WO2020149538A1 - 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2020149538A1
WO2020149538A1 PCT/KR2019/018089 KR2019018089W WO2020149538A1 WO 2020149538 A1 WO2020149538 A1 WO 2020149538A1 KR 2019018089 W KR2019018089 W KR 2019018089W WO 2020149538 A1 WO2020149538 A1 WO 2020149538A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
atopic dermatitis
stem cells
culture
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/018089
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
송순욱
김시나
문정현
Original Assignee
에스씨엠생명과학 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에스씨엠생명과학 주식회사 filed Critical 에스씨엠생명과학 주식회사
Priority to CN201980086599.6A priority Critical patent/CN113226338A/zh
Priority to JP2021540268A priority patent/JP7493814B2/ja
Priority to KR1020217018024A priority patent/KR20210087999A/ko
Priority to EP19909999.5A priority patent/EP3903793A4/en
Publication of WO2020149538A1 publication Critical patent/WO2020149538A1/ko
Priority to US16/992,825 priority patent/US11413313B2/en
Priority to JP2024016541A priority patent/JP2024040280A/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or improving atopic dermatitis comprising a single clonal stem cell obtained through layer separation culture of improved stem cells, and a method for manufacturing the same, and a method for treating atopic dermatitis using the same.
  • Atopic dermatitis also known as atopic eczema
  • AD is a very common inflammatory skin disease.
  • the mechanism of development of acute atopic dermatitis is skin penetration of CD4+ T cells and eosinophils, immunoglobulin E (IgE) and Th2 cytokines. It has been reported that it is associated with Th2 inflammatory response mediated by increased secretion.
  • Atopic dermatitis is accompanied by symptoms such as severe itching and dry skin, and atopic skin has high IgE expression in the blood and has features such as increased eosinophils.
  • atopic dermatitis is estimated to occur in about 10 to 20% of the total population, but there is no clear treatment to cure it, and most of them are diagnosed at a young age of 5 years or less, 50% of which is 6 months It is diagnosed between 24 months.
  • the national epidemiological survey conducted by the Korean Society for Pediatric Allergy and Respiratory Surgery the prevalence of atopic dermatitis has been gradually increasing in recent decades, and social interest in it has increased.
  • Early diagnosis and management of atopic dermatitis, the starting point of allergy is very important for the prevention of adult allergic progression, as 50 to 75% of children with atopic dermatitis show progression of allergic disease that progresses to asthma and rhinitis.
  • Atopic dermatitis is caused by many factors such as the activation of T lymphocytes, cytokine system abnormalities, cell-mediated immunity, immunological abnormalities such as increased IgE and physiological factors, and skin biochemical defects.
  • treatment with drugs such as steroids is typically required, including moisturizing the dried skin.
  • drugs such as steroids
  • As a treatment for atopic dermatitis if symptoms are mild, moisturizers, topical steroids, antihistamines, antibiotics, and local immune response modifiers are used.
  • systemic steroids or immunosuppressive agents are used, but when used for a long time, there are side effects, and if the drug is discontinued, the possibility of recurrence of the lesion is high.
  • stem cells have the potential to grow into tissues in all 210 organs of our body, can divide indefinitely, and can differentiate into desired organs through proper manipulation. Because of these characteristics of stem cells, stem cells are in the spotlight as a new treatment, and the possibility of treating incurable diseases using stem cells is very high, and it is expected to be able to treat numerous diseases such as leukemia, osteoporosis, hepatitis, Parkinson's disease, senile dementia, and burns. have.
  • stem cells there are still many limitations in that it is difficult to obtain them in large quantities. Although it can be said that the method of obtaining the stem cells from the frozen embryonic cells is efficient, there are still many controversies in terms of ethics. In order to solve this problem, many studies have been conducted on a method of obtaining a stem cell using a somatic cell nuclear transfer method or an adult stem cell.
  • Adult stem cell research is more actively conducted than embryonic stem cell research.
  • Adult stem cells are cells that remain in various organs such as the central nervous system or bone marrow and participate in long-term development and regeneration when damaged. Because they exist in various organs, they can be obtained from various parts including bone marrow, spleen, fat cells, etc. The method of obtaining is most often practiced. However, among many different types of bone marrow cells, it is difficult to always obtain a uniform type of cell in separating and culturing mesenchymal stem cells, and research has been conducted to compensate for these problems.
  • the present inventor has invented a method for separating stem cells, which is called a novel layer separation culture method, and has applied for and applied for a patent through Korean patent application KR 10-2006-0075676.
  • the layer-separated culture method can be performed at a lower cost than other methods, and there is no contamination problem and can effectively obtain clonal mesenchymal stem cells (cMSC) without fear of mixing with other stem cells. It has excellent superiority to the obtained method.
  • the layered culture method requires a large amount of mesenchymal stems through a process of producing a working cell bank and obtaining the final product through mass production of mesenchymal stem cells for use as a final product. It was difficult to obtain a fast monoclonal mesenchymal stem cell population in that cells could be obtained and at least 10 passages were required.
  • stem cells to treat inflammatory diseases, particularly atopic dermatitis
  • inflammatory diseases particularly atopic dermatitis
  • the present inventors while conducting research to induce rapid proliferation of stem cells through improvement of the layer separation culture method as described above, use an improved layer separation culture method in which cultured cell density is controlled low and antioxidant is added to culture. It is possible to induce an effective cell proliferation rate increase only with a small passage, and it was confirmed that the monoclonal stem cells obtained through this showed a very remarkable treatment effect for atopic dermatitis compared to the stem cells of the conventional layered culture method.
  • an object of the present invention is a composition for preventing, treating and improving atopic dermatitis comprising a single clonal stem cell obtained through a layer separation culture and proliferation method of a stem cell that has improved the existing layer separation culture method, and a method for manufacturing the same It is to provide a method for preventing, treating and improving atopic dermatitis used.
  • the present invention comprises the steps of 1) culturing bone marrow separated from an individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a quasi-drug composition for preventing or improving atopic dermatitis, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4).
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4) (cells/cm 2 ) Obtaining a monoclonal stem cell through the step of inoculating the medium with a cell density of culturing; And 6) administering the single clonal stem cells to the individual; It provides a method for preventing, improving or treating atopic dermatitis, comprising.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a stem cell for preventing, improving or treating atopic dermatitis obtained through.
  • the improved method for layer separation culture and proliferation of stem cells of the present invention it is possible to obtain a desired large amount of single clonal stem cells in a short time through rapid proliferation of single clonal stem cells, and the single clonal intermediate obtained therefrom Mesenchymal stem cells are stem cells with enhanced atopic dermatitis treatment effect, and thus can be usefully used as a therapeutic agent for atopic dermatitis.
  • FIG. 1 is a view showing a conventional layer separation culture method for separating monoclonal mesenchymal stem cells from bone marrow.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming the morphological changes of monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture through microscopic observation.
  • FIG. 3 shows changes in cell size and granularity of monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture through forward scatter (FSC) through flow cytometry (FACS) analysis.
  • FSC forward scatter
  • FACS flow cytometry
  • SSC side scatter
  • Figure 4 is a diagram showing the results of confirming whether the cells are aged by staining the activity of beta galactosidase (beta gal) with monoclonal mesenchymal stem cells with different cell culture density and cell passage culture.
  • Figure 5 shows the results of aging-related genes p15, p16 and proliferation marker PCNA confirmed by RT-PCR after culturing single-clonal mesenchymal stem cells of passage 15 (Passage 15; P15) at different cell culture densities. It is.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming the proliferation capacity of monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture through cell population doubling time (PDT) and population doubling level (PDL). (*P ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • 7 is a view showing the results of confirming the differentiation ability of the monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • 7A is a result of confirming the differentiation ability of monoclonal mesenchymal stem cells into adipocytes according to cell culture and cell passage culture through Oil red O histological staining
  • FIG. 7B quantifies the degree of histological staining of A It is a diagram shown.
  • 7C is a result of confirming the differentiation ability of monoclonal mesenchymal stem cells into osteogenic cells according to cell culture and cell passage culture through Alizarin red S histological staining
  • FIG. 7D shows the degree of histological staining of C It is a figure shown by quantifying.
  • FIG. 8 shows the production of total reactive oxygen species (ROS) produced from monoclonal mesenchymal stem cells according to cell culture density and cell passage culture (A) and thus DNA damage through comet assay (B ) It is a diagram showing one result (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • ROS total reactive oxygen species
  • Figure 9 shows the concentration of 8-oxo-deoxyguanosine (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine; 8-OHdG) in order to confirm the degree of DNA damage caused by reactive oxygen species produced according to cell culture density and cell passage culture. It is a diagram showing the measured results (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • FIG. 11 is a result of comparing the level of activated oxygen species produced after culturing monoclonal mesenchymal stem cells of passage 15 (P15) under high density conditions alone (HD) or high density conditions + addition of ascorbic acid (HD+AA). It is a diagram showing (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.005).
  • 12A is a diagram showing a comparison between a conventional layer separation culture method and an improved layer separation culture method experiment method.
  • 12B is a schematic diagram of an improved layer separation culture method, and is a schematic diagram showing a low density culture corresponding to passage 2 different from the conventional layer separation culture method.
  • FIG. 13 to 20 are inoculated with SCM01 to SCM08 monoclonal mesenchymal stem cells obtained through a layer separation culture method at a density of 1000 or 4000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) and LG- with or without antioxidant added.
  • a of each figure shows the change in cell number according to passage 1 (P1) to passage 5 (P5) of each experimental group
  • B of each figure shows the cell group doubling time (PDT) and cell number proliferation level (PDL) results of each experimental group. It is.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation rate in an experimental group using only LG-DMEM medium to which no antioxidant was added and varying cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density.
  • FIG. 22 shows the results of confirming the cell group doubling time (PDT) and cell number proliferation level (PDL) in the experimental group using only LG-DMEM medium without antioxidant added and varying the cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density. It is a diagram showing.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation rate in the experimental group using only ⁇ -MEM medium to which an antioxidant was added and varying cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of confirming PDT and PDL in an experimental group using only ⁇ -MEM medium to which antioxidant was added and varying cell density to 1000 or 4000 cells/cm 2 density.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation rate in the experimental group in which the cell density was fixed at a density of 1000 cells/cm 2 and the culture medium was changed to LG-DMEM or ⁇ -MEM.
  • 26 is a diagram showing the results of confirming PDT and PDL in an experimental group in which the cell density was fixed at a density of 1000 cells/cm 2 and the culture medium was changed to LG-DMEM or ⁇ -MEM.
  • FIG. 27 is a view showing the results of confirming the change in skin lesions according to the control (Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC administration in atopic dermatitis animal model.
  • FIG. 32 is a view showing the results of confirming the change in IgG2a production according to the control (Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC treatment (P**** ⁇ 0.0001).
  • 35 is a view showing the results of confirming the weight change according to the control (Cell Vehicle, veh), cMSC1 (100, 1000 cells / cm 2 ), cMSC2 (4000 cells / cm 2 ) administration in atopic dermatitis animal model.
  • 36 is a diagram showing the results of confirming the change in cell viability according to administration of cMSC1 (100, 1000 cells/cm 2 ) and cMSC2 (4000 cells/cm 2 ) in an atopic dermatitis animal model.
  • FIG. 37 shows the changes in total IgE production according to normal control (naive), control (Cell Vehicle, veh), cMSC1 (100, 1000 cells/cm 2 ), and cMSC2 (4000 cells/cm 2 ) in an atopic dermatitis animal model.
  • Figure 39 is atopy dermatitis animal model in the normal control (-), control (PBS, veh), cMSC1 (100, 1000 cells / cm 2 ), cMSC2 (4000 cells / cm 2 ) The results confirming the effect of relieving epidermal thickening It is a diagram showing.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopy, including a single clonal stem cell obtained through an improved layer separation culture and proliferation method of mesenchymal stem cells, or an individual in need thereof.
  • Administering It relates to a method for preventing or treating atopic dermatitis comprising a.
  • the present invention comprises the steps of obtaining a single clonal stem cells through an improved layer separation culture and proliferation method of mesenchymal stem cells; It relates to a method for preparing a composition for preventing, improving or treating atopic dermatitis comprising a.
  • the active ingredient of the present invention provides rapid proliferation of monoclonal stem cells, preferably monoclonal mesenchymal stem cells.
  • WCB Working Cell Bank
  • the monoclonal stem cells obtained through the above method are characterized in that they are stem cells having an improved atopic dermatitis treatment effect compared to the stem cells obtained through a conventional layer separation culture method.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the culture of steps 2) and 3) is cultured at 30 to 40° C. for 4 hours or less, preferably 1 hour to 3 hours, more preferably 1 hour 30 minutes to 2 hours 30 minutes, and repeated culture is 30 to 40 4 hours or less at °C, preferably 1 hour to 3 hours, more preferably 1 hour 30 minutes to 2 hours and 30 minutes after incubation, 12 to 36 hours at 30 to 40 °C, preferably 18 to 30 hours It is repeated 2 to 3 times, and then incubated at 30 to 40°C for 24 to 72 hours, 36 to 60 hours, preferably 36 to 60 hours, and each time the supernatant is transferred to a new culture vessel. have.
  • the cultured cells form a monoclonal cell population.
  • passage culture can be performed, and the present invention is characterized by including a passage culture step of step 5) in addition to the conventional layer separation culture method. Is done.
  • subfractionation culture means a method of separating stem cells according to specific gravity, first extracting human bone marrow and culturing it in a cell culture medium, and then obtaining only the supernatant Refers to a process in which the same process is repeated several times after the coating is transferred to a culture vessel with or without treatment, and then cultured.
  • This layer-separated culture is characterized by repeating the process of culturing by repeatedly obtaining the supernatant without centrifugation, and finally, without contamination of other cells, monoclonal stem cells, preferably monoclonal mesenchymal stems. There is an advantage that cells can be obtained.
  • Steps 1) to 4) of steps 1) to 5) of the present invention may be performed the same or equivalent to the layer separation culture method described in KR 10-2006-0075676 or KR10-2014-0170045, KR 10 -2006-0075676 may be incorporated by reference in its entirety.
  • a method for obtaining cells in connection with the treatment of atopic dermatitis (i) obtaining a supernatant by culturing a sample containing bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a first container; (ii) transferring the supernatant of the first container to the second container; (iii) culturing the cells present in the second container to obtain a supernatant; (iv) repeating steps (ii) and (iii) three or more times; (v) isolating a colony derived from a single cell; And (vi) transferring cells from the colony to the growth medium, and culturing the cells; to obtain clonal stem cells obtained through a layer separation culture method, and to prevent or treat atopic dermatitis using the same.
  • This uses the conventional layer separation culture method of KR 10-2006-0075676 in that it is a method of obtaining a single clonal stem cells obtained through a layer separation culture method, and to prevent or
  • the layer separation culture method of KR 10-2006-0075676 and KR10-2014-0170045 effectively obtains monoclonal stem cells at a low passage, and thereby significantly improves the treatment effect of atopic dermatitis. There is no disclosed method for obtaining stem cells.
  • the present invention relates to a “improved layer separation culture method” based on the fact that stem cells with excellent atopic dermatitis prevention, treatment, and improvement effects can be effectively obtained by controlling the cell density in culture after passage 2 and prior art. Characterized in that the separation method of the layer separation and the culturing step after the seed cell are different. For example, specifically, '5) The single clonal stem cells of step 4) above are 50 to 1000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) And incubating the medium with a cell density of'.
  • the improved layer separation culture method can induce the proliferation of single clonal stem cells faster than the conventional layer separation culture method, so that the final product can be rapidly obtained, and preferably, even with a culture of less than passage 10 such as P2 to P8 MCB (Master Cell Bank) can be prepared and monoclonal stem cells showing excellent atopic dermatitis prevention or treatment effect can be obtained.
  • a culture of less than passage 10 such as P2 to P8 MCB (Master Cell Bank) can be prepared and monoclonal stem cells showing excellent atopic dermatitis prevention or treatment effect can be obtained.
  • monoclonal stem cells of the present invention are cultured at a high density of 4000 cells/cm 2 as in the conventional process, the cell proliferation capacity is significantly reduced, the markers of mesenchymal stem cells are changed, and the differentiation capacity of stem cells may be lost. have. Therefore, monoclonal stem cells obtained through an improved layer separation culture method have a low to medium density, 4000 cells/cm 2 Low cell density of less than (cells/cm 2 ), such as 3000 cells/cm 2 Or less, preferably 2000 cells/cm 2 or less, more preferably 50 to 1000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) It can mean cultured at a cell density.
  • the improved layer separation culturing method of the present invention may be characterized in that the step cultivation step after the seed cell is performed only under passage 10, preferably passage 8 or less, and the conventional layer separation cultivation method has a sufficient number of cells. Compared to the one that had to be cultured up to 25 passages in order to secure, there is an advantage that mass production of single clonal stem cells is possible with only a small passage.
  • the cell when culturing a single-clonal mesenchymal stem cell with the above cell density, the cell has little DNA damage and has the advantage of being able to effectively maintain the differentiation ability of stem cells by inhibiting aging, so that it has excellent stem cell properties quickly and quickly. Monoclonal mesenchymal stem cells can be obtained.
  • the monoclonal stem cells obtained according to the method of the present invention show superior atopic dermatitis prevention, improvement or treatment effect compared to monoclonal stem cells cultured at a high density such as 4000 cells/cm 2 .
  • the medium used in the present invention may include a medium that does not contain an antioxidant, a medium in which an antioxidant is added to the medium, or a medium that contains an antioxidant.
  • DMEM medium may be used as a medium that does not contain an antioxidant, but is not limited thereto, and if necessary, culture may be performed by further adding an antioxidant to the medium. In addition, if necessary, the culture may be performed using an ⁇ -MEM medium containing an antioxidant.
  • Antioxidants of the invention may comprise an antioxidant that can be used in cell culture without limitation, and glutaric Leone (Glutathione), Cysteine (Cysteine), cysteamine (Cysteamine), ubiquinol (Ubiquinol), beta-Merced It may be at least one selected from the group consisting of cap-ethanol (b-mercaptoethanol) and ascorbic acid (Ascorbic acid; AA).
  • glutaric Leone Glutathione
  • Cysteine Cysteine
  • cysteamine cysteamine
  • Ubiquinol ubiquinol
  • beta-Merced It may be at least one selected from the group consisting of cap-ethanol (b-mercaptoethanol) and ascorbic acid (Ascorbic acid; AA).
  • the antioxidant may be added at a concentration of 10 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 25 ⁇ g/ml.
  • DMEM more preferably LG-DMEM medium is used as a medium containing no antioxidant
  • ⁇ -MEM medium is used as a medium containing ascorbic acid as an antioxidant.
  • a process of manufacturing a working cell bank (WCB) using MCB may be omitted. This simplifies the process compared to the conventional layer separation culture method that involves the process of manufacturing WCB after MCB production.
  • gentamicin When using a medium containing an antioxidant as the culture medium of the present invention, gentamicin may be added as an antibiotic to the culture medium.
  • the mesenchymal stem cells obtained through the method of the present invention may finally be preferably mesenchymal stem cells of P2 to less than P10, more preferably P2 to P8 mesenchymal stem cells, even more preferably P2 To P6 mesenchymal stem cells.
  • the single layer obtained by the improved layer separation cultivation method as described above, improved layer separation cultivation method of low density and antioxidant conditions of preferably 2000 cells/cm 2 or less, more preferably 1000 cells/cm 2 or less Clonal stem cells (hereinafter referred to as'cMSC1'or'SCM-cMSC) are smaller and more homogeneous in cell size compared to single clonal stem cells (hereinafter referred to as'cMSC2') obtained by a conventional layer separation culture method.
  • the effect of suppressing cells is excellent.
  • atopic dermatitis may include fevers, and may include, without limitation, allergic diseases of the skin having skin dryness and itching as the main symptoms.
  • the monoclonal stem cells obtained through the method of the present invention can effectively relieve the transdermal, dermal thickening and keratin symptoms appearing on the skin caused by atopic dermatitis, and in particular, it can be characterized by alleviating the thickening of the dermis or epidermis. have.
  • the monoclonal stem cells obtained through the method of the present invention can improve various immune and inflammatory factors caused by atopic dermatitis, and preferably produce one or more products selected from the group consisting of IgE, IgG1 and IL-4. It may be inhibited and promote the production of INF- ⁇ .
  • the monoclonal stem cells obtained through the method of the present invention can suppress cells that cause allergic reactions, and preferably may be characterized by suppressing mast cells.
  • the monoclonal stem cells obtained through the method of the present invention are compared to cMSC2 obtained by a conventional layer separation culture method as well as stem cells (GCM-MSC) obtained by a conventional density gradient centrifugation method. Also, it can be characterized as having an excellent effect of improving histological and physiological factors related to atopic dermatitis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient for administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier included in the pharmaceutical composition of the present invention is commonly used in formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but is not limited thereto It does not work.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the method of formulating the pharmaceutical composition, the method of administration, the administration time and/or the administration route, and the type and degree of reaction to be achieved by administration of the pharmaceutical composition.
  • Factors including the type of subject to be administered, age, weight, general health status, severity or severity of the disease, sex, diet, excretion, components of the drug or other composition used concurrently or in conjunction with the subject, and It can be varied according to similar factors well known in the pharmaceutical field, and those skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be, for example, 1 mg/kg to 1,000 mg/kg per day, but the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the route of administration and the mode of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent of each other, and are not particularly limited in the manner, and any route of administration and mode of administration as long as the pharmaceutical composition can reach the desired site. You can follow.
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral administration or parenteral administration.
  • the parenteral administration method includes, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration, or subcutaneous administration, and a method of applying, spraying, or inhaling the pharmaceutical composition to a diseased site may also be used. However, it is not limited thereto.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4) (cells/cm 2 ) Obtaining a single clonal stem cell through the step of inoculating the medium with a cell density of culturing; And 6) administering the single clonal stem cells to the individual; It provides a method for preventing or treating atopic dermatitis comprising a.
  • the'individual' includes an individual in need of preventing or treating atopic dermatitis, and may be a mammal or a mammal other than a human.
  • a single clonal stem cell of the present invention When a single clonal stem cell of the present invention is administered to an individual, it can be administered in combination with a drug for preventing or treating atopic dermatitis known in the art, and a stem cell therapeutic agent known in the art that has been confirmed to be harmless to a human body It can be administered in a formulated form with excipients.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). (cells/cm 2 ) Inoculating the medium with a cell density of culturing; It provides a stem cell for preventing, improving or treating atopic dermatitis obtained through.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) incubating the single clonal stem cells of step 4) in a medium with a cell density of 50 to 1000 cells/cm2 (cells/cm2); It provides a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the cosmetic composition in addition to the stem cells of the present invention, in addition to fat substances, organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water , Ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion blockers and chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles or commonly used in cosmetics It may contain adjuvants commonly used in the cosmetic field, such as any other ingredient.
  • the stem cells of the present invention may be added in an amount of 0.01 to 15% by weight, preferably 1 to 10% by weight, to a cosmetic composition that is usually contained.
  • the ingredients can be introduced in an amount commonly used in the field of skin science.
  • the stem cells or a culture medium thereof may be appropriately diluted and applied directly to the skin, and the pharmaceutical composition for treating skin diseases of the present invention may be prepared as an ointment so as to be effectively applied to the affected area.
  • the ointment is prepared by blending a pharmaceutical composition for treating atopic dermatitis of the present invention with an inorganic substance, and then coating it with a fat-soluble base.
  • the inorganic material is preferably used material having excellent antibacterial, anti-inflammatory, and epidermal regeneration effects, and specific examples thereof include zinc oxide, zinc carbonate, and iron oxide.
  • a ceramic carrier capable of safely impregnating the pharmaceutical composition for the treatment of atopic dermatitis of the present invention which is a water-soluble substance.
  • zeolite, talc, gypsum, sand powder and mixtures thereof are preferably used.
  • Such a ceramic carrier is excellent in impregnation of water-soluble components and can smoothly supply water-soluble components to the skin.
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4). inoculating the medium with a cell density of (cells/cm 2 ) and culturing; It provides a quasi-drug composition for preventing or improving atopic dermatitis, including monoclonal stem cells obtained through.
  • the term "quasi-drug” is a fiber or rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a person or animal.
  • a non-machine or similar product one of the agents used for sterilization, pesticide and similar purposes to prevent infection, and used for the purpose of diagnosing, treating, reducing, treating or preventing human or animal diseases.
  • the items to be used which is not a device, machine or device, and is used for the purpose of having a pharmacological effect on the structure and function of a person or animal. Includes supplies.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is included in quasi-drugs for the purpose of preventing, improving or treating atopic dermatitis, the composition may be used as it is or used in combination with other quasi-drug components, and may be suitably used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to the intended use.
  • the quasi-drug of the present invention is not particularly limited thereto, but may be prepared and used, for example, in the form of a cream, lotion, aerosol, shampoo, gel or pack.
  • creams, ointments, shampoos, gels or packs white petrolatum, yellow petrolatum, lanolin, bleached beeswax, cetanol, stearyl alcohol, stearic acid, hydrogenated oil, gelled hydrocarbons, polyethylene glycol, liquid paraffin, squalane, etc.
  • Solvents and dissolution aids such as oleic acid, isopropyl myristate, glycerin triisooctanoate, crotamiton, diethyl sebacate, diisopropyl adipate, hexyl laurate, fatty acids, fatty acid esters, aliphatic alcohols, and vegetable oils;
  • Antioxidants such as tocopherol derivatives, L-ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, and butylhydroxyanisole; Preservatives such as parahydroxybenzoic acid esters;
  • Moisturizing agents such as glycerin, propylene glycol, and sodium hyaluronate;
  • Surfactants such as polyoxyethylene derivatives, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, and lecithin;
  • thickeners such as carboxyviny
  • Solvents and dissolution aids include Antioxidants such as tocopherol derivatives, L-ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, and butylhydroxyanisole; Preservatives such as parahydroxybenzoic acid esters; Moisturizing agents such as glycerin, propylene glycol, and sodium hyaluronate; Surfactants such as polyoxyethylene derivatives, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, and lecithin; Thickeners such as carboxyvinyl polymer, xanthan gum, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose; In addition, various stabilizers, buffers, mating agents, suspending agents, emulsifiers, fragrances, preservatives, dissolution aids, and other suitable additives can be blended. In addition, stabilizers, preservatives,
  • the present invention 1) culturing the bone marrow separated from the individual in a first container; 2) only the supernatant of the first container is moved to a new container and cultured; 3) culturing the cells present in the new container and obtaining a supernatant; 4) obtaining a single clonal stem cell by repeating steps 2) and 3) one or more times using the supernatant from step 3) as the supernatant from step 1) in step 1); And 5) 50 to 1000 cells/cm 2 of the single clonal stem cells of step 4).
  • single clonal stem cells obtained by a conventional layer separation culture method compared to single clonal stem cells obtained by a conventional layer separation culture method, single clonal stem cells exhibiting excellent atopic dermatitis prevention, improvement or treatment effect can be obtained quickly and easily without WCB preparation, and the composition is Pharmaceuticals, food, quasi-drugs, and cosmetic compositions may be included without limitation.
  • the culture of step 5) is 1000 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) It can be characterized in that it is performed by inoculating the medium with a cell density of.
  • the medium of step 5 may be characterized in that the medium is added with antioxidants.
  • the contents described in the above composition may be applied identically, and overlapping contents are omitted to avoid the complexity of describing the specification.
  • An improved mesenchymal stem cell layer separation culture method and a proliferation method were used to prepare monoclonal mesenchymal stem cells showing excellent effects on atopic dermatitis.
  • the improved mesenchymal stem cell layer separation culture method and proliferation method are characterized by changing the cell density and culture medium among the culture conditions of the layer separation culture method described in Korean Patent Application No. 10-2006-0075676.
  • cell culture densities of monoclonal mesenchymal stem cells (cMSC) obtained through the layer separation culture method are 50 cells/cm 2 (cells/cm 2 ) (low density) and 1000 cells/cm 2 (medium density), respectively. , 4,000 cells/cm 2 (high density) and the characteristics of the cells were analyzed accordingly.
  • mesenchymal stem cells of passage 5 (P5), passage 10 (P10), and passage 15 (P15) were used, and inoculated into LG-DMEM medium under conditions of low density, medium density, and high density, respectively. Thereafter, the morphological changes of the cells were observed through a microscope to determine whether stem cells were aged, and the results are shown in FIG. 2.
  • passage 5 (P5) and passage 10 (P10) showed a difference in cell size and morphological pattern according to cell density, especially in the case of P15, in the high-density culture conditions, flat and enlarged mesenchyme Stem cells were observed.
  • This form represents the aging of typical mesenchymal stem cells, and it was confirmed that the density control of cells in long-term culture can control the aging of mesenchymal stem cells.
  • the size of the cells did not show a significant difference in P5, but in the case of P10 and P15, it was confirmed that it shows a significant difference according to the cell density.
  • the cell size was significantly increased in the culture conditions of high cell density, and thus it was confirmed that cell aging was further promoted.
  • the particle size of the cells also showed a significant increase as the density of the cells increased at all passages.
  • cell density control can be a factor that regulates cell aging, and by lowering the cell culture density, it can be confirmed that morphological changes occurring in later passages can be improved. .
  • Examples 1.1 and 1.2 are actually an aging-dependent phenomenon of mesenchymal stem cells
  • a staining analysis method using beta galactosidase capable of selectively staining senescent cells was performed, and the expressions of the aging-related genes p15, p16 and the proliferation marker PCNA gene were compared through RT-PCR. The results are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • passage 5 (P5) and passage 10 (P10) was not able to confirm the staining of aged cells at all cell densities, but at passage 15 (P15) the staining of aged cells increased as the cell density increased. It was confirmed that this increased significantly.
  • passage 15 (P15) as the cell culture density increased, the gene expression of the CDK inhibitors p15 and p16, which are aging-related genes, increased, and the proliferation marker PCNA decreased.
  • the proliferative capacity of mesenchymal stem cells gradually decreases as passage progresses and aging of cells progresses. Therefore, the proliferative capacity can be used as a criterion for confirming the aging of mesenchymal stem cells, and the proliferative capacity of mesenchymal stem cells according to the cell culture density during long-term cell culture was performed.
  • the proliferation capacity of each cell was confirmed by calculating the proliferation rate according to each passage through the number of cells initially inoculated and the number of cells obtained after the culture was over, and the results are shown in Table 1 and FIG. 6.
  • the differentiation capacity according to the P5 to P15 culture was compared. Adipose cell differentiation ability and bone cell differentiation ability were confirmed by stem cell function, and normal and quantitative analysis was performed at each passage and density.
  • the adipocyte differentiation culture is NCS (Newborn Calf Serum) (Gibco), 10 -7 mol dexamethasone (Sigma), 0.5 mM IBMX (Sigma), 10 ⁇ g/ml insulin (insulin) (Sigma) in High Glusose DMEM culture.
  • indomethacin indomethacin
  • indomethacin 100 ⁇ M indomethacin (indomethacin) (Sigma) was added to the medium was made and tested, 7 days after the differentiation was confirmed by Oil red O histochemical staining. In addition, after the oil red O histochemical staining, it was eluted with isopropyl alcohol, measured at 500 nm and confirmed by quantitative analysis.
  • FBS for the bone cell differentiation culture, FBS (Gibco), 50 ⁇ g/ml ascorbic 2 phosphate (sigma), 10 -8 mol dexamethasone (Sigma), and 10 mM beta-glycerophosphate (sigma) are added to the ⁇ -MEM culture medium.
  • One medium was used, and it was confirmed by Alizarin red S histochemical staining after 21 days of differentiation. Also, after Alizarin red S histochemical staining, it was eluted with 10% acetic acid, measured at 405 nm and confirmed by quantitative analysis. 7 shows the results of confirming adipocyte differentiation ability and osteoblast differentiation ability in the same manner as described above.
  • adipocyte differentiation capacity decreased as the passage progressed, but the difference due to density did not appear distinctly, whereas in the case of osteoblast differentiation capacity, it was significantly decreased in the passage 15 (P15) culture group under high density condition. Was confirmed. Through these results, it was confirmed that the osteoblast differentiation ability of mesenchymal stem cells can be better maintained when cultured with a low cell density.
  • passage 15 when the cells were cultured at a high density, the expression amount of most positive markers was significantly reduced, and CD73 and CD105 showed negative expression. It was confirmed that it can be a very important factor.
  • ROS Reactive oxygen species
  • the 8-OHdG analysis method is as follows. 50 ⁇ l of the DNA sample obtained from each cell was placed in an 8-OHdG conjugate coated plate, and then incubated at room temperature for 10 minutes. Thereafter, an anti-8-OHdG antibody was additionally added and cultured for 1 hour at room temperature. After washing 3 times, a secondary antibody enzyme conjugate was added to each well, and then again 1 Incubated at room temperature for an hour. After washing again three times, a substrate solution was added and incubated at room temperature for 30 minutes. Finally, after adding a stop solution, the absorbance at 450 nm was measured and confirmed, and the results are shown in FIG. 9.
  • the fold increased from P11 to P15 to 2.6, 1.9, and 1.6, respectively, and as the number of passages increased, aging began to decrease as the number of passages increased. It was confirmed that the proliferation capacity was maintained high by about 50%. Also, the growth fold increase in the antioxidant treatment group was 3.8 in P11 to P15, respectively. The proliferation capacity was maintained high even at P15 at 2.9 and 2.5.
  • MSC culture is preferably performed at a low cell density rather than a high density, and when the ROS production induced in the high-density cell culture is eliminated with an antioxidant, it is possible to increase the proliferation capacity of mesenchymal stem cells. That is, in the high-density condition, the proliferation ability of mesenchymal stem cells is suppressed due to ROS, and as the cell density decreases, the ROS decreases, and thus the mesenchymal stem cell proliferation ability may be promoted.
  • the cell density in the culture conditions is 1000 cells/cm 2 It is important to adjust the density to the following density, and when cultivated by adding an antioxidant, it was confirmed that the mesenchymal stem cell proliferation can be effectively promoted by suppressing oxidative stress that may be caused in cell culture.
  • stem cells of passage 10 or higher such as P15
  • stem cells of passage 10 or lower such as passage 5
  • passage 5 As the result is confirmed, 1000 cells/cm 2 It was confirmed that culturing with a low passage number of passage less than 10 at the following density was most effective.
  • Example 1 in the mesenchymal stem cell culture obtained by the layer separation culture method, since it was confirmed that cell density control, passage control, and addition of antioxidants could be important factors, the domestic patent application 10-2006- Single colony mesenchymal stem cells obtained by the conventional process of the layer separation culture method described in 0075676 are obtained by varying the cell culture density, and by performing passage culture while changing the medium with a medium to which antioxidant ascorbic acid is added. The proliferative capacity of the cells and thus the effect of obtaining cells were compared.
  • Example 1 of the previous Korean Patent Application No. 10-2006-0075676 discloses a method of separating and culturing mesenchymal stem cells from bone marrow through a layer separation culture method as shown in FIG. 1, and the unity obtained through the layer separation step Disclosed is the fact that colonies, cell populations, are transferred to the culture vessel at a number of cells between 100 and 600 per well.
  • Korean Patent Application No. 10-2014-0170045 discloses a method of isolating and culturing bone marrow-derived mesenchymal stem cells using a layer separation culture method, and discloses that the colonies are plated at 50 to 100 cells/cm 2 . .
  • the present improvement method after culturing the colonies of passage 1 (P1) obtained through the layer separation culture method, in passage culture after passage 2 (P2), cells are dispensed at a low density of 1000 cells/cm 2 or less, and Compared to the effect of 4000 cell/cm 2 cell culture.
  • the cell culture medium was different from the ⁇ -MEM medium containing the antioxidant and the LG-DMEM medium without the antioxidant, and the cell proliferation effect was compared accordingly.
  • the experimental group for confirming the effect of the improved layer separation culture method is shown in Table 3, schematically showing the process improvement part of the improved layer separation culture method compared to the conventional layer separation culture method in FIGS. 12A and 12B.
  • the conventional layer separation culture method and the improved layer separation culture method proceed in the same way until the step of obtaining passage 1, but the improved layer separation culture method uses extended passage 1 cells as seed cells for culture.
  • the passage culture process is different from the conventional layer separation culture method.
  • Existing layer separation culture method performs high density passage culture of 4000 cells/cm 2 or more for the purpose of obtaining many cells without recognition of density control, but the improved layer separation culture method reduces the density of passage culture to a low density of 1000 cells/cm. By adjusting to 2 or less, the final product can be obtained only after culturing up to passage 8 or less after passage 2.
  • the culture process after passage 2 is shown in detail in FIG. 12B.
  • the cell lines in Table 3 are cell lines separated by a layer separation culture method, and are named SCM01 to SCM08, respectively.
  • cm 2 exhibited an excellent cell proliferation effects than incubation test group was inoculated with a cell density of 4000 per cm 2 in all groups the culture inoculated with 1000 cells per density.
  • a more prominent cell proliferation effect was confirmed in the 1000 alpha experimental group cultured in ⁇ -MEM medium containing the antioxidant ascorbic acid.
  • the culture medium was fixed with LG DMEM or ⁇ -MEM medium, respectively, and the cell proliferation effect according to passage culture of 1000 or 4000 cell inoculation densities per cm 2 was compared, The results are shown in FIGS. 21 to 24.
  • the proliferation rate at passage 2 (P2) to passage 5 (P5) of the SCM01 to SCM08 cell lines cultured in LG DMEM was inoculated with 1000 cell counts than 4000 cell counts per cm 2 and cultured.
  • the proliferation rate of 1000 cell inoculation groups compared to 4000 cell inoculations per cm 2 confirmed in passage 5 (P5) was at least 3.08 to 48.50 times.
  • cm PDT value of 1000 cells inoculated group per Fig. 2 showed a cm 2 4000 gae cell lines lower or similar than the inoculated sugar in all cell lines, PDL values is 4000 per cm 2 in all cell lines Higher values were observed compared to dog cell inoculation.
  • Example 2.2 above Culture is 4000 cells/cm 2 Since it was confirmed that it can exhibit an excellent proliferation effect compared to the culture, the cell number was fixed to 1000, and the cell proliferation effect was compared by changing the medium to a variable, thereby further verifying the proliferation effect by the culture medium conditions and confirming the results. And 26.
  • the cell inoculation density was adjusted to 1000 or less cells per cm 2 , and in addition to cultivating a low passage less than passage 10 such as passage 2 (P2) to passage 5 (P5), the medium containing antioxidant was added. It indicates that the cell proliferation efficiency can be maximized when culturing using the product.
  • the layer separation culture process and proliferation culture of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells of the present invention were performed as follows.
  • bone marrow was collected by stabbing an injection needle into the hip bone.
  • 14 ml DMEM Dulbecco ⁇ s modified Eagle ⁇ s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin/streptomycin in a 100 mm culture vessel
  • human bone marrow The cells were cultured for 2 hours in a 37° C. 5% CO 2 cell incubator. After cultivation, the culture vessel was tilted slightly to one side, and only the top culture solution of the culture vessel was transferred to a new container so as not to fall as far as possible to the cells attached to the bottom.
  • the obtained culture solution was transferred to a culture vessel (Becton Dickinson) coated with collagen on the bottom, and then cultured at 37°C for 2 hours.
  • the culture was transferred to a new collagen-coated container again, and after 24 hours, to a new container, and after 24 hours, to a new container.
  • the cells were transferred to a new container, and the remaining cells were attached to the bottom of the culture vessel and visually confirmed. It is possible to guess that the cells that can reach this stage through the previous multiple layer separation steps are significantly smaller cells than other cells.
  • the cells form a single colony, which is separated by treatment with trypsin and then transferred to a 6-well culture vessel. After incubation for 4-5 days in a 37° C. 5% CO 2 cell incubator, when grown to about 80%, cells were obtained by treating with 0.05% trypsin/1mM EDTA (GIBCO-BRL), and then transferred to a T175 culture container for low cell density. The cells were passaged.
  • ROS stress induced in cell culture of high density can be effectively improved by antioxidant treatment, and the cell proliferation ability of mesenchymal stem cells can be restored.
  • it has a feature of significantly shortening the passage of cells and maintaining a characteristic of mesenchymal stem cells in which a single colony mesenchymal stem cell in a fresh state without progression can be rapidly and stably obtained.
  • low-density cell culture can obtain a large number of cells in a short time, simplifying the manufacturing process as well as aging, which maintains the characteristics of mesenchymal stem cells intact even in long-term culture. It was confirmed that it is possible to obtain cells in a non-stationary state, thereby enabling production of high-quality stem cells.
  • stem cells obtained through the improvement method constructed through the above example were used.
  • Example 4 Improvement Layer separation Through culture Obtained Confirmation of the effect of stem cells on atopic dermatitis treatment
  • GCM-MSC Stem cells obtained through a density gradient centrifugation method (GCM) using Ficoll-Hypaque used for obtaining conventional stem cells and improved layer separation culture method
  • SCM-cMSC monoclonal stem cells
  • mice After 20 days of sensitization, atopic dermatitis was administered to the mice three times at two-day intervals through the caudal vein at the dosages shown in Table 7 below, Cell vehicle, GCM-MSC, and SCM-cMSC. Five normal mice that did not cause atopic dermatitis were set as normal controls.
  • SCM-cMSC and GCM-MSC were administered to the atopic dermatitis-causing animal model prepared in Example 4.1 in the same protocol as above, and after 59 days, changes in skin lesions were confirmed and the results are shown in FIG. 27.
  • the dorsal tissue of the atopic dermatitis model was fixed at 4° C. for 24 hours by treatment with 10% formalin, and it was fixed to paraffin by incision and dehydration treatment.
  • the 4 ⁇ m-thick cut surface was placed on a slide, and stained with H&E solution for 8 minutes, washed with alcohol, and the thickness and inflammatory infiltration of the epidermis and dermis were confirmed.
  • the thickness of the epidermis and dermis was checked using CaseViewer 1.4 software (3DHISTECH, BU, Hungary) at 200 times magnification. After this, toluidine blue staining was performed after skin tissue treatment in the same manner as H&E, and staining was performed for 2-3 minutes in a working solution, followed by washing and dehydration.
  • Table 8 and FIGS. 28 to 30 The results of visual observation and tissue staining as described above are shown in Table 8 and FIGS. 28 to 30.
  • the SCM-cMSC treated group suppressed the increase in the thickness of the epidermis and dermis caused by atopic dermatitis up to 1.5 times compared to the Cell vehicle, and this effect was 1.4 compared to the GCM-MSC treated group. It was confirmed that it exhibited a remarkable improvement effect compared to the GCM-MSC treated group, showing a fold and a 1.3-fold inhibitory effect.
  • IgE and IgG1 production was measured and compared by ELISA in 4 groups of the donors to confirm the effect of treating atopic dermatitis.
  • microwell plates were coated with 100 ⁇ l/well of capture antigen diluted in coating buffer, the plates were sealed and incubated overnight at 4°C. The wells were aspirated, washed with a wash buffer, and the plate was turned over and the remaining buffer was removed after washing. The plate was blocked with 200 ⁇ l/well Assay Diluent and incubated for 1 hour at room temperature. After washing, each experimental group was transferred to an appropriate plate.
  • the sealed plate was incubated at room temperature for 2 hours, washed again, and then 100 ul of Working Detector (Detection Antibody and Sav HRP reagent) was added to further incubate at room temperature for 1 hour. After adding 100 ⁇ l of the substrate solution to each well, the plate was incubated at room temperature in a dark environment for 30 minutes without plate sealing and 50ul of the termination solution was added. Absorption was confirmed at 450 nm within 30 minutes of the termination reaction, and 570 nm absorbance was subtracted from the 450 nm absorbance value. The results confirming the effects of IgE and IgG1 production are shown in FIG. 31.
  • IgE and IgG1 production induced by atopic dermatitis was markedly decreased by administration of SCM-cMSC. This reduction effect was found to be remarkably superior compared to GCM-MSC.
  • the production of IgG2a was found to be significantly superior to that of the GCM-MSC treated group in SCM-cMSC, and was confirmed to increase by about 3 times or more compared to the atopic dermatitis model group (vehicle).
  • the reaction was performed in StepOnePlus RealTime PCR System (Applied Biosystems), and PCR was performed on the following conditions for a total of 20 ml: denaturation; Amplification at 94.1° C. for 5 minutes; 25 cycles for GAPDH, 30s at 94.1°C, 30s at 58.1°C and 30s at 72.1°C, elongation; 10 minutes at 72°C. Thereafter, 1 ⁇ l of each sample was placed on an agarose gel, stained with ethidium bromide, and visualized with ultraviolet light. The expression of each target gene was normalized to GAPDH, and the results are shown in FIG. 33.
  • the information of the primer used in the experiment is as follows.
  • IL-4 increased in the axillary lymph nodes of the atopic dermatitis model was decreased according to GCM-MSC and SCM-cMSC treatments, and the best reduction effect was confirmed by SCM-cMSC treatment. In addition, it was confirmed that the level of reduced IFN- ⁇ in the atopic dermatitis model was significantly increased by SCM-cMSC treatment.
  • the cMSC obtained by the improved layer separation culture method through Examples 2 and 3 is obtained in an aging cell state that maintains the characteristics of mesenchymal stem cells even in long-term culture, and the cMSC obtained by the improved layer separation culture method has a conventional density It was confirmed through Example 4 that it shows a remarkably excellent atopic dermatitis treatment effect compared to GCM-MSC, which is a stem cell obtained by gradient centrifugation. Accordingly, an additional experiment to confirm whether cMSC obtained by the improved layer separation culture method including the low density culture step shows a difference in the effect of treating atopic dermatitis compared to cMSC obtained by the conventional layer separation culture method including the high density culture step was performed.
  • the cell culture density was 100, 1000 cells/cm 2 when passaged, and monoclonal mesenchymal stem cells were obtained using a-MEM medium containing an antioxidant. Did. Gentamicin was added as an antibiotic, and was performed with ⁇ -MEM culture (see Table 5).
  • stem cells obtained through an improved layer separation culture method with low density and antioxidant conditions of 100 or 1000 cells/cm 2 or less were designated as “cMSC1”.
  • the stem cells obtained by the improved layer separation culture method which are cultured with a culture method of density of 4000 cells/cm 2 or more at passage and culture without additives in the passage.
  • cMSC2 a culture method of density of 4000 cells/cm 2 or more at passage and culture without additives in the passage.
  • mice used for the atopic dermatitis test were supplied by SLC, Inc (Shizuoka, Japan) as SPF (specific pathogen-free) BALB/c mice (15 ⁇ 20g) of female 6 weeks old, and acclimation period in the animal room for 1 week After the experiment was conducted.
  • SPF specific pathogen-free
  • BALB/c mice 15 ⁇ 20g of female 6 weeks old, and acclimation period in the animal room for 1 week After the experiment was conducted.
  • the Inha University College of Medicine, Life Science Research Institute was raised 5 mice in a cage for mouse under 150 ⁇ 300Lux lighting in alternating temperature of 22 ⁇ 25°C, humidity of 40 ⁇ 60%, and 12 hours of day and night, so that they could freely consume sterile distilled water and solid feed.
  • the breeding environment was maintained and experiments were conducted.
  • Ovalbumin (OVA) 50 ⁇ g/50 ⁇ l (PBS) and Alum Adjuvant 4 mg/100 ⁇ l were mixed in 7-week-old female BALB/c mice and administered intraperitoneally and subcutaneously three times a week for 3 weeks to induce sensitization of atopic dermatitis. When administered to the same site all three times, it was administered to different sites because it can cause inflammation irrelevant to the disease. After 3 weeks of OVA administration, 1.2x1.2cm size sterile gauze soaked with OVA 60 ⁇ g/60 ⁇ l (PBS) was attached to the back of the skin for 2 weeks 2-3 times a week to induce atopic dermatitis.
  • OVA Ovalbumin
  • PBS 1.2x1.2cm size sterile gauze soaked with OVA 60 ⁇ g/60 ⁇ l
  • PBS single clonal stem cells obtained through a layer separation culture method were obtained by varying cell densities such as 100cells/cm 2 , 1000cells/cm 2 , 4000cells/cm 2 in the step 2 after passage. And inject it through the vein 3 times in a total of 2 days. Dose is administered three times, a total of 1.0x10 6 / 600 ⁇ l vein by per 3.3x10 5 / 200 ⁇ l.
  • the lesion site was epilated again, followed by epilation of 1.2x1.2cm sterile gauze with a size of 1.2x1.2cm moistened with OVA 60 ⁇ g/60 ⁇ l (PBS) and attached to the skin 3-4 times a week for 2 weeks to atopy the topical area.
  • PBS OVA 60 ⁇ g/60 ⁇ l
  • the experimental animals are calibrated with a restrainer at 13 to 14 days, and then administered through the vein using a 1 ml syringe of BD company equipped with a 26 1/2gauge needle. Animals of the group Veh. are administered intravenously with PBS instead of the test substance. Naive, Veh. Except the group, the test substance is suspended in PBS and administered intravenously. Both PBS and test material were administered at the same amount of 200 ⁇ l/head.
  • Blood samples for confirming the effect on atopic dermatitis were obtained in the following manner. All experimental animals were anesthetized with isoflurane on the 13th day after administration of the cell stabilizer or test substance, and then the abdominal incision was exposed to expose the posterior vena cava, and then about 700 ⁇ l was collected using a 1 ml syringe. The collected blood is contained in a Serum separate tube and the serum is separated after centrifugation at 3,000 rpm/15 minutes at 4°C, and the separated serum is stored in a 1.5 ml e-tube and stored in a -70°C deep freezer.
  • IgE level in blood was performed by first collecting blood collected through the posterior vena cava in EDTA tube and centrifuging for 3,000 rpm/15 minutes to separate only the supernatant and storing it at -70°C until the experiment.
  • the capture antibody capable of recognizing IgE on the ELISA plate was stored overnight at 4°C with a coating buffer, and after blocking for 1 hour the next day, the serum was diluted 100-fold, and reacted at room temperature in an amount of 50 ⁇ l for 2 hours. Then, a secondary antibody recognizing IgE was added, followed by TMB solution, which is a substrate buffer, reacted for about 15 minutes, and then 50 ⁇ l of a stop solution was added. For the measurement, the value was measured in a 450 nm filter using an ELISA reader.
  • Skin tissues extracted at the end of the experiment were fixed in a 4% formalin solution, and then tissue sections were made to stain Hematoxylin & Eosin (H&E) and toluidine blue staining to stain infiltrated mast cells in the dermis.
  • H&E Hematoxylin & Eosin
  • the dyed tissue was measured for the thickness of the dermis and epidermis under 200 times the optical microscope, and the sensitization of inflammatory cells and mast cells under 100 times was measured. Measurement of skin thickness and mast cells was performed using the PAINT.NET program.
  • Real-time PCR was performed using SYBR FAST qPCR master mix that specifically binds to double DNA. Samples were prepared to have a volume of 20 ⁇ l with 5 ⁇ l of cDNA, 10 ⁇ l of qPCR master mix (2X), 1 ⁇ l of specific target primer, and 4 ⁇ l of DW. PCR was conducted in a total of 45 cycles, and the ratio of target gene correction with GAPDH was quantified.
  • Example 4.3 it was confirmed that the administration of SCM-cMSC has a superior IgE inhibitory effect in the animal model of atopic dermatitis compared to the administration of GCM-MSC. Accordingly, ELISA analysis was performed to confirm whether the IgE inhibitory effect was different in the serum due to the difference in density among stem cells obtained by the layer separation culture method. More specifically, the atopic dermatitis animal model prepared in Example 5.2 was sacrificed at D-59 time point, and serum was obtained from blood collected through posterior vein at the time of sacrifice to perform IgE ELISA analysis. The results are shown in Figure 37.
  • cMSC1 and cMSC2 administration groups showed an IgE inhibitory effect compared to the Vechicle treatment group, but cMSC1 (100, 1000 cells/cm 2 ) experimental group by an improved layer separation culture method including a low density culture step In the high-density culture cMSC2 compared to more excellent IgE inhibitory effect was confirmed.
  • This is a result showing that the monoclonal stem cells obtained by culturing at a low density can lower the IgE level more remarkably, thus exhibiting an excellent effect on atopic dermatitis.
  • PBC alone (Vechicle), cMSC1 (100, 1000 cells/cm 2 ), and cMSC2 were applied to a total of 7 atopic dermatitis mice prepared in Example 5.2, and the degree of recovery of atopic skin symptoms at the skin lesion site was visually confirmed. .
  • the degree of wound, erythema and keratin in the back area caused by atopic dermatitis was compared and confirmed, and the thickness change of the skin epidermis was confirmed by H&E staining and the results are shown in FIGS. 38 and 39.
  • cMSC1 obtained through an improved process can show a better anti-inflammatory effect compared to monoclonal stem cells obtained through a conventional density gradient layer separation culture method, and thus improved atopy. It was confirmed that it can exhibit an effect of improving dermatitis.
  • stem cells cMSC1 obtained by an improved layer separation culture method comprising a low density culture step
  • atopic dermatitis improvement compared to stem cells cMSC2 obtained by a layer separation culture method comprising a high density culture step It was confirmed that it can exhibit an effect.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

본 발명은 개선된 줄기세포의 층분리 배양을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 및 이의 제조방법, 이를 이용한 아토피 피부염 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개선된 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포는 아토피 피부염 치료 효과가 증대된 줄기세포인 바, 아토피 피부염 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 개선된 줄기세포의 층분리 배양을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 및 이의 제조방법, 이를 이용한 아토피 피부염 치료 방법에 관한 것이다.
아토피성 습진으로도 알려진 아토피 피부염(Atopic dermatitis, AD)은 매우 흔한 염증성 피부 질환으로, 급성 아토피 피부염의 발병 기전은 CD4+T 세포 및 호산구의 피부 침투, 면역 글로불린 E(IgE) 및 Th2 사이토카인의 분비 증가를 매개로 하는 Th2 염증반응과 관련된다는 보고가 있다. 아토피 피부염은 심한 가려움증과 피부건조증 등의 증상을 동반하고, 아토피는 혈액 내에서 높은 IgE 발현량을 나타내며 호산구의 증가와 같은 특징을 가진다. 최근 아토피 피부염은 전체 인구의 약 10 내지 20%에서 발병하고 있는 것으로 추산되고 있으나, 완치시킬 수 있는 뚜렷한 치료법이 없는 실정이고 특히 5세 이하의 어린 나이에 대부분 진단되며 이 중 50%는 6개월에서 24개월 사이에 진단된다. 대한 소아알레르기 호흡기학회에서 시행한 전국 역학 조사에서 최근 10년간 아토피 피부염의 유병률이 점차 증가하고 있어, 이에 대한 사회적 관심이 높아지고 있다. 아토피 피부염 환아의 50 내지 75% 에서 천식, 비염으로 진행하는 알레르기성 질환의 경과를 보이기 때문에 알레르기로 진행의 시작점인 아토피 피부염을 조기에 진단하고 관리하는 것이 성인 알레르기 진행의 예방에 매우 중요하다.
아토피 피부염은 T 림파구의 활성화, 사이토카인 체계의 이상, 세포 매개성 면역의 감소, IgE의 증가와 같은 면역학적 이상과 생리학적 요인 그리고 피부의 생화학적 결함과 같은 많은 요소로 인해 야기된다. 이러한 아토피 피부염을 치료하기 위해서는 건조된 피부의 보습을 비롯하여 대표적으로 스테로이드와 같은 약물을 이용한 치료가 필요하다. 아토피 피부염의 치료제로서 증상이 경한 경우에는 보습제 국소 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 및 국소 면역반응 조절제 등을 사용한다. 중증의 아토피 피부염인 경우에는 전신 스테로이드제나 면역억제제를 사용하게 되는데, 장기간 사용할 경우 부작용이 있으며, 약 복용을 중단하면 병변의 재발 가능성이 높으므로 장기적으로 사용하여도 안전하고 효과적인 치료법이 요구된다.
최근 다양한 염증성 질환의 치료에 줄기세포를 이용하고자 하는 시도들이 진행되고 있다. 줄기세포는 우리 몸의 210여개 모든 기관의 조직으로 성장할 수 있는 잠재적 능력을 갖고 있고, 무한히 분열할 수 있으며 적절한 조작을 통해 원하는 장기로 분화할 수 있다.　이와 같은 줄기세포의 특성 때문에 줄기세포는 새로운 치료제로 각광받고 있으며, 줄기세포를 이용한 난치병의 치료가능성은 대단히 높아 백혈병, 골다공증, 간염, 파킨슨씨병, 노인성 치매, 화상 등 수많은 질병 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다.
그러나 줄기세포의 경우, 이를 대량으로 수득하기 어렵다는 점에서 여전히 많은 제약사항이 있다. 줄기세포를 수득하는 방법으로 냉동 배아세포에서 얻는 방법이 효율적이라고 할 수 있지만 윤리적인 면에서 아직도 많은 논란이 있다. 이와 같은 문제점을 해소하기 위하여 체세포 핵 이식 방법이나 성체 줄기세포를 이용하여 줄기세포를 수득하는 방법 역시 많은 연구가 진행되었다. 배아줄기세포에 대한 연구보다 활발히 행해지는 분야는 성체줄기세포 연구이다.　성체줄기세포는 중추신경계나 골수 등 각종 장기에 남아 성장기의 장기발달과 손상시의 재생에 참여하는 세포로 각종 장기에 존재하기 때문에 골수, 비장, 지방세포 등을 포함한 여러 부위에서 얻을 수 있으나 골수에서 얻는 방법이 가장 흔히 시행된다.　그러나 많은 여러 종류의 골수세포들 중에서 중간엽 줄기세포들을 분리, 배양하는 데 있어 항상 균일한 형태의 세포를 얻는 데는 어려움이 있어 이러한 문제점들을 보완하기 위한 연구가 행해지고 있다.
본 발명자는 신규한 층분리 배양법이라고 명명된 줄기세포의 분리방법을 발명한 바 있으며, 대한민국 특허출원 KR 10-2006-0075676 호를 통해 특허 출원하고 이를 등록 받았다. 상기 층분리 배양법은 다른 방법에 비해 적은 비용으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 오염 문제가 없으며 타 줄기세포가 섞일 염려 없이 클로날 중간엽 줄기세포(cMSC)를 효과적으로 얻을 수 있다는 점에 있어서 다른 줄기세포 수득 방법에 비해 탁월한 우수성을 가지고 있다. 그러나 상기 방법의 우수성에도 불구하고, 층분리 배양법은 중간엽 줄기세포를 대량 생산하여 최종 산물로 사용하기 위해서는 워킹 셀 뱅크를 제조하고, 이를 통해 최종 산물을 수득하는 공정을 거쳐야 충분한 양의 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있으며 최소 10 계대(Passage) 이상의 배양이 필요하다는 점에서 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포 집단 수득이 어려운 한계점이 있었다.
따라서, 염증성 질환, 특히 아토피 피부염을 치료하기 위하여 줄기세포를 이용하는 것은 아직까지 다양한 한계점을 가지고 있으며, 효과적으로 아토피 피부염을 치료하기 위한 줄기세포 제조법 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료 방법에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 층분리 배양법의 개선을 통해 줄기세포의 빠른 증식을 유도하기 위한 연구를 하던 중, 배양 세포 밀도를 낮게 조절하고 항산화제를 첨가하여 배양하는 개선된 층분리 배양법을 이용하는 경우, 적은 계대 배양만으로도 효과적인 세포 증식률 증가를 유도할 수 있고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포가 종래 층분리 배양 방법의 줄기세포 대비 매우 현저한 아토피 피부염 치료 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 기존의 층분리 배양법을 개선한 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방, 치료 및 개선용 조성물 및 이의 제조방법, 이를 이용한 아토피 피부염 예방, 치료 및 개선 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 및 6) 상기 단일 클로날 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 개선된 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법에 따르면, 단일 클로날 줄기세포의 빠른 증식을 통해 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포의 대량 수득이 가능하고, 이를 통해 수득되는 단일 클로날 중간엽 줄기세포는 아토피 피부염 치료 효과가 증대된 줄기세포인 바, 아토피 피부염 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 골수로부터 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 분리하는 종래 층분리 배양법을 나타낸 도이다.
도 2는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 세포 크기 및 입도(granularity)의 변화를 유세포 분석기(Flow cytometry; FACS) 분석을 통해 전방산란(forward scatter; FSC) (A) 및 측방산란(side scatter; SSC) (B)광의 평균값으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 4는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양을 달리한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 베타 갈락토시다아제 (베타 gal)의 활성도를 염색을 통해 세포의 노화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 계대 15 (Passage 15; P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하여 배양한 후 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식능을 세포군 배가 시간(Population Doubling Time; PDT) 및 세포수 증식 수준(population Doubling Level; PDL)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 7은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 분화능력을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005). 도 7의 A는 세포 배양 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 Oil red O 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며 도 7의 B는 A의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다. 도7의 C는 세포배양 및 세포 계대 배양에 따른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 골화 세포로의 분화능을 Alizarin red S 조직학적 염색을 통하여 확인한 결과이며, 도 7의 D는 C의 조직학적 염색 정도를 정량화하여 나타낸 도이다.
도 8은 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따라 단일 클로날 중간엽 줄기세포에서 생산되는 총 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생산 (A) 및 이에 따른 DNA 손상을 comet assay를 통해 확인 (B) 한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 9는 세포 배양 밀도 및 세포 계대 배양에 따라 생산되는 활성산소종에 의한 DNA 손상 정도를 확인하기 위하여 8-옥소-데옥시구아노신(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine; 8-OHdG) 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 10은 계대 11(P11) 내지 15(P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+ 아스코르브산(항산화제의 일종) 추가(HD+AA)를 통해 배양한 후 세포 증식능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 계대 15(P15)의 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 고밀도 조건 단독(HD) 또는 고밀도 조건+ 아스코르브산 추가(HD+AA)로 배양한 후, 생산되는 활성산소종 수준을 비교한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).
도 12a 는 종래 층분리 배양법 및 개선된 층분리 배양법 실험 방법을 비교하여 나타낸 도이다.
도 12b 는 개선된 층분리 배양법의 모식도로, 종래 층분리 배양법과 상이한 계대 2 이후에 해당하는 저밀도 배양을 나타낸 모식도이다.
도 13 내지 도 20 은 층분리 배양법을 통해 수득된 SCM01 내지 SCM08 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 1000 또는 4000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 밀도로 접종하고 항산화제 첨가 유무를 달리한 LG-DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, low glucose), α-MEM(Minimum Essential Medium α) 배양 배지를 이용하여 배양한 세포의 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 각 도의 A는 각 실험군의 계대 1(P1) 내지 계대 5(P5)에 따른 세포 수의 변화를, 각 도의 B는 각 실험군의 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL) 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 항산화제가 첨가되지 않은 LG-DMEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 항산화제가 첨가된 α-MEM 배지를 이용하고, 1000 또는 4000 세포/cm 2 밀도로 세포 밀도만을 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 세포 밀도를 1000 세포/cm 2 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM으로 달리한 실험군에서의 세포 증식률을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 세포 밀도를 1000 세포/cm 2 밀도로 고정하고, 배양 배지를 LG-DMEM 또는 α-MEM로 달리한 실험군에서의 PDT 및 PDL을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 27 은 아토피 피부염 동물 모델에서 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 투여에 따른 피부 병변의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 아토피 피부염 동물 모델에서 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 투여에 따른 피부 병변의 변화를 H&E 및 톨루이딘 블루 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 아토피 피부염 동물 모델에서 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 처리에 따른 표피 두께 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P=0.0152, **P=0.0016)
도 30은 아토피 피부염 동물 모델에서 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 처리에 따른 진피 두께 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P=0.0003).
도 31은 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 처리에 따른 IgE, IgG1 생산량 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (IgE- P**=0.009, IgG1- P*=0.0432).
도 32는 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 처리에 따른 IgG2a 생산량 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (P****<0.0001).
도 33은 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 처리에 따른 액와림프절에서의 IL-4, IFN-γ 생산량 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P=0.0008, P*=0.0338).
도 34는 대조군(Cell Vehicle, veh), GCM-MSC, SCM-cMSC 처리에 따른 비만 세포수 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다(P**=0.0026, 0.0036).
도 35는 아토피 피부염 동물 모델에서 대조군(Cell Vehicle, veh), cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2), cMSC2 (4000 세포/cm 2) 투여에 따른 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 36은 아토피 피부염 동물 모델에서 cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2), cMSC2 (4000 세포/cm 2) 투여에 따른 세포 생존률 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 37 은 아토피 피부염 동물 모델에서 정상 대조군 (naive), 대조군(Cell Vehicle, veh), cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2), cMSC2 (4000 세포/cm 2) 투여에 따른 총 IgE 생산량 변화를 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (1way ANOVA - Tukey's multiple comparisons test ****P<0.0001 ***P=0.0001 *P=0.0238 compared to Veh. Unpaired t test - #P=0.0336 compared to 100 세포/cm 2 group).
도 38은 아토피 피부염 동물 모델에서 정상 대조군 (-), 대조군(PBS, veh), cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2), cMSC2 (4000 세포/cm 2) 도포에 따른 피부 병변의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 39는 아토피 피부염 동물 모델에서 정상 대조군 (-), 대조군(PBS, veh), cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2), cMSC2 (4000 세포/cm 2) 도포에 따른 표피 비후 완화 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 개선된 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 상기 단일 클로날 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 중간엽 줄기세포의 개선된 층분리 배양 및 증식 방법을 통해 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 유효성분인 단일 클로날 줄기세포는 줄기세포를 빠르고 오염없이 수득할 수 있는 층분리 배양법의 장점에 더하여, 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 빠른 증식을 통해 WCB (Working Cell Bank) 제조 단계 없이도 단시간에 원하는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있는 개선된 층분리 배양방법을 통해 수득되는 줄기세포이다. 상기의 방법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 종래 층분리 배양방법을 통해 수득되는 줄기세포와 비교하여 아토피 피부염 치료 효과가 증대된 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 2) 및 3) 단계의 배양은 30 내지 40℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양하고, 반복 배양은 30 내지 40℃에서 4시간 이하, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 배양 후, 30 내지 40℃에서 12 내지 36시간, 바람직하게는 18 시간 내지 30시간 배양을 2 내지 3회 반복하고, 이어서 30 내지 40℃에서 24 내지 72시간, 36시간 내지 60시간, 바람직하게는 36시간 내지 60시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 수행할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 분리한 방법을 간단히 요약하면 다음과 같다.　
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000001
배양한 세포들은 단일 클로날 세포군을 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 분리한 후 계대 배양을 수행할 수 있으며 본 발명은 종래 층분리 배양 방법에 더하여 5) 단계의 계대 배양 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어, "층분리 배양(Subfractionation Culturing Method, SCM)" 은 줄기세포를 비중에 따라 분리하는 방법을 의미하며, 먼저 사람 골수를 추출하여 세포 배양액에 배양한 후, 상층액만 수득하여 이를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기로 옮겨 배양한 후, 동일 과정을 몇 차례 반복하는 공정을 말한다. 이와 같은 층분리 배양은 원심분리 과정 없이 상층액을 반복적으로 수득하여 배양하는 공정을 반복하는 것을 특징으로 하며, 최종적으로 다른 세포의 오염없이 단일 클로날 줄기세포, 바람직하게는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 1) 내지 5) 단계 중 1) 내지 4) 단계는 KR 10-2006-0075676호 또는 KR10-2014-0170045호에 기재된 층분리 배양 방법과 동일 또는 동등하게 수행될 수 있고, KR 10-2006-0075676호는 본 발명에 전체로서 참고될 수 있다.
또한 종래 KR10-2014-0170045호에서는 아토피 피부염 치료와 관련하여 세포를 얻는 방법으로 (i) 골수 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 샘플을 제 1용기에 배양하여 상층액을 수득하는 단계; (ii) 제1용기의 상층액을 제 2용기에 옮기는 단계; (iii) 상기 제 2용기에 존재하는 세포를 배양하여 상층액을 수득하는 단계; (iv) (ii) 및 (iii) 단계를 3회 이상 반복하는 단계; (v) 단일 세포 유래 콜로니를 분리하는 단계; 및 (vi) 상기 콜로니로부터 성장 배지로 세포를 옮기고, 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 층분리 배양법을 통하여 수득한 클로날 줄기세포를 수득하고 이를 이용한 아토피성 피부염 예방 또는 치료 방법을 개시하고 있으며, 이는 원심분리 없이 밀도차이만으로 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 방법이라는 점에서 KR 10-2006-0075676호의 종래 층분리 배양방법을 이용한다.
그러나, 상기 KR 10-2006-0075676호 및 KR10-2014-0170045호의 층분리 배양 방법은, 단일 클로날 줄기세포를 낮은 계대에서 효과적으로 수득하고, 이를 통해 아토피 피부염 치료 효과가 현저하게 개선된 단일 클로날 줄기세포를 얻기 위한 방법을 개시하고 있지 않다.
종래 층분리 배양방법은 도 1에서 확인되는 바와 같이 단일 콜로니로부터 얻어진 모든 세포를 6웰로 이동시켜 80-90% 컨플루언시 (confluency) 로 증식시킨 후, 증식된 상태의 계대 1(P1) 세포들을 seed cell 로 하여 밀도 조절에 대한 인식 없이 많은 세포를 수득하기 위하여 4000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 로 고밀도 배양을 수행한다.
반면 본 발명은 계대 2 이후의 배양에서 세포 밀도를 조절함으로써 아토피 피부염 예방, 치료, 개선 효과가 우수한 줄기세포를 효과적으로 수득할 수 있음을 기초로 한 “개선된 층분리 배양 방법” 에 관한 것이며, 종래 층분리 배양방법과 seed cell 이후 배양 단계를 달리하는 것을 특징으로 한다. 예컨대 구체적으로 '5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계'를 포함한다. 개선된 층분리 배양 방법은 종래 층분리 배양 방법 대비 빠른 단일 클로날 줄기세포의 증식을 유도할 수 있으므로, 최종 산물을 빠르게 수득할 수 있으며, 바람직하게는 P2 내지 P8 과 같은 계대 10 미만의 배양만으로도 MCB (Master Cell Bank) 를 제조하고, 우수한 아토피 피부염 예방 또는 치료 효과를 나타내는 단일 클로날 줄기세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 단일 클로날 줄기세포는 기존의 공정과 같이 4000 세포/cm 2의 고밀도로 배양되는 경우 세포 증식능이 현저하게 감소하고 중간엽 줄기세포의 마커가 변화되고, 줄기세포의 분화능이 상실될 수 있다. 따라서 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포는 저밀도 내지 중간 정도의 밀도, 4000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 미만의 낮은 세포 밀도, 예컨대 3000 세포/cm 2 이하, 바람직하게는 2000 세포/cm 2 이하, 더욱 바람직하게는 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 세포 밀도로 배양된 것을 의미할 수 있다.
1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 이하의 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우, 세포의 증식능은 4000 세포/cm 2같이 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여 장기간의 배양기간 내내 현저히 높게 유지되므로, 많은 계대를 반복하지 않아도 원하는 양의 대량 단일 클로날 세포를 빠르게 수득할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 개선된 층분리 배양방법은 seed cell 이후의 계대 배양 단계를 계대 10 미만, 바람직하게는 계대 8 이하로만 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 종래 층분리 배양방법이 충분한 수의 세포를 확보하기 위해 최대 25계대까지 배양해야 했었던 것과 비교하여 적은 계대 배양만으로도 단일 클로날 줄기세포의 대량 생산이 가능한 장점이 있다.
또한 상기 세포 밀도로 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우 해당 세포는 DNA 손상이 적으며, 노화가 억제되어 줄기세포의 분화능을 효과적으로 유지할 수 있는 장점이 있어 빠르고 신속하게 우수한 줄기세포 특성을 갖는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다.
또한 본 발명의 방법에 따라 수득되는 단일 클로날 줄기세포는 4000 세포/cm 2같이 고밀도로 배양된 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 우수한 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낸다.
본 발명에 사용되는 배지는 항산화제를 포함하지 않는 배지, 상기 배지에 항산화제가 추가된 배지 또는 항산화제를 포함하는 배지를 모두 포함할 수 있다.
항산화제를 포함하지 않는 배지로는 이에 제한되는 것은 아니나 DMEM 배지를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 상기 배지에 항산화제를 더 추가하여 배양을 수행할 수 있다. 또한 필요에 따라 항산화제가 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 배양을 수행할 수 있다.
본 발명의 항산화제는 세포 배양에 사용될 수 있는 항산화제를 제한 없이 포함할 수 있으며, 글루타리온( Glutathione ), 시스테인(Cysteine), 시스테아민(Cysteamine), 유비퀴놀(Ubiquinol), 베타-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol) 및 아스코르브산(Ascorbic acid; AA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 항산화제가 배지에 추가되는 경우, 상기 항산화제는 10 내지 50, 바람직하게는 10 내지 30, 더욱 바람직하게는 25μg/ml의 농도로 추가될 수 있다.
본 발명의 일 예에서는 항산화제를 포함하지 않는 배지로 DMEM, 더욱 바람직하게는 LG-DMEM 배지를 사용하며, 항산화제로 아스코르브산을 포함하는 배지로 α-MEM 배지를 사용한다.
한편 본 발명의 방법에 따르면 단일 클로날 줄기세포를 매우 효과적으로 증식할 수 있으므로, MCB를 이용하여 WCB (Working Cell Bank)를 제조하는 공정이 생략될 수 있다. 이는 기존의 층분리 배양법이 MCB 제조 후 WCB를 제조하는 공정을 수반해야 하는 것과 비교하여 공정을 단순화한 것이다.
본 발명의 배양 배지로 항산화제를 포함하는 배지를 이용하는 경우, 상기 배양 배지에는 항생제로 젠타마이신이 추가될 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 수득된 중간엽 줄기세포는 최종적으로 바람직하게는 P2 내지 P10 미만의 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 P2 내지 P8의 중간엽 줄기세포, 더욱 더 바람직하게는 P2 내지 P6의 중간엽 줄기세포일 수 있다.
이는 최소 P10 내지 P12의 중간엽 줄기세포가 최종 산물로 수득되는 기존의 공정 대비 더 낮은 계대에서 수득되는 줄기세포이며, 세포 접종 밀도 조절을 통해 낮은 계대에서 빠르게 증식된 중간엽 줄기세포를 손쉽게 대량 수득할 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기와 같은 개선된 층분리 배양법, 바람직하게는 2000 세포/cm 2 이하, 더욱 바람직하게는 1000 세포/cm 2 이하의 저밀도 및 항산화 조건의 개선된 층분리 배양법 방법으로 수득된 단일 클로날 줄기세포 (이하, 'cMSC1' 또는 'SCM-cMSC 로 표기) 는 종래 층분리 배양법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포 (이하 'cMSC2' 로 표기)와 비교하여, 세포 크기가 더 작고 균질하게 형성될 수 있으며, 아토피 피부염이 유발된 피부 진피 또는 표피의 비후를 완화시키고, IgE, IgG1 및 IL-4 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생성을 억제하며, INF-γ 의 생성을 촉진하고, 비만 세포를 억제하는 효과가 우수하다.
본 발명에 있어 “아토피 피부염” 이란 태열을 포함할 수 있으며, 피부 건조증 및 가려움증을 주 증상으로 하는 피부의 알레르기 질환을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포는 아토피 피부염이 유발된 피부에서 나타나는 경피, 진피의 비후 및 각질 증상을 효과적으로 완화할 수 있으며, 특히 진피 또는 표피의 비후를 완화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포는 아토피 피부염에서 유발되는 각종 면역, 염증 인자들을 개선할 수 있으며, 바람직하게는 IgE, IgG1 및 IL-4 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생산을 억제하고, INF-γ 의 생성을 촉진하는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포는 알레르기 반응을 유발하는 세포를 억제할 수 있으며, 바람직하게는 비만 세포를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 얻어지는 단일 클로날 줄기세포인 cMSC1 또는 SCM-cMSC 는 종래 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 수득되는 줄기세포 (GCM-MSC) 뿐만 아니라 종래 층분리 배양법에 의해 수득되는 cMSC2 와 비교하여도 아토피성 피부염과 관련된 조직학적, 생리학적 인자들의 개선 효과가 우수한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이식에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 1일 1 mg/kg 내지 1,000 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함되며, 상기 약학적 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포 수득하는 단계; 및 6) 상기 단일 클로날 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어, 상기 '개체'는 아토피 피부염 예방 또는 치료가 필요한 개체를 포함하며, 포유류 또는 인간을 제외한 포유류일 수 있다.
본 발명의 단일 클로날 줄기세포를 개체에 투여하는 경우, 당 분야에 공지된 아토피 피부염 예방 또는 치료 약물과 병용하여 투여할 수 있으며, 허가 또는 인체에 무해한 것으로 확인된 당 분야의 공지된 줄기세포 치료제 부형제와 함께 제형화된 형태로 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm2 (cells/cm2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 상기 줄기세포 이외에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 줄기세포는 0.01 내지 15중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 아토피 피부염을 치료하기 위하여, 상기 줄기세포 또는 이의 배양액을 적당히 희석하여 피부에 직접 도포할 수도 있으며, 본 발명의 피부질환 치료용 약학적 조성물이 환부에 효과적으로 적용될 수 있도록 연고제로 제조할 수 있다. 상기 연고제는 본 발명의 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물을 무기물질과 배합한 다음, 이를 지용성 기제로 코팅하여 제조한다. 상기 무기물질은 항균성, 소염효과, 표피재생 효과 등이 우수한 소재를 사용하는 것이 바람직하고, 이들의 구체적인 예로는 산화아연, 탄산아연, 산화철 등이 있다. 또한, 수용성 물질인 본 발명의 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물을 안전하게 함침 할 수 있는 세라믹 담체를 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세라믹 담체로는 제올라이트, 활석, 석고, 모려분 및 이들의 혼합물이 바람직하게 사용된다. 이러한 세라믹 담체는 수용성 성분의 함침성이 우수하여 피부에 수용성 성분의 공급을 원활히 할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
본 발명의 조성물을 아토피 피부염의 예방 또는 개선, 치료를 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다. 본 발명의 의약외품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 크림제, 로션제, 에어로졸제, 샴푸제, 젤제 또는 팩제의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 크림제ㆍ연고제ㆍ샴푸제ㆍ젤제 또는 팩제의 경우에 있어서는, 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 아디프산디이소프로필, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제 등이 있다.
에어로졸제의 경우에 있어서는, 연고제, 크림제, 겔제, 현탁제, 유제, 액제 및 로션제 등의 조제에 사용되는 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 아디프산디이소프로필, 세바크산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 추가로 각종 안정제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제, 방향제, 보존제, 용해 보조제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 또한, 필요에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계; 2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계; 3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계; 4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및 5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 종래 층분리 배양법으로 수득되는 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 탁월한 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 단일 클로날 줄기세포를 WCB 제조없이 빠르고 손쉽게 수득할 수 있으며, 상기 조성물은 약학, 식품, 의약외품, 및 화장료 조성물을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2 ) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 치료방법 및 제조방법에 있어, 상기에서 조성물에서 기술된 내용이 동일하게 적용될 수 있으며, 중복되는 내용은 명세서 기재의 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되지는 않는다.
< 실시예 1> 개선된 층분리 배양법의 확립
아토피 피부염에 우수한 효과를 나타내는 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 제조하기 위하여 개선된 중간엽 줄기세포 층분리 배양법 및 증식 방법을 이용하였다. 개선된 중간엽 줄기세포 층분리 배양법 및 증식 방법은 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 배양 조건 중 세포 밀도 및 배양 배지를 변경한 것을 특징으로 한다. 이하 실험에서는 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 중간엽 줄기세포 (cMSC)의 세포 배양 밀도를 각각 50 세포/cm 2(cells/cm 2) (저밀도), 1000 세포/cm 2(중간 밀도), 4,000 세포/cm 2 (고밀도)로 달리하고 그에 따른 세포의 특성을 분석하였다.
1.1 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화 확인
먼저 장기간 배양에서 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 장기간 배양 조건을 주기 위하여 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)의 중간엽 줄기세포를 이용하였으며, 각각 저밀도, 중간밀도, 고밀도의 조건으로 LG-DMEM 배지에 접종하였다. 이 후 세포의 형태학적 변화를 현미경을 통해 관찰하여 줄기세포의 노화여부를 판단하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 계대 5(P5) 및 계대 10(P10)에서는 세포 밀도에 따라 세포 크기와 형태학적 패턴에서 차이를 나타냈으며, 특히 P15의 경우 고밀도 배양 조건에서 편평하며 커진 형태의 중간엽 줄기세포가 관찰되었다. 이와 같은 형태는 전형적인 중간엽 줄기세포의 노화를 나타내는 것으로, 장기간 배양에서 세포의 밀도 조절이 중간엽 줄기세포의 노화를 조절할 수 있음을 확인하였다.
1.2 세포 밀도에 따른 MSC 세포 크기 및 입도 확인
세포 밀도에 따른 줄기세포의 변화를 추가적으로 확인하기 위하여, 노화된 세포에서 증가하는 것으로 알려져 있는 세포 크기 및 세포의 입도(granularity)를 유세포 분석기를 통해 정략 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포의 크기는 P5에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, P10 및 P15인 경우 세포 밀도에 따라 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였다. 특히 P10 및 P15에서는 높은 세포 밀도의 배양 조건에서 세포의 크기가 유의적으로 증가하여 세포 노화가 더욱 촉진됨을 확인할 수 있었다. 이와 동일하게 세포의 입도 역시 모든 계대(Passage)에서 세포의 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었다.
따라서 중간엽 줄기세포의 장기간 배양에 있어 세포의 밀도 조절이 세포 노화를 조절하는 인자가 될 수 있음을 확인하였으며, 세포 배양 밀도를 낮춤으로써 후기 계대에서 나타나는 형태학적 변화를 개선할 수 있음을 확인하였다.
1.3 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 노화 확인
실시예 1.1 및 1.2에서 확인된 형태학적 변화가 실제로 중간엽 줄기세포의 노화 의존적 (age-dependent) 현상인지를 확인하기 위하여, 노화 세포를 선택적으로 염색할 수 있는 베타 갈락토시다아제를 이용한 염색분석법을 수행하고, 노화 관련 유전자인 p15, p16 및 증식 마커인 PCNA 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 비교하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 계대 5(P5) 및 계대 10(P10)에서는 모든 세포 밀도에서 노화된 세포의 염색을 확인할 수 없었으나, 계대 15(P15)에서는 세포 밀도가 높아질수록 노화된 세포의 염색이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 계대 15(P15)에서는 세포의 배양 밀도가 증가할수록 노화관련 유전자인 CDK 억제제 p15 및 p16의 유전자 발현이 증가하였으며, 증식 마커인 PCNA는 감소하였다.
이러한 결과는 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화가 중간엽 줄기세포의 노화와 관련 있음을 나타내는 결과이며, 계대 배양시 세포 배양 밀도의 조절이 중간엽 줄기세포의 노화를 조절할 수 있음을 나타내는 결과이다.
1.4 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능 변화 확인
중간엽 줄기세포의 증식 능력은 계대가 진행되고, 세포의 노화가 진행됨에 따라 점차적으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서 증식능은 중간엽 줄기세포의 노화를 확인할 수 있는 기준으로 사용될 수 있으며, 장기간 세포 배양 시 세포 배양 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 증식능 비교를 수행하였다. 각 세포의 증식능은 초기 접종 세포 수와 배양이 끝난 후 얻어지는 세포의 수를 통해 각 계대에 따른 증식률을 계산하여 확인하였고, 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000002
표 1에 나타낸 바와 같이, 저밀도로 배양된 중간엽 줄기세포(MSC)의 경우 계대 5(P5), 계대 10(P10), 계대 15(P15)에서 증가 배수 (fold increase) 가 88.4, 34.3, 16.4 인 반면, 중간 밀도로 배양된 중간엽 줄기세포는 8.5, 4.9, 3.1, 고밀도로 배양된 중간엽 줄기세포는 3.0, 1.9, 1.1 인 것을 확인하였다. 또한 도 6에 나타낸 바와 같이, 세포군 배가 시간(PDT) 및 세포수 증식 수준(PDL)도 증가 배수와 같은 패턴으로 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 장기간의 중간엽 줄기세포 배양에서 세포 밀도를 낮춤으로써 중간엽 줄기세포의 증식능을 유지시킬 수 있음을 보여주는 결과이며, 동일한 계대 배양을 수행하더라도, 중간엽 줄기세포의 노화를 억제시키고 수명을 연장시킬 수 있음을 나타낸다.
1.5 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포( MSC )의 분화능 변화 확인
세포 배양 밀도가 줄기세포능에 영향을 주는지 확인하기 위하여, P5 내지 P15 배양에 따른 분화능을 비교하였다. 줄기세포능으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인하였으며, 각각의 계대 및 밀도에서 정상, 정량 분석을 수행하였다. 구체적으로 지방세포 분화 배양액은 High Glusose DMEM 배양액에 NCS (Newborn Calf Serum) (Gibco), 10 -7mol 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma), 0.5mM IBMX(Sigma), 10μg/ml 인슐린(insulin)(Sigma), 100μM 인도메타신(indomethacin) (Sigma)을 첨가한 배지를 만들어 실험하였으며, 7일 분화 후에 Oil red O 조직화학 염색을 통하여 확인하였다. 또한 Oil red O 조직화학 염색 후, 이소프로필 알코올로 용출시켰으며, 500nm에서 측정 후 정량 분석하여 확인하였다.
골세포 분화 배양액은 α-MEM 배양액에 FBS(Gibco), 50 μg/ml ascorbic 2 phosphate (sigma), 10 -8mol 덱사메타손(Sigma), 10mM 베타글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate) (sigma)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 21일 분화 후에 Alizarin red S 조직화학염색을 통하여 확인하였다. 또한 Alizarin red S 조직화학 염색 후, 10% 아세트산으로 용출시켰으며, 405nm에서 측정하고 정량 분석하여 확인하였다. 상기와 같은 방법으로 지방세포 분화능 및 골세포 분화능을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화능은 계대가 진행됨에 따라 전체적으로 감소하였으나, 밀도에 의한 차이가 뚜렷하게 나타나지 않은 반면, 골세포 분화능의 경우 고밀도 조건의 계대 15(P15) 배양군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 중간엽 줄기세포의 골세포 분화능은 낮은 세포 밀도로 배양하는 경우 더욱 잘 유지될 수 있음을 확인하였다.
1.6 배양 세포 밀도에 따른 중간엽 줄기세포의 항원 프로파일 분석
세포 배양 밀도가 줄기세포의 항원 발현에도 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 각 계대 및 배양 밀도에 따른 양성 및 음성 항원 발현의 변화를 유세포 분석기로 확인하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000003
표 2에 나타낸 바와 같이, 음성 마커 발현의 변화는 뚜렷하게 확인되지 않았으나, 일부 양성 마커의 경우 같은 계대에서도 세포 배양 밀도에 따라 발현양의 변화가 나타남을 확인하였다.
특히 계대 15(P15)에서는 높은 밀도로 세포를 배양하는 경우 대부분의 양성 마커들의 발현 양이 현저하게 감소하였을 뿐만 아니라, CD73, CD105는 음성 발현을 보여 세포 밀도를 낮게 유지하여 세포 배양을 수행하는 것이 매우 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였다.
1.7 배양 세포 밀도에 따른 활성산소종 ( ROS ) 생산 및 DNA 손상 비교
중간엽 줄기세포의 기능의 감소와 DNA 손상은 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 활성산소종인 ROS에 의해 유도되는 DNA 손상은 중간엽 줄기세포(MSC)의 노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 배양 밀도에 따라 총 활성산소종(ROS) 생산 및 이에 따른 DNA 손상이 상이하게 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 계대 및 세포 배양 밀도에 따른 총 세포성 활성산소종(ROS)양을 형광 강도 분석을 통해 비교하고, comet 분석을 통해 DNA 손상 정도를 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 총 ROS 생산은 모든 계대에서 세포 배양 밀도가 증가할수록 증가되는 경향을 확인하였고, 특히 계대 10(P10)과 계대 15(P15)에서는 유의적으로 ROS 생산이 증가됨을 확인하였다 (A). comet 분석에서는 DNA 손상이 가장 약한 CC1부터 손상이 가장 심한 CC5로 분류하여 데이터를 분석하였으며, 손상이 가장 심한 CC5의 경우 세포 배양 밀도가 높아질수록 유의적으로 증가함을 확인하였다. 반면, CC1은 세포 밀도가 높아질수록 유의적으로 낮아지는 경향을 보였다 (B).
추가적으로 DNA 손상이 ROS에 의해 유발된 것인지 확인하기 위하여, ROS에 의한 DNA 손상을 확인하는 8-OHdG의 농도를 확인하는 실험을 수행하였다. 8-OHdG 분석방법은 다음과 같다. 각각의 세포로부터 얻은 DNA 시료 50μl를 8-OHdG 가 결합된 플레이트(8-OHdG conjugate coated plate)에 넣어준 후, 상온에서 10분간 배양하였다. 그 후, 항-8-OHdG 항체(anti-8-OHdG antibody)를 추가로 넣어 상온에서 한 시간 배양하였으며, 3회 세척 후, secondary antibody enzyme conjugate를 각 웰(well)에 넣어 준 후, 다시 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이 후 다시 3회 세척 후, 기질 용액(substrate solution)을 넣어 상온에서 30분간 배양하였다. 마지막으로 정지 용액(Stop solution)을 넣어 준 후, 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, DNA 손상이 가장 심한 것으로 나타난 계대 15(P15) 군에서는 세포 배양 밀도가 높아질수록 8-OHdG의 농도가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS에 의해 DNA 손상이 증가하는 것이며, 이에 의해 중간엽 줄기세포의 노화가 촉진된다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 세포 배양 밀도를 낮게 조절하는 것이 중간엽 줄기세포의 ROS 생산 증가에 의한 DNA 손상으로부터 중간엽 줄기세포를 보호하는 역할을 할 수 있음을 보여주는 결과이다.
1.8 항산화제 처리에 따른 중간엽 줄기세포( MSC ) 증식 및 활성산소종 ( ROS ) 생산능 확인
중간엽 줄기세포의 증식이 고밀도 배양 조건에서 생산되는 ROS에 의해서 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여, ROS 소거 실험을 수행하였다. 계대 11(P11) 내지 계대 15(P15)에서 고밀도 배양 조건 및 고밀도 배양 조건에 항산화제인 아스코르브산 25μg/ml을 배지에 첨가하여 배양한 후 두 그룹 간의 증식률의 증가 배수(Fold)를 비교하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 고밀도 배양 조건에서 증가 배수가 P11 내지 P15에서 각각 2.6, 1.9, 1.6으로, 계대수가 증가할수록 증식능이 감소하면서 노화가 나타나기 시작했으나, 항산화제를 처리한 경우 모든 계대에서 약 50% 정도 증식능이 높게 유지되는 것을 확인하였다. 또한 항산화제 처리군에서 성장 증가 배수 (growth fold increase)는 P11 내지 P15에서 각각 3.8. 2.9, 2.5로 P15까지도 증식능이 높게 유지되었다.
마지막 시점(Endpoint)인 P15에서 고밀도 배양 조건 단독 및 고밀도 배양 조건+항산화제 처리 두 그룹 간의 ROS 수준을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 항산화제인 아스코르브산을 처리하여 증식이 증가한 조건에서는 ROS 수준 역시 감소되어 있음을 확인하였다. 따라서 MSC 배양은 고밀도가 아닌 낮은 세포 밀도에서 수행하는 것이 바람직하며, 고밀도 세포 배양에서 유도되는 ROS 생산을 항산화제로 소거하는 경우 중간엽 줄기세포의 증식능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 즉 고밀도 조건은 ROS으로 인해 중간엽 줄기세포의 증식능이 억제되며, 세포 밀도가 낮아질수록 ROS가 감소하여 중간엽 줄기세포 증식능이 촉진될 수 있다.
이러한 결과를 종합하면, 층분리 배양을 통해 얻어진 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식, 배양 및 줄기세포능을 유지하기 위해서는 배양 조건 중 세포 밀도를 1000 세포/cm 2 이하의 밀도로 조절하는 것이 중요하며, 항산화제를 첨가하여 배양하는 경우 세포 배양에서 유발될 수 있는 산화 스트레스를 억제하여 중간엽 줄기세포 증식을 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다. 또한 동일한 낮은 세포 밀도 조건 배양을 비교하면, P15와 같은 계대 10 이상인 줄기세포는 계대 5와 같은 계대 10 미만의 줄기세포와 비교하였을 때 세포의 형태학적 변화가 두드러지고 줄기세포의 노화 촉진, 분화능 감소와 같은 결과가 확인되므로, 1000 세포/cm 2 이하의 밀도로 계대 10 미만의 낮은 계대 수로 배양하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다.
< 실시예 2> 개선된 층분리 배양법의 검증
상기 실시예 1을 통해, 층분리 배양법으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양에 있어서 세포 밀도의 조절, 계대 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 국내특허출원 10-2006-0075676 호에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정으로 수득한 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 세포 배양 밀도를 달리하고, 항산화제인 아스코르브산이 첨가된 배지로 배지를 달리하면서 계대 배양을 수행하여 수득되는 단일 콜로니 MSC 의 증식능 및 이에 따른 세포 수득 효과를 비교하였다.
이전 한국특허출원 10-2006-0075676호 의 실시예 1에서는 도 1과 같은 층분리 배양 방법을 통해 골수에서 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 개시하고 있으며, 층분리 단계를 거쳐 수득되는 단일성 세포군인 콜로니들을 웰당 100 내지 600의 세포수로 배양 용기로 이동한다는 사실을 개시한다.
또한 한국특허출원 10-2014-0170045호는 층분리 배양법을 이용하여 골수 유래 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법을 개시하고, 콜로니를 50 내지 100 cells/cm 2 로 도말한다는 사실을 개시하고 있다.
그러나 한국특허출원 10-2006-0075676호 및 10-2014-0170045호는 층분리 배양법에 의해 수득된 단일성 세포군 콜로니를 계수하여 6 웰 플레이트로 이동시킨 후, 저농도로 도말하여 계대 배양을 위한 seed cell 제조를 위하여 확장하는 구성, 즉 계대 1에 해당하는 콜로니 배양의 조건을 개시하고 있을 뿐, 계대 2 이후의 콜로니가 아닌 개별 세포들의 반복적인 배양 세포 밀도 조절에 대한 구성 및 이에 따른 효과는 개시되어 있지 않다. 상기 출원에 기재된 종래 층분리 배양법에 따르면 충분한 양의 아토피 피부염 예방, 치료, 개선 효과가 있는 단일 클로날 줄기세포를 얻기 위하여 최소 10 계대 이상의 배양을 수행해야 한다. 반면, 본 발명의 개선된 층분리 배양 방법에서는 계대 2 이후 낮은 세포 밀도 조건, 최대 8 계대 이하의 적은 계대 배양 수를 통해 효과적으로 목적하는 단일 클로날 줄기세포를 대량 수득할 수 있다.
구체적으로 본 개선 방법에서는 층분리 배양 방법을 통해 수득된 계대 1(P1)의 콜로니를 배양한 후, 계대 2(P2) 이후 계대 배양에서는 낮은 밀도인 1000 세포/cm 2 이하로 세포를 분주하고 이를 4000 세포/cm 2 세포 배양의 효과와 비교하였다. 또한 세포 배양 배지를 항산화제가 포함된 α-MEM 배지와 항산화제가 미 포함된 LG-DMEM 배지로 달리하고 이에 따른 세포 증식 효과를 비교하였다.
개선된 층분리 배양법의 효과를 확인하기 위한 실험군을 하기 표 3에, 종래 층분리 배양법 대비 개선된 층분리 배양방법의 공정 개선 부분을 도 12a 및 도 12b에 모식화하여 나타내었다.
도 12a 에 나타낸 바와 같이, 계대 1을 수득하는 공정까지는 종래 층분리 배양법과 개선된 층분리 배양법이 공정을 동일하게 진행하나, 개선된 층분리 배양법은 확장된 계대 1 세포를 seed cell 로 이용하여 배양하는 단계 이후의 계대 배양 공정이 종래 층분리 배양법과 상이하다. 기존 층분리 배양법은 밀도 조절에 대한 인식 없이 많은 세포를 수득하기 위한 목적으로 4000 세포/cm 2 이상의 고밀도 계대 배양을 수행하나, 개선된 층분리 배양법은 계대 배양의 밀도를 낮은 밀도인 1000 세포/cm 2 이하로 조절함으로써, 계대 2 이후 최대 계대 8 이하의 배양만으로도 최종 산물을 수득할 수 있다. 계대 2 이후의 배양 공정을 도 12b에 상세하게 나타내었다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000004
상기 표 3의 세포주들은 층분리 배양 방법에 의해 분리된 세포주이며 SCM01 내지 SCM08로 각각 명명하였다.
2.1 세포주 밀도 및 배지에 따른 증식 효과 확인
상기 SCM01 내지 08 세포주를 이용하여 배양을 수행하고, 계대 10 미만인 계대 5까지의 계대 배양에 따른 세포 증식 효과를 세포 수, 세포군 배가 시간(PDT; Population Doubling Time), 세포수 증식 수준(PDL; Population Doubling Level) 로 각각 비교하였으며, 이를 도 13 내지 도 20에 나타내었다.
도 13 내지 도 20에서 확인한 바와 같이, cm 2 당 1000개의 세포 밀도로 접종하여 배양된 모든 실험군에서 cm 2 당 4000개의 세포 밀도로 접종하여 배양한 실험군보다 우수한 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한, 동일한 1000개의 세포 밀도군이라도, 항산화제인 아스코르브산이 포함된 α-MEM 배지에서 배양된 1000alpha 실험군에서 더욱 현저한 세포 증식 효과를 확인하였다.
2.2 세포주 밀도에 따른 증식 효과 비교
배양 세포 수에 따른 증식률의 보다 정확한 비교를 위하여, 배양 배지를 각각 LG DMEM 또는 α-MEM 배지로 고정하고, cm 2 당 1000 또는 4000개의 세포 접종 밀도의 계대 배양에 따른 세포 증식 효과를 비교하였으며, 그 결과를 도 21 내지 도 24 에 나타내었다.
도 21 에 나타낸 바와 같이, LG DMEM에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주의 계대2(P2) 내지 계대 5(P5)에서의 증식률이 cm 2 당 4000 개의 세포수 접종군보다 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때 현저하게 높은 것을 확인하였으며, 계대 5(P5) 에서 확인된 cm 2 당 4000 개의 세포 접종 대비 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 3.08 내지 최대 48.50 배인 것을 확인하였다.
또한 도 22에 나타낸 바와 같이, cm 2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT값도 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포주 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL값은 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
또한 도 23에 나타낸 바와 같이, α-MEM 에서 배양된 SCM01 내지 SCM08 세포주 모두 1000 개의 세포수로 접종하여 배양하였을 때, DMEM 실험군과 같은 경향을 보였으며, 계대 5(P5)에서 확인된 cm 2 당 4000 개의 세포주 접종 대비 cm 2 당 1000개의 세포 접종군의 증식률은 최소 6.32 내지 최대 85.63배인 것을 확인하였다. 또한 도 24에 나타낸 바와 같이, cm 2 당 1000개의 세포 접종군의 PDT 값도 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포 접종보다 낮거나 비슷한 수준으로 나타났으며, PDL 값은 모든 세포주에서 cm 2 당 4000개 세포 접종 대비 높은 값을 확인하였다.
이러한 결과는 cm 2 당 4000개의 고밀도 세포 접종 배양에 비하여 cm 2 당 1000개 이하의 세포 접종을 통해 빠른 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 증식을 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
2.3 배양 배지에 따른 증식 효과 비교
앞서 실시예 2.2 를 통해 1000 세포/cm 2 배양이 4000 세포/cm 2 배양 대비 우수한 증식 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였으므로, 세포수를 1000개로 고정하고, 배지를 변수로 변화시키면서 세포 증식 효과를 비교함으로써, 배양 배지 조건에 의한 증식 효과를 추가적으로 검증하였고 그 결과를 도 25 및 도 26에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 배양 배지를 α-MEM 및 DMEM으로 달리하며 세포 증식률을 비교한 결과 LG-DMEM 대비 α-MEM 배지를 이용한 실험군에서 최소 1.77 배 내지 6.39 배의 높은 세포 증식률을 확인하였다. 또한 도 26에 나타낸 바와 같이, PDT가 모든 α-MEM 실험군에서 낮게 나타났으며, PDL 은 증가된 것을 확인하였다.
이와 같은 실험 결과는 세포 접종 밀도를 cm 2 당 1000개 이하의 세포로 조절하여 계대 2(P2) 내지 계대 5(P5)와 같은 계대 10 미만의 낮은 계대로 배양하는 것에 더하여 항산화제가 첨가된 배지를 이용하여 배양하는 경우 세포 증식 효율을 극대화할 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 3> 개선 공정의 수립
상기 실시예들을 통해, 중간엽 줄기세포 배양에 있어서 세포 밀도의 조절 및 항산화제의 첨가가 중요한 인자가 될 수 있음을 확인하였으므로, 한국특허출원 10-2006-0075676호 및 10-2014-0170045에 기재된 층분리 배양법의 기존 공정에 더하여, 계대 배양 시 세포 배양 밀도 및 배지 조건을 달리하여 단일 콜로니의 중간엽 줄기세포를 계대 10 미만의 낮은 계대에서 효과적으로 수득할 수 있는 개선된 공정을 확립하였으며, 이를 종합적으로 하기 표 4 (DMEM 배지를 이용한 배양 조건) 및 표 5 (α-MEM 배지를 이용한 배양 조건)에 나타내었다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000005
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000006
보다 구체적으로 본 발명의 골수 유래 중간엽 줄기세포의 층분리 배양 공정 및 증식 배양을 다음과 같이 수행하였다.
골수제공자의 엉덩이부분을 국소마취제로 마취시킨 후, 엉덩이뼈에 주사바늘을 찔러 골수를 채취하였다.　100 mm 배양용기에 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 14 ml DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA), 사람 골수 1 ml를 넣어 37℃5% CO 2 세포배양기에서 2시간 배양하였다.　배양 후, 배양용기를 한쪽으로 살짝 기울여 바닥에 붙은 세포들이 되도록 떨어지지 않도록 최대한 배양용기의 상층 배양액만 새로운 용기로 옮겼다.
동일한 과정을 한 번 더 반복한 후 수득한 배양액을 바닥에 교원질(collagen)이 코팅된 배양용기(Becton Dickinson)로 옮긴 후 37℃에서 2시간 배양하였다.　배양액을 다시 새로운 교원질이 코팅된 용기로 옮기고 24시간 후 다시 새로운 용기로 옮기고 24시간 후 또 새로운 용기로 옮겨주었다. 마지막으로 48시간 후 새로운 용기로 옮겨 준 후 남아있는 세포들이 배양용기 바닥에 붙어 자라는 것을 육안으로 확인하였다.　앞의 여러 층분리 단계들을 거쳐서 이 단계에까지 올 수 있는 세포들은 세포의 비중이 타 세포들보다 월등히 작은 세포들임을 짐작할 수 있다.　
약 10 내지 14일의 시간이 지나면 세포들이 단일 콜로니 (single colony)를 형성하는데, 이 단일 클로날 세포군들을 트립신을 처리하여 분리한 다음 6-웰 배양용기로 옮겼다. 37℃5% CO 2 세포배양기에서 4 내지 5일 배양한 후 약 80% 자랐을 때, 세포들을 0.05% trypsin/1mM EDTA(GIBCO-BRL)를 처리하여 수득한 후, T175 배양용기로 옮겨 낮은 세포 밀도로 계대 배양하였다.　
이와 같이 계대 10 미만, 바람직하게는 계대 8 이하의 계대 2(P2) 내지 계대 5(P5)에서 세포 밀도를 1000세포/cm 2 수준으로 낮춰 배양하는 경우, 다른 공정은 모두 동일하게 조절하였음에도 중간엽 줄기세포의 증식능 및 줄기세포 특성이 우수하게 유지되어 동일한 계대에서도 증식이 효과적으로 유도됨을 확인하였다. 특히 세포 밀도를 낮춰 배양하는 경우, 기존 공정에서 필요로 했던, 중간엽 줄기세포에서 WCB(Working Cell Bank)를 제조하는 과정을 생략할 수 있어, 세포 제조 기간을 효과적으로 단축할 수 있다. 특히 계대를 적게 하면 노화가 비교적 덜 진행된 세포를 많은 양으로 수득할 수 있으며, 이와 같은 세포를 치료제로 이용하는 경우 치료 효능이 우수할 것으로 기대할 수 있다.
또한, 배양 배지로써 항산화제가 첨가된 α-MEM을 이용하는 경우, 높은 밀도의 세포 배양에서 유도되는 ROS 스트레스가 항산화제 처리에 의해 효과적으로 개선되고 중간엽 줄기세포의 세포 증식능이 회복될 수 있어, 기존의 공정 대비 세포의 계대를 현저히 단축하고, 중간엽 줄기세포의 특성을 유지하는 노화가 진행되지 않은 신선한 상태의 단일 콜로니 중간엽 줄기세포를 빠르고 안정적으로 수득할 수 있다는 특징이 있다.
상기와 같은 내용을 종합하면, 저밀도 세포 배양은, 단시간에 많은 세포를 얻을 수 있어 제조공정은 간소화시킬 뿐 아니라 장기간 배양(long-term culture)에서도, 중간엽 줄기세포의 특성을 온전히 유지하는 노화되지 않은 상태의 세포를 수득할 수 있으므로, 양질의 줄기세포 생산을 가능하게 함을 확인하였다.
이에 따라, 이하 아토피 피부염 치료를 위한 실험에서 상기 실시예를 통해 구축한 개선 방법을 통해 얻어지는 줄기세포를 이용하였다.
< 실시예 4> 개선 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포의 아토피 피부염 치료 효과 확인
4.1 시료 및 방법
종래 줄기세포 수득을 위해 사용되는 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 를 이용한 밀도 구배 원심분리 방법 (gradient centrifugation method, GCM) 을 통해 수득되는 줄기세포 (이하, GCM-MSC) 와 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 단일 클로날 줄기세포 (이하, SCM-cMSC) 가 아토피 피부염 치료 효과에서 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위한 비교실험을 수행하였다.
실험에 사용된 시료는 하기 표 6에 나타내었다. 달걀 흰자 유래 알부민 및 알루미늄 하이드록사이드는 아토피 피부염 유도를 위해 사용하였으며, 테가덤 필름(Tegaderm Film)은 드레싱에 사용하였다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000007
아토피 피부염 동물 모델을 제조하기 위하여 6주령의 SPF (specific pathogen-free) BALB/c mice (15-20g) 를 SLC, Inc (스즈오카, 일본) 으로부터 공급받아 사용하였다. 실험은 1주일의 순응 기간 이후에 개시하였다. 아토피 피부염을 유발하기 위하여 6주령의 BALB/c 마우스에 OVA (오발부민) 50㎍ 및 Alum Ajuvant 40mg를 3주 동안 1주에 한번씩 복강 내 및 피하 투여하였다. 유발 물질 투여 후, 60㎍ 의 OVA를 포함하는 1.2cm X 1.2cm 패치를 2주 동안 2회 제모된 영역에 부착하여 BALB/c 에서 아토피를 유도하였다. 감작 20일 후, 아토피 피부염이 상기 마우스에 Cell vehicle, GCM-MSC, SCM-cMSC 를 하기 표 7과 같은 용법 용량으로 미정맥(caudal vein) 을 통해 2일 간격으로 3회 투여하였다. 정상 대조군으로는 아토피 피부염을 유발하지 않은 마우스 5마리를 설정하였다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000008
투여 후 아토피 피부염에 대한 효과를 확인하기 위하여 마우스 피부, 액와림프절 (axillary lymph node, aLN) 및 혈액에서 아토피 피부염과 관련된 마커의 발현 변화 및 관련 지표를 확인하였다.
4.2 SCM- cMSC 투여에 따른 피부 병변 변화 확인
실시예 4.1 에서 제조된 아토피 피부염 유발 동물 모델에 SCM-cMSC, GCM-MSC를 상기와 같은 프로토콜로 투여하고, 59일 후 피부 병변의 변화를 확인하였으며 그 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 SCM-cMSC 투여군에서는 아토피 피부 병변이 효과적으로 개선되는 것을 확인하였다.
아토피 피부염 모델의 등피부 조직을 10% 포르말린을 처리하여 24시간 동안 4℃에서 고정시키고, 이를 절개 및 탈수화처리하여 파라핀에 고정시켰다. 4μm 두께의 절단면을 슬라이드 상에 위치시키고 이를 H&E 용액으로 8분간 염색하고, 알코올로 세척한 후 표피와 진피의 두께 변화 및 염증성 침윤을 확인하였다. 표피와 진피의 두께는 200배율의 CaseViewer 1.4 software (3DHISTECH, BU, Hungary) 를 이용하여 확인하였다. 이 후 H&E 과 동일한 방법으로 피부 조직 처리 후 톨루이딘 블루 염색을 수행하였으며, working solution 에서 2-3분동안 염색을 수행하고, 세척 및 탈수화하였다. 상기와 같은 육안 소견 및 조직 염색의 결과를 표 8, 도 28 내지 도 30 에 나타내었다.
Figure PCTKR2019018089-appb-img-000009
표 8 에 나타낸 바와 같이, SCM-cMSC 처리군은 아토피 피부염 유발에 의해 증가되는 표피 및 진피의 두께 증가를 Cell vehicle 과 비교하여 1.5 배까지 억제하였으며, 이러한 효과는 GCM-MSC 처리군과 비교하여 1.4 배, 1.3 배 억제 효과를 나타내는 것으로, GCM-MSC 처리군과 비교하여 현저한 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
또한 도 28 내지 도 30에 나타낸 바와 같이, 피부 병변 부위의 조직학적 분석 결과, SCM-cMSC 를 처리한 군에서는 뚜렷한 아토피 중증도 감소가 확인되었다.
4.3 SCM- cMSC 투여에 따른 IgE , IgG1 억제 효과 및 IgG2 생산 효과 확인
4개의 실헌군에서 IgE, IgG1 생산을 ELISA 를 통해 측정, 비교하여 아토피 피부염 치료 효과를 확인하였다. IgE 분석을 위하여 마이크로웰 플레이트를 코팅 완충액에 희석된 캡쳐 항원 100 μl/웰로 코팅하였고, 플레이트를 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 웰을 흡입하고 세척완충액으로 세척한 후 플레이트를 뒤집고, 세척한 후 남아있는 완충액을 제거하였다. 플레이트를 200μl/well Assay Diluent 로 차단하고 실온에서 1시간동안 배양하였다. 세척 후, 각 실험군을 적절한 플레이트로 이동시켰다. 밀봉된 플레이트를 2시간 동안 실온에서 배양하고, 다시 세척한 후 Working Detector (Detection Antibody and Sav HRP reagent) 100ul 을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 100μl의 기질 용액을 각 웰에 추가한 후 플레이트 밀봉없이 플레이트를 암 환경에서 30분동안 실온 배양하고 종결 용액 50ul 을 첨가하였다. 종료 반응 30 분 이내에 450nm 에서 흡광도를 확인하였으며, 450nm 흡광도값에서 570nm 흡광도 값을 빼주었다. IgE 및 IgG1 생산에 의한 효과를 확인한 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염에 의하여 유발되는 IgE 및 IgG1 생산은 SCM-cMSC 의 투여에 의하여 뚜렷하게 감소하였다. 이러한 감소효과는 GCM-MSC 와 비교하여도 현저하게 우수한 것으로 나타났다.
추가적으로 ELISA 방법을 이용하여 IgG2a 생산 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타낸 바와 같이, IgG2a 의 생산은 SCM-cMSC 에서 GCM-MSC 처리군 대비 현저하게 우수한 것으로 나타났으며, 아토피 피부염 모델군 (vehicle) 대비 약 3배 이상 증가함을 확인하였다.
4.4 SCM- cMSC 투여에 따른 림프액와절에서 IL-4, IFN -γ 발현 효과 확인
아토피 피부염 동물모델에서 액와림프절 (axillary lymph nodes) 를 분리하고 SCM-cMSC, GCM-MSC 투여에 따른 액와림프절에서의 IL-4 및 IFN-γ의 발현 변화를 실시간 PCR 로 확인하였다. 총 RNA 는 TRIzol Reagent (Life technologies) 을 이용하여 액와림프절로부터 수득하였고, cDNA 는 제조사의 지시에 따라 primeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA) 를 이용하여 준비하였다. cDNA 산물을 SYBR Green Quantitative PCR Master Mix (KAPA Biosystems) 로 증폭하였으며, 프라이머는 모두 Qiagen 으로부터 구입하여 사용하였다. StepOnePlus RealTime PCR System (Applied Biosystems)에서 반응을 수행하였고, PCR 은 총 20ml 에 대하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다: 변성; 94.1 ℃에서 5분, 증폭; GAPDH 에 대하여 25 사이클, 94.1℃ 에서 30s, 58.1℃에서 30s 및 72.1℃에서 30s, 신장; 72℃ 에서 10분. 이 후, 각 시료 1μl 을 아가로오스 겔에 위치시키고 브로민화 에티듐으로 염색한 후 자외선으로 시각화하였다. 각 표적 유전자의 발현을 GAPDH에 대하여 표준화하고, 그 결과를 도 33에 나타내었다. 실험에 사용된 프라이머의 정보는 하기와 같다.
- GAPDH Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Cat# QT01658692
- IL-4 Mm_Il4_va.1_SG QuantiTect Primer Assay Cat# QT02418311
- IFNγ Mm_Ifng_1_SG QuantiTect Primer Assay Cat# QT0103882115
도 33에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염 모델의 액와림프절에서 증가된 IL-4 는 GCM-MSC 및 SCM-cMSC 처리에 따라 감소되었고, SCM-cMSC 처리에 의하여 가장 우수한 감소 효과가 확인되었다. 또한 아토피 피부염 모델에서 감소된 IFN-γ 의 수준은 SCM-cMSC 처리에 의하여 뚜렷하게 증가되는 것을 확인하였다.
4.5 SCM- cMSC 투여에 따른 비만세포 수 측정
비만 세포를 계수하기 위하여 Giemsa 를 이용한 피부 조직 염색을 추가적으로 수행하였으며, 침윤된 비만 세포의 수는 100 배율의 paint.NET를 이용하여 계수하였다.
도 34에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군과 비교하여 아토피 피부염 모델에서는 염증 유발에 의하여 비만 세포가 현저하게 증가 (평균 86)하였으며, 이와 같은 증가는 SCM-cMSC 투여에 의하여 평균 49 수준으로 현저하게 감소되었다. 이는 GCM-MSC 투여군이 비만 세포 감소 활성을 거의 나타내지 못하는 것과 비교하여 SCM-cMSC 투여군에서만 뚜렷하게 확인되는 효과이다.
< 실시예 5> 배양 밀도에 따른 아토피 피부염 치료 효과 비교
5.1 cMSC1 , cMSC2 의 준비
실시예 2, 3을 통해 개선된 층분리 배양법으로 수득된 cMSC 가 장기간 배양에서도 중간엽 줄기세포의 특성을 유지하는 노화되지 않은 세포 상태로 수득되며 이러한 개선된 층분리 배양법으로 수득된 cMSC 가 종래 밀도구배 원심분리에 의해 수득되는 줄기세포인 GCM-MSC 와 비교하여 현저히 우수한 아토피 피부염 치료 효과를 나타냄을 실시예 4를 통해 확인하였다. 이에 저밀도 배양 단계를 포함하는 개선된 층분리 배양법으로 수득된 cMSC가 고밀도 배양 단계를 포함하는 종래 층분리 배양법으로 수득된 cMSC 와 비교하여 아토피 피부염 치료 효과에서 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위한 추가 실험을 수행하였다.
실시예 3의 개선된 층분리 배양법에 따라, 계대 배양 시 세포 배양 밀도를 100, 1000 세포/cm 2 로 하고, 항산화제를 포함하는 a-MEM 배지를 이용하여 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득하였다. 항생제로는 젠타마이신이 추가되었으며, α-MEM 배양액으로 수행하였다(표 5 참조). 이하 100, 1000 세포/cm 2 이하의 저밀도 및 항산화 조건의 개선된 층분리 배양법을 통해 수득된 줄기세포를 "cMSC1"로 명명하였다.
또한 개선된 층분리 배양법에 의해 수득된 줄기세포와 효과를 비교하기 위하여 계대 배양시 4000 세포/cm 2 이상의 밀도 및 항산화제 미첨가 조건의 배양 방법으로 배양하는 종래 층분리 배양법에 의해 수득된 줄기세포를 “cMSC2” 로 명명하였다.
5.2 실험 재료 및 방법
아토피 피부염 시험에 사용된 동물은 암컷 6주령의 SPF(specific pathogen-free) BALB/c mice (15~20g)로 SLC, Inc (Shizuoka, Japan)에서 공급받았으며, 1주 동안 동물실 내에서 순화기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 인하대 의과대학 생명과학연구소에서 온도 22~25℃, 습도 40~60%, 주야 12시간 교대로 150~300Lux의 조명에서 mouse용 cage에 5마리씩 사육하였고, 멸균 증류수와 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육환경을 유지하고 실험을 수행하였다. 7주령의 암컷 BALB/c 마우스에 Ovalbumin(OVA) 50μg/50μl(PBS)과 Alum Adjuvant 4mg/100μl을 혼합하여 주 1회 3주간 총 3회로 복강, 피하 투여하여 아토피 피부염의 감작을 유도하였다. 3회 모두 같은 부위에 투여할 시 해당 질환과 무관한 염증을 유발할 수 있기 때문에 각각 다른 부위에 투여하였다. OVA 투여 3주 후 OVA 60μg/60μl(PBS)을 적신 1.2x1.2cm 크기의 멸균 거즈를 제모 한 등 피부에 2주 동안 주 2~3회 부착하여 국소부위에 아토피를 유도하였다. OVA patch를 통한 아토피 유도 후 PBS, 층분리 배양방법을 통해 수득한 단일 클로날 줄기세포를 계대 2 이후 단계에서 100cells/cm 2, 1000cells/cm 2, 4000cells/cm 2 과 같이 세포밀도를 달리하여 수득하고 2일 간격으로 총 3회 미정맥을 통해 주입한다. 주입량은 회당 3.3x10 5/200㎕씩 3회로, 총 1.0x10 6/600㎕ 정맥투여 한다. 투여를 마치고 이틀 후 병변 부위를 다시 제모한 후에 OVA 60μg/60μl(PBS)을 적신 1.2x1.2cm 크기의 멸균 거즈를 제모 한 등 피부에 2주 동안 주 3~4회 부착하여 국소부위에 아토피를 재유도하였다. 아토피 피부염 유도 후 13~14일 시점에 실험동물을 restrainer로 보정한 후, 26 1/2gauge needle이 장착된 BD사 1ml syringe를 이용하여 미정맥을 통해 투여한다. Veh.그룹의 동물은 시험물질 대신 PBS를 동일한 방법으로 정맥 내 투여하며 Naive, Veh. 그룹을 제외하고 시험물질을 PBS에 부유시킨 뒤에 정맥 투여한다. PBS 및 시험물질 모두 200μl/head의 동일한 양으로 투여하였다.
아토피 피부염에 대한 효과를 확인하기 위한 혈액샘플은 다음과 같은 방식으로 수득하였다. 모든 실험동물은 세포안정화제 또는 시험물질 투여 후 13일 째에 isoflurane을 이용하여 마취한 후 복부를 절개하여 후대정맥을 노출시킨 후에 1ml syringe를 이용하여 약 700μl 채혈하였다. 채혈한 혈액은 Serum separate tube에 담고 3,000rpm/15분, 4℃ 에서 원심분리 후에 serum을 분리하고, 분리된 serum은 1.5ml e-tube에 담아 -70℃ deep freezer에 보관하였다.
아토피 피부염에 대한 효과분석을 위하여 모든 실험동물의 serum sample은 ELISA kit를 이용하여 total IgE, IgG1, IgG2a의 농도를 측정하였고, 측정 방법은 kit내 프로토콜에 준하여 실시하였다. 구체적으로 혈액 내 IgE level 측정은 먼저 후대정맥을 통해 채혈한 혈액은 EDTA tube에 담아 3,000rpm/15분 동안 원심분리 하여 상층액만 분리하여 실험 전까지 -70℃에 보관하여 수행하였다. ELISA plate에 IgE를 인지할 수 있는 capture antibody를 coating buffer와 함께 4℃에 overnight 보관하고 다음 날 1시간 동안 blocking 과정을 거친 후 serum을 100배 희석하여 50μl의 양으로 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후 IgE를 인지하는 2차 항체를 넣은 후 substrate buffer인 TMB solution을 넣고 약 15분 정도 반응시킨 후 50μl의 stop solution을 넣었다. 측정은 ELISA reader기를 이용하여 450nm의 filter에서 값을 측정하였다.
실험 종료 시점에서 적출한 피부조직은 4% 포르말린 용액에 고정시킨 후 조직절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색 및 진피 내 침윤된 비만세포를 염색하는 toluidine blue 염색을 하였다. 염색한 조직은 광학현미경의 200배율 하에서 진피 및 표피의 두께를 측정하였으며, 100배율하에서 염증세포 침윤 및 비만세포의 증감도를 측정하였다. 피부 두께 및 비만세포 측정은 PAINT.NET 프로그램을 이용하여 진행하였다.
모든 실험동물로부터 샘플링한 skin과 axillary lymph node에서 qPCR master mix를 이용하여 IL-4, IL-5, IL-10, IL-17, IL-31, TNF-α, TGF-β, IFN-γ, TSLP 등의 발현량을 측정하였다. 측정 방법은 qPCR 내 프로토콜에 준하여 실시하였으며 구체적으로 Real-time PCR을 하기 위해 실험동물의 피부조직에서 mRNA를 분리하였다. RNA는 피부조직에 1ml trizol 용액을 넣고 막자를 통해 마쇄한 후 분리하여 얻었다. 분리한 RNA의 1μg을 cDNA로 만들기 위해 genomic DNA elimination reaction시킨 후, reverse-transcription enzyme을 추가하여 20분간 반응시켰다. Real-time PCR은 이중 DNA에 특이적 결합하는 SYBR FAST qPCR master mix를 사용하여 실험을 수행하였다. 시료는 cDNA 5μl, qPCR master mix(2X) 10μl, specific target primer 1μl, DW 4μl로 모두 20μl의 부피가 되도록 준비하였다. PCR은 총 45cycle로 진행하며, GAPDH로 target gene을 보정한 ratio를 수치화 하였다.
실험 결과의 모든 측정값은 평균±표준오차로 계산하여 나타냈으며, 통계학적 분석은 Prism 7.05 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 1Way ANOVA, Tukey’s multiple comparison test를 통해 실시했으며, p value 는 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
5.3 아토피 피부염 동물 모델 체중 및 세포 생존률 확인
아토피 피부염 유발 동물 모델의 희생 시점 (D-59) 에 각 그룹별 체중을 측정하였으며, cMSC1 및 cMSC2 의 투여에 의한 총 세포수 및 세포 생존률을 Automated cell counters and cell analyzers(NC-250™ 방법을 통해 확인하고, 그 결과를 도 35 및 도 36 에 나타내었다.
도 35 에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염이 유발된 동물 모델 및 cMSC1, 2 를 투여한 군 별 개체의 몸무게는 차이가 없었으며, 도 36에 나타낸 바와 같이 2일 간격으로 3회 미정맥으로 cMSC1 (100cm 2 및 1000cm 2) 및 cMSC2 (4000cm 2)를 주입한 군에서 평균 세포 생존율은 90% 이상인 것을 확인하였다.
5.4 IgE 발현 억제 효과 확인
실시예 4.3에서는 SCM-cMSC 의 투여가 GCM-MSC 투여와 비교하여 아토피 피부염 동물 모델에서 IgE 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 이에 층분리 배양법으로 수득한 줄기세포 사이에서도 밀도 차이에 의하여 혈청에서 IgE 억제 효과가 상이하게 나타나는지 여부를 확인하기 위한 ELISA 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로 실시예 5.2 에서 제조한 아토피 피부염 동물 모델을 D-59 시점에 희생시키고, 희생시점에서 후대 정맥을 통해 채취한 혈액으로부터 혈청을 수득하여 IgE ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 37에 나타내었다.
도 37에 나타낸 바와 같이, cMSC1, cMSC2 투여군 모두는 Vechicle 처리군에 비해 IgE 억제 효과가 나타났으나, 저밀도 배양 단계를 포함하는 개선된 층분리 배양법에 의한 cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2) 실험군에서 고밀도 배양 cMSC2 대비 더욱 우수한 IgE 억제 효과를 확인하였다. 이는 저밀도에서 배양하여 수득되는 단일 클로날 줄기세포가 IgE 수준을 더욱 현저하게 낮출 수 있어, 아토피 피부염에 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다.
5.4 피부 병변 육안 소견 확인
실시예 5.2에서 제조한 총 7마리의 아토피 피부염 마우스에 PBC 단독 (Vechicle), cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2), cMSC2 를 도포하고 피부 병변 부위에서 아토피 피부 증상의 회복정도를 육안으로 확인하였다. 병변에 대한 육안 소견으로 아토피 피부염 유발된 등 부위에서의 상처, 홍반, 각질 정도를 비교하여 확인하였으며, 피부 표피의 두께 변화를 H&E 염색을 통해 확인하고 그 결과를 도 38 및 도 39에 나타내었다.
도 38에 나타낸 바와 같이, 육안 상 cMSC2 보다 cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2) 군에서 피부 병변 개선 효과를 확인하였고, 보다 저밀도인 100 세포/cm 2를 도포한 군에서 보다 우수한 병변 개선 효과를 확인하였다.
도 39에 나타낸 바와 같이, cMSC2 와 비교하여 cMSC1 (100, 1000 세포/cm 2) 도포군에서 표피 비후 완화 효과가 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 개선된 공정을 통해 수득한 cMSC1을 이용하면 종래 밀도구배 층분리 배양법을 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포와 비교하여 더욱 우수한 항염증 효과를 나타낼 수 있으므로, 개선된 아토피 피부염 개선 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한, 저밀도 배양 단계를 포함하는 개선된 층분리 배양방법으로 수득된 줄기세포 (cMSC1) 의 경우, 고밀도 배양 단계를 포함하는 층분리 배양법으로 수득된 줄기세포 (cMSC2)와 비교하여 보다 우수한 아토피 피부염 개선 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

Claims (14)

1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 2 내지 계대 8 로 배양하는 것인, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 아토피 피부염이 유발된 진피 또는 표피의 비후를 완화시키는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 IgE, IgG1 및 IL-4 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생산을 억제하거나 INF-γ 의 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일 클로날 줄기세포는 비만 세포를 억제하는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 단일 클로날 줄기세포를 포함하는, 아토피 피부염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계를 통해 단일 클로날 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양은 계대 2 내지 계대 8 배양인, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 5) 단계의 배지는 항산화제가 추가된 배지인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
1) 개체로부터 분리된 골수를 제1용기에서 배양하는 단계;
2) 상기 제1 용기의 상층액만 새로운 용기로 이동하여 배양하는 단계;
3) 상기 새로운 용기에 존재하는 세포를 배양하고 상층액을 수득하는 단계;
4) 상기 3) 단계의 상층액을 2) 단계의 제1용기의 상층액으로 하여 2) 및 3) 단계를 1회 이상 반복하여 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 및
5) 상기 4) 단계의 단일 클로날 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm 2 (cells/cm 2) 의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계; 를 통해 수득되는 아토피 피부염 예방, 개선 또는 치료용 줄기세포.
PCT/KR2019/018089 2019-01-16 2019-12-19 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2020149538A1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980086599.6A CN113226338A (zh) 2019-01-16 2019-12-19 包含克隆干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物
JP2021540268A JP7493814B2 (ja) 2019-01-16 2019-12-19 クローナル幹細胞を含むアトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物
KR1020217018024A KR20210087999A (ko) 2019-01-16 2019-12-19 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
EP19909999.5A EP3903793A4 (en) 2019-01-16 2019-12-19 PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH CLONAL STEM CELLS FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS
US16/992,825 US11413313B2 (en) 2019-01-16 2020-08-13 Pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising clonal stem cells
JP2024016541A JP2024040280A (ja) 2019-01-16 2024-02-06 クローナル幹細胞を含むアトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962793022P 2019-01-16 2019-01-16
US62/793,022 2019-01-16

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US201916631575A A-371-Of-International 2019-01-16 2019-12-19
US16/992,825 Continuation US11413313B2 (en) 2019-01-16 2020-08-13 Pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising clonal stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020149538A1 true WO2020149538A1 (ko) 2020-07-23

Family

ID=71614139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/018089 WO2020149538A1 (ko) 2019-01-16 2019-12-19 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3903793A4 (ko)
JP (2) JP7493814B2 (ko)
KR (1) KR20210087999A (ko)
CN (1) CN113226338A (ko)
TW (1) TWI826635B (ko)
WO (1) WO2020149538A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020190023A2 (ko) * 2019-03-19 2020-09-24 에스씨엠생명과학 주식회사 단일 클로날 줄기세포를 이용한 아토피 피부염 치료 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060075676A (ko) 2004-12-28 2006-07-04 현익근 비닐,고무,천막재료로 쥬부식 기둥과 지붕,벽,바닥을만들어 에이야를 주입시켜 야영하우스와 침실을 만드는 방법
KR20070018738A (ko) * 2005-08-10 2007-02-14 인하대학교 산학협력단 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법
KR20150065147A (ko) * 2013-11-29 2015-06-12 인하대학교 산학협력단 클로날 중간엽 줄기세포를 포함하는, 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20160002490A (ko) * 2014-06-30 2016-01-08 가톨릭대학교 산학협력단 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005121320A1 (ja) 2004-06-10 2008-04-10 協和醗酵工業株式会社 幹細胞自己複製促進剤
US8796020B2 (en) * 2005-06-17 2014-08-05 Inha-Industry Partnership Institute Manufacturing process for fresh and frozen stem cells
JP7015316B2 (ja) * 2017-01-11 2022-02-02 ステムラボ・インコーポレイテッド ナノグを導入した羊水内胎児由来間葉系幹細胞から獲得したエクソソーム内に含まれた育毛促進用組成物の製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060075676A (ko) 2004-12-28 2006-07-04 현익근 비닐,고무,천막재료로 쥬부식 기둥과 지붕,벽,바닥을만들어 에이야를 주입시켜 야영하우스와 침실을 만드는 방법
KR20070018738A (ko) * 2005-08-10 2007-02-14 인하대학교 산학협력단 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법
KR20150065147A (ko) * 2013-11-29 2015-06-12 인하대학교 산학협력단 클로날 중간엽 줄기세포를 포함하는, 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20160002490A (ko) * 2014-06-30 2016-01-08 가톨릭대학교 산학협력단 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEON, MYUNG-SHIN ET AL.: "Characterization of mouse clonal mesenchymal stem cell lines established by subfractionation culturing method", WORLD JOURNAL OF STEM CELLS, 8 March 2011 (2011-03-08), pages 70 - 82, XP055352849 *
NA, K: "Bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells inhibit ovalbumin-induced atopic dermatitis", CELL DEATH AND DISEASE, 2014, pages e1345, XP055725660 *
See also references of EP3903793A4

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210087999A (ko) 2021-07-13
EP3903793A4 (en) 2022-11-02
JP2024040280A (ja) 2024-03-25
TW202039834A (zh) 2020-11-01
CN113226338A (zh) 2021-08-06
TWI826635B (zh) 2023-12-21
JP2022517983A (ja) 2022-03-11
EP3903793A1 (en) 2021-11-03
JP7493814B2 (ja) 2024-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018097540A2 (ko) 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물
WO2012026712A2 (ko) Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2015056982A1 (ko) 만능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포
WO2013176471A1 (ko) 곰보배추의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, stat3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2016048107A1 (ko) 인터페론-감마 또는 인터류킨-1베타를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2016006788A1 (ko) 작은 크기 줄기세포의 발모 촉진능 및 이의 용도
WO2019198995A1 (ko) 엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법
WO2018056706A1 (ko) 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 노화 줄기세포의 역노화용 조성물 및 이의 용도
WO2020149538A1 (ko) 클로날 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022045635A1 (ko) 배롱나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물
WO2019216623A1 (ko) 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법
WO2019022482A2 (ko) 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2024123024A1 (ko) 중대가리풀 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물 및 이의 제조 방법
WO2019004738A2 (ko) 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도
WO2023113541A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or inflammatory disease
WO2020096234A1 (ko) 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020130431A1 (ko) 클로날 줄기세포를 포함하는 이식편대숙주질환 치료용 약학적 조성물
WO2015023165A1 (ko) 염증조절복합체 및 ｓｔａｔ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포
WO2022245138A1 (ko) 기능강화 줄기세포를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물
WO2020122498A1 (ko) 클로날 줄기세포를 포함하는 췌장염 치료용 약학적 조성물
WO2015023147A1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
WO2022092523A1 (ko) 중대가리풀 유래의 추출물을 포함하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료용 조성물
WO2021251790A1 (ko) 항비만 활성을 가지는 디옥시콜산-펩타이드 결합체 및 이의 용도
WO2015190808A2 (ko) 작은 크기의 줄기세포의 미백능 및 이의 용도
WO2015194710A1 (ko) Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19909999

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20217018024

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021540268

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019909999

Country of ref document: EP

Effective date: 20210622