WO2021005801A1 - 接着性細胞の評価方法、プログラム、記録媒体、及び、接着性細胞の評価システム - Google Patents

接着性細胞の評価方法、プログラム、記録媒体、及び、接着性細胞の評価システム Download PDF

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adhesive
adhesive cells
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朗 松下
勲 坂根
遊 廣澤
拓磨 出澤
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オリンパス株式会社
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    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • the disclosure of the present specification relates to an adhesive cell evaluation method, a program, a recording medium, and an adhesive cell evaluation system.
  • Cultured cells are roughly classified into adhesive cells that proliferate while adhering to the culture vessel and floating cells that proliferate while floating in the container. In the evaluation of adherent cells, whether or not the cells are adhered is extremely important information. For example, the time until adhesion to the culture vessel obtained based on this information is effective in evaluating the proliferative ability of the cells. It is known as one of the indicators.
  • Patent Document 1 describes a technique for determining adhesion of adherent cells.
  • Patent Document 1 describes a technique for determining adhesion based on the area of cells when projected onto a culture vessel.
  • an object of one aspect of the present invention is to provide a technique for determining the adhesion of adhesive cells with high accuracy regardless of the cell type.
  • the method for evaluating adhesive cells is to acquire an image of the adhesive cells housed in the culture vessel and at least contact the adhesive cells identified from the image with the culture vessel. It includes determining the adhesion between the adhesive cells and the culture vessel based on the contour shape of the portion.
  • the adhesive cell program acquires an image of the adhesive cells contained in the culture vessel on a computer, and at least contacts the adhesive cells identified from the image with the culture vessel.
  • the process of determining the adhesion between the adhesive cells and the culture vessel is executed based on the contour shape of the portion.
  • the recording medium acquires an image of the adhesive cells housed in the culture vessel on a computer, and at least the outline of the contact portion of the adhesive cells specified from the image with the culture vessel. It is a computer-readable recording medium on which a program for executing a process of determining adhesion between the adhesive cells and the culture vessel based on the shape is recorded.
  • the adhesive cell evaluation system includes an imaging device for imaging adhesive cells housed in a culture vessel and a processor, and the processor acquires an image acquired by the imaging device. Then, at least based on the contour shape of the contact portion of the adhesive cell with the culture vessel specified from the image, the adhesion between the adhesive cell and the culture vessel is determined.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of the evaluation system 1.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the configuration of the image pickup apparatus 10.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the configuration of the control device 30. The configuration of the evaluation system 1 will be described with reference to FIGS. 1 to 3.
  • the evaluation system 1 is a system that acquires an image of the cultured cells while culturing the cultured cells in a controlled environment in the incubator 20 and evaluates the cultured cells based on the images.
  • the cultured cells to be evaluated by the evaluation system 1 are adhesive cells that proliferate in a state of being adhered to the culture vessel.
  • the evaluation system 1 includes imaging devices (imaging device 10a, imaging device 10b, imaging device 10c, imaging device 10d, and thereafter, each of these imaging devices is an imaging device) placed in the incubator 20. 10) and a control device 30 are provided.
  • the control device 30 evaluates the adhesive cells based on the image acquired by the imaging device 10. Further, the control device 30 communicates with the image pickup device 10 and the terminal device (terminal device 40, terminal device 50).
  • the evaluation system 1 may include an incubator 20 and a terminal device.
  • a culture container (culture container 100a, culture container 100b, culture container 100c, culture container 100d. After that, each of these culture containers is cultured on the imaging device 10 housed in the incubator 20. Container 100) is placed.
  • the culture vessel 100 is not particularly limited, and is, for example, a petridesh, a flask, a microplate, or the like.
  • the culture container 100 contains at least one adhesive cell. More specifically, as shown in FIG. 2, the culture vessel 100 contains cells C, which are adhesive cells, together with the medium M.
  • the medium M is a solution containing, for example, calf serum
  • the cell C is, for example, a chondrocyte.
  • the cell C is not limited to chondrocytes as long as it is an adhesive cell, and generally includes epithelial cells, stromal cells, established cells, cancer cells, and the like.
  • some cells of the blood cell lineage such as dendritic cells, have a period of needing a scaffold depending on the stage of differentiation. Such cells that temporarily require a scaffold may also be classified as adhesive cells.
  • the imaging device 10 acquires an image of the adhesive cells by imaging the adhesive cells contained in the culture container 100. Further, the image pickup device 10 has a wireless communication module (not shown). The imaging device 10 transmits the acquired image of the adhesive cells to the control device 30 by wireless communication using a wireless communication module.
  • the imaging device 10 includes a housing 11 and a stage 12 on which the culture container 100 is placed.
  • the image pickup apparatus 10 further includes an image pickup unit 13 and a scanning mechanism 16 for moving the image pickup unit 13 below the stage 12 and inside the housing 11.
  • the image pickup unit 13 is provided with an image pickup element 14, a light source 15, an optical system (not shown), and the like.
  • the image sensor 14 is, for example, a CCD (Charge-Coupled Device) image sensor, a CMOS (Complementary MOS) image sensor, or the like.
  • the light source 15 is, for example, a light emitting diode (LED) or the like, and illuminates the culture vessel 100 from below the stage 12. As shown in FIG. 2, the light source 15 may be arranged around the image pickup device 14. In the image pickup apparatus 10, the light emitted from the light source 15 passes through the bottom surface of the culture container 100, and a part of the light reflected on the upper surface of the culture container 100 passes through the cells C in the culture container 100.
  • the optical system forms an optical image of the cells C on the image pickup device 14 by using the light transmitted through the cells C in the culture vessel 100.
  • the scanning mechanism 16 includes a drive source such as a motor, and moves the image pickup unit 13 in a direction (XY direction) orthogonal to the optical axis of the optical system.
  • the scanning mechanism 16 moves the image pickup unit 13 in the XY directions, so that the image pickup apparatus 10 can change the range of the image pickup target.
  • the scanning mechanism 16 may further move the image pickup unit 13 in the optical axis direction (Z direction) of the optical system, and the image pickup device 10 may adjust the focus position by using the scanning mechanism 16. Further, the image pickup apparatus 10 may adjust the focus position by moving at least one of the lenses included in the optical system in the optical axis direction.
  • the control device 30 is a computer that controls the evaluation system 1. As shown in FIG. 3, the control device 30 includes a processor 31, a memory 32, an auxiliary storage device 33, an I / O interface 34, a medium drive device 35 for driving the portable storage medium 38, and a communication module 36. And equipped with a bus 37.
  • the auxiliary storage device 33 and the portable storage medium 38 are examples of non-transient computer-readable recording media that store programs, respectively.
  • the processor 31 is an arbitrary processing circuit including, for example, a CPU (Central Processing Unit), a GPU (Graphics Processing Unit), and the like.
  • the processor 31 expands the program stored in the auxiliary storage device 33 or the portable storage medium 38 into the memory 32, and then executes the programmed process, for example, various processes described later.
  • the memory 32 is, for example, an arbitrary semiconductor memory such as a RAM (RandomAccessMemory).
  • the memory 32 functions as a work memory for storing the program or data stored in the auxiliary storage device 33 or the portable storage medium 38 when the program is executed.
  • the auxiliary storage device 33 is, for example, a non-volatile memory such as a hard disk or a flash memory.
  • the auxiliary storage device 33 is mainly used for storing various data and programs.
  • the medium drive device 35 accommodates a portable storage medium 38 such as an optical disk and a compact flash (registered trademark).
  • the medium driving device 35 can output the data stored in the memory 32 or the auxiliary storage device 33 to the portable storage medium 38, and can read programs, data, and the like from the portable storage medium 38.
  • the portable storage medium 38 is an arbitrary storage medium that can be carried around.
  • the portable storage medium 38 includes, for example, an SD card, a USB (Universal Serial Bus) flash memory, a CD (Compact Disc), a DVD (Digital Versatile Disc), and the like.
  • the I / O (Input / Output) interface 34 is, for example, a USB (Universal Serial Bus) interface circuit, an HDMI (registered trademark) (High-Definition Multimedia Interface) circuit, or the like.
  • a USB Universal Serial Bus
  • HDMI registered trademark
  • an input device keyboard, mouse, etc.
  • an output device display, printer, etc.
  • the communication module 36 is, for example, a wireless communication module.
  • the wireless communication standard is not particularly limited, but may be, for example, Bluetooth (registered trademark) Low Energy (hereinafter referred to as BLE), Wi-Fi (registered trademark), or the like. Further, the communication module 36 may be a module for wired communication.
  • the control device 30 communicates with the image pickup device 10 and the terminal device using the communication module 36.
  • the bus 37 connects the processor 31, the memory 32, the auxiliary storage device 33, and the like to each other so that data can be exchanged.
  • the control device 30 may be integrated with the image pickup device 10.
  • the communication between the control device 30 and the imaging device 10 is a wired system.
  • the configuration shown in FIG. 3 is an example of the hardware configuration of the control device 30.
  • the control device 30 is not limited to this configuration.
  • the control device 30 may be a general-purpose device or a dedicated device.
  • the control device 30 may include, for example, a specially designed electric circuit, for example, an ASIC (Application Specific Integrated Circuit) or the like. Further, the control device 30 may be configured by using an FPGA (Field-Programmable Gate Array).
  • the terminal device 40 is a notebook computer.
  • the terminal device 50 is a tablet computer.
  • the terminal device has a display (display 41, display 51) which is a display unit, and displays an image of adhesive cells received from the control device 30, an evaluation result, and the like on the display.
  • the terminal device may include a display unit, and may be, for example, a desktop computer or a smartphone. The user can observe the adhesive cells and confirm the evaluation result by accessing the evaluation system 1 using the terminal device.
  • the adhesion of the cells C is determined based on the image of the cells C acquired by the imaging device 10.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the bonding process.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the shape of the contact portion of the cells in the unadhered state.
  • 6A to 6C and 7 are diagrams illustrating the shape of the contact portion of the cells in the adhered state.
  • the images P1 to P5 shown in FIGS. 5, 6A to 6C, and 7 are photographs showing the respective cell states.
  • adhesion process changes in cell shape in the process from seeding to adhesion (hereinafter, simply referred to as adhesion process), more precisely, changes in cell contour shape will be described. Further, a method of determining adhesion in the evaluation system 1 will be described.
  • the shape of the submerged cell C can be regarded as a spherical shape.
  • the contour shape of the cell C can be regarded as a spherical shape.
  • the contour shape of the contact portion (hereinafter, simply referred to as the contact portion) CA of the cell C with the culture vessel 100 as viewed from the bottom surface B side is a circular shape as shown in FIG. This is because the cells C have not yet adhered to the culture vessel 100 and are in a so-called unadhered state. In the unbonded state, an unbalanced stress that breaks the circular shape of the contact portion CA does not work between the cell C and the culture vessel 100 (bottom surface B).
  • the cell C adheres to the bottom surface B (culture container 100).
  • the cells C spread and collapse along the bottom surface B, as shown in FIGS. 4 (c) and 4 (d).
  • a non-isotropic biased stress acts between the cells C and the bottom surface B. Therefore, in most cases, the contour shape of the contact portion CA is different from the unbonded state and different from the circular shape.
  • the contour shape of the contact portion CA is, for example, an elliptical shape as shown in FIG. 6A, a polygonal shape as shown in FIG. 6B, a shape in which the pseudopodia is extended as shown in FIG. 6C, and the like.
  • Pseudopodia refers to a protruding structure generated in a cell.
  • the contour shape of the contact portion CA between the adhesive cells and the culture vessel 100 can be regarded as a circle in the non-adhesive state, whereas the contour shape deviates from the circular shape in the adhered state. .. Since this change is unavoidable with adhesion, it occurs regardless of the cell type. Utilizing this, the evaluation system 1 makes an adhesion determination based on the contour shape of the contact portion CA. As a result, the evaluation system 1 can determine the adhesion of adhesive cells with high accuracy regardless of the cell type.
  • the contour shape of the contact portion CA may accidentally become circular even in the bonded state due to the stress balance.
  • the adhered state a large stress is generated between the adhesive cells and the culture vessel 100 as compared with the non-adhesed state, so that, for example, as shown in FIG. 7, wrinkles are likely to occur in the contact portion CA. Therefore, if the surface of the adhesive cells such as the contact portion CA has irregularities, it may be determined that the adhesive cells are in an adhesive state.
  • the adhesion determination of the adhesive cells can be performed with higher accuracy.
  • the method for determining the presence or absence of unevenness such as wrinkles is not particularly limited, but there are a method using blob analysis, a method for detecting wrinkles after learning wrinkles by machine learning, and the like.
  • FIG. 8 is a flowchart of the process according to the present embodiment performed by the evaluation system 1.
  • FIG. 9 is a flowchart of the image acquisition process according to the present embodiment.
  • FIG. 10 is a flowchart of the adhesion determination process according to the present embodiment.
  • FIG. 11 is an example of a graph showing the number of unadherent cells and the number of adherent cells over time.
  • FIG. 12 is a flowchart of the evaluation process according to the present embodiment.
  • the method for evaluating adhesive cells performed by the evaluation system 1 will be specifically described with reference to FIGS. 8 to 12.
  • the evaluation method of the adhesive cells performed by the evaluation system 1 includes a culture determination process (step S1), an image acquisition process (step S10), an adhesion determination process (step S20), and a counting process. (Step S30), evaluation process (step S40), and display process (step S50) are included.
  • a case where time-lapse photography is performed will be described as an example.
  • the evaluation system first determines whether or not the cells are being cultured (step S1). If culturing is in progress, the treatments after step S10 are repeated. If it is not in culturing, the process of FIG. 8 is completed.
  • the evaluation system 1 acquires the image used in the adhesion determination process of step S20. Specifically, the imaging device 10 acquires an image of one or more cells C housed in the culture vessel 100 and transmits the image to the control device 30. As a result, the control device 30 acquires an image of one or more cells C.
  • step S10 the evaluation system 1 adjusts the focus position to the bottom surface of the culture vessel 100 to which the cells C can adhere by using, for example, the autofocus function of the imaging device 10, and then acquires an image. May be good. This is because it is possible to obtain an image in which the shape of the contact portion CA can be easily specified.
  • the evaluation system 1 may perform the image acquisition process shown in FIG. 9 in step S10.
  • the evaluation system 1 can obtain an image in which the shape of the contact portion CA can be easily specified even when the image acquisition process shown in FIG. 9 is performed.
  • the evaluation system 1 first acquires a Z-stack image (step S11).
  • the image pickup apparatus 10 moves the focus position at regular intervals in the optical axis direction, and then acquires an image at each position. That is, a plurality of images having different focus positions are acquired.
  • the imaging device 10 transmits the acquired plurality of images to the control device 30.
  • the control device 30 calculates the contrast of each of the plurality of images (step S12).
  • the method of calculating the contrast of the image is not particularly limited, but for example, Brenner Gradient may be adopted.
  • Brenner Gradient is the integral of the square of the difference between the pixel values of neighboring pixels within a predetermined area.
  • the predetermined region to be integrated may be the entire image or the region of interest in the image.
  • control device 30 selects the selected image to be used for the adhesion determination in step S20 based on the contrast of the plurality of images calculated in step S12 (step S13). In step S13, the control device 30 selects, for example, the image having the highest contrast as the selected image.
  • step S20 the evaluation system 1 determines the adhesion between the cell C and the culture vessel 100 based on the contour shape of the contact portion CA identified from the image acquired in step S10. If the image acquisition process shown in FIG. 9 is performed in step S10, the adhesion determination process is performed based on the selected image in step S20. In step S20, adhesion determination processing is performed on each of the plurality of cells C appearing in the image, and the states (adhesion state, non-adhesion state) of the plurality of cells C are determined.
  • step S10 is appropriately performed during cell culture.
  • image acquisition may be performed periodically during cell culture, and additional images may be acquired irregularly.
  • the analysis process including the adhesion determination and evaluation after step S20, which will be described later, may be performed in parallel with the cell culture each time an image is acquired.
  • a series of images acquired during the culture may be collectively analyzed after the culture is completed.
  • the adhesion determination process in step S20 may be performed using machine learning, and in particular, may be performed using deep learning.
  • a trained model is constructed in which the contour shape of the contact portion CA of the cells in the adhered state and the contour shape of the contact portion CA of the cells in the non-adhesive state are learned, and the image acquired in step S10 is input to the trained model.
  • the adhesion determination may be performed.
  • the adhesion may be determined by constructing a trained model in which the shape of the pseudopodia is learned and inputting the image acquired in step S10 into the trained model.
  • the trained model may learn the unevenness of the surface of the cells in the adhered state and the unevenness of the surface of the cells in the non-adhered state. This enables more accurate adhesion determination.
  • the teacher dataset for creating the trained model is the cell image acquired for model creation, the outline shape of the cells in the cell image, and the presence or absence of pseudopodia. It consists of the annotation data determined by.
  • the trained model may be improved as appropriate. Specifically, for example, in order to improve the trained model while using the system 1, the operator may visually perform the adhesion determination and additionally create annotation data, or additionally create annotation.
  • the trained model may be improved by performing additional training using the teacher data including the data.
  • the evaluation system 1 may perform the adhesion determination process shown in FIG. 10 in step S20.
  • the evaluation system 1 first identifies the contour shape of the contact portion CA (step S21).
  • the control device 30 identifies the contour shape of the contact portion CA based on the image acquired in step S10. More specifically, the control device 30 specifies the contour shape of the contact portion CA, for example, by performing contour extraction processing or the like on the image acquired in step S10.
  • the adhesion of a plurality of cells can be determined at one time by performing one process on the image.
  • control device 30 determines the adhesion between the cell C and the culture vessel 100 based on the deviation of the contour shape of the contact portion CA specified in step S21 from the reference shape (steps S22 to S24). This can be regarded as the stress generated when the cells C are adhered to the culture vessel 100 when the contour shape of the contact portion CA deviates greatly from the reference shape. This is because it can be determined that the cells C are adhered to the culture vessel 100.
  • the reference shape is a circle.
  • the control device 30 first calculates the roundness based on the contour shape specified in step S21 (step S22). Roundness is defined as the magnitude of deviation from a geometrically correct circle of a circular feature.
  • step S22 when the contour shape specified in step S21 is sandwiched between two concentric circles, the control device 30 determines the difference in radius between the two concentric circles when the distance between the two concentric circles is minimized. Calculate as.
  • the control device 30 determines whether or not the roundness calculated in step S22 is equal to or greater than the threshold value (step S23).
  • the threshold value used in step S23 is preset in consideration of, for example, the size of cells. Further, the threshold value may be set for each cell size. In that case, the control device 30 specifies the cell size (for example, the maximum diameter) together with the roundness in step S22, and in step S23. Thresholds according to the size of the identified cells may be used. Further, the control device 30 may specify the roundness and the cell size (for example, the maximum diameter) in step S22, and calculate a value obtained by dividing the roundness by the cell size. In that case, in step S23, the control device 30 may determine whether or not the value obtained by dividing the roundness by the cell size is equal to or greater than the threshold value.
  • step S23 When it is determined in step S23 that the roundness is equal to or greater than the threshold value (step S23YES), the control device 30 determines that the cells C are in an adhesive state (step S24). That is, the control device 30 determines that the cells C are adhered to the culture vessel 100. It can be considered that when the roundness is equal to or more than the threshold value, the shape of the contact portion CA is sufficiently deformed from the circular shape, and the generation of stress generated when the cells C adhere to each other is observed. Because.
  • step S23NO when it is determined in step S23 that the roundness is less than the threshold value (step S23NO), the control device 30 further sets the cell C and the culture vessel 100 based on the presence or absence of irregularities on the surface of the cell C. Adhesion is determined (step S25, step S26). This is because when the surface is uneven, it can be considered that the stress generated when the cells C adhere to each other is generated. In this example, the unevenness on the surface is a wrinkle formed on the contact portion CA. Since the wrinkled portion has a lower contrast than the peripheral portion of the cell, it is considered that the wrinkled portion is at a different height from the peripheral portion. Since the peripheral part of the cell is separated from the bottom surface of the container, it is considered that the wrinkled part is adhered to the container.
  • control device 30 first determines the presence or absence of irregularities on the surface of the cell C based on the image acquired in step S10 (step S25).
  • the control device 30 determines, for example, that there is unevenness when the contact portion CA is wrinkled, and determines that there is no unevenness when there is no wrinkle.
  • step S25NO If it is determined in step S25NO, the control device 30 determines that the cells C are in an unadhered state (step S27). On the other hand, if it is determined in step S25 that there is unevenness (step S25YES), the control device 30 further determines whether or not the size of the cell C having the contact portion CA is equal to or larger than the threshold value (step S26).
  • step S23 adhesion is determined based on the cell shape (including contour shape and surface shape), whereas in step S26, adhesion is determined based on the cell size. This is to ensure high determination accuracy by using the cell size as additional information when the shape of the cell is a shape that can be taken in both the adhered state and the non-adhered state. Since the size of the cell is related to the life or death of the cell, step S26 is substantially a step of determining the life or death of the cell. When the cell size is equal to or larger than the threshold value, it can be determined that the cell is a living cell, and when the cell size is smaller than the threshold value, it can be determined that the cell is a dead cell.
  • step S26 By performing the process of step S26, even if the adhered state and the non-adhered state cannot be specified from the shape of the cell, the adhered state and the non-adhered state are specified based on whether the cell is alive or dead. Can be done.
  • the size of the cell C may be estimated from the size of the contact portion CA, and the size of the contact portion CA itself may be regarded as the size of the cell C.
  • the threshold value used in step S26 is preset in consideration of, for example, the size of dead cells. Since the size of cells changes depending on the cell type, a threshold value unique to each cell type may be prepared in advance.
  • step S26 determines that the size of the cell C is equal to or larger than the threshold value. That is, the control device 30 determines that the cells C are adhered to the culture vessel 100.
  • step S27 determines that the cell C is only dead and is in an unadhered state (step S27). That is, the control device 30 determines that the cells C are not adhered to the culture vessel 100. When cell C dies, the surface becomes wrinkled.
  • step S26 by determining whether or not the size of the cell C is equal to or larger than the threshold value in step S26, it is possible to avoid confusing the wrinkles of dead cells that have become smaller with the wrinkles caused by adhesion. ..
  • the unbonded state and the dead state may be managed separately.
  • the formation of wrinkles due to cell death may not be due to stress. Specifically, there are causes such as holes in the cell membrane and the cytoskeleton not being maintained.
  • step S30 the control device 30 acquires the number of adherent cells and the number of unadherent cells from the image, respectively.
  • the cell counting method a method such as machine learning is used.
  • the control device 30 can obtain the information shown in FIG. 11 by repeating the processes of steps S10 to S30 described above.
  • the form of a graph is used.
  • the horizontal axis of FIG. 11 is the elapsed time from seeding, and the vertical axis is the number of cells identified from the image (obtained in step S30).
  • the broken line L1 shows the time change of the number of unadherent cells identified from the image, and the solid line L2 shows the time change of the number of adherent cells identified from the image.
  • a typical change in the number of cells will be described with reference to FIG.
  • unadhered cells start to increase again (see line L1). This is because adherent cells transition from an adherent state to a non-adherent state when they divide. The adherent cells transition to the non-adherent state, divide, and then adhere to the culture vessel 100 again.
  • adherent cells gradually increase due to the transition to the non-adherent state accompanying division and cell division (see line L2). As a result, the number of adherent cells exceeds the number of seeded cells. As division progresses and the total number of cells increases, so does the increase in cell number due to division (see line L2). Therefore, the rate of increase in the number of adherent cells also increases.
  • step S40 the evaluation system 1 evaluates various characteristics of the cell C based on the adhesion determination result obtained in step S20. Specifically, the evaluation system 1 performs the evaluation process shown in FIG. 12 in step S40.
  • the evaluation system 1 first calculates the sedimentation velocity and the sedimentation time (step S41).
  • step S41 the control device 30 repeats the calculation of the slope of the line L1 until the time t1 when the number of unattached cells reaches the peak, and specifies it as the settling speed at each time. Further, when the number of unattached cells reaches the peak, the time t1 at which the peak is reached is calculated as the sedimentation time.
  • the settling time is used, for example, to identify the period during which cell counting can be performed correctly. When imaging is performed from the bottom of the container, cells cannot be captured in the floating state immediately after seeding. That is, the control device 30 may execute the cell count after the settling time has elapsed, judging that the cell count can be performed correctly after the settling time has elapsed.
  • the evaluation system 1 calculates the bonding speed and the bonding time (step S42).
  • the control device 30 repeats the calculation of the slope of the line L2 until the time t2 when the number of adherent cells catches up with the number of unadherent cells, and specifies it as the adhesion speed at each time. Further, when the number of adherent cells catches up with the number of non-adherent cells, the time t2 for catching up is calculated as the adhesion time.
  • the adhesion time is used, for example, to estimate the cell division ability (proliferative ability).
  • step S43 the control device 30 repeatedly determines whether or not the number of adherent cells has reached a certain threshold value, and specifies the time when the threshold value is reached as the proliferation start time.
  • the growth start time is used, for example, to distinguish between the pre-growth period and the growth period.
  • the control device 30 may specify the period from seeding to the growth start time as the pre-growth period and the period after the start of growth as the growth period.
  • the evaluation system 1 When the evaluation process is completed, the evaluation system 1 outputs various information to the terminal device in response to a request from the terminal device and displays it on the display unit of the terminal device (step S50).
  • the control device 30 may display the adhesion determination result obtained in step S20 on the display unit of the terminal device in the graph format shown in FIG. 11, for example, and the evaluation result obtained in step S40 may be displayed. For example, it may be displayed on the display unit of the terminal device in a tabular format.
  • the adhesion of adhesive cells is determined based on the contour shape of the contact portion. Since the contour shape of the contact portion is less dependent on the cell type than the cell size, according to the evaluation system 1, it is possible to determine the adhesion of adhesive cells with high accuracy regardless of the cell type. it can.
  • the unevenness of the cell surface can be used for the adhesion determination. This can further reduce the possibility that adherent cells are mistaken for non-adherent cells. Further, the adhesion determination using the unevenness may be performed in combination with the cell size. By combining with the cell size, it is possible to avoid misidentifying the wrinkles of dead cells as the unevenness of adherent cells, so that the adhesion determination can be performed with higher accuracy.
  • the adherent cells can be evaluated using the adhesion determination result.
  • the adhesion determination can be performed with high accuracy, it is possible to perform the evaluation based on the correct information. As a result, the reliability of the evaluation can be improved as compared with the conventional case.
  • the evaluation system 1 can correctly count unadhered cells by the adhesion determination, it is possible to accurately calculate the sedimentation rate and the sedimentation time.
  • By calculating the settling speed and the settling time it is possible to identify the state in which the seeded cells have settled down. This makes it possible to specify the period during which cell counting can be performed correctly, so that accurate cell counting can be started as soon as possible.
  • the sedimentation rate and sedimentation time depend on the depth of the medium M, the viscosity of the medium, the specific gravity of the medium, the specific gravity of the cells, the shape of the cells, the agitated state of the cells, the seeding operation of the cells, and the like.
  • the sedimentation rate and sedimentation time determine whether or not the depth of the medium M, the viscosity of the medium, the specific gravity of the medium, the specific gravity of the cells, the shape of the cells, the agitated state of the cells, and the seeding operation of the cells were appropriate. It can also be used as a material.
  • the evaluation system 1 can correctly count the adherent cells and the non-adherent cells by the adhesion determination, the adhesion speed and the adhesion time can be calculated accurately.
  • the calculated adhesion speed and adhesion time can be used as a material for determining the degree of damage received by the cell C. Therefore, according to the evaluation system 1, the cell division ability can be estimated based on the calculated adhesion rate and adhesion time.
  • the evaluation system 1 can correctly count the adherent cells by the adhesion determination, the proliferation start time can be calculated accurately. As a result, the pre-proliferation period and the growth period can be distinguished, so that various information can be managed in association with the pre-proliferation period and the growth period.
  • the deviation of the contour shape of the contact portion CA from the reference shape is evaluated using the roundness.
  • the deviation from the reference shape is not limited to the roundness, and other evaluation values may be used for evaluation.
  • the control device 30 may evaluate the deviation using circularity instead of roundness.
  • the circularity of the contact portion CA can be calculated by (the circumference of a circle equal to the area of the contact portion CA) / (the circumference of the contact portion CA), and the closer it is to 1, the more the contact portion CA is a circle. Indicates that it is close to.
  • the evaluation system 1 can obtain the same effect even when the deviation is calculated based on the circularity.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the division process.
  • the evaluation system according to the present embodiment (hereinafter, simply referred to as an evaluation system) is different from the evaluation system 1 according to the first embodiment in that the division determination is performed in addition to the adhesion determination.
  • changes in cell shape during the division process will be described with reference to FIG. 13, and a method for determining division in the evaluation system 1 will be described.
  • Cell C in the adhered state undergoes cell division for proliferation.
  • the cell C changes from a crushed shape as shown in FIG. 13 (a) to a shape close to a sphere as shown in FIG. 13 (b).
  • This is the opposite of the change from FIG. 4 (b) to FIG. 4 (c) in the bonding process, and is a change from a bonded state to a non-bonded state. Therefore, when viewed from the bottom surface B side, the contact portion CA of the cell C changes from the shape shown in FIG. 6 or 7 to the shape shown in FIG.
  • cell C starts dividing as shown in FIG. 13 (c) and changes into a pair of two cells (cell C1 and cell C2) as shown in FIG. 13 (d).
  • cell C since the cell pair maintains the unadhered state, the shape of each contact portion CA of the cell pair is also maintained as the shape shown in FIG.
  • the cell dies it changes from an adhered state to a non-adhered state.
  • the cells do not divide as shown in FIG. 13 (c), and the shape shown in FIG. 5 causes irregularities and the cell area becomes smaller, so that the cells can be easily distinguished from the divided state.
  • each pair of cells adheres to the bottom surface B (culture container 100) by spreading along the bottom surface B and collapsing as shown in FIG. 13 (e). To do.
  • the shape of each contact portion CA of the cell pair changes to the shape shown in FIG. 6 or FIG.
  • the division of adhesive cells can be expected by changing the cells from the adherent state to the non-adhesive state. Therefore, in the evaluation system, the division determination is performed based on the determination result of the adhesion determination process. As a result, the evaluation system can perform the division determination of the adhesive cell with high accuracy regardless of the cell type as in the adhesion determination.
  • FIG. 14 is a flowchart of the process according to the present embodiment.
  • FIG. 15 is a flowchart of the division determination process according to the present embodiment.
  • FIG. 16 is an example of a graph showing changes over time in the total number of cells, the number of cells that started division, and the number of cells that completed division.
  • FIG. 17 is a flowchart of the evaluation process according to the present embodiment.
  • the method for evaluating adhesive cells performed by the evaluation system will be specifically described with reference to FIGS. 14 to 17.
  • the evaluation method of the adhesive cells performed by the evaluation system includes an image acquisition process (step S10), an adhesion determination process (step S20), a division determination process (step S100), and a counting process (step). S30), an evaluation process (step S200), and a display process (step S300) are included. Since the image acquisition process, the adhesion determination process, and the counting process are the same as the processes described above in the first embodiment, detailed description thereof will be omitted.
  • the evaluation system acquires an image of the adhesive cells in the image acquisition process of step S10, determines the adhesion of the adhesive cells in the adhesion determination process of step S20, and performs the division determination process (step S100).
  • step S100 the evaluation system identifies the dividing state of the adhesive cells based on the result of the adhesion determination performed in step S20.
  • step S100 the division determination process is performed on each of the plurality of cells C appearing in the image.
  • the evaluation system may perform the division determination process shown in FIG. 15, for example, in step S100.
  • the evaluation system first identifies cells that have started division (hereinafter referred to as division-initiated cells) (step S101).
  • the control device 30 identifies cells that have changed from the adhered state to the non-adhered state as division-initiated cells based on the result of the adhesion determination process in step S20. Specifically, the control device 30 first acquires the coordinates Ga (N-1) of the cell specified as the adherent cell in the image taken for the first N-1 shot.
  • the control device 30 acquires the coordinates Gb (N) of the cells identified as unadhered cells located at or near the coordinates Ga (N-1) in the image taken at the Nth time. Finally, the control device 30 identifies the cell located at the coordinate Gb (N) in the image of the Nth shooting as the division-initiating cell, and sets the number of the coordinates Gb (N) to the Nth time from the N-1 shooting. It is calculated as the number of dividing cells NS (N) that started division before imaging.
  • step S102 the evaluation system identifies cells that have completed division (hereinafter referred to as division-completed cells) (step S102).
  • step S102 the control device 30 identifies cells that have changed from the division-initiating cells identified in step S101 into a pair of cells that are close to each other as division-completed cells. Further, the evaluation system identifies cells in the process of division (hereinafter referred to as dividing cells) (step S103), and ends the division determination process.
  • step S103 the control device 30 identifies a dividing cell that has not yet completed division from the dividing-initiated cell identified in step S101 as a dividing cell.
  • control device 30 first acquires the coordinates Gb (N-1) of the cell specified as the division-initiating cell in the image taken at the N-1th time. After that, the control device 30 acquires the coordinates Gc (N) of the cells identified as unadhered cells located at or near the coordinates Gb (N-1) in the image taken at the Nth time.
  • control device 30 acquires the coordinates Gcp (N) whose distance from the other coordinates Gc (N) of the coordinates Gc (N) is shorter than the threshold value in the image taken at the Nth time, and the remaining coordinates ( That is, the Gcc (N) of the coordinates Gc (N) whose distance from the other coordinates Gc (N) is longer than the threshold value is acquired.
  • the control device 30 identifies the cell located at the coordinate Gcp (N) in the image of the Nth imaging as a division-completed cell, and captures 1/2 of the number of the coordinate Gcp (N) N-1 times. It is calculated as NE (N), which is the number of cells that have completed division between the first and the Nth imaging.
  • control device 30 identifies the cell located at the coordinate Gcc (N) in the image of the Nth imaging as a dividing cell, and determines the number of the coordinate Gcc (N) from the N-1 imaging to the Nth imaging. It is calculated as the number of dividing cells Nc (N) that was in the middle of division until.
  • the control device 30 can obtain the information shown in FIG. 16 by repeating the processes of steps S10, S20, S100, and S30 described above.
  • the horizontal axis of FIG. 16 is the elapsed time from seeding, and the vertical axis is the number of cells identified from the image.
  • the solid line Lt indicates the change in the total number of cells identified from the image
  • the dotted line Ls indicates the time change in the number of dividing-initiating cells identified by the division determination process
  • the dashed line Le indicates the change in the number of cells that started division.
  • FIG. 16 shows how the number of mitotic cells increases after the number of mitotic cells. For example, by calculating this delay time Td, the division time, which is the time required for division, can be estimated.
  • step S200 the evaluation system evaluates various characteristics of cell C based on the determination results obtained in steps S20 and S100. Specifically, the evaluation system performs the evaluation process shown in FIG. 17 in step S200.
  • step S201 the evaluation system first calculates the sedimentation rate and the sedimentation time (step S201), calculates the adhesion rate and the adhesion time (step S202), and calculates the growth start time (step S203). ..
  • the processing from step S201 to step S203 is the same as the processing from step S31 to step S33 shown in FIG. Therefore, detailed description of these processes will be omitted.
  • step S204 the control device 30 estimates the division time from the start of division to the end of division based on the time variation of the number of cells starting to divide and the number of cells completing division. Specifically, for example, as shown in FIG. 16, the time when the number of cells at the beginning of division reached half of the peak and the time when the number of cells at the completion of division reached the peak and then became half of the peak. The time difference between and may be estimated as the division time. Further, the time difference between the time when the number of cells starting to divide reaches the peak and the time when the number of cells completing division reaches the peak may be estimated as the division time.
  • step S205 the control device 30 first compares the number of cells that have completed division with the increment of the total number of cells during imaging, and determines whether or not the line Lt shown in FIG. 16 reflects the proliferative characteristics.
  • the characteristics shown by the line Lt shown in FIG. 16 are dominated by the influence of the inflow and outflow of cells on the observation field of view, and appropriately represent the proliferation characteristics. Judge that there is no.
  • the difference between the number of completed division cells and the increase in the total number of cells is sufficiently small, it is determined that the characteristics shown by the line Lt shown in FIG. 16 reflect the proliferation characteristics of cells C.
  • the evaluation system When the evaluation process is completed, the evaluation system outputs various information to the terminal device in response to the request from the terminal device and displays it on the display unit of the terminal device (step S300).
  • the control device 30 may display the adhesion determination result obtained in step S20 on the display unit of the terminal device in the graph format shown in FIG. 11, for example. Further, the control device 30 may display the division determination result obtained in step S100 on the display unit of the terminal device in the graph format shown in FIG. 16, for example. Further, the control device 30 may display the evaluation result obtained in step S200 on the display unit of the terminal device, for example, in a table format.
  • the adhesion of adhesive cells is determined based on the contour shape of the contact portion. Therefore, according to the evaluation system according to the present embodiment, it is possible to determine the adhesion of adhesive cells with high accuracy regardless of the cell type, as in the evaluation system 1. Further, in the evaluation system according to the present embodiment, the division of the adhesive cell is determined based on the adhesion determination result. Therefore, unlike the case where the increase in the number of cells due to division is indirectly detected from the change in the number of cells, the increase in the number of cells due to division can be directly detected. As a result, highly accurate information on division can be obtained, so that the proliferation characteristics of cells can be evaluated correctly.
  • the state of cells in the process of division such as cells that have just started dividing (cells that have started dividing), cells that have completed division (cells that have completed division), and cells that are in the process of dividing (cells that are dividing).
  • cells that have just started dividing cells that have started dividing
  • cells that have completed division cells that have completed division
  • cells that are in the process of dividing cells that are dividing.
  • FIG. 18 is a flowchart of the evaluation process according to the present embodiment.
  • the evaluation system according to the second embodiment is different from the evaluation system according to the second embodiment in that the evaluation process shown in FIG. 18 is performed instead of the evaluation process shown in FIG.
  • the evaluation process performed by the evaluation system according to the present embodiment hereinafter, simply referred to as an evaluation system
  • the evaluation system calculates the sedimentation rate and the sedimentation time (step S401), calculates the adhesion rate and the adhesion time (step S402), and calculates the growth start time (step S403).
  • the division time is estimated (step S404) and the validity of the growth characteristics is evaluated (step S405).
  • the processing from step S401 to step S405 is the same as the processing from step S201 to step S205 shown in FIG. Therefore, detailed description of these processes will be omitted.
  • step S406 the control device 30 estimates when to perform medium exchange or passage based on the division state of the adhesive cells obtained by the division determination process. Specifically, the control device 30 may determine, for example, whether or not the number of mitotic cells or the number of mitotic cells is increasing during the growth period. Then, the control device 30 may determine that the culture medium needs to be replaced when it is determined that the increase has not occurred, and may notify the necessity of the culture medium replacement in the subsequent display processing. In addition, the control device 30 may monitor the number of cells that have started division or the number of cells that have completed division after the medium exchange to notify the effect of the medium exchange.
  • the control device 30 determines that passage is necessary, and notifies the necessity of passage in the subsequent display processing. You may. Further, the control device 30 may determine whether or not the number of cells that have started division or the number of cells that have completed division has fallen below the threshold value. Then, when it is determined that the number of cells starting to divide or the number of cells completing division is below the threshold value, the control device 30 determines that passage is necessary, and notifies the necessity of passage in the subsequent display processing. You may.
  • the evaluation system according to the present embodiment can also determine the adhesion of adherent cells with high accuracy regardless of the cell type, and the evaluation system according to the second embodiment. Similarly, the proliferative properties of cells can be evaluated correctly.
  • the necessity of medium replacement or passage can be determined based on the quantitative information on the proliferative state of the cells obtained from the division determination result. For this reason, from the conventional judgment based on human intuition or experience (for example, judgment of medium replacement timing based on medium color, judgment of passage timing performed by human judgment of confluent state from images, etc.) However, it is possible to perform the necessary work at an appropriate timing.
  • the control device 30 may first determine the presence or absence of pseudopodia of adhesive cells based on the contour shape of the specified contact portion.
  • the presence or absence of pseudopodia may be determined based on, for example, the roundness calculated from the specified contact portion.
  • a trained model may be created using the teacher data for determining the presence or absence of pseudopodia, and the determination may be made using it. Then, when it is determined that there is pseudopodia, it may be determined that the adhesive cells are adhered to the culture vessel.
  • the proliferation start time may be specified as the time when the number of unadhered cells changes from decreasing to increasing. This is because the state in which the number of unadhered cells changed from decreasing to increasing suggests that the change from the adhered state to the unadhered state of the cells is progressing due to division.
  • the processing of the evaluation system 1 has been mainly described, but the work flow when the user evaluates the cultured cells using the system 1 will be described.
  • the user installs the culture vessel 100 on the imaging device 10 installed in the incubator 20, the user instructs the evaluation system 1 to start photographing.
  • the evaluation system 1 starts the process shown in FIG. 8 and performs image acquisition process, adhesion determination process, division determination process, counting process, evaluation process, and display process.
  • the execution timings of the image acquisition process and other processes may be synchronized or may be performed separately. That is, each time an image is acquired, a determination process, a counting process, an evaluation process, and a display process may be performed.
  • the determination process, the counting process, the evaluation process, and the display process may be performed. Further, after all the images have been acquired, determination processing, counting processing, evaluation processing, and display processing may be performed. After that, the user confirms the information displayed by the display process and evaluates the cultured cells. As described above, the user can evaluate the cultured cells based on the information provided by the evaluation system 1. That is, the evaluation system 1 can not only evaluate the cultured cells by itself, but also support the evaluation of the cultured cells by the user.

Abstract

接着性細胞の評価方法は、培養容器１００に収容された接着性細胞の画像を取得すること（ステップＳ１０）と、少なくとも画像から特定される接着性細胞の培養容器１００との接触部分ＣＡの輪郭形状に基づいて、接着性細胞と培養容器１００との接着を判定すること（ステップＳ２０）と、を含む。

Description

接着性細胞の評価方法、プログラム、記録媒体、及び、接着性細胞の評価システム
　本明細書の開示は、接着性細胞の評価方法、プログラム、記録媒体、及び、接着性細胞の評価システムに関する。
　培養細胞は、培養容器に接着した状態で増殖する接着性細胞と、容器内を浮遊したまま増殖する浮遊細胞とに、大別される。接着性細胞の評価では、細胞が接着しているか否かは極めて重要な情報であり、例えば、この情報に基づいて得られる培養容器に接着するまでの時間は、細胞の増殖能を評価する有効な指標の一つとして知られている。
　接着性細胞の接着判定に関する技術は、例えば、特許文献１に記載されている。特許文献１には、培養容器へ投影されたときの細胞の面積に基づいて、接着を判定する技術が記載されている。
特開２００３－２１６２８号公報
　しかしながら、投影面積と接着状態との間の関係は、必ずしも一定ではなく、細胞種によっても異なることが予想される。そのため、細胞種によらず接着性細胞の接着判定を高い精度で行うことができる新たな技術が求められている。
　以上のような実情から、本発明の一側面に係る目的は、細胞種によらず接着性細胞の接着判定を高精度で行う技術を提供することである。
　本発明の一態様に係る接着性細胞の評価方法は、培養容器に収容された接着性細胞の画像を取得することと、少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定することと、を含む。
　本発明の一態様に係る接着性細胞のプログラムは、コンピュータに、培養容器に収容された接着性細胞の画像を取得し、少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定する処理を実行させる。
　本発明の一態様に係る記録媒体は、コンピュータに、培養容器に収容された接着性細胞の画像を取得し、少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定する処理を実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。
　本発明の一態様に係る接着性細胞の評価システムは、培養容器に収容された接着性細胞を撮像する撮像装置と、プロセッサと、を備え、前記プロセッサは、前記撮像装置で取得した画像を取得し、少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定する。
　上記の態様によれば、細胞種によらず接着性細胞の接着判定を高精度で行うことができる。
評価システム１の構成を例示した図である。 撮像装置１０の構成を例示した図である。 制御装置３０の構成を例示した図である。 接着過程を説明するための図である。 未接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示した図である。 接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示した図である。 接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示した別の図である。 接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示したさらに別の図である。 接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示したさらに別の図である。 第１の実施形態に係る処理のフローチャートである。 第１の実施形態に係る画像取得処理のフローチャートである。 第１の実施形態に係る接着判定処理のフローチャートである。 未接着細胞数と接着細胞数の時間変化を示すグラフの一例である。 第１の実施形態に係る評価処理のフローチャートである。 分裂過程を説明するための図である。 第２の実施形態に係る処理のフローチャートである。 第２の実施形態に係る分裂判定処理のフローチャートである。 総細胞数と分裂開始細胞数と分裂完了細胞数の時間変化を示すグラフの一例である。 第２の実施形態に係る評価処理のフローチャートである。 第３の実施形態に係る評価処理のフローチャートである。
［第１の実施形態］
　図１は、評価システム１の構成を例示した図である。図２は、撮像装置１０の構成を例示した図である。図３は、制御装置３０の構成を例示した図である。図１から図３を参照しながら、評価システム１の構成について説明する。
　評価システム１は、インキュベータ２０内の管理された環境で培養細胞を培養しながら、培養細胞の画像を取得し、且つ、画像に基づいて培養細胞を評価するシステムである。なお、評価システム１が評価対象とする培養細胞は、培養容器に接着した状態で増殖する接着性細胞である。
　評価システム１は、図１に示すように、インキュベータ２０内に置かれた撮像装置（撮像装置１０ａ、撮像装置１０ｂ、撮像装置１０ｃ、撮像装置１０ｄ。以降では、これらの撮像装置の各々を撮像装置１０と記す。）と、制御装置３０と、を備えている。評価システム１では、撮像装置１０で取得した画像に基づいて、制御装置３０が接着性細胞を評価する。また、制御装置３０は、撮像装置１０及び端末装置（端末装置４０、端末装置５０）と通信する。なお、評価システム１は、インキュベータ２０と、端末装置を含んでもよい。
　インキュベータ２０に収容された撮像装置１０上には、図１に示すように、培養容器（培養容器１００ａ、培養容器１００ｂ、培養容器１００ｃ、培養容器１００ｄ。以降では、これらの培養容器の各々を培養容器１００と記す。）が置かれる。培養容器１００は、特に限定しないが、例えば、ペトリデッシュ、フラスコ、マイクロプレートなどである。
　培養容器１００には、少なくとも１つの接着性細胞が収容されている。より詳細には、培養容器１００には、図２に示すように、培地Ｍとともに接着性細胞である細胞Ｃが収容されている。なお、特に限定しないが、培地Ｍは、例えば仔ウシの血清などを含む溶液であり、細胞Ｃは、例えば軟骨細胞などである。細胞Ｃは接着性細胞であれば軟骨細胞に限定されず、例えば一般に、上皮系細胞、間質系細胞、株化細胞、がん細胞等が挙げられる。また、樹状細胞のように、血球系の細胞の中にも、分化の段階により、足場を必要とする時期を有するものがある。そのような一時的に足場を必要とする細胞についても接着性細胞に該当するものとしても良い。
　撮像装置１０は、培養容器１００に収容された接着性細胞を撮像することで、接着性細胞の画像を取得する。また、撮像装置１０は、図示しない無線通信モジュールを有している。撮像装置１０は、取得した接着性細胞の画像を無線通信モジュールを用いた無線通信によって制御装置３０へ送信する。
　より詳細には、撮像装置１０は、図２に示すように、筐体１１と、培養容器１００が載置されるステージ１２を備えている。撮像装置１０は、さらに、ステージ１２の下方であって筐体１１内部に、撮像ユニット１３と、撮像ユニット１３を動かす走査機構１６を備えている。撮像ユニット１３には、撮像素子１４と、光源１５と、光学系（図示せず）などが設けられている。
　撮像素子１４は、例えば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary MOS）イメージセンサなどである。光源１５は、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）などであり、ステージ１２の下方から培養容器１００を照明する。光源１５は、図２に示すように、撮像素子１４の周囲に配置されてもよい。撮像装置１０では、光源１５から出射した光は、培養容器１００の底面を透過し、培養容器１００の上面で反射した光の一部が培養容器１００内の細胞Ｃを透過する。光学系は、培養容器１００内の細胞Ｃを透過した光を用いて撮像素子１４上に細胞Ｃの光学像を形成する。
　走査機構１６は、例えば、モータなどの駆動源を含み、光学系の光軸と直交する方向（ＸＹ方向）に撮像ユニット１３を動かす。走査機構１６が撮像ユニット１３をＸＹ方向に動かすことで、撮像装置１０は、撮像対象の範囲を変更することができる。走査機構１６は、さらに、光学系の光軸方向（Ｚ方向）に撮像ユニット１３を動かしてもよく、撮像装置１０は、走査機構１６を用いることでフォーカス位置を調整してもよい。また、撮像装置１０は、光学系に含まれるレンズの少なくとも１つを光軸方向に移動することでフォーカス位置を調整してもよい。
　制御装置３０は、評価システム１を制御するコンピュータである。制御装置３０は、図３に示すように、プロセッサ３１と、メモリ３２と、補助記憶装置３３と、I/Oインターフェース３４と、可搬記憶媒体３８を駆動する媒体駆動装置３５と、通信モジュール３６と、バス３７を備えている。補助記憶装置３３、及び、可搬記憶媒体３８は、それぞれプログラムを記憶した非一過性のコンピュータ読取可能記録媒体の一例である。
　プロセッサ３１は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＧＰＵ（Graphics Processing Unit）などを含む任意の処理回路である。プロセッサ３１は、補助記憶装置３３又は可搬記憶媒体３８に格納されているプログラムをメモリ３２に展開して、その後、実行することでプログラムされた処理、例えば、後述する各種の処理を行う。
　メモリ３２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）などの任意の半導体メモリである。メモリ３２は、プログラムの実行の際に、補助記憶装置３３又は可搬記憶媒体３８に格納されているプログラムまたはデータを記憶するワークメモリとして機能する。補助記憶装置３３は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリ等の不揮発性のメモリである。補助記憶装置３３は、主に各種データ及びプログラムの格納に用いられる。
　媒体駆動装置３５は、光ディスク、コンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記憶媒体３８を収容する。媒体駆動装置３５は、メモリ３２又は補助記憶装置３３に記憶されているデータを可搬記憶媒体３８に出力することができ、また、可搬記憶媒体３８からプログラム及びデータ等を読み出すことができる。可搬記憶媒体３８は、持ち運びが可能な任意の記憶媒体である。可搬記憶媒体３８には、例えば、ＳＤカード、ＵＳＢ（Universal Serial Bus）フラッシュメモリ、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ(Digital Versatile Disc)などが含まれる。
　I/O（Input/Output）インタフェース３４は、例えば、ＵＳＢ（Universal Serial Bus）インタフェース回路、ＨＤＭＩ（登録商標）（High-Definition Multimedia Interface）回路などである。I/Oインターフェース３４には、例えば、図示しない入力装置（キーボード、マウスなど）、図示しない出力装置（ディスプレイ、プリンタなど）が接続される。
　通信モジュール３６は、例えば、無線通信モジュールである。無線通信の規格は特に限定しないが、例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）　Ｌｏｗ　Ｅｎｅｒｇｙ（以降、ＢＬＥと記す。）、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）などであってもよい。また、通信モジュール３６は、有線通信用のモジュールであってもよい。制御装置３０は、通信モジュール３６を用いて撮像装置１０及び端末装置と通信する。バス３７は、プロセッサ３１、メモリ３２、補助記憶装置３３等を、相互にデータの授受可能に接続する。
　制御装置３０は撮像装置１０と一体になっていてもよい。制御装置３０と撮影装置１０が一体になっている場合には、制御装置３０と撮像装置１０の間の通信は有線方式である方が好ましい。
　図３に示す構成は、制御装置３０のハードウェア構成の一例である。制御装置３０はこの構成に限定されるものではない。制御装置３０は、汎用装置であっても専用装置であってもよい。制御装置３０は、例えば、専用設計の電気回路、例えば、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）などを備えてもよい。また、制御装置３０は、ＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）を用いて構成されてもよい。
　端末装置４０は、ノート型コンピュータである。端末装置５０は、タブレット型コンピュータである。端末装置は、表示部であるディスプレイ（ディスプレイ４１、ディスプレイ５１）を有し、制御装置３０から受信した接着性細胞の画像、評価結果などをディスプレイに表示する。端末装置は、表示部を備えていればよく、例えば、デスクトップ型のコンピュータ、スマートフォンなどであってもよい。利用者は、端末装置を用いて評価システム１にアクセスすることで、接着性細胞の観察及び評価結果の確認を行うことができる。
　以上のように構成された評価システム１では、培養容器１００に収容されている接着性細胞の評価に当たり、撮像装置１０で取得した細胞Ｃの画像に基づいて細胞Ｃの接着判定を行う。
　図４は、接着過程を説明するための図である。図５は、未接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示した図である。図６Ａから図６Ｃ及び図７は、接着状態にある細胞の接触部分の形状を例示した図である。なお、図５、図６Ａから図６Ｃ、図７に示す画像Ｐ１から画像Ｐ５は、それぞれの細胞状態を示す写真である。以下、図４から図７を参照しながら、播種から接着までの過程（以降、単に接着過程と記す。）における細胞の形状の変化、より厳密には、細胞の輪郭形状の変化について説明し、さらに、評価システム１での接着判定の方法について説明する。
　培地Ｍが収容されてる培養容器１００に細胞Ｃが播種されると、細胞Ｃは、図４（ａ）に示されるように、培養容器１００の底面Ｂに向かって沈降を開始する。沈降中の細胞Ｃの形状、より詳細には、輪郭形状は、球体形状と見做すことができる。
　沈降が進むと、細胞Ｃは、底面Ｂに接触する。細胞Ｃが底面Ｂに接触すると、図４（ｂ）に示すように、細胞Ｃの底面Ｂに接触した部分が扁平になる。このため、細胞Ｃの輪郭形状は、球欠形状と見做すことができる。このとき、底面Ｂ側から見た、細胞Ｃの培養容器１００との接触部分（以降、単に接触部分と記す。）ＣＡの輪郭形状は、図５に示すような円形である。これは、細胞Ｃは、まだ培養容器１００に接着しておらず、いわゆる未接着状態であるためである。未接着状態では、接触部分ＣＡの円形状を崩すような偏った応力は細胞Ｃと培養容器１００（底面Ｂ）の間に働かない。
　その後、細胞Ｃは、底面Ｂ（培養容器１００）に接着する。接着が進むに連れて、細胞Ｃは、図４（ｃ）及び図４（ｄ）に示すように、底面Ｂに沿って広がり、且つ、潰れていく。細胞Ｃが培養容器１００に接着している状態、いわゆる接着状態では、細胞Ｃと底面Ｂの間には、等方的ではない偏った応力が働く。このため、接触部分ＣＡの輪郭形状は、ほとんどの場合、未接着状態とは異なり、円形とは異なる形状になる。具体的には、接触部分ＣＡの輪郭形状は、例えば、図６Ａに示すような楕円形状、図６Ｂに示すような多角形形状、図６Ｃに示すような仮足が伸びた形状などになる。なお仮足(pseudopod)とは、細胞に発生した突起状構造物のことを指す。
　このように、接着性細胞と培養容器１００との接触部分ＣＡの輪郭形状は、未接着状態においては円形と見做すことができるのに対して、接着状態においては円形から乖離した形状になる。この変化は、接着に伴って不可避的に生じるものであるため、細胞種によらず生じる。これを利用して、評価システム１は、接触部分ＣＡの輪郭形状に基づいて、接着判定を行う。これによって、評価システム１は、細胞種によらず、接着性細胞の接着判定を高精度で行うことができる。
　なお、接着状態であっても、稀ではあるが、接触部分ＣＡの輪郭形状が応力のバランスの関係で偶然に円形になることがある。そのようなケースでは、接着性細胞の容器との接着面の表面に生じた皺などの凹凸の有無に基づいて、接着状態か未接着状態かを判定してもよい。接着状態においては、未接着状態と比べて接着性細胞と培養容器１００との間に大きな応力が生じるため、例えば、図７に示すように、接触部分ＣＡに皺が寄りやすい。このため、接触部分ＣＡなどの接着性細胞の表面に凹凸がある場合には接着状態と判定してもよい。接触部分ＣＡの形状に加えて、凹凸の有無を考慮することで、接着性細胞の接着判定をさらに高精度で行うことができる。なお皺などの凹凸の有無を判定する方法は特に限定しないが、ブロブ解析を用いた方法、機械学習で皺を学習してから検出する方法などがある。
　図８は、評価システム１が行う本実施形態に係る処理のフローチャートである。図９は、本実施形態に係る画像取得処理のフローチャートである。図１０は、本実施形態に係る接着判定処理のフローチャートである。図１１は、未接着細胞数と接着細胞数の時間変化を示すグラフの一例である。図１２は、本実施形態に係る評価処理のフローチャートである。以下、図８から図１２を参照しながら、評価システム１で行われる接着性細胞の評価方法について、具体的に説明する。
　評価システム１が行う接着性細胞の評価方法は、図８に示すように、培養中判定処理（ステップＳ１）と、画像取得処理（ステップＳ１０）と、接着判定処理（ステップＳ２０）と、計数処理（ステップＳ３０）と、評価処理（ステップＳ４０）と、表示処理（ステップＳ５０）を含んでいる。ここでは、タイムラプス撮影が行われる場合を例に説明する。
　評価システムは、まず、細胞培養中否かを判定する（ステップＳ１）。培養中であれば、ステップＳ１０以降の処理を繰り返す。培養中でなければ、図８の処理を終了する。ステップＳ１０の画像取得処理では、評価システム１は、ステップＳ２０の接着判定処理で用いる画像を取得する。具体的には、撮像装置１０が培養容器１００に収容された１つ以上の細胞Ｃの画像を取得し、制御装置３０へ送信する。これによって、制御装置３０が１つ以上の細胞Ｃの画像を取得する。
　なお、ステップＳ２０の接着判定では、上述したように、接触部分ＣＡの形状が利用される。このため、ステップＳ１０では、評価システム１は、例えば、撮像装置１０のオートフォーカス機能を用いて、フォーカス位置を細胞Ｃが接着し得る培養容器１００の底面に合わせて、その後、画像を取得してもよい。これによって、接触部分ＣＡの形状を特定しやすい画像を得ることができるからである。
　また、評価システム１は、ステップＳ１０において、図９に示す画像取得処理を行ってもよい。評価システム１は、図９に示す画像取得処理を行った場合にも、接触部分ＣＡの形状を特定しやすい画像を得ることができる。
　図９に示す画像取得処理では、評価システム１は、まず、Ｚスタック画像を取得する（ステップＳ１１）。ステップＳ１１では、撮像装置１０は、光軸方向に一定間隔ずつフォーカス位置を動かして、その後、各位置で画像を取得する。即ち、フォーカス位置の異なる複数の画像を取得する。その後、撮像装置１０は、取得した複数の画像を制御装置３０へ送信する。
　制御装置３０は、フォーカス位置の異なる複数の画像を受信すると、複数の画像の各々のコントラストを算出する（ステップＳ１２）。画像のコントラストの算出方法は特に限定しないが、例えば、Brenner Gradientを採用してもよい。Brenner Gradientは、近隣画素の画素値の差分の二乗を所定領域内で積分したものである。積分する所定領域は、画像全体であっても、画像中の注目領域であってもよい。
　その後、制御装置３０は、ステップＳ１２で算出した複数の画像のコントラストに基づいて、ステップＳ２０の接着判定に用いる選択画像を選択する（ステップＳ１３）。ステップＳ１３では、制御装置３０は、例えば、最もコントラストの高い画像を選択画像として選択する。
　ステップＳ１０の画像取得処理が完了すると、評価システム１は、接着判定処理を行う（ステップＳ２０）。ステップＳ２０では、評価システム１は、ステップＳ１０で取得した画像から特定される接触部分ＣＡの輪郭形状に基づいて、細胞Ｃと培養容器１００との接着を判定する。ステップＳ１０で図９に示す画像取得処理が行われている場合であれば、ステップＳ２０では、選択画像に基づいて接着判定処理が行われる。なお、ステップＳ２０では、画像に表れている複数の細胞Ｃのそれぞれに対して接着判定処理が行われ、複数の細胞Ｃの状態（接着状態、未接着状態）が判定される。
　なお、ステップＳ１０の画像取得については、細胞培養中に適宜行われれる。例えば、上述したようにタイムラプス撮影において、細胞培養中に定期的に画像取得が行われてもよく、さらに、不定期で追加的に画像取得が行われてもよい。一方、後述するステップＳ２０以降の接着判定及び評価を含む解析処理については、画像を取得するたびに、細胞培養と時間的に並行して行われてもよい。また、培養中に取得した一連の画像を、培養終了後にまとめて解析してもよい。
　ステップＳ２０の接着判定処理は、機械学習を用いて行われてもよく、特に、ディープラーニングを用いて行われてもよい。例えば、接着状態の細胞の接触部分ＣＡの輪郭形状と未接着状態の細胞の接触部分ＣＡの輪郭形状を学習した学習済みのモデルを構築し、その学習済みモデルにステップＳ１０で取得した画像を入力することで、接着判定を行ってもよい。また、仮足の形状を学習した学習済みのモデルを構築し、その学習済みモデルにステップＳ１０で取得した画像を入力することで、接着判定を行ってもよい。接触部分ＣＡの輪郭形状を学習することで、細胞種によらず、接着性細胞の接着判定を高精度で行うことができる。なお、学習済みのモデルは、接触部分ＣＡの輪郭形状に加えて、接着状態の細胞の表面の凹凸と未接着状態の細胞の表面の凹凸などを学習してもよい。これによって、さらに精度の高い接着判定が可能となる。
　なお、学習済みモデルを作成するための教師データセットは、モデル作成用に取得した細胞画像と、その細胞画像における細胞の輪郭形状や仮足の有無をモデル作成者や専門的知見を有した者が判定したアノテーションデータと、からなる。また、学習済みモデルは、適宜改良されてもよい。具体的には、例えば、システム１を利用中に、学習済みモデルを改良するために、作業者自身が接着判定を目視で行い、アノテーションデータを追加で作成してもよく、追加で作成したアノテーションデータを含む教師データを使用して追加的に学習を行うことで、学習済みモデルを改良しても良い。
　また、評価システム１は、ステップＳ２０において、図１０に示す接着判定処理を行ってもよい。図１０に示す画像取得処理では、評価システム１は、まず、接触部分ＣＡの輪郭形状を特定する（ステップＳ２１）。ステップＳ２１では、制御装置３０は、ステップＳ１０で取得した画像に基づいて接触部分ＣＡの輪郭形状を特定する。さらに具体的には、制御装置３０は、例えば、ステップＳ１０で取得した画像に対して輪郭抽出処理などを行うことによって、接触部分ＣＡの輪郭形状を特定する。
　また、接着判定処理に用いる画像の各々には、複数の細胞が写っている。接着判定処理では、画像に対する１回の処理で、一度に複数の細胞の接着を判定することが出来る。
　次に、制御装置３０は、ステップＳ２１で特定した接触部分ＣＡの輪郭形状の基準形状からのずれに基づいて、細胞Ｃと培養容器１００との接着を判定する（ステップＳ２２からステップＳ２４）。これは、接触部分ＣＡの輪郭形状が基準形状から大きく乖離している場合には、細胞Ｃが培養容器１００に接着しているときに生じる応力が発生していると見做すことが可能であり、細胞Ｃが培養容器１００に接着していると判断できるからである。なお、この例では、基準形状とは、円形のことである。
　具体的には、制御装置３０は、まず、ステップＳ２１で特定した輪郭形状に基づいて、真円度を算出する（ステップＳ２２）。真円度は、円形形体の幾何学的に正しい円からの狂いの大きさとして定義される。ステップＳ２２では、制御装置３０は、ステップＳ２１で特定した輪郭形状を２つの同心円で挟んだとき、２つの同心円の間隔が最小となる場合の２つの円心円の半径の差を、真円度として算出する。
　真円度が算出されると、制御装置３０は、ステップＳ２２で算出した真円度が閾値以上か否かを判定する（ステップＳ２３）。ステップＳ２３で使用する閾値は、例えば、細胞の大きさを考慮して予め設定されている。また、閾値は、細胞の大きさ毎に設定されていてもよく、その場合、制御装置３０は、ステップＳ２２において真円度とともに細胞の大きさ（例えば、最大径）を特定し、ステップＳ２３において特定した細胞の大きさに応じた閾値を使用してもよい。また、制御装置３０は、ステップＳ２２において、真円度と細胞の大きさ（例えば、最大径）を特定し、真円度を細胞の大きさで割った値を算出してもよい。その場合、ステップＳ２３では、制御装置３０は、真円度を細胞の大きさで割った値が閾値以上であるか否かを判定してもよい。
　ステップＳ２３で真円度が閾値以上であると判定されると（ステップＳ２３ＹＥＳ）、制御装置３０は、細胞Ｃは接着状態であると判定する（ステップＳ２４）。つまり、制御装置３０は、細胞Ｃが培養容器１００に接着していると判定する。これは、真円度が閾値以上である場合には、接触部分ＣＡの形状が円形から十分に変形していて、細胞Ｃが接着するときに生じる応力の発生が観察されていると見做せるからである。
　一方、ステップＳ２３で真円度が閾値未満であると判定されると（ステップＳ２３ＮＯ）、制御装置３０は、さらに、細胞Ｃの表面の凹凸の有無に基づいて、細胞Ｃと培養容器１００との接着を判定する（ステップＳ２５、ステップＳ２６）。これは、表面に凹凸がある場合には、細胞Ｃが接着するときに生じる応力が発生していると見做せるからである。なお、この例では、表面の凹凸は、接触部分ＣＡに生じた皺である。皺の部分は、細胞周辺部よりコントラストが低くなるため、周辺部とは異なる高さにあると思われる。細胞周辺部分が容器の底面から離れていることから、皺の部分が容器に接着していると考えられる。
　具体的には、制御装置３０は、まず、ステップＳ１０で取得した画像に基づいて、細胞Ｃの表面の凹凸の有無を判定する（ステップＳ２５）。ここでは、制御装置３０は、例えば、接触部分ＣＡに皺が寄っている場合には、凹凸があると判定し、皺が寄っていない場合には、凹凸がないと判定する。
　ステップＳ２５で凹凸がないと判定されると（ステップＳ２５ＮＯ）、制御装置３０は、細胞Ｃは未接着状態であると判定する（ステップＳ２７）。一方、ステップＳ２５で凹凸があると判定されると（ステップＳ２５ＹＥＳ）、制御装置３０は、さらに、接触部分ＣＡを有する細胞Ｃの大きさが閾値以上か否かを判定する（ステップＳ２６）。
　ステップＳ２３及びステップＳ２５では、細胞の形状（輪郭形状と表面形状を含む）に基づいて接着を判定しているのに対して、ステップＳ２６では、細胞の大きさに基づいて接着を判定する。これは、細胞の形状が接着状態と未接着状態の両状態においてとり得る形状の場合に、細胞の大きさを追加の情報として用いることで高い判定精度を確保するためである。細胞の大きさは、細胞の生死に関連しているため、ステップＳ２６は、実質的には、細胞の生死を判定する工程である。細胞の大きさが閾値以上である場合は細胞が生細胞であり、細胞の大きさが閾値未満である場合は細胞が死細胞である、と判断できる。ステップＳ２６の処理を行うことで、細胞の形状から接着状態と未接着状態を特定できない場合であっても、細胞が生きているか死んでいるかを踏まえて、接着状態と未接着状態を特定することができる。
　なお、細胞Ｃの大きさは、接触部分ＣＡの大きさから推測してもよく、接触部分ＣＡの大きさ自体を細胞Ｃの大きさと見做してもよい。ステップＳ２６で使用する閾値は、例えば、死細胞の大きさを考慮して予め設定されている。細胞の大きさは細胞種によって変化するため、細胞種ごとに固有の閾値をあらかじめ用意しても良い。
　ステップＳ２６で細胞Ｃの大きさが閾値以上であると判定されると、制御装置３０は、細胞Ｃは接着状態であると判定する（ステップＳ２４）。つまり、制御装置３０は、細胞Ｃが培養容器１００に接着していると判定する。一方、ステップＳ２６で細胞Ｃの大きさが閾値未満であると判定されると、制御装置３０は、細胞Ｃは死んでいるだけであり、未接着状態であると判定する（ステップＳ２７）。つまり、制御装置３０は、細胞Ｃが培養容器１００に接着していないと判定する。細胞Ｃは死ぬと表面に皺が寄る。このため、ステップＳ２６で細胞Ｃの大きさが閾値以上であるか否かを判定することで、死んで小さくなった死細胞の皺を接着によって生じた皺と混同することを回避することができる。なお、未接着状態と死状態は、区別して管理してもよい。なお、細胞死による皺の形成は応力によるものでない場合がある。具体的には細胞膜に穴が開いたり、細胞骨格が維持されなくなるといった原因がある。
　ステップＳ２０の接着判定処理が終了すると、システム１は、計数処理を行う（ステップＳ３０）。ステップＳ３０では、制御装置３０は、画像から接着細胞数、未接着細胞数をそれぞれ取得する。セルカウント方法には、機械学習などの方法が用いられる。
　タイムラプス撮影において、上述したステップＳ１０からステップＳ３０の処理を繰り返し行うことで、制御装置３０は、図１１に示す情報を得ることができる。本明細書では、グラフという形態を用いている。図１１の横軸は、播種からの経過時間であり、縦軸は画像から特定された(ステップＳ３０で取得した)細胞の数である。破線である線Ｌ１は、画像から特定された未接着細胞の細胞数の時間変化を示し、実線である線Ｌ２は、画像から特定された接着細胞の細胞数の時間変化を示している。以下、典型的な細胞数の変化について図１１を参照しながら説明する。
　まず、播種後、培地内で浮遊していた細胞は、徐々に沈降し、培養容器１００の底面に着底する。このため、播種後しばらくの間は、未接着細胞が顕著に増加する（線Ｌ１参照）。一方、接着細胞は、着底した未接着細胞が接着することで増加する。このため、接着細胞は、未接着細胞に遅れて増加する（線Ｌ２参照）。
　沈降による未接着細胞の増加が収束した時間ｔ１において、未接着細胞の数はピークに達し、その後、未接着細胞は減少する（線Ｌ１参照）。一方、接着細胞は、未接着細胞の接着が進むことで増加を続ける（線Ｌ２参照）。そして、時間ｔ２において、接着細胞の数は、未接着細胞の数に達し、遂には、接着細胞の数は、未接着細胞の数を上回る（線Ｌ１及び線Ｌ２参照）。
　その後、未接着細胞は、再びに増加し始める（線Ｌ１参照）。これは、接着細胞は、分裂するときに、接着状態から未接着状態に遷移するからである。接着細胞は未接着状態に遷移してから分裂し、その後、再び培養容器１００に接着する。一方、接着細胞は、分裂が始まると、分裂に伴う未接着状態への遷移と細胞分裂とによって緩やかに増加する（線Ｌ２参照）。その結果、接着細胞数は、播種細胞数を上回る。分裂が進み、総細胞数が増加すると、分裂による細胞数の増加も急増する（線Ｌ２参照）。このため、接着細胞数の増加率も大きくなる。
　次に、評価システム１は、評価処理を行う（ステップＳ４０）。ステップＳ４０では、評価システム１は、ステップＳ２０で得られた接着判定結果に基づいて、細胞Ｃの様々な特性を評価する。具体的には、評価システム１は、ステップＳ４０において、図１２に示す評価処理を行う。
　図１２に示す評価処理では、評価システム１は、まず、沈降速度と沈降時間を算出する（ステップＳ４１）。ステップＳ４１では、制御装置３０は、未接着細胞の数がピークに達する時間ｔ１までの間、線Ｌ１の傾きの算出を繰り返し、各時刻における沈降速度として特定する。さらに、未接着細胞の数がピークに達すると、ピークに達した時間ｔ１を沈降時間として算出する。沈降時間は、例えば、正しくセルカウントを行うことができる期間を特定するために利用される。容器底面から撮像を行った場合、播種直後の浮遊状態では細胞を捉えることができない。つまり、沈降時間経過後はセルカウントが正しく行える期間であると判断して、制御装置３０は、沈降時間経過後にセルカウントを実行してもよい。
　沈降速度と沈降時間を算出すると、評価システム１は、接着速度と接着時間を算出する（ステップＳ４２）。ステップＳ４２では、制御装置３０は、接着細胞の数が未接着細胞の数に追いつく時間ｔ２までの間、線Ｌ２の傾きの算出を繰り返し、各時刻における接着速度として特定する。さらに、接着細胞の数が未接着細胞の数に追いつくと、追いついた時間ｔ２を接着時間として算出する。接着時間は、例えば、細胞の分裂能を（増殖能）推定するために利用される。
　接着速度と接着時間を算出すると、評価システム１は、最後に、増殖開始時間を算出し（ステップＳ４３）、評価処理を終了する。ステップＳ４３では、制御装置３０は、接着細胞の数がある閾値に達したか否かを繰り返し判断し、閾値に達した時間を増殖開始時間として特定する。増殖開始時間は、例えば、増殖前期間と増殖期間を区別するために利用される。制御装置３０は、播種から増殖開始時間までの期間を増殖前期間とし、増殖開始以降の期間を増殖期間として、特定してもよい。
　評価処理を終了すると、評価システム１は、端末装置からの要求に応じて、種々の情報を端末装置に出力し、端末装置の表示部に表示させる（ステップＳ５０）。ここでは、制御装置３０は、ステップＳ２０で得られた接着判定結果を、例えば、図１１に示すグラフ形式で端末装置の表示部に表示させてもよく、ステップＳ４０で得られた評価結果を、例えば、表形式で、端末装置の表示部に表示させてもよい。
　以上のように構成された評価システム１では、接触部分の輪郭形状に基づいて接着性細胞の接着を判定する。接触部分の輪郭形状は、細胞の大きさに比べて、細胞種への依存度は小さいため、評価システム１によれば、細胞種によらず接着性細胞の接着判定を高精度で行うことができる。
　また、評価システム１では、接触部分の輪郭形状に加えて、細胞の表面の凹凸を接着判定に用いることができる。これによって、接着細胞を未接着細胞と見誤る可能性をさらに低下させることができる。また、凹凸を用いた接着判定は、細胞の大きさと組み合わせることで行われてもよい。細胞の大きさと組み合わせることで、死細胞の皺を接着細胞の凹凸と誤認することを回避することができるため、さらに高精度に接着判定を行うことができる。
　また、評価システム１では、接着判定結果を用いて接着細胞を評価することができる。特に、評価システム１では、接着判定を精度よく行うことができるため、正しい情報に基づいて評価を行うことが可能である。その結果、従来に比べて、評価の信頼性を向上させることができる。
　具体的には、評価システム１は、接着判定によって未接着細胞を正しくカウントすることができるため、沈降速度と沈降時間を正確に算出することができる。沈降速度と沈降時間を算出することで、播種した細胞が一通り着底した状態を特定することができる。これによって、正しくセルカウントを行うことができる期間を特定することが可能となるため、正確なセルカウントをできる限り早期に開始することが可能となる。また、沈降速度と沈降時間は、培地Ｍの深さ、培地の粘度、培地の比重、細胞の比重、細胞の形状、細胞の攪拌状態、細胞の播種作業などに依存する。このため、沈降速度と沈降時間は、培地Ｍの深さ、培地の粘度、培地の比重、細胞の比重、細胞の形状、細胞の攪拌状態、細胞の播種作業が適切であったか否かを判断する材料として利用することも可能である。
　また、評価システム１は、接着判定によって接着細胞と未接着細胞を正しくカウントすることができるため、接着速度と接着時間を正確に算出することができる。細胞Ｃは、例えばトリプシン処理で細胞表面のコラーゲンが必要以上に失われるなど、ダメージを受けると、接着速度が遅くなり、接着時間が長くなる。このため、算出した接着速度と接着時間は、細胞Ｃが受けたダメージの程度についての判断材料として利用することが可能である。従って、評価システム１によれば、算出した接着速度と接着時間に基づいて、細胞の分裂能を推定することができる。
　また、評価システム１は、接着判定によって接着細胞を正しくカウントすることができるため、増殖開始時間を正確に算出することができる。これによって、増殖前期間と増殖期間を区別することができるため、種々の情報を増殖前期間と増殖期間に関連付けて管理することができる。
　なお、図１０に示す接着判定処理では、接触部分ＣＡの輪郭形状の基準形状からのずれを真円度を用いて評価する例を示した。しかしながら、基準形状からのずれは、真円度に限らず、他の評価値を用いて評価してもよい。例えば、制御装置３０は、真円度の代わりに円形度を用いてずれを評価してもよい。接触部分ＣＡの円形度は、（接触部分ＣＡの面積に等しい円の円周）／（接触部分ＣＡの周の長さ）で算出することが可能であり、１に近いほど接触部分ＣＡが円に近いことを示す。評価システム１は、円形度に基づいてずれを算出した場合であっても、同様の効果を得ることができる。
［第２の実施形態］
　図１３は、分裂過程を説明するための図である。本実施形態に係る評価システム（以降、単に評価システムと記す。）は、接着判定に加えて分裂判定を行う点が、第１の実施形態に係る評価システム１とは異なっている。以下、図１３を参照しながら、分裂過程における細胞の形状の変化について説明し、さらに、評価システム１での分裂判定の方法について説明する。
　接着状態にある細胞Ｃは、増殖のために細胞分裂を行う。分裂過程が始まると、細胞Ｃは、図１３（ａ）に示されるような潰れた形状から、図１３（ｂ）に示されるような球体に近い形状に変化する。これは、接着過程における図４（ｂ）から図４（ｃ）への変化とは反対の変化であり、接着状態から未接着状態への変化である。従って、底面Ｂ側から見ると、細胞Ｃの接触部分ＣＡは、図６又は図７の示す形状から図５に示す形状に変化する。
　その後、細胞Ｃは、図１３（ｃ）に示すように分裂を開始し、図１３（ｄ）に示すような２つの細胞（細胞Ｃ１、細胞Ｃ２）のペアに変化する。なお、図１３（ｄ）では、細胞のペアは未接着状態を維持するため、細胞のペアのそれぞれの接触部分ＣＡの形状も、図５に示す形状のまま維持される。
　ただし、細胞が死ぬ場合にも、接着状態から未接着状態への変化する。死ぬ場合には図１３（ｃ）に示す分裂はせず、図５に示す形状から凸凹が発生し細胞の面積が小さくなるので容易に分裂の状態とは区別ができる。
　最後に、再び接着が開始され、細胞のペアは、それぞれ、図１３（ｅ）に示すように、底面Ｂに沿って広がり、且つ、潰れていくことで、底面Ｂ（培養容器１００）に接着する。これによって、細胞のペアのそれぞれの接触部分ＣＡの形状は、図６又は図７に示す形状に変化する。
　このように、接着性細胞の分裂は、細胞が接着状態から未接着状態へ変化することで、予期することができる。そのため、評価システムでは、接着判定処理の判定結果に基づいて、分裂判定を行う。これによって、評価システムは、接着判定と同様に細胞種によらず、接着性細胞の分裂判定を高精度で行うことができる。
　図１４は、本実施形態に係る処理のフローチャートである。図１５は、本実施形態に係る分裂判定処理のフローチャートである。図１６は、総細胞数と分裂開始細胞数と分裂完了細胞数の時間変化を示すグラフの一例である。図１７は、本実施形態に係る評価処理のフローチャートである。以下、図１４から図１７を参照しながら、評価システムで行われる接着性細胞の評価方法について、具体的に説明する。
　評価システムが行う接着性細胞の評価方法は、図１４に示すように、画像取得処理（ステップＳ１０）と、接着判定処理（ステップＳ２０）と、分裂判定処理（ステップＳ１００）と、計数処理（ステップＳ３０）と、評価処理（ステップＳ２００）と、表示処理（ステップＳ３００）を含んでいる。なお、画像取得処理と接着判定処理と計数処理は、第１の実施形態で上述した処理と同様であるので、詳細な説明は省略する。
　評価システムは、ステップＳ１０の画像取得処理で接着性細胞の画像を取得し、ステップＳ２０の接着判定処理で接着性細胞の接着を判定すると、分裂判定処理を行う（ステップＳ１００）。ステップＳ１００では、評価システムは、ステップＳ２０で行われた接着の判定結果に基づいて、接着性細胞の分裂状態を特定する。なお、ステップＳ１００では、画像に表れている複数の細胞Ｃのそれぞれに対して分裂判定処理が行われる。以降では、現在、タイムラプス撮影におけるＮ回目の撮影が行われている場合を例に説明する。
　評価システムは、ステップＳ１００において、例えば、図１５に示す分裂判定処理を行ってもよい。図１５に示す分裂判定処理では、評価システムは、まず、分裂を開始した細胞（以降、分裂開始細胞と記す。）を特定する（ステップＳ１０１）。ステップＳ１０１では、制御装置３０は、ステップＳ２０の接着判定処理の結果に基づいて、接着状態から未接着状態へ変化した細胞を分裂開始細胞として特定する。具体的には、制御装置３０は、まず、Ｎ－１回目の撮影の画像において、接着細胞として特定された細胞の座標Ｇａ（Ｎ－１）を取得する。その後、制御装置３０は、Ｎ回目の撮影の画像において、座標Ｇａ（Ｎ－１）又はその近傍に位置する未接着細胞として特定された細胞の座標Ｇｂ（Ｎ）を取得する。最後に、制御装置３０は、Ｎ回目の撮影の画像における座標Ｇｂ（Ｎ）に位置する細胞を分裂開始細胞として特定し、座標Ｇｂ（Ｎ）の数をＮ－１回の撮影からＮ回目の撮影までの間に分裂を開始した分裂開始細胞数ＮＳ（Ｎ）として算出する。
　次に、評価システムは、分裂が完了した細胞（以降、分裂完了細胞と記す。）を特定する（ステップＳ１０２）。ステップＳ１０２では、制御装置３０は、ステップＳ１０１で特定した分裂開始細胞から互いに近接した細胞のペアに変化した細胞を、分裂完了細胞として特定する。さらに、評価システムは、分裂の途中にある細胞（以降、分裂中細胞と記す。）を特定し（ステップＳ１０３）、分裂判定処理を終了する。ステップＳ１０３では、制御装置３０は、ステップＳ１０１で特定した分裂開始細胞から未だ分裂が完了していない分裂の途中の細胞を、分裂中細胞として特定する。
　具体的には、制御装置３０は、まず、Ｎ－１回目の撮影の画像において、分裂開始細胞として特定された細胞の座標Ｇｂ（Ｎ－１）を取得する。その後、制御装置３０は、Ｎ回目の撮影の画像において、座標Ｇｂ（Ｎ－１）又はその近傍に位置する未接着細胞として特定された細胞の座標Ｇｃ（Ｎ）を取得する。さらに、制御装置３０は、Ｎ回目の撮影の画像において、座標Ｇｃ（Ｎ）のうち他の座標Ｇｃ（Ｎ）との距離が閾値よりも短い座標Ｇｃｐ（Ｎ）を取得し、残りの座標（つまり、座標Ｇｃ（Ｎ）のうち他の座標Ｇｃ（Ｎ）との距離が閾値よりも長い座標）Ｇｃｃ（Ｎ）を取得する。最後に、制御装置３０は、Ｎ回目の撮影の画像における座標Ｇｃｐ（Ｎ）に位置する細胞を分裂完了細胞として特定し、座標Ｇｃｐ（Ｎ）の数の１／２をＮ－１回の撮影からＮ回目の撮影までの間に分裂を完了した分裂完了細胞数ＮＥ（Ｎ）として算出する。また、制御装置３０は、Ｎ回目の撮影の画像における座標Ｇｃｃ（Ｎ）に位置する細胞を分裂中細胞として特定し、座標Ｇｃｃ（Ｎ）の数をＮ－１回の撮影からＮ回目の撮影までの間に分裂の途中であった分裂中細胞数Ｎｃ（Ｎ）として算出する。
　タイムラプス撮影において、上述したステップＳ１０、ステップＳ２０、ステップＳ１００、ステップＳ３０の処理を繰り返し行うことで、制御装置３０は、図１６に示す情報を得ることができる。図１６の横軸は、播種からの経過時間であり、縦軸は画像から特定された細胞の数である。実線である線Ｌｔは、画像から特定された総細胞数の変化を示し、点線である線Ｌｓは、分裂判定処理によって特定された分裂開始細胞数の時間変化を示し、破線である線Ｌｅは、分裂判定処理によって特定された分裂完了細胞数の時間変化を示している。図１６には、分裂開始細胞数から遅れて分裂完了細胞数が増加する様子が示されている。例えば、この遅れ時間Ｔｄを算出することで、分裂に要する時間である分裂時間を推定することができる。
　次に、評価システムは、評価処理を行う（ステップＳ２００）。ステップＳ２００では、評価システムは、ステップＳ２０及びステップＳ１００で得られた判定結果に基づいて、細胞Ｃの様々な特性を評価する。具体的には、評価システムは、ステップＳ２００において、図１７に示す評価処理を行う。
　図１７に示す評価処理では、評価システムは、まず、沈降速度と沈降時間を算出し（ステップＳ２０１）、接着速度と接着時間を算出し（ステップＳ２０２）、増殖開始時間を算出する（ステップＳ２０３）。ステップＳ２０１からステップＳ２０３までの処理は、図１２に示すステップＳ３１からステップＳ３３までの処理と同様である。このため、これらの処理については詳細な説明は省略する。
　次に、評価システムは、分裂時間を推定する（ステップＳ２０４）。ステップＳ２０４では、制御装置３０は、分裂開始細胞数と分裂完了細胞数の時間変化に基づいて、分裂開始から分裂終了までの分裂時間を推定する。具体的には、例えば、図１６に示すように、分裂開始細胞数がピークに達した後にピークの半分になった時間と、分裂完了細胞数がピークに達した後にピークの半分になった時間と、の時間差を分裂時間として推定してもよい。また、分裂開始細胞数がピークに達した時間と、分裂完了細胞数がピークに達した時間と、の時間差を分裂時間として推定してもよい。
　最後に、評価システムは、細胞Ｃの増殖特性の妥当性を判断し（ステップＳ２０５）、評価処理を終了する。ステップＳ２０５では、制御装置３０は、まず、分裂完了細胞数と、撮影間における総細胞数の増分を比較し、図１６に示す線Ｌｔが増殖特性を反映しているか否かを判定する。分裂完了細胞数と総細胞数の増分が大きく異なる場合には、図１６に示す線Ｌｔが示す特性は、観察視野に対する細胞の流入出の影響が支配的であり、増殖特性を適切に表していないと判定する。一方、分裂完了細胞数と総細胞数の増分との差が十分に小さい場合には、図１６に示す線Ｌｔが示す特性は、細胞Ｃの増殖特性を反映していると判断する。
　評価処理を終了すると、評価システムは、端末装置からの要求に応じて、種々の情報を端末装置に出力し、端末装置の表示部に表示させる（ステップＳ３００）。ここでは、制御装置３０は、ステップＳ２０で得られた接着判定結果を、例えば、図１１に示すグラフ形式で端末装置の表示部に表示させてもよい。また、制御装置３０は、ステップＳ１００で得られた分裂判定結果を、例えば、図１６に示すグラフ形式で端末装置の表示部に表示させてもよい。さらに、制御装置３０は、ステップＳ２００で得られた評価結果を、例えば、表形式で、端末装置の表示部に表示させてもよい。
　以上のように構成された評価システムでは、接触部分の輪郭形状に基づいて接着性細胞の接着を判定する。このため、本実施形態に係る評価システムによれば、評価システム１と同様に、細胞種によらず接着性細胞の接着判定を高精度で行うことができる。また、本実施形態に係る評価システムでは、接着判定結果に基づいて、接着性細胞の分裂を判定する。このため、細胞数の変化から分裂による細胞数の増分を間接的に検出する場合と異なり、分裂による細胞数の増分を直接的に検出することができる。これによって、分裂について精度の高い情報を得ることができるため、細胞の増殖特性を正しく評価することができる。
　また、評価システムでは、例えば、分裂を開始したばかりの細胞（分裂開始細胞）、分裂が完了した細胞（分裂完了細胞）、分裂の途中の細胞（分裂中細胞）など、分裂過程の細胞の状態を細かく識別することができる。これらを図１６に示すようにグラフ形式で表示することで、分裂による増殖状況を直感的に把握することができる。また、状態の異なる細胞をそれぞれ個別にカウントすることで、従来の評価では得られなかった分裂時間などの新たな指標を得ることもできる。これによって、細胞培養の状態をさらに詳細に把握することができる。
［第３の実施形態］
　図１８は、本実施形態に係る評価処理のフローチャートである。本実施形態に係る評価システムは、図１７に示す評価処理の代わりに、図１８に示す評価処理を行う点が、第２の実施形態に係る評価システムとは異なっている。以下、図１８を参照しながら、本実施形態に係る評価システム（以降、単に評価システムと記す。）で行われる評価処理について、具体的に説明する。
　評価システムは、図１８に示す評価処理を開始すると、沈降速度と沈降時間を算出し（ステップＳ４０１）、接着速度と接着時間を算出し（ステップＳ４０２）、増殖開始時間を算出し（ステップＳ４０３）、分裂時間を推定し（ステップＳ４０４）、増殖特性の妥当性を評価する（ステップＳ４０５）。ステップＳ４０１からステップＳ４０５までの処理は、図１７に示すステップＳ２０１からステップＳ２０５までの処理と同様である。このため、これらの処理については詳細な説明は省略する。
　その後、評価システムは、培地交換又は継代の必要性を評価する（ステップＳ４０６）。ステップＳ４０６では、制御装置３０は、分裂判定処理によって得られた接着性細胞の分裂状態に基づいて、培地交換又は継代を行うべき時期を推定する。具体的には、制御装置３０は、例えば、増殖期間において、分裂開始細胞数又は分裂完了細胞数が増加しているか否かを判定してもよい。そして、制御装置３０は、増加していないと判定した場合には培地交換が必要であると判定し、その後の表示処理において、培地交換の必要性を報知してもよい。また、制御装置３０は、培地交換後の分裂開始細胞数又は分裂完了細胞数を監視して、培地交換の効果を報知してもよい。例えば、培地交換によっても分裂開始細胞数又は分裂完了細胞数が増加しない場合には、制御装置３０は、継代が必要であると判定し、その後の表示処理において、継代の必要性を報知してもよい。さらに、制御装置３０は、分裂開始細胞数又は分裂完了細胞数が閾値を下回ったか否かを判定してもよい。そして、制御装置３０は、分裂開始細胞数又は分裂完了細胞数が閾値を下回ったと判定した場合には継代が必要であると判定し、その後の表示処理において、継代の必要性を報知してもよい。
　本実施形態に係る評価システムによっても、評価システム１と同様に、細胞種によらず接着性細胞の接着判定を高精度で行うことが可能であり、また、第２の実施形態に係る評価システムと同様に、細胞の増殖特性を正しく評価することができる。
　さらに、評価システムでは、培地交換又は継代の必要性を、分裂判定結果によって得られた細胞の増殖状態についての定量的な情報に基づいて判定することができる。このため、従来行われていた人間の直感若しくは経験に基づく判断（例えば、培地の色に基づく培地交換タイミングの判断、画像からコンフルエント状態を人間が判断することによって行う継代タイミングの判断など）よりも、適切なタイミングで必要な作業を行うことが可能となる。
　上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。上述した実施形態の一部を他の実施形態に適用しても良い。接着性細胞の評価方法、プログラム、記録媒体、及び、接着性細胞の評価システムは、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
　上述した実施形態では、接着判定処理において、制御装置３０が特定した接触部分の輪郭形状に基づいて接着を判定する例を示した。しかしながら、制御装置３０は、特定した接触部分の輪郭形状に基づいて、まず、接着性細胞の仮足の有無を判定してもよい。仮足の有無は、例えば、特定した接触部分から算出される真円度に基づいて判定してもよい。また仮足の有無を判定した教師データを用いて学習済みモデルを作成し、それを用いて判定しても良い。そして、仮足があると判定された場合に、接着性細胞が培養容器に接着していると判断してもよい。
　上述した実施形態では、接着細胞の数がある閾値に達した時間を増殖開始時間として特定する例を示したが、増殖開始時間の特定方法はこの例に限らない。増殖開始時間は、未接着細胞数が減少から増加に転じた時間として特定してもよい。これは、未接着細胞が減少から増加に転じた状態は、分裂のために細胞の接着状態から未接着状態への変化が進んでいることを示唆しているからである。
　以上では、評価システム１の処理を中心に記載したが、利用者がシステム１を用いて培養細胞を評価する場合の作業の流れを説明する。利用者は、インキュベータ２０内に設置した撮像装置１０上に培養容器１００を設置すると、撮影開始を評価システム１に指示する。評価システム１は、利用者からの指示を受けると、図８に示す処理を開始し、画像取得処理、接着判定処理、分裂判定処理、計数処理、評価処理、表示処理を行う。画像取得処理とその他の処理の実施タイミングは同期していてもよく別々に行われてもよい。即ち、画像が取得されるたびに、判定処理、計数処理、評価処理、表示処理が行われてもよい。また、画像が取得され、ある程度画像が溜まった後に、判定処理、計数処理、評価処理、表示処理が行われてもよい。さらに、画像がすべて取得され後に、判定処理、計数処理、評価処理、表示処理が行われてもよい。その後、利用者は、表示処理によって表示された情報を確認し、培養細胞を評価する。以上のように、利用者は、評価システム１から提供される情報に基づいて、培養細胞を評価することができる。即ち、評価システム１は、自身で培養細胞を評価するだけではなく、利用者による培養細胞の評価を支援することができる。
１　　　　　　　　　　　　　評価システム
１０、１０Ａ～１０Ｄ　　　　撮像装置
１１　　　　　　　　　　　　筐体
１２　　　　　　　　　　　　ステージ
１３　　　　　　　　　　　　撮像ユニット
１４　　　　　　　　　　　　撮像素子
１５　　　　　　　　　　　　光源
１６　　　　　　　　　　　　走査機構
２０　　　　　　　　　　　　インキュベータ
３０　　　　　　　　　　　　制御装置
３１　　　　　　　　　　　　プロセッサ
３２　　　　　　　　　　　　メモリ
３３　　　　　　　　　　　　補助記憶装置
３４　　　　　　　　　　　　Ｉ／Ｏインターフェース
３５　　　　　　　　　　　　媒体駆動装置
３６　　　　　　　　　　　　通信モジュール
３７　　　　　　　　　　　　バス
３８　　　　　　　　　　　　可搬記憶媒体
４０、５０　　　　　　　　　端末装置
４１、５１　　　　　　　　　ディスプレイ
１００、１００ａ～１００ｄ　培養容器
Ｂ　　　　　　　　　　　　　底面
Ｃ、Ｃ１、Ｃ２　　　　　　　細胞
ＣＡ　　　　　　　　　　　　接触部分
Ｍ　　　　　　　　　　　　　培地

Claims (14)

  1. 　培養容器に収容された接着性細胞の画像を取得することと、
    　少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定することと、を含む
    ことを特徴とする接着性細胞の評価方法。
  2. 　請求項１に記載の評価方法において、
    　前記接着を判定することは、
    　　前記画像に基づいて前記接触部分の輪郭形状を特定することと、
    　　特定した前記接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞の仮足の有無を判定することと、
    　　前記仮足があると判定した場合に、前記接着性細胞が前記培養容器に接着していると判定することと、を含む
    ことを特徴とする評価方法。
  3. 　請求項１に記載の評価方法において、
    　前記接着を判定することは、
    　　前記画像に基づいて前記接触部分の輪郭形状を特定することと、
    　　特定した前記接触部分の輪郭形状の基準形状からのずれに基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定することを含む
    ことを特徴とする評価方法。
  4. 　　請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の評価方法において、
    　前記接着を判定することは、
    　　前記画像に基づいて、前記接触部分の輪郭形状を特定することと、
    　　　前記画像に基づいて、前記接着性細胞の表面の凹凸の有無を判定することと、
    　　　少なくとも前記接触部分の輪郭形状と前記凹凸の有無に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定することと、を含む
    ことを特徴とする評価方法。
  5. 　請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の評価方法において、
    　前記接着を判定することは、
    　　前記画像に基づいて、前記接触部分の輪郭を特定することと、
    　　前記画像に基づいて、前記接着性細胞の表面の凹凸の有無を判定することと、
    　　前記画像に基づいて、前記凹凸があると判定された前記接着性細胞の大きさが閾値以上か否かを判定することと、
    　　少なくとも前記接触部分の輪郭形状と前記凹凸の有無と前記接着性細胞の大きさが閾値以上か否かとに基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定することと、を含む
    ことを特徴とする評価方法。
  6. 　請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の評価方法において、さらに、
    　前記接着性細胞と前記培養容器との接着の判定結果に基づいて、前記接着性細胞の分裂状態を特定することを含む
    ことを特徴とする評価方法。
  7. 　請求項６に記載の評価方法において、
    　前記接着性細胞の分裂状態を特定することは、接着状態から未接着状態へ変化した接着性細胞を、分裂を開始した細胞として特定することを含む
    ことを特徴とする評価方法。
  8. 　請求項７に記載の評価方法において、
    　前記接着性細胞の分裂状態を特定することは、さらに、
    　　前記分裂を開始した細胞から互いに近接した細胞のペアに変化した細胞を、前記分裂が完了した細胞として特定することと、を含み、
    　前記評価方法は、さらに、前記分裂を開始した細胞数と前記分裂が完了した細胞数の時間変化に基づいて、分裂開始から分裂終了までの時間を推定することを含む
    ことを特徴とする評価方法。
  9. 　請求項６乃至請求項８のいずれか１項に記載の評価方法において、さらに、
    　前記接着性細胞の分裂状態に基づいて、培地交換又は継代を行うべき時期を推定することを含む
    ことを特徴とする評価方法。
  10. 　請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の評価方法において、
    　前記画像を取得することは、
    　　フォーカス位置の異なる複数の画像を取得することと、
    　　前記複数の画像のコントラストを算出することと、
    　　前記複数の画像のコントラストに基づいて、前記接着の判定に用いる選択画像を、前記複数の画像から選択することと、を含み、
    　前記接着を判定することは、前記選択画像に基づいて、前記接着を判定することを含む
    ことを特徴とする評価方法。
  11. 　コンピュータに、
    　培養容器に収容された接着性細胞の画像を取得し、
    　少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定する
    処理を実行させることを特徴とするプログラム。
  12. 　コンピュータに、
    　培養容器に収容された接着性細胞の画像を取得し、
    　少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定する
    処理を実行させるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
  13. 　培養容器に収容された接着性細胞を撮像する撮像装置と、
    　プロセッサと、を備え、
    　前記プロセッサは、
    　　前記撮像装置で取得した画像を取得し、
    　　少なくとも前記画像から特定される前記接着性細胞の前記培養容器との接触部分の輪郭形状に基づいて、前記接着性細胞と前記培養容器との接着を判定する
    ことを特徴とする接着性細胞の評価システム。
  14. 　請求項１３に記載のシステムにおいて、
    　前記撮像装置は、
    　　前記培養容器が載置されるステージと、
    　　前記ステージの下方に配置された撮像素子と、
    　　前記培養容器を前記ステージの下方から照明する、前記撮像素子の周囲に配置された光源を含む
    ことを特徴とする評価システム。
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