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Die
Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und Genomik.
Zwei prinzipiell verschiedene Sequenzierungsverfahren werden heute
praktisch ausnahmslos angewendet.
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Das
erste Verfahren beruht auf einer basenspezifischen chemischen Spaltung
am Ende radioaktiv markierter DNA-Fragmente (Maxam-Gilbert-Methode).
In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen
werden die DNA-Fragmente an den 4 Basen partiell basenspezifisch
modifiziert. Danach wird die modifizierte Base von der Desoxyribose
entfernt und die Phosphodiesterbindung an dieser Stelle im DNA-Rückgrat hydrolysiert.
Die entstandenen Fragmente werden dann auf sehr dünnen Polyacrylamidgelen
im elektrischen Feld nach der Größe getrennt.
Nach Autoradiographie sind nur die Fragmente sichtbar, die noch ein
intaktes Ende besitzen, da die DNA nur dort radioaktiv markiert
wurde.
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Das
zweite, heute wesentlich verbreitetere Verfahren basiert auf der
enzymatischen Neusynthese der zu sequenzierenden DNA in Gegenwart
nukleotidspezifischer Inhibitoren (Sanger-Methode). Ausgehend von
einem kurzen Oligonukleotid (Primer) wird in 4 getrennten Ansätzen an
der zu sequenzierenden DNA ein DNA-Strang neusynthetisiert. Gleichzeitig
wird die neusynthetisierte DNA unter Einbau von 32P-dATP
radioaktiv markiert. Jedem Ansatz wird jedoch neben den für die DNA-Synthese notwendigen
Substraten (dNTPs) einer von 4 nukleotidspezifischen Inhibitoren
zugesetzt. Hierbei handelt es sich um Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs),
denen nicht nur die 2'-OH-Gruppe,
sondern auch die 3'-OH-Gruppe
der Desoxyribose fehlt. Didesoxynukleosidtriphosphate werden ebenso
wie Desoxynukleosidtriphosphate von der DNA-Polymerase als Substrate
verwendet. Werden sie jedoch statt eines Desoxynukleosidtriphosphats
statistisch in die DNA eingebaut, so kann an dieser Stelle die DNA-Kette
nicht mehr verlängert
werden, da ja die 3'-OH-Gruppe
fehlt. In jedem der 4 Reaktionsansätze befindet sich also eine
Population von DNA-Molekülen,
die zum einen alle radioaktiv markiert sind, die zum anderen alle
in Form des Primers ein identisches 5'-Ende ragen, und die sich schließlich aber
in der Länge
bis zum jeweils basenspezifischen 3'-Ende hin unterscheiden. Diese Fragmente
werden wiederum auf dünnen
Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Größe getrennt und durch Autoradiographie
dargestellt.
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Der
Hauptnachteil dieser Sequenzanalysen besteht im großen Zeit – und Finanzaufwand.
Vom Beginn des Projektes bis zu dem Punkt, wo ein Genom komplett
sequenziert wird, können
Jahre und sogar Jahrzehnte vergehen, z.B. wurde das "Human Genome Projekt" im Jahre 1973 begonnen
und wird voraussichtlich im 2003 beendet.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist, eine schnellere und billigere Sequenzierung
von Genomen zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro- oder eukaryontischen
Genoms bzw. menschlicher Chromosomen soll z.B. innerhalb eines Monats
oder einer Woche gelingen und möglichst
automatisch ablaufen.
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Die
Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, dass ein genomisches DNA-Molekül 7 über die Mantelfläche eines
Zylinders, eines Stabes, eines Rads oder einer Rolle gedreht bzw.
bewegt und während
dieser Drehung des Zylinders 2 mit Verfahren wie z.B. Laser-Scanning-Mikroskopie, z.B.
unter schwacher UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird,
oder NMR-Spektroskopie, oder Fourier-Infrarot-Analyse oder anderen
spektroskopischen Analysen, Elektronenmikroskopie (EM), Raster-Tunnel-Mikroskopie,
CD (Circular Dichroism), oder anderen physikalisch-optischen Verfahren
sequenziert wird.
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VORBEREITUNG
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a) Reinigung der genomischen,
z.B. chromosomalen DNA-Moleküle
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Ein
DNA-Molekül
in Form eines aus dem Zellkern isolierten Chromosoms, aus dem Plasma
einer isolierten Organelle, oder eine virale oder eine bakterielle
DNA oder DNA anderer Herkunft wird durch Abbau chromosomaler Proteine
bzw. Organellen-Proteine von den Proteinen getrennt und dann z.B.
durch Zentrifugation gereinigt.
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Um
einen Abbau chromosomaler Proteine zu erreichen, wird mindestens
ein Chromosom mit einem Gemisch von Proteasen inkubiert. Das Gemisch von
Proteasen enthält
z.B. Chymotrypsin, Streptomyces griseus-Protease (Pronase), Aspergillus
oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Pepsin, Bromealin
u.a. Proteasen.
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Durch
diese Protease werden die chromosomalen Proteine zersetzt, wobei
das DNA-Molekül nicht
angegriffen und freigesetzt wird. Das DNA-Molekül wird z.B. durch Zentrifugation
z.B. im Cäsiumchlorid
Gradient oder Gelelektrophorese gereinigt.
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b) Präparation und Ablegen des gereinigten DNA-Moleküls
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Für die Sequenzierung
wird ein langes DNA-Molekül
benötigt,
dessen Ende mit einem der zwei oder vier Enden der Chromosomen-DNA
ligiert werden muss.
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Dieses
lange synthetische DNA-Molekül kann
z.B. ein Poly(A/T)n-Molekül
sein und durch zwei verschiedene Methoden hergestellt werden:
- 1. dATP + Terminale Transferase → ssDNA-PolyA +
Terminale Transferase ssDNA-PolyA + dTTP + DNA-Polymerase → dsDNA-Poly(A/T)n
+ DNA Polymerase, oder
- 2. ATP + Polynukleotid-Kinase → RNA-PolyA + Polynukleotid-Kinase
RNA-PolyA + dTTP + Reverse Transcriptase → dsDNA-Poly(A/T)n + Reverse
Transcriptase
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Das
synthetische Poly(A/T)n-Molekül
wird auf die Mantelfläche
eines Rades bzw. Zylinders 2 gelegt, so dass ein Ende (a-Ende)
des Moleküls
sich in der Vertiefung oder in Reagenzglas A und das andere (b-Ende)
sich in der Vertiefung oder Reagenzglas B befindet. Auf die Mantelfläche des
Zylinders 2 können
zwei oder mehrere Poly (A/T)n-Moleküle gelegt werden, damit sie
mit zwei beliebigen Enden eines Mitose-Chromosoms ligiert werden
können.
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Das
auf der Mantelfläche
liegende DNA-Molekül
befindet sich im Fokus eines Sequenzierers wie z.B. eines Laser-Scanning-Mikroskops,
eines Elektronenmikroskops, eines Raster-Tunnel-Mikroskops oder eines anderen
Mikroskops oder Spektroskops, welches über der Mantelfläche des
Zylinders 2 befestigt ist.
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c) Ligation eines Endes
der chromosomalen DNA mit dem A-Ende des Poly(A/T)n-Moleküls
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Das
gereinigte genomische bzw. chromosomale DNA-Molekül wird in
die Vertiefung oder das Reagenzglas A z.B. mit Hilfe einer Pipette
abgelegt. Danach gibt man ein Gemisch mit DNA-Ligase, z.B. T4-Ligase,
und ATP in die Vertiefung A, damit das a-Ende mit einem der beiden
Enden des genomischen bzw. chromosomalen DNA-Moleküls ligiert wird.
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Das
Reagenzglas bzw. sein Inhalt wird erwärmt und geschüttelt um
die Reaktion bzw. Ligation zu beschleunigen. Nach der Ligation des
einen Endes des chromosomalen DNA-Moleküls (genannt „Chrom
DNA 1" oder einfach
1) mit dem a-Ende des Poly(A/T)n-Moleküls in der
Vertiefung A oder Reagenzglas A kann ein anderes chromosomales DNA-Molekül eines
anderen Chromosoms (genannt „Chrom
DNA 2" oder einfach
2) in die Vertiefung A für die
Ligation mit der DNA 1 bzw. von einem Ende der DNA 1 mit einem der
beiden Enden von der DNA 2, zugegeben werden, damit die Sequenzierung
des gesamten Genoms ununterbrochen verlaufen kann.
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Da
die T4-Ligasen schon seit der ersten Ligation in der Vertiefung
oder im Reagenzglas A geblieben bzw. vorhanden sind, wird eines
der beiden Enden der DNA 2 mit dem Ende der DNA 1 unter Zugabe von
ATP ligiert.
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In
die Vertiefung A kann ein gereinigtes, drittes chromosomales DNA-Molekül („Chrom
DNA 3", DNA 3 oder
einfach 3) für
die Ligation an ein Ende der DNA 2 gelegt werden.
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Man
kann die Reaktionen, die dabei in der Vertiefung oder Reagenzglas
geschehen, so schematisch darstellen:
- 1. DNA
1 (oder einfach 1) + Poly(A/T)n + T4-Ligase + ATP →
DNA
1 Poly(A/T)n + T4-Ligase + Phosphate
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Das
Produkt ist also DNA 1-Poly(A/T)n oder vereinfacht 1-PolyA.
- 2. 1-PolyA + 2(Chrom DNA 2) + ATP → 2-1-PolyA
- 3. 2-1-PolyA + 3(+ ATP in geringen Konzentrationen) → 3-2-1-PolyA
- 4. 3-2-1-PolyA + 4 → 4-3-2-1-PolyA
usw.
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1,
2, 3 und 4 sind gereinigte DNA-Moleküle der Chromosomen 1, 2, 3
und 4.
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Es
ist ungünstig,
alle gereinigten chromosomalen DNA-Moleküle in einem Reagenzglas durch eine
Ligase-Kettenreaktion (Ligase Chain Reaction, LCR) bzw. durch T4-Ligase
unter Zugabe von ATP zu ligieren, weil sog. Makrozyklen bzw. große Plasmide gebildet
werden können.
Solche Plasmide sind lange zirkuläre DNA-Moleküle, die
mehrere chromosomale DNA-Moleküle
enthalten, die nicht mit dem Ende des Poly(A/T)n-Moleküls ligiert
werden können.
Folglich werden sie nicht durch die Mantelfläche des Zylinders 2 bewegt
und sequenziert.
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Man
kann auch zwei DNA-Moleküle
auf den Zylinder legen, so dass zwei der vier Enden der DNA eines
Mitose-Chromosoms mit zwei Enden zweier Poly(A/T)n-Moleküle gleichzeitig
ligiert werden.
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SEQUENZIERUNG
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Nach
der Ligation eines Endes des genomischen DNA-Moleküls mit dem
a-Ende des Poly(A/T)-Moleküls
in der Vertiefung A wird der Motor, welcher den Zylinder dreht,
angeschalten. Der Zylinder fängt
an, sich zu drehen und bewegt bei dieser Drehung die auf der Mantelfläche liegende
DNA, so dass das gesamte DNA-Molekül aus der Vertiefung A über die
Mantelfläche
des drehenden Zylinders 2 in die Vertiefung B gelangt.
Das auf der Mantelfläche bewegte
DNA-Molekül
befindet sich im Fokus des Sequenzierers, z.B. eines Mikroskops
oder Spektroskops und wird bei der Drehung fortlaufend sequenziert.
Folglich ist die Sequenz der in die Vertiefung bzw. das Reagenzglas
B abgeführten
bzw. gelangenden DNA schon bekannt. Die Geschwindigkeit der Drehung
und folglich der Sequenzierung ist automatisch regulierbar.
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Bei
der Drehung des Zylinders 2 bzw. während dieser Drehung wird das
auf der Mantelfläche des
Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül mit Verfahren wie z.B. Laser-Scanning-Mikroskopie
unter schwacher UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird,
Raster-Tunnel-Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, NMR-Spektroskopie,
Fourier-Infrarot-Anaylse und
anderen spektroskopischen Analysen, CD (Circular Dichroism) oder
anderen physikalisch-optischen Verfahren sequenziert. Der Sequenzierer
kann folglich z.B. ein Laser-Scanning-Mikroskop, ein Elektronenmikroskop
usw. sein. Dabei kann die gesamte Sequenzierung automatisch ablaufen.
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Der
Zylinder besteht z.B. aus Glas; Silizium oder aus einem Metall wie
z.B. Gold oder Kupfer. Die Mantelfläche kann gut bzw. präzise oder
nicht gut geschliffen sein, konkav oder nicht konkav sein. In das System
können
auch zwei oder mehrere Zylinder und Sequenzierer zur Überprüfung der
Richtigkeit von Daten eingebaut werden.
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Die
Vertiefung bzw. Reagenzglas B kann z.B. durch eine Scheibe oder
Disk mit einer langen spiralförmigen
ununterbrochenen Nute für
das Ablegen der DNA, einen Stab oder eine lange Platte für das geradlinige
Legen, oder einen anderen Zylinder ersetzt werden. In die Vertiefung
bzw. Reagenzglas B, Disk, Stab oder lange Platte wird die sequenzierte DNA
abgelegt bzw. abgeführt.
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Das
DNA-Molekül,
das aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas A durch die Drehung des
Zylinders 2 auf die Mantelfläche dieses Zylinders aufsteigt,
wird als „präsequenziert" bezeichnet.
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In
der 1 ist ein Chromosom 10, welches in ein
Gemisch von Protease 11 im Reagenzglas 9 gelegt
wird, und eine Pipette 6 mit dem gereinigten chromosomalen
DNA-Molekül 7 schematisch
dargestellt. Die drei Pfeile vom Reagenzglas 9 zur Pipette 6 bedeuten
die Abtrennung und Reinigung des chromosomalen DNA-Moleküls und die
Einführung
in die Pipette, nachdem die chromosomalen Proteine im Gemisch von
Proteasen abgebaut wurden.
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In
der 2 ist schematisch ein Reagenzglas 9,
welches ein genomisches DNA-Molekül 7 oder ein synthetisches
Poly (A/T)n-Molekül 4 enthält, ein
Glasstab 18 mit dem Substrat 19, an welchem ein kurzes
synthetisches Poly(A/T)n-Molekül 27 immobilisiert
ist, und eine Pipette 6 mit dem Gemisch 12 von DNA-Ligasen
und ATP für
die Ligation eines der beiden Enden des Moleküls 4 bzw. 7 mit
dem Ende des Moleküls 27 dargestellt.
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In
den 2a und 2b sind
die Möglichkeiten der
Immobilisierung des Moleküls 27 an
das Substrat 19 gezeigt. In der 2a gezeigt
ist ein Fragment eines Substrates von einem DNA-Synthetisierer,
an welches das synthetische DNA-Molekül durch ein Sauerstoffatom
mit einem Ende immobilisiert ist. Das Substrat in der 2b enthält eine Ni-NTA (Nickel-Nitriloacetische
Säure)-Schicht 20,
welche mit Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptiden 21 interagiert.
Polyhistidin bindet an die Ni-NTA-Schicht und Polylysin bindet an
die DNA. So kann auf diesem Substrat ein synthetisches DNA-Molekül 27 immobilisiert
werden.
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In
der 3 ist ein Gerät
bzw. das System zur schnellen Genom-Sequenzierung schematisch dargestellt.
Das System enthält
einen Sequenzierer 1, einen Zylinder 2 und ein
Substrat 5 mit Vertiefungen 3A und 3B.
Die Pipette 6 führt
ein genomisches DNA-Molekül 7 und
das Gemisch mit DNA-Ligasen und ATP 12 in die Vertiefung 3A,
damit ein Ende des Moleküls 7 mit
dem Ende des Moleküls 4 ligiert
wird. Molekül 4 ist
an das Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiert
und wird durch den Glasstab 18 auf die Mantelfläche des
Zylinders 2 gelegt, so dass ein Ende (a-Ende) sich in der
Vertiefung A bzw. 3A und das andere b-Ende sich in der
Vertiefung B bzw. 3B befindet.
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In
der 4 sind verschiedene Formen der Substrate 5 mit
den Vertiefungen 3A und 3B dargestellt. Die Ansicht
A ist eine Sicht von oben auf das Substrat 5 und die Vertiefungen 3A und 3B und
die Ansicht B ist eine Sicht von der Seite im Querschnitt.
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In
der 5 ist ein Gerät
bzw. System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System
umfaßt
einen Sequenzierer 1, einen Zylinder 2, ein genomisches
DNA-Molekül 7 und ein
Substrat 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B.
Die Pfeile zeigen die Bewegung des Zylinders 2 und entsprechend
des Moleküls 7.
Durch die Drehung des Zylinders 2 steigt das Molekül 7 aus
der Vertiefung 3A und gelangt über die Mantelfläche des
sich drehenden Zylinders 2 in die Vertiefung. Z.B. das
auf der Mantelfläche
des Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül 7 befindet sich
im Fokus des Sequenzierers 1 und wird durch diesen Sequenzierer
sequenziert. Die Sequenz-Daten vom Sequenzierer gelangen in einen
Computer und werden gespeichert bzw. verarbeitet. Die Ansicht A
ist eine Sicht von vorne und in der 5a ist
die Ansicht dieses Systems von oben dargestellt.
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In
der 6 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt einen
Sequenzierer 1, einen Zylinder 2 und Reagenzgläser 3A und 3B,
welche durch eine Befestigung 13 befestigt sind. Das genomische
DNA-Molekül 7 steigt durch
die Drehung des Zylinders 2 aus der Vertiefung A und gelangt
durch die Mantelfläche
dieses Zylinders in die Vertiefung B. Das auf der Mantelfläche des
Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül wird durch Sequenzierer 1 sequenziert.
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Man
kann die Bewegung des sequenzierten DNA-Moleküls folglich schematisch darstellen:
3A → Sequenzierer 1 → 3B
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Um
das auf der Mantelfläche
des Zylinders 2 bzw. der Rolle 2 liegende DNA-Molekül zu stabilisieren,
kann der Zylinder 2 entweder nicht leicht zu bewegen sein
(bezogen auf das liegende DNA-Molekül), oder er kann sich nur in
einer Richtung drehen, und zwar so, dass das DNA-Molekül 7 nur
aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A in 3B gelangen kann.
Außerdem
kann das lange in der Vertiefung 3B liegende Molekül 4 als
Gegengewicht zu dem in der Vertiefung 3A liegenden Molekül 7 dienen.
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Die
Ansicht A in 6 ist die Sicht des Systems
von vorne. Ansicht 6a ist die Sicht
dieses Systems von der Seite. Schematisch ist auch dargestellt,
wie ein Reagenzglas A unter den Zylinder 2 gestellt und
durch ein Befestigungssystem 13 befestigt werden kann.
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In
der 7 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt drei
verschiedene bzw. voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c,
zwei Zylinder 2 und Reagenzgläser 3A und 3B,
die durch Befestigungen 13 befestigt sind. Zwei Zylinder 2 drehen
sich mit der gleichen Geschwindigkeit und durch die Drehung wird
das genomische DNA-Molekül 7 aus
dem Reagenzglas 3A über
die beiden Mantelflächen
der beiden sich drehenden Zylinder 2 in das Reagenzglas 3B bewegt.
Während
der Bewegung des Moleküls 7 über die
und zwischen den zwei Mantelflächen
wird dieses Molekül
durch z.B. drei voneinander unabhängige Sequenzierer 1a,
b und c sequenziert. Somit kann die Richtigkeit der Daten überprüft werden.
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In
der 8 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt den
Sequenzierer 1, den Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit
dem genomischen DNA-Molekül 7 und eine
Scheibe oder Disk 14, welche durch den Motor 8 gedreht
wird. In diesem System wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch
einen Disk 14 ersetzt. Die sequenzierte DNA wird auf die
Oberfläche des
Disks 14 bzw. auf seinen spiralförmigen langen und ununterbrochenen
Nut spiralförmig
gelegt.
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In
der 9 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt den
Sequenzierer 1, den Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit
dem genomischen DNA-Molekül 7 und eine
lange Platte bzw. ein Lineal 15. In diesem System wird
die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch eine lange
Platte bzw. ein Lineal 15 ersetzt. Die sequenzierte DNA
wird auf die Oberfläche
der Platte bzw. des Lineals 15 ununterbrochenen geradlinig
abgelegt. Die Ansicht A ist eine Sicht von der Seite. Die Pfeile
zeigen die Richtung der Bewegung von Lineal 15.
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In
der 10 ist das System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt
den Sequenzierer 1, den Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit
dem genomischen DNA-Molekül 7 und
einen Stab bzw. Zylinder 17. Jedes im System sequenzierte
DNA-Molekül 7 ist
durch ein Ende an das Ende des synthetischen Moleküls 4 ligiert.
Dabei dient Molekül 4 als
eine Verbindung zwischen dem operierenden bzw. sequenzierenden System
bzw. Gerät
und einem genomischen DNA-Molekül 7.
Im System der 10 wird die Vertiefung bzw.
das Reagenzglas 3B durch den Stab bzw. den Zylinder 17 ersetzt.
Die sequenzierte DNA wird um die Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt. Die
Ansicht A ist eine Sicht von der Seite. Molekül 7 ist mit einem
Molekül 4 verbunden;
dieses ist an der Ni-NTA-Schicht 20 durch Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptide
immobilisiert.
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In
der 11 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt
drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c,
zwei Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit dem genomischen
DNA-Molekül 7 und
die Scheibe oder Disk 14, welche durch den Motor 8 gedreht
wird. In diesem System ist die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch
Disk 14 ersetzt.
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In
der 12 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt
drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c,
zwei Zylinder 2, die Vertiefung 3A mit verschiedenen
Kapazitäten
a und b, die eine Lösung
mit einem genomischen DNA-Molekül 7 enthalten
und eine Scheibe oder Disk 14, welche durch den Motor 8 gedreht
wird. In diesem System wird das Reagenzglas 3A durch Vertiefungen 3A und
das Reagenzglas 3B durch Disk 14 ersetzt.
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In
der 13 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt
drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c,
zwei Zylinder 2, das Reagenzglas bzw. die Vertiefung 3A mit
verschiedenen Kapazitäten
a, b und c, und eine lange Platte bzw. ein Lineal 15. Das
genomische DNA-Molekül 7, das
durch die Drehung der Zylinder 2 aus dem Reagenzglas bzw.
Vertiefung 3A steigt und über die Mantelfläche der
Zylinder 2 bewegt wird, wird nach der Sequenzierung auf
die lange Platte bzw. auf ihrer langen Nut geradlinig abgelegt.
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In
der 14 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt
drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c,
zwei Zylinder 2, das Reagenzglas bzw. die Vertiefung 3A mit
verschiedenen Kapazitäten
a, b und c, und einen langen Stab bzw. Zylinder 17. Das
sequenzierte genomische DNA-Molekül 7 wird um die Mantelfläche des
sich drehenden Stabes bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt.
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In
der 15 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung
dargestellt. Das System umfaßt
den Sequenzierer 1, den Zylinder 2, ein langes, dünnes metallisches
Rohr 22, dessen eines Ende durch den Deckel 26 verschlossen
wird, eine lange Platte bzw. ein Lineal 15 mit einem langen
Nut 16 und einen Glasstab 18 mit einem Substrat 19,
das sich im Nut 16 bewegen kann. Die zweite Ansicht der 15 zeigt
die lange Platte bzw. Lineal 15 und den Nut 16 für das Substrat 19 von
vorne. Das genomische DNA-Molekül 7 befindet
sich im Rohr 22 und ist mit einem Ende an das Substrat 19 immobilisiert.
Während
der Zentrifugation des Rohres 22 wird das Molekül 7 in
diesem Rohr linearisiert. Danach wird es durch den Glasstab 18 und
den Zylinder 2 aus dem Rohr 22 gezogen, während der
Bewegung über
die Mantelfläche
des sich drehenden Zylinders 2 durch den Sequenzierer 1 sequenziert
und auf den langen Nut 16 der langen Platte bzw. Lineals 15 geradlinig abgelegt.
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In
der 16 ist das System zur Zentrifugation des Rohrs 22 schematisch
dargestellt. Das System umfaßt
eine Walze 25 mit den Befestigungen 23 und 24 für den Glasstab 18 und
für das
Rohr 22, welches mit dem Deckel 26 an einem Ende
verschlossen ist. Das andere Ende des Rohrs 22 ist durch
das Substrat 19 des Glasstabes 18 geschlossen.
Die Befestigung 24 stabilisiert die Lage des Rohrs 22,
in welchem ein genomisches DNA-Molekül 7 zentrifugiert und
dabei linearisiert wird.
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Ein
Mitose-, Telophase- oder Interphase-Chromosom 10, welches
schematisch in der 1 dargestellt ist, wird in das
Gemisch von Proteasen 11 gelegt. Dabei werden die chromosomalen Proteine
zersetzt und das DNA-Molekül
wird entfaltet und entschraubt. Danach wird das DNA-Molekül 7 abgetrennt,
d.h. isoliert, gereinigt und in eine Pipette 6 eingeführt.
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Ein
Ende des DNA-Moleküls 7 oder
eines synthetischen Moleküls 4,
welche schematisch in der 2 dargestellt
sind, wird mit dem Ende des kurzen synthetischen Moleküls 27,
das an dem Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiert
ist, durch DNA-Ligasen z.B. T4-Ligase und ATP ligiert. So kann man durch
den Glasstab 18 das Molekül 4 manipulieren, wie
z.B. auf die Mantelfläche
des Zylinders 2 ablegen (3), und
zwar so, dass ein Ende (a-Ende) sich in der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A und
das andere b-Ende entweder am Substrat 19 immobilisiert
bleibt, oder durch eine Säure
vom Substrat 19 getrennt wird und sich in der Vertiefung
bzw. Reagenzglas 3A befindet. Danach führt man das gereinigte genomische DNA-Molekül 7 in
die Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A und gibt dazu ein Gemisch 12 von
T4-Ligase und ATP. Dabei wird eines der beiden Enden des genomischen
Moleküls 7 mit
dem a-Ende des synthetischen Moleküls 4 ligiert.
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Der
Zylinder 2 fängt
an, sich zu drehen und durch diese Drehung gelangt das Molekül 7 aus
der Vertiefung 3A in die Vertiefung 3B. Während der
Bewegung über
und mit der Mantelfläche
wird das DNA-Molekül 7 durch
den Sequenzierer 1 sequenziert.
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Die
Vertiefungen 3A und 3B befinden sich im Substrat 5.
In der 4 sind verschiedene Formen der Vertiefungen im
Substrat 5 dargestellt. Je nach der Form haben die Vertiefungen
entsprechende Kapazitäten.
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Das
Substrat 5 in der 5 kann man
z.B. am einfachsten herstellen. Das Gerät in der 5 funktioniert ähnlich wie
das in der 3. Das synthetische Molekül 4 ist
schon vorbereitet, d.h. es ist auf die Mantelfläche des Zylinders 2 so
gelegt, dass das a-Ende sich in der Vertiefung 3A und das
b-Ende sich in der Vertiefung 3B befindet. Man gibt ein
gereinigtes genomisches DNA Molekül 7 in die Vertiefung 3A und
danach führt
man ein Gemisch 12 von DNA-Ligasen und ATP in die Vertiefung 3A ein.
Ein Ende des Moleküls 7 wird
mit dem a-Ende des
Moleküls 4 ligiert.
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Der
Zylinder 2 fängt
an, sich zu drehen und das sich auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegende
DNA-Molekül
wird durch den Sequenzierer 1 sequenziert. Die Daten vom
Sequenzierer 1 werden in einen Computer geleitet; dort
werden sie gespeichert und verarbeitet. Das DNA-Molekül, das aus
der Vertiefung 3A gezogen wird bzw. steigt, befindet sich noch
vor dem Zeitpunkt der Sequenzierung und deshalb wird dieses Molekül als „präsequenziert" bezeichnet. Das
auf der Mantelfläche
des sich drehenden Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül wird sequenziert,
und die in die Vertiefung 3B abgeführte DNA ist schon sequenziert.
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Das
Gerät der 6 funktioniert ähnlich,
wie die Geräte
der 3 und 5, aber das Substrat 5 mit
den Vertiefungen 3A und 3B wird durch zwei Reagenzgläser ersetzt.
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Beim
Gerät der 7 gibt
es mehrere Zylinder 2 und Sequenzierer 1. Das
Molekül 7 wird
durch zwei Zylinder 2 bewegt und durch drei unterschiedliche,
voneinander unabhängige
Sequenzierer 1a, 1b und 1c sequenziert.
Somit kann die Richtigkeit der Daten überprüft werden.
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Die
in den Figuren dargestellten Systeme bzw. Geräte funktionieren nach einem ähnlichen Prinzip
und das Molekül 7 wird
nach diesem Prinzip sequenziert.
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Beim
Gerät der 8 wird
das Molekül 7 nach
der Sequenzierung durch Sequenzierer 1 nicht einfach abgeführt, sondern
auf eine Scheibe oder Disk 14, bzw. auf die lange spiralförmige und
ununterbrochene Nut spiralförmig
gelegt.
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Beim
Gerät der 9 wird
das Molekül 7 nach
der Sequenzierung durch Sequenzierer 1 nicht einfach in
eine Vertiefung oder ein Reagenzglas abgeführt, sondern auf eine lange
Platte bzw. ein Lineal 15, auf den langen geraden und ununterbrochenen Nut 16 geradlinig
abgelegt.
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Beim
Gerät der 10 wird
das Molekül 7 nach
der Sequenzierung um die Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 7 spiralförmig abgelegt.
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Das
Gerät der 11 hat
mehrere Sequenzierer und Zylinder. Das Molekül 7 wird durch zwei Zylinder
bewegt und durch drei unterschiedliche voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c sequenziert.
Die sequenzierte DNA wird auf eine Scheibe oder Disk 14 bzw.
auf den langen spiralförmigen
und ununterbrochenen Nut spiralförmig
abgelegt.
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Das
Gerät der 12 hat
zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c.
die sequenzierte DNA wird auch auf eine Scheibe oder Disk 14 abgelegt.
Statt eines Reagenzglases enthält
das Gerät ein
Substrat mit einer Vertiefung, in welche das gereinigte genomische
DNA-Molekül 7 für die Sequenzierung
gelegt wird.
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Das
Gerät der 13 hat
zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c.
Das Molekül 7 wird
entweder in ein Reagenzglas oder in eine Vertiefung 3A in
einem Substrat 5 für
die Sequenzierung gelegt. Die sequenzierte DNA wird auf eine lange Platte
oder Lineal 15 bzw. auf den langen geraden und ununterbrochenen
Nut 16 geradlinig gelegt.
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Beim
Ablegen der sequenzierten DNA auf eine Scheibe oder Disk 14,
ein Lineal 15 oder spiralförmig um die Mantelfläche eines
Stabes bzw. Zylinders 17 bewegen sich diese, d.h. Disk 14 oder
Zylinder 17 drehen sich um eine bestimmte Achse, und die
lange Platte bzw. das Lineal 15 bewegen sich geradlinig.
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Das
Gerät der 14 hat
auch zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c.
Das Molekül 7 wird
entweder in ein Reagenzglas oder in eine Vertiefung 3A in
einem Substrat 5 für
die Sequenzierung gelegt. Die sequenzierte DNA wird um die Mantelfläche des
Stabs bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt.
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Das
Gerät der 15 umfaßt einen
Sequenzierer 1 und einen Zylinder 2. Das genomische
Molekül 7 wird
vor der Sequenzierung durch die Zentrifugation in einem langen dünnen metallischen
Rohr 22 linearisiert. Danach wird es aus dem Rohr 22 durch den
Zylinder 2 und den Glasstab 18 mit dem Substrat 19,
an welchem ein Ende des Molekül 7 immobilisiert ist,
herausgezogen. Während
der Drehung des Zylinders 2 wird die sich auf der Mantelfläche bewegende DNA 7 durch
Sequenzierer 1 sequenziert und dann auf eine lange Platte
oder Lineal 15 bzw. auf den langen und geraden Nut 16 geradlinig
gelegt.
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Das
Gerät der 16 ist
ein System zur Zentrifugation bzw. Linearisierung des Moleküls 7 im Rohr 22.
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Das
DNA-Molekül 7 befindet
sich im Rohr 22 und ist mit einem Ende an dem Substrat 19 des
Glasstabs 18 immobilisiert. Bei der Zentrifugation bzw. Drehung
des Rohres 22 wird die DNA 7 durch die ausgeübte Zentrifugalkraft
entlang des Rohres in einer Flüssigkeit
gezogen bzw. linearisiert. Ein linearisiertes DNA-Molekül 7 ist
leichter zu sequenzieren und auf den Nut 16 der langen
Platte bzw. des Lineals 15 geradlinig abzulegen.
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- 1
- Sequenzierer,
z.B. Sonde eines Raster-Tunnel-Mikroskops oder ein Spektroskop
- 2
- Zylinder
bzw. Rolle
- 3A
- Vertiefung
bzw. Reagenzglas A
- 3B
- Vertiefung
bzw. Reagenzglas B
- 4
- Ein
synthetisches DNA-Molekül,
wie z.B. ein Poly(A/T)n-Molekül
- 5
- Substrat
mit einer oder mehreren Vertiefungen
- 6
- Pipette
- 7
- Ein
genomisches, z.B. chromosomales DNA-Molekül
- 8
- Motor
- 9
- Reagenzglas
- 10
- Ein
Mitose-, Telophase- oder Interphase-Chromosom (schematisch und vergrößert dargestellt)
- 11
- Gemisch
mit Proteasen
- 12
- Gemisch
mit DNA-Ligasen und ATP
- 13
- Befestigung
für Reagenzglas
- 14
- Disk
- 15
- Lange
Platte bzw. Lineal
- 16
- Nut
auf der Oberfläche
des Lineals für
das Substrat 19
- 17
- Stab
bzw. Zylinder
- 18
- Glasstab
- 19
- Substrat
des Glasstabes
- 20
- Ni-NTA-Schicht
- 21
- Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptid-Schicht
- 22
- Langes
dünnes
metallisches Rohr
- 23
- Befestigung
für den
Glasstab
- 24
- Befestigung
für das
Rohr 22
- 25
- Walze
bzw. Stab
- 26
- Deckel
für ein
Ende des Rohrs 22
- 27
- Kurzes
auf dem Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiertes
Poly(A/T)n-Molekül