메치오닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 포함하는 O-아세틸 호모세린 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 미생물의 O-아세틸 호모세린 또는 L-메치오닌 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물은 O-아세틸 호모세린을 화학적 합성에 비해 환경친화적이면서도 고효율로 생산할 수 있다. 또한, 생산된 O-아세틸 호모세린은 O-아세틸 호모세린 설프하이드릴라아제에 의해 메치오닌과 아세트산 합성의 전구체로 사용하여 고효율로 L-메치오닌을 생물 전환할 수 있으며, 전환된 상기 L-메치오닌은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제의 생산에 널리 사용할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된, O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제"는 GNAT(Gcn5-Related N-Acetyltransferases) 패밀리에 속하는 N-아세틸트랜스퍼라제(N-acetyltransferase)를 의미한다.
구체적으로, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제의 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지거나(essentially consisting of), 구성될 수 있다. 예를 들어 상기 서열번호 1로 이루어지는 단백질은 공지의 NCgl0959 유전자에 의해 암호화되는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니며, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제, 보다 구체적으로는, NCgl0959 유전자에 의해 암호화되는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 상기 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파테이트를 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소루신, 류신, 메치오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 또한, 아미노산은 전하를 띠는(electrically charged) 곁사슬을 갖는 아미노산과 전하를 띠지 않는(uncharged) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류할 수 있으며, 전하를 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산은 다시 비극성(nonpolar) 아미노산 또는 극성 아미노산(polar)으로 분류할 수 있으며, 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소루신. 메치오닌, 페닐알라닌. 트립토판, 프롤린, 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
또한, GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "O-아세틸　호모세린"은 미생물의 메치오닌 생합성 경로상의 특이적 중간체 물질로, L-호모세린의 아세틸-유도체를 의미한다. 상기　O-아세틸　호모세린은　호모세린과 아세틸-CoA를 기질로 하여 아세틸-CoA의 아세틸기를　호모세린에 전이하는 효소 활성에 의하여 생성될 수 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "O-아세틸　호모세린　생산능을 가지는 미생물"은　O-아세틸　호모세린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서,　O-아세틸　호모세린　생산능이 없는 모균주에　O-아세틸　호모세린의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로　O-아세틸　호모세린　생산능을 갖는 미생물을 포함한다.　O-아세틸　호모세린　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 상기　O-아세틸　호모세린　생산능을 갖는 미생물은 L-라이신, L-트레오닌, L-이소류신 또는 L-메치오닌을 생산하는 균주, 또는 이의 유래일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 O-아세틸　호모세린을 생산하는 미생물은 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 약화되어, 목적하는 O-아세틸　호모세린 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 O-아세틸　호모세린 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물에 비하여 O-아세틸　호모세린 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 O-아세틸　호모세린을 생산하는 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 내재적으로 포함하는 미생물일 수 있다.
예를 들어, 상기 O-아세틸　호모세린을 생산하는 미생물은 상기 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 염기서열, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 내재적으로 포함하는 미생물일 수 있다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 미생물은 변이 전 모균주 또는 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물의 O-아세틸 호모세린 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 21% 이상, 약 22% 이상, 약 23% 이상, 약 24% 이상, 약 25% 이상, 약 26% 이상, 약 27% 이상, 약 28% 이상, 약 29% 이상 또는 약 30% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하 또는 약 35% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, O-아세틸 호모세린 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.21배 이상, 약 1.22배 이상, 약 1.23배 이상, 약 1.24배 이상, 약 1.25배 이상, 약 1.26배 이상, 약 1.27배 이상, 약 1.28배 이상, 약 1.29배 이상 또는 약 1.30배 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.4배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 내재적 활성에 비해 약화되지 않거나 약화되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 “변형 전 균주”, “변형 전 미생물”, “비변이 균주”, “비변형 균주”, “비변이 미생물” 또는 “기준 미생물”과 혼용될 수 있다.
상기　O-아세틸　호모세린　생산능을 갖는 미생물은, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 에스케리치아 속(Escherichiasp.), 어위니아 속(Erwiniasp.), 세라티아 속(Serratiasp.), 프로비덴시아 속(Providenciasp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteriasp.), 슈도모나스 속(Pseudomonassp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellasp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteriasp.), 하이포모나스 속(Hypomononassp.), 크로모박테리움 속(Chromobacteriumsp.) 및 노카디아 속(Norcardiasp.), 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더욱 구체적으로는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 균주일 수 있다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 비변형 미생물은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물일 수 있다.
한편, 코리네박테리움 속 미생물이 O-아세틸　호모세린을 생산할 수 있음은 이미 알려져 있었으나, 이의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 모두 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 본 출원의 O-아세틸　호모세린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 천연의 야생형 미생물 자체, O-아세틸　호모세린 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 O-아세틸　호모세린 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 O-아세틸　호모세린 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 모두 포함한다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 약화는 불활성화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 불활성화는 단백질의 발현이 모균주 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미할 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다.
상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성을 불활성화시키기 위해 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 예로, 상기 유전자의 일부 또는 전체를　결손시키는 방법은 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 목적 유전자가　결손된 균주를 선별하여 수행될 수 있다.
상기 유전자　결손　방법에는 유전자 재조합 기술(Genetic recombination technique)에 의한 방법이 포함된다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원에서 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나(essentially consisting of), 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이면 본 출원의 범주에 포함되며, 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
구체적으로, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 불활성화된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 서열번호 2의 핵산 염기서열이 결손된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 목적상, 상기 미생물은 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질을 숙주 세포에서 불활성화시키기 위한 발현 벡터를 포함함으로써, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 불활성화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역의 변형(예를 들어, 발현조절영역 내 변이 발생, 더욱 강한 활성을 갖는 서열로의 교체, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 서열 삽입);
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH 단백질 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH(L-methionine/branched-chain amino acid exporter YjeH)"은 수송 단백질(transporter)의 아미노산-폴라아민-유기체(Amino Acid-Polyamine-Organocation, APC) 수퍼패밀리 내 아미노산 배출 단백질(Amino Acid Efflux, AAE)의 하나로, O-아세틸 호모세린 및/또는 호모세린을 세포 밖으로 배출하도록 매개하는 단백질이다. 12 개의 막 횡단 α 나선(transmembrane α helices)을 포함할 것으로 예측되며, 그 중 10 개는 APC 수퍼패밀리의 특성인 거꾸로 된 반복 접이(inverted repeat fold)를 형성할 수 있다. 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 일 예로, 대장균(Escherichia coli,　E. coli) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서, 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH 단백질은 내막 단백질(inner membrane protein), O-아세틸 호모세린 배출 단백질, O-아세틸 호모세린 배출능을 갖는 단백질, O-아세틸 호모세린 배출 활성을 갖는 단백질, YjeH 단백질 또는 YjeH와 혼용하여 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 더욱 구체적으로 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체가 도입되어 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH 단백질 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체는 미생물의 O-아세틸 호모세린 배출량을 증가시킴으로써, O-아세틸 호모세린의 생산능을 증가시킬 수 있으며, 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지거나(essentially consisting of), 구성될 수 있다.
또한, 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체는 상기 서열번호 10으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 서열번호 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 서열번호 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 포함하여, 구체적으로 도입되어, O-아세틸 호모세린의 생산능이 추가로 증가된 미생물일 수 있다.
구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 유전자가 그 미생물내에서 발현됨에 따라 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 증가 또는 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체를 포함하는 미생물의 경우, 자연적으로 약한 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지고 있는 미생물에 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체가 도입되어 O-아세틸 호모세린 배출능이 증가된 미생물을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체가 도입되어 야생형 또는 비변형 미생물에 비하여 O-아세틸 호모세린의 세포 외 배출량이 증가함으로써, O-아세틸 호모세린의 생산능이 증가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 야생형 또는 비변형 미생물이 O-아세틸 호모세린을 배출하지 못하거나, O-아세틸 호모세린을 배출하더라도 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 상기 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH의 변이체를 도입함으로써 미생물의 O-아세틸 호모세린 배출량을 증가시킴으로써, O-아세틸 호모세린의 생산능을 증가시킬 수 있다.
본 출원에 적용될 수 있는　상기 내막 단백질 YjeH 및/또는 이의 변이체의 예는 대한민국 등록특허공보 제10-2182497호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 출원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase, MetX) 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "MetX"는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase)를 의미한다. 구체적으로, 자연계에 존재하는 대부분의 미생물은 메치오닌을 생합성하기 위해서 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸 호모세린을 중간체로 이용하는데 일반적으로 MetA는 O-숙시닐 호모세린을, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 O-아세틸 호모세린을 생성시킨다. 상기 MetX는 MetA와는 달리 피드백저해를 받지 않으며 효소 안정성도 높다. 상기 MetX의 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제"는 "MetX", "호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제"와 혼용될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 O-아세틸 호모세린 트랜스퍼라제를 코딩하는 metX 유전자의 발현이 증폭된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 metX 유전자의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 상기 MetX를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 MetX와 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이면 본 출원의 범주에 포함되며, 서열번호 26의 염기서열 또는 서열번호 26의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 26의 염기서열 또는 서열번호 26의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 적용될 수 있는　상기 metX 유전자의 예는 대한민국 등록특허공보 제10-2182497호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 출원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 아스파토키나아제(aspartokinase) 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로는, O-아세틸-호모세린 생합성을 증대하기 위하여, 상기 아스파토키나아제(aspartokinase) 활성이 비변이 미생물에 비하여 추가로 강화된 것일 수 있으며, 특히 아스파토키나아제를 코딩하는 유전자(lysC)의 L-라이신(L-Lysine) 및 L-쓰레오닌(L-Threonine)에 대한 피드백 저해 해제를 위한 변이(L377K)(한국 공개특허 제10-2019-0003019호)를 도입한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 lysC의 염기서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 아스파토키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 21의 염기 서열을 가질 수 있다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma synthase) 활성이 약화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 약화는 불활성화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 시스타치오닌 감마 신타제의 활성이 비변이 미생물의 활성보다 감소 또는 비활성화되는 것일 수 있으며, 특히 시스타치오닌 신타아제를 코딩하는 유전자(metB)가 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 용어 "시스타치오닌 감마 신타제"는 "시스타치오닌 신타제"와 혼용될 수 있다. 상기 metB의 염기서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 시스타치오닌 신타아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 11의 염기 서열을 가질 수 있다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물은 추가로 O-아세틸 호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase) 활성이 약화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 약화는 불활성화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 O-아세틸 호모세린 티올 리아제의 활성이 비변이 미생물의 활성보다 감소 또는 비활성화되는 것일 수 있으며, 특히 O-아세틸 호모세린 티올 리아제를 코딩하는 유전자(metY)가 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 metY의 염기서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, O-아세틸 호모세린 티올 리아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염기 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 16의 염기 서열을 가질 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 O-아세틸 호모세린의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물, O-아세틸 호모세린에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 방법에 있어서, 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메치오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메치오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서는 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배양물의 온도는 25℃내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 O-아세틸 호모세린은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산 방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 미생물로부터 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 O-아세틸 호모세린을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 O-아세틸 호모세린을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 O-아세틸 호모세린 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같이 회수된　O-아세틸　호모세린은 이단계 공법(대한민국 등록특허 제10-0905381호) 에 의해 메치오닌을 생산할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 O-아세틸 호모세린을 생산하는 단계 및 상기 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메치오닌의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물, O-아세틸 호모세린 및 L-메치오닌에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 이단계 공정은 상기 L-메치오닌 전구체 생산 균주에 의하여 생산된　O-아세틸　호모세린과 메칠 머캅탄을 기질로 이용하여　O-아세틸　호모세린　설피드릴라아제(O-acetyl homoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용한 효소반응을 통하여 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 공정을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 출원은 상기의 방법으로 축적된　O-아세틸　호모세린을 기질로 이용하여　O-아세틸　호모세린　설피드릴라아제등의 효소 반응을 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 2단계 공정에서　O-아세틸　호모세린을 L-메치오닌 전구체로 사용하는 경우, 구체적으로는 렙토스피라속(Leptospira　sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium　sp.), 하이포모나스속(Hyphomonas　sp.)에 속하는 미생물 균주, 보다 구체적으로는 렙토스피라 메에리(Leptospirameyeri), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonasaurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움(HyphomonasNeptunium), 크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된　O-아세틸　호모세린　설피드릴라아제가 사용될 수 있다.
상기의 반응은 하기와 같다.
CH3SH +　O-아세틸 호모세린　<=> 아세테이트 + 메치오닌
이와 같은 추가 메치오닌 생산 공정에 대해서는 대한민국 등록 특허 제10-0905381호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 출원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 포함하는 O-아세틸 호모세린 생산용 조성물을 제공한다.
상기 미생물, O-아세틸 호모세린에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 조성물은 O-아세틸 호모세린 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물의 O-아세틸 호모세린 또는 L-메치오닌 생산 용도를 제공하는 것이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 내재적 유전자(NCgl0959) 결실 균주 제작 및 O-아세틸 호모세린 및 호모세린 생산능 평가
실시예 1-1. NCgl0959 결손을 위한 결손 벡터 제작
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032에서 내재적 유전자인 NCgl0959 유전자의 유효성을 판단하기 위하여, 유전자 NCgl0959 (서열번호 2)를 결손시킨 결손 벡터를 제작하였다.
구체적으로, NCgl0959 결손 벡터를 제작하기 위해, 서열번호 2의 NCgl0959 유전자 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한 쌍(서열번호 3 및 4)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 5 및 6)을 고안하였다. 프라이머 서열은 하기 표 1과 같았다.
서열번호 서열명 서열
서열번호 3 0959 _del up F TGAATTCGAGCTCGGTACCCATCCACAGACGGTCATCGTG
서열번호 4 0959 _del up R TTTGGTGgatatcCATGCACGCAATTGTCCTGG
서열번호 5 0959 _del down F GTGCATGgatatcCACCAAATGGCAAGGATGCC
서열번호 6 0959 _del down R GTCGACTCTAGAGGATCCCCGCAGAGATCGTTGATTCAAT
ATCC13032 야생형(WT)의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 NCgl0959 유전자의 결손 부위를 중심으로 5' 상단 부위의 1476 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 1456bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 3 및 서열번호 6의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, NCgl0959 유전자를 결손할 수 있는 부위를 포함하는 2912 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pDCM2 벡터(서열번호 7, 대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물(2912 bp DNA 단편)을 SmaI 제한효소 처리한 pDCM2 벡터와 인퓨전 HD 클로닝 키트(In-Fusion® HD Cloning Kit, Clontech)를 사용하여 퓨전 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환하고 형질전환된 대장균을 카나마이신(kanamycin) 25mg/ℓ이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 상기 LB 고체배지에서 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법(미국 등록공보 US 5981235 A)을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 최종적으로 NCgl0959 결손 카세트가 클로닝된 pDCM2-ΔNCgl0959 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDCM2-ΔNCgl0959를 ATCC13032 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 NCgl0959 유전자가 결손된 ATCC13032 ΔNCgl0959를 수득하였다. NCgl0959 유전자의 불활성 여부는 서열번호 8와 9의 프라이머를 이용한 PCR 후 NCgl0959 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
서열번호 서열명 서열
서열번호 8 0959 _del F GTGAAAAAACACTGGCAAAACAAGC
서열번호 9 0959 _del R ATAAGAGGCACTCCCACAGATCACA
실시예 1-2. 야생형 균주에서의 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
실시예 1-1에서 제작된 ATCC13032 ΔNCgl0959와 야생형 균주인 ATCC13032의 O-아세틸 호모세린(O-AH; O-Acetyl Homoserine) 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-아세틸 호모세린을 분석하였다.
하기의 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주를 1백금이 접종하고, 33도에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-아세틸 호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 표 3와 같았다.
<O-아세틸 호모세린 생산배지(pH 7.2)>
포도당 30 g, KH2PO4 2 g, 요소 3 g, (NH4)2SO4 40 g, 펩톤 2.5 g, CSL(Sigma) 5 g(10 ml), MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g, CaCO3 20 g (증류수 1 리터 기준)
(플라스크 결과)
Strains O-AH (g/L)
ATCC13032 0.27
ATCC13032 Δ NCgl0959 0.30
그 결과 상기 표 3과 같이 ATCC13032 배양 시 O-아세틸 호모세린이 0.27g/L로 축적되며, 내재적 유전자인 NCgl0959 유전자를 결손 시킨 ATCC13032 Δ NCgl0959의 경우 O-아세틸 호모세린이 0.30g/L축적되어 대조군 ATCC13032 대비 120% 생산능을 보임을 확인하였다.
실시예 2. O-아세틸 호모세린 생산능이 증가된 균주에서의 NCgl0959 결손 균주 제작 및 O-아세틸 호모세린 및 호모세린 생산능 평가 - 1
실시예 2-1. 균주 제작
실시예 1-1에서 제작된 pDCM2-ΔNCgl0959 벡터를 O-아세틸 호모세린 생산능이 증가된 KCCM12634P (KR 10-2182497, ATCC13032 ΔNCgl2335::PCJ7-yjeH(eco,F351L)) 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 NCgl0959 유전자가 결손된 KCCM12634P ΔNCgl0959 을 수득하였다. NCgl0959 유전자의 불활성 여부는 서열번호 8와 9의 프라이머를 이용한 PCR 후 NCgl0959 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
실시예 2-2. O-아세틸 호모세린 생산능 평가
실시예 2-1에서 제작된 KCCM12634P 균주 및 KCCM12634P ΔNCgl0959 균주에 대하여, O-아세틸 호모세린(O-AH; O-Acetyl Homoserine) 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-아세틸 호모세린을 분석하였다.
하기의 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주를 1백금이 접종하고, 33도에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-아세틸 호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 표 4와 같았다.
<O-아세틸 호모세린 생산배지(pH 7.2)>
포도당 30 g, KH2PO4 2 g, 요소 3 g, (NH4)2SO4 40 g, 펩톤 2.5 g, CSL(Sigma) 5 g(10 ml), MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g, CaCO3 20 g (증류수 1 리터 기준)
(플라스크 결과)
Strains O-AH (g/L)
KCCM12634P 1.05
KCCM12634P Δ NCgl0959 1.31
그 결과 상기 표 4와 같이 KCCM12634P 균주에서 NCgl0959 결손 시 O-아세틸 호모세린이 1.31g/L 로 KCCM12634P 대비 약 130% 생산능을 보임을 확인하였다. 따라서, 상기 결과로부터 O-아세틸 호모세린 생산능이 증가한 균주에서 NCgl0959 결손에 따른 O-아세틸 호모세린 생산능 증가 효과가 더 큰 것을 확인하였다.
따라서, 실시예 1-2 및 2-2의 결과로부터 본 출원의 ATCC13032의 내재적 유전자인 NCgl0959 유전자 결실 및 불활성이 목적 아미노산의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. O-아세틸 호모세린 생산능이 증가된 균주에서의 NCgl0959 결손 균주 제작 및 O-아세틸 호모세린 및 호모세린 생산능 평가 - 2
실시예 3-1. 균주 제작 - 1
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸 호모세린 분해경로의 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma-synthase)를 코딩하는 metB 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)에서 metB 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 Ncgl2360, 서열번호 11)를 확보하고, 이에 근거하여 metB 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 12 및 13), C-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 14 및 15)를 합성하였다. 프라이머 서열은 하기 표 5에 기재하였다.
서열번호 서열명 서열
서열번호 12 metB_N_del F GGCTTCGGAGTTGGAGCG
서열번호 13 metB_N_del R GCCAAATAGTTTcccgggGGTAGATCAACTCCTGTAATCA
서열번호 14 metB_C_del F CAGGAGTTGATCTACCcccgggAAACTATTTGGCGGCAAG
서열번호 15 metB_C_del R TCGCGTCTGGGTGCGCATC
ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 12 및 13, 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 53℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, metB 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함한 558bp의 증폭된 유전자와 metB 유전자의 C-말단 부분과 링커 부분을 포함한 527bp의 증폭된 유전자를 각각 획득하였다.
상기에서 획득한, 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서 60초 변성, 50℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 10회 반복 후 서열번호 12 및 15를 첨가하고 중합반응을 20회 더 반복하였다. 그 결과 metB 유전자의 N-말단-링커-C-말단을 포함하는 1064bp의 불활성화 카세트를 획득하였다.
pDCM2 벡터(서열번호 7, 대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물(1064bp)을 SmaI 제한효소 처리한 pDCM2 벡터와 인퓨전 HD 클로닝 키트(In-Fusion® HD Cloning Kit, Clontech)를 사용하여 퓨전 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환하고 형질전환된 대장균을 카나마이신(kanamycin) 25mg/ℓ이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 상기 LB배지에서 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법(미국 등록공보 US 5981235 A)을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 최종적으로 metB 유전자 결손 카세트가 클로닝된 pDCM2-ΔmetB 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDCM2-ΔmetB 벡터를 KCCM12634P 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metB 유전자가 불활성화된 KCCM12634PΔmetB 을 수득하였다. 불활성화된 metB 유전자는 서열번호 12과 15의 프라이머를 이용한 PCR 후 metB 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
실시예 3-2. 균주 제작 - 2
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸 호모세린 분해경로의 O-아세틸 호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase)를 코딩하는 metY 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)에서 metY 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 Ncgl0625, 서열번호 16)를 확보하고, 이에 근거하여 metY 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 17 및 18), C-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 19 및 20)를 합성하였다. 프라이머 서열은 하기 표 6과 같았다
서열번호 서열명 서열
서열번호 17 metY_N_del F CCAAAGACAAGGAGACCA
서열번호 18 metY_N_del R AGTCTATTTAAAGcccgggTTGGAGGTCCTTAAGAGTTTT
서열번호 19 metY_C_del F TAAGGACCTCCAAcccgggCTTTAAATAGACTCACCCCAG
서열번호 20 metY_C_del R ATGCCGAGTGCGTCGAGG
ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 53℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 30회 반복하였다. 그 결과, metY 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함한 548bp의 증폭된 유전자와 metY 유전자의 C-말단 부분과 링커 부분을 포함한 550bp의 증폭된 유전자를 획득하였다. 상기에 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서 60초 변성, 50℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 10회 반복 후 서열번호 17 및 20를 첨가하고 중합반응을 20회 더 반복하였다. 그 결과 metY 유전자의 N-말단-링커-C-말단을 포함하는 1077bp의 불활성화 카세트를 획득하였다.
pDCM2 벡터(서열번호 7, 대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물(1077 bp)을 SmaI 제한효소 처리한 pDCM2 벡터와 인퓨전 HD 클로닝 키트(In-Fusion® HD Cloning Kit, Clontech)를 사용하여 퓨전 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환하고 형질전환된 대장균을 카나마이신(kanamycin) 25mg/ℓ이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 상기 LB배지에서 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법(미국 등록공보 US 5981235 A)을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 최종적으로 metY 유전자 결손 카세트가 클로닝된 pDCM2-ΔmetY 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDCM2-ΔmetY 벡터를 실시예 3-1에서 제작된 균주 KCCM12634PΔmetB 에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metY 유전자가 추가로 불활성화된 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY 을 수득하였다. 불활성화된 metY 유전자는 서열번호 17과 20의 프라이머를 이용한 PCR 후 metY 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
실시예 3-3. 균주 제작 - 3
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자(서열번호 21)에 lysC 유전자의 발현 강화와 L-라이신(L-Lysine) 및 L-쓰레오닌(L-Threonine)에 대한 피드백 저해 해제를 위한 변이(L377K)(한국 공개특허 제10-2019-0003019호)를 도입하고, 상기 변이형 lysC 유전자를 포함하는 벡터를 제작하기 위하여, 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한 쌍(서열번호 22 및 23)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 24 및 25)을 고안하였다. 프라이머 서열은 하기 표 7과 같았다.
서열번호 서열명 서열
서열번호 22 lysC_L377K_5 F CAGAAGCTGGAAAAGCTCA
서열번호 23 lysC_L377K_5 R ATCTCAGAGGTGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT
서열번호 24 lysC_L377K_3 F TGTCAACGTGAACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATT
서열번호 25 lysC_L377K_3 R TCCTTGTCGGAAGGGTTCA
ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 22 및 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 512 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 522 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 22 및 서열번호 25의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루이신이 라이신으로 치환된 아스파토키나아제 변이체를 코딩하는 변이 lysC(L377K) 유전자를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pDCM2 벡터(서열번호 7, 대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물(1011 bp)을 SmaI 제한효소 처리한 pDCM2 벡터와 인퓨전 HD 클로닝 키트(In-Fusion® HD Cloning Kit, Clontech)를 사용하여 퓨전 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환하고 형질전환된 대장균을 카나마이신(kanamycin) 25mg/ℓ이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 상기 LB배지에서 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법(미국 등록공보 US 5981235 A)을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 최종적으로 lysC(L377K) 유전자가 치환된 카세트가 클로닝된 pDCM2- lysC(L377K) 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDCM2-lysC(L377K) 벡터를 실시예 3-2에서 제작된 균주 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY 에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) 을 수득하였다. 뉴클레오티드 변이가 도입된 유전자는 서열번호 22 과 25의 프라이머를 이용한 PCR을 후 시퀀싱을 통해 야생형 lysC 유전자의 서열과 비교를 통하여 최종 확인하였다
실시예 3-4. 내재적 유전자 NCgl0959 결손 균주 제작 - 1
O-아세틸 호모세린 생성 극대화를 위하여 실시예 1-1에서 제작된 pDCM2-ΔNCgl0959 벡터를 실시예 3-3에서 제작된 균주 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) 에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 NCgl0959 유전자가 결손된 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959 을 수득하였다. NCgl0959 유전자의 불활성 여부는 서열번호 8와 9의 프라이머를 이용한 PCR 후 NCgl0959 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
실시예 3-5. 내재적 유전자 NCgl0959 결손 균주 제작 - 2
호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase, MetX)를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)에서 metX 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 NCgl0624, 서열번호 26)를 확보하고, 이에 근거하여 프로모터 부위(개시코돈 상단 약 300bp)로부터 터미네이터 부위(종결코돈 하단 약 100bp)까지 증폭하기 위한 프라이머 쌍(서열번호 27 및 28)의 양 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위를 삽입하여 고안하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metX 유전자의 코딩 부위 1546 bp의 DNA 단편을 수득하였다. pECCG117(KR 10-0057684) 벡터와 metX DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-metX WT라 명명하였다. 프라이머 서열은 하기 표 8와 같았다.
서열번호 서열명 서열
서열번호 27 metX F GGATCCCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC
서열번호 28 metX R GGATCCCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
제작된 pECCG117-metX WT 벡터를 3-3에서 제작된 균주 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) 및 실시에 3-4에서 제작된 균주 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959 에 각각 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/ℓ를 함유한 선별배지에 도말하여 각각 형질전환주 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) /pECCG117-metX WT 및 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959 /pECCG117-metX WT를 획득하였다.
실시예 3-6. O-아세틸 호모세린 생산능 평가
실시예 3-3 내지 3-5에서 제작된 균주들의 O-아세틸 호모세린 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-아세틸 호모세린을 분석하였다.
하기의 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주를 1백금이(inoculation loop) 접종하고, 33℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-아세틸 호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 표 9과 같았다.
<O-아세틸 호모세린 생산배지(pH 7.2)>
포도당 30 g, KH2PO4 2 g, 요소 3 g, (NH4)2SO4 40 g, 펩톤 2.5 g, CSL(Sigma) 5 g(10 ml), MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g, 메치오닌 400 mg, CaCO3 20 g (증류수 1 리터 기준)
Strains O-AH (g/L)
KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) 1.30
KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959 1.69
KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) /pECCG117-metX WT 2.10
KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959 /pECCG117-metX WT 2.73
그 결과, 상기 표 9과 같이 대조군 균주인 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K) 를 배양시 O-아세틸 호모세린이 1.3 g/L 축적되며 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959 배양 시 1.69g/L의 O-아세틸 호모세린이 축적되어 대조군 대비 130% 생산능을 보이는 것을 확인하였다.
또한, KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)/pECCG117-metX WT 균주를 배양하였을 경우 2.10g/L의 O-아세틸 호모세린이 축적되었으며, KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)ΔNCgl0959/pECCG117-metX WT 배양 시 O-아세틸 호모세린이 2.73g/L 로 KCCM12634P ΔmetB ΔmetY lysC(L377K)/pECCG117-metX WT 균주 대비 130%의 생산능을 보임을 확인하였다.
따라서, O-아세틸-L 호모세린 생산능이 증대된 균주에서 내재적 유전자 NCgl0959 결손 및 불활성화 시 목적 아미노산의 생산능을 추가로 향상시킬 수 있음을 확인 하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된, O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 약화는 불활성화인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 2의 핵산 염기서열이 결손된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 L-메티오닌/분지쇄 아미노산 배출자 YjeH 단백질 활성이 강화된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 10의 아미노산 서열이 도입된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  8. GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된, O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린의 생산 방법.
  9. GNAT 패밀리 N-아세틸트랜스퍼라아제 단백질 활성이 약화된, O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계;
    상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 O-아세틸 호모세린을 생산하는 단계; 및
    상기 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메치오닌의 생산 방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002081705A2 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human gnat acetyltransferase-like protein
KR20080102123A (ko) * 2006-07-28 2008-11-24 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌 전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
KR101641770B1 (ko) * 2014-06-23 2016-07-22 씨제이제일제당 (주) O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 o-아세틸 호모세린을 생산하는 방법
KR101825777B1 (ko) * 2014-06-05 2018-02-07 씨제이제일제당 (주) O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002081705A2 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human gnat acetyltransferase-like protein
KR20080102123A (ko) * 2006-07-28 2008-11-24 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌 전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
KR101825777B1 (ko) * 2014-06-05 2018-02-07 씨제이제일제당 (주) O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법
KR101641770B1 (ko) * 2014-06-23 2016-07-22 씨제이제일제당 (주) O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 o-아세틸 호모세린을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein 15 May 2021 (2021-05-15), ANONYMOUS : "GNAT family N-acetyltransferase [Corynebacterium glutamicum] -Protein -NCBI", XP093095264, retrieved from NCBI Database accession no. WP_011014038.1 *

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