KR100938002B1

KR100938002B1 - 개의 혈액으로부터 고순도의 단구세포 분리방법

Info

Publication number: KR100938002B1
Application number: KR1020090051317A
Authority: KR
Inventors: 이제중; 김수선; 홍철이; 김상기
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2010-01-21

Abstract

본 발명은 개의 말초혈액으로부터 단구세포(monocyte)의 분리방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분리방법은 특이적 항체만을 이용하여 순수 단구세포를 분리했던 기존의 방법을 극복하고, 개의 특이적인 항체 없이도 효율적으로 다량의 순수한 단구세포를 분리할 수 있어 개의 면역 치료용 수지상세포를 이용한 세포면역치료제 제조에 크게 기여할 것이다.

개, 말초혈액, 항체, 수지상세포, 세포면역치료제

Description

개의 혈액으로부터 고순도의 단구세포 분리방법{Isolation method of high purity of monocytes from canine peripheral blood}

본 발명은 개의 말초혈액으로부터 단구세포(monocyte)의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개의 특이적인 항체 없이도 과립구의 오염을 효율적으로 제거한 고순도의 단구세포 분리방법에 관한 것이다.

개는 암(Lee et al., 1996; Hogge et al., 1999; Helfand et al., 1996; Vail and MacEwon, 2000; Boutemmine et al., 2002), 면역결핍(Felsburg and Jezyk, 1982; Felsburg et al., 1985) 및 자가면역질환(Halliwell, 1978)같은 인간의 면역질환과 유사한 질병이 자연발생적으로 유발되기 때문에 아주 흥미있는 실험모델이다.

현재 개에서 진행되는 연구는 주로 면역반응(immune response) 또는 세포매개 면역반응(cell-mediated immune response)의 조절에 대한 연구가 주를 이루고 있으며, 특정세포군(specific cell population)들의 분리(isolation) 및 동정 (identification)이 이러한 생물학적 기능을 연구하기 위해 요구된다. 이를 위하여 순수한 말초혈액 단핵구세포(pheripheral blood mononuclear cells)나 말초혈액 림 프구세포(pheripheral blood lymphocyte)가 필요하다.

대부분의 알려진 개의 림프구세포 연구들은 1968년 Boyum에 의해 사용된 통상적인 1단계 밀도구배원심분리법(conventional one-step density gradient centrifugation)을 사용했으나 이 방법은 많은 수의 과립구(granulocytes) (Largiader et al., 1972; Kay et al., 1973; Esser et al., 1977; Krakowka and Guyot, 1977; Ho and Babiuk, 1978; Regal et al., 1983)와 인간림프구에서 미토겐(mitogen)에 의해 유발된 배자 발생 반응(blastogenic response)을 억제한다 (Ramesh et al., 1985)고 알려진 호산구(eosinophils)의 오염(contamination)으로 인해 림프구의 기능분석시 마다 큰 편차를 보였다는 보고가 있다. 한편 개의 혈액에서의 면역세포의 분리는 1979년 Hart와 Filder의 저속원침(low-speed centrifugation)에 의한 단구세포의 분리를 시작으로 호중구(neutrophils)의 분리로는 Latimer et .al.(1981) 등에 의해 보고된 침강법(sedimentation method) 및 Stickle et al.(1985) 등에 의해 보고된 녹말 용액(starch solution) 희석혈액 원심분리법이 있다.

개의 단구세포를 분리하기 위해 가장 흔히 사용되는 방법으로는 사람혈액에서의 단구세포 분리법인 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용한 원심분리법이 이용되었다. 특히 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용한 원심분리 후 단구세포를 배양용기에 부착시키는 방법, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용한 원심분리 후 인간의 단구세포를 인식하는 CD14 항체를 이용한 CD14+ 단구세포를 분리하는 방법을 사용하고 있다.

그러나 상기 사람혈액에서의 사용되는 단구세포 분리 방법들이 개에 있어서는 많은 과립구들의 오염을 동반하고, 개의 단구세포에 특이적인 항체가 없어 순수한 단세포의 분리가 어려움을 가지고 있어 개의 수지상세포를 이용한 세포면역치료제 제조에 걸림돌이 되고 있는 것이 현실이다.

이에 본 발명은 상기 문제점을 감안한 것으로, 본 발명의 목적은 개의 말초혈액으로부터 고순도의 단구세포 분리방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 개의 말초혈액으로부터 상기 분리방법에 따른 분리방법으로 분리된 순수한 단구세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 분리된 개의 순수한 단구세포로부터 유래된 수지상세포(dendritic cell)를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 개의 말초혈액으로부터 많은 과립구들의 오염을 동반하지 않는 고순도의 단구세포 분리방법을 제공한다. 구체적으로 개의 말초혈액을 90% 농도 즉 밀도가 0.9693를 가지는 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 단핵구세포를 분리 후, 퍼콜(Percoll)로 정제하여 사람의 hCD14-FITC 단클론항체(monoclonal antibody)로 선별된 고순도의 단구세포 분리방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

a) 개의 말초혈액(perpheral blood)을 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 단핵구세포(mononuclear cells)를 분리하는 단계;

b) 상기 분리된 단핵구세포를 퍼콜(Percoll)로 정제하는 단계; 및

c) 상기 정제된 단핵구세포를 사람의 hCD14-FITC 단클론항체(monoclonal antibody)로 선별하는 단계;

를 포함하는 개의 말초혈액으로부터 단구세포(monocyte)의 분리방법을 제공한다.

본 발명에 따른 단구세포 분리방법은 상기 b) 단계 후, 정제된 단핵구세포를 배양용기에 접착(adhesion)시켜 접착되지 않은 세포를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 개의 말초혈액은 (perpheral blood) 단구세포를 분리하기 위해 채열 후 RPMI1640 배지로 1:2 비율로 희석하여 사용하며, 상기 a) 단계의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)는 90%의 농도 즉 0.9693 밀도로 처리하는 것을 특징으로 한다.

구체적인 예로 세포배양배지(cell culture medium)나 1X PBS 용액으로 100%(밀도 1.077) 농도 및 90% (밀도 0.9693) 농도로 희석한 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용하여 원심분리 후 분리된 단핵구세포의 수득율을 비교한 결과, 90%의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용하여 분리한 단구세포군집(monocyte population; R2)에서 전체 살아있는 단구세포군의 함량이 4배 이상 높았으며, 단구세포군집 내 CD14+ 단구세포 함량 또한 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용해 분리한 혈액에서 더 많은 것을 확인하였다. 도 1 및 2를 참조한다.

상기 본 발명에 따른 90%의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)농도는 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)의 밀도가 0.9693인 것으로, 이는 개의 말초혈액으로부터의 단구세포분리에서 놀라운 수득효과를 가진다. 보다 구체적으로는 밀도 1.077인 100% 농도의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)에서는 가질 수 없는 현저한 효과가 있어 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)의 밀도 즉 0.9693의 밀도가 개의 말초혈액으로부터의 단구세포분리에서 아주 중요하다.

본 발명에 따른 상기 b) 단계의 퍼콜(Percoll)은 60 내지 70%, 50 내지 60% 및 40 내지 50%의 농도로 순차적으로 처리하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는62%, 52%, 45%인 것으로, 이는 많은 과립구들의 오염을 동반으로부터 고농도의 단구세포를 분리를 효과적으로 할 수 있는 큰 장점이 있다.

구체적인 예로, 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리에 의해 분리된 세포층 내 세포를 김자 염색액(Giemsa)으로 염색한 후 현미경을 통해 관찰한 결과 단핵구세포들이 단구세포층, 림프구층, 과립구층을 형성한 것을 확인하였다.

또한 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리를 했을 경우 단구세포층 내 포함된 단구세포의 순수도가 3배 정도 상승됨을 알 수 있었다. 도 4를 참조한다.

마지막으로 본 발명에 따른 b) 단계의 정제 후, 정제된 단구세포를 사람의 hCD14-FITC 단클론항체(monoclonal antibody)를 이용하여 선별한 후 CD14+ 단구세포를 순수 분리하는 것을 특징으로 한다.

구체적인 예로, 90% 및 100% 농도의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리 후, 순수 분리된 CD14+ 단구세포의 순수도를 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과, 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)의 단핵구 세포의 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배를 이용하여 분리된 CD14+ 단구세포의 순수도가 더 높은 것을 확인하였다. 도 6을 참조한다.

본 발명은 개의 말초혈액으로부터 상기 분리방법에 따른 분리방법으로 분리된 순수한 단구세포를 제공하며, 나아가 본 발명에 따른 단구세포로부터 유래된 수지상세포(dendritic cell)를 제공한다.

본 발명에 따른 개의 말초혈액으로부터의 단구세포의 분리방법은 특이적 항체만을 이용하여 순수 단구세포를 분리했던 기존의 방법을 극복한 것으로, 개의 특이적인 항체 없이도 효율적으로 다량의 순수한 단구세포를 분리할 수 있어 개의 면역 치료용 수지상세포를 이용한 세포면역치료제 제조에 크게 기여할 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 1] 피콜 - 하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용한 단핵구세포의 분리

본 발명에 사용된 개의 말초혈액(perpheral blood)은 전남대학교 수의과대학 의 동물병원에서 사육하는 개 중에서 혈액검사와 정기적인 건강검진을 통해 건강하다고 인정되는 3세 내지 7세 사이의 성견의 경정맥에서 50 ㎖의 말초혈액을 무균적으로 채혈하였으며, 채혈된 말초혈액은 헤파린튜브(heparin tube; BD vacutainer)에 보관하여 2시간 내에 사용하였다.

상기 채취한 말초혈액을 RPMI1640 배지로 1:2 비율로 희석하였다. 상기 RPMI1640 배지는 인비트로젠에서 구매한 것을 사용하였다. 또한 100%(밀도 1.077)의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)와 90%(밀도 0.9693)의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 준비하였다. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)의 희석은 세포배양배지(cell culture medium)나 1X PBS 용액으로 희석하였다.

상기 각각 준비된 100% 및 90% 농도의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 15 ㎖ 위에 희석한 말초혈액을 30 ㎖씩 조심스럽게 첨가한 후 1126 xg에서 45분 동안 원심분리 하였다. 원심분리에 의해 분리된 단핵구세포를 RPMI1640 배지로 3번 세척한 후, 수득한 단핵구세포를 세포의 크기(Forward scatter; FSC)와 과립의 함량(Size scatter; SSC)은 유세포분석기(FACS)로 분석하였으며, 또한 수득된 단핵구세포 군집 내 CD14+ 단구세포 함량은 FITC가 표지된 CD14 단클론항체를 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 1 및 2에서도 확인할 수 있듯이, 90%의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용하여 분리한 단구세포군집(monocyte population; R2)이 100% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용하여 분리한 단구세포군집(R2)보다 전체 살아있는 단구세포군집 내 살아있는 단구세포군의 함량이 4배 이상 높은 것을 확인하였다.

또한, 단구세포군집 내 CD14+ 단구세포 함량 또한 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용해 분리한 혈액에서 더 많았다.

피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도구배 원심분리 후 분리된 단핵구세포중에 포함된 단구세포의 함량은 하기 식 1과 같이 측정하였다.

[식 1]

분리된 단구세포군집(R2) × CD14+ 단구세포의 양(M1)

그 결과는 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)을 이용하여 분리한 단핵구세포에서 100% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용하여 분리한 단핵구세포에서 보다 5 내지 6배 더 많은 단구세포가 포함되어 있는 것을 확인하였다.

[ 실시예 2] 퍼콜 ( Percoll )를 이용한 단핵구세포의 정제

상기 실시예 1에서 100% 및 90% 농도의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)에 의해 분리 수득된 단핵구세포를 퍼콜(Percoll)을 이용한 밀도구배 원심분리를 이용하여 정제하였다. 먼저 퍼콜(Percoll)을 10X PBS을 이용하여 90% SIP를 만든 후, 상기 만들어진 90% SIP를 다시 RPMI1640 배지로 희석하여 62%, 52% 그리고 45% 농도로 퍼콜(Percoll) 희석액을 만들었다.

상기 실시예 1의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)에 의해 분리된 단핵구세포는 도 3의 모식도와 같이 5 ㎖의 62% 퍼콜(Percoll) 희석액으로 현탁시키고, 그 위에 3.5 ㎖의 52% 퍼콜(Percoll) 희석액과 3.5 ㎖의 45% 퍼콜(Percoll) 희석액 그리고 2 ㎖의 RPMI1640 순으로 조심스럽게 띄워서 농도구배를 만든 후, 2383 xg에서 1 시간동안 원심분리 하였다.

상기 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리에 의해 분리된 세포층 내 세포를 김자 염색액(Giemsa)으로 염색한 후 현미경을 통해 관찰한 결과 도 4의 A에서도 확인할 수 있듯이, 단핵구세포들이 단구세포층, 림프구층, 과립구층을 형성하였다.

또한 도 4의 B에서도 확인할 수 있듯이, 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리를 했을 경우 단구세포층 내 포함된 단구세포의 순수도는 평균 70% 이상이었으며, 100% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)으로 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리를 했을 경우에는 평균 40% 정도의 단구세포 순수도를 보이는 것을 확인할 수 있어, 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배 원심분리를 했을 경우 단구세포층 내 포함된 단구세포의 순수도가 3배 정도 상승됨을 알 수 있었다(도 5참조).

뿐만 아니라 도 5에서도 확인할 수 있듯이, 동일한 말초혈액으로부터 분리된 단구세포의 수는 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용했을 때가 100% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용했을 때 보다 대략 3배 정도 많은 단구세포를 수득할 수 있었다.

[ 실시예 3] CD14 - FITC 단클론항체를 이용한 단구세포의 선별

상기 실시예 2에서 정제된 단구세포를 사람의 hCD14-FITC 단클론항체(monoclonal antibody)가 결합된 미세구슬(microbead)을 이용하여 선별한 후 CD14+ 단구세포를 순수 분리하였다.

상기 순수 분리된 CD14+ 단구세포의 순수도를 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, 90% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)의 단핵구세포의 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배를 이용하여 분리된 단구세포에서 100% 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)의 단핵구세포의 분리 후 퍼콜(Percoll) 밀도구배를 이용하여 분리된 단구세포들 보다 분리된 CD14+ 단구세포의 순수도가 높은 것을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 따른 실시예 1의 분리된 단핵구세포 군집 내 함유된 세포군의 종류 및 단구세포의 함량을 조사한 결과이고,

(R2: 단구세포의 군집, M1: CD14 단클론항체로 표지된 단구세포의 양)

도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 분리된 단구세포군집 내 살아있는 단구세포군(A)의 함량 및 CD14 단클론항체로 표지된 단구세포의 양(B)을 조사한 결과이고,

도 3은 본 발명에 따른 실시예 2의 퍼콜(Percoll)의 밀도구배를 모식화한 것이고,

도 4는 본 발명에 따른 실시예 2의 정제된 세포들을 김자 염색액(Giemsa) 및 단구세포의 함량을 조사한 결과이고,

(A: 정제된 염색 세포, B: CD14 단클론항체로 표지된 단구세포의 양)

도 5는 본 발명의 말초혈액으로부터 단구세포 분리방법에 의해 분리된 단구세포의 수득률을 조사한 결과이고,

도 6은 본 발명의 말초혈액으로부터 단구세포 분리방법에 의해 분리된 CD14 단구세포의 함량을 조사한 결과이다.

Claims

a) 개의 말초혈액(perpheral blood)을 90%(밀도 0.9693) 농도의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)로 단핵구세포(mononuclear cells)를 분리하는 단계;

b) 상기 분리된 단핵구세포를 60 내지 70%, 50 내지 60% 및 40 내지 50%의 농도로 순차적으로 퍼콜(Percoll)로 정제하는 단계; 및

c) 상기 정제된 단핵구세포를 배양용기에 접착(adhesion)시켜 접착되지 않은 세포를 세척하는 단계; 및

d) 상기 세척 후 수득된 단핵구세포를 사람의 hCD14-FITC 단클론항체(monoclonal antibody)로 선별하는 단계;

를 포함하는 개의 말초혈액으로부터 단구세포(monocyte)의 분리방법.
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제 1항에 있어서,

상기 b) 단계의 퍼콜(Percoll)은 62%, 52% 및 45%의 농도로 순차적으로 처리하는 것을 특징으로 하는 말초혈액으로부터 단구세포(monocyte)의 분리방법.
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