DE19929530B4

DE19929530B4 - Verfahren und Gerät zur schnellen Genom-Sequenzierung

Info

Publication number: DE19929530B4
Application number: DE19929530A
Authority: DE
Inventors: Alexander Cherkasky
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-28
Filing date: 1999-06-28
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-06-29
Also published as: DE19929530A1

Abstract

Verfahren zur schnellen Genom-Sequenzierung, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eines DNA-Moleküls während der geordneten Bewegung über die Mantelfläche eines Zylinders, eines Stabes, eines Rades oder einer Rolle ununterbrochen ohne Fragmentierung bestimmt wird.

Description

Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und Genomik. Zwei prinzipiell verschiedene Sequenzierungsverfahren werden heute praktisch ausnahmslos angewendet.

Das erste Verfahren beruht auf einer basenspezifischen chemischen Spaltung am Ende radioaktiv markierter DNA-Fragmente (Maxam-Gilbert-Methode). In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen werden die DNA-Fragmente an den 4 Basen partiell basenspezifisch modifiziert. Danach wird die modifizierte Base von der Desoxyribose entfernt und die Phosphodiesterbindung an dieser Stelle im DNA-Rückgrat hydrolysiert. Die entstandenen Fragmente werden dann auf sehr dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach der Größe getrennt. Nach Autoradiographie sind nur die Fragmente sichtbar, die noch ein intaktes Ende besitzen, da die DNA nur dort radioaktiv markiert wurde.

Das zweite, heute wesentlich verbreitetere Verfahren basiert auf der enzymatischen Neusynthese der zu sequenzierenden DNA in Gegenwart nukleotidspezifischer Inhibitoren (Sanger-Methode). Ausgehend von einem kurzen Oligonukleotid (Primer) wird in 4 getrennten Ansätzen an der zu sequenzierenden DNA ein DNA-Strang neusynthetisiert. Gleichzeitig wird die neusynthetisierte DNA unter Einbau von ³²P-dATP radioaktiv markiert. Jedem Ansatz wird jedoch neben den für die DNA-Synthese notwendigen Substraten (dNTPs) einer von 4 nukleotidspezifischen Inhibitoren zugesetzt. Hierbei handelt es sich um Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs), denen nicht nur die 2'-OH-Gruppe, sondern auch die 3'-OH-Gruppe der Desoxyribose fehlt. Didesoxynukleosidtriphosphate werden ebenso wie Desoxynukleosidtriphosphate von der DNA-Polymerase als Substrate verwendet. Werden sie jedoch statt eines Desoxynukleosidtriphosphats statistisch in die DNA eingebaut, so kann an dieser Stelle die DNA-Kette nicht mehr verlängert werden, da ja die 3'-OH-Gruppe fehlt. In jedem der 4 Reaktionsansätze befindet sich also eine Population von DNA-Molekülen, die zum einen alle radioaktiv markiert sind, die zum anderen alle in Form des Primers ein identisches 5'-Ende ragen, und die sich schließlich aber in der Länge bis zum jeweils basenspezifischen 3'-Ende hin unterscheiden. Diese Fragmente werden wiederum auf dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Größe getrennt und durch Autoradiographie dargestellt.

Der Hauptnachteil dieser Sequenzanalysen besteht im großen Zeit – und Finanzaufwand. Vom Beginn des Projektes bis zu dem Punkt, wo ein Genom komplett sequenziert wird, können Jahre und sogar Jahrzehnte vergehen, z.B. wurde das "Human Genome Projekt" im Jahre 1973 begonnen und wird voraussichtlich im 2003 beendet.

Die Aufgabe der Erfindung ist, eine schnellere und billigere Sequenzierung von Genomen zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro- oder eukaryontischen Genoms bzw. menschlicher Chromosomen soll z.B. innerhalb eines Monats oder einer Woche gelingen und möglichst automatisch ablaufen.

Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, dass ein genomisches DNA-Molekül 7 über die Mantelfläche eines Zylinders, eines Stabes, eines Rads oder einer Rolle gedreht bzw. bewegt und während dieser Drehung des Zylinders 2 mit Verfahren wie z.B. Laser-Scanning-Mikroskopie, z.B. unter schwacher UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, oder NMR-Spektroskopie, oder Fourier-Infrarot-Analyse oder anderen spektroskopischen Analysen, Elektronenmikroskopie (EM), Raster-Tunnel-Mikroskopie, CD (Circular Dichroism), oder anderen physikalisch-optischen Verfahren sequenziert wird.

VORBEREITUNG
a) Reinigung der genomischen, z.B. chromosomalen DNA-Moleküle
Ein DNA-Molekül in Form eines aus dem Zellkern isolierten Chromosoms, aus dem Plasma einer isolierten Organelle, oder eine virale oder eine bakterielle DNA oder DNA anderer Herkunft wird durch Abbau chromosomaler Proteine bzw. Organellen-Proteine von den Proteinen getrennt und dann z.B. durch Zentrifugation gereinigt.
Um einen Abbau chromosomaler Proteine zu erreichen, wird mindestens ein Chromosom mit einem Gemisch von Proteasen inkubiert. Das Gemisch von Proteasen enthält z.B. Chymotrypsin, Streptomyces griseus-Protease (Pronase), Aspergillus oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Pepsin, Bromealin u.a. Proteasen.
Durch diese Protease werden die chromosomalen Proteine zersetzt, wobei das DNA-Molekül nicht angegriffen und freigesetzt wird. Das DNA-Molekül wird z.B. durch Zentrifugation z.B. im Cäsiumchlorid Gradient oder Gelelektrophorese gereinigt.
b) Präparation und Ablegen des gereinigten DNA-Moleküls
Für die Sequenzierung wird ein langes DNA-Molekül benötigt, dessen Ende mit einem der zwei oder vier Enden der Chromosomen-DNA ligiert werden muss.
Dieses lange synthetische DNA-Molekül kann z.B. ein Poly(A/T)n-Molekül sein und durch zwei verschiedene Methoden hergestellt werden:

1. dATP + Terminale Transferase → ssDNA-PolyA + Terminale Transferase ssDNA-PolyA + dTTP + DNA-Polymerase → dsDNA-Poly(A/T)n + DNA Polymerase, oder
2. ATP + Polynukleotid-Kinase → RNA-PolyA + Polynukleotid-Kinase RNA-PolyA + dTTP + Reverse Transcriptase → dsDNA-Poly(A/T)n + Reverse Transcriptase

Das synthetische Poly(A/T)n-Molekül wird auf die Mantelfläche eines Rades bzw. Zylinders 2 gelegt, so dass ein Ende (a-Ende) des Moleküls sich in der Vertiefung oder in Reagenzglas A und das andere (b-Ende) sich in der Vertiefung oder Reagenzglas B befindet. Auf die Mantelfläche des Zylinders 2 können zwei oder mehrere Poly (A/T)n-Moleküle gelegt werden, damit sie mit zwei beliebigen Enden eines Mitose-Chromosoms ligiert werden können.
Das auf der Mantelfläche liegende DNA-Molekül befindet sich im Fokus eines Sequenzierers wie z.B. eines Laser-Scanning-Mikroskops, eines Elektronenmikroskops, eines Raster-Tunnel-Mikroskops oder eines anderen Mikroskops oder Spektroskops, welches über der Mantelfläche des Zylinders 2 befestigt ist.
c) Ligation eines Endes der chromosomalen DNA mit dem A-Ende des Poly(A/T)n-Moleküls
Das gereinigte genomische bzw. chromosomale DNA-Molekül wird in die Vertiefung oder das Reagenzglas A z.B. mit Hilfe einer Pipette abgelegt. Danach gibt man ein Gemisch mit DNA-Ligase, z.B. T4-Ligase, und ATP in die Vertiefung A, damit das a-Ende mit einem der beiden Enden des genomischen bzw. chromosomalen DNA-Moleküls ligiert wird.
Das Reagenzglas bzw. sein Inhalt wird erwärmt und geschüttelt um die Reaktion bzw. Ligation zu beschleunigen. Nach der Ligation des einen Endes des chromosomalen DNA-Moleküls (genannt „Chrom DNA 1" oder einfach 1) mit dem a-Ende des Poly(A/T)n-Moleküls in der Vertiefung A oder Reagenzglas A kann ein anderes chromosomales DNA-Molekül eines anderen Chromosoms (genannt „Chrom DNA 2" oder einfach 2) in die Vertiefung A für die Ligation mit der DNA 1 bzw. von einem Ende der DNA 1 mit einem der beiden Enden von der DNA 2, zugegeben werden, damit die Sequenzierung des gesamten Genoms ununterbrochen verlaufen kann.
Da die T4-Ligasen schon seit der ersten Ligation in der Vertiefung oder im Reagenzglas A geblieben bzw. vorhanden sind, wird eines der beiden Enden der DNA 2 mit dem Ende der DNA 1 unter Zugabe von ATP ligiert.
In die Vertiefung A kann ein gereinigtes, drittes chromosomales DNA-Molekül („Chrom DNA 3", DNA 3 oder einfach 3) für die Ligation an ein Ende der DNA 2 gelegt werden.
Man kann die Reaktionen, die dabei in der Vertiefung oder Reagenzglas geschehen, so schematisch darstellen:

1. DNA 1 (oder einfach 1) + Poly(A/T)n + T4-Ligase + ATP → DNA 1 Poly(A/T)n + T4-Ligase + Phosphate

Das Produkt ist also DNA 1-Poly(A/T)n oder vereinfacht 1-PolyA.

2. 1-PolyA + 2(Chrom DNA 2) + ATP → 2-1-PolyA
3. 2-1-PolyA + 3(+ ATP in geringen Konzentrationen) → 3-2-1-PolyA
4. 3-2-1-PolyA + 4 → 4-3-2-1-PolyA usw.

1, 2, 3 und 4 sind gereinigte DNA-Moleküle der Chromosomen 1, 2, 3 und 4.
Es ist ungünstig, alle gereinigten chromosomalen DNA-Moleküle in einem Reagenzglas durch eine Ligase-Kettenreaktion (Ligase Chain Reaction, LCR) bzw. durch T4-Ligase unter Zugabe von ATP zu ligieren, weil sog. Makrozyklen bzw. große Plasmide gebildet werden können. Solche Plasmide sind lange zirkuläre DNA-Moleküle, die mehrere chromosomale DNA-Moleküle enthalten, die nicht mit dem Ende des Poly(A/T)n-Moleküls ligiert werden können. Folglich werden sie nicht durch die Mantelfläche des Zylinders 2 bewegt und sequenziert.
Man kann auch zwei DNA-Moleküle auf den Zylinder legen, so dass zwei der vier Enden der DNA eines Mitose-Chromosoms mit zwei Enden zweier Poly(A/T)n-Moleküle gleichzeitig ligiert werden.
SEQUENZIERUNG
Nach der Ligation eines Endes des genomischen DNA-Moleküls mit dem a-Ende des Poly(A/T)-Moleküls in der Vertiefung A wird der Motor, welcher den Zylinder dreht, angeschalten. Der Zylinder fängt an, sich zu drehen und bewegt bei dieser Drehung die auf der Mantelfläche liegende DNA, so dass das gesamte DNA-Molekül aus der Vertiefung A über die Mantelfläche des drehenden Zylinders 2 in die Vertiefung B gelangt. Das auf der Mantelfläche bewegte DNA-Molekül befindet sich im Fokus des Sequenzierers, z.B. eines Mikroskops oder Spektroskops und wird bei der Drehung fortlaufend sequenziert. Folglich ist die Sequenz der in die Vertiefung bzw. das Reagenzglas B abgeführten bzw. gelangenden DNA schon bekannt. Die Geschwindigkeit der Drehung und folglich der Sequenzierung ist automatisch regulierbar.
Bei der Drehung des Zylinders 2 bzw. während dieser Drehung wird das auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül mit Verfahren wie z.B. Laser-Scanning-Mikroskopie unter schwacher UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, Raster-Tunnel-Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, NMR-Spektroskopie, Fourier-Infrarot-Anaylse und anderen spektroskopischen Analysen, CD (Circular Dichroism) oder anderen physikalisch-optischen Verfahren sequenziert. Der Sequenzierer kann folglich z.B. ein Laser-Scanning-Mikroskop, ein Elektronenmikroskop usw. sein. Dabei kann die gesamte Sequenzierung automatisch ablaufen.
Der Zylinder besteht z.B. aus Glas; Silizium oder aus einem Metall wie z.B. Gold oder Kupfer. Die Mantelfläche kann gut bzw. präzise oder nicht gut geschliffen sein, konkav oder nicht konkav sein. In das System können auch zwei oder mehrere Zylinder und Sequenzierer zur Überprüfung der Richtigkeit von Daten eingebaut werden.
Die Vertiefung bzw. Reagenzglas B kann z.B. durch eine Scheibe oder Disk mit einer langen spiralförmigen ununterbrochenen Nute für das Ablegen der DNA, einen Stab oder eine lange Platte für das geradlinige Legen, oder einen anderen Zylinder ersetzt werden. In die Vertiefung bzw. Reagenzglas B, Disk, Stab oder lange Platte wird die sequenzierte DNA abgelegt bzw. abgeführt.
Das DNA-Molekül, das aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas A durch die Drehung des Zylinders 2 auf die Mantelfläche dieses Zylinders aufsteigt, wird als „präsequenziert" bezeichnet.
In der 1 ist ein Chromosom 10, welches in ein Gemisch von Protease 11 im Reagenzglas 9 gelegt wird, und eine Pipette 6 mit dem gereinigten chromosomalen DNA-Molekül 7 schematisch dargestellt. Die drei Pfeile vom Reagenzglas 9 zur Pipette 6 bedeuten die Abtrennung und Reinigung des chromosomalen DNA-Moleküls und die Einführung in die Pipette, nachdem die chromosomalen Proteine im Gemisch von Proteasen abgebaut wurden.
In der 2 ist schematisch ein Reagenzglas 9, welches ein genomisches DNA-Molekül 7 oder ein synthetisches Poly (A/T)n-Molekül 4 enthält, ein Glasstab 18 mit dem Substrat 19, an welchem ein kurzes synthetisches Poly(A/T)n-Molekül 27 immobilisiert ist, und eine Pipette 6 mit dem Gemisch 12 von DNA-Ligasen und ATP für die Ligation eines der beiden Enden des Moleküls 4 bzw. 7 mit dem Ende des Moleküls 27 dargestellt.
In den 2a und 2b sind die Möglichkeiten der Immobilisierung des Moleküls 27 an das Substrat 19 gezeigt. In der 2a gezeigt ist ein Fragment eines Substrates von einem DNA-Synthetisierer, an welches das synthetische DNA-Molekül durch ein Sauerstoffatom mit einem Ende immobilisiert ist. Das Substrat in der 2b enthält eine Ni-NTA (Nickel-Nitriloacetische Säure)-Schicht 20, welche mit Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptiden 21 interagiert. Polyhistidin bindet an die Ni-NTA-Schicht und Polylysin bindet an die DNA. So kann auf diesem Substrat ein synthetisches DNA-Molekül 27 immobilisiert werden.
In der 3 ist ein Gerät bzw. das System zur schnellen Genom-Sequenzierung schematisch dargestellt. Das System enthält einen Sequenzierer 1, einen Zylinder 2 und ein Substrat 5 mit Vertiefungen 3A und 3B. Die Pipette 6 führt ein genomisches DNA-Molekül 7 und das Gemisch mit DNA-Ligasen und ATP 12 in die Vertiefung 3A, damit ein Ende des Moleküls 7 mit dem Ende des Moleküls 4 ligiert wird. Molekül 4 ist an das Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiert und wird durch den Glasstab 18 auf die Mantelfläche des Zylinders 2 gelegt, so dass ein Ende (a-Ende) sich in der Vertiefung A bzw. 3A und das andere b-Ende sich in der Vertiefung B bzw. 3B befindet.
In der 4 sind verschiedene Formen der Substrate 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B dargestellt. Die Ansicht A ist eine Sicht von oben auf das Substrat 5 und die Vertiefungen 3A und 3B und die Ansicht B ist eine Sicht von der Seite im Querschnitt.
In der 5 ist ein Gerät bzw. System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt einen Sequenzierer 1, einen Zylinder 2, ein genomisches DNA-Molekül 7 und ein Substrat 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B. Die Pfeile zeigen die Bewegung des Zylinders 2 und entsprechend des Moleküls 7. Durch die Drehung des Zylinders 2 steigt das Molekül 7 aus der Vertiefung 3A und gelangt über die Mantelfläche des sich drehenden Zylinders 2 in die Vertiefung. Z.B. das auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül 7 befindet sich im Fokus des Sequenzierers 1 und wird durch diesen Sequenzierer sequenziert. Die Sequenz-Daten vom Sequenzierer gelangen in einen Computer und werden gespeichert bzw. verarbeitet. Die Ansicht A ist eine Sicht von vorne und in der 5a ist die Ansicht dieses Systems von oben dargestellt.
In der 6 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt einen Sequenzierer 1, einen Zylinder 2 und Reagenzgläser 3A und 3B, welche durch eine Befestigung 13 befestigt sind. Das genomische DNA-Molekül 7 steigt durch die Drehung des Zylinders 2 aus der Vertiefung A und gelangt durch die Mantelfläche dieses Zylinders in die Vertiefung B. Das auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül wird durch Sequenzierer 1 sequenziert.
Man kann die Bewegung des sequenzierten DNA-Moleküls folglich schematisch darstellen:
3A → Sequenzierer 1 → 3B
Um das auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bzw. der Rolle 2 liegende DNA-Molekül zu stabilisieren, kann der Zylinder 2 entweder nicht leicht zu bewegen sein (bezogen auf das liegende DNA-Molekül), oder er kann sich nur in einer Richtung drehen, und zwar so, dass das DNA-Molekül 7 nur aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A in 3B gelangen kann. Außerdem kann das lange in der Vertiefung 3B liegende Molekül 4 als Gegengewicht zu dem in der Vertiefung 3A liegenden Molekül 7 dienen.
Die Ansicht A in 6 ist die Sicht des Systems von vorne. Ansicht 6a ist die Sicht dieses Systems von der Seite. Schematisch ist auch dargestellt, wie ein Reagenzglas A unter den Zylinder 2 gestellt und durch ein Befestigungssystem 13 befestigt werden kann.
In der 7 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt drei verschiedene bzw. voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2 und Reagenzgläser 3A und 3B, die durch Befestigungen 13 befestigt sind. Zwei Zylinder 2 drehen sich mit der gleichen Geschwindigkeit und durch die Drehung wird das genomische DNA-Molekül 7 aus dem Reagenzglas 3A über die beiden Mantelflächen der beiden sich drehenden Zylinder 2 in das Reagenzglas 3B bewegt. Während der Bewegung des Moleküls 7 über die und zwischen den zwei Mantelflächen wird dieses Molekül durch z.B. drei voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, b und c sequenziert. Somit kann die Richtigkeit der Daten überprüft werden.
In der 8 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt den Sequenzierer 1, den Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit dem genomischen DNA-Molekül 7 und eine Scheibe oder Disk 14, welche durch den Motor 8 gedreht wird. In diesem System wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch einen Disk 14 ersetzt. Die sequenzierte DNA wird auf die Oberfläche des Disks 14 bzw. auf seinen spiralförmigen langen und ununterbrochenen Nut spiralförmig gelegt.
In der 9 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt den Sequenzierer 1, den Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit dem genomischen DNA-Molekül 7 und eine lange Platte bzw. ein Lineal 15. In diesem System wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch eine lange Platte bzw. ein Lineal 15 ersetzt. Die sequenzierte DNA wird auf die Oberfläche der Platte bzw. des Lineals 15 ununterbrochenen geradlinig abgelegt. Die Ansicht A ist eine Sicht von der Seite. Die Pfeile zeigen die Richtung der Bewegung von Lineal 15.
In der 10 ist das System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt den Sequenzierer 1, den Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit dem genomischen DNA-Molekül 7 und einen Stab bzw. Zylinder 17. Jedes im System sequenzierte DNA-Molekül 7 ist durch ein Ende an das Ende des synthetischen Moleküls 4 ligiert. Dabei dient Molekül 4 als eine Verbindung zwischen dem operierenden bzw. sequenzierenden System bzw. Gerät und einem genomischen DNA-Molekül 7. Im System der 10 wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch den Stab bzw. den Zylinder 17 ersetzt. Die sequenzierte DNA wird um die Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt. Die Ansicht A ist eine Sicht von der Seite. Molekül 7 ist mit einem Molekül 4 verbunden; dieses ist an der Ni-NTA-Schicht 20 durch Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptide immobilisiert.
In der 11 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit dem genomischen DNA-Molekül 7 und die Scheibe oder Disk 14, welche durch den Motor 8 gedreht wird. In diesem System ist die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch Disk 14 ersetzt.
In der 12 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, die Vertiefung 3A mit verschiedenen Kapazitäten a und b, die eine Lösung mit einem genomischen DNA-Molekül 7 enthalten und eine Scheibe oder Disk 14, welche durch den Motor 8 gedreht wird. In diesem System wird das Reagenzglas 3A durch Vertiefungen 3A und das Reagenzglas 3B durch Disk 14 ersetzt.
In der 13 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, das Reagenzglas bzw. die Vertiefung 3A mit verschiedenen Kapazitäten a, b und c, und eine lange Platte bzw. ein Lineal 15. Das genomische DNA-Molekül 7, das durch die Drehung der Zylinder 2 aus dem Reagenzglas bzw. Vertiefung 3A steigt und über die Mantelfläche der Zylinder 2 bewegt wird, wird nach der Sequenzierung auf die lange Platte bzw. auf ihrer langen Nut geradlinig abgelegt.
In der 14 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, das Reagenzglas bzw. die Vertiefung 3A mit verschiedenen Kapazitäten a, b und c, und einen langen Stab bzw. Zylinder 17. Das sequenzierte genomische DNA-Molekül 7 wird um die Mantelfläche des sich drehenden Stabes bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt.
In der 15 ist ein System zur schnellen Genom-Sequenzierung dargestellt. Das System umfaßt den Sequenzierer 1, den Zylinder 2, ein langes, dünnes metallisches Rohr 22, dessen eines Ende durch den Deckel 26 verschlossen wird, eine lange Platte bzw. ein Lineal 15 mit einem langen Nut 16 und einen Glasstab 18 mit einem Substrat 19, das sich im Nut 16 bewegen kann. Die zweite Ansicht der 15 zeigt die lange Platte bzw. Lineal 15 und den Nut 16 für das Substrat 19 von vorne. Das genomische DNA-Molekül 7 befindet sich im Rohr 22 und ist mit einem Ende an das Substrat 19 immobilisiert. Während der Zentrifugation des Rohres 22 wird das Molekül 7 in diesem Rohr linearisiert. Danach wird es durch den Glasstab 18 und den Zylinder 2 aus dem Rohr 22 gezogen, während der Bewegung über die Mantelfläche des sich drehenden Zylinders 2 durch den Sequenzierer 1 sequenziert und auf den langen Nut 16 der langen Platte bzw. Lineals 15 geradlinig abgelegt.
In der 16 ist das System zur Zentrifugation des Rohrs 22 schematisch dargestellt. Das System umfaßt eine Walze 25 mit den Befestigungen 23 und 24 für den Glasstab 18 und für das Rohr 22, welches mit dem Deckel 26 an einem Ende verschlossen ist. Das andere Ende des Rohrs 22 ist durch das Substrat 19 des Glasstabes 18 geschlossen. Die Befestigung 24 stabilisiert die Lage des Rohrs 22, in welchem ein genomisches DNA-Molekül 7 zentrifugiert und dabei linearisiert wird.
Ein Mitose-, Telophase- oder Interphase-Chromosom 10, welches schematisch in der 1 dargestellt ist, wird in das Gemisch von Proteasen 11 gelegt. Dabei werden die chromosomalen Proteine zersetzt und das DNA-Molekül wird entfaltet und entschraubt. Danach wird das DNA-Molekül 7 abgetrennt, d.h. isoliert, gereinigt und in eine Pipette 6 eingeführt.
Ein Ende des DNA-Moleküls 7 oder eines synthetischen Moleküls 4, welche schematisch in der 2 dargestellt sind, wird mit dem Ende des kurzen synthetischen Moleküls 27, das an dem Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiert ist, durch DNA-Ligasen z.B. T4-Ligase und ATP ligiert. So kann man durch den Glasstab 18 das Molekül 4 manipulieren, wie z.B. auf die Mantelfläche des Zylinders 2 ablegen (3), und zwar so, dass ein Ende (a-Ende) sich in der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A und das andere b-Ende entweder am Substrat 19 immobilisiert bleibt, oder durch eine Säure vom Substrat 19 getrennt wird und sich in der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A befindet. Danach führt man das gereinigte genomische DNA-Molekül 7 in die Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A und gibt dazu ein Gemisch 12 von T4-Ligase und ATP. Dabei wird eines der beiden Enden des genomischen Moleküls 7 mit dem a-Ende des synthetischen Moleküls 4 ligiert.
Der Zylinder 2 fängt an, sich zu drehen und durch diese Drehung gelangt das Molekül 7 aus der Vertiefung 3A in die Vertiefung 3B. Während der Bewegung über und mit der Mantelfläche wird das DNA-Molekül 7 durch den Sequenzierer 1 sequenziert.
Die Vertiefungen 3A und 3B befinden sich im Substrat 5. In der 4 sind verschiedene Formen der Vertiefungen im Substrat 5 dargestellt. Je nach der Form haben die Vertiefungen entsprechende Kapazitäten.
Das Substrat 5 in der 5 kann man z.B. am einfachsten herstellen. Das Gerät in der 5 funktioniert ähnlich wie das in der 3. Das synthetische Molekül 4 ist schon vorbereitet, d.h. es ist auf die Mantelfläche des Zylinders 2 so gelegt, dass das a-Ende sich in der Vertiefung 3A und das b-Ende sich in der Vertiefung 3B befindet. Man gibt ein gereinigtes genomisches DNA Molekül 7 in die Vertiefung 3A und danach führt man ein Gemisch 12 von DNA-Ligasen und ATP in die Vertiefung 3A ein. Ein Ende des Moleküls 7 wird mit dem a-Ende des Moleküls 4 ligiert.
Der Zylinder 2 fängt an, sich zu drehen und das sich auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegende DNA-Molekül wird durch den Sequenzierer 1 sequenziert. Die Daten vom Sequenzierer 1 werden in einen Computer geleitet; dort werden sie gespeichert und verarbeitet. Das DNA-Molekül, das aus der Vertiefung 3A gezogen wird bzw. steigt, befindet sich noch vor dem Zeitpunkt der Sequenzierung und deshalb wird dieses Molekül als „präsequenziert" bezeichnet. Das auf der Mantelfläche des sich drehenden Zylinders 2 bewegte DNA-Molekül wird sequenziert, und die in die Vertiefung 3B abgeführte DNA ist schon sequenziert.
Das Gerät der 6 funktioniert ähnlich, wie die Geräte der 3 und 5, aber das Substrat 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B wird durch zwei Reagenzgläser ersetzt.
Beim Gerät der 7 gibt es mehrere Zylinder 2 und Sequenzierer 1. Das Molekül 7 wird durch zwei Zylinder 2 bewegt und durch drei unterschiedliche, voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c sequenziert. Somit kann die Richtigkeit der Daten überprüft werden.
Die in den Figuren dargestellten Systeme bzw. Geräte funktionieren nach einem ähnlichen Prinzip und das Molekül 7 wird nach diesem Prinzip sequenziert.
Beim Gerät der 8 wird das Molekül 7 nach der Sequenzierung durch Sequenzierer 1 nicht einfach abgeführt, sondern auf eine Scheibe oder Disk 14, bzw. auf die lange spiralförmige und ununterbrochene Nut spiralförmig gelegt.
Beim Gerät der 9 wird das Molekül 7 nach der Sequenzierung durch Sequenzierer 1 nicht einfach in eine Vertiefung oder ein Reagenzglas abgeführt, sondern auf eine lange Platte bzw. ein Lineal 15, auf den langen geraden und ununterbrochenen Nut 16 geradlinig abgelegt.
Beim Gerät der 10 wird das Molekül 7 nach der Sequenzierung um die Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 7 spiralförmig abgelegt.
Das Gerät der 11 hat mehrere Sequenzierer und Zylinder. Das Molekül 7 wird durch zwei Zylinder bewegt und durch drei unterschiedliche voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c sequenziert. Die sequenzierte DNA wird auf eine Scheibe oder Disk 14 bzw. auf den langen spiralförmigen und ununterbrochenen Nut spiralförmig abgelegt.
Das Gerät der 12 hat zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c. die sequenzierte DNA wird auch auf eine Scheibe oder Disk 14 abgelegt. Statt eines Reagenzglases enthält das Gerät ein Substrat mit einer Vertiefung, in welche das gereinigte genomische DNA-Molekül 7 für die Sequenzierung gelegt wird.
Das Gerät der 13 hat zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c. Das Molekül 7 wird entweder in ein Reagenzglas oder in eine Vertiefung 3A in einem Substrat 5 für die Sequenzierung gelegt. Die sequenzierte DNA wird auf eine lange Platte oder Lineal 15 bzw. auf den langen geraden und ununterbrochenen Nut 16 geradlinig gelegt.
Beim Ablegen der sequenzierten DNA auf eine Scheibe oder Disk 14, ein Lineal 15 oder spiralförmig um die Mantelfläche eines Stabes bzw. Zylinders 17 bewegen sich diese, d.h. Disk 14 oder Zylinder 17 drehen sich um eine bestimmte Achse, und die lange Platte bzw. das Lineal 15 bewegen sich geradlinig.
Das Gerät der 14 hat auch zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c. Das Molekül 7 wird entweder in ein Reagenzglas oder in eine Vertiefung 3A in einem Substrat 5 für die Sequenzierung gelegt. Die sequenzierte DNA wird um die Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt.
Das Gerät der 15 umfaßt einen Sequenzierer 1 und einen Zylinder 2. Das genomische Molekül 7 wird vor der Sequenzierung durch die Zentrifugation in einem langen dünnen metallischen Rohr 22 linearisiert. Danach wird es aus dem Rohr 22 durch den Zylinder 2 und den Glasstab 18 mit dem Substrat 19, an welchem ein Ende des Molekül 7 immobilisiert ist, herausgezogen. Während der Drehung des Zylinders 2 wird die sich auf der Mantelfläche bewegende DNA 7 durch Sequenzierer 1 sequenziert und dann auf eine lange Platte oder Lineal 15 bzw. auf den langen und geraden Nut 16 geradlinig gelegt.
Das Gerät der 16 ist ein System zur Zentrifugation bzw. Linearisierung des Moleküls 7 im Rohr 22.
Das DNA-Molekül 7 befindet sich im Rohr 22 und ist mit einem Ende an dem Substrat 19 des Glasstabs 18 immobilisiert. Bei der Zentrifugation bzw. Drehung des Rohres 22 wird die DNA 7 durch die ausgeübte Zentrifugalkraft entlang des Rohres in einer Flüssigkeit gezogen bzw. linearisiert. Ein linearisiertes DNA-Molekül 7 ist leichter zu sequenzieren und auf den Nut 16 der langen Platte bzw. des Lineals 15 geradlinig abzulegen.

1: Sequenzierer, z.B. Sonde eines Raster-Tunnel-Mikroskops oder ein Spektroskop
2: Zylinder bzw. Rolle
3A: Vertiefung bzw. Reagenzglas A
3B: Vertiefung bzw. Reagenzglas B
4: Ein synthetisches DNA-Molekül, wie z.B. ein Poly(A/T)n-Molekül
5: Substrat mit einer oder mehreren Vertiefungen
6: Pipette
7: Ein genomisches, z.B. chromosomales DNA-Molekül
8: Motor
9: Reagenzglas
10: Ein Mitose-, Telophase- oder Interphase-Chromosom (schematisch und vergrößert dargestellt)
11: Gemisch mit Proteasen
12: Gemisch mit DNA-Ligasen und ATP
13: Befestigung für Reagenzglas
14: Disk
15: Lange Platte bzw. Lineal
16: Nut auf der Oberfläche des Lineals für das Substrat 19
17: Stab bzw. Zylinder
18: Glasstab
19: Substrat des Glasstabes
20: Ni-NTA-Schicht
21: Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptid-Schicht
22: Langes dünnes metallisches Rohr
23: Befestigung für den Glasstab
24: Befestigung für das Rohr 22
25: Walze bzw. Stab
26: Deckel für ein Ende des Rohrs 22
27: Kurzes auf dem Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiertes Poly(A/T)n-Molekül

Claims

Verfahren zur schnellen Genom-Sequenzierung, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz eines DNA-Moleküls während der geordneten Bewegung über die Mantelfläche eines Zylinders, eines Stabes, eines Rades oder einer Rolle ununterbrochen ohne Fragmentierung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach der Bewegung des DNA-Moleküls von Zylinder, Stab, Rad oder Rolle weg dieses Molekül geordnet auf der Oberfläche der Vertiefung eines Gefäßes, oder auf der Oberfläche einer Scheibe, eines Disks oder einer Platte, oder auf der Mantelfläche eines zweiten Zylinders, eines Stabes, eines Rades oder einer Rolle abgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das DNA-Molekül spiralförmig oder spiralisiert abgelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mantelfläche konkav oder konvex ist.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die Einrichtungen oder Mittel zur geordneten Bewegung eines DNA-Moleküls zur ununterbrochenen Sequenzbestimmung ohne Fragmentierung aufweist.