WO2021215532A1 - 月経前症候群の重症度検出方法 - Google Patents

月経前症候群の重症度検出方法 Download PDF

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WO2021215532A1
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pms
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genes
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夏海 長森
高良 井上
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花王株式会社
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the severity of PMS.
  • PMS premenstrual syndrome
  • nucleic acids such as DNA and RNA in a biological sample
  • a comprehensive analysis method has been established and abundant information can be obtained by one analysis, and the function of the analysis result based on many research reports on monobasic polymorphism and RNA function. It has the advantage of being easy to link.
  • Nucleic acid derived from a living body can be extracted from tissues such as blood, body fluids, secretions and the like.
  • Patent Document 1 states that RNA contained in skin surface lipids (SSL) is used as a sample for analysis of a living body, and marker genes for epidermis, sweat glands, hair follicles, and sebaceous glands are detected in SL. Is described.
  • SSL skin surface lipids
  • Non-Patent Documents 1 to 3, Patent Document 2 There are genes whose expression changes with the production of the female hormone estrogen or progesterone.
  • AQP3 aquaporin3
  • HIF-1 ⁇ hyperoxia inducible factor 1 subunit ⁇
  • MFN2 mitofusin2
  • DEFB4A defensin beta 4A, or hBD-2
  • hBD-3 etc. have been reported so far.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2018/008319
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-228829
  • Hum Reprod, 2018, 33 (11): 2060-2073 Non-Patent Document 2
  • Biol Reprod, 2018, 99 (2): 308-318 Non-Patent Document 3
  • the present invention relates to the genes shown below: SH3BGRL3, NDUFA11, PSME2, SNORA24, SSR4, ZNF91, SNORA70, HSPA6, ALDH2, BRK1, C20orf111, CSNK1A1, STK10, GHITM, RPL21, MED13, RPL32, UBE2R2, RPS3, , ALDH1A3, TSPYL1, NUB1, KRT6A, CCL22, ELOVL3, TMEM66, GDI2, MYL12B, CCNI, PSMC6, RABGEF1, ARF1, ACTN1, CHMP2A, GAK, STX3, SERP1 and GAS7, and a group consisting of translations of the gene.
  • the present invention also presents nucleic acids derived from the following genes: SH3BGRL3, NDUFA11, PSME2, SNORA24, SSR4, ZNF91, SNORA70, HSPA6, ALDH2, BRK1, C20orf111, CSNK1A1, STK10, GHITM, RPL21, MED13, RPL32, UBE2R2, RPS PLEKHM2, DDX6, ALDH1A3, TSPYL1, NUB1, KRT6A, CCL22, ELOVL3, TMEM66, GDI2, MYL12B, CCNI, PSMC6, RABGEF1, ARF1, ACTN1, CHMP2A, GAK, STX3, SERP1 and GAS7, and translations of the genes.
  • markers of PMS severity including at least one selected from the group.
  • PMS Premenstrual Syndrome
  • luteal phase menstruation phase
  • Frank Archives of Neurology and Psychiatry, 1931, 26: 1053
  • PMS is defined as "physical and psychological symptoms that begin 3 to 10 days before the onset of menstruation and diminish or disappear with the onset of menstruation.”
  • Typical symptoms of PMS include lower abdominal pain, lower back pain, lower abdominal tension, headache, stiff shoulders, cold hands and feet, increased appetite, diarrhea, constipation, swelling, breast pain, and breast tension.
  • Prone to acne, rough skin, tiredness, sleepiness, etc., and mental symptoms include frustration, anger, aggressiveness, depression, fragile tears, increased anxiety, etc. ..
  • severe PMS means a state in which the physical or mental symptoms of PMS are severe
  • mild PMS means that the physical or mental symptoms of PMS are severe.
  • the severity of menstrual-related symptoms such as PMS has been evaluated based on, for example, the score of a questionnaire of Menstrual Distress Questionnaire (MDQ).
  • MDQ Menstrual Distress Questionnaire
  • PMS can be evaluated as mild.
  • the present invention relates to a PMS severity marker that enables detection of the severity of PMS, and a method for detecting the severity of PMS using the marker.
  • the present invention provides a method for detecting the severity of PMS using a PMS severity marker including a novel marker. Since the PMS severity marker used in the present invention can be collected from lipids on the surface of the skin (SSL), it can be obtained easily and non-invasively. Therefore, according to the present invention, it is possible to detect the severity of PMS without imposing a burden on the subject.
  • the present invention more simply and objectively detects the severity of PMS, which previously had to be evaluated based on the subject's interview during the luteal phase as described above, based on the expression of the gene or its translation product. Make it possible.
  • the present invention also makes it possible to pre-detect the severity of PMS based on the expression of a gene or its translation product in the follicular phase prior to the luteal phase in which PMS occurs.
  • the invention provides a PMS severity marker.
  • PMS severity marker As shown in the examples below, the present inventor has found that the expression of 51 genes shown in Table 1 below is related to the severity of PMS. Furthermore, 40 of these 51 genes shown in Table 2 were genes for which no association with PMS has been previously reported. Therefore, the nucleic acids derived from the genes shown in Table 1 and the translation products of the genes can be used as markers for the severity of PMS, respectively. In addition, nucleic acids derived from the genes shown in Table 2 and translation products of the genes are novel PMS severity markers.
  • nucleic acid derived from a gene includes mRNA transcribed from the gene, cDNA prepared from the mRNA, reaction product from the cDNA (for example, PCR product, cloned DNA, etc.), and the like. ..
  • the severity of PMS of a subject can be detected based on the expression level of each gene shown in Table 1 or its translation product.
  • the expression level of the gene shown in Table 1 or its translation product can be measured by quantifying the nucleic acid derived from the gene or the translation product of the gene. For example, by quantifying the mRNA transcribed from the gene, the cDNA prepared from the mRNA, the reaction product from the cDNA, or the translation product (protein, etc.) obtained by translating the mRNA, the gene or The expression level of the translation product can be measured.
  • Nucleic acid derived from the gene shown in Table 1 or a translation product of the gene can be prepared according to a conventional method from a biological sample collected from a subject, for example, cells, body fluids, secretions and the like.
  • the nucleic acid is an mRNA prepared from a subject's skin surface lipids (SSL).
  • the translation product is a translation product prepared from the subject's SSL.
  • “detection” of the severity of PMS can be paraphrased in terms such as prediction, examination, measurement, judgment or evaluation support.
  • the terms “detection”, “prediction”, “examination”, “measurement”, “judgment” or “evaluation” of the severity of PMS in the present invention refer to the diagnosis of the severity of PMS by a doctor. Does not include.
  • skin surface lipid refers to a fat-soluble fraction existing on the surface of the skin, and is sometimes called sebum.
  • SSL mainly contains secretions secreted from exocrine glands such as sebaceous glands in the skin, and is present on the surface of the skin in the form of a thin layer covering the skin surface.
  • SSL contains RNA expressed in skin cells (see Patent Document 1).
  • skin is a general term for regions including the epidermis, dermis, hair follicles, and tissues such as sweat glands, sebaceous glands, and other glands on the body surface, unless otherwise specified.
  • any means used to recover or remove SSL from the skin can be adopted.
  • an SSL-absorbing material, an SSL-adhesive material, or an instrument that scrapes the SSL from the skin, which will be described later, can be used.
  • the SSL-absorbing material or the SSL-adhesive material is not particularly limited as long as it is a material having an affinity for SSL, and examples thereof include polypropylene and pulp. More detailed examples of the procedure for collecting SSL from the skin include a method of absorbing SSL into a sheet-like material such as oil blotting paper and oil blotting film, a method of adhering SSL to a glass plate, tape, etc., a spatula, a scraper, etc.
  • the SSL-absorbent material is preferably used in a dry state.
  • the part of the skin from which the SSL is collected is not particularly limited, and examples thereof include the skin of any part of the body such as the head, face, neck, trunk, and limbs, and the part where sebum is secreted, for example, the skin of the face. Is preferable.
  • the SSL collected from the subject may be stored for a certain period of time.
  • the collected SSL is preferably stored under low temperature conditions as soon as possible after collection in order to suppress the decomposition of the contained RNA as much as possible.
  • the storage temperature condition of the RNA-containing SSL in the present invention may be 0 ° C. or lower, preferably ⁇ 20 ⁇ 20 ° C. to ⁇ 80 ⁇ 20 ° C., more preferably ⁇ 20 ⁇ 10 ° C. to ⁇ 80 ⁇ 10 ° C. , More preferably ⁇ 20 ⁇ 20 ° C. to ⁇ 40 ⁇ 20 ° C., further preferably ⁇ 20 ⁇ 10 ° C.
  • the storage period of the RNA-containing SSL under the low temperature condition is not particularly limited, but is preferably 12 months or less, for example, 6 hours or more and 12 months or less, more preferably 6 months or less, for example, 1 day or more and 6 months or less. More preferably, it is 3 months or less, for example, 3 days or more and 3 months or less.
  • RNA extraction or purification of RNA from a biological sample for example, a phenol / chloroform method, an AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chromoform extension) method, or TRIzol ( Method using columns such as registered trademark), RNA®, QIAzol (registered trademark), method using special magnetic material particles coated with silica, method using Solid Phase Reversible Imaging magnetic material particles, ISOGEN, etc. Extraction with a commercially available RNA extraction reagent or the like can be used.
  • a method usually used for extracting or purifying a protein from a biological sample for example, a commercially available protein extraction reagent such as QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) can be used.
  • a commercially available protein extraction reagent such as QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) can be used.
  • the severity of PMS in a subject can be detected by examining the expression of one or more genes or their translation products shown in Table 1 using the nucleic acid or translation product prepared by the above procedure.
  • the invention comprises measuring the expression of at least one selected from the group consisting of the genes shown in Table 1 or their translations, the method of detecting the severity of PMS in a subject. I will provide a.
  • the subject in the method for detecting the severity of PMS according to the present invention is, for example, a female of a human or non-human mammal who needs to detect the severity of PMS. Just do it.
  • the subject is an animal having SSL on the skin, more preferably a human.
  • the method of the present invention comprises measuring the expression of at least one gene (hereinafter, also referred to as a target gene (group)) selected from the group consisting of the genes shown in Table 1 in a subject.
  • the method of the invention measures the expression of at least one (hereinafter, also referred to as a target product (group)) selected from the group consisting of translation products of the genes shown in Table 1 in a subject. Including that.
  • both the expression of the target gene (group) and the expression of the target product (group) may be measured.
  • the expression of the target gene (group) is measured.
  • the target gene (group) is at least one selected from the group consisting of the genes shown in Table 2, and the target product (group) is shown in Table 2. At least one selected from the group consisting of gene translations. Further, in the method of the present invention, at least one selected from the group consisting of the genes shown in Table 2 or translation products thereof and other genes (that is, CTNNB1, AQP3, ANXA1, ARHGDIB, DEFB4A, shown in Table 1).
  • the expression of the target gene (group) or target product (group) in the method of the present invention is measured using RNA or a translation product contained in the SSL of the subject.
  • the method of the invention may further comprise collecting the SSL of the subject.
  • the method of the invention may further comprise extracting RNA or translation product from SSL taken from the subject.
  • the expression level of the target gene can be measured by quantifying the amount of RNA derived from the target gene contained in the sample derived from the subject, for example, RNA extracted from SSL.
  • the amount of subject-derived RNA may be measured according to the procedure for gene expression analysis using RNA commonly used in the art.
  • RNA commonly used in the art.
  • the method of gene expression analysis using RNA after converting RNA into cDNA by reverse transcription, the cDNA or its amplification product is quantified by real-time PCR, multiplex PCR, microarray, sequencing, chromatography or the like. The method can be mentioned.
  • the expression level of the translation product can be measured by using protein quantification methods commonly used in the art, such as ELISA, immunostaining, fluorescence, electrophoresis, chromatography, mass analysis and the like.
  • the measured expression level may be the absolute amount of expression of the target gene (group) or target product (group) in the biological sample, or relative to the total expression level of other standard substances, genes or translation products. It may be the expression level.
  • the subject-derived RNA is converted to cDNA by reverse transcription, and then the cDNA is subjected to PCR to purify the resulting reaction product.
  • primers targeting the specific RNA to be analyzed may be used, but it is preferable to use random primers for more comprehensive nucleic acid storage and analysis.
  • a general reverse transcriptase or reverse transcriptase kit can be used for the reverse transcription.
  • a highly accurate and efficient reverse transcriptase or reverse transcriptase kit is used, and examples thereof include M-MLV Reverse Transcriptase and its variants, or a commercially available reverse transcriptase or reverse transcriptase kit.
  • PrimeScript registered trademark
  • Reverse Transcriptase series Takara Bio Co., Ltd.
  • SuperScript registered trademark
  • Reverse Transcriptase series Thermo Scientific
  • SuperScript registered trademark
  • III Reverse Transcriptase SuperScript (registered trademark) III Reverse Transcriptase
  • VILO cDNA Synthesis kit all of which are Thermo Scientific
  • PCR of the obtained cDNA only the specific DNA may be amplified using a primer pair targeting the specific DNA to be analyzed, or a plurality of DNAs may be amplified using a plurality of primer pairs. good.
  • the PCR is multiplex PCR.
  • Multiplex PCR is a method of simultaneously amplifying a plurality of gene regions by simultaneously using a plurality of primer pairs in a PCR reaction system. Multiplex PCR can be carried out using a commercially available kit (for example, Ion AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Kit; Life Technologies Japan Co., Ltd., etc.).
  • the temperature is adjusted to preferably 42 ° C. ⁇ 1 ° C., more preferably 42 ° C. ⁇ 0.5 ° C., still more preferably 42 ° C. ⁇ 0.25 ° C.
  • the reaction time is preferably adjusted to 60 minutes or longer, more preferably 80 to 120 minutes.
  • the temperature of the annealing and extension reactions in the PCR can be appropriately adjusted depending on the primers used, but for example, when the above-mentioned multiplex PCR kit is used, it is preferably 62 ° C.
  • the annealing and extension reactions are preferably carried out in one step.
  • the time of the annealing and extension reaction steps can be adjusted depending on the size of the DNA to be amplified and the like, but is preferably 14 to 18 minutes.
  • the conditions of the denaturation reaction in the PCR can be adjusted depending on the DNA to be amplified, preferably 95 to 99 ° C. for 10 to 60 seconds. Reverse transcription and PCR at temperature and time as described above can be performed using a thermal cycler commonly used for PCR.
  • the purification of the reaction product obtained by the PCR is preferably performed by size separation of the reaction product.
  • size separation By size separation, the PCR reaction product of interest can be separated from the primers and other impurities contained in the PCR reaction solution.
  • DNA size separation can be performed by, for example, a size separation column, a size separation chip, magnetic beads that can be used for size separation, or the like.
  • Preferred examples of magnetic beads that can be used for size separation include Solid Phase Reversible Imaging (SPRI) magnetic beads such as Aple XP.
  • SPRI Solid Phase Reversible Imaging
  • the purified PCR reaction product may be subjected to further treatment necessary for subsequent quantitative analysis.
  • the purified PCR reaction product can be prepared into a suitable buffer solution, the PCR primer region contained in the PCR-amplified DNA can be cleaved, or the adapter sequence can be added to the amplified DNA. May be further added.
  • the purified PCR reaction product is prepared into a buffer solution, the PCR primer sequence is removed and adapter ligation is performed on the amplified DNA, and the obtained reaction product is amplified as necessary for quantitative analysis. Library can be prepared.
  • RNA expression can be quantified based on the number of reads created by sequencing (read count).
  • the method of the present invention detects the severity of PMS in a subject based on the expression level of the target gene (group) or the target product (group).
  • the genes shown in Table 1 can be divided into two groups shown in Tables 3 and 4 according to the pattern of fluctuations in their expression levels with the severity of PMS. These patterns of variation can be used to detect the severity of PMS in a subject.
  • the genes shown in Table 3 are genes whose expression increases when PMS is severe and decreases when PMS is mild.
  • the genes shown in Table 4 are genes whose expression decreases when PMS is severe and whose expression increases when PMS is mild.
  • the severity of PMS of a subject can be detected.
  • the underlined 22 and 18 genes, respectively are genes for which no association with PMS has been reported (genes shown in Table 2).
  • the expression level of each target gene (group) or target product (group) is directly used as a parameter for detecting the severity of PMS.
  • the expression level of a target gene or target product of a subject at a specific time of the menstrual cycle is measured regularly (for example, monthly), and fluctuations in the expression level are tracked. This makes it possible to detect the severity of PMS in the subject.
  • the subject by comparing the expression level of the target gene or target product measured from the subject at a specific time of the menstrual cycle with the reference expression level of the target gene or target product at the same time of the menstrual cycle, the subject.
  • the severity of PMS can be detected.
  • a predetermined value for example, a statistical value of the expression level of the target gene or target product at a specific time of the menstrual cycle (for example, average expression level) can be used. ..
  • the reference expression level may be set for each subject. For example, it may be calculated from a statistical value (for example, an average value) of the expression level of a target gene or a target product at a specific time of the menstrual cycle measured multiple times from the same subject.
  • the reference expression level may be a statistical value (for example, an average value) of the expression level of the target gene or target product at a specific time of the menstrual cycle measured from the population.
  • a plurality of genes or translation products are used as the target gene group or target product group, it is preferable to determine the reference expression level for each of the genes or translation products.
  • the target gene or target product is the gene shown in Table 3 or its translation product
  • the subject's PMS can be detected as severe, and the expression level is the reference expression level. If lower, the subject's PMS can be detected as non-severe (or mild).
  • the target gene or target product is the gene shown in Table 4 or its translation product
  • the expression level is lower than the reference expression level
  • the subject's PMS can be detected as severe, and the expression level is the reference expression level. If higher, the subject's PMS can be detected as non-severe (or mild).
  • two or more of the genes shown in Tables 3 to 4 or their translation products may be combined and used as a target gene or target product.
  • a certain percentage for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 100% of the genes or translation products are the criteria for the above-mentioned expression level.
  • the severity of PMS in a subject can be detected based on whether or not the condition is met. For example, if the expression level of 50% or more of the target gene group or target product group selected from Table 3 is higher than the reference expression level, the PMS of the subject can be detected as severe.
  • the expression level of 50% or more of the target gene group or target product group selected from Table 4 is lower than the reference expression level, the PMS of the subject can be detected as severe.
  • the expression level of 50% or more of the target gene group or target product group selected from Table 3 is higher than the reference expression level, and the expression level of 50% or more of the target gene group or target product group selected from Table 4 is higher. If the expression level is lower than the reference expression level, the subject's PMS can be detected as severe.
  • the combination of the target gene group or the target product group in the method of the present invention is not limited to the above example.
  • the severity of PMS in a subject is detected based on a predictive model constructed using expression data of a target gene (group) or target product (group).
  • expression data data on the expression level of the target gene (group) or target product (group) at a specific time of the menstrual cycle (for example, follicular phase or luteal phase) can be used.
  • PMS is performed by machine learning using expression data for each of one or more target genes (groups) or target products (groups) as an explanatory variable and the severity of PMS (for example, severe or mild) as an objective variable. It is possible to build an optimal predictive model for detecting the severity of the disease. For example, from the genes shown in Table 1 or Table 2 or their translation products, a plurality of genes having a larger expression difference between the severe group and the mild group in PMS severity are selected, and each of the expression data is explained. It can be used as a variable.
  • the prediction model may be constructed after compressing the data by dimension reduction, if necessary. For example, a plurality of genes are selected from the genes shown in Table 1 or Table 2, and those genes or their translation products are extracted as a target gene group or a target product group. Next, a principal component analysis is performed on the expression level of the extracted target gene group or target product group. Optimal for detecting the severity of PMS by machine learning with one or more principal components calculated by the principal component analysis as explanatory variables and the severity of PMS (for example, severe or mild) as the objective variable. Predictive model can be constructed.
  • the target gene (group) or target product (group) used to construct the predictive model has a higher expression difference between the severe group and the mild group in the severity of PMS among the genes shown in Table 1 or their translation products. It is preferable to select one or more from the larger ones. For example, one or more genes or translations thereof selected from the 40 genes shown in Table 2, for which no association with PMS has been previously reported, are preferred target genes (groups) or targets used in the construction of predictive models. Listed as a product (group). The same applies to the target gene (group) or target product (group) used for principal component analysis.
  • genes having a larger expression difference between the severe PMS group and the mild PMS group in the luteal phase are selected.
  • About 5 to 20 genes, preferably about 5 to 15 genes are selected. More specifically, for example, from Table 2, No. 5 genes 1 to 5, No. 10 genes from 1 to 10 or No. 15 genes from 1 to 15, preferably No. 10 genes from 1 to 10 or No. Select 15 genes from 1 to 15.
  • a predictive model can be constructed using data on the expression level of the selected gene in the luteal phase as an explanatory variable.
  • the genes having a larger expression difference between the severe PMS group and the mild PMS group in the luteal phase are selected. More specifically, for example, from Table 2, No. 5 genes 1 to 5, No. 10 genes from 1 to 10 or No. 15 genes from 1 to 15, preferably No. Select 5 genes from 1 to 5.
  • a predictive model can be constructed using data on the expression level of the selected gene in the follicular phase as an explanatory variable.
  • the dimensions and number of principal components used to build the prediction model are not particularly limited, but components with a large contribution rate, for example, the first principal component is included and the total contribution rate is high.
  • the explanatory variable may be one or more principal components such that the content is preferably 20% or more, more preferably 50% or more.
  • principal component analysis is performed on the expression data of the target gene group in the luteal phase, and the first principal component is contained and the total contribution rate is 20% or more, preferably 50% or more, for example, preferably 22.
  • a prediction model can be constructed by selecting principal components so as to be ⁇ 55% or more, more preferably 50 to 70%, and even more preferably 55 to 65%, and using the selected principal components as explanatory variables.
  • principal component analysis is performed on the expression data of the target gene group in the follicular phase, and the first principal component is contained and the total contribution rate is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably.
  • a known algorithm such as an algorithm used for machine learning can be used.
  • machine learning algorithms include algorithms such as Random Forest, Neural Net, Linear Kernel Support Vector Machine (SVM (linear)), and rbf Kernel Support Vector Machine (SVM (rbf)).
  • SVM Linear Kernel Support Vector Machine
  • rbf Kernel Support Vector Machine
  • the severity of PMS of the subject can be determined. Can be detected.
  • it comprises detecting the severity of PMS based on the expression level of the gene or translation product. More preferably, it comprises detecting the severity of PMS based on the expression level of the gene.
  • it comprises detecting the severity of PMS using a predictive model based on the expression level of the gene or translation product.
  • the prediction model uses the expression level of the gene or translation product in the severe and mild groups of PMS, or at least one principal component calculated by principal component analysis of the expression level as an explanatory variable, and premenstrual syndrome. Constructed with the severity of the syndrome as the objective variable, The method according to any one of [1] to [5].
  • Nucleic acids derived from the following genes are preferably: SH3BGRL3, NDUFA11, PSME2, SNORA24, SSR4, ZNF91, SNORA70, HSPA6, ALDH2, BRK1, C20orf111, CSNK1A1, STK10, GHITM, RPL21, MED13, RPL32, UBE2R2.
  • RPS3, PLEKHM2, DDX6, ALDH1A3, TSPYL1, NUB1, KRT6A, CCL22, ELOVL3, TMEM66, GDI2, MYL12B, CCNI, PSMC6, RABGEF1, ARF1, ACTN1, CHMP2A, GAK, STX3, SERP1 and GAS7 The use according to [8], wherein at least one selected from the group consisting of is used.
  • nucleic acids derived from the following genes selected from the group consisting of CTNNB1, AQP3, ANXA1, ARHGDIB, DEFB4A, BIRC3, S100A7, SFN, HMGN2, HIF1A, and MFN2, and translation products of the genes.
  • the use according to any one of [8] to [10], wherein the nucleic acid derived from the gene is the mRNA of the gene contained in the lipid on the surface of the skin.
  • a marker of the severity of PMS including at least one selected from.
  • nucleic acids derived from the following genes are further selected from the group consisting of CTNNB1, AQP3, ANXA1, ARHGDIB, DEFB4A, BIRC3, S100A7, SFN, HMGN2, HIF1A, and MFN2, and translation products of the genes.
  • the marker according to [12] which comprises at least one of the markers.
  • the marker according to [12] or [13], wherein the nucleic acid derived from the gene is the mRNA of the gene contained in the lipid on the surface of the skin.
  • Example 1 Identification of PMS severity marker 1 SSL collection 38 healthy subjects (female 20-45 years old, BMI 18.5 or more and less than 25.0) were used as subjects. In healthy subjects, it was confirmed in advance that the menstrual cycle was stable every 25 to 30 days. Each period of the menstrual cycle (menstrual phase: any day 2-4 days after the start of menstruation, follicular phase: any day 10-12 days after the start of menstruation, luteal phase: 21-23 days after the start of menstruation On that day), sebum was collected from the entire face of each subject using a degreasing film (5.0 cm ⁇ 8.0 cm, 3M company). The oil removal film was transferred to a glass vial and stored at ⁇ 80 ° C.
  • RNA preparation and sequencing The oil-removing film from 1) above was cut to an appropriate size, and RNA was extracted using QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) according to the attached protocol. The extracted RNA was reverse transcribed under the conditions of 42 ° C. for 105 minutes, and the obtained cDNA was amplified by multiplex PCR. Multiplex PCR was performed at an annealing and elongation temperature of 62 ° C. The obtained PCR product was purified by Aple XP (Beckman Coulter, Inc.).
  • the solution of the obtained purified product is attached to the 5 ⁇ VILO RT Reaction Mix attached to the SuperScript VILO cDNA Synthesis kit and the Ion AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression Prime 5 ⁇ Hixnipion Primer (Life Technologies Japan Co., Ltd.). Mix and Ion Ampliseq Transcriptome Human Gene Expression Core Panel were mixed, and then the primer sequences were digested, adapter-ligated and purified, and amplified according to the protocol attached to each kit to prepare a library. The prepared library was loaded into an Ion 540 Chip and sequenced using an Ion S5 / XL system (Life Technologies Japan KK). The gene from which each read sequence was derived was determined by gene mapping each read sequence obtained by sequencing to hg19 AmpliSeq Transcriptome ERCC v1, which is a reference sequence of the human genome.
  • the gene that serves as is extracted.
  • the missing values were supplemented by Singular Value Decomposition (SVD) imputation.
  • SVD Singular Value Decomposition
  • Fifty-one genes whose expression fluctuated between groups were obtained (Table 5), of which 40 genes shown in Table 6 were genes for which no association with PMS was previously reported.
  • Nucleic acids derived from the genes in Table 5 and translation products of the genes can be used as markers of PMS severity, respectively.
  • nucleic acids derived from the genes shown in Table 6 and translation products of the genes are novel PMS severity markers.
  • Example 2 Construction of PMS severity prediction model based on luteal phase RNA expression level data
  • the RNA expression level data (read count RPM value) obtained in Example 1 is converted into the logarithmic value of the base 2 (Log 2 RPM). Value).
  • Method 2 Selection of features From the 40 genes shown in Table 6 for which no association with PMS has been reported among the genes extracted in Example 1, the features used for building a predictive model are selected by the following two methods. bottom.
  • Method 1 Among the genes shown in Table 6, 5 to 15 kinds of genes from those having a small p-value of the expression difference between the severe PMS group and the mild PMS group, specifically, No. 1 in Table 6. 5 types from 1 to 5, No. in Table 6 10 types from 1 to 10, or No. 1 in Table 6.
  • Expression level data (Log 2 RPM value) of 15 kinds of genes from 1 to 15 were selected as feature amounts for PMS severity detection.
  • Method 2 The gene expression level data shown in Table 6 was subjected to principal component analysis using the tidyverse package of the statistical analysis environment R, and variable compression was performed. Data with a new dimension (1st to 10th principal components, Table 7) obtained by principal component analysis were selected as features for PMS severity detection.
  • Model construction was performed using the carnet package of the statistical analysis environment R.
  • a prediction model was constructed using the features selected by methods 1 and 2 in 2) as explanatory variables and the PMS severity (severe or mild) as the objective variable.
  • Four algorithms for each feature Random Forest, Neural network, Linear kernel support vector machine (SVM (linear)), and rbf kernel support vector machine (SVM (rbf)).
  • SVM Linear kernel support vector machine
  • the prediction model was trained by performing 10-fold cross-validation using.
  • RNA expression level data Log 2 RPM value
  • principal component data of test data was input to the model after training to calculate the predicted value of PMS severity.
  • the accuracy rate which is a value indicating the degree of agreement between the predicted value and the measured value, was calculated, and the model with the largest value was selected as the optimum predicted model.
  • Results Table 8 shows the features used to detect the severity of PMS, the optimal algorithm with the maximum accuracy, and its accuracy. Based on the expression level data of genes related to PMS severity in the luteal phase or their main components, PMS severity could be detected with high accuracy. Therefore, it was shown that the severity of PMS can be detected using the data on the expression level of SSL-derived RNA in the luteal phase. Further, in the case of the prediction model based on the main component, the accuracy of the prediction model based on the first to fifth main components is higher than that of the prediction model based on the main component 1, while it is equivalent to the prediction model based on the first to sixth main components. there were.
  • one or more principal components such that the total contribution rate is 20% or more, for example, 22 to 55% or more, preferably 50 to 70%, and more preferably 55 to 65% are used as explanatory variables.
  • a more accurate PMS severity prediction model can be constructed.
  • the accuracy of the prediction model using 10 genes was higher than that of the prediction model using 5 genes, while it was equivalent to the prediction model using 15 genes.
  • a more accurate PMS severity prediction model can be constructed by using the expression data of about 10 to 15 genes or more genes from the one with the largest expression difference depending on the PMS severity. ..
  • Example 3 Construction of PMS Severity Prediction Model Based on Follicular Phase RNA Expression Data 1) Dataset Division and Feature Selection Using the subject's follicular phase SSL-derived RNA expression dataset for the genes shown in Table 6. Except for the above, training data and test data were created in the same procedure as in 1) of Example 2. Next, in the same procedure as in 2) of Example 2, the 1st to 15th principal components (Table 9) obtained by the principal component analysis of the Log 2 RPM value of the RNA expression level data and the expression level data were subjected to PMS severity. Selected as a feature for detection.
  • Results Table 10 shows the features used to detect the severity of PMS, the optimal algorithm with the maximum accuracy, and its accuracy. Based on the expression level data of genes related to PMS severity in the follicular phase or their main components, PMS severity could be detected with high accuracy. Therefore, it was shown that the severity of PMS associated with the next menstruation can be detected by using the data on the expression level of SSL-derived RNA in the follicular phase. Further, in the case of the prediction model based on the main components, the accuracy of the prediction model based on the first to fifteenth main components is the highest, and the total contribution rate is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more.
  • PMS severity prediction model can be constructed by using one or more principal components as explanatory variables.
  • a prediction model constructed directly from the gene expression level it is more accurate to use expression data of about 5 to 20, preferably about 5 to 15, genes having a high correlation with PMS severity. It was shown that a high PMS severity prediction model can be constructed.

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Abstract

簡便且つ被験者への負担の少ない月経前症候群の重症度の検出方法の提供。月経前症候群の重症度の検出を可能にするマーカー。該マーカーを用いた被験体の月経前症候群の重症度の検出方法。

Description

月経前症候群の重症度検出方法
　本発明は、月経前症候群の重症度を検出する方法に関する。
　女性の月経前及び／又は月経中の身体的及び精神的不快は、月経随伴症状と呼ばれ、月経前症候群（Ｐｒｅｍｅｎｓｔｒｕａｌ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、ＰＭＳという）、及び月経困難症に代表される。ＰＭＳは女性の労働生産性にも関係することが指摘されていることから、ＰＭＳや月経困難症に代表される月経随伴症状を緩和又は軽減し、女性のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）を向上させることは、保健的だけでなく、社会的にも重要である。
　生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。核酸を用いた解析は、網羅的な解析方法が確立されており一度の解析で豊富な情報を得られること、及び一塩基多形やＲＮＡ機能などに関する多くの研究報告に基づいて解析結果の機能的な紐付けが容易であることといった利点を有する。生体由来の核酸は、血液等の組織、体液、分泌物などから抽出することができる。特許文献１には、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として用いること、ＳＳＬから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出されたことが記載されている。
　女性ホルモンであるエストロゲン又はプロゲステロンの産生に伴って発現が変化する遺伝子が存在する。例えばこれまでに、ＡＱＰ３（aquaporin 3）、ＨＩＦ－１α（hypoxia inducible factor 1 subunit α）、ＭＦＮ２（mitofusin 2）、ＤＥＦＢ４Ａ（defensin beta 4A、又はhBD-2）、ｈＢＤ－３などが報告されている（非特許文献１～３、特許文献２）。
（特許文献１）国際公開公報第２０１８／００８３１９号
（特許文献２）特開２０１５－２２８８２９号公報
（非特許文献１）Hum Reprod, 2018, 33(11):2060-2073
（非特許文献２）Biol Reprod, 2018, 99(2):308-318
（非特許文献３）Mol Cell Endocrinol, 2013, 371:79-86
　本発明は、下記に示す遺伝子：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、被験体のＰＭＳの重症度を検出する方法を提供する。
　また本発明は、下記遺伝子に由来する核酸：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、ＰＭＳの重症度のマーカーを提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　月経前症候群（Ｐｒｅｍｅｎｓｔｒｕａｌ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＰＭＳ）は、１９３１年にＦｒａｎｋ（Archives of Neurology and Psychiatry, 1931, 26:1053）により初めて報告された、月経の１週間程前（黄体期）に発症する身体的症状群又は精神的症状群である。医学的には、ＰＭＳは、「月経開始の３～１０日前から始まる身体的、精神的症状で月経開始とともに減退ないし消失するもの」と定義される。ＰＭＳの代表的な症状は、身体的症状群としては、下腹痛、腰痛、下腹部が張る、頭痛、肩こり、手足の冷え、食欲が増す、下痢、便秘、むくみ、乳房が痛い、乳房が張る、ニキビができやすい、肌荒れ、疲れやすい、眠くなる、等が挙げられ、精神的症状群としては、イライラする、怒りやすい、攻撃的になる、憂うつ、涙もろい、不安が高まる、等が挙げられる。
　本明細書において、ＰＭＳが重症であるとは、上記ＰＭＳの身体的症状又は精神的症状が重度である状態をいい、ＰＭＳが軽症であるとは、上記ＰＭＳの身体的症状又は精神的症状が軽度である状態をいう。従来、ＰＭＳ等の月経随伴症状の重症度は、例えばＭｅｎｓｔｒｕａｌ　Ｄｉｓｔｒｅｓｓ　Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＭＤＱ）のアンケートのスコアに基づいて評価されていた。黄体期におけるＭＤＱスコアが高いほど、ＰＭＳの重症度は高いと評価される。例えば、心理測定尺度集III（サイエンス社、２００１発行）に記載されたＭＤＱに従って、黄体期のＭＤＱスコアが６６点以上である場合をＰＭＳが重症であると評価し、４８点以下である場合をＰＭＳが軽症であると評価することができる。
　本発明は、ＰＭＳの重症度の検出を可能にするＰＭＳ重症度マーカー、及び該マーカー用いたＰＭＳの重症度の検出方法に関する。
　本発明は、新規なマーカーを含むＰＭＳ重症度マーカーを用いてＰＭＳの重症度を検出する方法を提供する。本発明で使用するＰＭＳ重症度マーカーは、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から収集可能であるため、簡便且つ非侵襲的に取得することができる。したがって本発明によれば、被験者に負担をかけずにＰＭＳの重症度を検出することが可能である。
　本発明は、従来は上記のような黄体期における被験者の問診に基づいて評価しなければならなかったＰＭＳの重症度を、遺伝子又はその翻訳産物の発現に基づいてより簡易かつ客観的に検出することを可能にする。また本発明は、ＰＭＳが起こる黄体期に先立つ卵胞期における遺伝子又はその翻訳産物の発現に基づいてＰＭＳの重症度を事前に検出することを可能にする。
　一態様において、本発明は、ＰＭＳ重症度マーカーを提供する。後述の実施例に示されるとおり、本発明者は、下記表１に示す５１種の遺伝子の発現が、ＰＭＳの重症度との間に関連性を有することを見出した。さらに、これら５１種のうち表２に示した４０種の遺伝子は、従来ＰＭＳとの関連性が報告されていない遺伝子であった。したがって、表１に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、各々、ＰＭＳの重症度のマーカーとして使用することができる。また、表２に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、新規のＰＭＳ重症度マーカーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ　Ｓｙｍｂｏｌに従う。本明細書において、「遺伝子に由来する核酸」は、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡからの反応産物（例えばＰＣＲ産物、クローンＤＮＡ等）、などを包含する。
　本発明においては、表１に示す各遺伝子又はその翻訳産物の発現量に基づいて被験体のＰＭＳの重症度の検出が可能である。本発明において、表１に示す遺伝子又はその翻訳産物の発現量は、該遺伝子に由来する核酸又は該遺伝子の翻訳産物を定量することで測定することができる。例えば、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡからの反応産物、又は該ｍＲＮＡが翻訳されて合成される翻訳産物（タンパク質等）を定量することで、該遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定することができる。
　表１に示す遺伝子に由来する核酸又は該遺伝子の翻訳産物は、被験体から採取した生体試料、例えば細胞、体液、分泌物等から常法に従って調製することができる。好ましくは、該核酸は、被験体の皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）から調製されるｍＲＮＡである。また好ましくは、該翻訳産物は、被験体のＳＳＬから調製される翻訳産物である。
　本発明において、月経前症候群の重症度の「検出」とは、予測、検査、測定、判定又は評価支援などの用語で言い換えることもできる。なお、本発明における月経前症候群の重症度の「検出」、「予測」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による月経前症候群の重症度の診断を含むものではない。
　本明細書において、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（特許文献１参照）。また本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
　被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。
　被験体から採取されたＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
　採取したＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）などのカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出などを用いることができる。また、ＳＳＬからの翻訳産物の抽出には、生体試料からのタンパク質の抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、ＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）等の市販のタンパク質抽出試薬を用いることができる。
　以上の手順で調製された核酸又は翻訳産物を用いて表１に示す１つ以上の遺伝子又はその翻訳産物の発現を調べることで、被験体のＰＭＳの重症度を検出することができる。したがって、別の一態様において、本発明は、表１に示す遺伝子又はその翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、被験体のＰＭＳの重症度を検出する方法を提供する。
　本発明によるＰＭＳの重症度を検出する方法（以下、本発明の方法）における被験体は、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物の雌性であって、ＰＭＳの重症度の検出を必要とする者であればよい。好ましくは、該被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する動物であり、より好ましくはヒトである。
　一実施形態において、本発明の方法は、被験体における表１に示す遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子（以下、標的遺伝子（群）ともいう）の発現を測定することを含む。別の一実施形態において、本発明の方法は、被験体における表１に示す遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つ（以下、標的産物（群）ともいう）の発現を測定することを含む。あるいは、標的遺伝子（群）の発現と標的産物（群）の発現の両方が測定されてもよい。好ましくは、標的遺伝子（群）の発現が測定される。
　表１に示す遺伝子のなかでも、表２に示すものは、従来ＰＭＳとの関連性が報告されていない遺伝子である。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、該標的遺伝子（群）は、表２に示す遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、該標的産物（群）は、表２に示す遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つである。さらに、本発明の方法においては、表２に示す遺伝子又はその翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つと、他の遺伝子（すなわち、表１に記載のCTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2）又はそれらの翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせが標的遺伝子群又は標的産物群として用いられ、それらの発現が測定されてもよい。
　好ましくは、本発明の方法における該標的遺伝子（群）又は標的産物（群）の発現の測定は、被験体のＳＳＬに含まれるＲＮＡ又は翻訳産物を用いて行われる。一実施形態において、本発明の方法は、被験体のＳＳＬを採取することをさらに含んでいてもよい。一実施形態において、本発明の方法は、該被験体から採取したＳＳＬからＲＮＡ又は翻訳産物を抽出することをさらに含んでいてもよい。
　被験体由来の試料、例えばＳＳＬから抽出されたＲＮＡに含まれる標的遺伝子由来のＲＮＡの量を定量することで、標的遺伝子の発現量を測定することができる。被験体由来ＲＮＡの量の測定は、当該分野で通常用いられるＲＮＡを用いた遺伝子発現解析の手順に従って実施すればよい。ＲＮＡを用いた遺伝子発現解析の手法の例としては、ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、リアルタイムＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、マイクロアレイ、シーケンシング、クロマトグラフィーなどにより該ｃＤＮＡ又はその増幅産物を定量する方法が挙げられる。翻訳産物の発現量は、当該分野で通常用いられるタンパク質定量法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫染色、蛍光法、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析などを用いて測定することができる。測定される発現量は、生体試料における標的遺伝子（群）又は標的産物（群）の発現の絶対量であってもよく、又は、他の標準物質や、遺伝子又は翻訳産物の総発現量に対する相対発現量であってもよい。
　好ましい実施形態において、本発明の方法では、該被験体由来ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで該ｃＤＮＡをＰＣＲにかけ、得られた反応産物を精製する。該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などが好ましく用いられる。得られたｃＤＮＡのＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて複数のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
　当該逆転写及びＰＣＲの反応条件を調整することで、ＰＣＲ反応産物の収率がより向上し、ひいてはそれを用いた解析の精度がより向上する。好適には、該逆転写での伸長反応において、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整する。また好適には、該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存して適宜調整され得るが、例えば上記のマルチプレックスＰＣＲキットを用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。
　当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰ等のＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。
　精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ　ＲＴ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　ＨｉＦｉ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｏｒｅ　Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。シーケンシングには、好ましくは次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ　Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。
　好ましくは、本発明の方法では、該標的遺伝子（群）又は該標的産物（群）の発現量に基づいて、被験体のＰＭＳの重症度を検出する。例えば、表１に示す遺伝子は、ＰＭＳの重症度に伴うその発現量の変動のパターンによって表３及び表４に示す２つの群に分けることができる。これらの変動のパターンを利用して被験体のＰＭＳの重症度を検出することができる。
　表３に示す遺伝子は、ＰＭＳが重症のときに発現が増加し、ＰＭＳが軽症のときに発現が低下する遺伝子である。一方、表４に示す遺伝子は、ＰＭＳが重症のときに発現が低下し、ＰＭＳが軽症のときに発現が増加する遺伝子である。表３及び表４に示す遺伝子又はその翻訳産物のいずれか１つ以上についての発現量を基準にすることで、被験体のＰＭＳの重症度（例えば重症か否か）を検出することができる。表３及び表４に示す遺伝子のうち、下線で示した、それぞれ２２種及び１８種の遺伝子は、従来ＰＭＳとの関連性が報告されていない遺伝子（表２に示す遺伝子）である。
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　本発明の方法の一実施形態においては、個々の標的遺伝子（群）又は標的産物（群）の発現量を直接、ＰＭＳの重症度を検出するためのパラメーターとして用いる。例えば、月経周期の特定の時期（例えば卵胞期又は黄体期、以下同じ）における被験体の標的遺伝子又は標的産物の発現量を定期的に（例えば毎月）測定し、その発現量の変動を追跡することで、該被験体のＰＭＳの重症度を検出することができる。あるいは、月経周期の特定の時期において被験体から測定された標的遺伝子又は標的産物の発現量を、月経周期の同じ時期についての該標的遺伝子又は標的産物の基準発現量と比べることで、該被験体のＰＭＳの重症度を検出することができる。標的遺伝子又は標的産物の基準発現量には、予め決定した値、例えば、該標的遺伝子又は標的産物の月経周期の特定の時期での発現量の統計値（例えば平均発現量）を用いることができる。該基準発現量は、被験体ごとに設定されてもよい。例えば、同じ被験体から複数回測定した月経周期の特定の時期における標的遺伝子又は標的産物の発現量の統計値（例えば平均値など）から算出してもよい。あるいは、該基準発現量は、集団から測定した月経周期の特定の時期における標的遺伝子又は標的産物の発現量の統計値（例えば平均値など）であってもよい。標的遺伝子群又は標的産物群として複数の遺伝子又は翻訳産物を用いる場合は、該遺伝子又は翻訳産物の各々について基準発現量を求めることが好ましい。
　例えば、標的遺伝子又は標的産物が表３に示す遺伝子又はその翻訳産物の場合、その発現量が基準発現量よりも高い場合、被験体のＰＭＳは重症と検出され得、その発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のＰＭＳは重症ではない（又は軽症）と検出され得る。一方、標的遺伝子又は標的産物が表４に示す遺伝子又はその翻訳産物の場合、その発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のＰＭＳは重症と検出され得、その発現量が基準発現量よりも高い場合、被験体のＰＭＳは重症ではない（又は軽症）と検出され得る。
　あるいは、表３～４に示す遺伝子又はその翻訳産物を２つ以上組み合わせて標的遺伝子又は標的産物として用いてもよい。複数の遺伝子又は翻訳産物を用いる場合には、一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％の遺伝子又は翻訳産物が上述した発現量の基準を満たすか否かに基づいて、被験体のＰＭＳの重症度を検出することができる。例えば、表３から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の５０％以上の発現量が基準発現量よりも高い場合、被験体のＰＭＳは重症と検出され得る。あるいは、表４から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の５０％以上の発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のＰＭＳは重症と検出され得る。あるいは、表３から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の５０％以上の発現量が基準発現量よりも高く、かつ表４から選択した標的遺伝子群又は標的産物群の５０％以上の発現量が基準発現量よりも低い場合、被験体のＰＭＳは重症と検出され得る。但し、本発明の方法における標的遺伝子群又は標的産物群の組み合わせは、上記の例に限定されない。
　別の一実施形態においては、標的遺伝子（群）又は標的産物（群）の発現データを用いて構築した予測モデルに基づいて、被験体のＰＭＳの重症度を検出する。発現データとしては、月経周期の特定の時期（例えば卵胞期又は黄体期）における標的遺伝子（群）又は標的産物（群）の発現量についてのデータを用いることができる。例えば、１つ以上の標的遺伝子（群）又は標的産物（群）の各々についての発現データを説明変数とし、ＰＭＳの重症度（例えば、重症か軽症か）を目的変数とした機械学習により、ＰＭＳの重症度を検出するための最適な予測モデルを構築することができる。例えば、表１又は表２に示す遺伝子又はその翻訳産物の中からＰＭＳ重症度における重症群と軽症群のとの間で発現差のより大きいものを複数選択し、それらの発現データの各々を説明変数として用いることができる。
　あるいは、予測モデルの構築に複数の遺伝子又は翻訳産物の発現データを使用する場合、必要に応じて、次元削減によってデータを圧縮してから予測モデルの構築を行ってもよい。例えば、表１又は表２に示す遺伝子から複数の遺伝子を選択し、それらの遺伝子又はその翻訳産物を標的遺伝子群又は標的産物群として抽出する。次いで、該抽出した標的遺伝子群又は標的産物群の発現量について主成分分析を実施する。該主成分分析で算出された１つ以上の主成分を説明変数とし、ＰＭＳの重症度（例えば、重症か軽症か）を目的変数とした機械学習により、ＰＭＳの重症度を検出するための最適な予測モデルを構築することができる。
　予測モデルの構築に用いる標的遺伝子（群）又は標的産物（群）は、表１に示す遺伝子又はその翻訳産物のなかでＰＭＳの重症度における重症群と軽症群との間での発現差がより大きいものから１種以上を選択するのが好ましい。例えば、従来ＰＭＳとの関連性が報告されていない、表２に示す４０遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子又はその翻訳産物が、予測モデルの構築に用いられる好ましい標的遺伝子（群）又は標的産物（群）として挙げられる。主成分分析に用いる標的遺伝子（群）又は標的産物（群）も同様である。
　一実施形態においては、表２に示す遺伝子の中から、黄体期においてＰＭＳ重症群と軽症群との間での発現差がより大きい遺伝子（例えば、表２のＮｏ．１～２０の遺伝子）から５～２０個程度、好ましくは５～１５個程度の遺伝子を選択する。より具体的には、例えば表２からＮｏ．１～５の５遺伝子、Ｎｏ．１～１０の１０遺伝子又はＮｏ．１～１５の１５遺伝子、好ましくはＮｏ．１～１０の１０遺伝子又はＮｏ．１～１５の１５遺伝子を選択する。選択した遺伝子の黄体期における発現量についてのデータを説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。別の一実施形態においては、表２に示す遺伝子の中から、黄体期においてＰＭＳ重症群と軽症群との間での発現差がより大きい遺伝子（例えば、表２のＮｏ．１～２０の遺伝子）から５～２０個程度、好ましくは５～１５個程度の遺伝子を選択する。より具体的には、例えば表２からＮｏ．１～５の５遺伝子、Ｎｏ．１～１０の１０遺伝子又はＮｏ．１～１５の１５遺伝子、好ましくはＮｏ．１～５の５遺伝子を選択する。選択した遺伝子の卵胞期における発現量についてのデータを説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。
　主成分分析でデータ圧縮を行った場合、予測モデルの構築に用いる主成分の次元や数は、特に限定されないが、寄与率の大きい成分、例えば、第１主成分を含み、かつ合計寄与率が、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上になるような１つ以上の主成分を説明変数とするとよい。一実施形態においては、黄体期における標的遺伝子群の発現データに対して主成分分析を行い、第１主成分を含みかつ合計寄与率が２０％以上、好ましくは５０％以上、例えば、好ましくは２２～５５％又はそれ以上、より好ましくは５０～７０％、さらに好ましくは５５～６５％になるよう主成分を選択し、選択した主成分を説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。別の一実施形態においては、卵胞期における標的遺伝子群の発現データに対して主成分分析を行い、第１主成分を含みかつ合計寄与率が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上になるよう主成分を選択し、選択した主成分を説明変数に用いて予測モデルを構築することができる。
　予測モデルの構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（Random Forest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（SVM (rbf)）などのアルゴリズムが挙げられる。構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば、予測値と実測値の一致度合いを示す値である正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が高いモデルを、最適な予測モデルとして選択することができる。
　構築された予測モデルに、被験体における該標的遺伝子（群）もしくは標的産物（群）の発現データ（又はそれらから算出された主成分）を入力することで、該被験体のＰＭＳの重症度を検出することができる。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕下記に示す遺伝子：SH3BGRL3、NDUFA11、CTNNB1、AQP3、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、ANXA1、SNORA70、HSPA6、ALDH2、ARHGDIB、DEFB4A、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、BIRC3、S100A7、STK10、GHITM、SFN、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、HMGN2、HIF1A、RABGEF1、ARF1、ACTN1、MFN2、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、被験体の月経前症候群の重症度を検出する方法。
〔２〕好ましくは、下記に示す遺伝子：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、さらに、下記に示す遺伝子：CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、〔２〕記載の方法。
〔４〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
　より好ましくは、前記遺伝子の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、
〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の黄体期又は卵胞期での発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、〔４〕記載の方法。
〔６〕好ましくは、前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づく予測モデルを用いて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
　該予測モデルが、月経前症候群の重症群及び軽症群における該遺伝子又は翻訳産物の発現量、又は該発現量の主成分分析で算出された少なくとも１種の主成分を、説明変数とし、月経前症候群の重症度を目的変数として構築される、
〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記遺伝子の発現量が、前記被験体の皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のｍＲＮＡを定量することにより測定される、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕下記の遺伝子に由来する核酸：SH3BGRL3、NDUFA11、CTNNB1、AQP3、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、ANXA1、SNORA70、HSPA6、ALDH2、ARHGDIB、DEFB4A、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、BIRC3、S100A7、STK10、GHITM、SFN、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、HMGN2、HIF1A、RABGEF1、ARF1、ACTN1、MFN2、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの、月経前症候群の重症度マーカーとしての使用。
〔９〕好ましくは、下記の遺伝子に由来する核酸：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つが使用される、〔８〕記載の使用。
〔１０〕好ましくは、さらに、下記の遺伝子に由来する核酸：CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つが使用される、〔９〕記載の使用。
〔１１〕好ましくは、前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のｍＲＮＡである、〔８〕～〔１０〕のいずれか１項記載の使用。
〔１２〕下記の遺伝子に由来する核酸：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、月経前症候群の重症度のマーカー。
〔１３〕好ましくは、さらに、下記遺伝子に由来する核酸：CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、〔１２〕記載のマーカー。
〔１４〕好ましくは、前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のｍＲＮＡである、〔１２〕又は〔１３〕記載のマーカー。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１　ＰＭＳ重症度マーカーの同定
１）ＳＳＬ採取
　健常者（２０～４５歳女性、ＢＭＩ１８．５以上２５．０未満）３８名を被験者とした。健常者は、予め月経周期が約２５～３０日で毎回安定していることを確認されていた。月経周期の各時期（月経期：月経開始後２～４日のいずれかの日、卵胞期：月経開始後１０～１２日のいずれかの日、黄体期：月経開始後２１～２３日のいずれかの日）に、あぶら取りフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて各被験者の全顔から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で、約１ヶ月間保存した。また、皮脂採取後に、月経関連症状を評価する質問紙である、心理測定尺度集III（サイエンス社、２００１発行）に記載のＭｅｎｓｔｒｕａｌ　Ｄｉｓｔｒｅｓｓ　Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＭＤＱ）を用いて、被験者の月経周期の各時期（月経期、卵胞期及び黄体期）の月経随伴症状（月経困難症、月経前症候群等）の重症度を評価した。
２）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
　上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、４２℃、１０５分間の条件で逆転写し、得られたｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲで増幅した。マルチプレックスＰＣＲは６２℃のアニーリング及び伸長温度で実施した。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した。得られた精製産物の溶液を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔに付属している５×ＶＩＬＯ　ＲＴ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ　Ａｍｐｌｉｓｅｑ　ＨｉＦｉ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｏｒｅ　Ｐａｎｅｌを混合し、次いで各キット付属のプロトコルに従ってプライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ　５４０　Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ　Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるhg19 AmpliSeq Transcriptome ERCC v1に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
３）ＭＤＱスコアによる被験者の群分け
　ＭＤＱではスコアが高いほど月経随伴症状の重症度が高いことを示す。そのため、被験者３８名を、黄体期に得られたＭＤＱのスコアに従って、スコアが６６点以上である１５名（平均スコア８７．４）をＰＭＳ重症群、スコアが４８点以下である１５名（平均スコア４０．３）をＰＭＳ軽症群に群分けした。中間層である８名に関しては、以下のデータ解析から除外した。
４）データ解析
　上記２）で取得した卵胞期及び黄体期における被験者のＳＳＬ由来ＲＮＡのシーケンシングで得られた各リードのリードカウントを、各ＲＮＡの発現量のデータとし、リードカウントが１０未満のリードは欠損値として扱った。サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｒｅａｄｓ）値に変換した。８０％以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られた１８８４種の遺伝子を選択した。これら１８８４種の遺伝子について、ＰＭＳが発症する黄体期におけるそれらの発現量データ（ＲＰＭ値）に基づいて群間（ＰＭＳ重症群及び軽症群）でＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔを行い、ｐ＜０．０５となる遺伝子を抽出した。なお、欠損値についてはＳｉｎｇｕｌａｒ　Ｖａｌｕｅ　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＳＶＤ）ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎにて補填した。群間で発現が変動する遺伝子が５１個得られ（表５）、そのうち表６に示す４０種の遺伝子が従来ＰＭＳとの関連が報告されていない遺伝子であった。これら表５中の遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、各々、ＰＭＳ重症度のマーカーとして使用できる。さらに、これら表５中の遺伝子のうち、表６に示す遺伝子に由来する核酸、及び該遺伝子の翻訳産物は、新規のＰＭＳ重症度マーカーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例２　黄体期ＲＮＡ発現量データに基づくＰＭＳ重症度予測モデルの構築
１）データセット分割
　実施例１で得られた被験者の黄体期のＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量データセットのうち、全解析対象者数の６７％に当たる各群（ＰＭＳ重症群及び軽症群）１０名分ずつについてのデータをＰＭＳ重症度予測モデルの訓練データとし、残り３３％に当たる各群５名分ずつのデータをモデル精度の評価に使用するテストデータとした。負の二項分布に従うＲＰＭ値を正規分布に近似するため、実施例１で求めたＲＮＡの発現量データ（リードカウントのＲＰＭ値）を、底２の対数値に変換したＲＰＭ値（Log2ＲＰＭ値）に変換した。
２）特徴量の選択
　実施例１で抽出した遺伝子のうち、ＰＭＳとの関連が報告されていない表６に示す４０個の遺伝子から、以下の２つの方法により予測モデル構築に用いる特徴量を選択した。
（方法１）表６に示す遺伝子のうち、ＰＭＳ重症群と軽症群との発現差のｐ値が小さいものから５～１５種の遺伝子、具体的には表６のＮｏ．１～５の５種、表６のＮｏ．１～１０の１０種、又は表６のＮｏ．１～１５の１５種の遺伝子の発現量データ（Log2ＲＰＭ値）を、ＰＭＳ重症度検出の特徴量として選択した。
（方法２）表６に示す遺伝子の発現量データについて、統計解析環境Ｒのｔｉｄｙｖｅｒｓｅパッケージを使用して主成分分析を行い、変数圧縮を実施した。主成分分析によって得られた、新しい次元を持つデータ（第１～第１０主成分、表７）をＰＭＳ重症度検出の特徴量として選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
３）モデル構築
　モデル構築は統計解析環境Ｒのｃａｒｎｅｔパッケージを使用して行った。前記２）で方法１及び２により選択した特徴量を説明変数として用い、ＰＭＳ重症度（重症又は軽症）を目的変数として用いて、予測モデルを構築した。特徴量毎に、ランダムフォレスト（Random Forest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear））、及びｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（SVM (rbf)）の４種のアルゴリズムを用いて、１０倍交差検証を行って予測モデルを学習させた。各アルゴリズムについて、学習後のモデルにテストデータのＲＮＡの発現量データ（Log2ＲＰＭ値）又は主成分データを入力してＰＭＳ重症度の予測値を計算した。予測値と実測値の一致度合いを示す値である正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）を計算し、その値が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
４）結果
　表８に、ＰＭＳ重症度の検出に用いた特徴量、最大のＡｃｃｕｒａｃｙを与えた最適アルゴリズム、及びそのＡｃｃｕｒａｃｙを示す。ＰＭＳ重症度に関連する遺伝子の黄体期における発現量データ、又はそれらの主成分に基づいて、高いＡｃｃｕｒａｃｙでＰＭＳ重症度を検出することができた。したがって、ＳＳＬ由来ＲＮＡの黄体期における発現量のデータを用いてＰＭＳ重症度の検出が可能であることが示された。また、主成分に基づく予測モデルの場合、第１～第５主成分による予測モデルのＡｃｃｕｒａｃｙは、主成分１による予測モデルよりも高く、一方、第１～第６主成分による予測モデルと同等であった。これらの結果から、合計寄与率が２０％以上、例えば２２～５５％又はそれ以上、好ましくは５０～７０％、より好ましくは５５～６５％になるような１つ以上の主成分を説明変数とすることで、より精度の高いＰＭＳ重症度予測モデルが構築可能であることが示された。また、遺伝子発現量から直接構築した予測モデルの場合、１０遺伝子による予測モデルのＡｃｃｕｒａｃｙは、５遺伝子による予測モデルよりも高く、一方、１５遺伝子による予測モデルと同等であった。ＰＭＳ重症度による発現差の大きいものから１０～１５個程度の遺伝子又はそれより多くの遺伝子の発現データを用いることで、より精度の高いＰＭＳ重症度予測モデルが構築可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例３　卵胞期ＲＮＡ発現量データに基づくＰＭＳ重症度予測モデルの構築
１）データセット分割及び特徴量の選択
　表６に示す遺伝子についての被験者の卵胞期のＳＳＬ由来ＲＮＡ発現量データセットを用いた以外は、実施例２の１）と同様の手順で訓練データとテストデータを作成した。次いで実施例２の２）と同様の手順で、ＲＮＡの発現量データのLog2ＲＰＭ値及び発現量データの主成分分析によって得られた第１～第１５主成分（表９）をＰＭＳ重症度検出の特徴量として選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
２）モデル構築
　１）で選択した特徴量を説明変数として用いて、実施例２の３）と同様の手順で予測モデルを学習させ、正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデルを最適な予測モデルとして選抜した。
３）結果
　表１０に、ＰＭＳ重症度の検出に用いた特徴量、最大のＡｃｃｕｒａｃｙを与えた最適アルゴリズム、及びそのＡｃｃｕｒａｃｙを示す。ＰＭＳ重症度に関連する遺伝子の卵胞期における発現量データ、又はそれらの主成分に基づいて、高いＡｃｃｕｒａｃｙでＰＭＳ重症度を検出することができた。したがって、ＳＳＬ由来ＲＮＡの卵胞期における発現量のデータを用いて、次回月経に伴うＰＭＳの重症度の検出が可能であることが示された。また、主成分に基づく予測モデルの場合、第１～第１５主成分による予測モデルのＡｃｃｕｒａｃｙが最も高く、合計寄与率が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上になるような１つ以上の主成分を説明変数とすることで、より精度の高いＰＭＳ重症度予測モデルが構築可能であることが示された。一方、遺伝子発現量から直接構築した予測モデルの場合、ＰＭＳ重症度との相関が高いものから５～２０個程度、好ましくは５～１５個程度の遺伝子の発現データを用いることで、より精度の高いＰＭＳ重症度予測モデルが構築可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  

Claims (10)

  1. 　下記に示す遺伝子：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、被験体の月経前症候群の重症度を検出する方法。
  2. 　さらに、下記遺伝子：CTNNB1、AQP3、ANXA1、ARHGDIB、DEFB4A、BIRC3、S100A7、SFN、HMGN2、HIF1A、及びMFN2、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの発現を測定することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記遺伝子又は翻訳産物の黄体期又は卵胞期での発現量に基づいて月経前症候群の重症度を検出することを含む、請求項３記載の方法。
  5. 　前記遺伝子又は翻訳産物の発現量に基づく予測モデルを用いて月経前症候群の重症度を検出することを含み、
    　該予測モデルが、月経前症候群の重症群及び軽症群における該遺伝子又は翻訳産物の発現量、又は該発現量の主成分分析で算出された少なくとも１種の主成分を、説明変数とし、月経前症候群の重症度を目的変数として構築される、
    請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記遺伝子の発現量が、前記被験体の皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のｍＲＮＡを定量することにより測定される、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　下記の遺伝子に由来する核酸：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つの、月経前症候群の重症度のマーカーとしての使用。
  8. 　前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のｍＲＮＡである、請求項７記載の使用。
  9. 　下記の遺伝子に由来する核酸：SH3BGRL3、NDUFA11、PSME2、SNORA24、SSR4、ZNF91、SNORA70、HSPA6、ALDH2、BRK1、C20orf111、CSNK1A1、STK10、GHITM、RPL21、MED13、RPL32、UBE2R2、RPS3、PLEKHM2、DDX6、ALDH1A3、TSPYL1、NUB1、KRT6A、CCL22、ELOVL3、TMEM66、GDI2、MYL12B、CCNI、PSMC6、RABGEF1、ARF1、ACTN1、CHMP2A、GAK、STX3、SERP1及びGAS7、ならびに該遺伝子の翻訳産物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、月経前症候群の重症度のマーカー。
  10. 　前記遺伝子に由来する核酸が、皮膚表上脂質に含まれる該遺伝子のｍＲＮＡである、請求項９記載のマーカー。 
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