WO2021013814A1 - Verfahren zum strecken eines nukleinsäuremoleküls - Google Patents

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WO2021013814A1
WO2021013814A1 PCT/EP2020/070503 EP2020070503W WO2021013814A1 WO 2021013814 A1 WO2021013814 A1 WO 2021013814A1 EP 2020070503 W EP2020070503 W EP 2020070503W WO 2021013814 A1 WO2021013814 A1 WO 2021013814A1
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WO
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hydrogel
nucleic acid
acid molecule
temperature
stimuli
Prior art date
Application number
PCT/EP2020/070503
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English (en)
French (fr)
Inventor
Laura HOPPE ALVAREZ
Felix Maximilian GULAREK
Dominik WÖLL
Elmar Weinhold
Original Assignee
Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen
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Publication date
Application filed by Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen filed Critical Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Definitions

  • a method for stretching a nucleic acid molecule is provided.
  • the use of a hydrogel to stretch a nucleic acid molecule is also provided.
  • Sequence arrangements as well as in diagnostic examinations are optical mapping and fiber fluorescence in situ hybridization (fiber FISH) common methods. These studies make it possible to obtain information on a large scale that supplements sequencing results. Furthermore, only small segments can be analyzed in one piece during sequencing, which then have to be put together to form longer sequences. In contrast, with the DNA mapping, a changed arrangement of DNA segments and the number of copies of a sequence can be seen directly.
  • fiber FISH fiber fluorescence in situ hybridization
  • microstructured or positively charged surface or DNA combining In this technique, a DNA molecule is stretched on a modified, solid glass or polymer surface. The surface is modified with positively charged silanes so that anchor points are available for the negatively charged DNA. The interaction of a forced fluid flow and the ionic binding of the DNA to the surface makes it linear and stretched.
  • a method and use provided here typically allow a nucleic acid molecule to stretch by more than about 50 KBp. This is usually the size limit for DNA combining.
  • a hydrogel is used, on the surface of which a solution is arranged that contains the nucleic acid molecule to be stretched. Usually the solution defines a drop. The inventors have found that in a method and use provided here
  • the stretched nucleic acid molecule is advantageously fixed by means of the hydrogel used. If several nucleic acid molecules are stretched, those are those that have been subjected to a method and a use provided here
  • Nucleic acid molecules are usually stretched homogeneously.
  • stimulus-responsive hydrogel also called stimulus-responsive hydrogel
  • the use of a stimulus-responsive hydrogel is advantageous with regard to the stretching, which under the action of an external stimulus or stimulus is able to change its degree of swelling and / or its volume and thus a To go through swelling or a collapse.
  • the stimulus-responsive hydrogel is in some
  • thermoresponsive hydrogel Embodiments a thermoresponsive hydrogel.
  • a method and use disclosed herein is typically carried out so that the only liquid with which the hydrogel used is in contact is the
  • Aqueous solution containing nucleic acid molecule is not in contact with any other liquid such as water or an aqueous solution.
  • a method for stretching a nucleic acid molecule is provided.
  • An aqueous solution containing the nucleic acid molecule is located on the surface of the hydrogel.
  • the nucleic acid molecule can be a DNA molecule, for example.
  • the method includes exposing the hydrogel, on the surface of which the nucleic acid molecule solution is located, to a temperature from room temperature to 95 ° C. or to a temperature above room temperature. The selected temperature can also be between room temperature and 95 ° C.
  • the method includes applying an aqueous solution containing the nucleic acid molecule to the surface of the hydrogel.
  • the hydrogel is then exposed to a temperature from room temperature to 95 ° C, including between room temperature and 95 ° C.
  • the hydrogel used in the process contains water, which generally causes at least some swelling of the hydrogel. This water can be removed from the hydrogel by evaporation and / or evaporation. Such evaporation or evaporation is triggered by placing the hydrogel at a temperature from room temperature to 95 ° C, including between
  • the underlying process can also be understood as drying the hydrogel.
  • the hydrogel is exposed for a period of time to a temperature between room temperature and 95 ° C., which allows evaporation or evaporation long enough for a stretching of the nucleic acid molecule to be detectable.
  • the time period to choose depends, among other things, on the temperature selected, the dimensions of the hydrogel and the amount of nucleic acid solution used.
  • the method includes exposing the hydrogel, on the surface of which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is located, to a temperature of about 30 to 90 ° C.
  • the temperature to which the hydrogel is exposed is in the range of about 35 to 80 ° C, for example in the range of about 40 to 70 ° C.
  • a hydrogel as used herein has pores in some embodiments.
  • the hydrogel contains a polymer that is polyvinyl methyl ether. In some embodiments, the hydrogel contains a polymer that is poly (ethylene glycol) (PEG).
  • the hydrogel is a stimuli-responsive hydrogel.
  • a stimulus-responsive hydrogel has a degree of swelling and / or a volume that can be changed, e.g. reduced, by a stimulus.
  • the method can include exposing the stimuli-responsive hydrogel to a stimulus that triggers a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel.
  • a stimuli-responsive hydrogel it counts to the method, the stimuli-responsive hydrogel simultaneously the said stimulus and a temperature of
  • the method includes the hydrogel at a temperature from room temperature to 95 ° C, including between room temperature and 95 ° C.
  • the hydrogel is a stimuli-responsive hydrogel. To the procedure it can be in such
  • Embodiments include applying an aqueous solution containing the nucleic acid molecule to the surface of a stimulus-responsive hydrogel.
  • the stimulus-responsive hydrogel is able to change its degree of swelling and / or its volume in response to a stimulus.
  • a corresponding stimulus can be, for example, the ionic strength or the temperature.
  • Light or the pH value can also be such a stimulus.
  • the method also includes exposing the stimuli-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied to a stimulus which triggers a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel.
  • the method can also include further exposing the stimulus-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied to said stimulus and drying the stimulus-responsive hydrogel by heating to a temperature between room temperature and 95 ° C.
  • the method includes detecting the nucleic acid molecule.
  • the degree of stretching of the nucleic acid molecule can be recorded.
  • the stretching of the nucleic acid molecule can be monitored.
  • the hydrogel can be dried by heating to a temperature from room temperature to 95 ° C. until a sufficient degree of stretching is detected.
  • the nucleic acid molecule can for example by a color marking, such as a
  • Fluorescent marking can be detected.
  • a stimuli-responsive hydrogel is used as the hydrogel, then in corresponding embodiments the hydrogel can be exposed to the stimulus and the stimuli-responsive hydrogel can be dried by heating to a temperature from room temperature to 95 ° C. until it is sufficiently stretched is detected.
  • the method includes drying the hydrogel, which is further exposed to the stimulus, by holding it at a temperature between room temperature and 95 ° C. until the applied solution is macroscopically at least substantially no longer on the surface of the hydrogel is recognizable.
  • the hydrogel can be further dried by holding it at a temperature between room temperature and 95 ° C.
  • the hydrogel can be dried by holding at a temperature between room temperature and 95 ° C until none
  • the hydrogel can be dried by holding it at a temperature between room temperature and 95 ° C. until no change in the weight and / or the volume of the hydrogel can be detected any longer.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is not subjected to any flow on the surface of the hydrogel, e.g., the stimulus-responsive hydrogel.
  • the surface of the hydrogel e.g., the stimulus-responsive hydrogel.
  • no channels or similar microfluid elements are typically provided in a hydrogel.
  • a hydrogel with a flat surface can be used.
  • a hydrogel with an uneven, e.g., wavy or rough, surface can be used.
  • the method includes leaving the aqueous solution containing the nucleic acid molecule located on the surface of the hydrogel in at least substantially static form on the surface of the hydrogel. In some embodiments, it is part of the process, while the hydrogel is exposed to a temperature in the range from room temperature to 95 ° C., to leave the solution containing the nucleic acid molecule in a substantially static form on the surface of the hydrogel. In some embodiments, while the hydrogel is exposed to a temperature of from room temperature to 95 ° C., it is part of the method to leave the solution containing the nucleic acid molecule in static form on the surface of the hydrogel. In some embodiments, the aqueous solution containing the nucleic acid molecule located on the surface of the hydrogel is at least substantially static form on the surface of the hydrogel until macroscopically at least essentially no more solution is visible on the surface of the hydrogel.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is left in an at least essentially static form on the surface of the hydrogel after application. In some embodiments, the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is left in at least essentially static form on the surface of the hydrogel after application, until at least essentially no more solution is visible on the surface of the hydrogel, i.e. macroscopically. In some
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is left in at least essentially static form on the surface of the hydrogel after application until at least essentially no more solution is macroscopically visible on the surface of the hydrogel.
  • the method includes the nucleic acid molecule in a drop of an aqueous solution on the surface of the hydrogel, for example the
  • the hydrogel on which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is located can have any desired surface structure.
  • the hydrogel has in some
  • Embodiments have an at least substantially planar surface. In some embodiments,
  • the hydrogel has a completely planar surface.
  • the stimulus responsive hydrogel in which a stimulus responsive hydrogel is used, defines a planar surface upon exposure to the stimulus. In some embodiments, the stimulus-responsive hydrogel, at least in swollen form, e.g., gel form, defines a planar surface prior to exposure to the stimulus. In some embodiments, the stimulus-responsive hydrogel defines, at least in a shrunk form, a substantially planar surface. In some
  • Embodiments define the stimulus-responsive hydrogel at least in swollen form a substantially planar surface.
  • the hydrogel is disposed on a solid substrate, such as a glass substrate. In some embodiments, the hydrogel is fixed on a solid substrate. In some embodiments, the hydrogel is fixed to a solid substrate by covalent bonding.
  • the method includes using a hydrogel, e.g.
  • a stimuli-responsive hydrogel used contains a stimuli-responsive polymer, that is to say a polymer which is able to change its degree of swelling and / or its volume in response to a stimulus.
  • a stimuli-responsive hydrogel made from a stimuli-responsive polymer.
  • the stimuli-responsive hydrogel consists essentially of a stimuli-responsive polymer.
  • the method includes making a stimulus-responsive hydrogel on a substrate.
  • the substrate can contain functional groups to which a resulting polymer can be covalently bonded.
  • such a substrate contains functional groups to which a resulting polymer is covalently bonded.
  • Such a resulting polymer can be a polymer that is contained in the hydrogel used here.
  • Such a resulting polymer may in some embodiments be a
  • stimuli-responsive polymer which is contained in a stimuli-responsive hydrogel or which defines the corresponding stimuli-responsive hydrogel.
  • the stimuli-responsive hydrogel can be a
  • thermoresponsive hydrogel In some embodiments where the hydrogel is a stimuli responsive hydrogel, the hydrogel has a VPTT (Volume Phase Change Temperature) in the range of 20 to 95 ° C.
  • VPTT Volume Phase Change Temperature
  • the method includes the stimuli-responsive hydrogel, on the surface of which the the the hydrogel is a stimuli-responsive hydrogel
  • Aqueous solution containing nucleic acid molecule is exposed to a temperature which is at or above the VPTT of the hydrogel.
  • the method includes the stimuli-responsive hydrogel, on the surface of which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is located, for a period of 10 minutes to 5 hours at a temperature at or above VPTT of the
  • the method is carried out without supplying an external liquid, in particular without supplying an aqueous solution or water.
  • the hydrogel is at least substantially not brought into contact with any protein, for example with any enzyme, during the process. In typical embodiments, the hydrogel is not brought into contact with any protein during the process.
  • Embodiments of the following second aspect can also represent embodiments of the first aspect.
  • a method for stretching a nucleic acid molecule can be a DNA molecule, for example.
  • the method includes applying an aqueous solution containing the nucleic acid molecule to the surface of a stimuli-responsive hydrogel.
  • the hydrogel has a volume phase transition temperature (VPTT) which is in the range from room temperature to about 95 ° C, including a range from about 20 to 80 ° C.
  • the hydrogel usually has a VPTT under the selected pressure, for example under atmospheric pressure, which is in the range from room temperature to about 95.degree. In some embodiments, the VPTT is in the range of about 20 to 80 ° C.
  • the process also includes the stimuli-responsive hydrogel that the The aqueous solution containing nucleic acid molecule has been applied, expose to a temperature which is above the VPTT of the hydrogel.
  • the method further includes keeping the stimuli-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied at a temperature above the VPTT of the hydrogel until the applied solution is at least essentially macroscopic more on the surface of the
  • stimulus-responsive hydrogel is recognizable.
  • the selected temperature which is above the VPTT of the hydrogel, can be kept constant during the process.
  • the temperature above the VPTT of the hydrogel can also vary during the process.
  • the temperature above the VPTT of the hydrogel to which it is initially exposed can be selected independently of the temperature above the VPTT of the hydrogel at which it is held until at least essentially no more applied solution can be detected on the surface of the stimulus-responsive hydrogel.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is not subjected to any flow on the surface of the stimulus-responsive hydrogel.
  • no channels or similar microfluidic elements are provided in a hydrogel.
  • a hydrogel with a planar surface is used.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is left in at least essentially static form on the surface of the stimuli-responsive hydrogel after application until at least essentially no more solution can be detected on the surface of the stimuli-responsive hydrogel.
  • the method includes applying the nucleic acid molecule to the surface of the stimulus-responsive hydrogel in a drop of an aqueous solution.
  • the stimulus-responsive hydrogel defines a planar surface at least beneath the VPTT. In some embodiments, the stimulus responsive hydrogel defines a substantially planar surface at least beneath the VPTT.
  • the stimulus responsive hydrogel is disposed on a solid substrate, such as a glass substrate.
  • the hydrogel is fixed on a solid substrate.
  • the hydrogel is fixed to a solid substrate by covalent bonding.
  • the method includes preparing a stimuli-responsive hydrogel prior to applying an aqueous solution containing the
  • nucleic acid molecule Contains nucleic acid molecule. Any known method can be used for this purpose in order to obtain a stimulus-responsive hydrogel.
  • the method includes making a stimulus responsive hydrogel on a substrate.
  • the substrate can contain functional groups to which a resulting polymer can be covalently bonded.
  • such a substrate contains functional groups to which a resulting polymer is covalently bonded.
  • stimuli-responsive hydrogel is visible to allow the stimuli-responsive hydrogel to dry.
  • the method includes exposing the stimuli-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied to a temperature of about 30 to 90 ° C. In some embodiments, the temperature to which the stimuli responsive hydrogel is exposed is in the range of about 35 to 80 ° C,
  • the method includes the stimuli-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied for a period of about 10 minutes to about 5 hours at a temperature above the VPTT of the hydrogel hold.
  • the stimuli-responsive hydrogel contains an LCST polymer, that is to say a polymer with a lower critical solution temperature (LCST for short). In some embodiments, the stimulus-responsive is
  • the stimuli responsive hydrogel consists essentially of an LCST polymer.
  • the LCST polymer is a homopolymer or a copolymer.
  • the LCST polymer has an LCST in the range of about 20 to 100 ° C in water at the selected pressure, e.g., under atmospheric pressure. In some embodiments, the LCST polymer has an LCST in water in the range of about 30 to 90 ° C at the selected pressure, e.g., under atmospheric pressure.
  • the stimuli-responsive hydrogel contains a polymer, the poly (N-isopropylacrylamide (PNIPAAm) or
  • Poly (N, N-diethylacrylamide) (PDEAAm) is. In some embodiments, this includes
  • Stimuli-responsive hydrogel is a polymer that is poly (N-isopropylmethyl methacrylamide) (PNIPMAAm) or poly [2- (dimethylamino) ethyl methacrylate] (pDMAEMA).
  • the stimuli responsive hydrogel contains a polymer that is hydroxypropyl cellulose or poly (N-vinyl caprolactam) (PVCL).
  • the stimuli responsive hydrogel contains a polymer that is a PEG methacrylate (PEGMA).
  • the stimuli-responsive hydrogel contains a polymer which is a combination of two or more of poly (N-isopropylacrylamide (PNIPAAm), poly (N, N-diethylacrylamide) (PDEAAm), poly [2- ( dimethylamino) ethyl methacrylate] (pDMAEMA), hydroxypropyl cellulose, poly (N-vinylcaprolactam) (PVCL), polyvinyl methyl ether, poly (ethylene glycol) (PEG) and / or a PEG methacrylate (PEGMA).
  • the method includes applying a labeled nucleic acid molecule to the stimulus-responsive hydrogel.
  • the labeled nucleic acid molecule can be labeled with a fluorescent dye, for example. This can be, for example, a covalent label or a modification of the nucleic acid backbone.
  • An intercalation dye can also be used.
  • the method is carried out without supplying an external liquid, in particular without supplying an aqueous solution or water.
  • the hydrogel is at least substantially not brought into contact with any protein, for example with any enzyme, during the process. In typical embodiments, the hydrogel is not brought into contact with any protein during the process.
  • a hydrogel for stretching a nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule can, for example, be a DNA molecule.
  • the hydrogel, on the surface of which there is a solution of the nucleic acid molecule, is exposed to a temperature in the range from room temperature to 95 ° C.
  • Hydrogel on the surface of which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is located, exposed to a temperature of about 30 to 90 ° C.
  • the temperature to which the hydrogel is exposed is in the range of about 35 to 80 ° C, for example in the range of about 40 to 70 ° C.
  • the hydrogel is a stimuli responsive hydrogel.
  • exposure to a stimulus can typically trigger a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel.
  • the degree of swelling and / or the volume of the stimulus-responsive hydrogel can therefore be reduced by a stimulus.
  • a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel in a temperature range of about 20 to 100 ° C. is also possible.
  • the hydrogel is exposed to a stimulus which triggers a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel.
  • an aqueous solution containing the nucleic acid molecule is applied to the surface of a stimuli-responsive hydrogel.
  • the stimuli-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied is exposed to this stimulus and at a temperature between
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule on the surface of the stimuli-responsive hydrogel is not exposed to any flow such as microfluidic forces.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule after being applied to the surface of the stimuli-responsive hydrogel, is at least essentially static form on this very surface.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule is left in at least essentially static form on this surface after application to the surface of the stimuli-responsive hydrogel until macroscopically at least essentially no more solution is visible on the surface of the stimuli-responsive hydrogel.
  • there is no supply of an external liquid in particular no supply of an aqueous solution or of water.
  • the hydrogel is also at least in
  • a stimulus-responsive hydrogel for stretching a nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule can be a DNA molecule, for example.
  • the hydrogel has a VPTT that is in the range of about 20 to 80 ° C. At the selected pressure, e.g. under atmospheric pressure, the hydrogel usually has a VPTT in the range of around 20 to 80 ° C.
  • an aqueous solution containing the nucleic acid molecule is applied to the surface of a stimuli-responsive hydrogel.
  • the stimulus-responsive hydrogel to which the aqueous solution containing the nucleic acid molecule has been applied is kept at a temperature above the VPTT of the hydrogel, so that the nucleic acid molecule is stretched.
  • the stimuli-responsive hydrogel is kept at a temperature above the VPTT of the hydrogel until the applied solution is apparently at least essentially no longer macroscopically recognizable on the surface of the stimulus-responsive hydrogel.
  • the aqueous solution containing nucleic acid molecule has been applied, exposed to a first temperature which is above the VPTT of the hydrogel before it is kept at a second temperature above the VPTT of the hydrogel until the applied solution is at least substantially no longer visible to the naked eye of the stimuli-responsive hydrogel is visually recognizable.
  • the first temperature above the VPTT of the hydrogel to which it is initially exposed can be selected in such embodiments independently of the second temperature above the VPTT of the hydrogel at which it is held until at least essentially no more solution is applied to the surface of the stimulus-responsive hydrogels
  • the chosen temperature which is above the VPTT of the hydrogel at which it is held, can be kept constant.
  • the temperature above the VPTT of the hydrogel at which the hydrogel is held can also vary during the process.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule on the surface of the stimuli-responsive hydrogel is not exposed to any flow, such as microfluidic forces.
  • the aqueous solution containing the Contains nucleic acid molecule after application to the surface of the stimuli-responsive hydrogel left in at least essentially static form on this very surface.
  • the stimuli responsive hydrogel is a thermoresponsive hydrogel.
  • nucleic acid solution (4) Since the hydrogel (1) usually has a larger surface area than the droplet with nucleic acid solution (4), the total evaporation via the hydrogel should be higher than via the droplet of the solution. At the same time, the drop should serve as a liquid reservoir. In the event of a decrease in the total volume due to evaporation, in particular when heated, liquid should therefore flow from the nucleic acid solution (4) into the hydrogel (1). As a result, the nucleic acid molecule enters the hydrogel and is stretched in the process, a process that is actually observed.
  • FIG. 2 shows schematically a production of a stimuli-responsive hydrogel and the use of the same for stretching a nucleic acid molecule according to one embodiment of the method disclosed here.
  • a stock solution with one or more monomers for a stimulus-responsive hydrogel and typically a crosslinker and, for example, an initiator, e.g. a photoinitiator, are provided between a substrate such as a glass substrate (3) and a cover slip, e.g. a round cover slip (2).
  • the substrate (3) can be modified with a silane which is or can be linked to a monomer.
  • the polymerization is started by UV irradiation and a stimuli-responsive hydrogel (1) is formed.
  • the cover slip (2) is removed and a solution (4) applied that contains the
  • nucleic acid molecule Contains nucleic acid molecule. Heating, for example to a temperature in the range from about 35 to 75 ° C., brings about a stimulus-responsive shrinkage of the hydrogel, the nucleic acid molecule in the hydrogel (1) being stretched.
  • FIGS. 3A and 3B show a fluorescence microscopic picture of an I-phage DNA strand after stretching by heating in a polyacrylamide gel (diameter 10 mm). The l-phage DNA was stained with the intercalation dye YOYO-1.
  • FIGS. 4A and 4B show a fluorescence microscopic picture of an I-phage DNA strand after stretching by heating in a polymethacrylic acid gel (diameter 10 mm).
  • the l-phage DNA was stained with the intercalation dye YOYO-1.
  • FIGS. 5A and 5B show a fluorescence microscopic picture of an I-phage DNA strand after stretching by heating in a poly-NIPMAAm hydrogel (diameter 10 mm). The l-phage DNA was stained with the intercalation dye YOYO-1.
  • FIG. 6 shows a fluorescence microscope image of a 1-phage DNA strand after stretching by drying above the VPTT in a poly-NIPAAm hydrogel (diameter 10 mm).
  • the strands were labeled with AdoYnTAMRA and a DNA methyltransferase. Excess fluorophore was removed using Agarose Plug Purification (APP).
  • APP Agarose Plug Purification
  • the l-phage DNA was intercalated with YOYO-1.
  • FIG. 6A shows both colorations, while FIG. 6B shows only the yellow coloration of the TAMRA fluorophore and FIG. 6C only the cyan coloration of YOYO-1.
  • FIG. 7 shows, with the illustration parts 7A, 7B and 7C, three fluorescence microscopy images of T7 phage DNA strands which have been stretched in hydrogels with a diameter of 22 mm. The strands were marked as indicated for FIG. 6 with AdoYnTamra and YOYO-1. 7D, 7E and 7F show the same gels as FIGS. 7A, 7B and 7C, only the signals of the cyan staining by YOYO-1 being shown.
  • the word "about” as used herein refers to a value that is within an acceptable range of error for a particular value as determined by one of ordinary skill in the art. This will depend in part on how the respective value was determined or measured, ie on the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within a standard deviation of 1 or more, depending on the use in the respective area. The term “about” is also used to indicate that the respective amount or value can be the specified value or another value that is approximately the same. The term is intended to express that similar values favor equivalent results or effects as disclosed in this document. In this context, “about” can refer to a range of up to 10% above and / or below a certain value.
  • "about” refers to a range up to 5% above and / or below a certain value, such as 2% above and / or below a certain value. In some embodiments, “about” refers to a range of up to 1% above and / or below a certain value. In some embodiments,
  • “about” refers to a range of up to 0.5% above and / or below a certain value. In one embodiment, “about” refers to a range up to 0.1% above and / or below a certain value.
  • top and bottom refer to an orientation of a hydrogel disclosed herein as a whole, as is typically present in its manufacture on a surface of a substrate, such as a substantially planar surface of a substrate.
  • the alignment of the hydrogel is typically determined by the fact that the resulting polymer is in a liquid phase.
  • the substrate is therefore, viewed relative to the hydrogel being produced, in the direction of gravity.
  • the resulting hydrogel has a certain thickness in the direction of gravity and extends in a plane that is essentially perpendicular to gravity.
  • Singular forms such as “an”, “an”, “der”, “die” or “das” include the plural form when used in this document.
  • a reference to “a cell” means both an individual cell and a plurality of cells.
  • the term “one or more” is used explicitly to indicate that the singular form includes the plural form. Such explicit references do not limit the general meaning of the singular form.
  • the terms “at least”, “at least” and “at least” when preceded by a sequence of elements are understood to refer to each of these elements.
  • the terms “at least one”, “at least one”, “at least one” or “at least one of” include, for example, one, two, three, four or more elements.
  • nucleic acid when used herein refers to any nucleic acid molecule in any possible configuration, such as, for example, single-stranded, double-stranded or a combination thereof.
  • Nucleic acids include, for example, DNA molecules, RNA molecules, analogs of DNA or RNA that can be generated with nucleotide analogs or with the help of nucleic acid chemistry, LNA molecules (locked nucleic acid), peptide nucleic acid molecules (PNA) and Tecto RNA molecules (e.g. Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077).
  • a PNA molecule is a nucleic acid molecule in which the backbone is a pseudopeptide instead of a sugar is. Accordingly, PNA generally has a charge-neutral backbone, in contrast to, for example, DNA or RNA. PNA is nevertheless able to hybridize at least complementary and essentially complementary nucleic acid strands, such as, for example, DNA or RNA (of which PNA is considered to be a structural replica).
  • An LNA molecule has a modified RNA backbone with a methylene bridge between C4 'and 02', which fixes the furanose ring in an N-type configuration and gives the molecule in question greater duplex stability and nuclease insensitivity. Unlike a PNA molecule, an LNA molecule has a charged backbone.
  • DNA or RNA can be of genomic or synthetic origin and can be single or double stranded.
  • a nucleic acid can be, for example, mRNA, cRNA, synthetic RNA, genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, a copolymer of DNA and RNA or an oligonucleotide.
  • a corresponding nucleic acid can also contain non-natural nucleotide analogs and / or be linked to an affinity tag or a label.
  • nucleotide analogs are known, and in principle each can be used in the method disclosed here.
  • a nucleotide analog is a nucleotide that contains a modification, for example to the base, sugar or phosphate portion.
  • a substitution of 2'-OH residues of the siRNA by 2 ⁇ -, 2'O-Me or 2'H residues is known to improve the / «- v / vo stability of the RNA in question.
  • Modifications to the base part include natural and synthetic modifications of A, C, G and T / U, various purine or pyrimidine bases such as uracil-5-yl, hypoxanthin-9-yl and 2-aminoadenin-9-yl as well as non-purine or non-pyrimidine nucleotide bases.
  • Other nucleotide analogs serve as universal bases.
  • the universal bases include 3-nitropyrrole and 5-nitroindole. Universal bases are able to form a base pair with any other base. Base modifications can often be done with e.g.
  • Sugar modification such as 2'-0-methoxyethyl can be combined to e.g. unique
  • a method and a use disclosed herein are based on the use of a hydrogel.
  • a nucleic acid molecule is stretched on or in the hydrogel. There is therefore no need for a special geometric surface structure; rather, the hydrogel used can have a planar surface due to the manufacturing process. In particular, that is
  • Stretches do not rely on the presence of a depression such as a channel.
  • the stretching occurs in some embodiments without the presence of a depression such as a channel.
  • the hydrogel can have any desired surface topology.
  • one or more depressions such as a furrow, a flat, including a planar, depression or also one or more elevations are present.
  • An elevation can be, for example, the shape of a step, a bead or a flat, including a planar, elevation.
  • a depression and an elevation can be of any geometric shape.
  • a depression on the surface of the hydrogel is in fluid connection with the solution of the nucleic acid molecule or is wetted by this or during the process disclosed here and the use disclosed here filled out.
  • a depression on the surface of the hydrogel is generally not in fluid connection with another liquid.
  • nucleic acid molecule used. Several different nucleic acid molecules can be stretched in parallel on several hydrogels. Several nucleic acid molecules, including different nucleic acid molecules and identical nucleic acid molecules, can also be stretched on a single hydrogel.
  • hydrogel is suitable as the hydrogel, for example a hydrogel containing polyacrylate or a derivative thereof such as poly (2-hydroxyethyl methacrylate).
  • polyacrylate or a derivative thereof such as poly (2-hydroxyethyl methacrylate).
  • HPMA 2-hydroxypropyl methacrylate
  • a suitable hydrogel can also contain polyacrylamide or a derivative thereof. It can, for example, be a polyacrylamide crosslinked with bisacrylamide.
  • a suitable hydrogel may contain polyvinyl alcohol as another example.
  • a suitable hydrogel can also contain a polysaccharide or poly (ethylene glycol).
  • Methoxyl poly (ethylene glycol) monoacrylate is another illustrative example of a suitable polymer.
  • Numerous monomers suitable for hydrogels are commercially available and the appropriate protocol for preparing the hydrogel is available.
  • a stimuli-responsive hydrogel is employed. Accordingly, in such embodiments, a nucleic acid molecule is stretched on or in the stimulus-responsive hydrogel.
  • a stimuli-responsive hydrogel shows changes in its properties in response to one or more external influences such as temperature, pH, light, an ion change, a magnetic or electric field or a change in the redox potential.
  • a stimuli-responsive hydrogel described here can be, for example, a thermoresponsive hydrogel.
  • a stimulus-responsive hydrogel typically contains a polymer that collapses in response to an external stimulus.
  • thermoresponsive polymer has an upper and / or a lower critical
  • Solution temperature The typical case is a lower critical solution temperature. If a polymer is soluble in water above a certain temperature and insoluble below it, it has an upper critical solution temperature. If a polymer is soluble in water below a certain temperature and insoluble above it, it has a lower critical solution temperature (LCST). At temperatures below the LCST, such a polymer is soluble through the formation of hydrogen bonds with water. When the temperature reaches the LCST, the hydrophobic interaction becomes dominant, reducing the amount of
  • Poly (NIPAM) which has an LCST close to human body temperature.
  • Related polymers such as poly (N, N-diethylacrylamide), poly (dimethylaminoethyl methacrylate) and poly (N- (L) - (1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide), with LCSTs in the range of 30-50 ° C, were also examined.
  • Poly (ethylene oxide) -poly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide) copolymers known under the trade name Pluronic®, are another type of polymer that is extensively used in the
  • a polymer-based hydrogel is a cross-linked hydrophilic polymer. Numerous crosslinkers are known; ethylene glycol diacrylate (EGDA) or PEG diacrylate (PEGDA) are often used. A crosslinker that is frequently used is the / V, / V‘-methylenebis (acrylamide) (MBA) already mentioned above.
  • a hydrogel defines a three-dimensional hydrophilic polymer network made up of one or more chemically and / or physically crosslinked polymers. A polymer-based hydrogel can absorb or release water. After absorbing water, a hydrogel can swell to several times its weight.
  • thermoresponsive hydrogel that contains a cross-linked thermoresponsive polymer
  • the swelling does not proceed continuously with increasing temperature, since the underlying polymer is hydrated below its LCST, see below. Below a corresponding temperature, such a thermoresponsive hydrogel swells, from a corresponding one Temperature it collapses.
  • the temperature at which this change in the degree of swelling occurs is called the volume phase transition temperature (VPTT).
  • a stimulus-responsive hydrogel there is a corresponding separation from the solution and a collapse, or, conversely, an uptake of solution and a swelling by an external stimulus.
  • thermoresponsive hydrogel mentioned above is an illustrative example of a stimulus responsive hydrogel.
  • collapse and solidification take place from or up to a certain temperature.
  • Such a hydrogel can therefore undergo a temperature-induced reversible volume phase transition. Accordingly, a change in the local temperature can lead to swelling or collapse of the hydrogel, which can be used, for example, in the controlled release of substances.
  • Thermoresponsive hydrogels are typically based on one or more polymers that have an LCST, i.e. the gels collapse with increasing temperature.
  • the thermal gelation is usually due to the physical crosslinking of the hydrophobic domains at temperatures above the LCST. Below the lower critical solution temperature, the polymer that characterizes the hydrogel is soluble. Above the LCST, the polymer becomes increasingly hydrophobic and insoluble.
  • thermoresponsive hydrogel there are further examples of a stimuli-responsive hydrogel. What was said above with regard to the volume-phase transition applies accordingly to the external stimulus to which a stimuli-responsive hydrogel reacts.
  • a stimuli-responsive hydrogel can, for example, when a certain pH value is exceeded or not reached, a concentration of a certain chemical compound, when a value is exceeded or not reached certain wavelength or intensity of light or the exceeding or falling below a certain strength of an electric or magnetic field swell or collapse.
  • a suitable stimuli-responsive hydrogel can be, for example, a graft polymer composed of an LCST polymer and a further polymer such as hyaluronic acid or chitosan.
  • a copolymer of e.g. NiPAAm and propyl acrylic acid (PAA) can also be used.
  • a suitable hydrogel can, for example, also be a diblock polymer of two different types
  • a suitable hydrogel can also be a triblock polymer of three monomer units of a known LCST polymer.
  • a suitable polymer can also be a modified cellulose, which can be a cellulose whose hydroxyl groups are substituted by alkyl radicals, in particular C1, C2 or C3 alkyl radicals or hydroxyalkyl radicals, e.g. C1 to C5 hydroxyalkyl radicals. Substitution of the hydroxyl groups on cellulose by several hydrophobic units such as methyl or hydroxypropyl groups makes the originally water-soluble cellulose water-insoluble. For example, methyl cellulose gels in water at 60-80 ° C.
  • a graft polymer made from an alkylated cellulose with A-isopropylacrylamide (NiPAAm) is also a suitable hydrogel.
  • Another suitable stimuli-responsive polymer is poly (A-acryloylsarcosine methyl ester) (PNASME), a thermoresponsive N-ester-substituted polyacrylamide.
  • a method disclosed herein includes making the hydrogel by polymerization.
  • the hydrogel can be produced by polymerization on a solid support.
  • a hydrogel can be dried regardless of its degree of swelling and its volume, with water being removed from the hydrogel.
  • water is removed from the hydrogel by heating.
  • a stimuli-responsive hydrogel water is removed from the hydrogel by heating, after an external stimulus has caused a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel.
  • the selected temperature can be freely determined. In cases where a thermoresponsive hydrogel is used, the selected temperature will continue to be at or above the VPTT. Otherwise, the person skilled in the art will take into account the temperature stability of the nucleic acid molecule to be stretched.
  • the hydrogel is a temperature above the
  • the hydrogel is dehydrated by holding it at a temperature between about 35 ° C and about 90 ° C, including at a temperature between about 40 ° C and about 80 ° C. In some embodiments, the hydrogel is exposed to a temperature between about 45 ° C and about 75 ° C. In some embodiments, the hydrogel is exposed to about 50 ° C or about 60 ° C. In some embodiments, the hydrogel is exposed to a temperature of about 70 ° C. In some embodiments, the hydrogel is exposed to a temperature of about 37 ° C or about 42 ° C. In some
  • the hydrogel is exposed to a temperature of about 40 ° C. Any desired energy source can be used as the heat source.
  • the hydrogel as a whole is exposed to an elevated temperature, for example a temperature above 28 ° C or a temperature above 32 ° C. In typical embodiments, in this context, only selected areas of the hydrogel are not partially heated.
  • the hydrogel is exposed to an elevated temperature or dried until an extension or a desired degree of extension of the nucleic acid molecule can be detected.
  • the hydrogel can then be dried, for example by holding it at a temperature between about 40 and about 85 ° C., until no change in the weight and / or the volume of the hydrogel can be detected any longer.
  • the hydrogel can be exposed in a first stage to the stimulus which causes a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel.
  • the hydrogel which is still exposed to the stimulus, can be exposed to a temperature between about 35 ° C and about 90 ° C.
  • the stimulus-responsive hydrogel can be exposed to the stimulus while it is already exposed to a temperature between about 35 ° C and about 90 ° C.
  • the stimulus responsive hydrogel can be simultaneously exposed to the stimulus and a temperature between about 35 ° C and about 90 ° C.
  • the temperature to which the hydrogel, including a stimuli-responsive hydrogel, is exposed is in the range between room temperature and the boiling point of water.
  • the hydrogel while exposed to the stimulus, is dried by holding it at a temperature between about 35 ° C and about 90 ° C, including at a temperature between about 40 ° C and about 80 ° C. In some embodiments, while the hydrogel is exposed to the stimulus, it is dried at a temperature between about 45 ° C and about 75 ° C. In some embodiments, the hydrogel is dried at about 50 ° C or at about 60 ° C while exposed to the stimulus. In some embodiments, the hydrogel is dried at about 70 ° C while exposed to the stimulus. In some embodiments, while the hydrogel is exposed to the stimulus, it is dried at a temperature of about 37 ° C or about 42 ° C.
  • the action of the stimulus is optional as soon as macroscopically essentially no more nucleic acid-containing solution can be seen on the hydrogel.
  • the hydrogel can then be further dried by holding it at a temperature between, for example, about 30 ° C and about 95 ° C.
  • a temperature in the same range or at the same value can be selected as during the phase in which the hydrogel is exposed to the stimulus. The temperature can be selected independently of the preceding phase.
  • the hydrogel can then be dried, for example by holding it at a temperature between about 40 and about 85 ° C., until no change in the weight and / or the volume of the hydrogel can be detected any longer.
  • a method disclosed here and a use disclosed here can in principle be carried out at any desired pressure, as long as the nucleic acid used and the hydrogel used are accessible to the method or use disclosed here. If a stimulus-responsive hydrogel is used, a reduction in the degree of swelling and / or the volume of the hydrogel can be triggered in some embodiments at a pressure in the range from approximately 400 to 1200 hPa. In some embodiments, a reduction in the degree of swelling and / or the volume of a stimuli-responsive hydrogel can be triggered under atmospheric pressure.
  • the hydrogel is injected under ambient air pressure
  • the hydrogel is exposed to the temperature from room temperature to about 95 ° C. under ambient air pressure.
  • This can be an air pressure at atmospheric pressure or in the range of +20 to -60% of the atmospheric pressure in Pa, including in the range of ⁇ 10% of the atmospheric pressure.
  • the atmospheric pressure is the mean air pressure of the atmosphere at sea level, which is 101,325 Pa according to the standard.
  • the average air pressure is 1070 hPa. At this pressure, the method disclosed here can be carried out without any problems.
  • the average air pressure is 325 hPa, a pressure at which the method disclosed here can also be carried out well.
  • At least a portion of the method disclosed herein is performed at a pressure in the range from about 400 to 1200 hPa. In some embodiments, the entire method disclosed herein is performed at a pressure in the range of about 400 to 1200 hPa.
  • Use is carried out in some embodiments at a pressure in the range of about 400 to 1200 hPa. At least one step of a method and use disclosed herein is performed in some embodiments under ambient air pressure. Any step that is performed within a method and use disclosed herein is, in some embodiments, performed at a pressure in the range of about 400 to 1200 hPa. In some embodiments, any step performed within a method and use disclosed herein is shown below
  • the stimuli-responsive hydrogel can have a VPTT and the hydrogel can be exposed to a temperature above the VPTT.
  • this step can be carried out at a pressure in the range of about 400 to 1200 hPa.
  • the hydrogel e.g., the stimulus responsive hydrogel, is allowed to dry at atmospheric pressure.
  • both a step of keeping the stimuli-responsive hydrogel at a temperature above the VPTT of the hydrogel until the applied solution is at least essentially macroscopically no longer visible on the surface of the stimuli-responsive hydrogel can also be used , and a step of allowing the stimuli-responsive hydrogel to dry further, can be carried out at a pressure in the range from about 400 to 1200 hPa.
  • a step is to keep the stimuli-responsive hydrogel at a temperature above the VPTT of the hydrogel until the applied solution is at least in
  • a step of allowing the stimuli-responsive hydrogel to dry further can be carried out at atmospheric pressure.
  • the hydrogel can have a thickness in the range from about 10 to about 100 ⁇ m, for example a thickness in the range from about 20 to about 50 ⁇ m.
  • Illustrative values for a suitable thickness are, for example, 25 ⁇ m or 38 ⁇ m.
  • the hydrogel can have any shape. Suitable shapes are, for example, the circular shape, the shape of a square or rectangle or some other polygon.
  • the person skilled in the art can also choose the dimensions of the hydrogel in the plane perpendicular to the thickness, which in some embodiments can be interpreted as a diameter, depending on the desired application.
  • the hydrogel in the plane perpendicular to the thickness may have dimensions in the range of about 2 mm to about 100 mm, including, for example, about 5 mm to about 50 mm.
  • Illustrative values for a suitable maximum expansion in the plane perpendicular to the thickness are, for example, 10 mm or 22 mm.
  • the amount of nucleic acid that is used for stretching also depends essentially on the intended application and the analysis used. For example, when using the intercalation fluorescent dye YOYO-1® (l, l '- (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) to [4 - [(3-methylbenzo-1,3-oxazole -2-yl) methylidene] -1, 4- dihydroquinoline] tetraiodide) a drop with a concentration of about 15 to 100 pg / pl nucleic acid, including a concentration of about 25 to 60 pg / pl nucleic acid on a circular hydrogel 10 mm in diameter and 38 ⁇ m thick can be easily applied and stretched.
  • YOYO-1® l, l '- (4,4,8,8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene
  • the nucleic acid molecule to be stretched is in an aqueous solution.
  • the nucleic acid molecule to be stretched is provided in aqueous solution.
  • the aqueous solution contains a reducing agent such as a thiol, for example dithiothreitol or 2-mercaptoethanol.
  • the aqueous solution contains an inorganic salt in the range from about 1 to 500 mM.
  • a potassium and / or magnesium salt can be present.
  • the aqueous solution contains one or more buffer compounds. Numerous buffer compounds are known to the person skilled in the art and can be present in the aqueous solution which contains the nucleic acid molecule.
  • buffers examples include solutions of phosphate salts, carbonate, succinate, carbonate, citrate, acetate, formate, barbiturate, oxalate, lactate, phthalate, maleate, cacodylate, borate, N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonate (also ACES called), N- (2) hydroxyethyl) -piperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (also called HEPES), 4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazine propane sulphonic acid (also called HEPPS), piperazine l, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) (also called PIPES), (2- [tris (hydroxymethyl) -methylamino] -l-ethanesulfonic acid (also called TES), 2- cyclohexylamino-ethanesulfonic acid (also called CHES) and N- (2-acetamido) -i
  • any counterion can be used in these salts, illustrative examples may be ammonium, sodium and potassium.
  • suitable buffers are triethanolamine, diethanolamine, ethylamine, triethylamine, glycine, glycylglycine, histidine, tris- (Hydroxymethyl) aminomethane (also called TRIS), bis- (2-hydroxyethyl) -imino-tris (hydroxy- methyl) methane (also called BIS-TRIS) and N- [Tris (hydroxymethyl) -methyl] -glycine (also called TRICINE), to name just a few.
  • the aqueous solution that is to be stretched is stretched
  • nucleic acid molecule Contains nucleic acid molecule, applied to the hydrogel in the form of a drop.
  • the aqueous solution containing the nucleic acid molecule to be stretched is applied to the hydrogel in the form of a microdroplet
  • a nucleic acid molecule used in a method disclosed here and a use disclosed here is typically present in a purified or at least enriched form. It is a cell-free nucleic acid molecule.
  • essentially no other nucleic acid molecules are present in the solution containing it.
  • essentially no nucleic acid molecules of significantly different molecular weight are present in the solution containing this.
  • the solution containing this contains some
  • Embodiments no primers present.
  • the nucleic acid molecule used is
  • the nucleic acid molecule used is typically not anchored to a surface.
  • the method includes detecting the nucleic acid molecule.
  • the degree of stretching of the nucleic acid molecule can thus be determined.
  • the stretching of the nucleic acid molecule can be monitored in some embodiments.
  • any detection method can be used with which the state of elongation of a nucleic acid molecule can be assessed.
  • the extension state of a nucleic acid molecule is detected with the aid of a visualization technique.
  • a corresponding detection can take place, for example, with the aid of microscopy technology. Fluorescence microscopy can be used as an illustrative example.
  • the method and use disclosed herein include, after the hydrogel has been exposed to a temperature from room temperature to 95 ° C., to detect the nucleic acid molecule. In some embodiments, after the hydrogel has been exposed to a temperature from room temperature to 95 ° C and the nucleic acid molecule has been detected, the method and use disclosed herein may include re-exposing the hydrogel to a temperature from room temperature to 95 ° C.
  • an unstretched nucleic acid molecule Due to thermal movement in an aqueous environment, an unstretched nucleic acid molecule takes on the entropically favored form of a loose tangle, especially as long as electrolytes are present in the form of ions.
  • the degree of expansion or stretching of the nucleic acid molecule is essentially uniform in all directions.
  • a corresponding nucleic acid molecule appears to have an at least essentially round, typically circular cross section.
  • an unstretched nucleic acid molecule can also appear punctiform.
  • a deviation from the shape of a loose ball means a stretch.
  • the degree of expansion or stretching of the nucleic acid molecule is no longer the same in all directions.
  • the nucleic acid molecule extends in a certain direction or along a certain axis further than in other directions.
  • a degree of stretching can be achieved which is anywhere between the shape of a loose ball and the shape of a linear thread.
  • the hydrogel can be dried by heating to a temperature, for example above room temperature, until a desired degree of stretching is detected.
  • the degree of elongation of supermolecular structures can be used in this regard.
  • the nucleic acid molecule can for example by a color marking, such as a
  • Fluorescent marking can be detected.
  • the hydrogel used is generally not arranged in a capillary.
  • a method disclosed here and a use disclosed here can be illustrated by way of description.
  • a possible explanation of how it is possible for a nucleic acid molecule to be stretched is outlined in FIG. 1.
  • the solution containing the nucleic acid could flow, typically in the form of a drop, into the hydrogel by means of heating and drying.
  • the collapse of the hydrogel after exposure to an external stimulus could also result in the formation of a nanoporous structure.
  • a method disclosed here and a use disclosed here can be used in a cost-effective and quick manner in optical nucleic acid mapping, in particular in optical DNA mapping.
  • the nucleic acid to be stretched can in this case be genomic DNA.
  • a spinning disk confocal fluorescence microscope VisiScope Confocal-CSUX1 with Nikon Ti and Andor EMCCD camera was used for all fluorescence microscopy measurements. Recordings were usually made at 561 nm and 488 nm. In the 488 nm channel, the bleaching of the fluorophores was not critical as there was enough substance and only the shape of the strands had to be recognizable. In contrast, the bleaching of the markings in the 561 nm channel was very critical for further analysis, since each individual fluorophore molecule marked a sequence-specific position. Therefore, the focus was adjusted manually during recording. The gray value of the lightest point of the image was divided by the average gray value of the image. The 100 images with the highest ratio became one
  • Rectangular glass substrates (Marienfeld, high-precision microscope cover glasses, 24x50 mm, No. 1.5H) were cleaned one after the other in water, acetone and 2-propanol for 5 minutes each. Round cover slips (10 mm; 22 mm) were cleaned in the same way and stored in 2-propanol. The glass substrates were plasma cleaned for 1000 s at 100 W and a Ch pressure of 0.44 mbar.
  • Evaporation dish with 3- (trimethoxysilyl) propyl acrylate (100 pF) was placed against the substrates.
  • the solution was evaporated in the desiccator for 15 minutes.
  • the vacuum was held for 2 hours.
  • the desiccator was evacuated for 1 hour.
  • the glass substrates were stored light-tight under argon at ambient pressure.
  • a polymerization solution was prepared containing the monomer methacrylic acid (2.56 M, 100 equiv.%), The crosslinker N, N'-methylenebisacrylamide (MBA; 50.2 mM, 1.96 equiv.%) And the Photoinitiator contained 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (49.9 mM, 1.94 equiv.%) In DMSO.
  • a drop of polymerization solution (14.5 pL) was pipetted onto a glass substrate and covered with a cover slip (diameter 22 mm).
  • a polymerization solution was prepared containing the monomer acrylamide (2.56 M, 100 equiv.%), The crosslinker MBA (50.2 mM, 1.96 equiv.%) And the photoinitiator 2-hydroxy-2- methylpropiophenone (49.9 mM, 1.94 equiv.%) in DMSO.
  • a drop of polymerization solution (14.5 pL) was pipetted onto a glass substrate and covered with a cover slip (diameter 22 mm).
  • a polymerization solution was prepared which contained the monomer NIPAAm (1.77 M, 100 equiv.%), The crosslinker MBA (17.7 mM, 1.0 equiv.%) And the photoinitiator 2-hydroxy-2- methylpropiophenone (17.7 mM, 1.0 equiv.%) in DMSO.
  • a drop of polymerization solution for 10 mm cover slips: 1.0 pL; 2.0 pL; 3.0 ppL; for 22 mm: 14.5 pL was pipetted onto a glass substrate and covered with a cover slip (diameter 10 or 22 mm ) covered.
  • a polymerization solution was prepared that contained the monomer NIPMAAm (A-isopropylmethyl methacrylamide, 2.56 M, 100 equiv.%), The crosslinker MBA (50.2 mM, 1.96 equiv.%) And the photoinitiator 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (49.9 mM, 1.94 equiv%) in DMSO.
  • NIPMAAm A-isopropylmethyl methacrylamide, 2.56 M, 100 equiv.%
  • the crosslinker MBA 50.2 mM, 1.96 equiv.%)
  • the photoinitiator 2-hydroxy-2-methylpropiophenone 49.9 mM, 1.94 equiv%) in DMSO.
  • a drop of polymerization solution 22 mm cover slip, 14.5 pL was pipetted onto a glass substrate and covered with a cover slip (diameter 22 mm).
  • DNA was fluorescence-labeled using a DNA methyltransferase and AdoYnTAMRA. Furthermore, the intercalation dye Y OY O- 1 ® was used as a fluorescent dye for visualizing entire DNA double strands.
  • T7 phage DNA (50.0 ng pL 1 ) was treated with M.Taql (1.00 equiv. Per TCGA, 0.213 mM) or M BseCI (20.0 equiv. Per ATCGAT, 0.115 mM) and AdoYnTAMRA ( 10 mM) mixed in 1x NEB4 buffer or 1x BseCI buffer.
  • M.Taql-containing mixture was incubated at 65 ° C for 1 hour and the M.BseCI-containing mixture was incubated at 55 ° C for 1 hour.
  • Excess cofactor was removed by agarose plug purification (APP).
  • the hydrogel was incubated at 40 ° C for 5 minutes. A drop of the DNA-containing solution (pNIPAAm gels: 10 pL and 5 pL, all other gels: 10 pL) was pipetted onto the hydrogel. 10 ⁇ l DNA solution with a DNA concentration of 50 ⁇ g pL 1 were usually used. The system was incubated at 40 ° C for 1 hour.
  • Lig. 7A, 7B and 7C show three exemplary fluorescence microscopy images. Very good stretching behavior was observed in all lalls. All of the strands appear in lorm of perfectly straight lines and within the same image all of the strands have the same orientation. The markings are on the lines and can be easily assigned to the corresponding strand. Very few signals from free fluorophores lie between the strands.

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Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls, in dem ein Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich eine Lösung des Nukleinsäuremoleküls befindet, einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95°C ausgesetzt wird. Die Hydrogele können aus Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAAm), Poly(N-isopropylmethylmethacrylamid) (PNIPMAAm), Poly(N,N-diethylacrylamid) (PDEAAm), Poly[2-(dimethylamino) ethyl methacrylat] (PDMAEMA), Hydroxypropylcellulose, Poly(N- vinlycaprolactam) (PVCL), Polyvinylmethylether, Poly(ethylenglycol) (PEG) oder PEG-Methacrylat (PEGMA) bestehen.

Description

VERFAHREN ZUM STRECKEN EINES NUKLEINSÄUREMOLEKÜLS
TECHNISCHES GEBIET
[001] Bereitgestellt wird ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls. Bereitgestellt wird auch die Verwendung eines Hydrogels zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls.
HINTERGRUND
[002] Bei der Analyse der Genomstruktur und der physikalischen Validierung von
Sequenzanordnungen sowie in diagnostischen Untersuchungen sind optisches Mapping und Faser- Fluoreszenz in situ Hybridisierung (fiber-FISH) gängige Verfahren. Diese Untersuchungen erlauben es, in großem Maßstab Informationen zu gewinnen, die Sequenzierungsergebnisse ergänzen. Des Weiteren können beim Sequenzieren nur kleine Segmente in einem Stück analysiert werden, die anschließend zu längeren Sequenzen zusammengesetzt werden müssen. Demgegenüber werden mit dem DNA-Mapping eine veränderte Anordnung von DNA- Abschnitten und die Anzahl an Kopien einer Sequenz direkt ersichtlich.
[003] Praktisch alle diese Techniken basieren auf der Immobilisierung und Linearisierung von DNA auf einer Oberfläche. Dabei müssen die DNA-Moleküle von ihrer entropiebegünstigten gewundenen Form in eine auseinandergezogene lineare Form überführt werden. Zu diesem Zweck wurden zahlreiche Verfahren entwickelt wie z.B. unter Einsatz von Nanokanälen, Fluidkraft oder elektrophoretischer Kraft in einer mikrofluidischen Vorrichtung, Fließen auf einer
mikrostrukturierten oder positiv geladenen Oberfläche oder DNA-Combing. Bei dieser Technik wird ein DNA-Molekül auf einer modifizierten, festen Glas- oder Polymeroberflächen gestreckt. Die Oberfläche ist mit positiv geladenen Silanen modifiziert, so dass Ankerstellen für die negativ geladene DNA vorhanden sind. Durch das Zusammenspiel einer erzwungenen Fluidströmung und der ionischen Bindung der DNA an die Oberfläche wird diese linearisiert und gestreckt.
[004] Bei allen Verfahren zum Strecken von DNA sind das Streckungsverhältnis und die
Gleichmäßigkeit der Streckung wesentlich für eine qualitativ hochwertige Einzelmolekülanalyse, insbesondere für Hochdurchsatz- oder Vergleichsuntersuchungen. Das DNA-Combing gilt bislang als eines der vielseitigsten, einfachsten, kostengünstigsten und effektivsten Verfahren zum Strecken und Immobilisieren von DNA-Molekülen.
ZUSAMMENFASSUNG
[005] Es werden ein Verfahren und eine Verwendung bereitgestellt, die ein schnelles,
kostengünstiges und zuverlässiges Strecken von Nukleinsäuremolekülen wie DNA, beispielsweise für DNA-Mapping und epigenetische Analysen ermöglicht. Ein hier bereitgestelltes Verfahren und eine hier bereitgestellte Verwendung erlauben typischerweise eine Streckung eines Nukleinsäure moleküls von mehr als etwa 50 KBp. Dies ist üblicherweise die Größengrenze beim DNA-Combing. In einem hier beschriebenen Verfahren und einer hier beschriebenen Verwendung wird ein Hydrogel eingesetzt, auf dessen Oberfläche eine Lösung angeordnet ist, die das zu streckende Nukleinsäure molekül enthält. Üblicherweise definiert die Lösung einen Tropfen. Die Erfinder haben festgestellt, dass bei einem hier bereitgestellten Verfahren und einer hier bereitgestellten Verwendung
vorteilhafterweise eine Fixierung des gestreckten Nukleinsäuremoleküls mittels des eingesetzten Hydrogels erfolgt. Werden mehrere Nukleinsäuremoleküle gestreckt, so liegen die einem hier bereitgestellten Verfahren und einer hier bereitgestellten Verwendung unterzogenen
Nukleinsäuremoleküle in der Regel homogen gestreckt vor.
[006] Vorteilhaft in Bezug auf die Streckung ist der Einsatz eines stimuliresponsiven Hydrogels, auch stimulus-responsives Hydrogel genannt, das unter der Einwirkung eines externen Stimulus bzw. Reizes in der Lage ist, seinen Quellgrad und/oder sein Volumen zu ändern und damit eine Quellung bzw. ein Kollabieren zu durchlaufen. Das stimuliresponsive Hydrogel ist in einigen
Ausführungsformen ein thermoresponsives Hydrogel.
[007] In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung wird
typischerweise keine elektrische Kraft eingesetzt, um ein Nukleinsäuremolekül zu strecken. Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung wird typischerweise so durchgeführt, dass die einzige Flüssigkeit, mit der das eingesetzte Hydrogel in Kontakt steht, eine das
Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung ist. Das eingesetzte Hydrogel steht anders ausgedrückt nicht in Kontakt zu einer sonstigen Flüssigkeit wie Wasser oder einer wässrigen Lösung.
[008] Gemäß einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Auf der Oberfläche des Hydrogels befindet sich eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA-Molekül sein. Zum Verfahren zählt es, das Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die Nukleinsäuremolekül-Lösung befindet, einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C oder einer Temperatur, die oberhalb der Raumtemperatur hegt, auszusetzen. Die gewählte Temperatur kann auch zwischen Raumtemperatur und 95 °C liegen.
[009] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, eine das Nukleinsäuremolekül enthal tende wässrige Lösung auf die Oberfläche des Hydrogels aufbringen. Das Hydrogel wird dann einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C, inklusive zwischen Raumtemperatur und 95 °C ausgesetzt.
[010] Das im Verfahren eingesetzte Hydrogel enthält Wasser, das in der Regel eine zumindest gewisse Quellung des Hydrogels bewirkt. Dieses Wasser lässt sich durch Verdunstung und/oder Verdampfung dem Hydrogel entziehen. Eine solche Verdunstung bzw. Verdampfung wird ausgelöst, indem das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C, inklusive zwischen
Raumtemperatur und 95°C, ausgesetzt wird. Der zu Grunde hegende Vorgang kann auch als eine Trocknung des Hydrogels aufgefasst werden.
[011] Im hier offenbarten Verfahren wird das Hydrogel für einen Zeitraum einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C ausgesetzt, der lange genug eine Verdunstung bzw. Verdampfung erlaubt, dass eine Streckung des Nukleinsäuremoleküls detektierbar ist. Der zu wählende Zeitraum hängt dabei unter anderem von der gewählten Temperatur, den Dimensionen des Hydrogels und der Menge an eingesetzter Nukleinsäurelösung ab.
[012] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die wässrige Lösung befindet, die das Nukleinsäuremolekül enthält, einer Temperatur von etwa 30 bis 90 °C auszusetzen. In einigen Ausführungsformen hegt die Temperatur, der das Hydrogel ausgesetzt wird, im Bereich von etwa 35 bis 80 °C, beispielsweise im Bereich von etwa 40 bis 70 °C.
[013] Ein hier verwendetes Hydrogel hat in einigen Ausführungsformen Poren.
[014] In einigen Ausführungsformen enthält das Hydrogel ein Polymer, das Polyvinylmethylether ist. In einigen Ausführungsformen enthält das Hydrogel ein Polymer, das Poly(ethylenglycol) (PEG) ist.
[015] In einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt ist das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel. Ein stimuliresponsives Hydrogel hat einen Quellgrad und/oder ein Volumen, der bzw. das durch einen Reiz veränderbar, also z.B. verringerbar ist.
[016] In Ausführungsformen des Verfahrens, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, kann es zum Verfahren zählen, das stimuliresponsive Hydrogel einem Reiz auszusetzen, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst. In einigen Ausführungs formen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel verwendet wird, zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel gleichzeitig dem besagten Reiz und einer Temperatur von
Raumtemperatur bis 95 °C auszusetzen.
[017] In einigen Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel verwendet wird, zählt es zum Verfahren, während das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin dem besagten Reiz, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst, ausgesetzt wird, das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C, inklusive zwischen Raumtemperatur und 95 °C, auszusetzen.
[018] Wie bereits erwähnt, ist in einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel. Zum Verfahren kann es in solchen
Ausführungsformen zählen, eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufzubringen. Das stimuliresponsive Hydrogel ist in der Lage, seinen Quellgrad und/oder sein Volumen als Reaktion auf einen Reiz zu ändern. Ein entsprechender Reiz kann beispielsweise die Ionenstärke oder die Temperatur sein. Auch Licht oder der pH-Wert können ein solcher Reiz sein. Zum Verfahren zählt es weiterhin, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, einem Reiz aussetzen, der ein Verringern des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst. Zum Verfahren kann es auch zählen, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, dem besagten Stimulus weiterhin auszusetzen und das stimuliresponsive Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C zu trocknen. [019] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül zu detektieren. Dabei kann der Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls erfasst werden. In einigen Ausführungsformen kann die Streckung des Nukleinsäuremoleküls überwacht werden. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C so lange getrocknet werden, bis ein ausreichender Streckungsgrad detektiert wird. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise durch eine Farbmarkierung, wie eine
Fluoreszenzmarkierung detektiert werden.
[020] Wird als Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt, so kann in entsprechenden Ausführungsformen das Hydrogel dem Stimulus so lange ausgesetzt werden und das stimuli- responsive Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C so lange getrocknet werden, bis eine ausreichende Streckung detektiert wird.
[021] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Hydrogel, das dem Stimulus weiterhin ausgesetzt wird, so lange durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C zu trocknen, bis die aufgebrachte Fösung makroskopisch zumindest im Wesentlichen nicht mehr auf der Oberfläche des Hydrogels erkennbar ist. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel weiterhin durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C getrocknet werden. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C so lange getrocknet werden, bis keine
nennenswerte Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr feststellbar ist. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Halten bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C so lange getrocknet werden, bis keine Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr detektierbar ist.
[022] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Fösung auf der Oberfläche des Hydrogels, z.B. des stimuliresponsiven Hydrogels, keinerlei Fluss unterzogen. Beispielsweise werden typischerweise in einem Hydrogel keine Kanäle oder ähnlichen mikrofluiden Elemente vorgesehen. In einigen Ausführungsformen kann ein Hydrogel mit einer ebenen Oberfläche eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen kann ein Hydrogel mit einer unebenen, z.B. welligen oder rauen, Oberfläche eingesetzt werden.
[023] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, die sich auf der Oberfläche des Hydrogels befindende, das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Fösung in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels zu belassen. In einigen Ausführungs formen zählt es zum Verfahren, während das Hydrogel einer Temperatur im Bereich von Raumtempe ratur bis 95 °C ausgesetzt wird, die das Nukleinsäuremolekül enthaltende Fösung in im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels zu belassen. In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, während das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95 °C ausgesetzt wird, die das Nukleinsäuremolekül enthaltende Fösung in statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels zu belassen. In einigen Ausführungsformen wird die auf der Oberfläche des Hydrogels befindliche, das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Fösung in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen, bis makroskopisch zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des Hydrogels sichtbar ist.
[024] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen. In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen, bis bei in Augenscheinnahme, also makroskopisch, zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des Hydrogels sichtbar ist. In einigen
Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen, bis makroskopisch zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des Hydrogels sichtbar ist.
[025] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül in einem Tropfen einer wässrigen Lösung auf die Oberfläche des Hydrogels, beispielsweise des
stimuliresponsiven Hydrogels, aufzubringen.
[026] Das Hydrogel, auf dem sich die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, kann jede beliebige Oberflächenstruktur haben. Das Hydrogel hat in einigen
Ausführungsformen eine zumindest im Wesentlichen planare Oberfläche. In einigen
Ausführungsformen hat das Hydrogel eine vollständig planare Oberfläche.
[027] In einigen Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel verwendet wird, definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in kollabierter Form nach Aussetzen gegenüber dem Reiz eine planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in gequollener Form, z.B. Gelform, vor Aussetzen gegenüber dem Reiz eine planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in geschrumpfter Form eine im Wesentlichen planare Oberfläche. In einigen
Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest in gequollener Form eine im Wesentlichen planare Oberfläche.
[028] In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat angeordnet, z.B. auf einem Glassubstrat. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat fixiert. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat durch kovalente Bindung fixiert.
[029] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein Hydrogel, z.B. ein
stimuliresponsives Hydrogel herzustellen, bevor auf dessen Oberfläche eine wässrige Lösung aufgebracht wird, die das Nukleinsäuremolekül enthält. Es kann hierzu jedes bekannte Verfahren eingesetzt werden, um ein entsprechendes Hydrogel zu erhalten.
[030] In einigen Ausführungsformen enthält ein eingesetztes stimuliresponsives Hydrogel ein stimuliresponsives Polymer, also ein Polymer, das in der Lage ist, seinen Quellgrad und/oder sein Volumen als Reaktion auf einen Reiz zu ändern. In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive Hydrogel aus einem stimuliresponsiven Polymer. In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive Hydrogel im Wesentlichen aus einem stimuliresponsiven Polymer.
[031] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein stimuliresponsives Hydrogel auf einem Substrat herzustellen. Das Substrat kann dabei funktionelle Gruppen enthalten, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden werden kann. In einigen Ausführungsformen enthält ein derartiges Substrat funktionelle Gruppen, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden wird. Ein solches entstehendes Polymer kann ein Polymer sein, das im hier eingesetzten Hydrogel enthalten ist. Ein solches entstehendes Polymer kann in einigen Ausführungsformen ein
stimuliresponsives Polymer sein, das in einem stimuliresponsiven Hydrogel enthalten ist oder das das entsprechende stimuliresponsive Hydrogel definiert.
[032] Wie bereits vorangehend angegeben, kann das stimuliresponsive Hydrogel ein
thermoresponsives Hydrogel sein. In einigen Ausführungsformen, in denen das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, hat das Hydrogel eine VPTT (Volumen-Phasenübergangs- Temperatur) im Bereich von 20 bis 95 °C.
[033] In einigen Ausführungsformen, in denen das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die das
Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, einer Temperatur auszusetzen, die bei der VPTT des Hydrogels oder darüber hegt. In einigen Ausführungsformen, in denen das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, für eine Dauer von 10 Minuten bis 5 Stunden bei einer Temperatur bei oder oberhalb der VPTT des
Hydrogels zu halten.
[034] In typischen Ausführungsformen wird das Verfahren ohne Zufuhr einer externen Flüssigkeit, insbesondere ohne Zufuhr einer wässrigen Lösung oder von Wasser durchgeführt. In typischen Ausführungsformen wird das Hydrogel während des Verfahrens zumindest im Wesentlichen mit keinem Protein, beispielsweise mit keinem Enzym in Kontakt gebracht. In typischen Ausführungs formen wird das Hydrogel während des Verfahrens mit keinem Protein in Kontakt gebracht.
[035] Ausführungsformen des folgenden zweiten Aspekts können auch Ausführungsformen des ersten Aspekts darstellen.
[036] Gemäß einem zweiten Aspekt wird ein Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA-Molekül sein. Zum Verfahren zählt es, eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufzubringen. Das Hydrogel hat eine Volumen-Phasenübergangs- Temperatur (engl volume phase transition temperature, VPTT), die im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 95 °C, inklusive einem Bereich von etwa 20 bis 80 °C hegt. Dabei hat das Hydrogel in der Regel unter dem gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, eine VPTT, die im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 95 °C hegt. In einigen Ausführungsformen liegt die VPTT im Bereich von etwa 20 bis 80 °C. Zum Verfahren zählt es weiterhin, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, einer Temperatur aussetzen, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt.
[037] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren des Weiteren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, solange bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des
stimuliresponsiven Hydrogels erkennbar ist.
[038] Die gewählte Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, kann während des Verfahrens konstant gehalten werden. Die Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, kann während des Verfahrens auch variieren. Die Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels, der dieses zunächst ausgesetzt wird, kann unabhängig von der Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gewählt werden, bei der dieses gehalten wird, bis zumindest im Wesentlichen keine aufgebrachte Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels nachweisbar ist.
[039] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels keinerlei Fluss unterzogen.
Beispielsweise werden in einigen Ausführungsformen in einem Hydrogel keine Kanäle oder ähnlichen mikrofluiden Elemente vorgesehen. In einigen Ausführungsformen wird ein Hydrogel mit einer planaren Oberfläche eingesetzt.
[040] In einigen Ausführungsformen wird die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung nach dem Aufbringen in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels belassen, bis zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels nachweisbar ist.
[041] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül in einem Tropfen einer wässrigen Lösung auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels aufzubringen.
[042] In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest unterhalb der VPTT eine planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen definiert das stimuliresponsive Hydrogel zumindest unterhalb der VPTT eine im Wesentlichen planare Oberfläche.
[043] In einigen Ausführungsformen ist das stimuliresponsive Hydrogel auf einem festen Substrat angeordnet, z.B. auf einem Glassubstrat. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat fixiert. In einigen Ausführungsformen ist das Hydrogel auf einem festen Substrat durch kovalente Bindung fixiert.
[044] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein stimuliresponsives Hydrogel herzustellen, bevor auf dessen Oberfläche eine wässrige Lösung aufgebracht wird, die das
Nukleinsäuremolekül enthält. Es kann hierzu jedes bekannte Verfahren eingesetzt werden, um ein stimuliresponsives Hydrogel zu erhalten.
[045] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein stimuliresponsives Hydrogel auf einem Substrat herzustellen. Das Substrat kann dabei funktionelle Gruppen enthalten, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden werden kann. In einigen Ausführungsformen enthält ein derartiges Substrat funktionelle Gruppen, an die ein entstehendes Polymer kovalent gebunden wird.
[046] In einigen Ausführungsformen zählt es weiterhin zum Verfahren, nachdem die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des
stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, das stimuliresponsive Hydrogel trocknen zu lassen.
[047] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, aufgebracht worden ist, einer Temperatur von etwa 30 bis 90 °C auszusetzen. In einigen Ausführungsformen hegt die Temperatur, der das stimuliresponsive Hydrogel ausgesetzt wird, im Bereich von etwa 35 bis 80 °C,
beispielsweise im Bereich von etwa 40 bis 70 °C.
[048] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, aufgebracht worden ist, für eine Dauer von etwa 10 Minuten bis etwa 5 Stunden bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten.
[049] In einigen Ausführungsformen enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein LCST-Polymer, also ein Polymer mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur (engl lower critical solution temperature, abgekürzt LCST). In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive
Hydrogel aus einem LCST-Polymer. In einigen Ausführungsformen besteht das stimuliresponsive Hydrogel im Wesentlichen aus einem LCST-Polymer.
[050] In einigen Ausführungsformen ist das LCST-Polymer ein Homopolymer oder ein Copolymer.
[051] In einigen Ausführungsformen, in denen das stimuliresponsive Hydrogel ein LCST-Polymer enthält, hat das LCST-Polymer bei dem gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, in Wasser eine LCST im Bereich von etwa 20 bis 100 °C. In einigen Ausführungsformen hat das LCST- Polymer bei dem gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, in Wasser eine LCST im Bereich von etwa 30 bis 90 °C.
[052] In einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das Poly(N-isopropylacrylamid (PNIPAAm) oder
Poly(N,N-diethylacrylamid) (PDEAAm) ist. In einigen Ausführungsformen enthält das
stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das Poly(N-isopropylmethylmethacrylamid) (PNIPMAAm) oder Poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylat] (pDMAEMA) ist. In einigen Ausführungsformen enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das Hydroxypropylcellulose oder Poly(N- vinly caprolactam) (PVCL) ist. In einigen Ausführungsformen enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das ein PEG-Methacrylat (PEGMA) ist. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt enthält das stimuliresponsive Hydrogel ein Polymer, das eine Kombination von zwei oder mehreren von Poly(N-isopropylacrylamid (PNIPAAm), Poly(N,N-diethylacrylamid) (PDEAAm), Poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylat] (pDMAEMA), Hydroxypropylcellulose, Poly(N-vinlycaprolactam) (PVCL), Polyvinylmethylether, Poly(ethylenglycol) (PEG) und/oder einem PEG-Methacrylat (PEGMA) ist. [053] In einigen Ausführungsformen zählt es zum Verfahren, ein markiertes Nukleinsäuremolekül auf das stimuliresponsive Hydrogel aufzubringen. Das markierte Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Dabei kann es sich beispielsweise um eine kovalente Markierung oder um eine Modifikation des Nukleinsäurerückgrats handeln. Es kann auch ein Interkalationsfarbstoff eingesetzt werden.
[054] In typischen Ausführungsformen wird das Verfahren ohne Zufuhr einer externen Flüssigkeit, insbesondere ohne Zufuhr einer wässrigen Lösung oder von Wasser durchgeführt. In typischen Ausführungsformen wird das Hydrogel während des Verfahrens zumindest im Wesentlichen mit keinem Protein, beispielsweise mit keinem Enzym in Kontakt gebracht. In typischen Ausführungs formen wird das Hydrogel während des Verfahrens mit keinem Protein in Kontakt gebracht.
[055] Gemäß einem dritten Aspekt wird die Verwendung eines Hydrogels zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA- Molekül sein. Das Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich eine Lösung des Nukleinsäuremoleküls befindet, wird einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis 95 °C ausgesetzt.
[056] In einigen Ausführungsformen der Verwendung gemäß dem dritten Aspekt wird das
Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die wässrige Lösung befindet, die das Nukleinsäuremolekül enthält, einer Temperatur von etwa 30 bis 90 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen liegt die Temperatur, der das Hydrogel ausgesetzt wird, im Bereich von etwa 35 bis 80 °C, beispielsweise im Bereich von etwa 40 bis 70 °C.
[057] In einigen Ausführungsformen der Verwendung des dritten Aspekts ist das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel. In derartigen Ausführungsformen ist typischerweise durch Aussetzen gegenüber einem Reiz eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslösbar. Der Quellgrad und/oder das Volumen des stimuliresponsiven Hydrogels ist also durch einen Reiz verringerbar. Typischerweise ist weiterhing eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 100 °C möglich.
[058] In Ausführungsformen der Verwendung, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, wird das Hydrogel einem Reiz ausgesetzt, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst. In einigen Ausführungsformen wird eine wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufgebracht. Das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, wird diesem Reiz ausgesetzt und bei einer Temperatur zwischen
Raumtemperatur und 95 °C getrocknet.
[059] Für Ausführungsformen der Verwendung nach dem dritten Aspekt wird auf das Verfahren nach dem ersten Aspekt und nach dem zweiten Aspekt verwiesen. So wird in einigen
Ausführungsformen die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels keinerlei Fluss wie z.B. mikrofluiden Kräften ausgesetzt. Ebenso wird beispielsweise in einigen Ausführungsformen die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremole kül enthält, nach dem Aufbringen auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf ebendieser Oberfläche belassen. In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, nach dem Aufbringen auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf dieser Oberfläche belassen, bis makroskopisch zumindest im Wesentlichen keine Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist. In typischen Ausführungsformen erfolgt keine Zufuhr einer externen Flüssigkeit, insbesondere keine Zufuhr einer wässrigen Lösung oder von Wasser. In typischen Ausführungsformen wird das Hydrogel auch zumindest im
Wesentlichen mit keinem Protein in Kontakt gebracht.
[060] Gemäß einem vierten Aspekt wird die Verwendung eines stimuliresponsiven Hydrogels zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise ein DNA-Molekül sein. Das Hydrogel hat eine VPTT, die im Bereich von etwa 20 bis 80 °C hegt. Dabei hat das Hydrogel in der Regel beim gewählten Druck, z.B. unter atmosphärischem Druck, eine VPTT, die im Bereich von etwa 20 bis 80 °C hegt. In der Verwendung wird eine wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, auf die Oberfläche eines stimuliresponsiven Hydrogels aufgebracht. Das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, wird bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gehalten, so dass eine Streckung des Nukleinsäuremoleküls erfolgt. In einigen Ausführungsformen wird das stimuliresponsive Hydrogel solange bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gehalten, bis die aufgebrachte Lösung augenscheinlich zumindest im Wesentlichen nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels makroskopisch erkennbar ist.
[061] In einigen Ausführungsformen wird das stimuliresponsive Hydrogel, auf das die das
Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung aufgebracht worden ist, einer ersten Temperatur ausgesetzt, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, bevor es bei einer zweiten Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gehalten wird, bis die aufgebrachte Lösung mit bloßem Auge zumindest im Wesentlichen nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels optisch erkennbar ist. Die erste Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels, der dieses zunächst ausgesetzt wird, kann in solchen Ausführungsformen unabhängig von der zweiten Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels gewählt werden, bei der dieses gehalten wird, bis zumindest im Wesentlichen keine aufgebrachte Lösung mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels
makroskopisch sichtbar ist.
[062] Die gewählte Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, bei der es gehalten wird, kann konstant gehalten werden. Die Temperatur, die oberhalb der VPTT des Hydrogels hegt, bei der das Hydrogel gehalten wird, kann während des Verfahrens auch variieren.
[063] Für Ausführungsformen der Verwendung nach dem vierten Aspekt wird auf das Verfahren nach dem zweiten Aspekt und die Verwendung nach dem dritten Aspekt verwiesen. So wird in einigen Ausführungsformen die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels keinerlei Fluss wie z.B. mikrofluiden Kräften ausgesetzt. Ebenso wird beispielsweise in einigen Ausführungsformen die wässrige Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, nach dem Aufbringen auf die Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels in zumindest im Wesentlichen statischer Form auf ebendieser Oberfläche belassen. Auch ist in einigen Ausführungsformen das stimuliresponsive Hydrogel ein thermoresponsives Hydrogel.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
[064] Fig. 1 zeigt eine theoretische Überlegung zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls nach dem hier offenbarten Verfahren. Gezeigt ist ein auf ein Hydrogel (1) aufgetragener Tropfen
Nukleinsäurelösung (4). Da das Hydrogel (1) in der Regel eine größere Oberfläche besitzt als der Tropfen mit Nukleinsäurelösung (4), dürfte in der Summe die Verdampfung über das Hydrogel höher sein als über den Tropfen der Lösung. Gleichzeitig dürfte der Tropfen als Flüssigkeitsreservoir dienen. Bei einer Abnahme des Gesamtvolumens durch Evaporation, insbesondere bei Erwärmen, dürfte somit Flüssigkeit von der Nukleinsäurelösung (4) in das Hydrogel (1) strömen. Dadurch tritt das Nukleinsäuremolekül in das Hydrogel ein und wird dabei gestreckt, ein Vorgang, der tatsächlich beobachtet wird.
[065] Fig. 2 zeigt schematisch eine Herstellung eines stimuliresponsives Hydrogels und die Verwendung desselben zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls nach einer Ausführungsform des hier offenbarten Verfahrens. Eine Stammlösung mit einem oder mehreren Monomeren für ein stimuliresponsives Hydrogel sowie typischerweise ein Vernetzer sowie beispielsweise ein Initiator, z.B. ein Photoinitiator, werden zwischen einem Substrat wie einem Glassubstrat (3) und einem Deckgläschen, z.B. einem runden Deckgläschen (2) bereitgestellt. Das Substrat (3) kann mit einem Silan modifiziert sein, das mit einem Monomer verbunden ist oder verbunden werden kann. Durch UV-Bestrahlung wird die Polymerisation gestartet und es wird ein stimuliresponsives Hydrogel (1) gebildet. Das Deckgläschen (2) wird entfernt und eine Lösung (4) aufgebracht, die das
Nukleinsäuremolekül enthält. Durch Erwärmen, beispielsweise auf eine Temperatur im Bereich von etwa 35 bis 75 °C, wird ein stimuliresponsives Schrumpfen des Hydrogels bewirkt, wobei ein Strecken des Nukleinsäuremoleküls im Hydrogel (1) erfolgt.
[066] Fig. 3A und Fig. 3B zeigen eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA- Strangs nach Strecken durch Erwärmen in einem Polyacrylamidgel (Durchmesser 10 mm). Eine Färbung der l-Phagen-DNA erfolgte mit dem Interkalationsfarbstoff YOYO-1.
[067] Fig. 4A und Fig. 4B zeigen eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA- Strangs nach Strecken durch Erwärmen in einem Polymethacrylsäuregel (Durchmesser 10 mm). Eine Färbung der l-Phagen-DNA erfolgte mit dem Interkalationsfarbstoff YOYO-1.
[068] Fig. 5A und Fig. 5B zeigen eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA- Strangs nach Strecken durch Erwärmen in einem Poly-NIPMAAm-Hydrogel (Durchmesser 10 mm). Eine Färbung der l-Phagen-DNA erfolgte mit dem InterkalationsfarbstoffYOYO-1.
[069] Fig. 6 zeigt eine Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahme eines l-Phagen-DNA-Strangs nach Strecken durch Trocknung oberhalb der VPTT in einem Poly-NIPAAm-Hydrogel (Durchmesser 10 mm). Eine Markierung der Stränge erfolgte mit AdoYnTAMRA und einer DNA-Methyltransferase. Überschüssiges Fluorophor wurde mittels Agarose Plug Purification (APP) entfernt. Weiterhin erfolgte eine Interkalationsfärbung der l-Phagen-DNA mit YOYO-1. Fig. 6A zeigt beide Färbungen, während Fig. 6B nur die gelbe Färbung des TAMRA-Fluorophors und Fig. 6C nur die Cyan-Färbung des YOYO-1 zeigen.
[070] Fig. 7 zeigt mit den Abbildungsteilen 7A, 7B und 7C drei Fluoreszenzmikroskopie- Aufnahmen von T7-Phagen-DNA-Strängen, die in Hydrogelen mit einem Durchmesser von 22 mm gestreckt wurden. Die Markierung der Stränge erfolgte wie für Fig. 6 angegeben mit AdoYnTamra und YOYO-1. Fig. 7D, 7E und 7F zeigen die gleichen Gele wie Fig. 7A, 7B und 7C, wobei nur die Signale der Cyan-Färbung durch YOYO-1 wiedergegeben sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
[071] Soweit nicht anders angegeben, haben die folgenden Begriffe und Ausdrücke, wenn sie in diesem Dokument, inklusive Beschreibung und Patentansprüchen, verwendet werden, die im
Folgenden angegebenen Bedeutungen.
[072] Der Ausdruck„bestehend aus“, wie in diesem Dokument verwendet, bedeutet einschließend und begrenzt auf das, was auf den Begriff„bestehend aus“ folgt. Der Begriff„bestehend aus“, gibt somit an, dass aufgeführte Elemente erforderlich oder notwendig sind und dass keine weiteren Elemente vorhanden sein dürfen. Der Begriff„im Wesentlichen bestehend aus“ wird dahingehend verstanden, dass er bedeutet, dass jedwede Elemente, die nach dem Ausdruck definiert sind, umfasst sind und dass weitere Elemente, beispielsweise in einer Probe oder einer Zusammensetzung zugegen sein können, die die Aktivität oder Wirkung, die für die betreffenden Elemente in diesem Dokument angegeben sind, nicht verändern, also sie nicht beeinträchtigen und nicht zu ihr beitragen. Anders gesagt gibt der Ausdruck„im Wesentlichen bestehend aus“ an, dass die definierten Elemente notwendig oder erforderlich sind, dass aber weitere Elemente optional sind und zugegen sein können oder nicht, je nachdem, ob sie für die Wirkung oder Wirksamkeit der definierten Elemente von Belang sind oder nicht.
[073] Das Wort„etwa“ bezieht sich, wenn hier verwendet, auf einen Wert, der für einen bestimmten Wert, wie von einem Durchschnittsfachmann bestimmt, innerhalb eines akzeptablen Fehlerbereichs hegt. Dies wird teilweise davon abhängig sein, wie der jeweilige Wert ermittelt oder gemessen worden ist, d.h. von den Einschränkungen des Messsystems.„Etwa“ kann beispielsweise innerhalb einer Standardabweichung von 1 oder mehr bedeuten, je nach Gebrauch im jeweiligen Gebiet. Der Begriff„etwa“ wird auch verwendet um anzugeben, dass der jeweilige Betrag oder Wert der bezeichnete Wert sein kann oder ein anderer Wert, der näherungsweise gleich ist. Der Begriff soll ausdrücken, dass ähnliche Werte gleichwertige Ergebnisse oder Wirkungen, wie in diesem Dokument offenbart, begünstigen. In diesem Zusammenhang kann„etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 10 % über und/oder unter einem bestimmten Wert beziehen. In einigen Ausführungsformen bezieht „etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 5 % über und/oder unter einem bestimmten Wert, wie etwa 2 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einigen Ausführungsformen bezieht„etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 1 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einigen
Ausführungsformen bezieht„etwa“ sich auf einen Bereich von bis zu 0,5 % über und/oder unter einem bestimmten Wert. In einer Ausführungsform bezieht sich„etwa“ auf einen Bereich von bis zu 0,1 % über und/oder unter einem bestimmten Wert.
[074] Die Begriffe„oben“ und„unten“ beziehen sich auf eine Ausrichtung eines hier offenbarten Hydrogels als Ganzes wie es typischerweise bei seiner Herstellung auf einer Oberfläche eines Substrats, wie z.B. einer im Wesentlichen planaren Oberfläche eines Substrats vorliegt. Die
Ausrichtung des Hydrogels wird dabei typischerweise dadurch festgelegt, dass das entstehende Polymer sich in einer flüssigen Phase befindet. Das Substrat befindet sich daher, relativ zum entstehenden Hydrogel gesehen, in Richtung der Gravitation. Das entstehende Hydrogel hat in der Richtung der Gravitation eine bestimmte Dicke und erstreckt sich in einer Ebene, die zur Gravitation im Wesentlichen senkrecht ausgerichtet ist.
[075] Der Konjunktionalausdruck„und/oder“ zwischen mehreren Elementen, wenn hier verwendet, wird als sowohl individuelle als auch kombinierte Optionen umfassend verstanden. Sind beispiels weise zwei Elemente durch„und/oder“ verknüpft, betrifft eine erste Option den Einsatz des ersten Elements ohne das zweite Element. Eine zweite Option betrifft den Einsatz des zweiten Elements ohne das erste Element. Eine dritte Option betrifft den Einsatz des ersten und des zweiten Elements zusammen. Es wird verstanden, dass jede beliebige dieser Optionen unter die Bedeutung des Ausdrucks fällt und somit die Bedingungen des Begriffs„und/oder“, wie in diesem Dokument verwendet, erfüllt.
[076] Singularformen wie„eine“,„ein“,„der“,„die“ oder„das“ schließen die Pluralform ein, wenn sie in diesem Dokument verwendet werden. So bezeichnet beispielsweise eine Bezugnahme auf „eine Zelle“ sowohl eine individuelle Zelle als auch eine Mehrzahl an Zellen. In einigen Fällen wird explizit der Ausdruck„ein oder mehrere“ verwendet, um im jeweiligen Fall darauf hinzuweisen, dass die Singularform die Pluralform mit umfasst. Derartige explizite Hinweise schränken die allgemeine Bedeutung der Singularform nicht ein. Falls nicht anders angegeben, werden die Begriffe„zumindest“, „mindestens“ und„wenigstens“, wenn sie eine Abfolge von Elementen vorangehen, dahingehend verstanden, dass sie sich auf jedes dieser Elemente beziehen. Die Begriffe„zumindest ein“, „mindestens ein(e)“,„wenigstens einer“ oder„wenigstens eine(r) von“ schließen beispielsweise ein, zwei, drei, vier oder mehr Elemente ein.
[077] Der Begriff„Nukleinsäure“, wenn hier verwendet, bezieht sich auf jedwedes Nuklein säuremolekül in jedweder möglichen Konfiguration, wie z.B. einsträngig, doppelsträngig oder eine Kombination davon. Zu Nukleinsäuren zählen beispielsweise DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Analoga der DNA oder RNA, die mit Nukleotidanaloga oder mit Hilfe der Nukleinsäurechemie erzeugt werden können, LNA-Moleküle (englisch locked nucleic acid), Peptid-Nukleinsäure- moleküle (PNA) und Tecto-RNA-Moleküle (z.B. Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076- 4077). Ein PNA-Molekül ist ein Nukleinsäuremolekül, bei dem das Rückgrat ein Pseudopeptid anstelle eines Zuckers ist. Dementsprechend weist PNA im Allgemeinen ein ladungsneutrales Rückgrat auf, im Gegensatz zu beispielsweise DNA oder RNA. PNA ist dennoch in der Lage, zumindest komplementäre und im Wesentlichen komplementäre Nukleinsäurestränge zu hybridisieren, wie z.B. DNA oder RNA (zu der PNA als strukturelle Nachbildung gilt). Ein LNA-Molekül weist ein modifi ziertes RNA-Grundgerüst mit einer Methylenbrücke zwischen C4' und 02' auf, die den Furanosering in einer N-Typ-Konfiguration fixiert und dem betreffenden Molekül eine höhere Duplexstabilität und Nukleaseunempfindlichkeit verleiht. Anders als ein PNA-Molekül hat ein LNA-Molekül ein geladenes Rückgrat. DNA oder RNA kann genomischen oder synthetischen Ursprungs sein und kann ein- oder zweisträngig sein. Eine solche Nukleinsäure kann z.B. mRNA, cRNA, synthetische RNA, genomische DNA, cDNA, synthetische DNA, ein Copolymer aus DNA und RNA oder ein Oligonukleotid sein. Eine entsprechende Nukleinsäure kann darüber hinaus nicht-natürliche Nukleotidanaloga enthalten und/oder mit einem Affinitäts-Tag oder einer Markierung verbunden sein.
[078] Es sind viele Nukleotidanaloga bekannt und jedes kann grundsätzlich im hier offenbarten Verfahren eingesetzt werden. Ein Nukleotidanalogon ist ein Nukleotid, das eine Modifikation beispielsweise an dem Basen-, Zucker- oder Phosphatanteil enthält. Als veranschaulichendes Beispiel ist von einer Substitution von 2'-OH-Resten der siRNA durch 2Έ-, 2'O-Me oder 2'H-Reste bekannt, dass sie die /«-v/vo-Stabilität der betreffenden RNA verbessern. Zu Modifikationen am Basenteil gehören natürliche und synthetische Modifikationen von A, C, G und T/U, verschiedene Purin- oder Pyrimidinbasen wie Uracil-5-yl, Hypoxanthin-9-yl und 2-Aminoadenin-9-yl sowie Nicht-Purin- oder Nicht-Pyrimidin-Nukleotidbasen. Andere Nukleotidanaloga dienen als Universalbasen. Zu den Universalbasen zählen 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol. Universalbasen sind in der Lage, mit jeder anderen Base ein Basenpaar zu bilden. Basenmodifikationen können oft mit z.B. einer
Zuckermodifikation wie z.B. 2'-0-Methoxyethyl kombiniert werden, um z.B. einzigartige
Eigenschaften wie erhöhte Duplexstabilität zu erzielen.
[079] Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung basieren auf dem Einsatz eines Hydrogels. Dabei erfolgt das Strecken eines Nukleinsäuremoleküls auf bzw. in dem Hydrogel. Es ist somit keine besondere geometrische Oberflächenstruktur vonnöten, vielmehr kann das eingesetzte Hydrogel herstellungsbedingt von planarer Oberfläche sein. Insbesondere ist das
Strecken nicht auf die Gegenwart einer Vertiefung wie eines Kanals angewiesen. Das Strecken erfolgt in einigen Ausführungsformen ohne die Gegenwart einer Vertiefung wie eines Kanals.
[080] Das Hydrogel kann dennoch, wie bereits eingangs erwähnt, jede beliebige Oberflächentopologie haben. So sind in einigen Ausführungsformen eine oder mehrere Vertiefungen wie beispielsweise eine Furche, eine flächige, inklusive einer planaren, Absenkung oder auch eine oder mehrere Erhebungen vorhanden. Eine Erhebung kann beispielsweise die Form einer Stufe, einer Wulst oder einer flächigen, inklusive einer planaren, Anhebung sein. Eine Vertiefung und eine Erhebung können von beliebiger geometrischer Form sein. Eine Vertiefung auf der Oberfläche des Hydrogels steht dabei während des hier offenbarten Verfahrens und der hier offenbarten Verwendung allenfalls mit der Lösung des Nukleinsäuremoleküls in fluider Verbindung oder wird von dieser benetzt oder ausgefüllt. Eine Vertiefung auf der Oberfläche des Hydrogels steht in der Regel nicht mit einer weiteren Flüssigkeit in fluider Verbindung.
[081] In der Regel wird ein einziges Hydrogel für die Streckung eines bestimmten
Nukleinsäuremoleküls eingesetzt. Dabei können mehrere verschiedene Nukleinsäuremoleküle parallel auf mehreren Hydrogelen gestreckt werden. Es können auch mehrere Nukleinsäuremoleküle, inklusive verschiedener Nukleinsäuremoleküle und gleicher Nukleinsäuremoleküle auf einem einzigen Hydrogel gestreckt werden.
[082] Als Hydrogel ist jedes beliebige Hydrogel geeignet, beispielsweise ein Hydrogel, das Polyacrylat oder ein Derivat davon wie z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) enthält. Als geeignetes Derivat kann beispielsweise auch 2-Hydroxypropylmethacrylat (HPMA) gewählt werden. Ein geeignetes Hydrogel kann auch Polyacrylamid oder ein Derivat davon enthalten. Es kann sich beispielsweise um ein mit Bisacrylamid quervemetztes Polyacrylamid handeln. Ein geeignetes Hydrogel kann als weiteres Beispiel Polyvinylalkohol enthalten.
[083] Ein geeignetes Hydrogel kann auch ein Polysaccharid oder Poly(ethylenglycol) enthalten. Methoxyl-poly(ethylenglycol)monoacrylat ist ein illustratives weiteres Beispiel eines geeigneten Polymers. Zahlreiche für Hydrogele geeignete Monomere sind kommerziell erhältlich und das entsprechende Protokoll zur Herstellung des Hydrogels verfügbar.
[084] In einigen Ausführungsformen eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung wird ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt. Dementsprechend erfolgt in solchen Ausführungsformen das Strecken eines Nukleinsäuremoleküls auf bzw. in dem stimuliresponsiven Hydrogel.
[085] Ein stimuliresponsives Hydrogel zeigt Änderungen seiner Eigenschaften in Reaktion auf einen oder mehrere äußere Einflüsse wie Temperatur, pH-Wert, Licht, eine Ionenänderung, ein magnetisches oder elektrisches Feld oder eine Änderung des Redoxpotenzials. Ein hier beschriebenes stimuliresponsives Hydrogel kann beispielsweise ein thermoresponsives Hydrogel sein. Ein stimuliresponsives Hydrogel enthält in der Regel ein Polymer, das in Reaktion auf einen äußeren Reiz kollabiert.
[086] Ein thermoresponsives Polymer hat eine obere und/oder eine untere kritische
Lösungstemperatur. Der typische Fall ist eine untere kritische Lösungstemperatur. Ist ein Polymer oberhalb einer bestimmten Temperatur in Wasser löslich und unterhalb davon unlöslich, so hat es eine obere kritische Lösungstemperatur. Ist ein Polymer unterhalb einer bestimmten Temperatur in Wasser löslich und oberhalb davon unlöslich, so hat es eine untere kritische Lösungstemperatur (lower critical solution temperature, LCST). Bei Temperaturen unterhalb der LCST ist ein solches Polymer durch die Bildung von Wasserstoffbrücken mit Wasser löslich. Wenn die Temperatur die LCST erreicht, wird die hydrophobe Wechselwirkung dominant, wodurch die Menge an
strukturiertem Wasser, das die Polymerkette umgibt, verringert und die Entropie des Lösungsmittels maximiert wird. Das am meisten untersuchte Polymer dieser Klasse von Polymeren ist
Poly(NIPAM), das eine LCST nahe der menschlichen Körpertemperatur hat. Verwandte Polymere wie Poly(N,N-diethylacrylamid), Poly(dimethylaminoethylmethacrylat) und Poly(N-(L)-(l- hydroxymethyl)propylmethacrylamid), mit LCSTs im Bereich von 30-50 °C, wurden ebenfalls untersucht. Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid)-Copolymere, bekannt unter dem Handelsnamen Pluronic®, sind eine weitere Art von Polymer, das umfassend in der
kontrollierten Wirkstoffabgabe untersucht wurde.
[087] Ein Hydrogel auf Polymerbasis ist ein quervemetztes hydrophiles Polymer. Zahlreiche Quervemetzer sind bekannt, oft eingesetzt werden Ethylenglycol-diacrylat (EGDA) oder PEG- diacrylat (PEGDA). Ein häufig eingesetzter Quervemetzer ist das bereits im Vorangehenden genannte /V,/V‘-methylenbis(acrylamid) (MBA). Ein Hydrogel definiert ein dreidimensionales hydrophiles Polymemetzwerke aus einem oder mehreren chemisch und/oder physikalisch vernetzten Polymeren. Ein Hydrogel auf Polymerbasis kann Wasser aufnehmen oder abgeben. Nach Absorption von Wasser kann ein Hydrogel auf ein Mehrfaches seines Gewichts quellen.
[088] Bei einem Hydrogel, das ein quervemetztes thermoresponsives Polymer enthält, verläuft die Quellung mit zunehmender Temperatur nicht kontinuierlich, da das zu Grunde hegende Polymer unterhalb seiner LCST hydratisiert ist, s.o.. Unterhalb einer entsprechenden Temperatur quillt ein solches thermoresponsives Hydrogel, ab einer entsprechenden Temperatur kollabiert es. Die Temperatur, bei der diese Änderung des Quellgrades eintritt, wird die Volumen-Phasenübergangs- Temperatur (engl volume phase transition temperature, VPTT) genannt.
[089] In typischen Ausführungsformen eines stimuliresponsiven Hydrogels findet eine entsprechende Trennung von der Lösung und ein Kollabieren, oder umgekehrt eine Aufnahme von Lösung und ein Quellen durch einen äußeren Reiz statt.
[090] Ein zuvor genanntes thermoresponsives Hydrogel ist ein illustratives Beispiel eines stimuliresponsiven Hydrogels. Bei einem thermoresponsiven Hydrogel finden ein Kollabieren und eine Verfestigung ab oder bis zu einer bestimmten Temperatur statt. Ein solches Hydrogel kann also einen temperaturinduzierten reversiblen Völumenphasenübergang durchlaufen. Dementsprechend kann eine Änderung der lokalen Temperatur zu einer Quellung oder einem Kollabieren des Hydrogels führen, was beispielsweise bei der geregelten Freisetzung von Substanzen genutzt werden kann. Thermoresponsive Hydrogele basieren typischerweise auf einem oder mehreren Polymeren, die eine LCST aufweisen, d.h. die Gele kollabieren mit steigender Temperatur. Bei einem solchen Hydrogel ist die thermische Gelierung in der Regel auf die physikalische Vernetzung der hydrophoben Domänen bei Temperaturen oberhalb der LCST zurückzuführen. Unterhalb der unteren kritische Lösungstemperatur ist das Polymer, das das Hydrogel charakterisiert, löslich. Oberhalb der LCST wird das Polymer zunehmend hydrophob und unlöslich.
[091] Neben einem thermoresponsiven Hydrogel existieren weitere Beispiele eines stimulirespon- siven Hydrogels. Das oben gesagte hinsichtlich des Volumen-Phasenübergangs gilt dementsprechend für den äußeren Reiz, auf den ein stimuliresponsives Hydrogel reagiert. Ein stimuliresponsives Hydrogel kann beispielsweise beim Überschreiten oder Unterschreiten eines bestimmten pH-Wertes, einer Konzentration einer bestimmten chemischen Verbindung, dem Über- oder Unterschreiten einer bestimmten Wellenlänge oder Intensität von Licht oder dem Über- oder Unterschreiten einer bestimmten Stärke eines elektrischen oder magnetischen Felds quellen bzw. kollabieren.
[092] Ein geeignetes stimuliresponsives Hydrogel kann beispielsweise ein Graft-Polymer aus einem LCST-Polymer und einem weiteren Polymer wie Hyaluronsäure oder Chitosan sein. Ein Copolymer aus z.B. NiPAAm und Propyl acryl säure (PAA) kann ebenso eingesetzt werden. Ein geeignetes Hydrogel kann beispielsweise auch ein Diblock-Polymer zweier verschiedener
Monomereinheiten eines bekannten LCST-Polymers sein wie z.B. ein PEG-PCL-Copolymer. Ein geeignetes Hydrogel kann auch ein Triblock-Polymer dreier Monomereinheiten eines bekannten LCST-Polymers sein. Ein geeignetes Polymer kann auch eine modifizierte Cellulose sein, wobei es sich um eine Cellulose handeln kann, deren Hydroxygruppen mit Alkylresten, insbesondere Ci-, C2- oder C3-Alkylresten oder Hydroxyalkylresten, z.B. Ci- bis C5- Hydroxyalkylresten substituiert ist. Substitution der Hydroxylgruppen an Cellulose durch mehrere hydrophobe Einheiten wie Methyl oder Hydroxypropylgruppen macht die ursprünglich wassserlösliche Cellulose wasserunlöslich. Methylcellulose geliert beispielweise in Wasser bei 60-80 °C. Auch ein Graft-Polymer aus einer alkylierten Cellulose mit A-isopropylacrylamid (NiPAAm) ist ein geeignetes Hydrogel.
[093] Ein geeignetes stimuliresponsives Polymer ist auch Poly(A-acryloylsarcosin-methylester) (PNASME), ein thermoresponsives N-Ester-substituiertes Polyacrylamid.
[094] In einigen Ausführungsformen zählt es zu einem hier offenbarten Verfahren, das Hydrogel durch Polymerisation herzustellen. Das Hydrogel kann in einigen Ausführungsformen durch Polymerisation auf einer festen Auflage hergestellt werden.
[095] Ein Hydrogel lässt sich unabhängig von seinem Quellgrad und von seinem Volumen trocknen, wobei dem Hydrogel Wasser entzogen wird. In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung wird dem Hydrogel durch Erwärmen Wasser entzogen. In einigen Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, wird dem Hydrogel durch Erwärmen Wasser entzogen, nachdem durch einen externen Reiz eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels bewirkt wurde. Die gewählte Temperatur kann dabei frei bestimmt werden. In Fällen, in denen ein thermoresponsives Hydrogel verwendet wird, hegt die gewählte Temperatur weiterhin bei oder oberhalb der VPTT. Im Übrigen wird der Fachmann die Temperaturstabilität des zu streckenden Nukleinsäuremoleküls berücksichtigen.
[096] In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur oberhalb der
Raumtemperatur ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird dem Hydrogel durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C Wasser entzogen, inklusive bei einer Temperatur zwischen etwa 40 °C und etwa 80 °C. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur zwischen etwa 45 °C und etwa 75 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel etwa 50 °C oder etwa 60 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur von etwa 70 °C ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur von etwa 37 °C oder bei etwa 42 °C ausgesetzt. In einigen
Ausführungsformen wird das Hydrogel einer Temperatur von etwa 40 °C ausgesetzt. [097] Als Wärmequelle kann jede beliebige Energiequelle eingesetzt werden. Typischerweise wird das Hydrogel als Ganzes einer erhöhten Temperatur ausgesetzt, beispielsweise einer Temperatur oberhalb von 28 °C oder einer Temperatur oberhalb von 32 °C. In typischen Ausführungsformen wird in diesem Zusammenhang keine partielle Erwärmung nur ausgewählter Bereiche des Hydrogels vorgenommen.
[098] Das Hydrogel wird in der Regel einer erhöhten Temperatur ausgesetzt bzw. getrocknet, bis eine Streckung oder ein gewünschtes Ausmaß an Streckung des Nukleinsäuremoleküls nachweisbar ist. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel dann beispielsweise durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und etwa 85 °C so lange getrocknet werden, bis keine Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr detektierbar ist.
[099] In Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, kann das Hydrogel in einer ersten Stufe dem Reiz ausgesetzt werden, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels bewirkt. In einer zweiten Stufe kann das Hydrogel, das dem Stimulus weiterhin ausgesetzt wird, einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C ausgesetzt werden. In einigen Ausführungsformen kann das stimuliresponsive Hydrogel dem Reiz ausgesetzt werden, während es bereits einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C ausgesetzt ist. In einigen Ausführungsformen kann das stimuliresponsive Hydrogel gleichzeitig dem Reiz und einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C ausgesetzt werden.
[100] In einigen Ausführungsformen hegt die Temperatur, der das Hydrogel, inklusive ein stimuliresponsives Hydrogel, ausgesetzt wird, im Bereich zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt von Wasser.
[101] In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 90 °C getrocknet, inklusive bei einer Temperatur zwischen etwa 40 °C und etwa 80 °C. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei einer Temperatur zwischen etwa 45 °C und etwa 75 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei etwa 50 °C oder bei etwa 60 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei etwa 70 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, während es dem Stimulus ausgesetzt wird, bei einer Temperatur von etwa 37 °C oder bei etwa 42 °C getrocknet. In einigen Ausführungsformen ist das Einwirken des Stimulus optional, sobald makroskopisch im Wesentlichen keine Nukleinsäure enthaltende Lösung mehr auf dem Hydrogel erkennbar ist. Das Hydrogel kann dann weiterhin durch Halten bei einer Temperatur zwischen beispielsweise etwa 30 °C und etwa 95 °C getrocknet werden. Es kann eine Temperatur im gleichen Bereich oder bei einem gleichen Wert gewählt werden wie während der Phase, in der das Hydrogel dem Stimulus ausgesetzt wird. Dabei kann die Temperatur unabhängig von der vorangehenden Phase gewählt werden. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel dann beispielsweise durch Halten bei einer Temperatur zwischen etwa 40 und etwa 85 °C so lange getrocknet werden, bis keine Veränderung des Gewichts und/oder des Volumens des Hydrogels mehr detektierbar ist. [102] Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung können grundsätzlich bei jedem gewünschten Druck durchgeführt werden, solange die eingesetzte Nukleinsäure und das verwendete Hydrogel dem hier offenbarten Verfahren bzw. der Verwendung zugänglich sind. Wird ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt, so kann eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels in einigen Ausführungsformen bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa auslösbar sein. In einigen Ausführungsformen kann eine Verringerung des Quellgrads und/ oder des Volumens eines stimuliresponsiven Hydrogels unter atmosphärischem Druck auslösbar sein.
[103] In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel unter Umgebungsluftdruck einer
Temperatur oberhalb der Raumtemperatur ausgesetzt. Das Hydrogel wird in einigen Ausführungs formen der Temperatur von Raumtemperatur bis etwa 95°C unter Umgebungsluftdruck ausgesetzt. Dabei kann es sich um einen Luftdruck beim atmosphärischen Druck oder im Bereich von +20 bis -60 % des atmosphärischen Drucks in Pa handeln, inklusive im Bereich von ±10 % des atmosphärischen Drucks. Der atmosphärische Druck ist der mittlere Luftdruck der Atmosphäre auf Meereshöhe, der normgemäß 101.325 Pa beträgt. Auf der Höhe des Toten Meeres beträgt der Luftdruck im Mittel 1070 hPa. Bei diesem Druck kann das hier offenbarte Verfahren problemlos durchgeführt werden. Auf Höhe des Gipfels des Mt. Everest beträgt der Luftdruck im Mittel 325 hPa, ein Druck, bei dem das hier offenbarte Verfahren ebenfalls gut durchführbar ist. In einigen Ausführungsformen wird zumindest ein Teil des hier offenbarten Verfahrens bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird das gesamte hier offenbarte Verfahren bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt.
[104] Zumindest ein Schritt eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten
Verwendung wird in einigen Ausführungsformen bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. Zumindest ein Schritt eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung wird in einigen Ausführungsformen unter Umgebungsluftdruck durchgeführt. Jeder Schritt, der innerhalb eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung durchgeführt wird, wird in einigen Ausführungsformen bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird jeder Schritt, der innerhalb eines hier offenbarten Verfahrens und einer hier offenbarten Verwendung durchgeführt wird, unter
Umgebungsluftdruck durchgeführt.
[105] Wie bereits zuvor erläutert, kann in Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel eingesetzt wird, das stimuliresponsive Hydrogel eine VPTT haben und das Hydrogels einer Temperatur oberhalb der VPTT ausgesetzt werden. In einigen Ausführungsformen wird das
Hydrogels einer Temperatur oberhalb der VPTT ausgesetzt, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist. In einigen Ausführungsformen wird der Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird der Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, bei atmosphärischem Druck durchgeführt.
[106] In Ausführungsformen, in denen das Hydrogel, z.B. das stimuliresponsive Hydrogel, trocknen gelassen wird, kann dieser Schritt bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen wird das Hydrogel, z.B. das stimuliresponsive Hydrogel, bei atmosphärischem Druck trocknen gelassen. In Ausführungsformen, in denen ein stimuliresponsives Hydrogel trocknen gelassen wird, können auch sowohl ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, und ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin trocknen zu lassen, bei einem Druck im Bereich von etwa 400 bis 1200 hPa durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen wird ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel bei einer Temperatur oberhalb der VPTT des Hydrogels zu halten, bis die aufgebrachte Lösung zumindest im
Wesentlichen makroskopisch nicht mehr auf der Oberfläche des stimuliresponsiven Hydrogels sichtbar ist, und ein Schritt, das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin trocknen zu lassen, bei atmosphärischem Druck durchgeführt werden.
[107] Die Dicke des eingesetzten Hydrogels kann der Fachmann je nach der gewünschten
Anwendung wählen. Das Hydrogel kann in einigen Ausführungsformen eine Dicke im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 pm haben, beispielsweise eine Dicke im Bereich von etwa 20 bis etwa 50 pm. Illustrative Werte für eine geeignete Dicke sind beispielsweise 25 pm oder 38 pm.
[108] In der Ebene senkrecht zur Dicke kann das Hydrogel jede beliebige Form haben. Geeignete Formen sind beispielsweise die Kreisform, die Form eines Quadrats oder Rechtecks oder ein sonstiges Vieleck. Auch die Dimensionen des Hydrogels in der Ebene senkrecht zur Dicke, die in einigen Ausführungsformen als Durchmesser aufgefasst werden kann, kann der Fachmann je nach der gewünschten Anwendung wählen. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel in der Ebene senkrecht zur Dicke beispielsweise Dimensionen im Bereich von etwa 2 mm bis etwa 100 mm haben, inklusive z.B. etwa 5 mm bis etwa 50 mm. Illustrative Werte für eine geeignete maximale Ausdehnung in der Ebene senkrecht zur Dicke sind beispielsweise 10 mm oder 22 mm.
[109] Auch die Menge an Nukleinsäure, die zum Strecken eingesetzt wird, hängt im Wesentlichen von der beabsichtigten Anwendung sowie von der verwendeten Analytik ab. So kann beispielsweise bei der Verwendung des Interkalationsfluoreszenzfarbstoffs YOYO-1® (l,l'-(4,4,8,8-Tetramethyl- 4,8-diazaundecamethylen)bis[4-[(3-methylbenzo-l,3-oxazol-2-yl)methyliden]-l,4- dihydrochino- linium]-tetraiodid) ein Tropfen mit einer Konzentration von etwa 15 bis 100 pg/pl Nukleinsäure, inklusive einer Konzentration von etwa 25 bis 60 pg/pl Nukleinsäure auf ein kreisrundes Hydrogel von 10 mm Durchmesser und 38 pm Dicke problemlos aufgetragen und gestreckt werden.
[110] Das zu streckende Nukleinsäuremolekül hegt in wässriger Lösung vor. In einigen
Ausführungsformen wird das zu streckende Nukleinsäuremolekül in wässriger Lösung bereitgestellt. Die wässrige Lösung enthält in typischen Ausführungsformen ein Reduktionsmittel wie ein Thiol, beispielsweise Dithiothreitol oder 2-Mercaptoethanol. Die wässrige Lösung enthält in typischen Ausführungsformen ein anorganisches Salz im Bereich von etwa 1 bis 500 mM. Beispielsweise kann ein Kalium- und oder Magnesiumsalz vorhanden sein. Die wässrige Lösung enthält in typischen Ausführungsformen eine oder mehrere Pufferverbindungen. Zahlreiche Pufferverbindungen sind dem Fachmann bekannt und können in der wässrigen Lösung, die das Nukleinsäuremolekül enthält, vorhanden sein. Beispiele für geeignete Puffer sind unter anderem Lösungen von Phosphatsalzen, Carbonat, Succinat, Carbonat, Citrat, Acetat, Formiat, Barbiturat, Oxalat, Laktat, Phthalat, Maleat, Cacodylat, Borat, N-(2-Acetamido)-2-Aminoethansulfonat (auch ACES genannt), N- (2)Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (auch HEPES genannt), 4-(2-Hydroxyethyl)-l- piperazinpropansulfonsäure (auch HEPPS genannt), Piperazin- l,4-bis(2-ethansulfonsäure) (auch PIPES genannt), (2-[Tris(hydroxymethyl)-methylamino]-l-ethansulfonsäure (auch TES genannt), 2- Cyclohexylamino-ethansulfonsäure (auch CHES genannt) und N-(2-acetamido)-iminodiacetat (auch ADA genannt). Jedes Gegenion kann in diesen Salzen verwendet werden, als illustrative Beispiele mögen Ammonium, Natrium und Kalium dienen. Weitere Beispiele für geeignete Puffer sind Triethanolamin, Diethanolamin, Ethylamin, Triethylamin, Glycin, Glycylglycin, Histidin, Tris- (Hydroxymethyl)aminomethan (auch TRIS genannt), Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris(hydroxy- methyl)methan (auch BIS-TRIS genannt) und N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-glycin (auch TRICINE genannt), um nur einige zu nennen.
[111] In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung, die das zu streckende
Nukleinsäuremolekül enthält, in Form eines Tropfens auf das Hydrogel aufgebracht. In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung, die das zu streckende Nukleinsäuremolekül enthält, in Form eines Mikrotropfens auf das Hydrogel aufgebracht
[112] Ein in einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung eingesetztes Nukleinsäuremolekül hegt typischerweise in gereinigter oder zumindest angereicherter Form vor. Es handelt sich um ein zellfreies Nukleinsäuremolekül. Neben dem zu streckenden Nukleinsäure molekül sind in der dieses enthaltenden Lösung in einigen Ausführungsformen im Wesentlichen keine sonstigen Nukleinsäuremoleküle vorhanden. Neben dem zu streckenden Nukleinsäuremolekül sind in der dieses enthaltenden Lösung in einigen Ausführungsformen im Wesentlichen keine Nukleinsäuremoleküle von signifikant anderem Molekulargewicht vorhanden. Neben dem zu streckenden Nukleinsäuremolekül sind in der dieses enthaltenden Lösung in einigen
Ausführungsformen keine Primer vorhanden. Das eingesetzte Nukleinsäuremolekül ist
typischerweise in Lösung frei beweglich. Das eingesetzte Nukleinsäuremolekül ist typischerweise nicht an einer Oberfläche verankert.
[113] Wie bereits eingangs angegeben, zählt es in einigen Ausführungsformen zum Verfahren, das Nukleinsäuremolekül zu detektieren. So kann der Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls erfasst werden. Dabei kann die Streckung des Nukleinsäuremoleküls in einigen Ausführungsformen überwacht werden. Grundsätzlich kann jedes Detektionsverfahren eingesetzt werden, mit dem sich der Streckungszustand eines Nukleinsäuremoleküls beurteilen lässt. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Detektion des Streckungszustands eines Nukleinsäuremoleküls mit Hilfe einer Visualisie rungstechnik. Eine entsprechende Detektion kann beispielsweise mit Hilfe einer Mikroskopietechnik erfolgen. Als illustratives Beispiel kann eine Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen zählt es zum hier offenbarten Verfahren und zur hier offenbarten Verwendung, nachdem das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C ausgesetzt worden ist, das Nukleinsäuremolekül zu detektieren. In einigen Ausführungsformen kann es zum hier offenbarten Verfahren und zur hier offenbarten Verwendung zählen, nachdem das Hydrogel einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C ausgesetzt worden ist und das Nukleinsäuremolekül detektiert worden ist, das Hydrogel erneut einer Temperatur von Raumtemperatur bis 95°C auszusetzten.
[114] Ein ungestrecktes Nukleinsäuremolekül nimmt auf Grund thermischer Bewegung in einer wässrigen Umgebung die entropisch begünstigte Form eines lockeren Knäuels ein, insbesondere solange Elektrolyte in Form von Ionen vorhanden sind. In der Form eines lockeren Knäuels ist der Ausdehnungs- oder Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls in alle Richtungen im Wesentlichen gleichförmig. Bei mikroskopischer Detektion erscheint ein entsprechendes Nukleinsäuremolekül als von zumindest im Wesentlichen rundem, typischerweise kreisförmigem Querschnitt. Je nach gewählter Auflösung und Größe kann eine ungestrecktes Nukleinsäuremolekül auch punktförmig erscheinen. Eine Abweichung von der Form eines lockeren Knäuels bedeutet eine Streckung. Der Ausdehnungs- oder Streckungsgrad des Nukleinsäuremoleküls ist nicht mehr in alle Richtungen gleich. Vielmehr erstreckt sich das Nukleinsäuremolekül in eine bestimmte Richtung oder entlang einer bestimmten Achse weitre als in andere Richtungen. Es kann je nach Dauer der Einwirkung einer gewählten Temperatur und der Höhe der gewählten Temperatur ein Streckungsgrad erreicht werden, der beliebig im Bereich zwischen der Form eines lockeren Knäuels und der Form eines linearen Fadens hegt. In einigen Ausführungsformen kann das Hydrogel durch Erwärmen auf eine Temperatur beispielsweise oberhalb der Raumtemperatur so lange getrocknet werden, bis ein gewünschter Streckungsgrad detektiert wird. Bekannte Verfahren zum Detektieren des
Streckungsgrads von übermolekularen Strukturen können in dieser Hinsicht eingesetzt werden. Das Nukleinsäuremolekül kann beispielsweise durch eine Farbmarkierung, wie eine
Fluoreszenzmarkierung detektiert werden.
[115] In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung wird
typischerweise keine Kapillare eingesetzt. In einem hier offenbarten Verfahren und einer hier offenbarten Verwendung ist das eingesetzte Hydrogel in der Regel nicht in einer Kapillare angeordnet.
[116] Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, lässt sich ein hier offenbartes Verfahren sowie eine hier offenbarte Verwendung beschreibend veranschaulichen. So ist in Fig. 1 eine mögliche Erklärung skizziert, wie es möglich ist, dass eine Streckung eines Nukleinsäuremoleküls erfolgt. Durch Erwärmen und Trocknen könnte eine Strömung von der die Nukleinsäure enthaltenden Fösung, typischerweise in Form eines Tropfens, in das Hydrogel erfolgen. Das Kollabieren des Hydrogels nach Einwirken eines externen Reizes könnte zusätzlich die Bildung einer nanoporösen Struktur zur Folge haben. [117] Ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung lassen sich in kosten günstiger und schneller Weise im optischen Nukleinsäure-Mapping, insbesondere im optischen DNA- Mapping einsetzen. Die zu streckende Nukleinsäure kann in diesem Fall genomische DNA sein.
BEISPIEL
[118] Nachfolgend wird zur Veranschaulichung beispielhaft beschrieben, wie sich ein hier offenbartes Verfahren und eine hier offenbarte Verwendung umsetzen lassen.
[119] Eingesetzes Wasser wurde entweder durch eine Kombination aus Millipore Elix 3 mit einem nachgeschalteten Milli-Q Academic System (Q = 0,055 pS cm 1) oder durch ein membraPure Astacus2 System (s= 0,055 pS cm 1) gereinigt.
[120] Für die Plasmareinigung wurde ein Zepto-System von Diener electronic verwendet.
[121] Für alle Fluoreszenzmikroskopie-Messungen wurde ein spinning disk-Konfokal- Fluoreszenzmikroskop VisiScope Confocal-CSUXl mit Nikon Ti und Andor EMCCD-Kamera verwendet. Aufnahmen wurden in der Regel bei 561 nm und bei 488 nm erstellt. Im 488 nm Kanal war das Bleichen der Fluorophore unkritisch, da genügend Substanz vorhanden war und lediglich die Form der Stränge erkennbar sein musste. Im Gegensatz dazu war das Bleichen der Markierungen im 561 nm-Kanal für die weitere Analyse sehr kritisch, da jedes einzelne Fluorophormolekül eine sequenzspezifische Position markierte. Daher wurde der Fokus während der Aufnahme manuell eingestellt. Der Grauwert des hellsten Punktes des Bildes wurde durch den durchschnittlichen Grauwert des Bildes dividiert. Die 100 Bilder mit dem höchsten Verhältnis wurden zu einem
Einzelbild gemittelt.
Herstellung von Hydrogelen
Reinigung der Glassubstrate
[122] Rechteckige Glassubstrate (Marienfeld, Hochpräzisions-Mikroskop-Abdeckgläser, 24x50 mm, Nr. 1,5H) wurden durch Ultraschall nacheinander in Wasser, Aceton und 2-Propanol für je 5 min gereinigt. Runde Deckgläschen (10 mm; 22 mm) wurden auf die gleiche Weise gereinigt und in 2- Propanol gelagert. Die Glassubstrate wurden für 1000 s bei 100 W und einem Ch-Druck von 0,44 mbar plasmagereinigt.
Silanisieren der Glassubstrate
[123] Die Glassubstrate wurden in einen Exsikkator ohne Trockenmittel gegeben. Eine
Verdampfungsschale mit 3-(Trimethoxysilyl)propylacrylat (100 pF) wurde den Substraten gegenübergestellt. Im Exsikkator wurde die Fösung 15 Minuten lang verdampft. Das Vakuum wurde für 2 h gehalten. Nachdem die Verdampfungsschale entfernt worden war, wurde der Exsikkator für 1 Std. evakuiert. Die Glassubstrate wurden lichtdicht unter Argon bei Umgebungsdruck gelagert.
Polymerisationslösung für Polymethacrylat-Hydrogele
[124] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer Methacrylsäure (2,56 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA; 50,2 mM, 1,96 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2-methylpropiophenon (49,9 mM, 1,94 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 22 mm) abgedeckt.
Polymerisationslösung für Polyacrylamid-Hydrogele
[125] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer Acrylamid (2,56 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer MBA (50,2 mM, 1,96 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2- methylpropiophenon (49,9 mM, 1,94 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 22 mm) abgedeckt.
Polymerisationslösung für PNIPAAm-Hydrogele
[126] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer NIPAAm (1,77 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer MBA (17,7 mM, 1,0 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2- methylpropiophenon (17,7 mM, 1,0 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (für 10 mm Deckgläser: 1,0 pL; 2,0 pL; 3,0ppL; für 22 mm: 14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 10 oder 22 mm) abgedeckt.
Polymerisationslösung für PNIPMAAm-Hydrogele
[127] Es wurde eine Polymerisationslösung hergestellt, die das Monomer NIPMAAm (A-isopro- pylmethylmethacrylamid, 2,56 M, 100 Äquiv. %), den Vernetzer MBA (50,2 mM, 1,96 Äquiv. %) und den Photoinitiator 2-Hydroxy-2-methylpropiophenon (49,9 mM, 1,94 Äquiv. %) in DMSO enthielt. Für jedes Hydrogel wurde ein Tropfen Polymerisationslösung (22 mm Deckgläschen, 14,5 pL) auf ein Glassubstrat pipettiert und mit einem Deckgläschen (Durchmesser 22 mm) abgedeckt.
Polymerisation der Hydrogele
[128] Die radikalische Terpolymerisation wurde mit jeder Polymersisationslösung gestartet, indem die Proben 1 Stunde lang UV-Licht (l = 254 und 366 nm) ausgesetzt wurden. Es wurden vernetzte und an die Oberfläche gebundene Polymethacrylat-, Polyacrylamid-, PNIPAAm- und PNIPMAAm- Hydrogele erhalten. Das Deckglässchen wurde entfernt und das Hydrogel wurde für mindestens 16 Stunden in Wasser (50 mL) gelagert. Das Hydrogel wurde unter einem Argonstrom getrocknet.
[129] Als Volumen für Hydrogele mit einem Durchmesser von 10 mm wurden 3 pL gewählt. Dies entspricht einer Höhe der Stammlösung von 38 pm.
DNA -Präparation
[130] DNA wurde mittels einer DNA-Methyltransferase und AdoYnTAMRA Fluoreszenz-markiert. Weiterhin wurde als Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung ganzer DNA-Doppelstränge der Interkalationsfarbstoff Y OY O- 1 ® eingesetzt.
Modifikation von l Phagen-DNA mit AdoYnTAMRA undM. Taql
[131] l Phagen-DNA (50,0 ng pL 1) wurde mit M.Taql (1,00 Äquiv. pro TCGA, 0,189 pM) und AdoYnTAMRA (10 mM) in lx NEB4-Puffer gemischt. Das Gemisch wurde für 1 Stunde bei 65 °C inkubiert. Überschüssiger Cofaktor wurde durch Agarose Plug Purification (APP) entfernt.
Modifikation von T7 Phagen-DNA mit AdoYnTAMRA durch M. Tagl oder M.BseCI
[132] T7 Phagen-DNA (50,0 ng pL 1) wurde mit M.Taql (1,00 Äquiv. pro TCGA, 0,213 mM) oder M BseCI (20,0 Äquiv. pro ATCGAT, 0,115 mM) und AdoYnTAMRA (10 mM) in lx NEB4-Puffer bzw. lx BseCI-Puffer vermischt. Die M.Taql-haltige Mischung wurde bei 65 °C für 1 h inkubiert und die M.BseCI-haltige Mischung wurde bei 55 °C für 1 Stunde inkubiert. Überschüssiger Cofaktor wurde durch Agarose Plug Purification (APP) entfernt.
Thermische Behandlung von beladenen Hydrogelen
[133] Das Hydrogel wurde 5 Minuten lang bei 40 °C inkubiert. Ein Tropfen der DNA-haltigen Lösung (pNIPAAm-Gele: 10 pL und 5 pL, alle anderen Gele: 10 pl) wurde auf das Hydrogel pipettiert. Üblicherweise wurden 10 pl DNA-Lösung mit einer DNA-Konzentration von 50 pg pL 1 eingesetzt. Das System wurde 1 Stunde lang bei 40 °C inkubiert.
Variation des Durchmessers des Hydrogels
[134] Nach theoretischen Überlegungen könnte der radiale Zug auf die DNA durch die
Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Hydrogel durch die Hydrogeloberfläche entstehen. Dies würde zur Überlegung führen, dass eine größere Oberfläche zu mehr verdunstetem Lösungsmittel pro Zeiteinheit und damit zu einer höheren Zugkraft führen könnte. Es könnten sich Auswirkungen auf das Streckverhältnis, die Lorm und die Ausrichtung der DNA-Moleküle ergeben. Um den Einfluss der Hydrogeloberfläche auf das Streckverhalten zu prüfen, wurde der Hydrogeldurchmesser von bisher 10 mm auf 22 mm erhöht. Dies entspricht einer Steigerung der Oberfläche um 384 %. Die übrigen Parameter blieben unverändert. Die Hydrogeldicke wurde bei 38 pm gehalten, indem das Hydrogelvolumen proportional zur Lläche erhöht wurde.
[135] Lig. 7A, 7B und 7C zeigen drei exemplarische Lluoreszenzmikroskopie-Bilder. In allen Lällen wurde ein sehr gutes Streckungsverhalten beobachtet. Alle Stränge erscheinen in Lorm von perfekt geraden Linien und innerhalb des gleichen Bildes haben alle Stränge die gleiche Ausrichtung. Die Markierungen befinden sich auf den Linien und sind dem entsprechenden Strang gut zuordenbar. Zwischen den Strängen liegen nur sehr wenige Signale von freien Lluorophoren.
[136] Der Inhalt von wissenschaftlichen Artikeln, Patenten und Patentanmeldungen sowie der Inhalt von allen anderen Dokumenten und elektronisch zugänglichen Daten, die hier erwähnt oder zitiert werden, wird hiermit durch Bezug in ihrer Gesamtheit im gleichen Maße aufgenommen, als wäre jede einzelne Veröffentlichung ausdrücklich und individuell als durch Bezug aufgenommen bezeichnet. Im Palle eines Widerspruchs gibt das vorliegende Dokument den Ausschlag. Der Anmel der behält sich das Recht vor, jedwedes, inklusive alles Material und Daten aus jedweden solchen Artikeln, Patenten und Patentanmeldungen oder anderen physischen und/oder elektronischen Dokumenten per Bezug in dieses Dokument aufzunehmen. [137] Die Nennung oder Diskussion eines zuvor veröffentlichten Dokuments in dieser Beschrei bung sollte nicht notwendigerweise als Anerkenntnis verstanden werden, dass ein solches Dokument zum Stand der Technik zählt oder Allgemeinwissen des Fachmanns darstellt.
[138] Das Verfahren und die Verwendung, die hier veranschaulichend beschrieben sind, können in geeigneter Weise ohne ein einzelnes Element oder Elemente, Beschränkung oder Beschränkungen ausgeführt und eingesetzt werden, die hier nicht explizit offenbart sind. Die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke sind ferner als beschreibende Begriffe und nicht als Einschränkung verwendet, und es besteht keine Absicht, beim Verwenden solcher Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon
auszuschließen. Es wird erkannt, dass verschiedene Abwandlungen im Umfang der beanspruchten Erfindung möglich sind. So sollte daher verstanden werden, dass der Fachmann auf Abwandlungen und Variationen der offenbarten Ausführungsformen zurückgreifen kann, obwohl die hier offenbarten Vorrichtungen und Verfahren für den Fachmann in ausreichendem Detail beschrieben und veran schaulicht sind, um sie anzuwenden, und dass solche Abwandlungen und Variationen als innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung befindlich anzusehen sind.
[139] Es sollte somit verstanden werden, dass ein Verfahren und eine Verwendung, die hier in ausreichend Detail beschrieben und anhand bestimmter spezifischer Ausführungsformen
veranschaulicht sind, so dass sie vom Fachmann ausgeführt werden können, nicht darauf beschränkt sein sollen; vielmehr werden Abwandlungen und Variationen der beschriebenen Ausführungsformen als im Umfang der Erfindung befindlich angesehen.
[140] Die Erfindung ist hier ausgedehnt und allgemein beschrieben worden. Jede der engeren Spezies und Subgenus-Gruppierungen, die unter die allgemeine Offenbarung fallen, bilden ebenfalls einen Teil des Verfahrens und der Verwendung. Das schließt die allgemeine Beschreibung des des Verfahrens und der Verwendung mit einer Bedingung oder einer negativen Beschränkung ein, die einen Gegenstand aus dem Genus ausschließen, unabhängig davon, ob der ausgeschlossene
Gegenstand hier explizit wiedergegeben ist.
[141] Weitere Ausführungsformen sind in den nachfolgenden Patentansprüchen wiedergegeben. Sind ferner Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Form von Markush-Gruppen angegeben, wird der Fachmann erkennen, dass die Erfindung auf diese Weise auch hinsichtlich jedes individuellen Mit glieds oder jeder individuellen Untergruppe von Mitgliedern von Markush-Gruppen beschrieben ist.
[142] Wie ein durchschnittlicher Fachmann im Fachgebiet an Hand der vorliegenden Offenbarung bereitwillig zu schätzen wissen wird, können andere Komponenten, Elemente oder Schritte, die zur Zeit existieren oder später entwickelt werden und die im Wesentlichen das gleiche Ergebnis erzielen wie die hier beschriebenen beispielhaften Ausführungsformen, gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingesetzt werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls, aufweisend:
- ein Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95°C aussetzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, aufweisend eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung auf die Oberfläche des Hydrogels aufbringen und anschließend das Hydrogel einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95°C aussetzen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, aufweisend die sich auf der Oberfläche des Hydrogels befindende, das Nukleins äuremolekül enthaltende wässrige Lösung in zumindest im
Wesentlichen statischer Form auf der Oberfläche des Hydrogels belassen.
4. Verfahren zum Strecken eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der vorangehenden
Ansprüche, wobei das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, dessen Quellgrad und/oder Volumen durch einen Reiz verringerbar ist, wobei das Verfahren aufweist:
- das stimuliresponsive Hydrogel einem Reiz aussetzen, der eine Verringerung des
Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst.
5. Verfahren nach Anspruch 4, aufweisend:
- das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich eine das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, einem Stimulus aus setzen, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des Volumens des Hydrogels auslöst, und
- während das stimuliresponsive Hydrogel weiterhin dem besagten Reiz ausgesetzt ist, dieses einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95°C aussetzen.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das stimuliresponsive Hydrogel ein
thermoresponsives Hydrogel ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Hydrogel eine VPTT (Volum en- Phasenübergangs -Temperatur) im Bereich von 20 bis 95 °C aufweist und das Verfahren aufweist:
- das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, einer Temperatur aussetzen, die bei der VPTT des Hydrogels oder darüber liegt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, aufweisend: - das stimuliresponsive Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich die das Nukleinsäuremolekül enthaltende wässrige Lösung befindet, für eine Dauer von 10 Minuten bis 5 Stunden bei einer Temperatur bei oder oberhalb der VPTT des Hydrogels halten.
9 Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Hydrogel ein Polymer aufweist, das Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAAm), Poly(N- isopropylmethylmethacrylamid) (PNIPMAAm), Poly(N,N-diethylacrylamid) (PDEAAm), Poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylat] (PDMAEMA), Hydroxypropylcellulose, Poly(N- vinlycaprolactam) (PVCL), Polyvinylmethylether, Poly(ethylenglycol) (PEG), PEG- Methacrylat (PEGMA) oder eine Kombination von zwei oder mehreren derselben ist.
10 Verwendung eines Hydrogels zur Streckung eines Nukleinsäuremoleküls, wobei das
Hydrogel, auf dessen Oberfläche sich eine Lösung des Nukleinsäuremoleküls befindet, einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 95 °C aus ge setzt wird.
11 Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Hydrogel ein stimuliresponsives Hydrogel ist, dessen Quellgrad und/oder Volumen durch einen Reiz verringerbar ist, und wobei das Hydrogel einem Reiz aus ge setzt wird, der eine Verringerung des Quellgrads und/oder des
Volumens des Hydrogels auslöst.
12 Verwendung nach Anspruch 11, wobei das stimuliresponsive Hydrogel ein
thermoresponsives Hydrogel ist.
13 Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Nukleinsäuremolekül ein
DNA-Molekül ist.
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