CN106539759B - 一种高稳定性的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗痤疮丙酸杆菌感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种由C10‑C14的脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成的非囊泡型纳米颗粒。本发明的非囊泡型纳米颗粒针对丙酸杆菌，特别是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)具备显著的抗菌活性；本发明的非囊泡型纳米颗粒具备显著的抗菌活性和优异的稳定性，并且不诱导耐药株的产生，从而能够作为优秀的抗菌药物。

Description

一种高稳定性的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗痤疮丙酸杆菌 感染中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域。具体地说，本发明涉及一种高稳定的、非囊泡型纳米颗粒，以及这种纳米颗粒在治疗丙酸杆菌(Propionibacterium)感染，特别是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)感染中的应用。

背景技术

痤疮感染是一种常见皮肤病，80％的人都会或曾经受其影响。痤疮的起因主要是皮脂过度分泌，导致毛囊堵塞，因而产生局部的低氧或无氧环境，这会刺激痤疮丙酸杆菌迅速繁殖。痤疮丙酸杆菌是一种革兰氏阳性的厌氧性细菌，与痤疮感染密切相关。痤疮丙酸杆菌的过度生长会导致毛囊壁破裂，于是宿主免疫细胞会对入侵的细菌产生反应，导致炎症性痤疮发生。严重发炎的痤疮病变可引起色素沉淀和永久性皮肤疤痕，给年轻人带来尴尬、压力和自卑感，从而影响他们的心理健康和心理发育。

许多种抗菌药物已经研发出来并批准用于治疗痤疮，包括阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、过氧化苯甲酰(BPO)，及其它的抗生素。尽管这些抗生素类药物有着显著的抗痤疮疗效，但这些药物通常会产生严重的副作用。例如，BPO是最常用的治疗痤疮的皮肤药物之一；但它导致的红斑、鳞屑、皮肤灼烧和毛发变白的发生率很高。口服抗生素虽然也非常有效，但常常伴随着破坏肠道菌群，诱生耐药性痤疮丙酸杆菌等风险。例如，异维A酸是一种治疗特严重型痤疮的维生素A衍生药维甲酸药物，它的使用受到严格的监管。由于其具有强烈致畸作用，因此绝大多数痤疮患者都不能使用该药。因此，新的抗痤疮药物不仅要具有良好的治疗效果，还要具有非常小的毒副作用并且不诱导耐药株产生。

在过去的几十年，纳米技术在药物学中的应用被广泛地探索。通过物理包覆或化学结合，药物可以被装入纳米颗粒，从而相比于游离药物，显著提高了药物的动力学指数和治疗指数。这些基于纳米颗粒的药物输送系统的优点多集中在：提高药物的血清溶解度、延长药物的体循环周期以及持续、可控地释放药物等方面。然而，由于这些纳米颗粒中的药物多为传统的抗生素，仍然会产生耐药株。而且，所使用的纳米颗粒制备过程复杂，成本高，并且稳定性有限，从而严重影响了这类药物的实际应用价值。

因此，本领域急需高效、毒副作用低或无毒副作用、并且不诱导产生耐药株的抵御丙酸杆菌，特别是痤疮丙酸杆菌感染的新型治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、毒副作用低或无毒副作用、并且不诱导产生耐药株的抵御丙酸杆菌，特别是痤疮丙酸杆菌感染的新型治疗药物。

在第一方面，本发明提供一种非囊泡型纳米颗粒，所述颗粒由脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成，其中，所述脂肪酸是C10-C14，优选C11-C13的脂肪酸。

在具体的实施方式中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。

在具体的实施方式中，所述脂肪酸是月桂酸。

在优选的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯二醇、聚山梨醇酯20、聚山梨酯80，吐温20、吐温80和Triton X-100。

在优选的实施方式中，所述脂质为磷脂和/或胆固醇。

在优选的实施方式中，所述磷脂包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。

在优选的实施方式中，所述脂质和表面活性剂的质量比为10～0:1；优选5～0:1；更优选2.5～0:1。

在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径为1-90nm；优选2-80nm；更优选5-50nm；更优选5-20nm；最优选5-15nm。

在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30nm；10-40nm；20-50nm；30-60nm；40-70nm；50-80nm；60-90nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25nm；15-35nm；25-45nm；35-55nm；45-65nm；55-75nm；65-85nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30nm；20-40nm；30-50nm；40-60nm；50-70nm；60-80nm；70-90nm。

在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.3；优选<0.2。

在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：

20℃-100℃下保持30分钟，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于10％；或者

在20℃储存5个月后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于10％；或者

在37℃储存5个月后，所述非囊泡型纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小杀菌浓度(MBC)值的改变小于20％，优选小于10％。

在优选的实施方式中，所述纳米颗粒中脂肪酸含量为0.01～5％w/v；优选0.1～3％w/v；更优选0.2～2％w/v。

在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的MIC为0.0125％w/v；MBC为0.02％w/v。

在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒由以下方法制备，所述方法包括：

1).将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；

2).搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；

3).加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；

4).将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；

5).降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。

在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒用于制备抗丙酸杆菌(Propionibacterium)感染的试剂，或可用于治疗丙酸杆菌感染；优选地，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、卵白丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)；更优选痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。

在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1).将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；

2).搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；

3).加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；

4).将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；

5).降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。

在优选的实施方式中，所述方法中的熔点温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

在优选的实施方式中，所述方法还可包括检测所得非囊泡型纳米颗粒的流体动力学尺寸。

在优选的实施方式中，所述脂肪酸是C10-C14的饱和脂肪酸。

在优选的实施方式中，所述脂肪酸是月桂酸。

在优选的实施方式中，所述脂质为磷脂和/或胆固醇。

在优选的实施方式中，所述磷脂包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。

在优选的实施方式中，所述脂质和表面活性剂的质量比为10～0:1；优选5～0:1；更优选2.5～0:1。

在优选的实施方式中，所述表面活性剂包含包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯二醇、聚山梨醇酯20、聚山梨酯80，吐温20、吐温80和Triton X-100。

在优选的实施方式中，所述脂肪酸的浓度为0.01～5％w/v；优选0.1～3％w/v；更优选0.2～2％w/v。

在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径为1-90nm；优选2-80nm；更优选5-50nm；更优选5-20nm；最优选5-15nm。

在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30nm；10-40nm；20-50nm；30-60nm；40-70nm；50-80nm；60-90nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25nm；15-35nm；25-45nm；35-55nm；45-65nm；55-75nm；65-85nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30nm；20-40nm；30-50nm；40-60nm；50-70nm；60-80nm；70-90nm。

在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.3；优选<0.2。

在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：

20℃-100℃下保持30分钟，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于10％；或者

在20℃储存5个月后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于10％；或者

在37℃储存5个月后，所述非囊泡型纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小杀菌浓度(MBC)值的改变小于20％，优选小于10％。

在第三方面，本发明提供一种药物组合物，包含本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒以及任选的药学上可接受的载体。

在优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型包括但不限于：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型；

进一步地，所述剂型包括但不限于：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂、贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂；

优选外用或局部给药的剂型，包括但不限于：贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。

在优选的的实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)；润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(例如淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。

在优选的实施方式中，所述药物组合物还可含有穿透促进剂；所述穿透促进剂包括但不限于：表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；胆汁酸盐(例如胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合性非表面活性剂(例如不饱和环脲)。

在具体的实施方式中，所述药物组合物还包含其它抗生素。

在优选的实施方式中，所述抗生素是治疗痤疮丙酸杆菌感染的抗生素，包括但不限于：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰(BPO)。

在具体的实施方式中，所述药物组合物是水性药物组合物。

在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗丙酸杆菌(Propionibacterium)试剂中的用途。

在具体的实施方式中，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、卵白丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacteriumgranulosum)；优选痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。

在第五方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括将本发明第一方面所述的纳米颗粒给予需要治疗微生物感染的对象。

在另一实施方式中，所述治疗方法包括将本发明第一方面所述的纳米颗粒与其它抗生素联合给予需要治疗微生物感染的对象。

在优选的实施方式中，所述抗生素是治疗丙酸杆菌，例如痤疮丙酸杆菌、卵白丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌，优选痤疮丙酸杆菌感染的抗生素，包括但不限于：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰(BPO)；所述抗生素也可以是治疗其它类型微生物感染的抗生素，例如喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、酰胺醇类、硝基咪唑类等。

在优选的实施方式中，所述纳米颗粒与其它抗生素利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明纳米颗粒的一组照片，溶液所含月桂酸的浓度从(a)0.1％w/v至(f)5％w/v(其中％w/v等于wt％)。根据这些样品的聚集度和透明度等物理性质，可以找出理想的本发明纳米颗粒剂型。

图2显示的是不同温度下含有1％w/v月桂酸的本发明纳米颗粒的流体动力学直径(nm)。在较大范围的温度下(-40℃至+100℃)，纳米颗粒的尺寸保持稳定状态。

图3显示的是20℃条件下本发明纳米颗粒的存储稳定性。在5个月的检测期内，纳米颗粒的尺寸保持稳定状态。

图4显示的是本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对不同浓度的痤疮丙酸杆菌的抗菌活性曲线图：(a)1x 10⁶CFU/mL，(b)1x 10⁷CFU/mL，(c)1x 10⁸CFU/mL和(d)1x 10⁹CFU/mL。本发明纳米颗粒与每个浓度的菌样品共孵育5小时。之后，样品用PBS稀释，稀释倍数为1:10至1:10⁶，每个样品取10μL接种到RCM琼脂平板上。然后在37℃厌氧条件下培养3天，计数痤疮丙酸杆菌的菌落形成单位(CFU)(UD：检测不到)。

图5显示本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对1x 10⁷CFU/mL痤疮丙酸杆菌的抗菌活性与时间的关系图。孵育5小时之后，痤疮丙酸杆菌完全被杀死(UD：检测不到)。

图6显示经过5小时孵育后，本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对1x 10⁷CFU/mL痤疮丙酸杆菌的抗菌活性与温度的关系图。结果显示，在室温(20℃)或更高温度下，痤疮丙酸杆菌完全被杀死(UD：检测不到)。

图7显示在不同温度下存储5个月的本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对1x10⁷CFU/mL痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。在37℃存储条件下，痤疮丙酸杆菌完全被杀死(UD：检测不到)。

图8显示扫描电镜(SEM)图片：(a)未处理的痤疮丙酸杆菌，(b)本发明纳米颗粒处理的痤疮丙酸杆菌。电镜观察到本发明纳米颗粒处理后痤疮丙酸杆菌的菌膜受到了破坏。

图9显示用小鼠耳朵模型测试本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)在活体内对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。ICR小鼠的耳朵(左耳和右耳)经皮内注射了痤疮丙酸杆菌(1x10⁷CFU，混于20μL的PBS中)。痤疮丙酸杆菌注射部位再分别注射本发明纳米颗粒(1wt％月桂酸)或PBS。注射24小时后，取出被细菌感染的皮肤组织进行细菌计数。(a)注射后24小时，注射部位的组织损伤。(b)注射后24小时，注射部位的微生物负载(UD：检测不到)。

图10显示本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对小鼠背部皮肤的毒性测试结果。凝胶形式的本发明纳米颗粒贴在小鼠剃毛的背部皮肤上。24小时后取下凝胶，对皮肤进行分析。本发明纳米颗粒处理过的皮肤保持了正常结构，未观察到红斑或水肿。苏木精&伊红染色(H&E)结果显示本发明纳米颗粒处理过的皮肤结构完好，真皮层上带有一层健康的表皮细胞。使用本发明纳米颗粒处理的观察结果与使用PBS处理的结果相同，表明本发明纳米颗粒不会对皮肤造成可检测到的毒性。

图11显示98名痤疮志愿者使用本发明纳米颗粒凝胶后的反馈结果。在第3天、第7天和第21天分别采集反馈结果。

图12显示了本发明纳米颗粒的结构示意图。

图13显示了本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外最小抑菌浓度(MIC)，其中图(b)是图(a)的放大图。

图14显示了本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外最小杀菌浓度(MBC)，其中图(b)是图(a)的放大图。

图15显示了本发明纳米颗粒的尺寸分布曲线。

图16对比了本发明纳米颗粒与游离脂肪酸在水性环境中的最小杀菌浓度。

图17显示了包含不同脂肪酸的本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的杀菌活性。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质制成的非囊泡型纳米颗粒(胶束纳米颗粒结构)不仅具备显著的抗菌活性，还能具备优异的稳定性，并且本发明的非囊泡型纳米颗粒不诱导产生耐药株，从而能够作为优秀的抗菌药物。在此基础上完成了本发明。

非囊泡型纳米颗粒

本文所用的术语，“纳米颗粒”、“本发明纳米颗粒”、“非囊泡型纳米颗粒”以及“本发明的非囊泡型纳米颗粒”具备相同的含义，均是指不具有囊泡型式的纳米颗粒。具体地说，本发明的非囊泡型纳米颗粒是相对于其它的具有空腔结构的纳米颗粒而言的，即，本发明的非囊泡型纳米颗粒是其中不具备空腔的纳米颗粒。此外，基于下文所述的本发明纳米颗粒的制备方法，本领域技术人员可以理解，本发明的纳米颗粒是一种纳米颗粒体系，即，处于水性体系中的纳米颗粒，或包含纳米颗粒的水性体系整体；换言之，本发明所述的纳米颗粒是一种纳米颗粒的水性体系，即，一种不含有机溶剂的纳米颗粒体系。

本发明提供的非囊泡型纳米颗粒由脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成。这些组成成分的分子都具有亲水的部分和一个伸长的碳氢链构成的疏水部分。例如，脂肪酸(如月桂酸)是由一个疏水的碳氢链和亲水的羧酸头基组成的两亲性分子，这种结构使得脂肪酸能够纳入纳米胶束这样具有两亲性环境的纳米颗粒中。在水的存在下，它们的亲水部分和表面活性剂排队形成了一个面对着水的表面，与此同时疏水部分排队形成了一个远离水的核心，从而形成了胶束的纳米结构。

在具体的实施方式中，本发明的非囊泡型纳米颗粒中的脂肪酸是C10-C14的饱和脂肪酸。在具体的实施方式中，所述脂肪酸是月桂酸。本文所述的“月桂酸”包含了此脂肪酸的酸、酯和盐三种形式。

月桂酸是一种游离脂肪酸，存在于人的皮脂中，其抗菌活性强于过氧化苯甲酰，同时又不会对人的皮脂细胞产生毒性。因为月桂酸的水溶性较差，因此必须用二甲亚砜(DMSO)等溶剂来溶解月桂酸以形成外用剂型。DMSO可促进细胞穿透，提高通过皮肤屏障的转运速率，但DMSO具有刺激性和毒性副作用。此外，常规的剂型，例如霜剂、凝胶和软膏无法有效穿过毛囊皮脂腺单元，也无法提供并维持具有疗效的药物浓度。

在具体的实施方式中，所述脂质为磷脂，包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。

在具体的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯乙二醇、聚山梨酯20、聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠、吐温20、吐温80和Triton X-100。

在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒的赋形剂材料可以包含磷脂酰胆碱、胆固醇、卵磷脂、吐温20、吐温80和十二烷基硫酸钠。

在本发明的非囊泡型纳米颗粒中，脂质和表面活性剂的配比为10～0:1；优选5～0:1；更优选2.5～0:1。

本发明的非囊泡型纳米颗粒成分包含适量的脂肪酸，优选月桂酸。此成分能够有效抑制痤疮丙酸杆菌在布氏培养基中的生长。该培养基含有5％(v/v)去纤维蛋白绵羊血，5μg/mL的维生素K以及50μg/mL的氯高铁血红素。在37℃厌氧条件下培养5小时，根据OD600测量痤疮丙酸杆菌培养物吸光度，可以确定本发明纳米颗粒抑制细菌生长的最小有效剂量。根据细胞计数测量，可以确定本发明纳米颗粒的最小杀菌剂量。

在某些实施方式中，本发明纳米颗粒至少包含0.1mg/mL的脂肪酸，例如月桂酸(例如，至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少40mg/mL、至少45mg/mL、至少50mg/mL、至少60mg/mL、至少70mg/mL、至少80mg/mL、至少90mg/mL或者是至少100mg/mL)。在具体的实施方式中，所述脂肪酸的浓度为0.01～5％w/v；优选0.1～3％w/v；更优选0.2～2％w/v。在优选的实施方式中，本发明的纳米颗粒中脂肪酸含量为1.0％w/v。

本领域技术人员应理解，本文所述的脂肪酸，例如月桂酸的浓度是指该脂肪酸在包含本发明纳米颗粒的体系，特别是水性体系，例如水性悬浮液中的质量浓度。

本发明的非囊泡型纳米颗粒具备一系列的理化特征，例如纳米颗粒的直径和月桂酸的浓度(即，月桂酸在整个纳米颗粒悬浮液中的质量百分比或质量体积比)。纳米颗粒的直径可以采用动态光散射法来测量。本发明的非囊泡型纳米颗粒的平均直径约为1至90nm；优选2-80nm；更优选5-50nm；更优选5-20nm；最优选5-15nm。

在其它实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30nm；10-40nm；20-50nm；30-60nm；40-70nm；50-80nm；60-90nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25nm；15-35nm；25-45nm；35-55nm；45-65nm；55-75nm；65-85nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30nm；20-40nm；30-50nm；40-60nm；50-70nm；60-80nm；70-90nm。

本发明的非囊泡型纳米颗粒的粒径分布均一，其多分散性系数<0.3；优选<0.2；更优选<0.1。本发明的非囊泡型纳米颗粒的尺寸分布曲线如图15所示。

本文所用的术语“约”是指所引用的实际数字或数值，以及在所引用数字或数值的上下10％范围内。

本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的稳定性。在具体的实施方式中，本发明纳米颗粒的稳定性为：在20℃-100℃下保持30分钟，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于10％；或者，在20℃储存5个月后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于10％。在另一实施方式中，在37℃储存5个月后，本发明的非囊泡型纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小杀菌浓度(MBC)值的改变小于20％，优选小于10％。

本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的抗菌活性。在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0125％w/v，最小杀菌浓度(MBC)为0.02％w/v。

本发明的纳米颗粒抑制痤疮丙酸杆菌的能力可以如下测定。例如，将痤疮丙酸杆菌与本发明的纳米颗粒在实施例描述的体外培养基中共孵育，或者在实施例描述的动物模型中共孵育；然后测量痤疮丙酸杆菌的菌数(表征为CFU)。本文所用的术语“抑制生长”指的是本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌共孵育时，能够停止痤疮丙酸杆菌CFU的升高。因此，当痤疮丙酸杆菌与抑制其生长的本发明纳米颗粒接触时，痤疮丙酸杆菌的CFU保持不变或下降。

本文所用的术语“最小抑菌浓度(MIC)”是指能够有效抑制痤疮丙酸杆菌生长的本发明纳米颗粒的最小浓度。MIC的值可以通过测量痤疮丙酸杆菌在接触各种浓度的本发明纳米颗粒后的光密度来确定，尤其是比较OD₆₀₀值是否发生变化。经过一段时间后，如果OD₆₀₀并未升高，则表明培养液中的细菌数量没有升高。

本文所用的术语“最小杀菌浓度(MBC)”是指能够有效杀死痤疮丙酸杆菌的本发明纳米颗粒最小浓度。其MBC的值可以通过计数具有不同浓度纳米颗粒的特定培养条件下(37℃，无氧条件)，培养基上长出的菌落数量来确定。

本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备方法

本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备需要考虑如下参数，例如纳米颗粒中含有的成分与材料的理化特征、用来分散纳米颗粒的溶液的特性、纳米颗粒包裹物质的有效浓度及其可能具有的毒性、应用/运送纳米颗粒所涉及的加工过程、纳米颗粒的大小，多分散性和保质期、批间生产的可重复性、以及大规模生产安全有效产品的可能性。

本发明的纳米颗粒(纳米胶束)的制备并不是自发形成的，当有足够的能量提供给水中的脂肪酸，例如月桂酸和赋形剂材料时才能形成(例如通过超声处理、均化、振动或加热)。

本发明的纳米颗粒可以借助诸多方法来生成，例如高压匀浆法。高压匀浆法广泛用于多种行业，被认为是最可行的工业应用方法。该方法可以在高于室温或低于室温的条件下制备固态脂质体纳米颗粒，气蚀和涡流作用可使颗粒尺寸减小。使用热高压匀浆法可使脂质体和药物融化，并在同等温度下与表面活性剂水溶液组合。热的预乳浊液再在控温的高压匀浆机中进行加工，一般要在500bar的条件下进行最多3个循环。所获得的纳米乳浊液在冷却至室温后重结晶，形成固态脂质体纳米颗粒。冷高压匀浆法可用于加工亲水性药物。

还可以通过搅拌法和加热法来生产本发明的纳米颗粒。在有些实施方式中，按照本文实施例中所述的方法制备本发明的纳米颗粒。此类方法包括高速搅拌法。该技术的优点在于仅需常用设备，生产简单易行。

除了上述方法以外，其它任何用于制备固态脂质体纳米颗粒的方法都可以用来生产本发明纳米颗粒。此类方法包括微乳液法、乳化-溶剂挥发法、乳化溶剂扩散法、溶剂注入法和倒相法。

本发明的制备方法得到的纳米颗粒在结构和生物学活性上具备优异的稳定性；本发明的制备方法对脂肪酸的利用率也非常充分。

在具体的实施方式中，本发明的非囊泡型纳米颗粒可采用以下方法制备，包括以下步骤：

1).将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；

2).搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；

3).加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；

4).将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；

5).降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。

在优选的实施方式中，所述方法中的熔点温度为20℃-80℃，例如20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

在进一步优选的实施方式中，所述方法还可包括检测所得纳米颗粒的流体动力学尺寸。

药物组合物及其使用方法

本发明的纳米颗粒可以制成药物组合物以便用于人和其它哺乳动物。使用的时候可以与其它药物载体或稀释剂混合在一起，并根据哺乳动物病情的特征和严重性来确定给药的剂量和周期。通常情况下，本发明纳米颗粒中的脂肪酸，例如月桂酸应能达到药学有效剂量；例如，能够有效减少哺乳动物皮肤上的活性痤疮丙酸杆菌量的剂量。

本发明纳米颗粒的给药方法是本领域技术人员所熟知的方法。通常情况下，根据所治疾病病情的严重性与药效反应来给药，疗程持续数日至数月，直到病情缓解为止。最佳给药剂量、给药方法和重复率也是本领域普通人士所能决定的。最佳给药剂量可以根据本发明纳米颗粒的相对疗效进行调整，一般可根据体外和体内动物模型的MIC和MBC值来估测使用效量。给药频率可以为每天一次或多次、一周两次，每周一次或更长时间一次。治疗成功后，应继续进行一些维护治疗，以防感染复发。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”与“赋形剂”具备相同的含义，均是指用于向使用对象输送本发明纳米颗粒的药学认可的溶剂、悬浮剂或任何其它药学惰性的赋形剂。药学可接受载体可以为液体或固体，应根据所计划的给药方式来选择载体，从而当本发明的纳米颗粒和一种或多种有治疗作用的化合物或其他药学成分联用时，可以达到理想的剂量、一致性、及其它药物传输和化学的特性。

不会与本发明的纳米颗粒产生有害反应或破坏本发明纳米颗粒的纳米结构的药学可接受载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)；润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(例如淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。

本发明的纳米颗粒可以采用多种方法给药，但通常是局部给药。本发明的纳米颗粒可以与其它分子混合，或者与其它分子、分子结构或化合物的混合物一起使用，例如聚乙二醇、凡士林，或其它外用制剂，从而促进药物的摄取、分布和/或吸收。局部给药的剂型可包括无菌和非无菌水溶液，以及常用溶剂的非水溶液(例如乙醇或液体或固体油基质溶液)。此类溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。局部给药的药物剂型包括透皮贴、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、液体和粉末。其中洗剂、霜剂和凝胶剂特别好用。在使用的时候常可能需要常规药物载体(水基质、粉末基质或油基质的)，也可能会用到增稠剂等其它物质。在有些情况下，药物可能悬浮在水基质、非水基质或混合基质中的悬浮液中。悬浮液中还可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。

在优选的实施方式中，本发明的药物组合物还可含有穿透促进剂以提高本发明纳米颗粒有效穿透哺乳动物皮肤的功能。穿透促进剂可同时提高亲脂性与非亲脂性药物穿过细胞膜的能力。穿透促进剂包括但不限于：表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；胆汁酸盐(例如胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合性非表面活性剂(例如不饱和环脲)。

另外，在某些实施方式中，本发明的纳米颗粒可以通过离子电渗法进行递送，利用带有电荷的透皮贴来“驱使”该纳米颗粒达到真皮。

本发明的药物组合物中通常也可以含有一些其它辅助药物成分。这些包括相容的药物活性材料，如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药、以及其它用来改进剂型物理性能的材料(例如染色剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂等)。另外还可以加入一些辅助试剂，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和芳香物质等。当然，这些辅助物质的加入不应该干扰本发明纳米颗粒的活性和使用效果。如有需要，制剂配好后应进行灭菌处理。

鉴于本发明的内容以及现有技术中的教导，本领域技术人员可将本发明的药物组合物制成各种剂型。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物的剂型包括但不限于：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型。进一步地，所述剂型包括但不限于：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂、贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是外用或局部给药的剂型，包括但不限于：贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。

本发明的药物组合物可以用作抗丙酸杆菌试剂。所述丙酸杆菌包括但不限于：痤疮丙酸杆菌、卵白丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)；优选地，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌。

本发明的纳米颗粒或药物组合物尤其可通过减少哺乳动物(例如人)皮肤表面或毛囊内部痤疮丙酸杆菌的数量来治疗痤疮。因此，本发明为需要治疗的对象提供了治疗痤疮和减少疮丙酸杆菌细胞数量的方法。该方法包括向需要治疗的对象的皮肤上使用本发明的纳米颗粒或本发明的药物组合物。痤疮丙酸杆菌的活菌数量减少可通过如下特征来证明：观察到痤疮丙酸杆菌诱发的皮肤感染面积变小，哺乳动物身上取样后进行培养发现痤疮丙酸杆菌数量减少，或者使用其它检测痤疮丙酸杆菌数量的方法。

除了减少痤疮丙酸杆菌活细胞的数量，利用本发明的药物组合物或本发明的纳米颗粒进行治疗还可以减少痤疮症状。痤疮的症状包括但不限于以下的一种或多种：丘疹、脓疱、黑头、白头或粟丘疹、结节和囊肿。非炎性痤疮包括微小黑头粉刺、黑头和粟丘疹，这些痤疮都不红或不疼，并可导致整个皮肤表面的凸起或凹凸，或不均匀的皮肤纹理。炎性痤疮包括微小黑头粉刺、黑头和粟丘疹，以及丘疹、脓疱，并可能有结节和囊肿。这样的症状可导致发红、肿胀以及皮肤刺激，还可能出现结痂、脓液渗出或病灶结痂。利用本发明的药物组合物或本发明的纳米颗粒进行治疗可减少部分症状或全部症状。

本发明的药物组合物还可包含其它抗生素，从而与其它抗生素联用，只要这些其它常规抗生素与本发明纳米颗粒不对彼此产生不良影响。与单用常规抗生素相比，上述联用起到降低常规抗生素的用量、降低毒副作用以及提高治疗效果等有益效果。所述其它抗生素是治疗痤疮丙酸杆菌的抗生素，包括但不限于：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰(BPO)。本领域技术人员还应理解，所述抗生素也可以是治疗其它微生物感染的药物，从而能够治疗不同的微生物感染或复杂的微生物感染，例如，所述抗生素可以是喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、酰胺醇类、硝基咪唑类等。

此外，本领域技术人员应该知晓，上文所述的其它抗生素可以采用与本发明的纳米颗粒相同的给药途径、在同一给药时间给予；也可以采用与本发明的纳米颗粒不同的给药途径、在同一给药时间给予；也可以采用与本发明的纳米颗粒相同的给药途径、在不同的给药时间给予。例如，上述其它抗生素可以与本发明的纳米颗粒离散地存在于同一药物组合物中(例如，试剂盒中)，从而可以利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。

在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是水性药物组合物，即，不含有机溶剂的药物组合物。本领域技术人员可根据本发明的教导以及实际需求决定药物组合物中脂肪酸的浓度。

本发明的优点：

1.本发明的非囊泡型纳米颗粒具备显著的抗菌活性，并且特异性的针对痤疮丙酸杆菌；

2.本发明的非囊泡型纳米颗粒选用天然来源的成分，安全性高，无毒副作用；

3.本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的稳定性；

4.本发明的非囊泡型纳米颗粒避免使用诸如DMSO等有机溶剂来递送药物；

5.本发明非囊泡型纳米颗粒的制备方法简单，无需使用氯仿等有毒有害的有机溶剂，从而降低了生产成本并且对环境友好；

6.本发明非囊泡型纳米颗粒粒径小，更易进入组织内部发挥杀菌作用；和

7.本发明非囊泡型纳米颗粒多分散性小，均一性好，杀菌效果稳定。

除非特别说明，本发明中使用的所有技术术语和科学术语都为本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的。虽然本发明可以使用与本专利所阐述的相似或等同的方法与材料来实施，但下文仍然阐述了适合的方法与材料。本专利中所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料一经引用即全文纳入。如这些出版物、专利申请、专利和其它参考资料与本专利申请有冲突，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，本专利申请中的材料、方法和实例仅用作说明，并不是限制性的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

材料和方法

材料：蛋黄卵磷脂(egg PC)、胆固醇、C6-NBD植物鞘氨醇(C6NBD)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-丽丝胺若丹明B磺酰基(DMPE-RhB)购自Avanti PolarLipids有限公司(Alabaster,AL)。月桂酸购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。KHCO₃购自Fisher Scientific司(Pittsburgh,PA)。3,4-二氟苯甲酰甲基溴购自Maybridge公司(Cambridge,英国)。布氏培养基(批号211088)，吸气装置(批号260683)和人琼脂(批号214010)购自BD公司(Sparks,MD)。每升布氏培养基含有10.0g酪蛋白的胰蛋白酶消化物、10.0g动物组织的胃蛋白酶消化物、1.0g葡萄糖、2.0g酵母浸膏、5.0g氯化钠和0.1g亚硫酸氢钠。去纤维蛋白绵羊血(批号为R54016和R54008)与氯高铁血红素和维生素K溶液(批号R450951)购自Remel公司(Lenexa,KS)。强化梭菌培养基(批号OXCM0149B)购自Oxoid公司(Hampshire,英国)。

细菌培养：痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919)用布氏培养基培养，培养基中添加5％(v/v)去纤维蛋白绵羊血、维生素K(5μg/mL)和氯高铁血红素(50μg/mL)，在吸气装置产生的37℃无氧环境中进行培养。挑取单克隆接种到强化梭菌培养基中，并在37℃无氧条件下培养，直到OD600达到约1.0(对数生长期)为止。5000g离心10分钟，收菌并用PBS洗涤，然后用适当量的PBS重溶用于试验。

本发明纳米颗粒的制备与检测：将200mg表面活性剂(吐温20或吐温80)和脂质(蛋黄卵磷脂:胆固醇＝9:1重量比)的混合物悬浮在4mL的水中，其中表面活性剂：脂质体的比率分别为10:0、8:2、5:5、3:7、1:9或0:10。搅拌悬液使溶液均质化，然后加热到脂质和表面活性剂的熔点温度以上(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃，具体温度取决于所用的脂质和表面活性剂及其比率)。然后向加热的悬液中加入适当浓度的月桂酸(0.1％w/v-5％w/v)，再搅拌30分钟。然后溶液在室温下冷却至常温。本发明纳米颗粒的流体动力学尺寸，用马尔文Zetasizer ZS仪器(英国马尔文仪器公司，英国)测量。本发明纳米颗粒的平均直径是通过动态光散射(DLS)测定。所有的性质测量在25℃重复3次。包含月桂酸的本发明纳米颗粒在本文也称为“TNAN-1”。

纳米颗粒的稳定性：在两种试验环境下检测本发明纳米颗粒的稳定性。第一种是在不同的温度条件下评价本发明纳米颗粒的稳定性。纳米颗粒溶液(含有1％w/v月桂酸)被冷却或加热到-80℃、-40℃、-20℃、4℃、20℃、40℃、80℃或100℃，持续30分钟，然后将样品放到热水中加热或冷却至室温，随后测量颗粒的尺寸来确定所述纳米颗粒经过不同温度处理后的稳定性(图2)。第二种将所述纳米颗粒(含有1％w/v月桂酸)在室温(20℃)下储存5个月。在每个预先确定的时间点，测量样品的颗粒尺寸(图3)。

本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外抗菌活性：为了确定所述纳米颗粒(含有1％w/v月桂酸)的抗菌活性，将纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌在37℃，无氧条件下共孵育5小时，细菌浓度为1x 10⁶CFU/mL至1x 10⁹CFU/mL。每个样品都使用PBS作为阴性对照。孵育后，用PBS将样品稀释，稀释比为1:10至1:10⁶，然后取5μL稀释液涂布在布氏琼脂平板上，培养基中添加5％去纤维蛋白绵羊血、氯高铁血红素和维生素K(5μg/mL)。琼脂平板在37℃，无氧条件下培养3天，然后计数痤疮丙酸杆菌的CFU(菌落形成单位)。

本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外MIC：在厌氧条件下，将不同浓度的本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌(1*10⁶CFU/mL)培育5小时，然后检测样品在600nm处的吸收度(600nm处的光密度，OD600)。所有的检测都平行操作三次。

本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外MBC：37℃，厌氧条件下，将不同浓度的本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌(1*10⁶CFU/mL)培育5小时。培育后，样品用PBS作1:10至1:10⁶稀释，取5μL稀释液接种于RCM琼脂板上。琼脂板在37℃，厌氧条件下培养3天，之后定量测定痤疮丙酸杆菌的CFU(菌落形成单位)。

本发明纳米颗粒处理后痤疮丙酸杆菌的形态学特征：用扫描电镜(SEM)观察本发明纳米颗粒处理后痤疮丙酸杆菌的形态学。在PBS中，痤疮丙酸杆菌(1×10⁷CFU/mL)与纳米颗粒在37℃、无氧条件下共孵育5小时。同样量的痤疮丙酸杆菌在PBS中孵育5小时作为阴性对比试验。然后样品在PBS(pH＝7.4)中用2％的戊二醛在室温下固定30分钟。固定完成后，样品离心去除戊二醛，用水洗三遍，然后重溶于100μL水中。然后再取5μL细菌溶液滴在抛光硅晶片上，在生物安全柜内干燥过夜。细菌样品镀铬后用扫描电镜进行观察。

本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体内抗菌活性：用ICR小鼠(来自CharlesRiver laboratories)进行皮内注射来检测生理环境下本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。具体来说，皮内注射痤疮丙酸杆菌(1x10⁷CFU，溶于20μL PBS)到ICR小鼠双耳上(包括左耳和右耳)，随后痤疮丙酸杆菌的注射部位再分别注射本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)或PBS(用作阴性对比试验)。注射24小时后，用8mm活检穿孔采集小鼠耳朵样品，然后用1mL无菌PBS(Mini-Beadbeater^TM)匀浆。匀浆液用PBS稀释，稀释比为1:10至1:10⁶。每个稀释液取10μL涂布在RCM琼脂平板上。琼脂平板在37℃、无氧条件下培养3天，然后再计数痤疮丙酸杆菌的CFU。每组使用6只小鼠(n＝6)，实验重复三次以验证统计学显著性。

皮肤毒性：在ICR小鼠的背部皮肤上检测本发明纳米颗粒的皮肤毒性。具体来说，研究开始之前24小时，小鼠背部进行脱毛，然后局部给服本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)纤维素凝胶(由羟乙基纤维素、甘油、聚乙二醇按适当比率调制而成的水凝胶)。空白PBS凝胶(不含本发明纳米颗粒)用作阴性对比试验。24小时后，检测皮肤的形态学并拍照。根据Draize打分系统对皮肤受刺激结果进行打分。用8mm活检穿孔取皮肤的横截面切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，然后用显微镜拍照来观察皮肤的组织学。每组使用6只小鼠(n＝6)，实验重复三次以验证统计学显著性。

实施例1本发明纳米颗粒的制备和表征

如“材料和方法”部分所述制备本发明的纳米颗粒。

本发明纳米颗粒的流体动力学尺寸要通过两个参数来检测：z-平均尺寸和多分散性指数，这两个参数都是根据动态光散射测量结果的累积分析计算得出。

通过改变月桂酸的浓度，制得一系列本发明纳米颗粒，通过反复试验来鉴定最佳配方。如图1所示，当月桂酸浓度为1％w/v时，溶液看上去澄清且透明(图1c)，该纳米颗粒的平均直径为11.1nm，平均多分散性指数为0.09。因此，在后续实验中选择的制剂是1％w/v月桂酸(脂质与表面活性剂的质量比为2:1)。

此外，本发明人还检测了本发明纳米颗粒在水中的表面电势在-5mV～-15mV。

实施例2.本发明的纳米颗粒的体外抗菌活性

本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸；表面活性剂与脂质的质量比为2:1)与不同浓度的痤疮丙酸杆菌(1x 10⁶CFU/mL，1x 10⁷CFU/mL，1x 10⁸CFU/mL和1x 10⁹CFU/mL)在37℃下共孵育5小时，以此来检测其在体外的抗菌活性。共孵育完成后，样品用PBS稀释，稀释比为1:10至1:10⁶，然后每个样品取10μL，涂布在RCM琼脂平板上。样品在37℃、无氧条件下培养3天，然后计数痤疮丙酸杆菌的CFU。如图4所示，当细菌浓度低于1x 10⁷CFU/mL时，本发明纳米颗粒能够完全杀死痤疮丙酸杆菌。当细菌浓度升高至1x 10⁹CFU/mL时，本发明纳米颗粒可降低细菌负载达5个数量级，剩余细菌浓度大约为1x 10⁴CFU/mL。这表明细菌在高浓度下，所述纳米颗粒(1％w/v月桂酸)不足以清除所有细菌，原因可能是溶液中纳米颗粒的量不足。

本发明纳米颗粒的时间依赖性抗菌活性试验结果显示只有当本发明纳米颗粒与细菌(1x 10⁷CFU/mL)共孵育5小时后，才能完全杀死细菌。随着共孵育时间减少，抗菌性能也随之减弱(图5)。

本发明纳米颗粒的这种抗菌活性还和操作温度相关。当所述纳米颗粒(1％w/v月桂酸)与细菌(1x 10⁷CFU/mL)共孵育5小时后，结果显示，在室温(20℃)或更高温度下，细菌被完全清除(图6)。

进一步研究显示，本发明纳米颗粒的抗菌活性与样品的储存温度也有关系。本发明纳米颗粒在37℃下储存5个月后，其抗菌活性与新鲜纳米颗粒相同，可以完全杀死1x10⁷CFU/mL的痤疮丙酸杆菌。然而，当储存温度为20℃或4℃时，其抗菌活性下降，分别只能杀死4.4和1.8个数量级的原始痤疮丙酸杆菌量(1x 10⁷CFU/mL)(图7)。

为测定本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外MIC，在厌氧条件下，将不同浓度的本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌(1*10⁶CFU/mL)培育5小时，然后检测样品在600nm处的吸收度(600nm处的光密度，OD600)。所有的检测都平行操作三次。结果显示当本发明的纳米颗粒浓度为0.0125％w/v或更高时，其抑制细菌的生长，如图13所示。

为测定本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外MBC，在37℃，厌氧条件下，将不同浓度的本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌(1*10⁶CFU/mL)培育5小时。培育后，样品用PBS作1:10至1:10⁶稀释，取5μL稀释液接种于RCM琼脂板上。琼脂板在37℃，厌氧条件下培养3天，之后定量测定痤疮丙酸杆菌的CFU(菌落形成单位)。结果显示，0.02％w/v的本发明纳米颗粒杀死了99.9％的痤疮丙酸杆菌。此外，0.05％w/v和更高的本发明纳米颗粒杀死全部细菌，如图14所示。

以上结果显示出本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的MBC:MIC比值是1.6:1，表明此纳米颗粒对该细菌是杀菌剂。

定量分析本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外抗菌活性之后，用扫描电镜来观察所述纳米颗粒处理对细菌形态产生的影响。痤疮丙酸杆菌与所述纳米颗粒共孵育5小时后，用2％的戊二醛固定，然后再用扫描电镜观察。如图8所示，未处理样品(即与PBS缓冲液共孵育)的扫描电镜图显示痤疮丙酸杆菌具有规则的杆状结构，菌表面光滑，具有菌毛。相反，使用本发明纳米颗粒处理过的细菌表现出明显的异常；细菌表面出现不规则变形和收缩，无菌毛(图8)。以上结果表明，本发明纳米颗粒可能会破坏细菌膜的结构，从而实现其杀菌的功能。

实施例3.本发明纳米颗粒的储存稳定性

作为药用，本发明纳米颗粒很关键的一点就要能够在长时间保存下保持有效杀菌作用。对此，本发明人对本发明的纳米颗粒在极端高温和极端低温条件下的稳定性和药效进行了检测。根据颗粒尺寸(图2)和最小杀菌浓度(MBC)结果(实施例2，图6)，处在20至100℃温度下的颗粒很稳定，其抗菌活性保持不变。此外，更低温度(4至-80℃)下保存的颗粒不能完全清除浓度为1x10⁷CFU/mL的痤疮丙酸杆菌，-80℃下冷冻的TNAN-1极不稳定。

进一步的长期稳定试验发现该纳米颗粒在20℃下可以稳定保存5个月。在试验期间，颗粒体积和多分散性指数均保持几乎恒定不变(图3)。

实施例4.本发明纳米颗粒的体内抗菌功效

对ICR小鼠进行皮内注射，以此来检测本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体内抗菌活性。在本实施例中，选择小鼠耳朵进行皮内注射，因为小鼠耳朵的结构能使接种细菌停留在注射区域。为了检测生理环境下本发明的纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性，在ICR小鼠的双耳(左耳和右耳)皮内注射痤疮丙酸杆菌(1x10⁷CFU，溶于20μL PBS)。注射痤疮丙酸杆菌的部位再分别注射本发明的纳米颗粒(1％w/v月桂酸)或PBS(用作阴性对比试验)。注射24小时后，用直径为8-mm活检穿孔采集小鼠耳朵样品，然后进行匀浆及培养，以计数剩余的痤疮丙酸杆菌菌数。如图9所示，使用本发明纳米颗粒治疗可完全清除小鼠耳朵上接种的痤疮丙酸杆菌。相反，阴性对照组(PBS缓冲液处理)检测到的菌数为1.2×10⁴CFU/mL。以上结果证明本发明的纳米颗粒在生理环境下(例如在真皮内)能够有效杀死痤疮丙酸杆菌。

实施例5.本发明纳米颗粒对正常皮肤组织的毒性

在ICR小鼠的背部皮肤上局部使用本发明纳米颗粒凝胶之后，通过检查皮肤形态学的变化来检测所述纳米颗粒对正常皮肤组织可能产生的毒性。在本实施例中，给药前24小时对小鼠背部皮肤进行刮毛，这样有足够的时间让皮肤角质层从可能受到的刮伤中恢复过来，在实验开始之前用PBS润湿皮肤。然后将本发明纳米颗粒样品局部用药到皮肤上，过24小时后除去药物，并用PBS清洗润湿。如图10所示，本发明纳米颗粒处理过的皮肤保持了正常结构，未出现红斑或水肿。所述纳米颗粒处理过的皮肤结构与阴性对照，即空白PBS凝胶处理过的皮肤结构相似。根据Draize的皮肤刺激打分系统，本发明纳米颗粒处理过的皮肤红斑和水肿打分均为0分，表明并未出现明显的皮肤刺激。采集皮肤活检样品，并用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学检测和分析，结果显示(图10，下行)本发明纳米颗粒处理过的皮肤结构完好，真皮层上带有一层健康的表皮细胞，与PBS处理的结果相同。这一结果进一步确认了本发明纳米颗粒的使用安全性。

实施例6.本发明纳米颗粒的人体测试

招募98名志愿者使用本发明纳米颗粒的凝胶，这些志愿者都患有不同阶段的痤疮感染。凝胶每天使用两次，连续使用3周。在第3、7和21天收集使用者的反馈结果。统计结果表明在第3、7和21天，正面肯定本发明纳米颗粒的凝胶有效果的比率分别为72.4％、82.7％和90.8％(图11)。志愿者提供的反馈结果表明，本发明的纳米颗粒能够有效减少或清除痤疮丙酸杆菌导致的痤疮感染。

实施例7.月桂酸在水性体系中的抗菌作用

本发明人进一步测试了水性体系中的本发明纳米颗粒以及游离月桂酸针对痤疮丙酸杆菌的抗菌作用，结果如图16所示。

结果发现，在水性体系中(PBS)，包含月桂酸的本发明纳米颗粒能够显著杀灭痤疮丙酸杆菌，而游离的月桂酸在水性体系中几乎没有杀菌作用。

实施例8.包含不同脂肪酸的纳米颗粒的制备及抗菌活性筛选

本发明人重复了上述实施例1-2，从而制备了包含癸酸和肉豆蔻油酸的纳米颗粒。本发明人进一步筛选了这些非囊泡型纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的杀菌作用，结果如图17所示。

结果发现，包含癸酸和肉豆蔻油酸的纳米颗粒对于痤疮丙酸杆菌没有显著的杀菌作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (24)

1.一种非囊泡型纳米颗粒悬浮液，所述颗粒由脂肪酸、表面活性剂以及脂质构成，其中，所述脂肪酸是月桂酸，所述纳米颗粒的粒径为5-20 nm；

所述纳米颗粒悬浮液中月桂酸含量为0.2-2% w/v；

所述脂质和表面活性剂的质量比为2: 1；

所述非囊泡型纳米颗粒悬浮液由以下方法制备，所述方法包括：

1). 将表面活性剂和脂质的混合物以5%w/v的浓度悬浮在水中；

2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；

3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和脂质的熔点以上；

4). 将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；

5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液；

所述表面活性剂选自以下的一种或多种：吐温20和吐温80；

所述脂质为重量比为9: 1的蛋黄卵磷脂和胆固醇。

2.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径为5-15 nm。

3.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.3。

4.如权利要求3所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的多分散性系数为<0.2。

5.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度MIC为0.0125%w/v；针对痤疮丙酸杆菌的最小杀菌浓度MBC为0.02%w/v。

6.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：

20℃-100℃下保持30分钟，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20%；或者

在20℃储存5个月后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于20%；或者

在37℃储存5个月后，所述非囊泡型纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小杀菌浓度MBC值的改变小于20%。

7.如权利要求6所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：

20℃-100℃下保持30分钟，所述非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于10%；或者

在20℃储存5个月后，所述的非囊泡型纳米颗粒的粒径改变小于10%；或者

在37℃储存5个月后，所述非囊泡型纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小杀菌浓度MBC值的改变小于10%。

8.如权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液的制备方法，包括以下步骤：

1). 将表面活性剂和脂质的混合物以5%w/v悬浮在水中；

2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；

3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和脂质的熔点以上；

4). 将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；

5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括检测所得非囊泡型纳米颗粒的流体动力学尺寸。

10.一种药物组合物，包含权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒以及任选的药学上可接受的载体。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含其它抗生素。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述抗生素是治疗痤疮丙酸杆菌感染的抗生素。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述抗生素选自下组：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰。

14.如权利要求11-13中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是水性药物组合物。

15.权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒或权利要求10-14中任一项所述的药物组合物在制备抗丙酸杆菌Propionibacterium试剂中的用途。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌Propionibacterium acnes、卵白丙酸杆菌Propionibacterium avidum或颗粒丙酸杆菌Propionibacteriumgranulosum。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌Propionibacterium acnes。

18.权利要求1-7中任一项所述的纳米颗粒在制备治疗微生物感染的药物中的用途。

19.权利要求1-7中任一项所述的纳米颗粒与其它抗生素的组合在制备治疗微生物感染的药物中的用途。

20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述抗生素是治疗丙酸杆菌感染的抗生素；或者治疗其它类型微生物感染的抗生素。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌、卵白丙酸杆菌或颗粒丙酸杆菌。

22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌。

23.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述治疗丙酸杆菌感染的抗生素选自：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰；所述治疗其它类型微生物感染的抗生素选自：喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、酰胺醇类、硝基咪唑类。

24.如权利要求19-23中任一项所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒与其它抗生素利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。

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