DE19929530A1

DE19929530A1 - Verfahren und Gerät zur schnelleren Sequenzierung von Genome

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Publication number: DE19929530A1
Application number: DE19929530A
Authority: DE
Inventors: Alexander Cherkasky
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-28
Filing date: 1999-06-28
Publication date: 2001-01-04
Anticipated expiration: 2019-06-29
Also published as: DE19929530B4

Abstract

Die Erfindung betrifft den Bereich Molekularbiologie und Genomik. Zwei prinzipiell verschiedene Sequenzierungsverfahren werden heute praktisch ausnahmslos angewendet. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung ist eine schnellere und billigere Sequenzierung von Genome zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro oder eukaryotischen z. B. eines menschlichen Chromosoms soll z. B. innerhalb eines Montas oder einer Woche gelingen und möglichst automatisch ablaufen. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, dass eine genomische DNA-Sequenz 7 über die Mantelfläche eines Zylinders 2, eines Rads bzw. einer Rolle gedreht bzw. bewegt und während dieser Drehung des Zylinders 2 mit solchen Verfahren wie z. B. Laser-Scanning Mikroskopie, z. B. unter schwacher UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, NMR-Spektroskopie, Fourier-infrarote u. a. spektroskopische Analyse, Elektronenmikroskopie (EM), Raster-Tunnel-Mikroskopie, CD (Circular Dichroism) oder anderen Verfahren sequenziert wird.

Description

Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und Genomik. Zwei prinzipiell verschiedene Sequnzierungsverfahren werden heute praktisch ausnahmslos angewendet.

Das erste Verfahren beruht auf einer basenspezifischen chemischen Spaltung am Ende radioaktiv markierter DNA-Fragmente (Maxam und Gilbert-Me thode). In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen werden die DNA- Fragmente an den 4 Basen partiell basenspezifisch modifiziert. Danach wird die modifizierte Base von der Desoxyribose entfernt und die Phosphordiesterbindung an dieser Stelle im DNA-Rückgrat hydrolysiert. Dia entstandenen Fragmente werden dann auf sehr dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Grösse getrennt. Nach Autoradiographie sind nur die Fragmente sichtbar, die noch ein intaktes Ende besitzen, da die DNA nur dort radioaktiv markiert wurde.

Das zweite, heute wesentlich verbreitete Verfahren basiert auf der enzymatischen Neusynthese der zu sequenzierenden DNA in Gegenwart nukleotidspezifischer Inhibitoren (Sanger-Metode). Ausgehend von einem kurzen Oligonukleotid (Primer) wird in 4 getrennten Ansätzen an der zu sequenzierenden DNA ein DNA-Strang neusynthesiert. Gleichzeitig wird die neusynthetisierte DNA unter Einbau von [³²P] dATP radioaktiv markiert. Jedem Ansatz wird jedoch neben den für die DNA-Synthese notwendige Substraten (dNTP) einer von 4 nukleotidspezifischen Inhibitoren zugesetzt. Hierbei handelt es sich um Didesoxynukleotidtriphosphate (ddNTP), denen nicht nur die 2'-OH- Gruppe, sondern auch die 3'-OH-Gruppe der Ribose fehlt.

Didesoxynukleotidtripliosphate werden ebenso wie Desoxynukleotidtriphospha te von der DNA-Polylnerase als Substrate verwendet. Werden sie jedoch statt eines Desoxynukleotidtriphosphats statistisch in die DNA eingebaut, so kann dieser Stelle die DNA-Kette nicht mehr verlängert werden, da ja die 3'-OH- Gruppe fehlt. In jedem der 4 Reaktionsansätze befindet sich also eine Population von DNA-Molekülen, die zum einen alle radioaktiv markiert sind, die zum anderen alle in Form des Primers ein identisches 5'-Ende tragen, die sich schließlich aber in der Länge bis zum jeweils basenspezifischen 3'-Ende hin unterscheiden. Diese Fragmente werden wiederum auf dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Grösse getrennt und durch Autoradiographie dargestellt.

Der Hauptnachteil dieser Sequenzanalysen besteht im grossen Zeit- und Finanzaufwand.

Vom Anfang an bis zu dem Punkt, wo ein Genom komplett sequeriziert wird, können Jahre und sogar Jahrzehnte dauern, z. B. das "Human Genome Projekt" wurde im Jahre 1973 angefangen und wird voraussichtlich im 2003 beendet.

Die Aufgabe der Erfindung ist eine schnellere und billigere Sequenzierung von Genome zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro- oder eukaryotischen z. B. eines menschlichen Chromosoms soll z. B. innerhalb eines Monats oder einer Woche gelingen und möglichst automatisch ablaufen.

Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, dass eine genomische DNA-Sequenz 7 über die Mantelfläche eines Zylinders, eines Rads bzw. einer Rolle gedreht bzw. bewegt und während dieser Drehung des Zylinders 2 mit solchen Verfahren wie z. B. Laser-Scanning Mikroskopie, z. B. unter schwachen UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, NMR- Spektroskopie, Fourier-infrarote u. a. spektroskopische Analysen, Elektronen- mikroskopie (EM), Raster-Tunnel-Mikroskopie, CD (Circular Dichroism), oder anderen Verfahren sequenziert wird.

VORBEREITUNG a. Reinigung der genomischen z. B. chromosomalen DNA-Sequenz

Die DNA-Sequenz eines aus dem Nukleus isolierten Chromosoms, einer aus der Plasma isolierten Organelle eine virale oder eine bakterielle DNA oder anderer Herkunft wird durch Degradation chromosomaler bzw. organellen Proteine abgesondert und dann z. B. durch Zentrifugation gereinigt.

Um eine Degradation chromosomaler Proteine zu erreichen, wird mindestens ein Chromosom in ein Gemisch von Proteasen gelegt. Das Gemisch von Proteasen enthält z. B. Chymotrypsin, Streptomyces griseus-Protease (Pronase), Aspergillus oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Papain, Bromealin u. a. Proteasen.

Durch diese Protease werden die chromosomalen Proteine zersetzt, wobei die DNA-Sequenz nicht beeinträchtigt und zu einer freien Masse wird. Diese DNA-Sequenz wird z. B. durch Zentrifugation z. B. im Cäsiumchlorid- Gradient oder Gelelektroforese gereinigt.

b. Präparation und Legen syntetischer DNA-Sequenz

Für die Sequenzierung ist eine lange DNA-Sequenz nötig, derer Ende mit einem der zwei oder vier Enden der Chromosomen-DNA ligiert werden muss.

Diese lange synthetische DNA-Sequenz kann z. B. eine Poly( A|T)- Sequenz sein und durch zwei verschiedene Methoden hergestellt werden:

1. dATP + Terminale Transferase → ssDNA Poly A + Terminale Transferase ssDNA Poly A + dTTP + DNA Polymerase → dsDNA Poly( A|T)n + DNA Polymerase,

oder

1. ATP + Polynukleotid-Kinase → RNA Poly A + Polynukleotid-Kinase RNA Poly A + dTTP + Reverse Transcriptase → dsDNA Poly( A|T)n + Reverse Transcriptase.

Diese synthetische Poly( A|T)n Sequenz wird auf die Mantelfläche eines Rads bzw. Zylinders 2 gelegt, so dass ein Ende (a-Ende) der Sequenz sich in der Vertiefung oder in Reagenzglas A und das andere (b-Ende) sich in der Vertiefung oder Reagenzglas B befindet. Auf die Mantelfläche des Zylinders 2 können zwei oder mehrere Poly( A|T)n-Sequenzen gelegt werden, damit sie mit zwei beliebige Enden eines Mitose-Chromosoins ligiert werden können.

Die auf der Mantelfläche liegende DNA-Sequenz befindet sich im Fokus eines Sequenzierers wie z. B. eines Laser-Scanning-Mikroskops, Elektronen, Raster-Tunnel oder eines anderen Mikroskops oder Spektroskopes, welcher über die Mantelfläche des Zylinders 2 befestigt ist.

c. Ligation von einem Ende der Chromosomglen DNA mit dem A-Ende der Poly( A|T)-Sequenz

Die gereinigte genomische bzw. chromosomale DNA-Sequenz wird in die Vertiefung oder Reagenzglas A z. B. durch eine Pipette gelegt. Danach gibt man einen Gemisch mit DNA-Ligasen z. B. T4 Ligasen und ATP in die Vertiefung A, damit das a-Ende mit einem der beiden Enden von der genomischen bzw. chromosomalen DNA-Sequenz ligiert wird.

Das Reagenzglas bzw. sein Inhalt wird erwärmt und geschüttelt um die Reaktion bzw. Ligation zu beschleunigen. Nach der Ligation von einem Ende einer cbromosomolen DNA-Sequenz (genormt Chrom DNA 1 oder einfach 1) mit dem a-Ende der Poly( A|T)-Sequenz in der Vertiefung A oder Reagenz glas A kann eine chromosomale DNA-Sequenz von einem anderen Chromosom (genannt Chrom DNA 2 oder einfach 2) in die Vertiefung A für die Ligation mit der DNA 1 bzw. von einem Ende der DNA 1 mit einem der beiden Enden von der DNA 2, zugegeben werden, damit die Sequenzierung des gesamten Genoms ununterbrochen verlaufen kann.

Da die T4-Ligasen schon seit der ersten Ligation in der Vertiefung oder im Reagenzglas A geblieben bzw. vorhanden sind, wird ein der beiden Enden von der DNA 2 mit dem Ende der DNA 1 unter Zugabe von ATP ligiert.

In die Vertiefung A kann eine gereinigt dritte chromosomale DNA- Sequenz (Chrom DNA 3, DNA 3 oder einfach 3) für die Ligation vom einem Ende der DNA 2 gelegt werden.

Man kann die Reaktionen, die dabei in der Vertiefung oder Reagenzglas geschehen, so schematisch darstellen:

1. DNA 1 (oder einfach 1) + Poly( A|T)n + T4-Ligasen + ATP → → DNA 1 Poly( A|T)n + T4 + Phosphate.
Das Produkt ist also DNA 1 Poly( A|T)n oder vereinfacht 1 Poly A. 2. 1 Poly A + 2 (d. h. Chrom DNA 2) + ATP → 21 Poly A
2. 21 Poly A + 3 (+ ATP in geringen Konzenzentrationen) → 321 Poly A
3. 321 Poly A A + 4 → 4321 Poly A usw.

1, 2, 3 und 4 sind gereinigte DNA Sequenzen der beliebigen Chromosomen 1, 2, 3 und 4.

Es ist ungünstig alle gereinigten chromosomalen DNA-Sequenzen in einem Reagenzglas durch eine Ligase-Ketten Reaktion (Ligase Chain Reaction LCR) bzw. durch T4-Ligasen unter Zugabe von ATP zu ligieren, weil die sog. Makrozyklen bzw. grosse Plasmide gebildet werden können. Solche Plasmide sind lange zirkuläre DNA-Sequenzen, die mehrere chromosomale DNA- Sequenzen enthalten und können nicht mit dem Ende der Poly( A|T)n-Sequenz ligiert werden. Folglich werden sie nicht durch die Mantelfläche des Zylinders 2 bewegt und sequenziert.

Man kann zwei Sequenzen auf das Zylinder legen, sodass zwei der vier Enden der DNA eines Mitosechromosoms mit zwei Enden der Poly( A|T)n- Sequenz ligiert werden.

SEQUENZIERUNG

Nach der Ligation von einem Enden der genomischen DNA mit dem a- Ende der Poly( A|T)n-Sequenz in der Vertiefung A wird der Motor, welcher den Zylinder dreht, angeschalten. Das Zylinder fängt an zu drehen und bewegt bei dieser Drehung die auf der Mantelfläche liegende DNA, so dass die gesamte DNA-Sequenz aus der Vertiefung A über die Mantelfläche des drehenden Zylinders 2 in die Vertiefung B gelangt. Die auf der Mantelfläche bewegende DNA-Sequenz befindet sich im Fokus des Sequenzierers z. B. eines Mikroskopes oder Spektroskopes und wird bei der Drehung sequenziert. Folglich ist die Sequenz der in die Vertiefung bzw. Reagenzglas B abgeführten bzw. gelangenden DNA schon bekannt. Die Geschwindigkeit der Drehung und folglich der Sequenzierung ist automatisch regulierbar.

Bei der Drehung des Zylinders 2 bzw. während dieser Drehung wird die auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegende DNA-Sequenz mit solchen Verfahren wie z. B. Laser-Scanning-Mikroskopie unter schwachen UV- Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, Raster-Tunnel- Mikroskopie, Elektronemnikroskopie, NMR-Spektroskopie, fourier-infrarote u. a. spektroskopische Analysen, CD (Circular Dichroism) oder anderen Verfahren sequenziert. Der Sequenzierer kann folglich z. B. ein Laser- Scanning-Mikroskop, ein Elektronenmikroskop usw. sein. Dabei kann die gesamte Sequenzierung automatisch ablaufen.

Das Zylinder besteht z. B. aus Glas, Silizium oder aus einem Metall wie z. B. Gold oder Kupfer. Die Mantelfläche kann gut bzw. präzise oder nicht gut geschleift werden, konkav oder nicht konkav sein.

In das System können auch zwei oder mehrere Zylinder und Sequenzierer Überprüfung der Richtigkeit von Daten eingebaut werden. Die Vertiefung bzw. Reagenzglas B kann z. B. durch einen Disk mit einer langen spiralförmigen ununterbrochene Nute für das Legen der DNA, einen Stab einer langen Platte für das geradlinige Legen oder ein anderes Zylinder ersetzt werden. In die Vertiefung bzw. Reagenzglas B, Disk, Stab oder langen Platte wird die sequenzierte DNA gelegt bzw. abgeführt.

Die DNA-Sequenz die aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas A durch die Drehung des Zylinders 2 auf die Mantelfläche dieses Zylinders aufsteigt, habe ich präsequenziert bezeichnet.

In der Fig. 1 ist ein Chromosom 10, welches in ein Gemisch von Protease 11 im Reagenzglas 9 gelegt wird, und Pipette 6 mit der gereinigten chromosomalen DNA-Sequenz 7 schematisch dargestellt. Die drei Pfeile vom Reagenzglas 9 zur Pipette 6 bedeuten die Absonderung Reinigung der chromosomalen DNA-Sequenz und Einführung in die Pipette, nachdem die chromosomalen Proteine im Gemisch von Proteasen degradiert werden.

In der Fig. 2 ist schematisch ein Reagenzglas 9, welches eine genomische DNA-Sequenz 7 oder eine synthetische Poly( A|T)n-Sequenz 4 enthält, ein Glasstab 18 mit dem Substrat 19, an welchem eine kurze synthetische Poly( A|T)n- Sequenz 27 immobilisiert ist, und eine Pipette 6 mit dem Gemisch 12 von DNA-Ligasen und ATP für die Ligation von einem der beiden Enden von der Sequenz 4 bzw. 7 mit dem Ende der Sequenz 27 dargestellt.

In den Fig. 2A und 2B sind die Möglichkeiten der Immobilisierung der Sequenz 27 an den Substrat 19 in der Fig. 2A ist ein Fragment eines Substrates von einem DNA-Synthetisierer, an welchen die synthetische DNA- Sequenz durch ein Sauerstoffatom mit einem Ende an den Substrat immobilisiert ist. Der Substrat in der Fig. 2B enthält einen Ni-NTA (Nickel-Nitrillo- acetische Säure(acid))-Schicht 20, welcher mit den Polyhistidin-Polylysin- Fusionspeptide 21 interagiert. Polyhistidin bindet sich an Ni-NTA Schicht und Polylisin bindet sich an DNA. So kann auf diesem Substrat eine synthetische DNA-Sequenz 27 immobilisiert werden.

In der Fig. 3 ist ein Gerät bzw. das System zur schnelleren Sequenzierung von Genome schematisch dargestellt. Das System enthält ein Sequenzierer 1, ein Zylinder 2 und ein Substrat 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B. Die Pipette 6 führt eine genomische DNA-Sequenz 7 und das Gemisch mit DNA-Ligasen und ATP 12 in die Vertiefung 3A damit ein Ende der Sequenz 7 mit dem Ende der Sequenz 4 eigiert wird. Die Sequenz 4 ist an den Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiert und wird durch das Glasstab 18 auf die Mantelfläche des Zylinders 2 gelegt, so dass ein Ende (a-Ende) sich in der Vertiefung A bzw. 3A und das andere b-Ende sich in der Vertiefung B befindet.

In der Fig. 4 sind verschiedene Formen der Substrate 5 mit den Vertiefun gen 3A und 3B dargestellt. Der Sicht A ist ein Sicht von oben auf das Substrat 5 und die Vertiefungen 3A und 3B und der Sicht B ist ein Sicht von der Seite im Durchschnitt.

In der Fig. 5 ist ein Gerät bzw. System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält ein Sequenzierer 1, ein Zylinder 2, eine genomische DNA-Sequenz 7 und ein Substrat 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B. Die Pfeile zeigen die Bewegung des Zylinders 2 und entsprechend der Sequenz 7. Durch die Drehung des Zylinders 2 steigt die Sequenz 7 aus der Vertiefung 3A und gelangt über die Mantelfläche des drehenden Zylinders 2 in die Vertiefung z. B. die auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegende DNA- Sequenz 7 befindet sich im Fokus des Sequenzierers 1 und wird durch diesen Sequenzierer sequenziert. Die Sequenz-Daten vom Sequenzierer gelangen in ein Computer und werden gespeichert bzw. verarbeitet. Der Sicht A ist ein Sicht von vorne und in der Fig. 5A ist der dieses Systems von oben dargestellt.

In der Fig. 6 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält ein Sequenzierer 1, ein Zylinder 2 und Reagenzgläser 3A und 3B, welche durch Befestigung 13 befestigt sind. Die genomische DNA-Sequenz 7 steigt durch die Drehung des Zylinders 2 aus der Vertiefung A und gelangt durch die Mantelfläche dieses Zylinders in die Vertiefung B. Die auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegende DNA- Sequenz wird durch Sequenzierer 1 sequenziert.

Man kann die Bewegung der sequenzierenden DNA-Sequenz folglich schematisch darstellen:

3A → Sequenzierung 1 → 3B.

Um die auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bzw. der Rolle 2 liegende DNA- Sequenz zu stabilisieren, kann das Zylinder 2 entweder nicht leicht zu bewegen sein (bezogen auf die liegende DNA-Sequenz), oder er kann sich nur in ein Richtung drehen, und zwar so, dass die DNA-Sequenz 7 nur aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A in die 3B gelangen kann. Außerdem kann die lange in der Vertiefung 3B liegende Sequenz 4 als Gegengewicht zur in der Vertiefung 3A liegenden Sequenz 7 dienen.

Der Sicht A ist der Sicht des Systems von vorne. Der Sicht ist der Sicht dieses Systems von der Seite. Schematisch ist auch dargestellt, wie ein Reagenzglas A unter dem Zylinder 2 gestellt und durch ein Befestigungssystem 13 befestigt werden kann.

In der Fig. 7 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2 und Reagenzgläser 3A und 3B, die durch Befestigungen 13 befestigt sind. Zwei Zylinder 2 drehen sich mit der gleichen Geschwindigkeit und durch die Drehung wird die genomische DNA- Sequenz 7 aus dem Reagenzglas 3A über die beiden Mantelflächen der beiden drehenden Zylinder 2 in das Reagenzglas 3B bewegt. Während der Bewegung der Sequenz 7 über die und zwischen den zwei Mantelflächen, wird diese Sequenz durch z. B. drei von einander unabhängigen Sequenzierer 1a, b und c sequenziert. Somit kann die Richtigkeit der Daten überprüft werden.

In der Fig. 8 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält den Sequenzierer 1, das Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit der genomischen DNA-Sequenz 7 und ein Disk 14, welches durch den Motor 8 gedreht wird. In diesem System wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch ein Disk 14 ersetzt. Dia sequenzierte DNA wird auf die Oberfläche des Disks 14 bzw. auf seinen spiralförmigen langen und ununterbrochenen Nut spiralförmig gelegt.

In der Fig. 9 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält den Sequenzierer 1, das Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit der genomischen DNA-Sequenz 7 und eine lange Platte bzw. Lineal 15. In diesem System wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch eine lange Platte bzw. Lineal 15 ersetzt. Die sequenzierte DNA wird auf die Oberfläche des Lineals 15 bzw. auf seinen geradlinigen und ununterbrochenen geradlinig gelegt. Der Sicht A ist ein Sicht vom der Seite. Die Pfeile zeigen die Richtung der Bewegung vom Lineal 15.

In der Fig. 10 ist das System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält den Sequenzierer 1, das Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit der genomischen DNA-Sequenz 7 und einen Stab bzw. Zylinder 17.

Jede im System sequenzierende DNA-Sequenz 7 ist durch ein Ende mit dem Ende der synthetischen Sequenz 4 ligiert. Dabei dient die Sequenz 4 als eine Verbindung zwischen dem operierenden bzw. sequenzierenden System bzw. Gerät und einer genomischen DNA-Sequenz 7.

In diesem System wird die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch den Stab bzw. das Zylinder 17 ersetzt. Die sequenzierte DNA wird um Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt. Der Sicht A ist ein Sicht von der Seite. Die Sequenz 7 ist mit einer Sequenz 4 verbinden; dieser ist an dem Ni-NTA-Schicht 20 durch Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptide immobilisiert.

In der Fig. 11 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, das Reagenzglas 3A mit der genomischen DNA-Sequenz 7 und das Disk 14, welches durch den Motor 8 gedreht wird. In diesem System ist die Vertiefung bzw. das Reagenzglas 3B durch den Disk 14 ersetzt.

In der Fig. 12 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, die Vertiefung 3A mit verschiedenen Kapazitäten a und b, die eine Lösung mit einer genomischer DNA-Sequenz 7 enthalten und ein Disk 14 welcher durch den Motor 8 gedreht wird. In diesem System wird das Reagenzglas 3A durch Vertiefungen 3A und das Reagenzglas 3B durch einen Disk 14 ersetzt.

In der Fig. 13 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, das Reagenzglas bzw. die Vertiefung 3A mit verschiedenen Kapazitäten a, b und c, und die lange Platte bzw. Lineal 15. Die genomische DNA-Sequenz 7, die durch die Drehung der Zylinder 2 aus den Reagenzglas bzw. Vertiefung 3A steigt und über die Mantelfläche der Zylinder 2 bewegt wird, wird nach der Sequenzierung auf die lange Platte bzw. auf ihr langen Nut geradlinig gelegt.

In der Fig. 14 ist ein System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält drei verschiedene bzw. von einander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c, zwei Zylinder 2, das Reagenzglas bzw. die Vertiefung 3A mit verschiedenen Kapazitäten a, b und c, und den langen Stab bzw. Zylinder 17. Die sequenzierte genomische DNA-Sequenz 7 wird um die Mantelfläche des drehenden Stabs bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt.

In der Fig. 15 ist des System zur schnelleren Sequenzierung von Genome dargestellt. Das System enthält den Sequenzierer 11, das Zylinder 2, ein langes, dünnes metallisches Rohr 22, das ein Ende dieses Rohr wird durch den Deckel 26 geschlossen, die lange Platte bzw. Lineal 15 mit einem langen Nut 16 und den Glasstab 18 mit den Substrat 19, der sich im Nut 16 bewegen kann. Der andere Sicht zeigt die lange Platte bzw. Lineal 15 und den Nut 16 für den Substrat 19 von vorne. Die genomische DNA-Sequenz 7 befindet sich im Rohr 22 und ist mit einem Ende in den Substrat 19 immobilisiert. Während der Zentrifugation des Rohres 22 wird die Sequenz 7 in diesem Rohr linearisiert. Danach wird sie durch den Glasstab 18 und das Zylinder 2 aus dem Rohr 22 gezogen, während der Bewegung über die Mantelfläche des drehenden Zylinders 2 durch den Sequenzierer 1 sequenziert Lind auf den langen Nut 16 der langen Platte bzw. Lineals 15 geradlinig gelegt.

In der Fig. 16 ist das System zur Zentrifugation des Rohrs 22 schematisch dargestellt. Das System enthält eine Walze 25 mit den Befestigungen 23 und 24 für den Glasstab 18 und für das Rohr 22, welches mit dem Deckel 26 auf einem Ende geschlossen ist. Das andere Ende des Rohrs 22 ist durch das Substrat 19 des Glasstabes 18 geschlossen. Die Befestigung 24 stabilisiert die Lage des Rohrs 22, in welchem eine genomische DNA-Sequenz (7) zentrifugiert und dabei linearisiert wird.

Ein Metose- bzw. Telophase- oder Interphase-Chromosom 20, welches schematisch in der Fig. 1 dargestellt ist, wird in das Gemisch von Proteasen 11 gelegt. Dabei werden die chromosomalen Proteine zersetzt und die DNA- Sequenz wird entfaltet und entschraubt. Danach wird diese DNA-Sequenz 7 abgesondert d. h. isoliert, gereinigt und in eine Pipette 6 eingeführt.

Ein Ende der DNA-Sequenz 7 oder einer synthetischen Sequenz 4, welche schematisch in der Fig. 2 dargestellt ist, wird mit dem Ende der kurzen synthetischen Sequenz 27, die an dem Substrat 19 des Glasstabes 18 immobilisiert ist, durch DNA-Ligasen z. B. T4-Ligasen und ATP ligiert. So kann man durch den Glasstab 18 die Sequenz 4 manipulieren, wie z. B. auf die Mantelfläche des Zylinders 2 legen (Fig. 3), und zwar so dass ein Ende (A- Ende) sich in der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A und das andere B-Ende entweder am Substrat 19 immobilisiert bleibt, oder durch eine Säure vom Substrat 19 getrennt wird und sich in der Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A befindet. Danach führt man die gereinigte genomische DNA-Sequenz 7 in die Vertiefung bzw. Reagenzglas 3A und gibt dazu einen Gemisch 12 von T4- Ligasen und ATP. Dabei wird eins der beiden Enden der genomischen Sequenz 7 mit dem A-Ende der synthetischen Sequenz 4 ligiert.

Das Zylinder 2 fängt an zu drehen und durch diese Drehung gelangt die Sequenz 7 aus der Vertiefung 3A in die Vertiefung 3B. Während der Bewegung durch die Mantelfläche wird die DNA-Sequenz 7 durch den Sequenzierer 1 sequenziert.

Die Vertiefungen 3A und 3B befinden sich im Substrat 5. In der Fig. 4 sind verschiedene Formen der Vertiefungen im Substrat 5 dargestellt. Je nach der Form haben die Vertiefungen entsprechende Kapazitäten.

Das Substrat 5 in der Fig. 5 kann man z. B. am einfachsten herstellen. Das Gerät in der Fig. 5 funktioniert ähnlich wie das in der Fig. 3. Die synthetische Sequenz 4 ist schon vorbereitet, d. h. sie ist auf die Mantelfläche des Zylinders 2 so gelegt, dass das A-Ende sich in der Vertiefung 3A und das B-Ende sich in der Vertiefung 3B befindet. Man gibt eine gereinigte genomische DNA- Sequenz 7 in die Vertiefung 3A und danach führt man ein Gemisch 12 von DNA- Ligasen und ATP in die Vertiefung 3A ein. Ein Ende der Sequenz 7 wird mit dem A-Ende der Sequenz 4 ligiert.

Das Zylinder 2 fängt an zu drehen und die auf der Mantelfläche des Zylinders 2 bewegende DNA-Sequenz wird durch den Sequenzierer 1 sequenziert.

Die Daten vom Sequenzierer 1 werden in ein Computer geleitet; dort werden sie gespeichert und verarbeitet. Die DNA-Sequenz, die aus der Vertiefung 3A gezogen wird bzw. steigt, befindet sich vor dem Zeitpunkt der Sequenzierung und deshalb habe ich diese Sequenz als präsequenziert bezeichnet. Die auf der Mantelflächen des drehenden Zylinders 2 bewegende DNA-Sequenz wird sequenziert, und die in die Vertiefung 3B abgeführte DNA ist schon sequenziert.

Das Gerät in der Fig. 6 funktioniert ähnlich, wie die in der Fig. 3 und 5, aber das Substrat 5 mit den Vertiefungen 3A und 3B wird durch zwei Reagenzgläser ersetzt.

Beim Gerät in der Fig. 4 gibt es mehrere Zylinder 2 und Sequenzierer 1. Die Sequenz 7 wird durch zwei Zylinder 2 bewegt 5 und durch drei unterschiedliche voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c sequenziert. Somit kann die Richtigkeit der Daten überprüft werden.

Die in den Figuren dargestellte Systeme bzw. Geräte funktionieren nach dem ähnlichen Prinzip und die Sequenz 7 wird nach diesem Prinzip sequenziert.

Beim Gerät in der Fig. 8 wird sie Sequenz 7 nach der Sequenzierung durch Sequenzierer 1 nicht einfach abgeführt, sondern auf einen Disk 14, bzw. auf seinen langen spiralförmigen und ununterbrochenen Nut spiralförmig gelegt.

Beim Gerät in der Fig. 9 wird die Sequenz 7 nach der Sequenzierung durch Sequenzierer 1 nicht einfach in eine Vertiefung oder ein Reagenzglas abgeführt. Sondern auf eine lange Platte bzw. Lineal 15, auf seinen langen geraden und ununterbrochenen Nut 16 geradlinig gelegt.

Beim Gerät in der Fig. 10 wird die Sequenz 7 nach der Sequenzierung um die Mantelfläche des Stabs bzw. Zylinders 7 spiralförmig gelegt.

Das Gerät in der Fig. 11 hat mehrere Sequenzierer und Zylinder. Die Sequenz 7 wird durch zwei Zylinder bewegt und durch drei unterschiedliche voneinander unabhängige Sequenzierer 1a, 1b und 1c sequenziert. Die Sequenzierte DNA wird auf einem Disk 14 bzw. auf seinen langen spiralförmigen und ununterbrochenen Nut spiralförmig gelegt.

Das Gerät in der Fig. 12 hat zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c. Die sequenzierte DNA wird auch auf einen Disk 14 gelegt. Statt einen Reagenzglas enthält das Gerät einen Substrat mit einer Vertiefung in welche die gereinigte genomische DNA-Sequenz 7 für die Sequenzierung gelegt wird.

Das Gerät in der Fig. 13 hat zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c. Die Sequenz 7 wird entweder in ein Reagenzglas oder in eine Vertiefung 3A in einem Substrat 5 für die Sequenzierung gelegt. Die sequenzierte DNA wird auf eine lange Platte oder Lineal 15 bzw. auf seinen langen geraden und ununterbrochenen Nut 16 geradlinig gelegt.

Beim Legen der sequenzierten DNA auf einem Disk 14, ein Lineal 15 oder spiralförmig um die Mantelfläche des Stab bzw. Zylinders 17 bewegen sich diese, d. h. der Disk 14 und das Zylinder 17 drehen sich um eine bestimmte Achse, und die lange Platte bzw. das Lineal 15 bewegt sich geradlinig.

Das Gerät in der Fig. 14 hat auch zwei Zylinder 2 und drei Sequenzierer 1a, 1b und 1c. Die Sequenz 7 wird entweder in ein Reagenzglas oder in eine Vertiefung 3A in einem Substrat 5 für die Sequenzierung gelegt. Die sequenzierte DNA wird um die Mantelfläche des Stabs und bzw. Zylinders 17 spiralförmig gelegt.

Das Gerät in der Fig. 15 enthält ein Sequenzierer 1 und Zylinder 2. Die genomische Sequenz 7 wird vor der Sequenzierung, durch die Zentrifugation in einem langen dünnen metallischen Rohr 22 linearisiert. Danach wird sie aus dem Rohr 22 durch das Zylinder 2 und den Glasstab 18 mit dem Substrat 19, an welchem ein Ende der Sequenz 7 immobilisiert ist, rausgezogen. Während der Drehung des Zylinders 2 wird die auf der Mantelfläche bewegende DNA 7 durch Sequenzierer 1 sequenziert und dann auf eine lange Platte oder Lineal 15 bzw. auf seinen langen und geraden Nut 16 geradlinig gelegt.

Das Gerät in der Fig. 16 ist ein System zur Zentrifugation bzw. Linearisierung der Sequenz 7 im Rohr 22.

Die DNA-Sequenz 7 befindet sich im Rohr 22 und ist mit einem Ende an dem Substrat 19 des Glasstabs 18 immobilisiert. Bei der Zentrifugation bzw. Drehung des Rohr 22 wird die DNA 7 durch die ausgeübte Zentrifugalkraft entlang des Rohres in einer Flüssigkeit gezogen bzw. linearisiert. Eine linearisierte DNA-Sequenz (7) ist leichter zu sequenzieren und auf den Nut 16 der langen Platte bzw. des Lineals 15 geradlinig zu legen.

LISTE DER ZAHLEN

1

Sequenzierer z. B. Sonde eines Raster-Tunnel-Mikroskops oder ein Spektroskop

2

Zylinder bzw. Rolle

3

A Vertiefung bzw. Reagenzglas A

3

B Vertiefung bzw. Reagenzglas B

4

Eine synthetische DNA-Sequenz, wie z. B. Poly(

A|T

)-Sequenz

5

Substrat mit einer oder mehreren Vertiefungen

6

Pipette

7

Eine genomische z. B. chromosomale DNA-Sequenz

8

Motor

9

Reagenzglas

10

Ein Mitose- bzw. Telophase- oder Interphase-Chromosom (schematisch und vergrössert dargestellt)

11

Gemisch mit Proteasen

12

Gemisch mit DNA-Ligasen und ATP

13

Befestigung für Reagenzglas

14

Disk

15

Lange Platte bzw. Lineal

16

Nut auf der Oberfläche des Lineals für das Substrat

19

17

Stab bzw. Zylinder

18

Glasstab

19

Substrat des Glasstabes

20

Ni-NTA Schicht

21

Polyhistidin-Polylysin Fusionspeptid-Schicht

22

Langes dünnes metallisches Rohr

23

Befestigung für das Glasstab

24

Befestigung für das Rohr

22

25

Walze bzw. Stab

26

Deckel für ein Ende des Rohrs

22

27

Kurze auf dem Substrat

19

des Glasstabes

18

immobilisierte Poly(

A|T

)n- Sequenz

Claims

1. Verfahren und Gerät zur schnelleren Sequenzierung von Genome, dadurch gekennzeichnet, dass eine genomische DNA-Sequenz (7) ununterbrochen sequenziert und nicht fragmentiert werden kann.

2. Verfahren und Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische DNA-Sequenz (7) über die Mantelfläche eines Zylinders 2 bewegt und dabei sequenziert wird.

3. Verfahren und Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die auf der Mantelfläche liegende oder bewegende DNA sich im Fokus des Sequenzierers (1) befindet.

4. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-3, dadurch gekennzeichnet, dass die auf der Mantelfläche des Zylinders (2) liegende DNA-Sequenz durch die bzw. Bei der Drehung dieses Zylinders bewegt wird.

5. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mitose bzw. Interphase-Chromosom, derer DNA-Sequenz sequenziert werden muss, in einem Gemisch von Proteasen versetzt wird. Dabei werden chromosomale Proteine degradiert und die DNA wird zu einer freien Masse bzw. entfalten oder entschraubt.

6. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-5, dadurch gekennzeichnet, dass die chromosomale DNA-Sequenz z. B. durch Zentrifugation wie z. B. im Cäsiumchlorid oder durch Gel-Elektrophorese abgesondert und gereinigt wird.

7. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine synthetische DNA-Sequenz z. B. Poly( A|T) auf die Mantelfläche des Zylinders (2) gelegt wird, so dass ein Ende (a-Ende) sich in der Vertiefung oder Reagenzglas A und das andere (b-Ende) sich in der Vertiefung oder Reagenzglas B befindet.

8. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung bzw. Reagenzglas B z. B. durch ein Disk, lange Platte, ein Stab oder Zylinder ersetzt werden kann.

9. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-8, dadurch gekennzeichnet, dass nachdem die DNA-Sequenz sequenziert wird, wird sie entweder in ein Reagenzglas bzw. Vertiefung B abgeführt oder auf die lange ununterbrochene spiralförmige Nute eines Disks spiralförmig gelegt, oder entlang eines Stabs oder Zylinders (2) spiralisiert, oder auf die Nute eines langen Platte geradlinig gelegt.

10. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zylinder, ein Disk oder ein Stab z. B. auf Glas, Silizum oder Metalle, wie z. B. Gold oder Kupfer bestehen.

11. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Poly( A|T)n Sequenz entweder mit d ATP, d TTP, Terminalen, Transferasen und DNA-Polymerasen 1 oder mit ATP, d TTP, Polynucleotid kinasen und Reversen Transcriptasen synthetesiert wird.

12. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-11, dadurch gekennzeichnet, dass die gereinigte genomische DNA-Sequenz (7) z. B. durch eine Pipette in die Vertiefung bzw. Reagenzglas A gelegt wird.

13. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-12, dadurch gekennzeichnet, dass eins der beiden oder vier Enden der gereinigte genomische DNA-Sequenz 7 durch T4 Ligasen unter Zugabe von ATP, in der Vertiefung bzw. Reagenzglas A mit dem a-Ende der Poly( A|T)n Sequenz ligiert wird.

14. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-13, dadurch gekennzeichnet, dass der Motor angeschaltet wird, das Zylinder anfängt zu drehen. Dabei wird die auf der Mantelfläche des Zylinders (2) liegende DNA-Sequenz in Bewegung gebracht bzw. bewegt, so dass bei dieser Bewegung die gesamte DNA- Sequenz aus der Vertiefung bzw. Reagenzglas A über die Mantelfläche des drehenden Zylinders (2) in die Vertiefung bzw. Reagenzglas B, oder auf die Nute des Disks gelangt.

15. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Sequenzierer wie z. B. Laser-Scanning-Mikroskop usw. sich über dem Zylinder befindet und die auf dem Mantelfläche liegende oder bewegende DNA-Sequenz oder Sequenzen befindet sich in seinem Fokus.

16. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-15, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Drehung des Zylinders (2) die auf der Mantelfläche bewegende DNA- Sequenz mit solchen Verfahren wie z. B. Laser-Scanning Mikroskte z. B. unter schwachen UV-Bestrahlung, welche von der DNA absorbiert wird, Raster-, Tunnel-Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, NMR, Spektro skopie, Fourierinfrarote u. a. spektroskopische Analysen-CD, (Circular Dichroism) oder anderen Verfahren sequenziert wird. Der Sequenzierer ist daher ein Laser-Scanning Mikroskop usw.

17. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-16, dadurch gekennzeichnet, dass auf das Zylinder zwei oder mehrere Poly( A|T)n-Sequenzen gelegt werden können, damit zwei Enden einer DNA des Mitose-Chromosoms mit zwei Enden der Poly( A|T)n-Sequenz ligiert werden.

18. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-17, dadurch gekennzeichnet, dass System bzw. das Gerät zur schnelleren Sequenzierung von Genome zwei oder mehrere Zylinder und Sequenzierer z. B. zur Überprüfung der Richtigkeit von Daten besitzen kann.

19. Verfahren und Gerät nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Zylinder, Disk, Stab, lange Platte, sich drehen bzw. bewegen und die Geschwindigkeit dieser Drehung bzw. Bewegung und folglich der Sequenzierung ist automatisch regulierbar.

20. Verfahren und Gerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Proteasen z. B. Chymotrypsin Streptomyces, griseus-Protease (Pronase), Aspergillus oryzae-Protease, Bromelain u. a. Protease enthält.

21. Verfahren und Gerät nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die auf der Mantelfläche bewegende DNA-Sequenz sich im Fokus des Sequenzierers befindet und wird sequenziert.

22. Verfahren und Gerät nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die in die Vertiefung bzw. Reagenzglas B, auf die Nute des Disks usw. gelangende DNA-Sequenz schon sequenziert ist.

23. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-22, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, die aus der Vertiefung bzw. dem Reagenzglas A durch die Drehung des Zylinders (2) auf die Mantelfläche dieses Zylinders aufsteigt, vom Erfinder präsequenziert bezeichnet wird.

24. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-23, dadurch gekennzeichnet, dass die Mantelfläche des Zylinders (2) gut oder nicht gut geschleift, konkav oder nicht konkav sein kann.

25. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 2-24, dadurch gekennzeichnet, dass die chromosomolen Proteine im Protease-Gemisch degradiert bzw. versetzt werden, danach die chromosomale DNA-Sequenz entwindet und zu einer freien Masse wird.

26. Verfahren und Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz 7 doppel- oder einzelsträngig sein kann.

27. Verfahren und Gerät nach Ansprüche 1-26, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur schnelleren Sequenzierung von Genome mindestens ein Zylinder (2), ein Sequenzierer (1), eine Vertiefung bzw. Reagenzglas (3A) bzw. (3B), eine Sequenz (4) auf der Mantelfläche des Zylinders (2), eine Sequenz (7) in der Vertiefung bzw. Reagenzglas (3A) u. a. Elemente enthält.