CN107811969B - 一种高稳定性的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗真菌感染中的应用 - Google Patents

一种高稳定性的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗真菌感染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种由脂肪酸衍生物、表面活性剂以及任选的脂质构成，其中，所述脂肪酸衍生物是C10‑C14，优选C11‑C13的脂肪酸的单甘油酯、双甘油酯或三甘油酯。本发明的非囊泡型纳米颗粒具备显著的抗真菌活性，还具备安全性高、无毒副作用、稳定性高、均一性好且不易诱导产生耐药株等优点，从而能够作为优秀的抗真菌药物。

Description

一种高稳定性的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗真菌感染中的 应用
技术领域
本发明涉及药物领域。具体地说，本发明涉及一种高稳定的、非囊泡型纳米颗粒，以及这种纳米颗粒在治疗真菌感染，包括但不限于球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌、毛癣菌、念珠菌属、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等感染中的应用。
背景技术
真菌 (Fungus)是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，也包括霉菌和酵母。根据生长特性与形态差异，可将真菌简单分为酵母、真菌和蕈(蘑菇)。其中对人类有致病性的真菌约有300多个种类。除新型隐球菌和蕈外，医学上有意义的致病性真菌几乎都是霉菌。
根据真菌侵犯人体的部位，真菌感染性疾病分为4类：浅表真菌病、皮肤真菌病、皮下组织真菌病和系统性真菌病；前二者合称为浅部真菌病，后二者又称为深部真菌病。
目前，随着骨髓和器官移植、肿瘤化疗、糖皮质激素长期应用以及广谱抗生素的普遍使用，致使侵袭性真菌感染发病率逐年攀升，新的致病菌不断出现，病情也日趋严重。深部真菌病在真菌感染中危害最大，也是院内感染类型之一，其临床症状体征无特异性，缺乏有效诊断工具，病程进展快，预后差，预防性治疗和经验性治疗的应用越来越普遍。
目前，临床抗真菌药物大致分为四类：唑类、多烯类、丙烯胺类、氟胞嘧啶类等，其中唑类药物应用最广泛。现有抗真菌药物普遍存在诸如抗菌谱窄、副作用大等局限性，导致其临床应用受限。同时随着抗真菌药物的大量使用，真菌的耐药率持续上升，从而影响了药物的治疗效果。
因此，本领域急需开发高效、毒副作用低或无毒副作用、并且不易诱导产生耐药株的新型抗真菌药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、毒副作用低或无毒副作用、并且不诱导产生耐药株的抵御真菌，例如红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)、烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)的新型抗真菌药物。
在第一方面，本发明提供一种非囊泡型纳米颗粒，所述颗粒由脂肪酸衍生物、表面活性剂以及任选的脂质构成，其中，所述脂肪酸衍生物是C10-C14，优选C11-C13的脂肪酸的单甘油酯、双甘油酯或三甘油酯。
在具体的实施方式中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸是月桂酸。
在具体的实施方式中，所述脂肪酸衍生物是月桂酸单甘油酯。
在优选的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯二醇、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆和Triton X-100。
在优选的实施方式中，所述脂质为磷脂和/或胆固醇。
在优选的实施方式中，所述磷脂包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。
在优选的实施方式中，所述脂质和表面活性剂的质量比为10~0 : 1；优选5~0 :1；更优选2.5~0 : 1。
在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径为1-90 nm；优选2-80 nm；更优选5-50 nm；更优选5-20 nm；最优选5-15 nm。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30 nm；10-40 nm；20-50 nm；30-60 nm；40-70 nm；50-80 nm；60-90 nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25 nm；15-35 nm；25-45 nm；35-55 nm；45-65 nm；55-75 nm；65-85 nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30 nm；20-40 nm；30-50 nm；40-60 nm；50-70 nm；60-80 nm；70-90 nm。
在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.3；优选<0.2。
在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：在室温下储存6周后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20%；优选改变小于15%；更优选粒径改变小于10%。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒中脂肪酸衍生物的含量为0.1~5%w/v；优选0.1~3%w/v； 更优选0.2~2%w/v。
在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒针对1×106 CFU的红色毛癣菌MIC为0.006%w/v，针对1×106 CFU的烟曲霉MIC为0.1%w/v。
在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒由以下方法制备，所述方法包括：
1). 将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸衍生物加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
在优选的实施方式中，本发明的纳米颗粒用于制备抗真菌感染的试剂，或可用于治疗真菌感染；优选地，所述真菌包括但不限于：球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌、毛癣菌、念珠菌属、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等等；优选毛癣菌和曲菌；更优选红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)、烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)。
在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1). 将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸衍生物加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
在优选的实施方式中，所述方法中的熔点温度为20℃-80℃，例如20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。
在优选的实施方式中，所述方法还可包括检测所得非囊泡型纳米颗粒的流体动力学尺寸。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸衍生物是C10-C14，优选C11-C13的脂肪酸的单甘油酯、双甘油酯或三甘油酯。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸是月桂酸。
在优选的实施方式中，所述脂质为磷脂和/或胆固醇。
在优选的实施方式中，所述磷脂包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。
在优选的实施方式中，所述脂质和表面活性剂的质量比为10~0 : 1；优选5~0 :1；更优选2.5~0 : 1。
在优选的实施方式中，所述表面活性剂包含包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯二醇、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆和Triton X-100。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸的浓度为0.1~5%w/v；优选0.1~3%w/v； 更优选0.2~2%w/v。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径为1-90 nm；优选2-80 nm；更优选5-50nm；更优选5-20 nm；最优选5-15 nm。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30 nm；10-40 nm；20-50 nm；30-60 nm；40-70 nm；50-80 nm；60-90 nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25 nm；15-35 nm；25-45 nm；35-55 nm；45-65 nm；55-75 nm；65-85 nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30 nm；20-40 nm；30-50 nm；40-60 nm；50-70 nm；60-80 nm；70-90 nm。
在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.3；优选<0.2。
在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：
在室温下储存6周后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20%；优选粒径改变小于15%；更优选粒径改变小于10%。
在第三方面，本发明提供一种药物组合物，包含本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒以及任选的药学上可接受的载体。
在优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型包括但不限于：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型；
进一步地，所述剂型包括但不限于：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂、贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂；
优选外用或局部给药的剂型，包括但不限于：贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂；更优选洗剂、霜剂和凝胶剂。
在优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型可以是通过离子电渗法进行运送的剂型，例如利用带有电荷的透皮贴剂。
在优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂 (例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料 (例如乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)；润滑剂 (例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂 (例如淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂 (例如月桂基硫酸钠)。
在优选的实施方式中，所述药物组合物还可含有穿透促进剂；所述穿透促进剂包括但不限于：表面活性剂 (例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；胆汁酸盐 (例如胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂 (例如乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合性非表面活性剂 (例如不饱和环脲)。
在优选的实施方式中，所述药物组合物还包含其它辅助药物成分，包括相容的药物活性材料，如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药、以及其它用来改进剂型物理性能的材料，例如染色剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂等。
在具体的实施方式中，所述药物组合物还包含其它抗真菌感染的药物，包括但不限于：氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、特比萘芬、萘替芬、阿莫罗芬、两性霉素B、灰黄霉素、环吡酮胺、卡泊芬净等。
在具体的实施方式中，所述药物组合物是水性药物组合物。
在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗真菌感染的试剂中的用途。
在具体的实施方式中，所述真菌包括但不限于：球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌、毛癣菌、念珠菌属、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等等；优选毛癣菌和曲菌；更优选红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。
在第五方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括将本发明第一方面所述的纳米颗粒或本发明第三方面所述的药物组合物给予需要治疗真菌感染的对象。
在第六方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括将本发明第一方面所述的纳米颗粒与其它抗真菌药物联合给予需要治疗真菌感染的对象。
在优选的实施方式中，所述抗真菌感染的药物包括但不限于：氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、特比萘芬、萘替芬、阿莫罗芬、两性霉素B、灰黄霉素、环吡酮胺、卡泊芬净等。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒与其它抗真菌感染的药物利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了一组本发明纳米颗粒的照片，其中月桂酸单甘油酯浓度从0.1% w/v到0.8% w/v。根据这些样品的聚集度和澄清度等物理性质，可以确定理想的纳米颗粒剂型。
图2显示了本发明的纳米颗粒的尺寸分布曲线。
图3显示了本发明的纳米颗粒的稳定性。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将脂肪酸甘油酯、表面活性剂以及任选的脂质制成的非囊泡型纳米颗粒 (胶束纳米颗粒结构)不仅具备显著的抗菌活性，还能具备优异的稳定性，并且本发明的非囊泡型纳米颗粒不易诱导产生耐药株，从而能够作为优秀的抗真菌药物。在此基础上完成了本发明。
非囊泡型纳米颗粒
本文所用的术语，“纳米颗粒”、“本发明纳米颗粒”、“非囊泡型纳米颗粒”以及“本发明的非囊泡型纳米颗粒”具备相同的含义，均是指不具有囊泡型式的纳米颗粒。具体地说，本发明的非囊泡型纳米颗粒是相对于其它的具有空腔结构的纳米颗粒而言的，即，本发明的非囊泡型纳米颗粒是其中不具备空腔的纳米颗粒。此外，基于下文所述的本发明纳米颗粒的制备方法，本领域技术人员可以理解，本发明的纳米颗粒是一种纳米颗粒体系，即，处于水性体系中的纳米颗粒，或包含纳米颗粒的水性体系整体；换言之，本发明所述的纳米颗粒是一种纳米颗粒的水性体系，即，一种不含有机溶剂的纳米颗粒体系。
本发明的纳米颗粒可以用于输送，例如脂肪酸及其衍生物 (如月桂酸单甘油酯)类的天然抗菌物质到真菌感染处，而避免使用诸如DMSO等的溶剂。本发明提供的非囊泡型纳米颗粒由脂肪酸及其衍生物、表面活性剂以及任选的脂质构成。这些组成成分的分子都具有亲水的部分和一个伸长的碳氢链构成的疏水部分。例如，脂肪酸甘油酯，如月桂酸单甘油酯这样的脂肪酸酯是由一个疏水的碳氢链和亲水的甘油头基组成的两亲性分子。这种结构使得这种脂肪酸酯能够被纳入纳米胶束这样的具有两亲性环境的纳米结构中。在水的存在下，它们的亲水部分和表面活性剂排队形成了一个面对着水的表面，与此同时疏水部分排队形成了一个远离水的核心，从而形成了胶束的纳米结构。
在具体的实施方式中，本发明的非囊泡型纳米颗粒中的脂肪酸衍生物是C10-C14，优选C11-C13的脂肪酸的单甘油酯、双甘油酯或三甘油酯。在具体的实施方式中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸，优选月桂酸。在优选的实施方式中，所述脂肪酸衍生物是月桂酸单甘油酯。
本文所用的术语“月桂酸单甘油酯”包括月桂酸单甘油酯中甘油羟基采取R、S不同构型的异构体，1-羟基取代的月桂酸单甘油酯、2-羟基取代的月桂酸单甘油酯、以及它们任意混合物等多种形式。
在具体的实施方式中，所述脂质为磷脂，包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。
在具体的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯乙二醇、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆和Triton X-100。
在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒的赋形剂材料可以包含磷脂酰胆碱、胆固醇、卵磷脂、吐温20、吐温80和十二烷基硫酸钠。
在本发明的非囊泡型纳米颗粒中，脂质和表面活性剂的配比为10～0 : 1；优选5～0 : 1；更优选2.5～0 : 1。
本发明的非囊泡型纳米颗粒成分包含适量的脂肪酸衍生物，所述纳米颗粒能够有效抑制真菌，包括但不限于：球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌、毛癣菌、念珠菌属、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等等；优选毛癣菌和曲菌；更优选红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)、烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)。
在某些实施方式中，本发明纳米颗粒至少包含0.1 mg/mL的脂肪酸衍生物，例如月桂酸单甘油酯 (例如，至少1 mg/mL、至少10 mg/mL、至少25 mg/mL、至少40 mg/mL、至少45mg/mL、至少50 mg/mL、至少60 mg/mL、至少70 mg/mL、至少80 mg/mL、至少90 mg/mL或者是至少100 mg/mL)。在具体的实施方式中，所述脂肪酸衍生物，例如月桂酸单甘油酯的浓度为0.1～5%w/v；优选0.1～3%w/v；更优选0.2～2%w/v。在优选的实施方式中，本发明的纳米颗粒中脂肪酸衍生物，例如月桂酸单甘油酯的含量为0.4%w/v。
本领域技术人员应理解，本文所述的脂肪酸甘油酯，例如月桂酸甘油酯的浓度是指该脂肪酸甘油酯在包含本发明纳米颗粒的体系，特别是水性体系，例如水性悬浮液中的质量浓度。
本发明的非囊泡型纳米颗粒具备一系列的理化特征，例如纳米颗粒的直径和月桂酸甘油酯的浓度 (即，月桂酸甘油酯在整个纳米颗粒悬浮液中的质量百分比或质量体积比)。纳米颗粒的直径可以采用动态光散射法来测量。本发明的非囊泡型纳米颗粒的平均直径约为1至90 nm；优选2-80 nm；更优选5-50 nm；更优选5-20 nm；最优选5-15 nm。
在其它实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30 nm；10-40 nm；20-50 nm；30-60 nm；40-70 nm；50-80 nm；60-90 nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25 nm；15-35 nm；25-45 nm；35-55 nm；45-65 nm；55-75 nm；65-85 nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30 nm；20-40 nm；30-50 nm；40-60 nm；50-70 nm；60-80 nm；70-90 nm。
本发明的非囊泡型纳米颗粒的粒径分布均一，其多分散性系数<0.3；优选<0.2。本发明的非囊泡型纳米颗粒的尺寸分布曲线如图2所示。
本文所用的术语“约”是指所引用的实际数字或数值，以及在所引用数字或数值的上下10%范围内。
本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的稳定性。在具体的实施方式中，本发明纳米颗粒的稳定性为：在室温下储存6周后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20%，优选小于15%，更优选小于10%。
本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的抗菌活性。在具体的实施方式中，本发明的非囊泡型纳米颗粒针对红色毛癣菌的MIC为0.006%w/v，针对烟曲霉的MIC为0.1%w/v。
本发明的纳米颗粒抑制真菌的能力可以如下测定。例如，将真菌与本发明的非囊泡型纳米颗粒在体外培养基中共孵育，或者在动物模型中共孵育，然后测量真菌的菌数(表征为CFU)。本文所用的术语 “抑制生长”是指本发明的非囊泡型纳米颗粒与真菌共育时抑制CFU增长的能力。因此，当真菌与本发明的非囊泡型纳米颗粒接触时，真菌的CFU不会升高或者会下降。
本文所用的术语“最小抑菌浓度”(MIC)是指能够抑制真菌(例如红色毛癣菌和烟曲霉菌)生长的药物成分(例如本发明的非囊泡型纳米颗粒)的最小浓度。MIC是可以测量的，MIC的值可以通过测量真菌在接触各种浓度的本发明的非囊泡型纳米颗粒后的光密度来确定，尤其是比较OD450值是否发生变化。真菌在接触各种浓度的本发明的非囊泡型纳米颗粒一段时间后，如果OD450并未升高，则表明培养液中的真菌数量没有增加。
本文所用的术语“最小杀菌浓度 (MBC)”是指能够有效杀死真菌的本发明纳米颗粒的最小浓度。所述MBC的值可以通过计数具有不同浓度纳米颗粒的特定培养条件下，培养基上长出的菌落数量来确定。
本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备方法
本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备需要考虑如下参数，例如纳米颗粒中含有的成分与材料的理化特征、用来分散纳米颗粒的介质的特性、纳米颗粒包裹物质的有效浓度及其可能具有的毒性、应用/运送纳米颗粒所涉及的加工过程、纳米颗粒的大小，多分散性和保质期、批间生产的可重复性、以及大规模生产安全有效产品的可能性。
本发明的纳米颗粒 (纳米胶束)的制备并不是自发形成的，当有足够的能量提供给水中的脂肪酸衍生物，例如月桂酸单甘油酯和赋形剂材料时才能形成 (例如通过超声处理、均化、振动或加热)。
本发明的纳米颗粒可以借助诸多方法来生成，例如高压匀浆法。高压匀浆法广泛用于多种行业，被认为是最可行的工业应用方法。该方法可以在高于室温或低于室温的条件下制备固态脂质体纳米颗粒，气蚀和涡流作用可使颗粒尺寸减小。使用热高压匀浆法可使脂质体和药物融化，并在同等温度下与表面活性剂水溶液组合。热的预乳浊液再在控温的高压匀浆机中进行加工，一般要在500 bar的条件下进行最多3个循环。所获得的纳米乳浊液在冷却至室温后重结晶，形成固态脂质体纳米颗粒。冷高压匀浆法可用于加工亲水性药物。
还可以通过搅拌法和加热法来生产本发明的纳米颗粒。在有些实施方式中，按照本文实施例中所述的方法制备本发明的纳米颗粒。此类方法包括高速搅拌法。该技术的优点在于仅需常用设备，生产简单易行。
除了上述方法以外，其它任何用于制备固态脂质体纳米颗粒的方法都可以用来生产本发明纳米颗粒。此类方法包括微乳液法、乳化-溶剂挥发法、乳化溶剂扩散法、溶剂注入法和倒相法。
本发明的制备方法得到的纳米颗粒在结构和生物学活性上具备优异的稳定性；本发明的制备方法对脂肪酸甘油酯的利用率也非常充分。
在具体的实施方式中，本发明的非囊泡型纳米颗粒可采用以下方法制备，包括以下步骤：
1). 将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸衍生物加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
在优选的实施方式中，所述方法中的熔点温度为20℃-80℃，例如20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。
在进一步优选的实施方式中，所述方法还可包括检测所得纳米颗粒的流体动力学尺寸。
药物组合物及其使用方法
本发明的纳米颗粒可以制成药物组合物以便用于人和其它哺乳动物。使用的时候可以与其它药物载体或稀释剂混合在一起，并根据哺乳动物病情的特征和严重性来确定给药的剂量和周期。通常情况下，本发明纳米颗粒中的脂肪酸衍生物，例如月桂酸单甘油酯应能达到药学有效剂量；例如，能够有效减少哺乳动物体表或体内存活的真菌数量的剂量。
本发明纳米颗粒的给药方法是本领域技术人员所熟知的方法。通常情况下，根据所治疾病病情的严重性与药效反应来给药，疗程持续数日至数月，直到病情缓解为止。最佳给药剂量、给药方法和重复率也是本领域普通人士所能决定的。最佳给药剂量可以根据本发明纳米颗粒的相对疗效进行调整，一般可根据体外和体内动物模型的MIC和MBC值来估测使用效量。给药频率可以为每天一次或多次、一周两次，每周一次或更长时间一次。治疗成功后，应继续进行一些维护治疗，以防感染复发。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”与“赋形剂”具备相同的含义，均是指用于向使用对象输送本发明纳米颗粒的药学认可的溶剂、悬浮剂或任何其它药学惰性的赋形剂。药学可接受载体可以为液体或固体，应根据所计划的给药方式来选择载体，从而当本发明的纳米颗粒和一种或多种有治疗作用的化合物或其他药学成分联用时，可以达到理想的剂量、一致性、及其它药物传输和化学的特性。
不会与本发明的纳米颗粒产生有害反应或破坏本发明纳米颗粒的纳米结构的药学可接受载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂 (例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料 (例如乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)；润滑剂 (例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂 (例如淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂 (例如月桂基硫酸钠)。
本发明的纳米颗粒可以采用多种方法给药，但通常是局部给药。本发明的纳米颗粒可以与其它分子混合，或者与其它分子、分子结构或化合物的混合物一起使用，例如聚乙二醇、凡士林，或其它外用制剂，从而促进药物的摄取、分布和/或吸收。局部给药的剂型可包括无菌和非无菌水溶液，以及常用溶剂的非水溶液 (例如乙醇或液体或固体油基质溶液)。此类溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。局部给药的药物剂型包括透皮贴、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、液体和粉末。其中洗剂、霜剂和凝胶剂特别好用。在使用的时候常可能需要常规药物载体 (水基质、粉末基质或油基质的)，也可能会用到增稠剂等其它物质。在有些情况下，药物可能悬浮在水基质、非水基质或混合基质中的悬浮液中。悬浮液中还可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物还可含有穿透促进剂以提高本发明纳米颗粒有效穿透哺乳动物皮肤的功能。穿透促进剂可同时提高亲脂性与非亲脂性药物穿过细胞膜的能力。穿透促进剂包括但不限于：表面活性剂 (例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；胆汁酸盐 (例如胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂 (例如乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合性非表面活性剂 (例如不饱和环脲)。
另外，在某些实施方式中，本发明的纳米颗粒可以通过离子电渗法进行递送，利用带有电荷的透皮贴来“驱使”该纳米颗粒达到真皮。
本发明的药物组合物中通常也可以含有一些其它辅助药物成分。这些包括相容的药物活性材料，如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药、以及其它用来改进剂型物理性能的材料 (例如染色剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂等)。另外还可以加入一些辅助试剂，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和芳香物质等。当然，这些辅助物质的加入不应该干扰本发明纳米颗粒的活性和使用效果。如有需要，制剂配好后应进行灭菌处理。
鉴于本发明的内容以及现有技术中的教导，本领域技术人员可将本发明的药物组合物制成各种剂型。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物的剂型包括但不限于：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型。进一步地，所述剂型包括但不限于：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂、贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是外用或局部给药的剂型，包括但不限于：贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂；更优选洗剂、霜剂和凝胶剂。
本发明的药物组合物可以用作抗真菌试剂。所述真菌包括但不限于：球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌、毛癣菌、念珠菌属、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等等；优选毛癣菌和曲菌；更优选红色毛癣菌、烟曲霉。
本发明的纳米颗粒或药物组合物尤其可通过通过减少哺乳动物 (例如人)体表或体内存活的真菌数量来治疗真菌感染。因此，本发明为需要治疗的对象提供了治疗真菌感染和减少存活的真菌细胞数量的方法。该方法包括将本发明的非囊泡型纳米颗粒或其药物组合物给药到感染的哺乳动物的病灶部位。存活的真菌的数量减少可通过如下特征来证明：由真菌引起的皮肤损伤减轻，通过携带真菌的哺乳动物的皮肤拭片上真菌菌落数量的减少，或通过任何其他可以测量真菌数量的合适方法得以验证。
除了减少真菌活细胞的数量，利用本发明的药物组合物或本发明的纳米颗粒进行治疗还可以减轻真菌感染的症状。所述真菌感染的症状包括但不限于红肿、痛楚、瘙痒、小水疱、糜烂、及会出现脓性分泌物的溃疡。
本发明的药物组合物还可包含其它抗真菌感染的药物，从而与这些药物联用，只要这些其它抗真菌感染的药物与本发明纳米颗粒不对彼此产生不良影响。与单用常规抗真菌感染的药物相比，上述联用起到降低常规抗真菌感染药物的用量、降低毒副作用以及提高治疗效果等有益效果。所述其它抗真菌感染药物包括但不限于：氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、特比萘芬、萘替芬、阿莫罗芬、两性霉素B、灰黄霉素、环吡酮胺、卡泊芬净等。本领域技术人员还应理解，本发明的药物组合物还可包含其它治疗微生物感染的药物，从而能够治疗不同的微生物感染或复杂的微生物感染，例如，可以包含喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、酰胺醇类、硝基咪唑类等药物。
此外，本领域技术人员应该知晓，上文所述的其它抗真菌感染的药物或其它抗微生物感染的药物可以采用与本发明的纳米颗粒相同的给药途径、在同一给药时间给予；也可以采用与本发明的纳米颗粒不同的给药途径、在同一给药时间给予；也可以采用与本发明的纳米颗粒相同的给药途径、在不同的给药时间给予。例如，上述其它抗真菌感染的药物或其它抗微生物感染的药物可以与本发明的纳米颗粒离散地存在于同一药物组合物中(例如，试剂盒中)，从而可以利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是水性药物组合物，即，不含有机溶剂的药物组合物。本领域技术人员可根据本发明的教导以及实际需求决定药物组合物中脂肪酸衍生物，例如月桂酸单甘油酯的浓度。
本发明的优点：
1. 本发明的非囊泡型纳米颗粒具备显著的抗真菌活性；
2. 本发明的非囊泡型纳米颗粒选用天然来源的成分，安全性高，无毒副作用；
3. 本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的稳定性；
4. 本发明的非囊泡型纳米颗粒避免使用诸如DMSO等有机溶剂来递送药物；
5. 本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备方法简单，无需使用氯仿等有毒有害的有机溶剂，从而降低了生产成本并且对环境友好；
6. 本发明的非囊泡型纳米颗粒粒径小，更易进入组织内部发挥杀菌作用；
7. 本发明的非囊泡型纳米颗粒多分散性小，均一性好，杀菌效果稳定，且不易诱导产生耐药株。
除非特别说明，本发明中使用的所有技术术语和科学术语都为本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的。虽然本发明可以使用与本专利所阐述的相似或等同的方法与材料来实施，但下文仍然阐述了适合的方法与材料。本专利中所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料一经引用即全文纳入。如这些出版物、专利申请、专利和其它参考资料与本专利申请有冲突，以本说明书 (包括定义在内)为准。此外，本专利申请中的材料、方法和实例仅用作说明，并不是限制性的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
材料和方法
材料：氢化卵磷脂 (egg PC)、胆固醇、C6-NBD植物鞘氨醇(C6NBD)和1,2 -二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-丽丝胺若丹明B磺酰基(DMPE-RhB)购自Avanti PolarLipids有限公司 (Alabaster, AL)。月桂酸单甘油酯购自TCI (Tokyo ChemicalIndustry)、红色毛癣菌株216-3664 (获自华山医院真菌室)、烟曲霉116-7490 (获自华山医院真菌室)、PDA成品干粉 (购自德国默克公司)、RPMI1640 (购自美国GIBCO公司)。
真菌的培养：红色毛癣菌株216-3664和烟曲霉116-7490从冰冻存储中取出，在37°C条件下接种于PDA脂板上培养48h。
本发明非囊泡型纳米颗粒的制备及表征：将200mg磷脂(鸡蛋卵磷脂：胆固醇=9：1重量比)和表面活性剂(聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)悬浮在4mL的水中，其中脂质体：表面活性剂的比率分别为10：0，8：2，5：5，3：7，1:9和0：10。悬浮液被搅拌直至形成均相溶液，然后加热到脂质体和表面活性剂的熔点以上(20℃、30℃、40°C, 50°C, 60°C, 70°C 或80°C, 取决于使用的脂质体与表面活性剂)。相应浓度的月桂酸单甘油酯(0.1%w/v到5%w/v)被加入至热的悬浮液中并搅拌30分钟。此后溶液室温下放置过夜。纳米粒子的流体动力学尺寸，用马尔文Zetasizer ZS仪器(英国马尔文仪器公司，英国)测量。纳米颗粒的平均直径是通过动态光散射(DLS)测定。所有的性质测量在25°C重复3次。
本发明非囊泡型纳米颗粒的稳定性：本发明的非囊泡型纳米颗粒的长期稳定性(包含0.4%w/v的月桂酸单甘油酯)通过将纳米溶液在室温下储存6周的时间跨度来考察。在每个预先确定的时间点，测量样品的粒径以判断本发明的非囊泡型纳米颗粒在室温下的稳定性。
本发明非囊泡型纳米颗粒的体外抗菌活性：挑取PDA平板上培养的红色毛癣菌株216-3664菌落置于无菌双蒸水中，配置成浊度106 CFU的菌液，然后用RPMI 1640液体稀释1000倍，使最终菌液浓度在103 CFU。取有盖的96孔板，将倍比稀释的药液由高到低的浓度加入96孔板中，每1-10孔加入药液100 μl，11孔加入RPMI 1640液体培养基100 μl (不含药液)作为阳性对照，12孔加入RPMI 1640液体培养基200 μl (不含药液)作为阴性对照。1-11孔中加入菌悬液100 μl。每种菌株作一行复孔，平行操作一次。将制备好的培养板放入35℃电热恒温培养箱中湿盒孵育48h后，通过观察菌未生长的最低药液浓度，得到药物的MIC值。
采用类似的过程测量本发明的非囊泡型纳米颗粒对烟曲霉116-7490的体外MIC值。具体地说，挑取PDA平板上培养的烟曲霉116-7490菌落置于无菌双蒸水中，配置成浊度106 CFU的菌液。MIC测定方法同药物对红色毛癣菌株216-3664的测定方法。
实施例1. 本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备和表征
如“材料和方法”部分所述制备本发明的非囊泡型纳米颗粒。
本发明的非囊泡型纳米颗粒的流体动力学粒径通过两个参数来描述：平均粒径和多分散性指数，两个参数都是通过动态光散射测量的累积量分析计算得来的。
通过改变月桂酸单甘油酯的浓度，制备了一系列的非囊泡型纳米颗粒，检测这些纳米颗粒以判断最适剂型。当月桂酸单甘油酯浓度是0.4%w/v，溶液呈现澄清而透明 (如图1所示)，其中，纳米颗粒的平均粒径为7.5 nm，以及多分散性指数平均为0.17 (如图2所示)。
实施例2. 本发明纳米颗粒的储存稳定性
本发明人进一步考察了本发明纳米颗粒 (包含0.4%w/v月桂酸单甘油酯)的稳定性。
将本发明的纳米颗粒在室温下储存6周。其稳定性的变化通过检测粒径大小得以体现。如图3所示，室温下储存6周的本发明纳米颗粒的粒径保持在7.5~8.0 nm之间，其粒径变化几乎可以忽略不计，表明了本发明的纳米颗粒在所有储存条件下的高稳定性。
实施例3. 本发明纳米颗粒的体外抗菌活性
通过检查真菌和不同浓度的本发明纳米颗粒共孵育时出现的抑菌作用来评估本发明纳米颗粒对真菌的体外抗菌活性。
首先测量最小抑制细菌生长的本发明纳米颗粒浓度(MIC)。具体地说，将1×103CFU的红色毛癣菌216-3664与0-0.4%w/v浓度的本发明纳米颗粒共孵育。根据NCCLS-M27-A3微量稀释法进行测定，在药敏板孵育48小时后，结果判定以空白对照菌未生长，生长对照菌已生长，各浓度纳米颗粒培养基: 菌已生长示无抑制作用，菌未生长示有抑菌作用。菌未生长所对应的纳米颗粒培养基最低浓度，即为MIC。通过观察，本发明的纳米颗粒对红色毛癣菌216-3664的MIC值为0.006%w/v。
此外，将1×103 CFU的烟曲霉116-7490与0-0.4%w/v浓度的本发明纳米颗粒共孵育。采用的方法与红色毛癣菌216-3664的方法相同，本发明的纳米颗粒针对烟曲霉116-7490的MIC为0.1%w/v。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (35)

1.一种非囊泡型纳米颗粒悬浮液，所述颗粒由脂肪酸衍生物、表面活性剂以及脂质构成，其中，所述脂肪酸衍生物是月桂酸单甘油酯；所述非囊泡型纳米颗粒的粒径为5-20 nm；
所述纳米颗粒中脂肪酸衍生物的含量为0.1~0.4%w/v；
所述表面活性剂选自以下的一种或多种：聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；
所述脂质为重量比为9: 1的鸡蛋卵磷脂和胆固醇；
脂质和表面活性剂的质量比2.5~0 : 1；
所述非囊泡型纳米颗粒由以下方法制备，所述方法包括：
1). 将表面活性剂和脂质悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸衍生物加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
2.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径为5-15 nm。
3.如权利要求1或2所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.3。
4.如权利要求3所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.2。
5.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：在室温下储存6周后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20%。
6.如权利要求5所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：在室温下储存6周后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于15%。
7.如权利要求6所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：在室温下储存6周后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于10%。
8.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒针对1×106 CFU的红色毛癣菌MIC为0.006%w/v，针对1×106 CFU的烟曲霉MIC为0.1%w/v。
9.权利要求1-8中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
1). 将表面活性剂和脂质悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸衍生物加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法中的熔点温度为20℃-80℃。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法中的熔点温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还可包括检测所得非囊泡型纳米颗粒的流体动力学尺寸。
13.一种药物组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液以及任选的药学上可接受的载体。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂。
16.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括：贴剂、喷剂、软膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂或洗剂。
17.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型是油膏剂或乳膏剂。
18.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型是洗剂、霜剂或凝胶剂。
19.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型是通过离子电渗法进行运送的剂型。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型是利用带有电荷的透皮贴剂。
21.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括水；生理盐水；结合剂；填料；润滑剂；崩解剂或润湿剂。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，所述结合剂是聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素；所述填料是乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙；所述润滑剂是淀粉、聚乙二醇或乙酸钠；所述崩解剂是淀粉或羟基乙酸淀粉钠；所述润湿剂是月桂基硫酸钠。
23.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有穿透促进剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述穿透促进剂包括表面活性剂，胆汁酸盐，螯合剂或非螯合性非表面活性剂。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或聚氧乙烯-20-十六烷基醚；所述胆汁酸盐是胆酸、脱氢胆酸或脱氧胆酸；所述螯合剂是乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸或水杨酸盐；所述非螯合性非表面活性剂是不饱和环脲。
26.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含其它辅助药物成分。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述其它辅助药物成分包括相容的药物活性材料以及其它用来改进剂型物理性能的材料。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其特征在于，所述相容的药物活性材料是止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药；所述其它用来改进剂型物理性能的材料是染色剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂或稳定剂。
29.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含其它抗真菌感染的药物。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，所述其它抗真菌感染的药物包括氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、特比萘芬、萘替芬、阿莫罗芬、两性霉素B、灰黄霉素、环吡酮胺或卡泊芬净。
31.如权利要求13-30中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是水性药物组合物。
32.如权利要求1-8中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液或权利要求13-31中任一项所述的药物组合物在制备抗真菌感染的试剂中的用途。
33.如权利要求32所述的用途，其特征在于，所述真菌包括：球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌、毛癣菌、念珠菌属、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌。
34.如权利要求33所述的用途，其特征在于，所述真菌包括毛癣菌或曲菌。
35.如权利要求34所述的用途，其特征在于，所述真菌包括红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)或烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)。
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