WO2020215136A1 - Lipossomas multifuncionais, composições, usos e processos para a preparação dos mesmos - Google Patents

Lipossomas multifuncionais, composições, usos e processos para a preparação dos mesmos Download PDF

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WO2020215136A1
WO2020215136A1 PCT/BR2020/050049 BR2020050049W WO2020215136A1 WO 2020215136 A1 WO2020215136 A1 WO 2020215136A1 BR 2020050049 W BR2020050049 W BR 2020050049W WO 2020215136 A1 WO2020215136 A1 WO 2020215136A1
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liposomes
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lipid
lauric acid
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PCT/BR2020/050049
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Paulo De Tarso Hennies
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Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De São Paulo - Fapesp
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    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents

Definitions

  • the present patent application relates to multifunctional liposomes comprising fatty acids with antimicrobial, anti-inflammatory and antioxidant activities.
  • Such liposomes are suitable for dermatological treatment, whether medical, cosmetic or veterinary and are carried in cosmetic and / or pharmaceutical compositions.
  • the use of fatty acids for the preparation of liposomes and the respective preparation process are also described.
  • Fatty acids are part of a class of broad-spectrum antimicrobial agents capable of acting on the microbial membrane, which is why they are considered as compounds with low potential for the development of resistant strains, unlike what happens with antibiotics conventionally used in treatment bacterial and fungal infections. They represent a significant portion of the antimicrobial lipids recognized as natural components of the human body's immune system.
  • free fatty acids play an important role in the human immune system, particularly in the defense of skin surfaces and body mucous membranes, with 10 mg to 15 mg of free fatty acids per square centimeter.
  • human skin including lauric, myristic, palmitic, sapienic and cis-8-octadecanoic (DESBOIS, AP, SMITH, VJ, "Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential.” Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 85, p. 1629-42, 2010 ).
  • Patent application CA2120511 (MIKLOS, G. et al., "Pharmaceutical and / or cosmetic composition and the use thereof.” Rhône-Poulenc Rorer Gmbh, Germany. CIPO - CA 2120511, 02/17/1994) describes a pharmaceutical and / or cosmetic composition for topical use containing fatty acid, composed of at least one active ingredient and a liposomal carrier for the penetration of the active ingredient into the skin, where said active ingredient is the linoleic acid and / or at least one compound derived therefrom.
  • Other active ingredients such as azelaic acid, erythromycin and retinoic acid, can be added to this composition. And it claims the use of the aforementioned composition for the prevention and / or treatment of acne and / or related changes.
  • Patent application BRPI0805754-0 (MARTINS, MH, PESSINE, FBT, "Pharmaceutical composition comprising liposomal isotretinoin and process for its preparation.” UNICAMP, Brazil. INPI - BR PI 0805754 (A2), 09/14 / 2010) describes a pharmaceutical composition for dermatological use that comprises liposome-encapsulated isotretinoin for the topical treatment of skin disorders, such as acne, psoriasis and photoaging, but does not mention the use of fatty acids as an antimicrobial active ingredient in the liposomal formulation.
  • the liposomal vesicles generated may have an average size ranging from a few tens of nanometers to a few micrometers.
  • liposomes can appear as unilamellar vesicles, when there is only a single liposomal lipid bilayer encapsulating the watery heartwood, or else present as multilamellar vesicles, when two or more lamellae are present .
  • Liposomes with an average size in the range of 25 nm to 100 nm are classified as small, while those with an average size greater than 100 nm are classified as large liposomes.
  • a process for the preparation of unilamellar liposomes based on the injection through a mouthpiece (nozzle of 0.1 mm to 10.0 mm in diameter), under pressure, of an ethanolic solution of the lipid components and lipophilic active ingredient ( flow rate of 1 mL to 1,000 mL per minute), in an aqueous phase under intense agitation (1,500 rpm at 20,000 rpm), in a homogenizer, is described in EP0253619 BI (BOLLER, FH, "Method of preparing single bilayered liposomes.” CILAG LTD., Switzerland EPO - EP 0253619, 1/15/1992).
  • Said hydrophilic agent is an antifungal active (econazole, terconazole or miconazole), and / or a non-steroidal anti-inflammatory (prostaglandin).
  • econazole, terconazole or miconazole an antifungal active
  • prostaglandin a non-steroidal anti-inflammatory
  • EPO - EP 0253619, 01/15/1992 uses a homogenizer, essential equipment for the execution of the production of liposomes in this case, while in the preparation of multifunctional liposomes object of the present patent application it is not necessary to use this equipment for the generation of unilamellar liposomes.
  • Patent application W02003077861 A2 (SK ⁇ LD, T. "Water-based delivery systems.” Collagenex Pharmaceuticals, Inc., United States. PCT - WO 2003/077861, 13/03/2002) describes a vesicular system for modified delivery of active ingredients capable of providing restoration of the barrier in the stratum corneum, in which fatty acids are present in the lipid composition of the bilayer, together with phospholipids, ceramides and cholesterol.
  • the function of fatty acid in the composition and in the final claimed application does not involve its cutaneous antimicrobial or anti-inflammatory activity, being described the use of other active compounds for the different topical therapeutic purposes claimed, including for the treatment of acne.
  • the invention described here involves the use of a fatty acid, specifically lauric acid, conveyed in liposomes for topical dermatological, cosmetic and / or pharmaceutical and / or veterinary applications, associated with complementary active ingredients with anti-inflammatory and antioxidant action.
  • lauric acid as an antimicrobial and anti-inflammatory skin agent has the advantage of not inducing bacterial resistance, as reported for conventional antibiotics, such as p. ex. clindamycin and erythromycin.
  • lauric acid can be used to replace benzoyl peroxide, with the advantage of not having a bleaching action (does not stain clothes or hair), does not expose human or animal skin to free radicals, and can be used in lower concentrations.
  • liposomes with lauric acid can be used over the entire surface of the skin to prevent and treat acne vulgaris, which is another advantage over the use of benzoyl peroxide.
  • fatty acids in general especially lauric acid
  • category 3 of skin irritation according to the GHS Classification.
  • Such dilution allows the maintenance of the desired activities and properties, for example antimicrobials, without the occurrence of significant skin irritation.
  • tea tree essential oil the advantage of using fatty acid lies in the fact that it is a single compound (only one substance), without allergenic potential, unlike essential oils, composed of numerous substances, some of which are known to be involved in allergic processes when applied topically to humans.
  • the delivery of fatty acids, especially lauric acid in liposomes represents a very promising alternative, since it minimizes the content of lipid compounds in the galenic formulation, especially important in the case of its application for the cosmetic treatment of oily skin prone to acne.
  • lauric acid has been shown to have anti-inflammatory activity on the skin, as described by HUANG and colleagues (HUANG, W.-C., et al., "Anti-bacterial and anti-inflammatory properties of capric acid against Propionibacterium acnes: a comparative study with lauric acid. "Journal of Dermatological Science, v. 73, p. 232-240, 2014).
  • the form of delivery via liposomal allows to associate other complementary active ingredients, necessary for the adequate treatment of different skin and / or body mucosa problems. And also, given the interaction of the liposomes with the intercellular cement of the stratum corneum, it is possible to partially accumulate the active ingredients in this structure (reservoir effect), allowing the action of such ingredients on the skin over a longer period of time, in addition to favor the recovery and / or improvement of the skin barrier function.
  • the antimicrobial and anti-inflammatory agent lauric acid alone, or associated with compounds that have anti-inflammatory and / or antioxidant activities complementary, conveyed in a liposomal formulation, allows this composition to be used for the prevention and / or treatment of acne vulgaris, psoriasis, atopic dermatitis, skin aging, seborrhea (dandruff), alopecia, body or mouth odor, and opportunistic microbial infections, given that the spectrum of lauric acid's antimicrobial action is broad, also showing antimicrobial activity against the pathogenic bacteria Staph ⁇ lococcus aureus (NAKATSUJI, T.
  • the liposomes now written is the simpler process of their production, which involves the injection of an oily phase, - in which the main solvent can be an alcohol, specifically ethanol, and / or a polyol, a polyester polyol or a polyol polyether such as e.g. ex. polyethylene glycol or glycerol, more specifically propylene glycol, in an aqueous phase under agitation using a conventional stirrer.
  • the composition may have an ethyl alcohol content in the liposomal suspension that can vary from 4.5% to 21% (m: m), making it possible to obtain cosmetic and / or pharmaceutical and / or veterinary formulations with ethanol content. ranging from 0.1% (or less) to 20% (m: m).
  • Liposomes (“Large Unilamellar Vesicles” - LUV) comprising ingredients with antimicrobial activities, applicable in the prevention and topical cosmetic treatment of mild to moderate acne.
  • Such liposomes are stable on at least one cosmetic base, such as gel, cream, gel-cream and lotion.
  • LUVs are useful, for example, against Cutibacterium acnes, and have anti-inflammatory and antioxidant action. Its medical, cosmetic and veterinary uses, as well as related methods are also part of the invention.
  • FIGURE 1 SAXS data for the sample of liposomes prepared with non-hydrogenated soy phosphatidylcholine (Lipoid S75 ® ), diluted to 20mM of total lipids.
  • the experimental points are represented by the open circles while the continuous line corresponds to the adjustment.
  • FIGURE 2 Electronic density profile obtained from the adjustment of the experimental curve shown in Figure 1.
  • FIGURE 3 Comparison between the SAXS curves of ⁇ liposomes prepared with soy phosphatidylcholine (Lipoid S75®) and A liposomes prepared with hydrogenated soy phosphatidylcholine Phospholipon 80H®.
  • FIGURE 4 Comparison between SAXS curves of multifunctional hydrogenated soy phosphatidylcholine liposomes (Phospholipon 80H®), obtained under total lipid concentrations of 50mM, 25mM and 12.5mM.
  • FIGURE 5 Comparison of the inhibitory effect on the growth of C. acnes by the action of multifunctional liposomes, lauric acid alone and reference antimicrobial ingredient benzoyl peroxide.
  • FIGURE 6 Comparison of the inhibitory effect against C. acnes of liposomal gel, placebo gel and lauric acid multifunctional liposomes.
  • the liposomal gel refers to the cosmetic gel containing 25% suspension of multifunctional liposomes with a high relative concentration of lauric acid, prepared with hydrogenated soy lecithin, as described in Table 8;
  • the placebo gel without lauric acid, was used in the same amounts as the liposomal gel; for comparison, its concentration was referred to in the graph as the one corresponding to the concentration of lauric acid present in an equal volume of the liposomal gel).
  • FIGURE 7 Evaluation of the antioxidant activity of liposomes (LF) through the percentage of inhibition of lipid peroxidation of arachidonic acid due to the presence of liposomes (with or without saccharides).
  • FIGURE 8 Evaluation of anti-inflammatory action "in v ⁇ tro" - Levels of IL-1a dosed in culture supernatants of NHK cells pre-incubated with biosaccharide gum-2 (RH 0.05 mM) or with liposomes containing biosaccharide gum-2 (Lip. + RH, black bracket) in 4 different concentrations, or with liposomes without biosaccharide gum-2 (Lip. - RH, red bracket) in 4 different concentrations, and subsequently incubated with C. acnes wall extract inactivated by heat.
  • biosaccharide gum-2 RH 0.05 mM
  • liposomes containing biosaccharide gum-2 Lip. + RH, black bracket
  • liposomes without biosaccharide gum-2 Lip. - RH, red bracket
  • the present patent application refers, in one embodiment, to liposomes comprising lipids with antimicrobial action against microorganisms involved in dermatological problems, such as e.g. ex. the bacteria Cutibacterium acne and Staph ⁇ lococcus aureus, as well as anti-inflammatory action.
  • the lipids in question are fatty acids, including capric, caprylic, myristic, lauric, oleic, palmitic, stearic, arachidic and / or linoleic acid, or mixtures thereof, but preferably lauric acid, associated or not with other antimicrobial agents, lipidic or not, or to compounds that have relevant biological activities for the prevention and / or treatment of dermatological problems, such as active ingredients with anti-inflammatory, antioxidant, sebum-regulating, moisturizing, skin barrier-restoring, promoting properties cell proliferation, anti-aging, anti-hair loss, promoting the balance of the skin microbiota, among others.
  • dermatological problems such as active ingredients with anti-inflammatory, antioxidant, sebum-regulating, moisturizing, skin barrier-restoring, promoting properties cell proliferation, anti-aging, anti-hair loss, promoting the balance of the skin microbiota, among others.
  • the delivery of the aforementioned antimicrobial and / or anti-inflammatory lipid is carried out through its incorporation into lipid bilayers, specifically in liposomal vesicles, in order to minimize the use of other agents usually employed to enable the incorporation of lipophilic compounds in aqueous based formulations, such as e.g. ex. surfactants, emulsifiers and / or emulsifiers.
  • Liposomal vesicles, or liposomes can be incorporated into topical cosmetic and / or pharmaceutical formulations for application to the skin, scalp and / or body mucous membranes (mouth or genitals).
  • the present patent application relates to the liposomes described above.
  • Such liposomes have, in their lipid composition, a fatty acid concentration sufficiently high so that their antimicrobial action is relevant, being significantly higher in relation to the fatty acid concentration in most liposomes previously reported in the literature.
  • One of the advantages brought about by the liposomes now described and claimed is that such concentration, although high and sufficient to achieve the necessary activity, does not cause skin irritation. This is surprising given the potential for fatty acids, such as lauric acid to cause skin irritation.
  • the high relative concentration of fatty acid compared to the other lipophilic components that make up the liposomal bilayer, can also be considered a determining factor for obtaining liposomes with the specific characteristics of size and lamellarity described in the present patent application.
  • liposomes described in the present patent application are obtained when fatty acid with antimicrobial and / or anti-inflammatory action, such as lauric acid, is used in sufficiently high concentration and, simultaneously, when a significant portion of this fatty acid is in the form of its salt, that is, in the form of laurate.
  • the final concentration of lauric acid in the liposome suspension must be above the minimum inhibitory concentration for the liposomes to have an antimicrobial action against C. acnes, determined to be 0.02% (m: m).
  • the concentration of lauric acid in the liposomal suspension described in this specification should be between 0.08% and 0.75%, preferably in the range of 0.20% to 0.60%, more specifically in the range of 0, 40% to 0.50% (m: m).
  • the formation of said salt is best described below.
  • the liposomes described and claimed herein may comprise other nanoencapsulated compounds, such as antioxidants, anti-inflammatories and other cosmetic agents, for example, but not limited to tocopherol acetate and Biosaccharide Gum-2.
  • Another embodiment of the invention relates to a process for producing the multifunctional liposomes described and claimed herein. Said process comprises, in general, the solubilization of fatty acid and other lipid components, or oily, in one or more lipophilic solvents, followed by the alkalinization of the lipid phase with a solution of an alkalizing agent and later addition of the mixture of the lipid phase and alkalizing agent to an aqueous phase.
  • the lipid, or oily, components can, for example, be selected from the group comprising, but not limited to, defatted hydrogenated soy lecithin with 70% phosphatidylcholine, lauric acid, tocopheryl acetate, cholesterol and polysorbate 80.
  • Suitable lipophilic solvents can be, for example, an alcohol and a polyol selected from the group comprising, but not limited to, ethanol and propylene glycol, where the mass concentration of ethanol can vary from 0% to 99.9%, and The mass concentration of propylene glycol can vary between 0% and 95%.
  • concentrations of such components are exemplified in Table 4.
  • the solubilization of the oily components in one or more suitable lipophilic solvents which can be an alcohol and a polyol, specifically ethanol and propylene glycol, where the mass concentration of ethanol in the liposomal suspension can vary from 1% to 25%, preferably in the range of 2% to 7%, especially in the range of 4% to 5%, and the mass concentration of propylene glycol in the liposomal suspension can vary between 0% and 30%, preferably in the range of 20% to 30%, more specifically in the range of 24% to 28%.
  • suitable lipophilic solvents which can be an alcohol and a polyol, specifically ethanol and propylene glycol
  • the solution of an alkalizing agent can, for example, be selected from the group comprising, but not limited to, an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium hydroxide or triethanolamine, among other equivalents.
  • the alkalizing agent solution must have a final concentration in the liposomal suspension in the range of 0.009% to 0.040%, preferably in the range of 0.020% to 0.030%, more specifically in the range of 0.024% to 0.026% (m: m).
  • the addition of the lipid phase to the aqueous phase can be carried out by directly pouring the lipid phase over such aqueous phase, with constant mechanical agitation thereof, in which the lipid phase is obtained, for example, through the solubilization of fat-soluble ingredients in organic solvent.
  • the addition of the mixture of the lipid phase and alkalizing agent to an aqueous phase can be carried out, for example, by injecting the lipid solution, under a controlled flow (for example, via a peristaltic pump), into the aqueous phase, or pouring the lipid phase is directly and slowly over the aqueous phase, under heating and under moderate mechanical agitation (for example, agitator with centrifugal propeller or magnetic agitation).
  • the heating temperature of the aqueous and oily phases for the preparation of the liposomes is in the range of 40 ° C to 80 ° C, preferably in the range of 65 ° C to 75 ° C. It is essential that both the aqueous and oily phases are simultaneously within these temperature ranges for the preparation process to be successful.
  • the type of agitator used to agitate the aqueous phase during the preparation of the liposomes is, for example, a mechanical, propeller, centrifugal type stirrer. Throughout the phase addition stage oily in the aqueous phase, the agitation speed of this mechanical stirrer with centrifugal propeller must be adjusted, for example, in the range of 850rpm to 1,800rpm, preferably in the range of 1,200rpm to 1,600rpm.
  • the flow of addition of the oil phase into the aqueous phase, when transferred by the peristaltic pump, should be, for example, in the range of 5mL / minute to 20mL / minute, preferably in the range of 10mL / minute at 11 ml / minute.
  • the aqueous phase can be composed, for example, of demineralized water or a buffer solution with pH 6.0 at
  • a potassium phosphate buffer solution can be 30mM and pH 6.6.
  • the alkalinization of the lipid phase has proved to be a critical step in the process for obtaining physically-chemically stable liposomes.
  • the relevance of the alkalinization of the lipid phase which theoretically would provide the deprotonation of lauric acid, proved to be, surprisingly, an important factor for the stabilization of the lipid bilayer of the liposome, indicated by complementary tests carried out in which the alkalinization step was suppressed. It is important to consider that fatty acids typically have pKa in the range of 4.5 to 5.5, with the pKa of lauric acid being 5, 3.
  • the molar relationship between sodium hydroxide and lauric acid present in the liposomal suspension must be in the range of 10% to 70%, preferably in the range of 20% to 35%, more specifically in the range of 26% to 30% (mol: mol - percentage relative to the quotient of the molar quantities of sodium hydroxide and lauric acid).
  • mol: mol - percentage relative to the quotient of the molar quantities of sodium hydroxide and lauric acid.
  • the liposomes described in the present patent application are obtained when lauric acid is used in a sufficiently high concentration and, simultaneously, when a significant portion of this fatty acid is in the form of its salt, that is, in the form of laurate, for example sodium or potassium.
  • the average size of the liposomes can be adjusted or modulated, within a size range between 90nm to 300nm, depending on the lipid composition, especially the lecithin or phospholipid used, as well as depending on the lipophilic solvent system employed.
  • the following liposomes with characteristics considered ideal were prepared with hydrogenated soy phosphatidylcholine and when the solvent system of the lipid phase is composed of propylene glycol and ethanol.
  • the average size range of the nanoparticles obtained for said liposomes is 90nm to 300nm, more preferably between 140nm and 260nm, with a polydispersity index (PDI) in the range of 0.01 to 0.30, preferably a polydispersity index (PDI) in the range of 0.05 to 0.20.
  • the polydispersity index (PDI) parameter represents a measure of the size distribution of the liposomal nanoparticles, considering the photon correlation spectroscopy (PCS - "photon correlation spectroscopy”) technique used to determine the size of the nanoparticles.
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • the liposomes described and claimed herein can be obtained in order to comprise other encapsulated compounds, such as antioxidants, anti-inflammatories and other cosmetic agents, for example, but not limited to tocopherol acetate and Biosaccharide Gum-2.
  • the present patent application relates to unilamellar liposomes with an average diameter between 90nm and 300nm.
  • the processes now claimed allow for the obtaining of unilamellar liposomes with an average diameter of less than 90 nm to 100 nm, this when the lipophilic solvent is composed only of ethanol.
  • propylene glycol is added to the system, larger diameters can be obtained, as shown in Table 4.
  • Such liposomes comprise an antimicrobial and / or anti-inflammatory lipid, preferably a fatty acid, such as p. ex. lauric acid.
  • the liposomes disclosed herein also have a low polydispersity characteristic.
  • compositions comprising liposomes as described above and an acceptable cosmetic, pharmaceutical and / or veterinary vehicle.
  • Such compositions can be in the form of, for example, gel, cream, gel-cream or a lotion.
  • the ethyl alcohol content of such compositions is equal to or less than 20.5% (when ethyl alcohol is the only lipophilic solvent used in the preparation of liposomes), or less than or equal to 1.25% (when another lipophilic solvent is used together with ethyl alcohol).
  • the present patent application relates to uses of lauric acid for preparing a liposome as defined above.
  • such uses are in the preparation of a composition to treat and / or prevent dermatological problems.
  • a dermatological problem can be caused, for example, by bacteria, fungi, molds and / or yeasts, e.g. ex. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acne), Staphylococcus aureus, Malassezia furfur, Corineumbacterium spp. , Trichophyton spp., Among others.
  • the dermatological problem may be acne, psoriasis, atopic dermatitis, skin aging, seborrhea (dandruff), alopecia, bad body or mouth odor, microbial infection, or unbalance of the skin microbiota.
  • soy lecithin enriched in phosphatidylcholine (Emulmetik ® 900 / Lucas Meyer)
  • lauric acid tocopheryl acetate
  • esters of tocopheryl aminopropanediol of safflower oil / palm oil (omega-6-Ceramide ® / Solabiá) were initially solubilized in ethanol under magnetic stirring and at room temperature (25 ° C).
  • a 0.1M aqueous solution of sodium hydroxide (0.1 mol / L) was added.
  • the liposomal suspension thus obtained whose composition is shown in Table 1, had a pH equal to 7.0.
  • lauric acid represents 58.5% (molar ratio) in relation to the total lipids present in the liposomes. Therefore, the lipid bilayer is mainly composed of molecules of this fatty acid.
  • Table 1 Composition of the multifunctional liposome suspension described in Example 1.
  • the lipid components Lipoid S75 ® / Lipoid (soy lecithin defatted with 70% soy phosphatidylcholine), acid lauric acid, tocopheryl acetate, cholesterol and polysorbate 80 were solubilized in a mixture of propylene glycol and ethanol, under magnetic stirring (IKA brand, mod. C-Mag HS-7, speed: level 6) and at 70 ° C.
  • a solution of sodium hydroxide 2.0 M (2.0 mol / L) in water was added to this lipid solution.
  • the alkaline lipid solution was injected into an aqueous phase, consisting of sucrose, Malt Secrets ® / Gattefossé (Propanediol (and) Water (and) Hordeum vulgare seed extract) and Biosaccharide Gum-2, previously solubilized in 30mM Potassium Phosphate Buffer solution pH 6.6.
  • Said injection of the alkalinized lipid phase was performed using a peristaltic pump (Watson-Marlow brand, mod.
  • the obtained liposomes were characterized as being unilamellar using the low angle X-ray scattering technique (SAXS).
  • SAXS low angle X-ray scattering technique
  • lauric acid represents 51% (molar ratio) in relation to the total lipids present in the liposomes.
  • Table 2 Composition of the multifunctional liposome suspension described in Example 2.
  • the lipid components Phospholipon 80H® / Lipoid hydrogenated soy lecithin, defatted and with 70% phosphatidylcholine
  • lauric acid tocopheryl acetate
  • cholesterol and polysorbate 80 were solubilized in a mixture of propylene glycol and ethanol, under magnetic stirring (IKA brand, mod. C-Mag HS-7, speed: level 6) and at 70 ° C for 30 minutes.
  • a 2.0 M aqueous solution of sodium hydroxide (2.0 mol / L) was added to this lipid solution.
  • the alkaline lipid solution was injected into a aqueous phase, composed of sucrose and Biosaccharide Gum-2, previously solubilized in 30mM pH 6.6 Potassium Phosphate Buffer solution.
  • the referred injection of the alkalinized lipid phase was performed using a peristaltic pump (Watson-Marlow brand, mod. 120S / DV) with a silicone hose with an internal diameter of 1.6 mm, at a speed of 80 rpm and flow rate of 10, 5 ml / minute.
  • the aqueous phase was kept under mechanical agitation (IKA brand, model RW20, with centrifugal rod), at a speed of 1,200 rpm and at a temperature of 70 ° C.
  • the liposomes obtained were characterized as being unilamellar using the low angle X-ray scattering technique (SAXS).
  • SAXS low angle X-ray scattering technique
  • lauric acid represents 51% (molar ratio) in relation to the total lipids present in the liposomes.
  • Table 3 Composition of the multifunctional liposome suspension, described in Example 3.
  • the liposomal nanoparticles generated in this case had the smallest average size (93nm), being about 100nm smaller than those from the third example (average size of 190nm), where hydrogenated lecithin was used, and 180nm smaller than the average size of the liposomes obtained in the second example, from non-hydrogenated lecithin (average size of 270nm).
  • the average size of the liposomes obtained with the process described in this patent is dependent on both the type of lecithin used (hydrogenated or non-hydrogenated), as well as the solvent system used for the solubilization of the lipophilic components in the preparation of the oil phase.
  • Table 4 Variation of the average diameter of the liposomes as a function of the phospholipid and the solvent system of the lipid phase used.
  • the main difference between the curves is in the region of q ⁇ 0, 10 ⁇ -1, in which it is possible to notice an oscillation in both curves, attributed to the interaction between the vesicles.
  • the oscillations have different characteristics, it is possible to say that the change between the liposomal formulations mainly altered the interaction between the vesicles, but the unilamellar shape was preserved.
  • dilutions were made in the hydrogenated soy phosphatidylcholine liposome sample (12.5mM and 25mM) in potassium phosphate buffer 30mM and pH 7, and the results are shown in Figure 4.
  • the multifunctional liposomes obtained with hydrogenated soy phosphatidylcholine, described in the third example, were characterized as to the encapsulation efficiency of the ingredient biosaccharide gum-2, determined to be (28.8% ⁇ 0.3%), through the separation of the aqueous phase external to the liposomes by means of the gel permeation chromatography technique (Sephadex® G100 / Sigma-Aldrich gel; mobile phase 30mM potassium phosphate buffer and pH 7.0), with the subsequent quantification of the ramnose residues of biosaccharide gum-2 in samples containing liposomes and in samples containing the free ingredient (aqueous phase external to liposomes).
  • the ingredient biosaccharide gum-2 was characterized according to the content of the monosaccharide rhamnose through a colorimetric method (GIBBONS, M. N., "The determination of methylpentoses.” Analyst, v. 80, p. 268 276, 1955).
  • the multifunctional liposomes described and claimed herein showed antimicrobial activity against Cutibacterium acnes ATCC 6919 (Propionibacterium acnes ATCC 6919) at a concentration equal to or greater than 0.63mM liposomal lipids, determined by the Minimum Inhibitory Concentration Test (MIC Test) against this bacterium, using the method described by NAKATSUJI et al. (NAKATSUJI, T. et al., "Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes: its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris.” J. Invest. Dermatol., V.129, p. 2480-2488, 2009), with adaptations .
  • MIC Test Minimum Inhibitory Concentration Test
  • the bacteria were cultured on Clostridium reinforced medium agar (RCM - "Reinforced Clostridium Médium”) at 37 ° C for 3 days, under anaerobic conditions. Then, 3 or 4 colonies of C. acnes were collected, inoculated in RCM broth and cultured anaerobically at 37 ° C for 24 hours, a period necessary for the bacteria to reach the logarithmic growth phase. At the end of the incubation, the absorbance was read at 595 nm (Genesys 105 Vis spectrophotometer), using the sterile RCM broth as white. The RCM broth with C.
  • RCM Clostridium reinforced medium agar
  • acnes was subsequently diluted with the sterile RCM medium until the value of 0.150 was obtained for absorbance at 595nm. According to the bacterial growth curve as a function of the absorbance previously obtained for C. acnes, this absorbance value corresponds to a load of 4.0 x 107 CFU / mL (UFC: Colony Forming Units). From this inoculum, the necessary dilutions were made with sterile RCM broth to obtain 1.0 x 10 5 CFU in each well of the Elisa microplate containing the sample to be tested, considering the volume of medium with inoculum that would be added in each well. The stock solution of the hydrophobic agents was prepared using dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the absorbance was read at 595 nm in an Elisa reader (Biotek brand, Sinergy Hl Multi-Mode Reader) to estimate microbial growth. Aiming at the qualitative confirmation of the results obtained for preparations containing liposomes by the method described above, the resazurin reduction test (O'BRIEN, J. et al., "Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity ". Eur. J. Biochem., v. 267, p. 5421-5426, 2000) was also used on the same plates, after absorbance readings at 595nm were taken. For this purpose, 70mL of a 0.01% resazurin solution was added to each well and the color development was recorded using a photographic image.
  • Elisa reader Biotek brand, Sinergy Hl Multi-Mode Reader
  • the results, when expressed in terms of relative absorbance, refer to the quotient between the absolute absorbance of the sample in relation to the absorbance of its blank, in the case of isolated ingredients or in a mixture of ingredients in aqueous phase, without the presence of liposomes.
  • the relative absorbance refers to the quotient between the absolute absorbances of the sample inoculated with C. acnes and the same non-inoculated (sterile) sample.
  • the inhibition of bacterial growth was more pronounced for lauric acid, considering that a significant inhibitory effect was obtained at a lower concentration (22 pg / mL) compared to the inhibitory effect observed for peroxide benzoyl (336 pg / ml).
  • the inhibitory concentration of lauric acid was 15 times lower than that of benzoyl peroxide, considering a similar decrease in relative absorbance in relation to the initial relative absorbance (relative to the sample without any ingredient, that is, with a concentration of 0.0 pg / mL), obtained for each compound in the indicated concentrations.
  • non-liposomal lauric acid was transmitted after its previous solubilization in DMSO to make it miscible with the aqueous phase of the culture medium and, consequently, to allow its interaction with bacteria.
  • benzoyl peroxide was also solubilized in DMSO.
  • the antioxidant activity of multifunctional liposomes prepared with hydrogenated soy phosphatidylcholine was determined by assessing levels of malondialdehyde (MDA), using the TBARS method ("Thiobarbituric Acid Reactive Substances"), with the intention of verify the antioxidant action of liposomes with regard to the protection of lipid peroxidation [MIYAMOTO, S. et al. , "Evaluation of Malondialdehyde Leveis", In: Zenteno-Savin, T. et al. , "Oxidative Stress in Aquatic Ecosystems", John Wiley & Sons Ltd., p. 440-447, 2011].
  • the first stage of this test involves inducing the peroxidation of arachidonic acid (AA), a lipid naturally present in human skin.
  • AA arachidonic acid
  • 10mL of the 125mg / mL AA solution in ethanol, 20mL of 10mM ascorbic acid solution in 30mM potassium phosphate buffer pH 7.0 and 20mL of the 50mM solution of FeC13 in deionized water were placed in test tubes.
  • the volume was made up to 1 ml with methanol and no antioxidant agent was added.
  • distinct volumes of solutions liposomal suspension and other controls
  • the volume was also made up to 1 ml with methanol.
  • a second control in which the addition of the FeC13 solution was suppressed, was prepared in order to assess the extent of lipid oxidation generated by the oxidizing agents.
  • the tubes were closed, vortexed and incubated at 37 ° C for 1h.
  • 50mL of each sample exposed to oxidizing agents was transferred to tubes containing 1.5mL of the 1% (v / v) solution of phosphoric acid and 500mL of 0.67% (m / v) solution of acid thiobarbiturate in water.
  • 150mL of 1.0% (m / v) solution of disodium EDTA in water were added to each tube.
  • the tubes were closed, vortexed, and subjected to a boiling water bath for 30 minutes. After cooled to room temperature, the samples were transferred to a tube containing 1 ml of n-butanol. The tubes were vortexed and centrifuged at 1000g for 5min. Samples were read on a spectrophotometer at 535nm. The results obtained were analyzed in a relative way, considering that the positive control test (absence of any antioxidant agent) suffered 100% oxidation.
  • Saccharides interfere with the method, exerting a strong synergistic effect on the formation of TBARS, thereby overestimating the extent of oxidation (SILVA, FAM et al., "Methods for assessing the degree of lipid oxidation and antioxidant capacity”. Chemistry Nova, v. 22, nl, pp. 94-103, 1999). For this reason, multifunctional liposomes prepared in the absence and presence of saccharides (sucrose and biosaccharide gum-2) were analyzed. Figure 7 shows the results obtained for these tests, in which the positive control represents 100% AA oxidation, that is, 0% inhibition of lipid peroxidation.
  • Anti-inflammatory activity was determined by quantifying the pro-inflammatory cytokine IL-1a produced by human skin keratinocytes (NHK cells - Primary Epidermal Keratinocytes; Normal, Human, Neonatal Foreskin ATCC® PCS-200-010 TM), induced by heat-dead C. acnes membrane extract, based on the methodology described by ISARD et al. (ISARD, O. et al, "Anti-inflammatory properties of a new undecyl-rhamnoside (APRC11) against P. acnes.” Arch. Dermatol. Res., V.303, n.10, p. 707-13, 2011).
  • C. acnes (ATCC 6919) was initially cultured in RCM broth, under anaerobiosis and at 37 ° C, for 4 days (period necessary for the bacteria reach the stage of stationary growth).
  • the microbial load was quantified by measuring the absorbance at 595nm using the sterile RCM broth as white. According to the bacterial growth curve as a function of the absorbance previously obtained for C. acnes, an absorbance reading of 0.150 (at 595nm) corresponds to a load of 4.0 x 107 CFU / mL. Then, the bacteria were thermally inactivated in a water bath at 60 ° C for 30 minutes.
  • the inactive bacterial suspension was centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes by carefully removing the supernatant with a Pasteur pipette.
  • the bacterial mass was washed 5 times with saline and centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes.
  • the bacterial mass was resuspended in saline, proceeding with 15 cycles of freezing (-80 ° C) and heating (37 ° C) of this suspension, followed by 5 cycles of sonication.
  • the bacterial extract thus obtained was frozen.
  • the heat-killed C was performed at the time of use.
  • acnes membrane extract was thawed at room temperature, centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed with a Pasteur pipette and the pellet was resuspended in the keratinocyte culture medium. .
  • NHK cells were cultured in Dermal Cell Basal Medium (ATCC, Manassas, VA) supplemented with the Keratinocyte Growth kit (ATCC, Manassas, VA) and antibiotics (10 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin and 25 ng / mL of amphotericin B; ATCC, Manassas, VA) according to the manufacturer's instructions and maintained at 37 ° C in a humid atmosphere incubator containing 5% CO2. Upon reaching 70% -80% of confluence, the cell monolayers were trypsinized to obtain subcultures.
  • ATCC Dermal Cell Basal Medium
  • VA Keratinocyte Growth kit
  • antibiotics 10 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin and 25 ng / mL of amphotericin B
  • ATCC Manassas, VA
  • Example 8 Formulations comprising liposomes
  • Cosmetic formulations for topical use, in the galenic form of a gel were prepared using some of the multifunctional liposome suspensions previously described.
  • one or more gel-forming and / or thickening agents which may be xanthan gum, carrageen gum, guar gum, acacia gum, tragacanth gum, pectin, dextrin, were added to the aqueous phase or to the liposomal suspension itself.
  • gelatin cellulose derivatives, such as carbocimethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose or microcrystalline cellulose, carboxyvinyl polymers or carbomers, such as carbopol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidones, poloxamer, propylene glycol or sodium alginates, or other synthetic or natural polymers.
  • carboxyvinyl polymers or carbomers such as carbopol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidones, poloxamer, propylene glycol or sodium alginates, or other synthetic or natural polymers.
  • ingredients were used for the composition of the product's preservative system, parabens (methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, heptyparaben, isobutylparaben, isopropylparaben, benzyl-paraben and / or its sodium salts), phenoxyethanol, DMDM hydantoin, methylchlorisothiazolinone, propynylbutylcarbamate, imidazolidinyl urea, diazolidinyl urea, Quaterniumló, sodium hydroxymethylglycinate, among other preservative ingredients and / or adjuvants not considered as preservative ingredients, but that contribute to the microbiological conservation of cosmetic products, such as caprililol.
  • parabens methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, heptyparaben
  • a first example of a topical cosmetic formulation, in gel form, was obtained by incorporating the microbiological preservative DMDM hydantoin into the liposome suspension prepared with soy lecithin (Emulmetik 900 / Lucas Meyer) previously described in the first example of the preparation of multifunctional liposomes (Table 1), under magnetic stirring (IKA brand, mod. C-Mag HS-7, speed: level 6) and at room temperature. Then, the resulting suspension, while stirring, was heated to 40 ° C-45 ° C and the xanthan gum gelling agent was added to it (see Table 5).
  • the system was kept under agitation and heated (40 ° C-45 ° C) for another 40 minutes. At the end of this period, the system was cooled to room temperature (25 ° C), obtaining a cosmetic gel with low viscosity, translucent, slightly yellow and with a final pH equal to pH 6.9.
  • Table 5 Formula of the first example of cosmetic gel containing multifunctional liposomes with a high relative concentration of lauric acid.
  • Table 6 Cosmetic gel formula containing 2.5% of the suspension of multifunctional liposomes with a high relative concentration of lauric acid, prepared with hydrogenated soy lecithin.
  • Table 7 Cosmetic gel formula containing 10% suspension of multifunctional liposomes with high relative concentration of lauric acid, prepared with hydrogenated soy lecithin.
  • Table 8 Cosmetic gel formula containing 25% suspension of multifunctional liposomes with high relative concentration of lauric acid, prepared with hydrogenated soy lecithin.
  • the microbiological preservative system composed of phenoxyethanol and caprylglycol (Microcare ® PHG / Thor - Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol) was incorporated into the formulation, and the system was cooled to room temperature (25 ° C), maintaining agitation . Upon reaching this temperature, and still maintaining the same agitation condition, the fragrance was added as the final stage of preparing the product.

Abstract

O presente pedido de patente se refere a lipossomas multifuncionais compreendendo ingredientes com atividades antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante. Os referidos lipossomas são úteis, por exemplo, contra Cutibacterium acnes. Composições compreendendo tais lipossomas, como gel, creme, gel-creme e loção, o processo produção dos lipossomas e seus usos médicos, cosméticos e veterinário são também parte do escopo deste pedido.

Description

"LIPOSSOMAS MULTIFUNCIONAIS, COMPOSIÇÕES, USOS E PROCESSOS PARA A PREPARAÇÃO DOS MESMOS"
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] O presente pedido de patente se refere a lipossomas multifuncionais compreendendo ácidos graxos com atividades antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante . Tais lipossomas são adequados para o tratamento dermatológico, seja médico, cosmético ou veterinário e são veiculados em composições cosméticas e/ou farmacêuticas. O uso de ácidos graxos para preparação dos lipossomas e respectivo processo de preparação são também descritos.
ESTADO DA TÉCNICA
[002] Ácidos graxos fazem parte de uma classe de agentes antimicrobianos de amplo espectro capazes de atuar na membrana microbiana, sendo por isso considerados como compostos com baixo potencial de desenvolvimento de cepas resistentes, ao contrário do que acontece com os antibióticos convencionalmente utilizados no tratamento de infecções bacterianas e fúngicas. Eles representam uma parcela significativa dos lipídios antimicrobianos reconhecidos como componentes naturais do sistema imune do corpo humano.
[003] Entretanto, a aplicação dos ácidos graxos em produtos para o tratamento cosméticos ou farmacêutico da pele e de mucosas corporais é limitada pela característica hidrofóbica destes compostos, a qual dificulta sua veiculação e disponibilização no sítio biológico alvo.
[004] Para a sua incorporação em produtos dermatológicos tópicos, é necessário o uso de agentes tensoativos, e/ou de solventes orgânicos ou oleosos. Neste aspecto, a incorporação de ácidos graxos em formulações nanotecnológicas , como lipossomas, representa uma alternativa para aproveitar sua potente ação antimicrobiana e melhorar suas propriedades farmacológicas, viabilizando e otimizando a sua veiculação e entrega, conforme apresentado por JACKMAN et al . (JACKMAN, J.A. et al . , "Nanotechnology formulations for antibacterial free fatty acids and monoglycerides", Molecules, v.21, n.305, p.1-9, 2016). Também nesse sentido, o desenvolvimento de sistemas nanoparticulados para a encapsulação, direcionamento preferencial ao sitio biológico na pele e a liberação modificada de substâncias capazes de atuar contra um ou mais fatores causadores da acne representa uma abordagem inovadora e muito promissora para o tratamento da pele acneica .
[005] Atualmente são relativamente poucos os relatos de lipossomas com ação antimicrobiana para aplicações terapêuticas e/ou cosméticas, não existindo nenhum produto envolvendo lipossomas na qual o ingrediente ativo antimicrobiano seja o ácido láurico. As únicas referências bibliográficas identificadas em que há a descrição da preparação e da avaliação de eficácia de lipossomas contendo ácido láurico como agente antimicrobiano contra a bactéria Cutibacterium acnes (até recentemente denominada como Propionibacterium acnes), são os artigos científicos publicados por um grupo de pesquisas dos Estados Unidos (YANG, D. et al . , "The antimicrobial activity of liposomal lauric acid against Propionibacterium acnes." Biomaterials, v .30 , p. 6035-6040, 2009; PORNPATTANANANGKUL, D. et al . , "In vivo treatment of Propionibacterium acnes infection with liposomal lauric acids." Advanced Healthcare Materials, v. 2, n. 10, p. 1322-1328, 2013) . Paralelamente, um outro grupo de pesquisas de Taiwan, associado a este grupo americano, relatou estudo de lipossomas de ácido oleico para o controle da bactéria Staphylococcus aureus (HUANG, W.-C., et al . , "Eradication of drug resistant Staphylococcus aureus by liposomal oleie acids." Biomaterials, v. 32, p. 214-221, 2011) . O processo utilizado nos trabalhos relatados por YANG et al. (2009); e PORNPATTANANANGKUL et al . (2013) envolveu a formação do filme lipidico seco, seguido pela sonicação de dispersão lipidica em um banho ultrassónico para a produção de vesículas muitilamelares (MLVs) . Posteriormente, a suspensão de MLVs foi sonicada através de um probe de titânio para produzir vesículas unilamelares pequenas (SUVs) . E, finalmente, a suspensão de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) foi submetida a 11 ciclos de extrusão através de membrana com diâmetro de poro definido (lOOnm) para gerar lipossomas unilamelares grandes (LUVs) . Em comparação com o processo acima descrito, cujo escalonamento é praticamente inviável, o processo de produção de lipossomas unilamelares grandes (LUVs) descrito no presente pedido de patente representa uma inovação tecnológica substancial, por ser muito mais simples, rápido e, principalmente, facilmente escalonável para a produção piloto ou industrial dos lipossomas .
[006] Em um outro estudo, é relatada a atividade anti- inflamatória dos ácidos cáprico e láurico na pele (HUANG, W.-C., et al . , "Anti-bacterial and anti-inflammatory properties of capric acid against Propionibacterium acnes : a comparative study with lauric acid." Journal of Dermatological Science, v. 73, p. 232-240, 2014) . Os autores descrevem preliminarmente as bases moleculares para a ação anti-inflamatória destes dois ácidos graxos em células monocíticas THP-1 estimuladas pela C. acnes. De uma forma mais ampla, é relatado que os ácidos graxos livres exercem um papel relevante no sistema imune humano, particularmente na defesa das superfícies da pele e das mucosas corporais, sendo que existem de 10 mg a 15mg de ácidos graxos livres por centímetro quadrado da pele humana, entre os quais encontram-se os ácidos láurico, mirístico, palmítico, sapienico e cis-8-octadecanóico (DESBOIS, A.P., SMITH, V.J., "Antibacterial free fatty acids : activities, mechanisms of action and biotechnological potential." Appl . Microbiol. Biotechnol . , v. 85, p. 1629-42, 2010) .
[007] No pedido de patente WO2007142548 (CONSTANTINO, L.F.P., et al . "Vesicular formulations containing organic acid prodrugs, process for their preparation, new prodrugs, pharmaceutical compositions and method for the treatment of tuberculosis and other mycobacteriosis" . Universidade de Lisboa, Portugal. PCT - WO 2007/142548, 13/12/2007.) é descrita a preparação de formulações lipossomais para a aplicação farmacêutica no tratamento da tuberculose e de outras infecções micóticas ou bacterianas, caracterizada pela presença de um ou mais ácidos orgânicos fracos, incluindo ácidos graxos e seus ésteres derivados. Ela reivindica formulações vesiculares contendo pró-drogas de ácidos orgânicos, o processo de sua preparação, novas pró- drogas, composições farmacêuticas e método para o tratamento de tuberculose e de outras micobacterioses . Porém não se refere a qualquer aplicação tópica para o tratamento cosmético ou farmacêutico da pele ou de mucosas oral ou vaginal. O processo reivindicado da preparação dessas formulações envolve a esterificação dos ácidos orgânicos, a solubilização dos componentes lipidicos em um solvente apropriado, a remoção do referido solvente por evaporação ou liofilização, seguida pela hidratação do produto obtido, não havendo qualquer indicação sobre o tamanho e a lamelaridade dos lipossomas obtidos, que são aspectos críticos para a sua aplicação cosmética e farmacêutica, e que, portanto, fica sem ser esclarecido.
[008] O pedido de patente CA2120511 (MIKLOS, G. et al . , "Pharmaceutical and/or cosmetic composition and the use thereof." Rhône-Poulenc Rorer Gmbh, Alemanha. CIPO - CA 2120511, 17/02/1994) descreve uma composição farmacêutica e/ou cosmética para uso tópico contendo ácido graxo, composta de ao menos um ingrediente ativo e um carreador lipossomal para a penetração do ingrediente ativo na pele, onde o referido ingrediente ativo é o ácido linoleico e/ou ao menos um composto dele derivado. A esta composição podem ser associados outros ingredientes ativos, como ácido azeláico, eritromicina e ácido retinóico. E reivindica o uso da supracitada composição para a prevenção e/ou tratamento da acne e/ou de alterações a ela relacionadas.
[009] O pedido de patente BRPI0805754-0 (MARTINS, M.H., PESSINE, F.B.T., "Composição farmacêutica compreendendo isotretinoina lipossomal e processo para a preparação da mesma." UNICAMP, Brasil. INPI - BR PI 0805754 (A2), 14/09/2010) descreve uma composição farmacêutica para uso dermatológico que compreende isotretinoina encapsulada em lipossomas destinada ao tratamento tópico de desordens da pele, como acne, psoriase e fotoenvelhecimento, mas não referencia o uso de ácidos graxos como ingrediente ativo antimicrobiano na formulação lipossomal.
[010] No caso do tratamento da acne vulgar, atualmente o agente antimicrobiano de referência é o peróxido de benzoila, cujo uso no Brasil é restrito a formulações farmacêuticas (seu uso não é permitido em produtos cosméticos) . Assim como os ácidos graxos, o peróxido de benzoila é considerado de baixo potencial de desenvolvimento de cepas bacterianas resistentes. Porém, devido à elevada capacidade alvejante deste ingrediente ativo, o seu uso pode provocar manchas na roupa dos usuários, o que é considerado um problema tecnológico ainda não solucionado. Antibióticos clássicos, como clindamicina e eritromicina, também são utilizados no tratamento da acne, apesar da sua propensão em gerar resistência bacteriana a médio e longo prazo. [011] Lipossomas podem ser produzidos através de diversos métodos de preparação. Em função do método utilizado, as vesículas lipossomais geradas podem apresentar tamanho médio variando desde algumas poucas dezenas de nanômetros até alguns micrômetros. Em termos do número de bicamadas lipídicas, ou lamelas, os lipossomas podem apresentar-se como vesículas unilamelares , quando há apenas uma única bicamada lipídica lipossomal encapsulando o cerne aquoso, ou então apresentar-se como vesículas multilamelares, quando duas ou mais lamelas estão presentes. Lipossomas com tamanho médio na faixa de 25 nm até lOOnm são classificados como pequenos, enquanto aqueles com tamanho médio superior a lOOnm são classificados como lipossomas grandes.
[012] Os métodos mais amplamente utilizados para a preparação de lipossomas, como o da hidratação do filme lipídico seco ou o da injeção da fase lipídica em uma fase aquosa, normalmente resultam na obtenção de lipossomas multilamelares grandes. Tais características de lamelaridade e de tamanho podem ser, posteriormente, modificadas através do emprego de outros processos, como a homogeneização sob alta pressão, a extrusão da suspensão lipossomal através de membrana com diâmetro de poro definido e uniforme, ou pela sua sonicação, possibilitando a obtenção de lipossomas unilamelares com redução de seus tamanhos médios.
[013] Um processo para a preparação de lipossomas unilamelares, baseado na injeção através de um bocal (nozzle de 0,1 mm a 10,0 mm de diâmetro), sob pressão, de uma solução etanólica dos componentes lipídicos e ingrediente ativo lipofílico (vazão de 1 mL a 1.000 mL por minuto), em uma fase aquosa sob agitação intensa (1.500 rpm a 20.000 rpm), em homogeneizador, é descrito na patente EP0253619 BI (BOLLER, F.H., "Method of preparing single bilayered liposomes." CILAG LTD . , Suíça. EPO - EP 0253619, 15/01/1992) . O referido agente hidrofilico é um ativo antifúngico (econazol, terconazol ou miconazol), e/ou um anti-inflamatório não esteroidal (prostaglandina) . Porém persiste aqui o problema tecnológico de uso de etanol em concentrações significativas (em torno de 5% a 10%), que é indesejável no caso de produtos para uso tópico na pele oleosa com tendência à acne, ou de peles ressecadas, especialmente aquelas cuja barreira cutânea está comprometida, como no caso da dermatite atópica e psoriase, que foi devidamente considerado no processo ora revelado, na qual os lipossomas concentrados (até 50mM de lipídios) são produzidos com até 5% de concentração de etanol, o que permite se obter concentração de etanol no produto cosmético final igual ou inferior a 1,25%. Além disso, o processo descrito na patente EP0253619 BI (BOLLER, F.H., "Method of preparing single bilayered liposomes." CILAG LTD., Suíça. EPO - EP 0253619, 15/01/1992) utiliza um homogeneizador, equipamento imprescindível para a execução da produção dos lipossomas neste caso, enquanto na preparação dos lipossomas multifuncionais objeto do presente pedido de patente não se faz necessário o uso deste equipamento para a geração de lipossomas unilamelares .
[014] O pedido de patente W02003077861 A2 (SKÕLD, T. "Water-based delivery systems." Collagenex Pharmaceuticals, Inc. , Estados Unidos. PCT - WO 2003/077861, 13/03/2002) descreve um sistema vesicular para a entrega modificada de ingredientes ativos capaz de proporcionar a restauração da barreira no estrato córneo, no qual ácidos graxos estão presentes na composição lipídica da bicamada, juntamente com fosfolipídios, ceramidas e colesterol. Neste caso, entretanto, a função do ácido graxo na composição e na aplicação final reivindicada não envolve a sua atividade antimicrobiana ou anti-inflamatória cutânea, sendo descrita a utilização de outros compostos ativos para as diferentes finalidades terapêuticas tópicas reivindicadas, inclusive para o tratamento da acne.
[015] O invento aqui descrito envolve o uso de um ácido graxo, especificamente o ácido láurico, veiculado em lipossomas para aplicações dermatológicas tópicas, cosméticas e/ou farmacêuticas e/ou veterinárias, associado a ingredientes ativos complementares com ação anti- inflamatória e antioxidante . O uso de ácido láurico como agente antimicrobiano e anti-inflamatório cutâneo apresenta a vantagem de não indução de resistência bacteriana, como os relatados para os antibióticos convencionais, como p. ex . clindamicina e eritromicina . Por outro lado, o ácido láurico pode ser utilizado em substituição ao peróxido de benzoila, com a vantagem de não apresentar ação alvejante (não mancha as roupas ou o cabelo) , não expor a pele humana ou animal a radicais livres, e de poder ser usado em menores concentrações. Além disso, os lipossomas com ácido láurico podem ser usados sobre toda a superfície da pele visando a prevenção e o tratamento da acne vulgar, sendo esta uma outra vantagem sobre o uso do peróxido de benzoila.
[016] Um problema amplamente conhecido no estado da técnica, e ao menos parcialmente superado pelas invenções ora reveladas, trata-se da irritação cutânea causada por ácidos graxos em geral, especialmente o ácido láurico, classificado na categoria 3 de irritação cutânea de acordo com a Classificação GHS . Tal problema é minimizado pela diluição suficiente do ácido láurico conforme descrição detalhada a seguir. Tal diluição permite a manutenção das atividades e propriedades desejadas, por exemplo antimicrobianas , sem a ocorrência de irritação cutânea significativa. [017] Comparado a outros agentes antimicrobianos vegetais, como alguns óleos essenciais, p. ex . óleo essencial de melaleuca, a vantagem de se usar o ácido graxo reside no fato dele ser um composto único (uma substância apenas), sem potencial alergênico, ao contrário dos óleos essenciais, compostos por inúmeras substâncias, algumas das quais reconhecidamente envolvidas em processos alérgicos quando aplicadas topicamente em humanos. A veiculação de ácidos graxos, especialmente do ácido láurico em lipossomas representa uma alternativa muito promissora, pois minimiza o teor de compostos lipidicos na formulação galênica, especialmente importante no caso de sua aplicação para o tratamento cosmético da pele oleosa com tendência à acne. Ainda, o ácido láurico comprovadamente apresenta atividade anti-inflamatória na pele, como descrito por HUANG e colaboradores (HUANG, W.-C., et al . , "Anti-bacterial and anti-inflammatory properties of capric acid against Propionibacterium acnes : a comparative study with lauric acid." Journal of Dermatological Science, v. 73, p. 232-240, 2014) .
[018] Além disso, a forma de veiculação via lipossomal permite associar outros ingredientes ativos complementares, necessários para o adequado tratamento de diferentes problemas da pele e/ou de mucosas corporais. E também, dada a interação dos lipossomas com o cimento intercelular do estrato córneo, é possível o acúmulo parcial dos ingredientes ativos nesta estrutura (efeito reservatório) , possibilitando a ação de tais ingredientes na pele ao longo de um maior período de tempo, além de favorecer a recuperação e/ou melhoria da função de barreira da pele. O agente antimicrobiano e anti-inflamatório ácido láurico isoladamente, ou associado com compostos que apresentam atividades anti-inflamatória e/ou antioxidante complementares, veiculado em uma formulação lipossomal, permite que esta composição seja utilizada para a prevenção e/ou o tratamento de acne vulgar, de psoriase, de dermatite atópica, do envelhecimento da pele, da seborreia (caspa) , da alopecia, do mau-odor corporal ou bucal, e de infecções microbianas oportunistas, dado que o espectro da ação antimicrobiana do ácido láurico é amplo, apresentando atividade antimicrobiana também contra a bactéria patogênica Staphílococcus aureus (NAKATSUJI, T. et al., "Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes : its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris." J. Invest. Dermatol . , v.129, p. 2480-2488, 2009) e, portanto, não se restringindo apenas à C. acnes. Desta forma, a formulação lipossomal desenvolvida pode ter uma gama maior de aplicações, contribuindo na manutenção da microbiota cutânea normal como forma de prevenção e/ou de tratamento de diferentes problemas dermatológicos associados ao desbalanço da microflora cutânea. Outra vantagem dos lipossomas ora escritos é o processo mais simples de produção dos mesmos, que envolve a injeção de uma fase oleosa, - na qual o solvente principal pode ser um álcool, especificamente o etanol, e/ou um poliol, um poli-éster de poliol ou um poli-éter de poliol, como p. ex . polietileno-glicol ou glicerol, mais especificamente o propilenoglicol , em uma fase aquosa sob agitação em agitador convencional. E a sua composição pode apresentar um teor de álcool etílico na suspensão lipossomal que pode variar desde 4,5% até 21% (m:m) , possibilitando a obtenção de formulações cosméticas e/ou farmacêuticas e/ou veterinárias finais com teores de etanol variando desde 0, 1% (ou inferior) até 20% (m:m) .
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[019] Foram desenvolvidos lipossomas unilamelares grandes ("Large Unilamellar Vesicles" - LUV) compreendendo ingredientes com atividades antimicrobiana, aplicáveis na prevenção e no tratamento cosmético tópico da acne leve a moderada. Tais lipossomas são estáveis em pelo menos uma base cosmética, como gel, creme, gel-creme e loção.
[020] A produção dos lipossomas foi realizada pelo processo de injeção da fase lipidica em uma fase aquosa, com adequado controle do fluxo da fase lipidica e uso de agitação mecânica convencional (haste centrífuga) , obtendo-se uma suspensão lipossomal estável, de elevada concentração lipidica e baixa concentração de etanol.
[021] Os referidos LUV são úteis, por exemplo, contra Cutibacterium acnes, e têm ação anti-inflamatória e antioxidante . Seus usos médicos, cosméticos e veterinários, bem como métodos relacionados são também parte da invenção.
DE CR ÇÃO DAS FIGURAS
[022] FIGURA 1: Dados de SAXS para a amostra de lipossomas preparados com fos fatidilcolina de soja não hidrogenada (Lipoid S75®) , diluída a 20mM de lipídios totais. Os pontos experimentais estão representados pelos círculos abertos enquanto a linha contínua corresponde ao ajuste.
[023] FIGURA 2: Perfil de densidade eletrónica obtido a partir do ajuste da curva experimental mostrada na Figura 1.
[024] FIGURA 3: Comparação entre as curvas de SAXS de · lipossomas preparados com fosfatidilcolina de soja (Lipoid S75®) e A lipossomas preparados com fosfatidilcolina de soja hidrogenada Phospholipon 80H®.
[025] FIGURA 4: Comparação entre as curvas de SAXS de lipossomas multifuncionais de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Phospholipon 80H®) , obtidas sob concentrações lipídicas totais de 50mM, 25mM e 12,5mM.
[026] FIGURA 5: Comparação do efeito inibitório sobre o crescimento da C. acnes pela ação dos lipossomas multifuncionais, do ácido láurico isoladamente e do ingrediente antimicrobiano de referência peróxido de benzoila .
[027] FIGURA 6: Comparação do efeito inibitório contra a C. acnes do gel lipossomal, do gel-placebo e dos lipossomas multifuncionais de ácido láurico. (OBS. 1: O gel lipossomal refere-se ao gel cosmético contendo 25% de suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada, conforme descrito na Tabela 8; OBS .2 : O gel placebo, sem ácido láurico, foi empregado nas mesmas quantidades do gel lipossomal; para fins de comparação, sua concentração foi referenciada no gráfico como a correspondente à concentração de ácido láurico presente em igual volume do gel lipossomal) .
[028] FIGURA 7: Avaliação da atividade antioxidante dos lipossomas (LF) através da porcentagem de inibição da peroxidação lipidica de ácido araquidônico devido à presença de lipossomas (com ou sem sacarideos) .
[029] FIGURA 8: Avaliação da ação anti-inflamatória " in vítro" - Níveis de IL-1a dosados em sobrenadantes de cultura de células NHK pré-incubadas com biosaccharide gum-2 (RH 0,05 mM) ou com lipossomas contendo biosaccharide gum-2 (Lip. + RH, colchete preto) em 4 concentrações diferentes, ou com lipossomas sem biosaccharide gum-2 (Lip. - RH, colchete vermelho) em 4 concentrações diferentes, e incubados posteriormente com extrato de parede de C. acnes inativada pelo calor.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[030] O presente pedido de patente se refere, em uma modalidade, a lipossomas compreendendo lipídios com ação antimicrobiana contra microrganismos envolvidos em problemas dermatológicos, como p. ex . as bactérias Cutibacterium acne e Staphílococcus aureus, bem como ação anti-inflamatória . [031] Os lipídios em questão são ácidos graxos, entre eles o ácido cáprico, caprílico, mirístico, láurico, oleico, palmítico, esteárico, araquídico e/ou linoleico, ou misturas dos mesmos, mas preferencialmente o ácido láurico, associado ou não a outros agentes antimicrobianos , lipídicos ou não, ou a compostos que apresentem atividades biológicas relevantes para a prevenção e/ou tratamento de problemas dermatológicos, como ingredientes ativos com ação anti- inflamatória, antioxidante, sebo-reguladora, hidratante, restauradora da barreira cutânea, promotora de proliferação celular, anti-envelhecimento, anti-queda capilar, promotora do equilíbrio da microbiota cutânea, entre outras.
[032] De acordo com uma modalidade alternativa, a veiculação do lipídio antimicrobiano e/ou anti -inflamatório supracitado é realizada através da sua incorporação em bicamadas lipídicas, especificamente em vesículas lipossomais, de forma a minimizar o uso de outros agentes usualmente empregados para viabilizar a incorporação de compostos lipofílicos em formulações de base aquosa, como p. ex . agentes tensoativos, emulsionantes e/ou emulsificantes . As vesículas lipossomais, ou lipossomas, podem ser incorporadas em formulações cosméticas e/ou farmacêuticas de uso tópico para a aplicação na pele, no couro cabeludo e/ou nas mucosas corporais (boca ou genitais) .
[033] Em uma modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere aos lipossomas descritos acima. Tais lipossomas apresentam, em sua composição lipídica, uma concentração de ácido graxo suficientemente alta para que a sua ação antimicrobiana seja relevante, sendo significativamente mais alta em relação à concentração de ácido graxo na maioria dos lipossomas relatados previamente na literatura. Uma das vantagens trazidas pelos lipossomas ora descritos e reivindicados é que tal concentração, embora alta e suficiente para alcançar a atividade necessária, não causa irritação cutânea. Isso é surpreendente dado o potencial de ácidos graxos, como o ácido láurico de causar irritação cutânea.
[034] A elevada concentração relativa de ácido graxo, perante os demais componentes lipofilicos constituintes da bicamada lipossomal, também pode ser considerado um fator determinante para a obtenção de lipossomas com as caracteristicas especificas de tamanho e de lamelaridade descritas no presente pedido patente.
[035] Em uma modalidade preferida especifica, lipossomas descritos no presente pedido de patente são obtidos quando o ácido graxo com ação antimicrobiana e/ou anti- inflamatória, como por exemplo, o ácido láurico, é usado em concentração suficientemente elevada e, simultaneamente, quando uma parcela significativa deste ácido graxo está na forma do seu sal, isto é, na forma de laurato. De acordo com tal modalidade, a concentração final de ácido láurico na suspensão de lipossomas deve ficar acima da concentração mínima inibitória para que os lipossomas apresentem ação antimicrobiana contra a C. acnes, determinada como sendo 0,02% (m:m) . Desta forma, a concentração de ácido láurico na suspensão lipossomal descrita no presente relatório descritivo deve estar entre 0,08% e 0,75%, preferencialmente na faixa de 0,20% a 0,60%, mais especificamente na faixa de 0,40% a 0,50% (m:m) . A formação do referido sal é melhor descrita abaixo.
[036] Alternativamente, além do ácido láurico, os lipossomas aqui descritos e reivindicados podem compreender outros compostos nanoencapsulados , como antioxidantes , anti- inflamatórios e outros agentes cosméticos, por exemplo, mas não limitados a acetato de tocoferol e Biosaccharide Gum-2. [037] Outra modalidade da invenção se refere a um processo de produção dos lipossomas multifuncionais aqui descritos e reivindicados. O referido processo compreende, de maneira geral, a solubilização do ácido graxo e demais componentes lipidicos, ou oleosos, em um ou mais solventes lipofilicos, seguida da alcalinização da fase lipidica com uma solução de um agente alcalinizante e posterior adição da mistura da fase lipidica e agente alcalinizante a uma fase aquosa.
[038] Os tamanhos médios dos lipossomas mostraram-se dependentes da composição lipidica e do(s) solvente (s) lipofilico ( s ) utilizado ( s ) , conforme descrito na Tabela 4.
[039] Os componentes lipidicos, ou oleosos, podem ser, por exemplo, selecionados do grupo compreendendo, mas não limitados a lecitina hidrogenada de soja desengordurada e com 70% de fosfatidilcolina, ácido láurico, acetato de tocoferila, colesterol e o polissorbato 80.
[040] Solventes lipofilicos adequados podem ser, por exemplo, um álcool e um poliol selecionados do grupo compreendendo, mas não limitado a etanol e propilenoglicol, onde a concentração em massa de etanol pode variar de 0% até 99,9%, e a concentração em massa de propilenoglicol pode variar entre 0% e 95%. As concentrações de tais componentes são exemplificadas na Tabela 4.
[041] A solubilização dos componentes oleosos em um ou mais solventes lipofilicos adequados, que podem ser um álcool e um poliol, especificamente etanol e propilenoglicol, onde a concentração em massa de etanol na suspensão lipossomal pode variar de 1% a 25%, preferencialmente na faixa de 2% a 7%, especialmente na faixa de 4% a 5% , e a concentração em massa de propilenoglicol na suspensão lipossomal pode variar entre 0% e 30%, preferencialmente na faixa de 20% a 30%, mais especificamente na faixa de 24% a 28%. [042] A solução de um agente alcalinizante pode ser, por exemplo, selecionada do grupo compreendendo, mas não limitado a uma solução aquosa de hidróxido de sódio , hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, hidróxido de cálcio ou trietanolamina, entre outros equivalentes. A solução de agente alcalinizante deve ter concentração final na suspensão lipossomal na faixa de 0,009% até 0,040%, preferencialmente na faixa de 0,020% até 0,030%, mais especificamente na faixa de 0,024% até 0,026% (m:m) .
[043] A adição da fase lipidica à fase aquosa pode ser efetuada vertendo-se diretamente a fase lipidica sobre tal fase aquosa, com constante agitação mecânica desta, em que a fase lipidica é obtida, por exemplo, através da solubilização de ingredientes lipossolúveis em solvente orgânico. Preferencialmente, a adição da mistura da fase lipidica e agente alcalinizante a uma fase aquosa pode ser efetuada, por exemplo, pela injeção da solução lipidica, sob um fluxo controlado (por exemplo, via bomba peristáltica) , no seio da fase aquosa, ou vertendo-se direta e lentamente a fase lipidica sobre a fase aquosa, sob aquecimento e sob agitação mecânica moderada (por exemplo, agitador com hélice centrífuga ou agitação magnética) .
[044] Em uma modalidade preferida, a temperatura de aquecimento das fases aquosa e oleosa para a preparação dos lipossomas está na faixa de 40°C a 80°C, preferencialmente na faixa de 65°C a 75°C. É essencial que ambas as fases, aquosa e oleosa, estejam, simultaneamente, dentro das referidas faixas de temperatura para o processo de preparação ser bem sucedido.
[045] Em outra modalidade preferida, o tipo de agitador usado para agitar a fase aquosa durante a preparação dos lipossomas é, por exemplo, um agitador mecânico, com hélice, do tipo centrífuga. Ao longo da etapa de adição da fase oleosa na fase aquosa, a velocidade de agitação deste agitador mecânico com hélice centrífuga deve ser ajustada, por exemplo, na faixa de 850rpm a 1.800rpm, preferencialmente na faixa de 1.200rpm a 1.600rpm.
[046] Em mais uma modalidade preferida, o fluxo de adição da fase oleosa na fase aquosa, quando transferida pela bomba peristáltica, deve estar, por exemplo, na faixa de 5mL/minuto a 20mL/minuto, preferencialmente na faixa de lOmL/minuto a llmL/minuto .
[047] A fase aquosa pode ser composta, por exemplo, por água desmineralizada ou por uma solução tampão com pH 6,0 a
7.5, por exemplo. Especificamente, mas não se limitando a uma possibilidade específica, uma solução tampão fosfato de potássio pode ter 30mM e pH 6,6.
[048] O uso de uma solução tampão é desejável para evitar variações no pH da suspensão lipossomal, uma vez que os lipossomas não são completamente estáveis quando preparados e/ou mantidos sob pH menor que pH 6,0 ou sob pH maior que pH
7.5.
[049] É importante ressaltar que a alcalinização da fase lipídica demonstrou ser uma etapa crítica do processo para a obtenção de lipossomas físico-quimicamente estáveis. A relevância da alcalinização da fase lipídica, que teoricamente proporcionaria a desprotonação do ácido láurico, mostrou ser, surpreendentemente, um fator importante para a estabilização da bicamada lipídica do lipossoma, indicada por testes complementares realizados nos quais a etapa de alcalinização foi suprimida. É importante se considerar que os ácidos graxos apresentam pKa tipicamente na faixa de 4,5 a 5,5, sendo que o pKa do ácido láurico é 5, 3.
[050] Portanto, a incorporação da solução alcalinizante na fase lipídica durante a preparação da suspensão de lipossomas, é essencial para viabilizar a obtenção dos lipossomas unilamelares e com as caracteristicas adequadas de tamanho e estabilidade fisico-quimica .
[051] Outro aspecto importante é que a relação molar entre o hidróxido de sódio e o ácido láurico presentes na suspensão lipossomal deve estar na faixa de 10% a 70%, preferencialmente na faixa de 20% a 35%, mais especificamente na faixa de 26% a 30% (mol:mol - percentual relativo ao quociente das quantidades molares de hidróxido de sódio e ácido láurico) . Desta forma, garante-se que uma parcela significativa de ácido láurico seja saponificado pelo hidróxido de sódio, condição fundamental para a obtenção de lipossomas unilamelares e com as caracteristicas adequadas de tamanho e estabilidade fisico-quimica descritas neste pedido de patente. Os lipossomas descritos no presente pedido de patente são obtidos quando o ácido láurico é usado em concentração suficientemente elevada e, simultaneamente, quando uma parcela significativa deste ácido graxo está na forma do seu sal, isto é, na forma de laurato, por exemplo laurato de sódio ou potássio.
[052] O processo descrito acima, e aqui reivindicado, permite a obtenção lipossomas unilamelares, com tamanho médio na faixa de 90nm a 300nm, por exemplo de 140nm a 250nm. O referido processo é simples o suficiente para ser implementado em escala industrial, não necessitando de equipamentos especiais de custo mais elevado, e/ou que envolveriam maior tempo de processo, tais como homogeneização a alta pressão, agitação com elevado cisalhamento em agitador tipo rotor-estator, ou mesmo como a extrusão da suspensão lipossomal através de membranas de diâmetro de poros definido ou como a sonicação. Além disso, o tamanho médio dos lipossomas pode ser ajustado ou modulado, dentro de uma faixa de tamanhos entre 90nm a 300nm, em função da composição lipidica, especialmente da lecitina ou do fosfolipidio usado, assim como em função do sistema solvente lipofilico empregado.
[053] Considerando os resultados experimentais descritos nos Exemplos, a seguir, lipossomas com caracteristica consideradas ideais foram preparados com fosfatidilcolina de soja hidrogenada e quando o sistema solvente da fase lipidica é composto por propilenoglicol e etanol. A faixa de tamanho médio das nanoparticulas obtidas para os referidos lipossomas é de 90nm a 300nm, mais preferencialmente entre 140nm e 260nm, com índice de polidispersidade (PDI) na faixa de 0,01 a 0,30, preferencialmente índice de polidispersidade (PDI) na faixa de 0,05 a 0,20. O parâmetro índice de polidispersidade (PDI - "polydispersity index") representa uma medida da distribuição de tamanho das nanopartículas lipossomais, considerando a técnica de espectroscopia de correlação fotônica (PCS - "photon correlation spectroscopy" ) empregada para a determinação do tamanho das nanopartículas . Entretanto, é evidente, a partir da presente descrição, que outros lipossomas com características adequadas podem ser obtidos por variações dos processos ora descritos e reivindicados.
[054] Alternativamente, além do ácido láurico, os lipossomas aqui descritos e reivindicados podem ser obtidos de modo a compreender outros compostos encapsulados, como antioxidantes , anti-inflamatórios e outros agentes cosméticos, por exemplo, mas não limitados a acetato de tocoferol e Biosaccharide Gum-2.
[055] Os lipossomas obtidos como acima descritos foram caracterízados em termos de pH da suspensão (pH entre pH6,6 e pH 7,5, preferencialmente pH 6,8 a pH 7,0), tamanho médio (90nm a 300nm) e distribuição de tamanhos das nanopartículas (PDI < 0,3), potencial zeta (-41mV a -32mV) , lamelaridade (unilamelar) , eficiência de encapsulação (EE = 28,8% ± 0,3% ref. ao ingrediente ativo hidrofilico encapsulado, biosaccharide gum-2), sendo estáveis do ponto de vista fisico-quimico e microbiológico .
[056] Em uma modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere a lipossomas unilamelares de diâmetro médio entre 90nm e 300nm. Particularmente, os processos ora reivindicados permitem a obtenção de lipossomas unilamelares de diâmetro médio inferior a 90 nm a lOOnm, isto quando o solvente lipofilico é composto apenas por etanol. Quando o propilenoglicol é adicionado ao sistema, diâmetros maiores podem ser obtidos, conforme demonstrado na Tabela 4. Tais lipossomas compreendem um lipídio antimicrobiano e/ou anti- inflamatório, preferencialmente um ácido graxo, como p. ex. ácido láurico. Os lipossomas aqui revelados possuem ainda característica de baixa polidispersidade .
[057] Em outra modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere a composições que compreendem lipossomas conforme descritos acima e um veículo cosmético, farmacêutico e/ou veterinário aceitável. Tais composições podem ser na forma de, por exemplo, gel, creme, gel-creme ou uma loção. Em algumas modalidades alternativas, o teor de álcool etílico de tais composições é igual ou inferior a 20,5% (quando o álcool etílico é o único solvente lipofilico utilizado na preparação dos lipossomas), ou igual ou inferior a 1,25% (quando outro solvente lipofilico é usado juntamente com o álcool etílico) .
[058] Em outra modalidade preferida, o presente pedido de patente se refere a usos de ácido láurico para preparação de um lipossoma conforme definido acima. Alternativamente, tais usos são no preparo de uma composição para tratar e/ou prevenir problemas dermatológicos. Tal problema dermatológico pode ser causado, por exemplo, por bactérias, fungos, bolores e/ou leveduras, como p. ex . Cutibacterium acnes (Propionibacterium acne) , Staphylococcus aureus , Malassezia furfur, Corineumbacterium spp. , Trichophyton spp., entre outros. Alternativamente, o problema dermatológico pode ser acne, psoriase, dermatite atópica, envelhecimento da pele, seborreia (caspa) , alopecia, mau odor corporal ou bucal, infecção microbiana, ou desbalanço da microbiota cutânea.
[059] A seguir, são apresentadas concretizações especificas da presente invenção. No entanto, deve ser entendido que tais exemplos são providos somente para finalidade ilustrativa e que várias modificações ou mudanças, à luz das concretizações aqui reveladas, serão sugestivas a um técnico no assunto e devem estar incluídas dentro do espírito e alcance desta descrição e escopo das reivindicações que a acompanham.
EXEMPLOS
Exe pl o 1 : Preparação de Lipossomas
[060] Em um exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido graxo perante os demais componentes da bicamada lipossomal, lecitina de soja enriquecida em fosfatidilcolina (Emulmetik® 900/Lucas Meyer) , ácido láurico, acetato de tocoferila e ésteres de aminopropanodiol de óleo de cártamo/azeite de dendê (ômega-6-Ceramide® /Solabiá) foram inicialmente solubilizados em etanol sob agitação magnética e à temperatura ambiente (25°C) . Em seguida, a esta solução etanólica de lipídios, sob agitação e à temperatura ambiente, adicionou-se uma solução aquosa de hidróxido de sódio 0,1M (0,1 mol/L) . A solução lipídica alcalinizada foi então injetada no seio de uma fase aquosa através de uma cânula de aço-inox de 18 biseis (gauge 18), com a saída imersa nesta fase aquosa, composta por uma solução de Biosaccharide Gum- 2 em água desmineralizada, e mantida sob agitação por 20 minutos e à temperatura de 45°C, obtendo-se lipossomas com tamanho médio de 93nm (PDI = 0,252) . A suspensão lipossomal assim obtida, cuja composição é apresentada na Tabela 1, apresentou pH igual a 7,0. Em relação aos componentes lipidicos, o ácido láurico representa 58,5% (proporção molar) em relação ao total de lipídios presentes nos lipossomas. Portanto, a bicamada lipídica é constituída maj oritariamente por moléculas deste ácido graxo.
[061] Tabela 1: Composição da suspensão de lipossomas multifuncionais descrita no Exemplo 1.
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Exemplo 2: Preparação de Li possoma s
[062] Em um outro exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido graxo perante os demais componentes da bicamada lipossomal, os componentes lipidicos Lipoid S75®/Lipoid (lecitina de soja desengordurada com 70% de fosfatidilcolina de soja), ácido láurico, acetato de tocoferila, colesterol e o polissorbato 80 foram solubilizados em uma mistura de propilenoglicol e etanol, sob agitação magnética (marca IKA, mod. C-Mag HS-7, velocidade: nível 6) e a 70°C. Após a completa solubilização destes ingredientes, e ainda mantendo-se a agitação e o aquecimento, adicionou-se a esta solução lipídica uma solução de hidróxido de sódio 2,0 M (2,0 mol/L) em água. Posteriormente, fez-se a injeção da solução lipídica alcalinizada no seio de uma fase aquosa, composta por sacarose, Malt Secrets®/Gattefossé (Propanediol (and) Water (and) Hordeum vulgare seed extract) e Biosaccharide Gum-2, previamente solubilizados em solução Tampão Fosfato de Potássio 30mM pH 6,6. A referida injeção da fase lipídica alcalinizada foi realizada usando-se uma bomba peristáltica (marca Watson-Marlow, mod. 120S/DV) com mangueira de silicone de diâmetro interno de 0, 8mm, sob velocidade de 200rpm e vazão de 6,75 mL/minuto. Durante o processo de injeção da fase lipídica, a fase aquosa foi mantida sob agitação mecânica (marca IKA, modelo RW20, com haste centrífuga) , sob velocidade de 850rpm e sob a temperatura de 70°C. Ao final deste processo, a suspensão lipossomal obtida, cuja composição é apresentada na Tabela 2, apresentou pH igual a 7,0 e tamanho médio dos lipossomas de 270 nm (PDI = 0,198), observando-se uma única população de nanopartículas . Os lipossomas obtidos foram caracteri zados como sendo unilamelares através da técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) . Nesta formulação, o ácido láurico representa 51% (proporção molar) em relação ao total de lipídios presentes nos lipossomas.
[063] Tabela 2: Composição da suspensão de lipossomas multifuncionais descrita no Exemplo 2.
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Exemplo 3: Preparação de Lipossomas
[064] Em um mais um exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido graxo perante os demais componentes da bicamada lipossomal, os componentes lipidicos Phospholipon 80H®/Lipoid (lecitina hidrogenada de soja, desengordurada e com 70% de fosfatidilcolina) , ácido láurico, acetato de tocoferila, colesterol e o polissorbato 80 foram solubilizados em uma mistura de propilenoglicol e etanol, sob agitação magnética (marca IKA, mod. C-Mag HS-7, velocidade: nivel 6) e a 70°C durante 30 minutos. Após a completa solubilização destes ingredientes, e ainda mantendo-se a agitação e o aquecimento, adicionou-se a esta solução lipidica uma solução aquosa de hidróxido de sódio 2,0 M (2,0 mol/L) . Posteriormente, fez- se a injeção da solução lipidica alcalinizada no seio de uma fase aquosa, composta por sacarose e Biosaccharide Gum-2, previamente solubilizados em solução Tampão Fosfato de Potássio 30mM pH 6,6. A referida injeção da fase lipidica alcalinizada foi realizada usando-se uma bomba peristáltica (marca Watson-Marlow, mod. 120S/DV) com mangueira de silicone de diâmetro interno de 1,6 mm, sob velocidade de 80 rpm e vazão de 10,5 mL/minuto. Durante o processo de injeção da fase lipidica, a fase aquosa foi mantida sob agitação mecânica (marca IKA, modelo RW20, com haste centrífuga), sob velocidade de 1.200 rpm e sob a temperatura de 70°C. Ao final deste processo, a suspensão lipossomal obtida, cuja composição é apresentada na Tabela 3, apresentou pH igual a 6, 9 e tamanho médio dos lipossomas de 190 nm (PDI = 0,176) . Os lipossomas obtidos foram caracterizados como sendo unilamelares através da técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) . Nesta formulação, o ácido láurico representa 51% (proporção molar) em relação ao total de lipídios presentes nos lipossomas.
[065] Tabela 3: Composição da suspensão de lipossomas multifuncionais, descritos no Exemplo 3.
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[066] Um resultado interessante e inesperado é relativo aos tamanhos médios das nanoparticulas obtidas ao se alterar um ingrediente (fosfolipidio) e/ou o sistema solvente utilizado na preparação da fase lipidica ( Tabela 4 ) . Os lipossomas preparados com Phospholipon 80H® (lecitina de soja hidrogenada) , como descrito no terceiro exemplo, apresentaram tamanho médio inicial de 190nm, que é 80nm menor do que aquele obtido para os lipossomas preparados com Lipoid S75® (270nm) . Comparando-se com o tamanho médio dos lipossomas obtidos no primeiro exemplo, preparado apenas com etanol como solvente da fase lipidica, percebe-se que as nanoparticulas lipossomais geradas neste caso apresentavam o menor tamanho médio (93nm), sendo cerca de lOOnm menores que aquelas do terceiro exemplo (tamanho médio de 190nm) , onde se utilizou lecitina hidrogenada, e 180nm menores que o tamanho médio dos lipossomas obtidos no segundo exemplo, a partir de lecitina não-hidrogenada (tamanho médio de 270nm) . Desta forma, evidencia-se que o tamanho médio dos lipossomas obtidos com o processo descrito nesta patente é dependente tanto do tipo de lecitina utilizada (hidrogenada ou não-hidrogenada) , quanto do sistema solvente utilizado para a solubilização dos componentes lipofilicos na preparação da fase oleosa.
[067] Tabela 4: Variação do diâmetro médio dos lipossomas em função do fosfolipidio e do sistema solvente da fase lipidica utilizados.
Figure imgf000029_0001
Exemplo 4: Lamel ar i dade dos lipossomas
[068] A lamelaridade dos lipossomas multifuncionais foi determinada utilizando-se a técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS ;equipamento Nanostar Bruker, com ótica otimizada pela empresa Xenocs) . Nestes experimentos foram utilizados capilares de vidro de l,5mm de diâmetro onde foram colocadas a suspensão lipossomal e suas diluições em tampão fosfato de potássio a 30mM e pH 7. A análise foi realizada através do programa SUPERSAXS . A Figura 1 apresenta o dado experimental (em escala absoluta, e para o qual já foram feitas as correções e calibrações necessárias) obtido durante a medição da amostra lipossomal preparada com fosfatidilcolina de soja não hidrogenada (Lipoid S75®) . O dado foi ajustado desconsiderando-se o fator de estrutura de camadas estacadas, ou seja, foi assumido que as vesículas são unilamelares (N = 1) . Nota-se que o ajuste é satisfatório, conseguindo descrever bem o comportamento da curva experimental.
[069] A Figura 2 mostra o perfil de densidade eletrónica usado para modelar o fator de forma P(q) das bicamadas. A partir do mesmo, conclui-se que a espessura da bicamada é dm = (42 ± 1) Å. Como se tratam de vesículas unilamelares, não é possível obter os parâmetros periodicidade lamelar (D) e parâmetro de Caillé (h) (flexibilidade das bicamadas), pois ambos descrevem o fator de estrutura de camadas estacadas, o qual não é aplicável a este sistema.
[070] Com isso, demonstrou-se que os lipossomas multifuncionais preparados com fosfatidilcolina de soja não hidrogenada (Lipoid S75®) eram unilamelares. Esse mesmo ensaio foi repetido para a formulação de lipossomas preparada com fosfatidilcolina de soja hidrogenada ( Phospholipon 80H®) . A comparação entre os resultados está indicada na Figura 3. Um fator de escala e "background" foi ajustado de maneira a tornar mais fácil a comparação dos dados. As curvas aproximadamente se sobrepõem para valores de "q" maiores que 0, 10Å-1, indicando que ambas são unilamelares. A principal diferença entre as curvas está na região de q < 0, 10Å-1, na qual é possível notar uma oscilação em ambas as curvas, atribuída à interação entre as vesículas. Como as oscilações possuem características diferentes, é possível dizer que a mudança entre as formulações lipossomais alterou principalmente a interação entre as vesículas, mas a forma unilamelar foi preservada. A fim de verificar se as oscilações estão correlacionadas com as interações entre as vesículas, foram feitas diluições na amostra de lipossomas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (12,5mM e 25mM) em tampão fosfato de potássio 30mM e pH 7, e os resultados são mostrados na Figura 4.
[071] Um fator de escala e "background" foi ajustado de maneira a tornar mais fácil a comparação dos dados. Como é possível perceber, as curvas se sobrepõem perfeitamente na região de q > 0,10Å-1, indicando novamente que a forma das vesículas é a mesma para as três concentrações. Ao mesmo tempo, as oscilações observadas para a amostra a 50mM tornam- se menos pronunciadas no caso da amostra a 25mM e praticamente inexistes para a amostra a 12,5mM. Portanto, o começo da curva (região de q < 0,10Å-1), pode ser associado à interação entre as vesículas.
[072] Os lipossomas multifuncionais obtidos com fosfatidilcolina de soja hidrogenada, descritos no terceiro exemplo, foram caracterizados quanto à eficiência de encapsulação do ingrediente biosaccharide gum-2, determinada como sendo (28,8% ± 0,3%), através da separação da fase aquosa externa aos lipossomas por meio da técnica de cromatografia de permeação em gel (gel Sephadex® G100/Sigma- Aldrich; fase móvel = tampão fosfato de potássio 30mM e pH 7,0), com a subsequente quantificação dos resíduos de ramnose provenientes da biosaccharide gum-2 nas amostras contendo lipossomas e nas amostras contendo o ingrediente livre (fase aquosa externa aos lipossomas) . O ingrediente biosaccharide gum-2 foi caracterizado em função do teor do monossacarídeo ramnose através de método colorimétrico (GIBBONS, M. N., "The determination of methylpentoses . " Analyst, v. 80, p. 268 276, 1955) .
F.xempl o 5: Ati vi dade ant i mi crobi ana dos lipossomas
[073] Os lipossomas multifuncionais aqui descritos e reivindicados apresentaram atividade antimicrobiana contra a Cutibacterium acnes ATCC 6919 (Propionibacterium acnes ATCC 6919) sob concentração igual ou superior a 0, 63mM de lipídios lipossomais, determinada através do Teste de Concentração Inibitória Mínima (Teste MIC) contra esta bactéria, utilizando-se o método descrito por NAKATSUJI et al . (NAKATSUJI, T. et al., "Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes : its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris." J. Invest. Dermatol., v.129, p. 2480-2488, 2009), com adaptações. Inicialmente as bactérias foram cultivadas em ágar de meio reforçado de Clostridium (RCM - "Reinforced Clostridium Médium") a 37 °C durante 3 dias, sob condições anaeróbias. Depois, 3 ou 4 colónias de C. acnes foram coletadas, inoculadas em caldo RCM e cultivadas anaerobicamente a 37 °C por 24h, período necessário para a bactéria atingir a fase de crescimento logarítmico. Ao término da incubação, foi feita a leitura de absorbância a 595nm ( espectrofotômetro Genesys 105 Vis), usando o caldo RCM estéril como branco. O caldo RCM com C. acnes foi posteriormente diluído com o meio RCM estéril até se obter o valor de 0,150 para absorbância a 595nm. Conforme a curva de crescimento bacteriano em função da absorbância previamente obtida para a C. acnes, este valor de absorbância corresponde a uma carga de 4,0 x 107 UFC/mL (UFC: Unidades Formadoras de Colónia) . A partir deste inoculo foram feitas as diluições necessárias com caldo RCM estéril para se obter 1,0 x 105 UFC em cada poço da microplaca de Elisa contendo a amostra a ser testada, considerando -se o volume de meio com inoculo que se adicionaria em cada poço. A solução-mãe dos agentes hidrofóbicos foi preparada usando- se dimetilsul fóxido (DMSO) como solvente. Alíquotas desta solução foram dispensadas nos poços de uma microplaca (96 poços) e diluídas sequencialmente com DMSO. No caso dos ingredientes hidrofí licos, bem como das suspensões e géis lipossomais, água destilada foi utilizada em substituição ao DMSO. Alíquotas de cada uma das diluições das amostras foram acrescidas de meio de cultura (caldo RCM) contendo inoculo, e o material foi incubado a 37 °C, sob anaerobiose, durante 48h. No caso das amostras com lipossomas, tanto dispersos em suspensão aquosa quanto em gel cosmético, uma segunda microplaca foi preparada, com a diferença única de se empregar o caldo RCM estéril (não inoculado) . Após a incubação das microplacas foi efetuada a leitura de absorbância a 595nm em leitor de Elisa (marca Biotek, Sinergy Hl Multi-Mode Reader) para estimar o crescimento microbiano. Visando a confirmação qualitativa dos resultados obtidos para preparações contendo lipossomas pelo método acima descrito, o teste de redução da resazurina (0'BRIEN, J. et al . , " Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity" . Eur. J. Biochem. , v. 267, p. 5421-5426, 2000) foi também empregado nas mesmas placas, após as leituras de absorbância a 595nm terem sido efetuadas. Para tanto, 70mL de uma solução 0,01% de resazurina foi adicionada a cada poço e o desenvolvimento da cor foi registrado através de imagem fotográfica.
[074] Os resultados, quando expressos em termos de absorbância relativa, referem-se ao quociente entre a absorbância absoluta da amostra em relação à absorbância do seu branco, no caso dos ingredientes isolados ou em uma mistura de ingredientes em fase aquosa, sem a presença de lipossomas. No caso das amostras com lipossomas (suspensão ou gel aquoso) , a absorbância relativa refere-se ao quociente entre as absorbâncias absolutas da amostra inoculada com C. acnes e da mesma amostra não-inoculada (estéril) .
[075] Foram comparadas as atividades antimicrobianas contra C. acnes de lipossomas multifuncionais de ácido láurico com relação aos ingredientes ácido láurico e peróxido de benzoila (agente antimicrobiano de referência) , assim como em relação ao gel lipossomal e ao gel placebo (sem lipossomas) . Os resultados obtidos nestes estudos são apresentados nas Figuras 5 e 6, tendo sido confirmados qualitativamente através do teste de redução da resazurina.
[076] Com relação aos ingredientes antimicrobianos , a inibição do crescimento bacteriano foi mais pronunciada para o ácido láurico, considerando-se que um efeito inibitório significativo foi obtido a uma concentração inferior (22 pg/mL) relativamente ao efeito inibitório verificado para o peróxido de benzoila (336 pg/mL) . A concentração inibitória do ácido láurico foi 15 vezes inferior à do peróxido de benzoila, considerando-se uma diminuição de absorbância relativa similar em relação à absorbância relativa inicial (relativa à amostra sem qualquer ingrediente, ou seja, com concentração de 0,0 pg/mL) , obtida para cada composto nas concentrações indicadas.
[077] A inibição da C. acnes pela ação dos lipossomas ocorreu sob concentrações de ácido láurico superiores à deste ingrediente isoladamente, porém ainda sob concentrações inferiores às do peróxido de benzoila. Uma significativa ação inibitória dos lipossomas foi observada a partir de concentração de 56 pg/mL de ácido láurico lipossomal. Tais resultados demonstram que o ácido láurico isoladamente seria mais eficiente que os lipossomas multifuncionais contendo ácido láurico. Porém, deve-se considerar a possível interferência causada pela ação antibacteriana do solvente DMSO (dimetil sulfóxido) . Neste estudo, o ácido láurico não- lipossomal foi veiculado após sua prévia solubili zação em DMSO para torná-lo miscível com a fase aquosa do meio de cultura e, consequentemente, possibilitar a sua interação com as bactérias. Da mesma forma, o peróxido de benzoila foi igualmente solubilizado em DMSO.
Eempl o 5: Ati vidade antioxidante dos lipossomas
[078] A atividade antioxidante dos lipossomas multifuncionais preparados com fosfatidilcolina de soja hidrogenada ( Phospholipon 80H®) foi determinada pela avaliação dos níveis de malondialdeído (MDA) , através do método de TBARS ( "Thiobarbituric Acid Reactive Substances") , com a intenção de verificar a ação antioxidante dos lipossomas no que diz respeito à proteção da peroxidação lipídica [MIYAMOTO, S. et al . , "Evaluation of Malondialdehyde Leveis", In: Zenteno-Savin, T. et al . , "Oxidative Stress in Aquatic Ecosystems", John Wiley & Sons Ltd., p. 440-447, 2011]. A primeira etapa deste ensaio envolve a indução da peroxidação do ácido araquidônico (AA) , lipídio presente naturalmente na pele humana. Para isso, foram colocados em tubos de ensaio 10mL da solução 125mg/mL de AA em etanol, 20mL de solução lOmM de ácido ascórbico em tampão fosfato de potássio a 30mM pH 7,0 e 20mL da solução 50mM de FeC13 em água deionizada. Para o controle positivo, o volume foi completado para lmL com metanol e nenhum agente antioxidante foi adicionado. Para os tubos contendo as amostras-teste, foram adicionados volumes distintos de soluções (suspensão lipossomal e demais controles) e o volume foi igualmente completado para lmL com metanol. Um segundo controle, no qual foi suprimida a adição da solução de FeC13, foi preparado visando a avaliação da extensão da oxidação lipídica gerada pelos agentes oxidantes. Os tubos foram fechados, homogeneizados em vórtex e incubados a 37°C por lh. Para se quantificar os níveis de MDA gerados, 50mL de cada amostra exposta aos agentes oxidantes foram transferidos para tubos contendo 1,5mL da solução 1% (v/v) de ácido fosfórico e 500mL de solução 0,67% (m/v) de ácido tiobarbitúrico em água. Para interromper a reação de formação de MDA, foram adicionados em cada tubo 150mL de solução 1,0% (m/v) de EDTA dissódico em água. Os tubos foram fechados, agitados em vortex, e submetidos a banho-maria de água fervente por 30min. Após resfriadas até temperatura ambiente, as amostras foram transferidas para um tubo contendo lmL de n-butanol. Os tubos foram agitados em vórtex e centrifugados a l000g por 5min. Foram realizadas leituras das amostras em espectrofotômetro a 535nm. Os resultados obtidos foram analisados de forma relativa, considerando que o ensaio de controle positivo (ausência de qualquer agente antioxidante) sofreu 100% de oxidação.
[079] Os sacarideos interferem no método, exercendo um forte efeito sinérgico na formação de TBARS, superestimando desta forma a extensão da oxidação (SILVA, F. A. M. et al . , "Métodos para avaliação do grau de oxidação lipidica e da capacidade antioxidante". Química Nova, v. 22, n.l, p. 94- 103, 1999) . Por esta razão, foram analisados os lipossomas multifuncionais preparados na ausência e na presença dos sacarideos (sacarose e biosaccharide gum-2) . A Figura 7 mostra os resultados obtidos para estes ensaios, na qual o controle positivo representa 100% de oxidação de AA, ou seja, 0% de inibição de peroxidação lipidica.
[080] O ensaio com o controle sem Fe(III), conduzido na ausência deste íon, apresentou 33, 6% de oxidação (equivalente a 66,4% de inibição), que pode ser interpretado como a oxidação basal do sistema. Isso indica que a reação de oxidação ocorre em uma extensão significativa mesmo sem a ação do Fe (III) como promotor da oxidação.
[081] A presença dos lipossomas junto ao ácido araquidônico no meio reacional proporcionou uma inibição de 44,5% da oxidação deste lipídio. Efeito antioxidante similar foi observado com os lipossomas preparados sem qualquer sacarideo, com 37,9% de inibição da peroxidação lipidica. Estes resultados indicam que a interferência na quantificação dos produtos da reação com o TBA, decorrente da presença de sacarideos na suspensão lipossomal, foi pouco relevante. Portanto, a suspensão lipossomal é capaz de proporcionar um razoável efeito antioxidante . Por outro lado, os resultados obtidos indicam que o ingrediente biosaccharide gum-2 também apresenta atividade antioxidante, estando de acordo com a indicação prévia de ISARD e colaboradores (ISARD, O. et al, "Anti-inflammatory properties of a new undecyl-rhamnoside (APRC11) against P. acnes." Arch. Dermatol. Res., v.303, n.10, p. 707-13, 2011) .
[082] A comparação dos resultados observados com o controle positivo e com o controle sem Fe (III) evidencia que o método utilizado está adequado, sendo capaz de gerar níveis significativos e detectáveis de complexo formado entre MDA e TBA. Desta forma, é possível afirmar que os resultados obtidos para os lipossomas indicam de fato uma significativa capacidade antioxidante destes.
Exemplo 7: Ati vi dade ant i - i n f l ama tória dos lipossomas
[083] A Atividade anti-inflamatória foi determinada pela quantificação da citocina pró-inflamatórias IL-1a produzida por queratinócitos de pele humana (células NHK - Primary Epidermal Keratinocytes ; Normal, Human, Neonatal Foreskin ATCC® PCS-200-010™) , induzidas por extrato de membrana de C. acnes morta pelo calor, com base na metodologia descrita por ISARD e colaboradores (ISARD, O. et al, "Anti -inflammatory properties of a new undecyl-rhamnoside (APRC11) against P. acnes." Arch. Dermatol. Res., v.303, n.10, p. 707-13, 2011) .
[084] Para o preparo do extrato de membrana de bactéria morta pelo calor, inicialmente realizou-se a cultura da C. acnes (ATCC 6919) em caldo RCM, sob anaerobiose e a 37°C, por 4 dias (período necessário para a bactéria atingir a fase de crescimento estacionário) . Ao final do período de incubação, quantificou-se a carga microbiana através da medida de absorbância a 595nm utilizando se o caldo RCM estéril como branco. Conforme a curva de crescimento bacteriano em função da absorbância previamente obtida para a C. acnes, uma leitura de absorbância de 0,150 (a 595nm) corresponde a uma carga de 4,0 x 107 UFC/mL. Em seguida procedeu se à inativação térmica das bactérias em banho maria a 60°C durante 30 minutos. Centrifugou-se a suspensão bacteriana inativa sob 4.000 rpm por 15 minutos removendo-se cuidadosamente o sobrenadante com pipeta Pasteur. A massa bacteriana foi lavada por 5 vezes com soro fisiológico e centrifugada a 4.000rpm por 15 minutos. Para se efetuar o rompimento das membranas celulares, ressuspendeu-se a massa bacteriana em soro fisiológico, procedendo-se a 15 ciclos de congelamento (-80°C) e aquecimento (37°C) desta suspensão, seguida por 5 ciclos de sonicação. O extrato bacteriano assim obtido foi congelado. No momento de sua utilização, o extrato de membrana de C. acnes morta pelo calor foi descongelado sob temperatura ambiente, centrifugado sob 4.000rpm por 15 minutos removeu-se o sobrenadante com pipeta Pasteur e ressuspendeu-se o pellet no meio de cultura de queratinócitos .
[085] As células NHK foram cultivadas no meio Dermal Cell Basal Médium (ATCC, Manassas, VA) suplementado com o kit Keratinocyte Growth (ATCC, Manassas, VA) e antibióticos (10 U/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina e 25 ng/mL de amfotericina B; ATCC, Manassas, VA) de acordo com as instruções do fabricante e mantidas a 37 °C em incubadora com atmosfera úmida contendo 5% CO2. Ao atingirem 70%-80% de confluência, as monocamadas de células foram tripsinizadas para obtenção de subculturas.
[086] Suspensões lipossomais contendo ou não biosaccharide gum-2 foram pré-incubadas com as células NHK antes do estimulo do extrato de parede de C. acnes inativada ser adicionado ao meio. Conforme os resultados apresentados na Figura 8, há indicativos de efeito preventivo contra a inflamação induzida pela bactéria sem, no entanto, mostrarem um comportamento concentração-dependente. Nota-se que os lipossomas contendo biosaccharide gum-2 apresentaram uma maior redução nos níveis da citocina IL-1a do que os lipossomas que não continham este ingrediente. Entretanto, quando comparamos os valores obtidos para as amostras lipossomais com aquele obtido para o controle positivo, biosaccharide gum-2 isoladamente (RH) , os dois tipos de lipossomas apresentam ainda concentrações mais elevadas. Por outro lado, o fato dos lipossomas sem biosaccharide gum-2 proporcionarem uma redução dos níveis de IL-1a é uma evidência de que os próprios lipossomas de ácido láurico apresentaram efeito preventivo contra a inflamação.
Exemplo 8: Formulações compreendendo os lipossomas
[087] Formulações cosméticas de uso tópico, na forma galênica de um gel, foram preparadas utilizando-se algumas das suspensões de lipossomas multifuncionais anteriormente descritas. Para tanto, à uma fase aquosa, ou à própria suspensão lipossomal, adicionou-se um ou mais agentes formadores de gel e/ou espessantes, que podem ser goma xantana, goma carragenana, goma guar, goma acácia, goma tragacanto, pectina, dextrina, gelatina, derivados de celulose, como carbocimetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose ou celulose microcristalina, polímeros carboxivinílicos ou carbômeros, como o carbopol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidonas, poloxamer, alginatos de propilenoglicol ou de sódio, ou outros polímeros sintéticos ou naturais. Um ou mais dos seguintes ingredientes foram utilizados para a composição do sistema conservante do produto, parabenos (metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, heptilparabeno, isobutilparabeno , isopropilparabeno, benzil -parabeno e/ou seus sais de sódio) , fenoxietanol, DMDM hidantoína, metilcloroisotiazolinona, iodo propinilbutilcarbamato, imidazolidinil uréia, diazolidinil uréia, Quaterniumló, hidroximetilglicinato de sódio, entre outros ingredientes conservantes e/ou adjuvantes não considerados como ingredientes conservantes, mas que contribuem para a conservação microbiológica de produtos cosméticos, tais como o caprililglicol .
[088] Um primeiro exemplo de formulação cosmética de uso tópico, na forma de gel, foi obtida pela incorporação do conservante microbiológico DMDM hidantoína à suspensão de lipossomas preparada com lecitina de soja (Emulmetik 900/Lucas Meyer) anteriormente descrita no primeiro exemplo da preparação de lipossomas multifuncionais (Tabela 1), sob agitação magnética (marca IKA, mod. C-Mag HS-7, velocidade: nível 6) e à temperatura ambiente. Seguidamente, a suspensão resultante, ainda sob agitação, foi aquecida até 40°C-45°C e o agente gelificante goma xantana foi a ela adicionado (vide Tabela 5) . Para a completa hidratação da goma xantana e obtenção de um gel homogéneo, o sistema foi mantido sob agitação e aquecido (40°C-45°C) por mais 40 minutos. Ao final deste período, o sistema foi resfriado até atingir a temperatura ambiente (25°C), obtendo-se um gel cosmético com baixa viscosidade, translúcido, levemente amarelado e com pH final igual a pH 6,9.
[089] Tabela 5: Fórmula do primeiro exemplo de gel cosmético contendo lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico.
Figure imgf000041_0001
[090] Tabela 6: Fórmula do gel cosmético contendo 2,5% da suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada.
Figure imgf000041_0002
[091] Tabela 7: Fórmula do gel cosmético contendo 10% de suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada.
Figure imgf000042_0001
[092] Tabela 8: Fórmula do gel cosmético contendo 25% de suspensão de lipossomas multifuncionais com elevada concentração relativa de ácido láurico, preparados com lecitina de soja hidrogenada.
Figure imgf000042_0002
[093] Outros três exemplos de formulação cosmética de uso tópico, na forma de gel, foram obtidas pelo uso dos agentes gelificantes e/ou espessantes goma carragenana (Viscarin® PC-389/EMC - Chondrus Crispus ( carrageenan) , (and) Glucose) e hidroxietilcelulose (CELLOSIZE® QP IOOMH/Dow - Hydroxyethylcellulose ) , conforme apresentado nas Tabelas 6,
7 e 8, acima. Estes dois ingredientes foram primeiramente dispersos em glicerina e incorporados em solução tampão fosfato de potássio 30mM pH 7,0 , sob agitação mecânica vigorosa (marca IKA, modelo RW20, com haste centrífuga), sob velocidade de 1.600rpm e sob aquecimento (70°C), mantendo- se estas condições durante 15 minutos para a completa dispersão. Após este intervalo, a suspensão de lipossomas multifuncionais preparada com lecitina de soja hidrogenada (Phospholipon 80H®/Lipoid) , descrita no exemplo 3 anteriormente relatado (Tabela 3), foi adicionada lentamente, sob as mesmas condições de agitação e temperatura. Posteriormente, o sistema conservante microbiológico composto por fenoxietanol e caprililglicol (Microcare® PHG/Thor - Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol) foi incorporado à formulação, e o sistema foi resfriado até a temperatura ambiente (25°C) , mantendo-se a agitação. Ao atingir esta temperatura, e ainda mantendo a mesma condição de agitação, adicionou-se a fragrância como etapa final do preparo do referido produto.
[094] O gel cosmético obtido ao se utilizar a menor concentração da suspensão lipossomal (2,5%) apresentou concentrações finais de propilenoglicol e de etanol iguais a, respectivamente, 0,6% e 0,1% (m:m) . Ao se utilizar a concentração intermediária da suspensão lipossomal (10%), o gel cosmético apresentou concentrações finais de propilenoglicol e de etanol iguais a, respectivamente, 2,5% e 0,5% (m:m) E ao se utilizar a maior concentração da suspensão lipossomal (25%), o gel cosmético foi obtido com concentrações de propilenoglicol e de etanol iguais a, respectivamente, 6,3% e 1,1% (m:m) . Estes dois componentes, propilenoglicol e etanol, são oriundos exclusivamente da suspensão lipossomal utilizada na formulação dos referidos géis cosméticos.
[095] Apesar de certas concretizações terem sido descritas, elas foram apresentadas como um modo exemplificativo somente, e não há intenção de limitar o escopo da presente invenção. De fato, as novas concretizações aqui descritas podem ser concretizadas em uma variedade de outras formas; mais que isso, várias omissões, substituições e mudanças na forma das concretizações aqui descritas podem ser feitas sem se afastar do espirito da presente invenção. As reivindicações que acompanham esta descrição e suas equivalentes são consideradas como cobrindo tais formas ou modificações a medida em que elas podem estar dentro do escopo e espirito da presente invenção.

Claims

REIVINDICAC ES
1. Lipossoma unilamelar caracterizado pelo fato de compreender um ácido graxo com ação antimicrobiana e/ou anti- inflamatória em uma concentração entre 0,08% e 0,75% e possuir diâmetro médio entre 90nm e 300nm.
2. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de apresentar polidispersidade na faixa de 0,01 a 0,30.
3. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é o ácido láurico .
4. Liposssoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que também pode compreender acetato de tocoferol e Biosaccharide Õum-2.
5. Processo de produção de lipossomas, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) solubilização do ácido graxo e demais componentes lipidicos, ou oleosos, em um ou mais solventes lipofílicos;
(b) alcalinização da fase lipidica com uma solução de um agente alcalinizante; e
(c) adição da mistura da fase lipidica e agente alcalinizante a uma fase aquosa.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é o ácido láurico .
7. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução de agente alcalinizante compreende uma solução aquosa de hidróxido de sódio .
8. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa compreende água desmineralizada ou uma solução tampão com pH 6,0 a 7,5.
9. Composição caracterizada pelo fato de que compreende lipossoma conforme definido nas reivindicações de 1 a 3 e um veiculo cosmético, farmacêutico e/ou veterinário aceitável.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser na forma de um gel, creme, gel-creme ou uma loção.
11. Uso de ácido láurico caracterizado pelo fato de ser para preparação de um lipossoma conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
12. Uso de um lipossoma conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo fato de ser no preparo de uma composição para tratar e/ou prevenir problemas dermatológicos.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o problema dermatológico ser acne, psoriase, dermatite atópica, envelhecimento da pele, seborreia (caspa) , alopecia, mau odor corporal ou bucal, infecção microbiana, ou desbalanço da microbiota cutânea .
14. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o problema dermatológico é causado por bactérias, fungos, bolores e/ou leveduras, como p. ex. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acne) , Staphylococcus aureus, Malassezía furfur, Corineumbacterium spp. , Trichophyton spp., entre outros.
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