JP2009089629A - 細胞観察装置および細胞観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養容器内の個々の細胞の挙動を観察する。
【解決手段】画像処理装置１２は、培養容器３１内の細胞の細胞画像に基づいて、細胞が単一細胞であるか、または、多細胞の細胞塊であるかを判定する。画像処理装置１２は、細胞画像に基づいて、単一細胞であると判定された細胞が、培養容器３１内に浮遊しているか、または、培養容器３１に部分的に接着しているかを判定する。画像処理装置１２は、培養容器３１に部分的に接着していると判定された細胞に細胞ＩＤを付与する。画像処理装置１２は、細胞画像に基づいて、細胞ＩＤが付与された細胞が分裂しているか、または死滅しているかを判定する。本発明は、例えば細胞観察システムに適用することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞観察装置および細胞観察方法に関する。

従来、マイクロプレートのウェル内の複数の細胞の画像を顕微鏡で取り込み、その画像から複数の細胞の各々の初期状態を認定して、ウェルの中に薬物を導入し、その後に顕微鏡で取り込んだ画像に基づいて薬物を導入した後の複数の細胞の各々の反応を検出し、複数の細胞の各々の初期状態と反応との相関情報を生成する細胞観察装置がある（例えば、特許文献１参照）。

ところで、この細胞観察装置では、個々の細胞が静的なものとして扱われているが、実際には、細胞は接着状態であっても移動するものである。即ち、細胞は移動して分裂していくものである。また、細胞は死滅することもある。そして、このような細胞の挙動は個々の細胞で異なるものであり、個々の細胞の挙動を把握することは、例えば癌化のメカニズムや、再生医療実現のツールとして重要視されている幹細胞の性質などを解明するために、必要不可欠であると考えられている。従って、個々の細胞を特定し、その挙動を経時的に観察したいという要望があった。
特開２００５−１０２５３８号公報

しかしながら、個々の細胞の挙動を観察する細胞観察装置は考案されていなかった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、培養容器内の個々の細胞の挙動を観察することができるようにするものである。

本発明の細胞観察装置は、培養容器内の細胞の画像を取得する取得手段と、前記画像に基づいて、前記細胞が単一細胞であるか、または、多細胞の細胞塊であるかを判定する細胞判定手段と、前記画像に基づいて、前記細胞判定手段により前記単一細胞であると判定された細胞が、前記培養容器内に浮遊しているか、または、前記培養容器に部分的に接着しているかを判定する浮遊判定手段と、前記浮遊判定手段により前記培養容器に部分的に接着していると判定された細胞に、その細胞に固有の情報である固有情報を付与する付与手段と、前記画像に基づいて、前記固有情報が付与された細胞が分裂しているか、または死滅しているかを判定する挙動判定手段とを備えることを特徴とする。

本発明の細胞観察方法は、培養容器内の細胞を観察する細胞観察装置の細胞観察方法において、前記培養容器内の細胞の画像を取得し、前記画像に基づいて、前記細胞が単一細胞であるか、または、多細胞の細胞塊であるかを判定し、前記画像に基づいて、前記単一細胞であると判定された細胞が、前記培養容器内に浮遊しているか、または、前記培養容器に部分的に接着しているかを判定し、前記培養容器に部分的に接着していると判定された細胞に、その細胞に固有の情報である固有情報を付与し、前記画像に基づいて、前記固有情報が付与された細胞が分裂しているか、または死滅しているかを判定するステップを含むことを特徴とする。

以上のように、本発明によれば、培養容器内の細胞の画像を取得し、画像に基づいて、細胞が単一細胞であるか、または、多細胞の細胞塊であるかを判定し、画像に基づいて、単一細胞であると判定された細胞が、培養容器内に浮遊しているか、または、培養容器に部分的に接着しているかを判定し、培養容器に部分的に接着していると判定された細胞に、その細胞に固有の情報である固有情報を付与し、画像に基づいて、固有情報が付与された細胞が分裂しているか、または死滅しているかを判定するようにしたので、培養容器内の個々の細胞の挙動を観察することができる。

図１は、本発明を適用した細胞観察システムの一実施の形態の構成例を示している。

図１の細胞観察システム１０は、位相差顕微鏡１１と画像処理装置１２により構成される。

位相差顕微鏡１１は、図１に示すように、光源側から順に、光源２１、コレクタレンズ２２、拡散板２３、開口絞り２４、コンデンサレンズ２５、ステージ２６、対物レンズ２７、結像レンズ２８、およびCCD(Charge Coupled Device)カメラ２９により構成される。位相差顕微鏡１１は、ステージ２６に載置されるウェルプレートなどの培養容器３１内の培養環境にある試料ｏとしての細胞に光を照射し、その細胞の画像である細胞画像を撮像する。このとき、観察対象となる細胞は接着細胞であるため、培養容器３１の底面に接着する細胞を観察するように、位相差顕微鏡１１の焦点は培養容器３１の底面に合わせられる。

詳細には、位相差顕微鏡１１の光源２１は所定の光を出射する。光源２１から出射された光はコレクタレンズ２２により略平行光束になる。この略平行光束は、拡散板２３を介して、輪帯形状（リング形状）の開口絞り２４によって制限される。そして、開口絞り２４を通過した光は、コンデンサレンズ２５によって集光され、ステージ２６に載置される培養容器３１内の試料ｏとしての細胞に照射される。

細胞を透過した直接光（０次の回折光）は、対物レンズ２７に入射し、対物レンズ２７内のリング状の位相膜（図示せず）を透過することによって位相が変換される。なお、この位相膜は、対物レンズ２７内であって開口絞り２４と共役な位置に設けられている。また、位相膜は、対物レンズ２７の開口数の違いによってその径が異なるため、開口絞り２４は位相膜の径に応じて開口が異なるものに適宜変更される。

また、細胞によって回折されることで直接光に対して位相がずれた０次以外の回折光は、対物レンズ２７に入射し、対物レンズ２７内の位相膜以外の部分を透過する。そして、対物レンズ２７を透過した直接光と回折光は、結像レンズ２８によって結像されてCCDカメラ２９の撮像面上で干渉する。これにより、CCDカメラ２９の撮像面上には、細胞の拡大像Ｉが形成される。CCDカメラ２９は、制御部３０からの指令に応じて、撮像面上に形成された拡大像Ｉを細胞画像として撮像する。

以上のように、位相差顕微鏡１１では、試料ｏとしての細胞の屈折力の差や厚みなどによって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変換して像の明暗として可視化することで、細胞画像を観察することができる。

なお、制御部３０は、位相差顕微鏡１１の各部を制御する。例えば、制御部３０は、画像処理装置１２からのステージ２６の移動の指令に応じてステージ２６を所定の方向に移動させ、培養容器３１内に対流を発生させる。これにより、培養容器３１内の細胞に、培養容器３１内に浮遊している細胞の位置がずれ、かつ、培養容器３１に部分的に接着している細胞の位置がずれない程度(以下、浮遊ずれ程度という)の物理的振動が与えられる。

さらに、制御部３０は、画像処理装置１２からの撮像の開始の指令に応じて、比較的短い間隔でCCDカメラ２９に撮像の指令を行う。なお、この間隔は、例えば細胞の移動速度に応じて決定される。具体的には、撮像間隔は、連続画像の中で細胞の同一性が認識できる程度の間隔であり、動きの早い細胞の場合は比較的短い時間間隔で、動きの遅い細胞の場合は比較的長い時間間隔で撮像が行われる。

画像処理装置１２には、CCDカメラ２９により撮像された細胞画像が入力される。画像処理装置１２は、入力された細胞画像を解析する。そして、画像処理装置１２は、培養容器３１に部分的に接着している単一細胞に、その単一細胞に固有の情報としての細胞ＩＤを付与する。

このとき、画像処理装置１２は、培養容器３１に部分的に接着している単一細胞を検出するために、所定のタイミングで制御部３０にステージ２６の移動を指令して細胞に振動を与える。

また、画像処理装置１２は、細胞画像に基づいて、細胞ＩＤが付与された細胞の挙動を追跡する。さらに、画像処理装置１２は、ユーザからの解析の開始の指示に応じて、制御部３０に撮像の開始を指令する。

以上のように、画像処理装置１２は、培養容器３１に部分的に接着している単一細胞に細胞ＩＤを付与し、細胞ＩＤが付与された細胞の挙動を追跡するので、培養容器３１内の個々の細胞の挙動を独立して観察することができる。

次に、図２Ａと図２Ｂを参照して、培養環境にある単一細胞の状態の経時的変化ついて説明する。

なお、図２Ａと図２Ｂでは、左から右に向かって時間が経過していくものとする。また、図２Ａは、各状態の単一細胞の横方向（重力方向に垂直な方向）から見た形状を模式的に示しており、図２Ｂは、各状態の単一細胞の細胞画像を模式的に示している。

図２Ａに示すように、培養容器３１内の単一細胞は、最初、培養容器３１内を浮遊している状態ａにある。この場合、図２Ａに示すように、単一細胞の横方向から見た２次元形状は略円形であり、図２Ｂに示すように、細胞画像における単一細胞の２次元形状も略円形である。即ち、単一細胞の３次元形状は略球形である。また、図２Ｂに示すように、状態ａの単一細胞の境界に見えるハローは強い。さらに、図２Ｂに示すように、状態ａの単一細胞の細胞移動度は低く、培養容器３１を動かさなければ状態ａの単一細胞は２次元方向（観察光軸に略垂直な面内）には移動しない。

そして時間が経過すると、図２Ａに示すように、単一細胞は分裂を始めるため、状態ａから培養容器３１に部分的に接着する状態ｂになる。この場合、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の３次元形状、ハローの強度、および細胞移動度は変化しない。

さらに時間が経過すると、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞は、状態ｂから足場を形成した状態ｃに変化する。この場合、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の３次元形状は球形からかけ離れた突起を有する形状になり、その形状は経時的に変化する。

なお、状態ｃの単一細胞の細胞画像においては、細胞核を含む細胞オルガネラを認識することができる。また、単一細胞の状態が状態ｃになると、図２Ｂに示すように、ハローは弱くなり、細胞移動度は高くなる。従って、細胞移動度が高い単一細胞は、状態ｃになると移動を開始する。

そしてさらに時間が経過し、分裂する直前になると、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の状態は、状態ｃから分裂前の丸まっている状態ｄに変化する。この場合、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の３次元形状は再び球形になり、ハローは強くなる。また、図２Ｂに示すように、細胞移動度は低くなり、単一細胞はあまり移動しなくなる。

さらに時間が経過すると、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の状態は、状態ｄから分裂した状態ｅに変化する。この場合、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の３次元形状にはくびれが発生するが、ハローの強度と細胞移動度は変化しない。

そしてさらに時間が経過すると、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の状態は、状態ｅから分裂した細胞が足場を形成した状態ｆに変化する。この場合、図２Ａと図２Ｂに示すように、単一細胞の３次元形状は突起を有する形状になる。また、図２Ｂに示すように、ハローは弱くなり、細胞移動度は高くなる。従って、単一細胞は状態ｆになると再び移動を開始する。

この後、分裂した２つの単一細胞はそれぞれ状態ｄになり、以降も同様に状態の変化を繰り返す。なお、培養環境にある単一細胞は、上述した状態ａ乃至ｆのいずれかになるだけでなく死滅する場合もある。

図１の画像処理装置１２は、生きている細胞の最も原始的な状態である状態ｂの単一細胞に細胞ＩＤを付与する。従って、画像処理装置１２は、細胞画像から単一細胞の状態が状態ａであるか、状態ｂであるかを判定する必要がある。

そこで、画像処理装置１２は、図１の制御部３０を制御して培養容器３１内の細胞に浮遊ずれ程度の振動を与え、振動の前後の細胞画像における単一細胞の位置の変化によって状態ｂを判定する。

即ち、単一細胞の状態が状態ｂである場合、浮遊ずれ程度の振動が与えられても単一細胞の位置は変化しないが、単一細胞の状態が状態ａである場合、浮遊ずれ程度の振動が与えられると単一細胞の位置は変化する。従って、浮遊判定部８３は、浮遊ずれ程度の振動が与えられても単一細胞の位置が変化しない場合、その単一細胞の状態が状態ｂであると判定し、単一細胞の位置が変化する場合、その単一細胞の状態が状態ａであると判定する。

なお、単一細胞の状態が状態ａまたはｂである場合、培養容器３１を動かさなければ細胞は２次元方向には移動しないので、CCDカメラ２９が細胞画像を比較的短い間隔で撮像することにより、振動の前後の細胞画像から、振動以外の要因による単一細胞の位置の変化がほとんど検出されないようにすることができる。

実際には、培養容器３１に振動を与えた前後における単一細胞の輪郭中心位置の変化量が所定値以内であるものを接着細胞、所定値より大きいものを浮遊細胞と判定することができる。この所定値と撮像間隔とは、細胞の種類に応じて実験により定めることができる。

また、画像処理装置１２は、単一細胞の挙動として、状態ｃのときの移動、状態ｅのときの分裂、および死滅を観察する。

図３は、図１の画像処理装置１２のハードウェアの構成例を示している。

図３の画像処理装置１２のCPU（Central Processing Unit）５１は、ROM（Read Only Memory）５２、または記憶部５８に記憶されているプログラムにしたがって各種の処理を実行する。RAM（Random Access Memory）５３には、CPU５１が実行するプログラムやデータなどが適宜記憶される。これらのCPU５１、ROM５２、およびRAM５３は、バス５４により相互に接続されている。

CPU５１にはまた、バス５４を介して入出力インターフェース５５が接続されている。入出力インターフェース５５には、キーボード、マウス、操作ボタンなどよりなる入力部５６、ディスプレイ、スピーカなどよりなる出力部５７が接続されている。CPU５１は、入力部５６から入力される指令に対応して各種の処理を実行する。なお、CPU５１が実行する処理の詳細については、後述する図４を参照して説明する。

入力部５６は、ユーザからの操作を受け付け、その操作に対応する指令をCPU５１に入力する。出力部５７は、CPU５１からの指令に応じて画像や音声を出力する。

入出力インターフェース５５にはまた、例えばハードディスクからなる記憶部５８が接続されている。記憶部５８は、CPU５１が実行するプログラムや各種のデータを記憶する。また、記憶部５８は、図１のCCDカメラ２９から後述する通信部５９を介して送信されてくる細胞画像などを記憶する。

入出力インターフェース５５にはさらに、通信部５９が接続されている。通信部５９は、インターネットやローカルエリアネットワークなどのネットワークを介して、位相差顕微鏡１１などの外部の装置と通信する。例えば、通信部５９は、ネットワークを介して位相差顕微鏡１１のCCDカメラ２９と通信し、CCDカメラ２９から細胞画像を取得する。

入出力インターフェース５５にはまた、ドライブ６０が接続されている。ドライブ６０は、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、或いは半導体メモリなどのリムーバブルメディア６１が装着されたとき、それらを駆動し、そこに記録されているプログラムやデータなどを取得する。取得されたプログラムやデータは、必要に応じて記憶部５８に転送され、記憶される。なお、プログラムは、通信部５９を介して取得され、記憶部５８に記憶されてもよい。

図４は、図３のCPU５１の機能的構成例を示している。

図４のCPU５１の取得部８１は、図１のCCDカメラ２９により撮像された細胞画像を、解析の対象とする対象細胞画像として、通信部５９を介して取得する。取得部８１は、その細胞画像を細胞判定部８２に供給するとともに、表示制御部８５に供給する。

細胞判定部８２は、取得部８１から供給される対象細胞画像に基づいて、その対象細胞画像内の単一細胞の形状と輪郭中心の対象細胞画像上の位置とを検出し、その形状と位置を表す形状位置情報を浮遊判定部８３と挙動判定部８７に供給する。また、細胞判定部８２は、対象細胞画像と形状位置情報を記憶読出制御部８６に供給して、図３の記憶部５８に記憶させる。

浮遊判定部８３は、指令部８８から供給される培養容器３１内の細胞が振動した旨の通知に応じて、対象細胞画像の１つ前に撮像された細胞画像（以下、前細胞画像という）の形状位置情報、および、単一細胞に付与された細胞ＩＤと、その単一細胞の形状位置情報とを対応付けた識別テーブルの記憶部５８からの読み出しを、記憶読出制御部８６に要求する。

また、浮遊判定部８３は、その要求に応じて記憶読出制御部８６から供給される前細胞画像の形状位置情報および識別テーブルと、細胞判定部８２から供給される対象細胞画像の形状位置情報とに基づいて、対象細胞画像内のまだ細胞ＩＤが付与されていない単一細胞（以下、未付与単一細胞という）のうちの状態ｂの単一細胞の形状位置情報を、付与部８４に供給する。

付与部８４は、浮遊判定部８３から供給される形状位置情報に対応する未付与単一細胞に細胞ＩＤを付与する。また、付与部８４は、その細胞ＩＤ、その細胞ＩＤが付与された単一細胞の形状位置情報、および対象細胞画像の撮像時刻を記憶読出制御部８６に供給し、記憶部５８に記憶されている識別テーブルに登録する。なお、対象細胞画像の撮像時刻は、例えばCCDカメラ２９により対象細胞画像に付加され、画像処理装置１２に入力されたものである。

表示制御部８５は、取得部８１から供給される細胞画像を出力部５７に供給して表示させる。記憶読出制御部８６は、記憶部５８に対する記憶と読み出しの制御を行う。具体的には、記憶読出制御部８６は、細胞判定部８２から供給される対象細胞画像と形状位置情報を対応付けて記憶部５８に記憶させる。

また、記憶読出制御部８６は、浮遊判定部８３からの要求に応じて、記憶部５８から前細胞画像に対応付けられている形状位置情報と識別テーブルを読み出し、浮遊判定部８３に供給する。記憶読出制御部８６は、挙動判定部８７からの要求に応じて記憶部５８から識別テーブルを読み出し、挙動判定部８７に供給する。

さらに、記憶読出制御部８６は、付与部８４から供給される細胞ＩＤに対応付けて、形状位置情報および対象細胞画像の撮像時刻を、記憶部５８に記憶されている識別テーブルに登録する。また、記憶読出制御部８６は、挙動判定部８７から供給される、細胞ＩＤが付与された単一細胞の挙動を表す挙動情報を、その細胞ＩＤに対応付けて識別テーブルに登録する。

挙動判定部８７は、識別テーブルの読み出しを記憶読出制御部８６に要求する。挙動判定部８７は、要求に応じて記憶読出制御部８６から供給される識別テーブルと、細胞判定部８２から供給される対象細胞画像の形状位置情報とに基づいて、細胞ＩＤが付与された単一細胞が移動しているか、分裂しているか、または、死滅しているかを判定する。

挙動判定部８７は、対象細胞画像の撮像時刻、判定対象である単一細胞の対象細胞画像における形状位置情報、判定結果である「移動」、「死滅」、または「分裂」などを対応付けた情報を、判定対象である単一細胞の挙動情報として、その単一細胞の細胞ＩＤとともに記憶読出制御部８６に供給する。

指令部８８は、図３の入力部５６から入力される解析の開始の指令に応じて、図１の制御部３０に撮像の開始を指令する。また、指令部８８は、所定のタイミングでステージ２６の移動を制御部３０に指令して、培養容器３１内の細胞に浮遊ずれ程度の振動を与えるとともに、培養容器３１内の細胞が振動した旨を浮遊判定部８３に通知する。

次に、図５のフローチャートを参照して、図４のCPU５１による細胞画像の解析処理について説明する。この解析処理は、例えば、ユーザが入力部５６を操作して、細胞画像の解析の開始を指示したときに開始される。

ステップＳ１１において、取得部８１は、通信部５９を介してCCDカメラ２９から細胞画像を取得したかを判定し、細胞画像を取得したと判定するまで待機する。

具体的には、ユーザが入力部５６を操作して細胞画像の解析の開始を指示すると、入力部５６は、細胞画像の解析の開始を指令部８８に指令する。指令部８８は、その指令に応じて位相差顕微鏡１１の制御部３０に撮像の開始を指令する。制御部３０は、その指令に応じて比較的短い間隔でCCDカメラ２９に撮像の指令を行い、その結果CCDカメラ２９により得られる細胞画像が通信部５９を介して取得部８１に供給される。取得部８１は、その細胞画像を取得するまで待機する。

ステップＳ１１で細胞画像を取得したと判定された場合、取得部８１は、取得した細胞画像を対象細胞画像として細胞判定部８２と表示制御部８５に供給する。そして、ステップＳ１２において、細胞判定部８２は、対象細胞画像に基づいて、その対象細胞画像に単一細胞があるかを判定する。

具体的には、細胞判定部８２は、円環形状検出手法などの手法を用いて対象細胞画像内から円環形状のハローを抽出する。そして、細胞判定部８２は、抽出した円環形状のハローの大きさに基づいて、そのハローに対応する細胞が単一細胞であるかを判定する。

なお、円環形状検出手法としては、例えば細胞画像内の所定の測定点としての画素から延びる所定の形状を有した輝度測定領域内の輝度分布を、その測定点を中心に輝度測定領域を所定角度ずつ回転させてそれぞれ測定し、この輝度分布を積算して輝度測定領域に対応する第１の積算輝度分布を算出し、輝度測定領域における所定部分領域内の測定輝度値を輝度測定領域の所定角度の回転それぞれについて積算して、所定角度の回転に応じて部分領域を円環状に繋げた円環状測定領域における第２の積算輝度分布を算出し、第１の積算輝度分布と第２の積算輝度分布に基づいて細胞画像内の円環形状を検出する方法を用いることができる。また、輪郭（外径形状）を検出する周知の各種画像処理手法を用いることもできる。

ステップＳ１２で単一細胞があると判定された場合、ステップＳ１３において、細胞判定部８２は、その単一細胞のハローを含む領域を、単一細胞の存在する領域である細胞存在領域として対象細胞画像から抽出する。

ステップＳ１４において、細胞判定部８２は、各単一細胞の内側のエッジを抽出する。具体的には、細胞判定部８２は、対象細胞画像から抽出した各単一細胞の細胞存在領域内にあるエッジのうち輪郭が最長のものを、各単一細胞の内側のエッジとして抽出する。

ステップＳ１５において、細胞判定部８２は、各単一細胞の内側のエッジの形状を各単一細胞の形状として、各単一細胞の形状の輪郭中心の対象細胞画像上の位置を検出する。そして、細胞判定部８２は、その形状と位置を表す形状位置情報を浮遊判定部８３と挙動判定部８７に供給する。また、細胞判定部８２は、対象細胞画像と形状位置情報を記憶読出制御部８６に供給して記憶部５８に記憶させる。

ステップＳ１６において、CPU５１は、状態ｂの単一細胞に細胞ＩＤを付与する識別処理を行う。この識別処理の詳細は、後述する図６を参照して説明する。

ステップＳ１７において、CPU５１は、細胞ＩＤが付与された単一細胞が移動しているかを判定する移動判定処理を行う。この移動判定処理の詳細は、後述する図７を参照して説明する。

ステップＳ１８において、CPU５１は、細胞ＩＤが付与された単一細胞が分裂しているかを判定する分裂判定処理を行う。この分裂判定処理の詳細は、後述する図８を参照して説明する。

ステップＳ１９において、CPU５１は、細胞ＩＤが付与された単一細胞が死滅しているかを判定する死滅判定処理を行う。この死滅判定処理の詳細は、後述する図９を参照して説明する。ステップＳ１９の処理後、処理はステップＳ２０に進む。

一方、ステップＳ１２で単一細胞がないと判定された場合、即ち対象細胞画像内の細胞が全て多細胞の細胞塊である場合、処理はステップＳ１３乃至Ｓ１９をスキップして、ステップＳ２０に進む。

ステップＳ２０において、指令部８８は、入力部５６から解析の終了が指令されたか、即ちユーザが入力部５６を操作して解析の終了を指示したかを判定する。ステップＳ２０で解析の終了が指令されていないと判定された場合、処理はステップＳ１１に戻り、以降の処理が繰り返される。また、ステップＳ２０で解析の終了が指令されたと判定された場合、処理は終了する。

なお、図５の解析処理では、ハローの大きさによって細胞が単一細胞であるかが判定されたが、ハローの大きさだけでなく、ハローの形状や核の数などによって判定されるようにしてもよい。

次に、図６のフローチャートを参照して、図５のステップＳ１６の識別処理の詳細について説明する。

ステップＳ３１において、浮遊判定部８３は、対象細胞画像の撮像直前に培養容器３１内の細胞が振動したか、即ち、指令部８８から培養容器３１内の細胞が振動した旨の通知が供給されたかを判定する。ステップＳ３１で培養容器３１内の細胞が振動していないと判定された場合、処理は図５のステップＳ１６に戻り、以降の処理が行われる。

一方、ステップＳ３１で培養容器３１内の細胞が振動したと判定された場合、ステップＳ３２において、浮遊判定部８３は、未付与単一細胞があるかを判定する。具体的には、浮遊判定部８３は、識別テーブルの読み出しを記憶読出制御部８６に要求する。記憶読出制御部８６は、その要求に応じて識別テーブルを記憶部５８から読み出し、その識別テーブルを浮遊判定部８３に供給する。浮遊判定部８３は、細胞判定部８２からの対象細胞画像の形状位置情報のうち、記憶読出制御部８６からの識別テーブルに登録されていない形状位置情報があるかを判定する。

ステップＳ３２で未付与単一細胞がないと判定された場合、即ち対象細胞画像の形状位置情報の全てが識別テーブルに既に登録されていると判定された場合、処理は図５のステップＳ１６に戻り、以降の処理が行われる。

一方、ステップＳ３２で未付与単一細胞があると判定された場合、即ち対象細胞画像の形状位置情報のうち識別テーブルに登録されていない形状位置情報があると判定された場合、浮遊判定部８３は、記憶読出制御部８６に前細胞画像の形状位置情報の読み出しを要求する。そして、ステップＳ３３において、記憶読出制御部８６は、浮遊判定部８３からの要求に応じて、記憶部５８から前細胞画像の形状位置情報を読み出す。

ステップＳ３４において、浮遊判定部８３は、対象細胞画像の未付与単一細胞の形状位置情報と、前細胞画像の未付与単一細胞の形状位置情報とに基づいて、その未付与単一細胞の移動距離を計算する。

具体的には、浮遊判定部８３は、対象細胞画像の形状位置情報から、識別テーブルに登録されていない形状位置情報を、対象細胞画像の未付与単一細胞の形状位置情報として選択する。また、浮遊判定部８３は、前細胞画像の形状位置情報から、識別テーブルに登録されていない形状位置情報を、前細胞画像の未付与単一細胞の形状位置情報として選択する。さらに、浮遊判定部８３は、対象細胞画像の未付与単一細胞の形状位置情報が表す位置と、前細胞画像の未付与単一細胞の形状位置情報が表す位置との距離を計算する。そして、浮遊判定部８３は、その距離の最小値を、未付与単一細胞の移動距離とする。

ステップＳ３５において、浮遊判定部８３はカウント値Ｌを１にする。ステップＳ３６において、浮遊判定部８３は、移動距離に基づいて、先頭からＬ番目の未付与単一細胞が培養容器３１に部分的に接着しているかを判定する。例えば、浮遊判定部８３は、移動距離が、予め設定された閾値未満であるかを判定する。なお、この閾値としては、任意の値(例えば、単一細胞の半径や直径など)を設定することができる。

ステップＳ３６でＬ番目の未付与単一細胞が培養容器３１に部分的に接着している、例えば移動距離が閾値未満であると判定された場合、浮遊判定部８３は、Ｌ番目の未付与単一細胞の形状位置情報を付与部８４に供給する。そして、ステップＳ３７において、付与部８４は、Ｌ番目の未付与単一細胞に細胞ＩＤを付与する。

以上のように、画像処理装置１２では、生きている細胞の最も原始的な状態である、部分的に接着している状態ｂの未付与単一細胞に細胞ＩＤが付与されるので、細胞ＩＤが付与された各単一細胞の挙動を観察することにより、各単一細胞の挙動を最初から確実に観察することができる。従って、画像処理装置１２では、各単一細胞の挙動を観察する場合において最適な時期に、各単一細胞に対して細胞ＩＤを付与することができるといえる。

ステップＳ３８において、付与部８４は、Ｌ番目の未付与単一細胞の細胞ＩＤおよび形状位置情報、並びに対象細胞画像の撮像時刻を記憶読出制御部８６に供給して、記憶部５８に記憶されている識別テーブルに登録する。そして処理はステップＳ３９に進む。

一方、ステップＳ３６でＬ番目の未付与単一細胞が培養容器３１に部分的に接着していないと判定された場合、即ち、Ｌ番目の未付与単一細胞は浮遊していると判定された場合、処理はステップＳ３７とＳ３８をスキップして、ステップＳ３９に進む。

ステップＳ３９において、浮遊判定部８３は、全ての未付与単一細胞に対するステップＳ３６の判定が行われたかを判定する。ステップＳ３９でまだ全ての未付与単一細胞に対するステップＳ３６の判定が行われていないと判定された場合、ステップＳ４０において、浮遊判定部８３はカウント値Ｌを１だけインクリメントする。そして処理はステップＳ３６に戻り、上述した処理が繰り返される。

一方、ステップＳ３９で全ての未付与単一細胞に対するステップＳ３６の判定が行われたと判定された場合、処理は図５のステップＳ１６に戻り、以降の処理が行われる。

次に、図７のフローチャートを参照して、図５のステップＳ１７の移動判定処理の詳細について説明する。

ステップＳ６１において、挙動判定部８７は、細胞判定部８２から供給される対象細胞画像の全ての形状位置情報に基づいて、状態ｃの単一細胞があるか、即ち移動している単一細胞があるかを判定する。具体的には、挙動判定部８７は、対象細胞画像の少なくとも１つの形状位置情報が円形と楕円形ではない形状を表しているかを判定する。

ステップＳ６１で対象細胞画像内に状態ｃの単一細胞がない、即ち対象細胞画像の全ての形状位置情報が円形または楕円形を表していると判定された場合、処理は図５のステップＳ１７に戻り、以降の処理が行われる。

一方、ステップＳ６１で対象細胞画像内に状態ｃの単一細胞がある、即ち対象細胞画像の少なくとも１つの形状位置情報が円形と楕円形ではない形状を表していると判定された場合、処理はステップＳ６２に進む。

ステップＳ６２において、挙動判定部８７は、識別テーブルに登録されている形状位置情報と、対象細胞画像における状態ｃの各単一細胞の形状位置情報とに基づいて、状態ｃの各単一細胞の細胞ＩＤを認識する。

具体的には、挙動判定部８７は、記憶部５８から読みされた識別テーブルに登録されている各細胞ＩＤに対応する最近の形状位置情報が表す位置と、対象細胞画像における状態ｃの各単一細胞の形状位置情報が表す位置との距離を、移動距離の候補としてそれぞれ求める。そして、挙動判定部８７は、状態ｃの各単一細胞において、その移動距離の候補が最小となる場合の細胞ＩＤを、その状態ｃの単一細胞の細胞ＩＤとする。

ステップＳ６３において、挙動判定部８７は、ステップＳ６２で認識した状態ｃの各単一細胞の細胞ＩＤに対応付けて、対象細胞画像の撮像時刻、その状態ｃの単一細胞の対象細胞画像における形状位置情報、および判定結果である「移動」を識別テーブルに登録する。

具体的には、挙動判定部８７は、対象細胞画像の撮像時刻、判定対象である状態ｃの単一細胞の対象細胞画像における形状位置情報、および判定結果である「移動」を対応付けた挙動情報を、判定対象である状態ｃの単一細胞の細胞ＩＤとともに、記憶読出制御部８６に供給する。記憶読出制御部８６は、挙動判定部８７からの挙動情報を、記憶部５８に記憶されている識別テーブルの、その挙動情報とともに挙動判定部８７から供給される細胞ＩＤに対応付けて登録する。そして、ステップＳ６３の処理後、処理は図５のステップＳ１７に戻り、以降の処理が行われる。

なお、ステップＳ６３において、挙動判定部８７は、細胞ＩＤに対応付けて、ステップＳ６２の処理で求められた、その細胞ＩＤが付与された状態ｃの単一細胞の移動距離の候補のうちの最小値を、移動距離としてさらに登録するようにしてもよい。

また、図７の移動判定処理では、ステップＳ６２において、挙動判定部８７は、移動距離の候補が最小となる場合の細胞ＩＤを、状態ｃの単一細胞の細胞ＩＤとしたが、状態ｃの単一細胞の細胞ＩＤの決定方法はこれに限定されない。

例えば、撮像間隔が比較的長い場合、挙動判定部８７は、単一細胞の形状位置情報などに基づいて単一細胞の移動ベクトルを予測し、予測した移動ベクトルと、識別テーブルに登録されている各細胞ＩＤの最近の形状位置情報が表す位置から対象細胞画像における状態ｃの各単一細胞の形状位置情報が表す位置までのベクトルが最も近似している場合の細胞ＩＤを、状態ｃの単一細胞の細胞ＩＤとして決定するようにしてもよい。この場合、単一細胞が近接した位置に多くある場合であっても、状態ｃの単一細胞の細胞ＩＤを比較的正確に決定することができる。

次に、図８のフローチャートを参照して、図５のステップＳ１８の分裂判定処理の詳細について説明する。

ステップＳ８１において、挙動判定部８７は、細胞判定部８２から供給される対象細胞画像の全ての形状位置情報に基づいて、状態ｅの単一細胞があるか、即ち分裂している単一細胞があるかを判定する。具体的には、挙動判定部８７は、対象細胞画像の少なくとも１つの形状位置情報が表す形状にくびれがあるかを判定する。

ステップＳ８１で対象細胞画像内に状態ｅの単一細胞がない、即ち対象細胞画像の全ての形状位置情報が表す形状にくびれがないと判定された場合、処理は図５のステップＳ１８に戻り、以降の処理が行われる。

一方、ステップＳ８１で対象細胞画像内に状態ｅの単一細胞がある、即ち対象細胞画像の少なくとも１つの形状位置情報が表す形状にくびれがあると判定された場合、処理はステップＳ８２に進む。

ステップＳ８２において、挙動判定部８７は、識別テーブルに登録されている形状位置情報と、対象細胞画像の状態ｅの各単一細胞の形状位置情報とに基づいて、図７のステップＳ６２の処理と同様の方法で、状態ｅの各単一細胞の細胞ＩＤを認識する。

ステップＳ８３において、挙動判定部８７は、ステップＳ８２で認識した状態ｅの単一細胞の細胞ＩＤに対応付けて、対象細胞画像の撮像時刻、その状態ｅの単一細胞の対象細胞画像における形状位置情報、および判定結果である「分裂」を登録する。

ステップＳ８４において、挙動判定部８７は、ステップＳ８２で認識した分裂前の細胞ＩＤに基づいて、分裂後の２つの単一細胞に細胞ＩＤを付与する。即ち、挙動判定部８７は、分裂前の細胞ＩＤに関連する細胞ＩＤを、分裂後の２つの単一細胞に付与する。

ステップＳ８５において、挙動判定部８７は、ステップＳ８２で認識した細胞ＩＤに対応する対象細胞画像における形状位置情報を分裂前の形状位置情報として、その分裂前の形状位置情報に基づいて、分裂後の２つの単一細胞の形状位置情報を生成する。具体的には、挙動判定部８７は、分裂前の形状位置情報が表す形状に存在するくびれで、その形状を２つに分割する。挙動判定部８７は、分割後の２つの形状の輪郭中心の対象細胞画像上の位置を検出する。そして、挙動判定部８７は、分割後の各形状と、それに対応する輪郭中心の対象細胞画像上の位置を表す形状位置情報を、分裂後の２つの単一細胞の形状位置情報としてそれぞれ生成する。

ステップＳ８６において、挙動判定部８７は、ステップＳ８４で付与された分裂後の単一細胞の細胞ＩＤに対応付けて、対象細胞画像の撮像時刻とステップＳ８５で生成された形状位置情報を識別テーブルに登録する。そして、ステップＳ８６の処理後、処理は図５のステップＳ１８に戻り、以降の処理が行われる。

次に、図９のフローチャートを参照して、図５のステップＳ１９の死滅判定処理の詳細について説明する。

ステップＳ１０１において、挙動判定部８７は、記憶部５８から読みされた識別テーブルに登録されている形状位置情報と、細胞判定部８２から供給される対象細胞画像の形状位置情報とに基づいて、対象細胞画像内に死滅している単一細胞があるかを判定する。具体的には、挙動判定部８７は、識別テーブルに登録されている各細胞ＩＤに対応する最近の形状位置情報が表す位置から所定の範囲内に、対象細胞画像の形状位置情報が表す位置が１つもないかを判定する。

ステップＳ１０１で死滅している単一細胞がない、即ち識別テーブルに登録されている全ての細胞ＩＤに対応する最近の形状位置情報において、各形状位置情報が表す位置から所定の範囲内に、対象細胞画像の形状位置情報が表す位置が少なくとも１つあると判定された場合、処理は図５のステップＳ１９に戻り、以降の処理が行われる。

一方、ステップＳ１０１で死滅している単一細胞がある、即ち識別テーブルに登録されている少なくとも１つの細胞ＩＤに対応する最近の形状位置情報において、その形状位置情報が表す位置から所定の範囲内に、対象細胞画像の形状位置情報が表す位置が１つもないと判定された場合、処理はステップＳ１０２に進む。

ステップＳ１０２において、挙動判定部８７は、識別テーブルに登録されている形状位置情報のうち、その形状位置情報が表す位置から所定の範囲内に、対象細胞画像における形状位置情報が表す位置が１つもない形状位置情報に対応する細胞ＩＤを、死滅している単一細胞の細胞ＩＤとして認識する。

ステップＳ１０３において、挙動判定部８７は、ステップＳ１０２で認識した細胞ＩＤに対応付けて、対象細胞画像の撮像時刻および判定結果である「死滅」を識別テーブルに登録する。そして、ステップＳ１０３の処理後、処理は図５のステップＳ１９に戻り、以降の処理が行われる。

なお、図７の移動判定処理、図８の分裂判定処理、および図９の死滅判定処理において、直近の単一細胞の挙動を考慮してもよい。また、上述した説明では、単一細胞の挙動として、移動、分裂、および死滅を判定したが、単一細胞の挙動はこれに限定されない。例えば、単一細胞の老化を判定するようにしてもよい。

また、上述した説明では、ステージ２６を所定の方向に移動させることにより、培養容器３１内に対流を発生させたが、ステージ２６を傾けたり、ステージ２６を円運動させることにより対流を発生させ、細胞に浮遊ずれ程度の振動を与えるようにしてもよい。

さらに、上述した説明では、細胞に振動を与えることにより、単一細胞が浮遊しているか、または、培養容器３１に部分的に接着しているかを判定したが、判定方法は、これに限定されない。例えば、位相差顕微鏡１１の焦点を接着している細胞の位置に合わせておき、細胞画像内のボケが生じている領域に対応する単一細胞は浮遊していると判定し、ボケが生じていない領域に対応する単一細胞は培養用器３１に部分的に接着していると判定することもできる。

なお、本明細書において、プログラム記録媒体に格納されるプログラムを記述するステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる処理はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列的あるいは個別に実行される処理をも含むものである。

また、本明細書において、システムとは、複数の装置により構成される装置全体を表すものである。

さらに、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

本発明を適用した細胞観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。 培養環境にある単一細胞の状態の経時的変化ついて説明する図である。 図１の画像処理装置のハードウェアの構成例を示す図である。 図３のCPUの機能的構成例を示す図である。 CPUによる解析処理について説明するフローチャートである。 図５のステップＳ１６の識別処理の詳細について説明するフローチャートである。 図５のステップＳ１７の移動判定処理の詳細について説明するフローチャートである。 図５のステップＳ１８の分裂判定処理の詳細について説明するフローチャートである。 図５のステップＳ１９の死滅判定処理の詳細について説明するフローチャートである。

符号の説明

１０ 細胞観察システム, １１ 位相差顕微鏡, １２ 画像処理装置, ５１ CPU, ５８ 記憶部, ８１ 取得部, ８２ 細胞判定部, ８３ 浮遊判定部, ８４ 付与部， ８７ 挙動判定部

Claims (4)

1. 培養容器内の細胞の画像を取得する取得手段と、
   前記画像に基づいて、前記細胞が単一細胞であるか、または、多細胞の細胞塊であるかを判定する細胞判定手段と、
   前記画像に基づいて、前記細胞判定手段により前記単一細胞であると判定された細胞が、前記培養容器内に浮遊しているか、または、前記培養容器に部分的に接着しているかを判定する浮遊判定手段と、
   前記浮遊判定手段により前記培養容器に部分的に接着していると判定された細胞に、その細胞に固有の情報である固有情報を付与する付与手段と、
   前記画像に基づいて、前記固有情報が付与された細胞が分裂しているか、または死滅しているかを判定する挙動判定手段と
   を備えることを特徴とする細胞観察装置。
2. 前記挙動判定手段は、前記固有情報が付与された細胞が移動しているか、分裂しているか、または死滅しているかを判定する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
3. 前記挙動判定手段は、前記固有情報が付与された細胞に対する判定の結果を、その固有情報に対応付けて記憶させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
4. 培養容器内の細胞を観察する細胞観察装置の細胞観察方法において、
   前記培養容器内の細胞の画像を取得し、
   前記画像に基づいて、前記細胞が単一細胞であるか、または、多細胞の細胞塊であるかを判定し、
   前記画像に基づいて、前記単一細胞であると判定された細胞が、前記培養容器内に浮遊しているか、または、前記培養容器に部分的に接着しているかを判定し、
   前記培養容器に部分的に接着していると判定された細胞に、その細胞に固有の情報である固有情報を付与し、
   前記画像に基づいて、前記固有情報が付与された細胞が分裂しているか、または死滅しているかを判定する
   ステップを含むことを特徴とする細胞観察方法。

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