WO2022211428A1 - 자연 살해 세포 분리 장치 및 그의 자연 살해 세포 분리 방법 - Google Patents

자연 살해 세포 분리 장치 및 그의 자연 살해 세포 분리 방법 Download PDF

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WO2022211428A1
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natural killer
blood
separation
killer cell
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이정민
김종만
신현영
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Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for separating natural killer cells and a method for separating natural killer cells thereof, and more particularly, by applying a disk-based automated ultra-precision thin film separation technology to minimize the separation deviation according to the manual method, high-purity natural It relates to a natural killer cell separation apparatus capable of isolating killer cells in high yield while minimizing stress in the separation process, and a method for isolating natural killer cells thereof.
  • Anticancer treatment using immune cells has received much attention in recent years because it is superior to existing treatments in terms of superiority of anticancer effects because it has significantly fewer side effects such as systemic toxicity or the risk of recurrence of second-generation anticancer drugs that occur in existing first-generation anticancer drugs. are receiving
  • Immune cell therapy using natural killer cells is one of the anticancer immune cell therapy therapies known as the fourth anticancer therapy. has a
  • natural killer cells unlike T cells, can be administered as a cell therapy even if they are not the patient's own cells, and therefore can be developed and used as a therapeutic agent at a relatively low cost.
  • it due to its high cytotoxicity, it can be used for the treatment of solid cancers as well as blood cancers, which have previously been confirmed to be effective using T cells, and has great potential as a therapeutic agent for the treatment of various types of cancer.
  • These natural killer cells are produced by separating them from blood.
  • physical stress such as high g-force or chemical stress such as antibody binding is used. Due to this, there was a problem that high sensitivity was generated or unwanted activation was induced.
  • a novel device for separating natural killer cells and a method for separating them with a disk-based ultra-precision thin film separation technology that can minimize the process time and stress applied to cells during the separation process and prevent the activation of natural killer cells is in demand.
  • the embodiment of the present invention minimizes the separation deviation according to the manual method by applying the disk-based automated ultra-precision thin film separation technology, so that high-purity natural killer cells can be separated in high yield, while minimizing the stress in the separation process.
  • an apparatus for isolating natural killer cells and a method for isolating natural killer cells thereof are provided.
  • the device for separating natural killer cells is provided to be interconnected in a rotatable disk body and the disk body, and uses the centrifugal force and density gradient material generated when the disk body rotates to extract natural killer cells from the blood. It may include a plurality of chambers for separating (Natural Killer cell).
  • the plurality of chambers are provided in the disk body, blood and a first density gradient medium (DGM, density gradient medium) are compartmentally accommodated, and a plasma layer by centrifugal force generated when the disk body rotates,
  • a mixing side chamber for mixing the blood mononuclear cell layer and the beads, and the peripheral blood mononuclear cell layer in which the beads are mixed, which is connected to the mixing side chamber and is provided with a 2 density gradient material, moved from the mixing side chamber, the second A separation side chamber divided into a layer of natural killer cells and a layer of beads with a density gradient material therebetween, and a natural killer cell separation chamber connected to the separation side chamber and accommodating the natural killer cells moved from the separation side chamber may include.
  • the main chamber may include a blood receiving space in which the blood is introduced and accommodated, and a material receiving space partitioned by the blood receiving space and a partition wall to receive and receive the first density gradient material.
  • the partition wall may be inclined upward from the blood receiving space to the material receiving space.
  • the first density gradient material may be a Ficoll having a higher density than plasma and peripheral blood mononuclear cells and a smaller density than red blood cells.
  • the disk body so as to be connected to the main chamber, it may further include a plasma separation chamber in which the plasma forming the plasma layer is separated.
  • between the main chamber and the plasma separation chamber, between the main chamber and the mixing side chamber, between the mixing side chamber and the separation side chamber, between the separation side chamber and the natural killer cell separation chamber in a channel connected by a , and the channel may be provided with an opening/closing valve for opening/closing.
  • the mixing side chamber may be provided in a funnel shape, and a channel connected to the separation side chamber may be connected to the collecting part.
  • the beads provided in the mixing side chamber have a magnetism, a magnet is provided outside the separation side chamber, and the peripheral blood mixed with the beads moved from the mixing side chamber to the separation side chamber Mononuclear cells may be separated into a layer of natural killer cells and a layer of beads by the second density gradient material and the magnet.
  • CD3, CD14, CD36, MHC class II DR/DP, CDw123 and CD235a antibodies may be bound to the surface of the bead, and blood components other than natural killer cells in whole blood are bound to the antibody. Since it can be captured by the bead layer, only natural killer cells can be isolated by separation of the bead layer.
  • the second density gradient material may be Percoll having a higher density than natural killer cells and a smaller density than beads.
  • the plurality of chambers include a buffer chamber, a blood chamber and a main chamber formed in a line in a direction away from the center of the disk body, and Phosphate Buffer Saline (PBS) is injected into the buffer chamber, and the Whole blood and an erythrocyte-labeled antibody for selectively removing erythrocytes from the whole blood are injected into the blood chamber, and a density gradient material may be injected into the main chamber.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • the plurality of chambers are provided at one side of the main chamber and include a plasma separation chamber for separating plasma and plasma, which are uppermost layers of blood layers generated as a result of centrifugation in the main chamber, and the other side of the main chamber. It may further include a natural killer cell separation chamber provided in the main chamber for separating the natural killer cells from the blood layer generated as a result of centrifugation in the main chamber.
  • the blood layer comprising.
  • the plasma and PBS formed in the uppermost layer of the blood layer formed in the main chamber may be sent to the plasma separation chamber, and then the natural killer cells in the blood layer may be sent to the natural killer cell separation chamber.
  • the buffer chamber and the blood chamber may be provided with a bent inlet to prevent the PBS or whole blood from leaving during the mixing process.
  • a channel for connection is provided between the blood chamber and the main chamber, between the main chamber and the plasma separation chamber, and between the main chamber and the natural killer cell separation chamber, and the channel is formed by electromagnetic waves or heat.
  • An open/close valve may be provided.
  • the disk body may include a central portion connected to the rotation driving unit and a plurality of divided portions respectively coupled to the central portion, and a plurality of chambers may be provided in each of the plurality of divided portions.
  • 1000ul of the blood may be introduced into the blood receiving space of the main chamber and 2000ul of the first density gradient material may be introduced into the material receiving space of the main chamber.
  • the method may further include a plasma separation step performed between the blood layer forming step and the mixing step, and separating the plasma generated during the blood layer forming step into a plasma separation chamber connected to the main chamber.
  • FIG. 1 is a perspective view schematically showing the disc body of the natural killer cell separation device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating a configuration of a plurality of chambers shown in FIG. 1 .
  • FIG. 3 is a view showing a state after the blood and the first density gradient material in the main chamber shown in FIG. 2 are centrifuged.
  • Figure 4 is a flow chart of the natural killer cell separation method of the natural killer cell separation apparatus of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the inflow step shown in FIG. 4 .
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a blood layer forming step shown in FIG. 4 .
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the plasma separation step shown in FIG. 4 .
  • FIG. 8 is a diagram illustrating the mixing step shown in FIG. 4 .
  • FIG. 9 is a diagram illustrating the separation step shown in FIG. 4 .
  • FIG. 10 is a diagram illustrating an acquisition step shown in FIG. 4 .
  • FIG. 11 is a plan view of an apparatus for separating natural killer cells according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a view showing the structure of a chamber provided in a divided portion of the disc body shown in FIG. 11 .
  • FIG. 13 is a view sequentially illustrating the separation process of natural killer cells according to the cell separation apparatus shown in FIG. 11 .
  • FIG. 14 and 15 are plan views of an apparatus for separating natural killer cells according to another embodiment of the present invention.
  • F2 Peripheral blood mononuclear cells or layers thereof
  • FIG. 1 is a perspective view schematically showing a disc body of a natural killer cell separation device according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating the configuration of a plurality of chambers shown in FIG. 1
  • FIG. 2 is a view showing a state after the blood and the first density gradient material in the main chamber shown in FIG. 2 are centrifuged.
  • Natural killer cell separation apparatus may include a rotation drive unit, and a disk body (100, see FIG. 1) rotated by the rotation drive unit.
  • the disk body 100 may include an upper cover covering the disk body 100, and may include an electromagnetic wave generator for opening and closing the on/off valve provided in the disk body 100, and a control unit for controlling the above-described components.
  • an electromagnetic wave generator for opening and closing the on/off valve provided in the disk body 100
  • a control unit for controlling the above-described components.
  • a heat generating unit that opens and closes the opening/closing valve through fluid control may be applied.
  • the disk body 100 can be rotated by driving the rotation drive unit under the control of the control unit, and thus the separation process for blood is carried out in the disk body 100 so that natural killer cells can be extracted. .
  • the disk body 100 is provided with a plurality of chambers 110 , 120 , 130 , 140 , 150 , and these chambers 110 , 120 , 130 , 140 , 150 serve as channels 105 (refer to FIG. 2 ). connected and an on/off valve 106 may be mounted within the channel 105 .
  • the electromagnetic wave generator can open the on-off valve 106 at a desired time by providing a laser or heat to the on-off valve 106, thereby discharging substances generated during the separation process for blood into the respective chambers 110, 120, 130, 140, 150).
  • the disc body 100 of the natural killer cell separation device of this embodiment will be mainly described with reference to, as described above, the natural killer cell separation device of this embodiment, the disc body 100, and A plurality of chambers 110 , 120 , 130 , 140 , 150 are provided, that is, the main chamber 110 of the present embodiment, the plasma separation chamber 120 , the mixing side chamber 130 , and the separation side chamber 140 . ), and may include a natural killer cell separation chamber 150 .
  • a total of four chamber structures may be provided in the disk body 100 of the present embodiment. That is, a total of four main chambers 110 are provided at intervals of 90 degrees in the circumferential direction with respect to the center of the disk body 100 , and in each main chamber 110 , a plasma separation chamber 120 , and a mixing side chamber 130 , the separation side chamber 140 , and the natural killer cell separation chamber 150 are connected to each other.
  • the structure of the main chamber 110 and the chambers 120, 130, 140, and 150 connected thereto is not limited to FIG. 1, and may be formed in a structure of a larger number of chambers or a smaller number of chambers. Of course.
  • the main chamber 110 is provided in the radial direction of the disk body 100 .
  • the main chamber 110 may have a rectangular shape elongated from a portion adjacent to the center of the disk body 100 to a portion adjacent to the outer edge of the disk body 100 when viewed from above.
  • the main chamber 110 when the main chamber 110 is viewed from the side as shown in FIG. 3 , the main chamber 110 includes a blood receiving space 111 into which blood B flows and receiving, and a blood receiving space 111 . and a partition wall 115 and may include a material receiving space 113 in which a first density gradient material (D1, Density Gradient Medium) is introduced and accommodated.
  • D1 Density Gradient Medium
  • the blood receiving space 111 has a slightly deeper depth than the material receiving space 113, which is, for example, 2000ul of blood B is introduced into the blood receiving space 111. This is because, for example, 1000ul of the first density gradient material D1 is introduced and accommodated in the material receiving space 113 .
  • the partition wall 115 formed in the main chamber 110 has a shape inclined upward from the blood receiving space 111 to the material receiving space 113, and this causes the disk body 100 to rotate to form blood B and When a centrifugal force is applied to the first density gradient material D1, a blood layer may be formed as shown in the lower drawing of FIG. 3 .
  • the blood B in the blood receiving space 111 and the first density gradient material D1 in the material receiving space 113 are transferred to the plasma layer F1 by centrifugal force.
  • Plasma the peripheral blood mononuclear cell layer (F2, PBMS layer), the first density gradient material layer (D1), it can be separated into a red blood cell layer (F3, RBC).
  • the introduced amount of the blood (B) is 2000ul and the introduced amount of the first density gradient material (D1) is 1000ul
  • the plasma layer (F1) is 930ul
  • peripheral blood The mononuclear cell layer (F2) is 200ul
  • the first density gradient material layer (D1) is 1000ul
  • the red blood cell layer (F3) may be separated to have an amount of 870ul.
  • the plasma layer F1 is formed from the middle portion of the blood receiving space 111 to the middle portion of the partition wall 115 , and the peripheral blood mononuclear cell layer F2 is formed on a portion of the partition wall 115 .
  • the first density gradient material layer D1 and the red blood cell layer F3 may be formed in the material receiving space 113 .
  • the first density gradient material D1 may be a Ficoll having a higher density than plasma and peripheral blood mononuclear cells and a smaller density than red blood cells, but is not limited thereto.
  • the plasma separation chamber 120 is connected by a channel 105 at one side of the main chamber 110, more precisely, the main plasma layer (F1) is formed
  • the main plasma layer (F1) is formed
  • One end of the channel 105 is connected to a part of the chamber 110 and the other end of the channel 105 is connected to the plasma separation chamber 120, so that the plasma F1 is received from the main chamber 110 after centrifugation and received.
  • the opening/closing valve 106 is mounted on the channel 105 connecting the main chamber 110 and the plasma separation chamber 120 , for example, when electromagnetic waves or heat are applied to the opening/closing valve 105 .
  • the valve 105 is opened, the plasma F1 may move from the main chamber 110 to the plasma separation chamber 120 .
  • the mixing side chamber 130 of this embodiment is connected to the channel 105 from the other side of the main chamber 110, more precisely, a part of the main chamber 110 in which the peripheral blood mononuclear cell layer F2 is formed and connected Therefore, the peripheral blood mononuclear cells (F2) separated after centrifugation of the disc body 100 may be moved to the mixing side chamber 130 .
  • a bead 135 (refer to FIG. 5 ) may be provided in the mixing side chamber 130 of the present embodiment. Accordingly, the peripheral blood mononuclear cells F2 moved from the main chamber 110 to the mixing side chamber 130 may be mixed with the beads 135 .
  • this mixing side chamber 130 has a funnel shape that gathers toward the outside of the disc body 100 as shown in FIG. 2, the peripheral blood mononuclear cells (F21, FIG. 8) in which the beads are mixed are It may be gathered in the collected portion of the mixing side chamber 130 .
  • the bead 135 of this embodiment may be a magnetic microbead.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the separation side chamber 140 of this embodiment is provided in the outer direction of the separation side chamber 140 , and the part where the mixing side chamber 130 is collected and the separation side based on FIG. 2 .
  • the upper side of the chamber 140 is connected to the channel, so that the bead-mixed peripheral blood mononuclear cells F21 may be moved to the separation side chamber 140 .
  • the second density gradient material D2 may be introduced and accommodated in the separation side chamber 140 .
  • a magnet 160 is provided on the outside of the separation side chamber 140, so the peripheral blood mononuclear cells F21 mixed with the beads moved from the mixing side chamber 130 to the separation side chamber 140 are magnets 160. It can be separated into natural killer cells (F22, NK cells, see FIG. 9) and beads 135 by the magnetic force and the second density gradient material (D2) applied from the.
  • the natural killer cell (F22) on one side (upper side based on FIG. 2), and on the other side (lower side based on FIG. 2) there is a bead 135. . Since the bead 135 receives a magnetic force (attractive force) by the magnet 160 , the natural killer cells F22 and the bead 135 may be separated.
  • the second density gradient material (D2) may be a Percoll having a higher density than the natural killer cells (F22) and a lower density than the beads (135), but is not limited thereto.
  • the natural killer cell separation chamber 150 of this embodiment is connected to the separation side chamber 140, the natural killer cells (F22) are moved from the separation side chamber 140 to the natural killer cell separation chamber 150, Killer cells (F22) can finally be isolated.
  • Figure 4 is a flow chart of the natural killer cell separation method of the natural killer cell separation apparatus of the present invention
  • Figures 5 to 10 are diagrams expressing the steps according to the flow chart of Figure 4.
  • the natural killer cell separation method includes an inflow step (S100) of introducing blood and a first density gradient material (D1) into the main chamber 110 (S100), and the disc body A blood layer forming step (S200) of rotating the 100 to form the blood (B) and the first density gradient material (D1) in the main chamber 110 into a plurality of blood layers (S200), and a plasma (F1) of the formed blood layers
  • the blood (B) is introduced and accommodated in the blood receiving space 111 , and the first density gradient material ( D1 ) is introduced into the material receiving space 113 . can be imported and accepted.
  • the gradient material layer (D1) and the red blood cell layer (F3) may be formed, thereby forming a basis for separation of the plasma layer (F1) and the peripheral blood mononuclear cell layer (F2).
  • the opening/closing valve 106 of the channel 105 connecting the main chamber 110 and the plasma separation chamber 120 is opened to open the plasma separation chamber ( The plasma F1 may be separated in 120 .
  • the peripheral blood mononuclear cells F2 and the beads 135 moved from the main chamber 110 to the mixing side chamber 130 may be mixed.
  • the peripheral blood mononuclear cells (F21) mixed with beads are moved from the mixing side chamber 130 to the separation side chamber 140, and then the separation side chamber ( 140) by the action of the second density gradient material (D2) and the magnetic force applied from the magnet 160 within the natural killer cells (F22) and the beads 135 may form a separated layer.
  • natural killer cells (F22) are separated from the separation side chamber 140 to the natural killer cell separation chamber 160, and through this, natural killer cells (F22) ) can be obtained.
  • 80ul of the antibody can be applied, the magnetic beads 135 can be applied 400ul, and the rotation of the disk body 100 for 15 minutes under these conditions can be made. Wash is not applied, and the magnet operation time can be applied to 2 minutes, but is not limited thereto.
  • the separation deviation according to the manual method can be minimized to separate high-purity natural killer cells in a high yield while the separation process stress can be minimized.
  • FIG. 11 is a plan view of an apparatus for separating natural killer cells according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 12 is a view showing the chamber structure provided in the divided portion of the disc body shown in FIG. 11, and
  • FIG. 13 is shown in FIG. It is a diagram sequentially illustrating the separation process of natural killer cells according to the illustrated cell separation apparatus.
  • the natural killer cell separation apparatus may include a first split-type disc body 200 .
  • the divided disk body 200 of the present embodiment may include a central portion 201 to which the rotation drive unit is coupled, and a divided portion 205 detachably coupled to the four corners of the central portion 201 . .
  • the four corners of the central portion 201 may be provided with a curved groove 202 with an inwardly curved end, and the divided portion 205 has a hook coupled to the groove 202.
  • a member 206 may be provided.
  • the divided portion 205 can be coupled to or separated from the central portion 201 .
  • a plurality of chambers may be provided in each divided portion 205 .
  • the plurality of chambers of the present embodiment may include a buffer chamber 220 , a blood chamber 230 , and a main chamber 210 that are formed in a line away from the portion facing the central portion 201 .
  • a plasma separation chamber 240 and a natural killer cell separation chamber 250 may be provided on both sides of the main chamber 210 .
  • Reactive substances may be moved to the chamber 250 , and natural killer cells may be finally isolated.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • an erythrocyte-labeled antibody for selectively removing red blood cells from whole blood and whole blood is injected into the blood chamber 230
  • a density gradient is injected into the main chamber 210 .
  • a substance may be injected.
  • the buffer chamber 220 and the blood chamber 230 may be provided with a bent inlet 225 to prevent the PBS or whole blood from escaping during the mixing process.
  • connection channel between the blood chamber 230 and the main chamber 210, between the main chamber 210 and the plasma separation chamber 240, between the main chamber 210 and the natural killer cell separation chamber 250 for a connection channel ( 208 is provided, and the channel 208 may be provided with a valve 209 that is opened and closed by electromagnetic waves or heat.
  • valve 209 made of, for example, a wax material may be opened using an electromagnetic wave generator or a heat generator at an appropriate stage in the cell separation process.
  • a mixing process is performed for, for example, about 20 minutes in order to generate the whole blood 275 to which the antibody is attached to the red blood cells.
  • the whole blood ( 275) and PBS 271 can be mixed for about 60 seconds.
  • the valve 209 between the blood chamber 230 and the main chamber 210 is opened to lower the mixed whole blood 276 into the main chamber 210 .
  • the blood layer may be formed by centrifuging the whole blood 276 using the density gradient material 274 in the main chamber 210 .
  • the plasma and PBS 277 in the uppermost layer of the formed blood layer are separated by a plasma separation chamber 240, and then, as shown in (h), natural killer cells 276 By separating into the natural killer cell separation chamber 250, it is possible to finish the natural killer cell separation process.
  • the chamber structure according to another embodiment of the present invention may be provided in the divided disk body, it is natural that it may be provided in the integrated disk body, which will be described with reference to FIGS. 14 and 15 . .
  • FIG. 14 and 15 are plan views of an apparatus for separating natural killer cells according to another embodiment of the present invention.
  • a total of six chamber structures may be provided in the integrated disk body 300
  • a total of three chamber structures may be provided in the integrated disk body 400 . have. Of course, it is not limited to this number.

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Abstract

본 발명의 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치는, 회전 가능한 디스크몸체 및 상기 디스크몸체에서 상호 연결되도록 구비되며, 상기 디스크몸체의 회전 시 발생되는 원심력과 밀도구배물질을 이용하여 혈액으로부터 자연 살해 세포(Natural Killer cell)를 분리시키는 복수 개의 챔버를 포함할 수 있다.

Description

자연 살해 세포 분리 장치 및 그의 자연 살해 세포 분리 방법
본 발명은 자연 살해 세포 분리 장치 및 그의 자연 살해 세포 분리 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 디스크 기반의 자동화 초정밀 박막 분리 기술을 적용함으로써 수동(manual) 방식에 따른 분리 편차를 최소화하여 고순도의 자연 살해 세포를 높은 수득률로 분리할 수 있으면서도 분리 과정에서의 스트레스를 최소화할 수 있는 자연 살해 세포 분리 장치 및 그의 자연 살해 세포 분리 방법에 관한 것이다.
면역세포를 이용한 항암치료는 기존의 1세대 항암치료제에서 발생하는 전신 독성 또는 2세대 항암치료제의 재발의 위험 등의 부작용이 현저히 적기 때문에, 항암 효과의 우수성의 측면에서 기존 치료제 대비 우수하여 최근 많은 관심을 받고 있다.
이중 자연 살해 세포(NK cell, Natural Killer cell)를 이용한 면역세포 치료는 제4의 항암 치료로 알려진 항암 면역세포 치료 요법 중 하나이며, 부작용이 적어서 타인의 면역세포를 이용할 수 있는 유일한 세포 치료라는 장점을 가지고 있다.
다양한 면역세포 중에서도 자연 살해 세포는 T 세포와는 달리 환자 본인의 세포가 아닌 경우에도 세포 치료제로 투여가 가능하고 그로 인해 상대적으로 적은 비용으로도 치료제로 개발 및 이용이 가능하다. 또한 높은 세포 독성으로 인해, 기존에 T 세포를 이용해 효과를 확인한 혈액암뿐 아니라 고형암의 치료에도 활용 가능하여 보다 다양한 종류의 암 치료를 위한 치료제로서의 잠재력이 크다.
이러한 자연 살해 세포는 혈액으로부터 분리하여 생성하는데, 종래의 자연 살해 세포 분리 방식의 경우, 분리 과정에서 예를 들면 높은 지-포스(g-force)와 같은 물리적인 스트레스 또는 항체 바인딩과 같은 화학적 스트레스로 인해 민감성이 높게 발생되거나 또는 원치 않는 활성화가 유발되는 문제가 있었다.
또한 종래의 자연 살해 세포 분리 방식 중 DGC 분리 방식의 경우 파이펫팅(pippeting) 방식의 자연 살해 세포층 추출 과정에서 원하지 않는 세포 오염 또는 자연 살해 세포의 손실이 발생될 우려가 있다.
또는 종래의 분리 방식에 있어서는, 높은 원심력으로 인해 자연 살해 세포의 활성화가 유발될 가능성이 있었고, 이로 인해 자연 살해 세포의 손실이 발생되거나 파손이 발생될 수 있었다.
따라서, 분리 과정에서 프로세스 타임 및 세포에 가해지는 스트레스를 최소화할 수 있고, 자연 살해 세포의 활성화를 방지할 수 있는 디스크 기반 초정밀 박막 분리 기술이 적용된 새로운 구성의 자연 살해 세포 분리 장치 및 이의 분리 방법이 요구되는 실정이다.
관련 선행기술로는, 대한민국특허 등록번호 10-1760764(발명의 명칭: NK세포의 대량 증식을 위한 배양방법) 등이 있다.
본 발명의 실시예는 디스크 기반의 자동화 초정밀 박막 분리 기술을 적용함으로써 수동(manual) 방식에 따른 분리 편차를 최소화하여 고순도의 자연 살해 세포를 높은 수득률로 분리할 수 있으면서도 분리 과정에서의 스트레스를 최소화할 수 있는 자연 살해 세포 분리 장치 및 그의 자연 살해 세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치는, 회전 가능한 디스크몸체 및 상기 디스크몸체에서 상호 연결되도록 구비되며, 상기 디스크몸체의 회전 시 발생되는 원심력과 밀도구배물질을 이용하여 혈액으로부터 자연 살해 세포(Natural Killer cell)를 분리시키는 복수 개의 챔버를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 복수 개의 챔버는, 상기 디스크몸체에 구비되며, 혈액 및 제1 밀도구배물질(DGM, density gradient medium)이 구획되게 수용되며 상기 디스크몸체의 회전 시 발생되는 원심력에 의해 플라즈마층, 말초혈액단핵세포(PBMC)층, 제1 밀도구배물질(DGM)층 및 적혈구층이 형성되는 메인 챔버와, 상기 메인 챔버에 연결되고 비드(bead)를 구비하며, 상기 메인 챔버로부터 이동된 상기 말초혈액단핵세포층과 상기 비드를 혼합시키는 혼합 사이드 챔버와, 상기 혼합 사이드 챔버와 연결되고 2 밀도구배물질을 구비하며, 상기 혼합 사이드 챔버로부터 이동된 상기 비드가 혼합된 상기 말초혈액단핵세포층을 상기 제2 밀도구배물질을 사이에 두고 자연 살해 세포의 층과 비드의 층으로 나누는 분리 사이드 챔버와, 상기 분리 사이드 챔버와 연결되며, 상기 분리 사이드 챔버로부터 이동된 상기 자연 살해 세포가 수용되는 자연 살해 세포 분리 챔버를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 메인 챔버는, 상기 혈액이 유입되어 수용되는 혈액 수용 공간 및 상기 혈액 수용 공간과 격벽에 의해 구획되며 상기 제1 밀도구배물질이 유입되어 수용되는 물질 수용 공간을 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 격벽은 상기 혈액 수용 공간에서 상기 물질 수용 공간으로 갈수록 상방으로 경사질 수 있다.
일측에 따르면, 상기 제1 밀도구배물질은 플라즈마 및 말초혈액단핵세포보다는 밀도가 크고 적혈구보다는 밀도가 작은 피콜(Ficoll)일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 메인 챔버와 연결되도록 상기 디스크몸체에 구비되며, 상기 플라즈마층을 형성하는 플라즈마가 분리되는 플라즈마 분리 챔버를 더 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 메인 챔버와 상기 플라즈마 분리 챔버 사이, 상기 메인 챔버와 상기 혼합 사이드 챔버 사이, 상기 혼합 사이드 챔버 및 상기 분리 사이드 챔버 사이, 상기 분리 사이드 챔버 및 상기 자연 살해 세포 분리 챔버 사이는 채널에 의해 연결되며, 상기 채널에는 개폐를 위한 개폐 밸브가 구비될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 혼합 사이드 챔버는 깔때기 형상으로 마련되며, 모아지는 부분에 상기 분리 사이드 챔버와 연결된 채널이 연결될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 혼합 사이드 챔버 내에 구비되는 상기 비드는 자성을 가지며, 상기 분리 사이드 챔버의 외측에는 마그네트가 구비되며, 상기 혼합 사이드 챔버에서 상기 분리 사이드 챔버로 이동된 상기 비드가 혼합된 상기 말초혈액단핵세포는 상기 제2 밀도구배물질 및 상기 마그네트에 의해서 자연 살해 세포의 층 및 비드의 층으로 분리될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 비드의 표면에는 CD3, CD14, CD36, MHC class II DR/DP, CDw123 및 CD235a 항체가 결합된 것일 수 있으며, 전혈 중 자연 살해 세포를 제외한 혈액 성분이 비드에 결합된 상기 항체에 의하여 포집될 수 있으므로, 비드의 층의 분리에 의하여 자연 살해 세포만을 분리할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 제2 밀도구배물질은 자연 살해 세포보다는 밀도가 크고 비드보다는 밀도가 작은 퍼콜(Percoll)일 수 있다.
일측에 따르면, 상기 복수 개의 챔버는, 상기 디스크몸체의 중앙으로부터 멀어지는 방향으로 일렬로 형성되는 버퍼 챔버, 블러드 챔버 및 메인 챔버를 포함하며, 상기 버퍼 챔버에는 PBS(Phosphate Buffer Saline)가 주입되고, 상기 블러드 챔버에는 전혈과 상기 전혈로부터 적혈구 선택적으로 제거하기 위한 적혈구 표지 항체가 주입되고, 상기 메인 챔버에는 밀도구배물질이 주입될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 복수 개의 챔버는, 상기 메인 챔버의 일측에 구비되며 상기 메인 챔버에서의 원심 분리 결과 발생되는 혈액층 중 최상층인 혈장 및 플라즈마를 분리하는 플라즈마 분리 챔버와, 상기 메인 챔버의 다른 일측에 구비되며 상기 메인 챔버에서의 원심 분리 결과 발생되는 혈액층 중 자연 살해 세포를 분리하는 자연 살해 세포 분리 챔버를 더 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 버퍼 챔버에 PBS를 주입하고, 상기 블러드 챔버에 전혈과 항체를 주입하고, 상기 메인 챔버에 밀도구배물질을 주입하는 주입한 다음, 적혈구에 항체를 붙이기 위해 믹싱을 한 후, 상기 버퍼 챔버에 있는 PBS를 상기 블러드 챔버로 내려 상기 블러드 챔버 내의 적혈구가 제거된 전혈과 상기 PBS를 혼합한 다음, 상기 PBS가 혼합된 전혈을 상기 메인 챔버로 보낸 후 원심분리에 의해 밀도구배물질층을 포함하는 상기 혈액층을 형성할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 메인 챔버 내에서 형성된 상기 혈액층 중 최상층에 형성된 혈장과 PBS를 상기 플라즈마 분리 챔버로 보낸 다음, 상기 혈액층 중 자연 살해 세포를 자연 살해 세포 분리 챔버로 보낼 수 있다.
일측에 따르면, 상기 버퍼 챔버 및 상기 블러드 챔버에는 믹싱 과정에서 PBS 또는 전혈의 이탈을 방지하도록 구부러진 인렛이 구비될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 블러드 챔버와 상기 메인 챔버 사이, 상기 메인 챔버와 상기 플라즈마 분리 챔버 사이, 상기 메인 챔버와 상기 자연 살해 세포 분리 챔버 사이에는 연결을 위한 채널이 구비되고, 상기 채널에는 전자기파 또는 열에 의해 개폐되는 밸브가 구비될 수 있다.
일측에 따르면, 상기 디스크몸체는, 회전 구동부에 연결되는 중앙 부분 및 상기 중앙 부분에 각각 결합되는 복수 개의 분할 부분을 포함하며, 상기 복수 개의 분할 부분 각각에 복수 개의 챔버가 구비될 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법은, 상기 메인 챔버에 구비되는 혈액 수용 공간에 혈액을 유입시키고 물질 수용 공간에 제1 밀도구배물질을 유입시키는 유입 단계와, 상기 디스크몸체를 회전시켜서 상기 메인 챔버 내의 상기 혈액 및 상기 제1 밀도구배물질을 복수 개의 혈액층으로 형성하는 혈액층 형성 단계와, 상기 복수 개의 혈액층 중 말초혈액단핵세포를 상기 혼합 사이드 챔버로 이동시킨 다음 상기 혼합 사이드 챔버 내의 비드와 혼합시키는 혼합 단계와, 상기 혼합 사이드 챔버로부터 상기 비드가 혼합된 상기 말초혈액단핵세포를 상기 분리 사이드 챔버로 이동시킨 후 상기 분리 사이드 챔버 내에 구비된 제2 밀도구배물질과 상기 분리 사이드 챔버에 인접한 마그네트의 자력을 이용하여 제2 밀도구배물질을 기준으로 자연 살해 세포와 비드를 분리시키는 분리 단계와, 상기 분리 사이드 챔버로부터 상기 자연 살해 세포를 상기 자연 살해 세포 분리 챔버로 분리시킴으로써 자연 살해 세포를 획득하는 획득 단계를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 유입 단계 시, 상기 메인 챔버의 혈액 수용 공간에 상기 혈액 1000ul를 유입시키고 상기 메인 챔버의 물질 수용 공간에 상기 제1 밀도구배물질 2000ul를 유입시킬 수 있다.
일측에 따르면, 상기 혈액층 형성 단계 및 상기 혼합 단계 사이에 실행되며, 상기 혈액층 형성 단계 시 생성되는 플라즈마를 상기 메인 챔버와 연결된 플라즈마 분리 챔버로 분리시키는 플라즈마 분리 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 자동화 방식에 따른 분리 편차의 최소화가 가능하여 고순도의 자연 살해 세포를 높은 수득률로 분리할 수 있으면서도 분리 과정에서의 스트레스를 최소화할 수 있으므로 자연 살해 세포의 분리를 효율적으로 실행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 디스크몸체를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 다수의 챔버들의 구성을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 도 2에 도시된 메인 챔버의 혈액 및 제1 밀도구배물질이 원심 분리된 후 상태를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법의 순서도이다.
도 5는 도 4에 도시된 유입 단계를 표현한 도면이다.
도 6은 도 4에 도시된 혈액층 형성 단계를 표현한 도면이다.
도 7은 도 4에 도시된 플라즈마 분리 단계를 표현한 도면이다.
도 8은 도 4에 도시된 혼합 단계를 표현한 도면이다.
도 9는 도 4에 도시된 분리 단계를 표현한 도면이다.
도 10은 도 4에 도시된 획득 단계를 표현한 도면이다.
도 11은 본 발명의 다른 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 평면도이다.
도 12는 도 11에 도시된 디스크몸체 중 분할 부분에 구비되는 챔버 구조를 도시한 도면이다.
도 13은 도 11에 도시된 세포 분리 장치에 따른 자연 살해 세포의 분리 과정을 순차적으로 도시한 도면이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 평면도들이다.
*도면 중 주요 부호에 대한 설명
100: 디스크몸체
105: 채널
106: 개폐 밸브
110: 메인 챔버
111: 혈액 수용 공간
113: 물질 수용 공간
115: 격벽
120: 플라즈마 분리 챔버
130: 혼합 사이드 챔버
135: 비드
140: 분리 사이드 챔버
150: 자연 살해 세포 분리 챔버
160: 마그네트
B: 혈액
D1: 제1 밀도구배물질
D2: 제2 밀도구배물질
F1: 플라즈마 또는 그의 층
F2: 말초혈액단핵세포 또는 그의 층
F21: 비드가 혼합된 말초혈액단핵세포
F22: 자연 살해 세포
F3: 적혈구층
본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 디스크몸체를 개략적으로 도시한 사시도이고, 도 2는 도 1에 도시된 다수의 챔버들의 구성을 개략적으로 도시한 도면이고, 도 3은 도 2에 도시된 메인 챔버의 혈액 및 제1 밀도구배물질이 원심 분리된 후 상태를 도시한 도면이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치는, 도시하지는 않았지만, 회전 구동부와, 회전 구동부에 의해 회전되는 디스크몸체(100, 도 1 참조)를 포함할 수 있다.
또한, 도시하지는 않았지만, 디스크몸체(100)를 덮는 상부커버를 포함하며, 디스크몸체(100)에 구비되는 개폐밸브를 개폐하기 위한 전자기파 발생부를 포함할 수 있고, 전술한 구성들을 제어하기 위한 제어부를 포함할 수 있다.
다만, 전자기파 발생부 이외에도 유체 제어를 통해 개폐밸브를 개폐하는 열 발생부 등이 적용될 수 있음은 당연하다.
다시 말해, 제어부의 제어에 의해서 회전 구동부가 구동하여 디스크몸체(100)가 회전할 수 있고, 이로 인해 디스크몸체(100) 내에서 혈액에 대한 분리 과정이 진행됨으로써 자연 살해 세포를 추출해낼 수 있는 것이다.
후술하겠지만, 디스크몸체(100)에는 복수 개의 챔버(110, 120, 130, 140, 150)들이 구비되는데, 이들 챔버(110, 120, 130, 140, 150)는 채널(105, 도 2 참조)로 연결되고 채널(105) 내에는 개폐 밸브(106)가 장착될 수 있다. 전자기파 발생부는 개폐 밸브(106)에 레이저 또는 열을 제공함으로써 원하는 시기에 개폐 밸브(106)를 열 수 있고, 이로 인해 혈액에 대한 분리 과정 중 발생되는 물질을 각각의 챔버(110, 120, 130, 140, 150)들로 보낼 수 있다.
도 1 및 도 2를 참조하여 본 실시예의 자연 살해 세포 분리 장치의 디스크몸체(100)를 중심으로 설명하면, 전술한 것처럼, 본 실시예의 자연 살해 세포 분리 장치는, 디스크몸체(100)와, 이에 구비되는 복수 개의 챔버(110, 120, 130, 140, 150)들, 즉 본 실시예의 메인 챔버(110)와, 플라즈마 분리 챔버(120)와, 혼합 사이드 챔버(130)와, 분리 사이드 챔버(140)와, 자연 살해 세포 분리 챔버(150)를 포함할 수 있다.
도 1을 참조하면, 본 실시예의 디스크몸체(100)에는 각각의 총 4개의 챔버 구조들이 구비될 수 있다. 즉, 디스크몸체(100)의 중심을 기준으로 원주 방향으로 90도 간격으로 총 4개의 메인 챔버(110)가 구비되고, 각각의 메인 챔버(110)에, 플라즈마 분리 챔버(120), 혼합 사이드 챔버(130), 분리 사이드 챔버(140), 자연 살해 세포 분리 챔버(150)가 연결되도록 구비되는 것이다.
다만, 메인 챔버(110) 및 이에 연결되는 챔버(120, 130, 140, 150)들의 구조가 도 1에 한정되는 것은 아니며, 더 많은 수의 챔버 또는 더 적은 수의 챔버 구조로 형성될 수 있음은 당연하다.
하나의 챔버 구조에 대해서 도 1 및 도 2를 참조하면, 디스크몸체(100)의 방사 방향으로 메인 챔버(110)가 구비된다. 메인 챔버(110)는, 상방에서 봤을 때, 디스크몸체(100)의 중앙에 인접한 부분에서부터 디스크몸체(100)의 외연에 인접한 부분까지 길게 형성되는 직사각 형상을 가질 수 있다.
아울러, 메인 챔버(110)를 측면에서 봤을 때는 도 3에 도시된 바와 같은데, 메인 챔버(110)는, 혈액(B)이 유입되어 수용되는 혈액 수용 공간(111)과, 혈액 수용 공간(111)과 격벽(115)에 의해 구획되며 제1 밀도구배물질(D1, Density Gradient Medium)이 유입되어 수용되는 물질 수용 공간(113)을 포함할 수 있다.
도 3에 도시된 것처럼, 혈액 수용 공간(111)은 물질 수용 공간(113)에 비해 약간 더 깊은 깊이를 가지는데, 이는 혈액 수용 공간(111)에 예를 들면 2000ul의 혈액(B)이 유입되어 수용되고, 물질 수용 공간(113)에는 예를 들면 1000ul의 제1 밀도구배물질(D1)이 유입되어 수용되기 때문이다.
다만, 이들의 형상이 이에 한정되는 것은 아니며, 각각의 수용 공간(111, 113)에 수용되는 혈액(B) 또는 제1 밀도구배물질(D1)의 용량도 상기 수치에 한정되는 것은 아니다.
메인 챔버(110) 내에 형성된 격벽(115)은 혈액 수용 공간(111)에서 물질 수용 공간(113)으로 갈수록 상방으로 경사진 형상을 가지며, 이로 인해 디스크몸체(100)가 회전하여 혈액(B)과 제1 밀도구배물질(D1)에 원심력이 가해지는 경우, 도 3의 아래 도면에 도시된 것처럼, 혈액층이 형성될 수 있다.
부연하면, 디스크몸체(100)의 회전 시, 혈액 수용 공간(111)에 있었던 혈액(B) 및 물질 수용 공간(113)에 있었던 제1 밀도구배물질(D1)이 원심력에 의해서 플라즈마층(F1, Plasma), 말초혈액단핵세포층(F2, PBMS층), 제1 밀도구배물질층(D1), 적혈구층(F3, RBC)으로 분리될 수 있다.
이때, 전술한 것처럼, 혈액(B)의 유입된 양이 2000ul이고, 제1 밀도구배물질(D1)의 유입된 양이 1000ul인 경우, 원심 분리 후, 플라즈마층(F1)은 930ul이고, 말초혈액단핵세포층(F2)은 200ul이고, 제1 밀도구배물질층(D1)은 1000ul이며, 적혈구층(F3)은 870ul의 양을 가지도록 분리될 수 있다.
도 3을 참조하면, 혈액 수용 공간(111)의 중간 부분 정도부터 격벽(115)의 중간 부분 정도까지 플라즈마층(F1)이 형성되고, 격벽(115)의 일부분에 말초혈액단핵세포층(F2)이 형성되고, 물질 수용 공간(113)에 제1 밀도구배물질층(D1), 적혈구층(F3)이 형성될 수 있다.
여기서, 제1 밀도구배물질(D1)는 플라즈마 및 말초혈액단핵세포보다는 밀도가 크고 적혈구보다는 밀도가 작은 피콜(Ficoll)일 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 플라즈마 분리 챔버(120)는, 도 1 및 도 2에 도시된 것처럼, 메인 챔버(110)의 일측에서 채널(105)에 의해 연결되는데, 더 정확하게는, 플라즈마층(F1)이 형성되는 메인 챔버(110)의 부분에 채널(105)의 일단이 연결되고 채널(105)의 타단이 플라즈마 분리 챔버(120)에 연결됨으로써, 원심 분리 후 메인 챔버(110)로부터 플라즈마(F1)를 받아서 수용할 수 있다.
전술한 것처럼, 메인 챔버(110)와 플라즈마 분리 챔버(120)를 연결하는 채널(105)에는 개폐 밸브(106)가 장착되며, 예를 들면 전자기파 또는 열이 개폐 밸브(105)에 가해지는 경우 개폐 밸브(105)가 열림으로써 메인 챔버(110)로부터 플라즈마 분리 챔버(120)로의 플라즈마(F1)의 이동이 이루어질 수 있다.
이는 후술할 다른 챔버들의 연결을 위한 채널(105)에서도 적용되는 것이기 때문에, 이에 대한 설명은 앞으로 생략하기로 한다.
한편, 본 실시예의 혼합 사이드 챔버(130)는, 메인 챔버(110)의 타측에서 채널(105)로 연결되는데, 더 정확하게는 말초혈액단핵세포층(F2)이 형성되는 메인 챔버(110)의 부분과 연결된다. 따라서, 디스크몸체(100)의 원심 분리 후 분리된 말초혈액단핵세포(F2)가 혼합 사이드 챔버(130)로 이동될 수 있다.
본 실시예의 혼합 사이드 챔버(130)에는 비드(135, 도 5 참조)가 구비될 수 있다. 따라서, 메인 챔버(110)로부터 혼합 사이드 챔버(130)로 이동된 말초혈액단핵세포(F2)가 비드(135)와 혼합될 수 있다.
이러한 혼합 사이드 챔버(130)는, 도 2에 도시된 것처럼, 디스크몸체(100)의 바깥 방향으로 갈수록 모아지는 깔때기 형상을 가지기 때문에, 비드가 혼합된 말초혈액단핵세포(F21, 도 8참조)는 혼합 사이드 챔버(130)의 모아진 부분에 모일 수 있다.
본 실시예의 비드(135)는 자성을 가진 마이크로 비드일 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 실시예의 분리 사이드 챔버(140)는, 도 2에 도시된 것처럼, 분리 사이드 챔버(140)의 외측 방향에 구비되는데, 혼합 사이드 챔버(130)의 모아지는 부분과 도 2 기준으로 분리 사이드 챔버(140)의 상측이 채널로 연결되어 비드가 혼합된 말초혈액단핵세포(F21)가 분리 사이드 챔버(140)로 이동될 수 있다.
이러한 분리 사이드 챔버(140) 내에는 제2 밀도구배물질(D2)이 유입되어 수용될 수 있다. 분리 사이드 챔버(140)의 외측에는 마그네트(160)가 구비되며, 따라서 혼합 사이드 챔버(130)에서 분리 사이드 챔버(140)로 이동된 비드가 혼합된 말초혈액단핵세포(F21)는 마그네트(160)로부터 가해지는 자력과 제2 밀도구배물질(D2)의 의해서 자연 살해 세포(F22, NK cell, 도 9 참조) 및 비드(135)로 분리될 수 있다.
즉, 제2 밀도구배물질(D2)을 기준으로 일측에는(도 2 기준으로 상측에는) 자연 살해 세포(F22)가 있는 것이고, 타측에는(도 2 기준으로 하측에는) 비드(135)가 있는 것이다. 비드(135)는 마그네트(160)에 의해서 자력(인력)을 받기 때문에 자연 살해 세포(F22)와 비드(135)의 분리가 이루어질 수 있다.
여기서, 제2 밀도구배물질(D2)은 자연 살해 세포(F22)보다는 밀도가 크고 비드(135)보다는 밀도가 작은 퍼콜(Percoll)일 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 실시예의 자연 살해 세포 분리 챔버(150)는 분리 사이드 챔버(140)와 연결되는데, 분리 사이드 챔버(140)로부터 자연 살해 세포 분리 챔버(150)로 자연 살해 세포(F22)가 이동되어 자연 살해 세포(F22)를 최종적으로 분리시킬 수 있다.
이하에서는 전술한 구성을 갖는 본 발명의 일 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법에 대해서 도 4 및 도 5를 참조하여 설명하기로 한다.
도 4는 본 발명의 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법의 순서도이며, 도 5 내지 도 10은 도 4의 순서도에 따른 단계를 표현한 도면들이다.
이들 도면에 도시된 것처럼, 본 발명의 일 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 방법은, 혈액 및 제1 밀도구배물질(D1)을 메인 챔버(110)에 유입시키는 유입 단계(S100)와, 디스크몸체(100)를 회전시켜 메인 챔버(110) 내의 혈액(B) 및 제1 밀도구배물질(D1)을 복수 개의 혈액층으로 형성하는 혈액층 형성 단계(S200)와, 형성된 혈액층 중 플라즈마(F1)를 플라즈마 분리 챔버(120)로 분리시키는 플라즈마 분리 단계(S300)와, 형성된 혈액층 중 말초혈액단핵세포(F2)를 혼합 사이드 챔버(130)로 분리시킨 후 비드(135)와 혼합시키는 혼합 단계(S400)와, 비드가 혼합된 말초혈액단핵세포(F21)를 분리 사이드 챔버(140)로 이동시킨 후 제2 밀도구배물질(D2)과 마그네트(160)를 이용하여 자연 살해 세포(F22)와 비드(135)를 분리하는 분리 단계(S500)와, 분리 사이드 챔버(140)로부터 자연 살해 세포(F22)를 자연 살해 세포 분리 챔버(150)로 분리시킴으로써 자연 살해 세포(F22)를 획득하는 획득 단계(S600)를 포함할 수 있다.
도 5에 도시된 것처럼, 본 실시예의 유입 단계(S100) 시, 혈액 수용 공간(111)에 혈액(B)이 유입되어 수용되고, 물질 수용 공간(113)에 제1 밀도구배물질(D1)이 유입되어 수용될 수 있다.
도 6에 도시된 것처럼, 본 실시예의 혈액층 형성 단계(S200) 시, 디스크몸체(100)의 회전 시 발생되는 원심력을 이용하여 플라즈마층(F1), 말초혈액단핵세포층(F2), 제1 밀도구배물질층(D1), 적혈구층(F3)이 형성될 수 있으며, 이로 인해 플라즈마층(F1), 말초혈액단핵세포층(F2)의 분리를 위한 기반이 조성될 수 있다.
도 7에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 플라즈마 분리 단계(S300) 시, 메인 챔버(110)와 플라즈마 분리 챔버(120)를 연결하는 채널(105)의 개폐 밸브(106)를 열어서 플라즈마 분리 챔버(120)에 플라즈마(F1)를 분리할 수 있다.
도 8에 도시된 것처럼, 본 실시예의 혼합 단계(S400) 시, 메인 챔버(110)로부터 혼합 사이드 챔버(130)로 이동된 말초혈액단핵세포(F2)와 비드(135)가 혼합될 수 있다.
도 9에 도시된 것처럼, 본 실시예의 분리 단계(S500) 시, 혼합 사이드 챔버(130)로부터 분리 사이드 챔버(140)로 비드가 혼합된 말초혈액단핵세포(F21)가 이동된 후 분리 사이드 챔버(140) 내에서 제2 밀도구배물질(D2)의 작용과 마그네트(160)에서 가해지는 자력에 의해서 자연 살해 세포(F22)와 비드(135)가 분리된 층을 형성할 수 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 획득 단계(S600) 시, 분리 사이드 챔버(140)로부터 자연 살해 세포 분리 챔버(160)로 자연 살해 세포(F22)가 분리되고 이를 통해 자연 살해 세포(F22)를 획득할 수 있다.
이러한 과정의 조건에 대해 설명하면, 항체가 80ul이 적용될 수 있고, 자성이 있는 비드(135)가 400ul 적용될 수 있으며, 이러한 조건 하에 15분 동안의 디스크몸체(100)의 회전이 이루어질 수 있다. 워쉬는 적용되지 않으며, 마그네트 가동 시간은 2분으로 적용할 수 있는데 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 디스크 기반의 자동화 초정밀 박막 분리 기술을 적용함으로써 수동(manual) 방식에 따른 분리 편차를 최소화하여 고순도의 자연 살해 세포를 높은 수득률로 분리할 수 있으면서도 분리 과정에서의 스트레스를 최소화할 수 있다.
한편, 이하에서는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 분리 장치에 대해서 설명하되 전술한 일 실시예의 세포 분리 장치와 실질적으로 대응되는 부분에 대해서는 그 설명을 생략하기로 한다.
도 11은 본 발명의 다른 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 평면도이고, 도 12는 도 11에 도시된 디스크몸체 중 분할 부분에 구비되는 챔버 구조를 도시한 도면이며, 도 13은 도 11에 도시된 세포 분리 장치에 따른 자연 살해 세포의 분리 과정을 순차적으로 도시한 도면이다.
이들 도면에 도시된 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치는, 먼저 분할형 디스크몸체(200)를 포함할 수 있다.
먼저, 본 실시예의 분할형 디스크몸체(200)는, 회전 구동부가 결합되는 중앙 부분(201)과, 중앙 부분(201)의 네 모서리에 착탈 가능하게 결합되는 분할 부분(205)을 포함할 수 있다.
도 11 및 도 12를 참조하면, 중앙 부분(201)의 네 모서리에 단부가 내측으로 구부러진 디귿자 형 홈(202)이 구비될 수 있고, 분할 부분(205)에는 이 홈(202)에 결합되는 걸림부재(206)가 구비될 수 있다. 따라서 분할 부분(205)을 중앙 부분(201)에 결합시키거나 분리할 수 있다.
그리고, 각각의 분할 부분(205)에 복수 개의 챔버가 구비될 수 있다. 본 실시예의 복수개의 챔버는, 중앙 부분(201)을 향하는 부분으로부터 멀어지는 방향으로 일렬로 형성되는 버퍼 챔버(220), 블러드 챔버(230) 및 메인 챔버(210)를 포함할 수 있다.
또한, 메인 챔버(210)의 양측에 플라즈마 분리 챔버(240) 및 자연 살해 세포 분리 챔버(250)가 구비될 수 있다.
이러한 구성에 의해서, 버퍼 챔버(220)로부터 블러드 챔버(230)로, 블러드 챔버(230)에서 메인 챔버(210)로, 메인 챔버(210)에서 양측의 플라즈마 분리 챔버(240) 또는 자연 살해 세포 분리 챔버(250)로 반응 물질들이 이동될 수 있으며, 최종적으로 자연 살해 세포를 분리할 수 있다.
부연하면, 버퍼 챔버(220)에는 PBS(Phosphate Buffer Saline)가 주입되고, 블러드 챔버(230)에는 전혈과 전혈로부터 적혈구 선택적으로 제거하기 위한 적혈구 표지 항체가 주입되고, 메인 챔버(210)에는 밀도구배물질이 주입될 수 있다.
여기서, 버퍼 챔버(220) 및 블러드 챔버(230)에는 믹싱 과정에서 PBS 또는 전혈의 이탈을 방지하도록 구부러진 인렛(225)이 구비될 수 있다.
아울러, 블러드 챔버(230)와 메인 챔버(210) 사이, 메인 챔버(210)와 플라즈마 분리 챔버(240) 사이, 메인 챔버(210)와 자연 살해 세포 분리 챔버(250) 사이에는 연결을 위한 채널(208)이 구비되고, 채널(208)에는 전자기파 또는 열에 의해 개폐되는 밸브(209)가 구비될 수 있다.
따라서, 세포 분리 과정에서 적절한 단계에 전자기파 발생부 또는 열 발생부를 이용하여 예를 들면 왁스 재질로 마련되는 밸브(209)를 열 수 있다.
한편, 이하에서는 본 실시예의 세포 분리 장치에 의해서 자연 살해 세포가 분리되는 과정에 대해서 도 13을 참고하여 설명하기로 한다.
먼저, 도 13의 (a) 에 도시된 것처럼, 버퍼 챔버(220)에 예를 들면 PBS(271)를 1ml 주입하고, 블러드 챔버(230)에 예를 들면 전혈(272) 1ml와 항체(273) 50ul를 주입하고, 메인 챔버(210)에 밀도구배물질(274) 0.7ml를 주입한다.
이어서 (b)에 도시된 것처럼, 블러드 챔버(230) 내에서 적혈구에 항체가 붙은 전혈(275)을 생성하기 위해 예를 들면 20분 정도 믹싱 과정을 실행한다.
이후 (c)에 도시된 것처럼, 버퍼 챔버(220)에 있는 PBS(271)를 블러드 챔버(230)로 옮긴 후, (d)에 도시된 것처럼, 블러드 챔버(230) 내에서 항체가 붙은 전혈(275)과 PBS(271)를 약 60초 동안 믹싱할 수 있다.
다음으로 (e)에 도시된 것처럼, 블러드 챔버(230)와 메인 챔버(210) 사이의 밸브(209)를 열어서 믹싱된 전혈(276)을 메인 챔버(210)로 내릴 수 있다. 이후 (f)에 도시된 바와 같이, 메인 챔버(210) 내에 있던 밀도구배물질(274)을 이용하여 전혈(276)을 원심 분리함으로써 혈액층을 형성할 수 있다.
이후, (g)에 도시된 것처럼, 형성된 혈액층 중 최상층에 있는 혈장과 PBS(277) 를 플라즈마 분리 챔버(240)로 분리시키고, 이어서, (h)에 도시된 것처럼, 자연 살해 세포(276)를 자연 살해 세포 분리 챔버(250)로 분리시킴으로써 자연 살해 세포 분리 공정을 마무리할 수 있다.
한편, 전술한 것처럼, 본 발명의 다른 실시예에 따른 챔버 구조가 분할형 디스크몸체에 구비될 수 있지만, 일체형 디스크몸체에 구비될 수 있음은 당연한데, 이는 도 14 및 도 15를 통해 설명하기로 한다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 자연 살해 세포 분리 장치의 평면도들이다.
도 14에 도시된 것처럼, 일체형의 디스크몸체(300)에 총 6개의 챔버 구조가 구비될 수 있고, 도 15에 도시된 것처럼, 일체형의 디스크몸체(400)에 총 3개의 챔버 구조가 구비될 수도 있다. 물론, 이 개수에 한정되는 것은 아니다.
지금까지 본 발명에 따른 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허 청구의 범위뿐 아니라 이 특허 청구의 범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명 사상은 아래에 기재된 특허청구범위에 의해서만 파악되어야 하고, 이의 균등 또는 등가적 변형 모두는 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 회전 가능한 디스크몸체; 및
    상기 디스크몸체에서 상호 연결되도록 구비되며, 상기 디스크몸체의 회전 시 발생되는 원심력과 밀도구배물질을 이용하여 혈액으로부터 자연 살해 세포(Natural Killer cell)를 분리시키는 복수 개의 챔버;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복수 개의 챔버는,
    상기 디스크몸체에 구비되며, 혈액 및 제1 밀도구배물질(DGM, density gradient medium)이 구획되게 수용되며 상기 디스크몸체의 회전 시 발생되는 원심력에 의해 플라즈마층, 말초혈액단핵세포(PBMC)층, 제1 밀도구배물질(DGM)층 및 적혈구층이 형성되는 메인 챔버;
    상기 메인 챔버에 연결되고 비드(bead)를 구비하며, 상기 메인 챔버로부터 이동된 상기 말초혈액단핵세포층과 상기 비드를 혼합시키는 혼합 사이드 챔버;
    상기 혼합 사이드 챔버와 연결되고 2 밀도구배물질을 구비하며, 상기 혼합 사이드 챔버로부터 이동된 상기 비드가 혼합된 상기 말초혈액단핵세포층을 상기 제2 밀도구배물질을 사이에 두고 자연 살해 세포의 층과 비드의 층으로 나누는 분리 사이드 챔버; 및
    상기 분리 사이드 챔버와 연결되며, 상기 분리 사이드 챔버로부터 이동된 상기 자연 살해 세포가 수용되는 자연 살해 세포 분리 챔버를 포함하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 메인 챔버는,
    상기 혈액이 유입되어 수용되는 혈액 수용 공간; 및
    상기 혈액 수용 공간과 격벽에 의해 구획되며 상기 제1 밀도구배물질이 유입되어 수용되는 물질 수용 공간을 포함하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 격벽은 상기 혈액 수용 공간에서 상기 물질 수용 공간으로 갈수록 상방으로 경사지는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제1 밀도구배물질은 플라즈마 및 말초혈액단핵세포보다는 밀도가 크고 적혈구보다는 밀도가 작은 피콜(Ficoll)인 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 메인 챔버와 연결되도록 상기 디스크몸체에 구비되며, 상기 플라즈마층을 형성하는 플라즈마가 분리되는 플라즈마 분리 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 메인 챔버와 상기 플라즈마 분리 챔버 사이, 상기 메인 챔버와 상기 혼합 사이드 챔버 사이, 상기 혼합 사이드 챔버 및 상기 분리 사이드 챔버 사이, 상기 분리 사이드 챔버 및 상기 자연 살해 세포 분리 챔버 사이는 채널에 의해 연결되며,
    상기 채널 내에는 개폐를 위한 개폐 밸브가 구비되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 혼합 사이드 챔버는 깔때기 형상으로 마련되며, 모아지는 부분에 상기 분리 사이드 챔버와 연결된 채널이 연결되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 혼합 사이드 챔버 내에 구비되는 상기 비드는 자성을 가지며,
    상기 분리 사이드 챔버의 외측에는 마그네트가 구비되며, 상기 혼합 사이드 챔버에서 상기 분리 사이드 챔버로 이동된 상기 비드가 혼합된 상기 말초혈액단핵세포는 상기 제2 밀도구배물질 및 상기 마그네트에 의해서 자연 살해 세포의 층 및 비드의 층으로 분리되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2 밀도구배물질은 자연 살해 세포보다는 밀도가 크고 비드보다는 밀도가 작은 퍼콜(Percoll)인 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 복수 개의 챔버는, 상기 디스크몸체의 중앙으로부터 멀어지는 방향으로 일렬로 형성되는 버퍼 챔버, 블러드 챔버 및 메인 챔버를 포함하며,
    상기 버퍼 챔버에는 PBS(Phosphate Buffer Saline)가 주입되고,
    상기 블러드 챔버에는 전혈과 상기 전혈로부터 적혈구 선택적으로 제거하기 위한 적혈구 표지 항체가 주입되고,
    상기 메인 챔버에는 밀도구배물질이 주입되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 복수 개의 챔버는, 상기 메인 챔버의 일측에 구비되며 상기 메인 챔버에서의 원심 분리 결과 발생되는 혈액층 중 최상층인 혈장 및 플라즈마를 분리하는 플라즈마 분리 챔버와, 상기 메인 챔버의 다른 일측에 구비되며 상기 메인 챔버에서의 원심 분리 결과 발생되는 혈액층 중 자연 살해 세포를 분리하는 자연 살해 세포 분리 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 버퍼 챔버에 PBS를 주입하고, 상기 블러드 챔버에 전혈과 항체를 주입하고, 상기 메인 챔버에 밀도구배물질을 주입하는 주입한 다음, 적혈구에 항체를 붙이기 위해 믹싱을 한 후, 상기 버퍼 챔버에 있는 PBS를 상기 블러드 챔버로 내려 상기 블러드 챔버 내의 적혈구가 제거된 전혈과 상기 PBS를 혼합한 다음, 상기 PBS가 혼합된 전혈을 상기 메인 챔버로 보낸 후 원심분리에 의해 밀도구배물질층을 포함하는 상기 혈액층을 형성하는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 메인 챔버 내에서 형성된 상기 혈액층 중 최상층에 형성된 혈장과 PBS 를 상기 플라즈마 분리 챔버로 보낸 다음, 상기 혈액층 중 자연 살해 세포를 자연 살해 세포 분리 챔버로 보내는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 버퍼 챔버 및 상기 블러드 챔버에는 믹싱 과정에서 PBS 또는 전혈의 이탈을 방지하도록 구부러진 인렛이 구비되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 블러드 챔버와 상기 메인 챔버 사이, 상기 메인 챔버와 상기 플라즈마 분리 챔버 사이, 상기 메인 챔버와 상기 자연 살해 세포 분리 챔버 사이에는 연결을 위한 채널이 구비되고, 상기 채널에는 전자기파 또는 열에 의해 개폐되는 밸브가 구비되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 디스크몸체는,
    회전 구동부에 연결되는 중앙 부분; 및
    상기 중앙 부분에 각각 결합되는 복수 개의 분할 부분을 포함하며,
    상기 복수 개의 분할 부분 각각에 복수 개의 챔버가 구비되는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치.
  18. 회전 가능한 디스크몸체와, 상기 디스크몸체에서 상호 연결되도록 구비되며 상기 디스크몸체의 회전 시 발생되는 원심력과 밀도구배물질을 이용하여 혈액으로부터 자연 살해 세포를 분리시키기 위하여 메인 챔버와 혼합 사이드 챔버와 분리 사이드 챔버와 자연 살해 세포 분리 챔버를 포함하는 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법에 있어서,
    상기 메인 챔버에 구비되는 혈액 수용 공간에 혈액을 유입시키고 물질 수용 공간에 제1 밀도구배물질을 유입시키는 유입 단계;
    상기 디스크몸체를 회전시켜서 상기 메인 챔버 내의 상기 혈액 및 상기 제1 밀도구배물질을 복수 개의 혈액층으로 형성하는 혈액층 형성 단계;
    상기 복수 개의 혈액층 중 말초혈액단핵세포를 상기 혼합 사이드 챔버로 이동시킨 다음 상기 혼합 사이드 챔버 내의 비드와 혼합시키는 혼합 단계;
    상기 혼합 사이드 챔버로부터 상기 비드가 혼합된 상기 말초혈액단핵세포를 상기 분리 사이드 챔버로 이동시킨 후 상기 분리 사이드 챔버 내에 구비된 제2 밀도구배물질과 상기 분리 사이드 챔버에 인접한 마그네트의 자력을 이용하여 제2 밀도구배물질을 기준으로 자연 살해 세포와 비드를 분리시키는 분리 단계; 및
    상기 분리 사이드 챔버로부터 상기 자연 살해 세포를 상기 자연 살해 세포 분리 챔버로 분리시킴으로써 자연 살해 세포를 획득하는 획득 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 유입 단계 시, 상기 메인 챔버의 혈액 수용 공간에 상기 혈액 1000ul를 유입시키고 상기 메인 챔버의 물질 수용 공간에 상기 제1 밀도구배물질 2000ul를 유입시키는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 혈액층 형성 단계 및 상기 혼합 단계 사이에 실행되며, 상기 혈액층 형성 단계 시 생성되는 플라즈마를 상기 메인 챔버와 연결된 플라즈마 분리 챔버로 분리시키는 플라즈마 분리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자연 살해 세포 분리 장치의 자연 살해 세포 분리 방법.
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