WO2020149258A1 - 免疫チェックポイント阻害剤 - Google Patents

免疫チェックポイント阻害剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2020149258A1
WO2020149258A1 PCT/JP2020/000874 JP2020000874W WO2020149258A1 WO 2020149258 A1 WO2020149258 A1 WO 2020149258A1 JP 2020000874 W JP2020000874 W JP 2020000874W WO 2020149258 A1 WO2020149258 A1 WO 2020149258A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
caveolin
peptide fragment
cav
antibody
positive
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/000874
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
圭 大沼
幾夫 森本
良 波多野
Original Assignee
学校法人順天堂
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人順天堂 filed Critical 学校法人順天堂
Priority to JP2020566410A priority Critical patent/JPWO2020149258A1/ja
Publication of WO2020149258A1 publication Critical patent/WO2020149258A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a new immune checkpoint inhibitor and antineoplastic agent.
  • the body's immune system has a mechanism to maintain the life of an individual by creating effector T lymphocytes that recognize cancer cell antigens and eliminate cancer cells.
  • cancer cells have various mechanisms to escape attacks from the immune system.
  • IL-10 interleukin-10
  • TGF- ⁇ tumor growth factor- ⁇
  • Treg regulatory T cell
  • DC dendritic cells
  • PD-1 programmed cell death protein-1
  • CTLA-4 CTLA-4
  • Immune checkpoint molecules such as cytotoxic T-lymphocyte associated protein-1) are induced to be expressed on the surface of T cells and send a negative signal to effector T lymphocytes, resulting in suppression of antitumor T cell function.
  • cancer cells themselves activate the immune checkpoint mechanism by expressing the PD-1 receptor ligand (PD-L1 programmed death ligand-1), and escape from immune surveillance to carry out proliferation, invasion, and metastasis.
  • Non-Patent Document 2 the response rate of cancer treatment with existing immune checkpoint inhibitors is only 5 to 30%, and it is necessary to develop an immune checkpoint inhibitor having a more antitumor effect.
  • caveolin-1 is a costimulatory ligand for CD26, a marker for T cell activation.
  • the present inventor has found that a protein (Cav-Ig) in which the N-terminal region of human caveolin 1 is fused to the constant region of immunoglobulin suppresses memory antigen and allogeneic immune reaction (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 a protein in which anti-caveolin 1 antibody exhibits an antitumor effect.
  • the object of the present invention is to provide a new immune checkpoint inhibitor and antineoplastic agent.
  • the present inventor found that a fusion protein of the N-terminal region of caveolin-1 and the immunoglobulin constant region is an immune checkpoint molecule by the CD26-caveolin-1 signal in the cancer microenvironment.
  • the present invention has been completed by finding that antitumor immunity is exerted by inhibiting activation and that the antitumor immunity is maintained as memory immunity for a long period of time.
  • the present invention provides the following [1] to [12].
  • An antineoplastic agent comprising a combination of the immune checkpoint inhibitor described in [1] and one or more antibodies selected from anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody.
  • Caveolin 1 N-terminal region peptide fragment for inhibiting immune checkpoint caveolin 1 scaffolding domain sequence peptide fragment, caveolin 1 N-terminal region scaffolding domain deleted peptide fragment, One or more selected from a peptide fragment of the caveolin-1 binding region of CD26, and a fusion protein of any one of these peptide fragments and an immunoglobulin constant region.
  • Caveolin-1 N-terminal region peptide fragment caveolin-1 scaffolding domain sequence peptide fragment, caveolin-1 N-terminal region scaffolding domain-deleted peptide fragment, CD26 for treating malignant tumors Caveolin 1-binding domain peptide fragment, and an immune checkpoint inhibitor containing one or more selected from fusion proteins of any of these peptide fragments and an immunoglobulin constant domain, and anti-PD-1 antibody and anti-PD -A combination with one or more antibodies selected from L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention inhibits immune checkpoint molecule activation by the CD26-caveolin-1 signal and exerts excellent antitumor immunity, and the antitumor immunity is maintained as memory immunity for a long period of time. Therefore, the immune checkpoint inhibitor of the present invention has a molecular mechanism different from those of conventionally known immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody. When used in combination with the immune checkpoint inhibitor, it can be a more effective anti-neoplastic agent.
  • the ratio of LAG-3 positive CD26 positive cells (LAG3+CD26) in CD3 positive cells (CD3+Cells) in tumor infiltrating cells (TIL) is shown.
  • the ratio of PD-1 in CD8 positive cells (CD8+Cells) in tumor infiltrating cells (TIL) is shown.
  • the ratio of PD-1 in CD4-positive FoxP3-positive cells (CD4+FoxP3+Cells) in tumor infiltrating cells (TIL) is shown.
  • the ratio of Cav-1 positive CD11b positive (Cav+CD11b+CD11c+) in CD45 positive cells (CD45+Cells) in tumor infiltrating cells (TIL) is shown.
  • FIG. 7 shows the effect of prolonging the survival period of the Cav-Ig administration group on colorectal cancer mice.
  • 7 shows the effect of administration of Cav-Ig on colorectal cancer mice.
  • the effect of Cav-Ig on the cell proliferation of colorectal cancer (MTT assay) is shown.
  • the effect of Cav-Ig on the ratio of Cav-1 positive CD11b positive CD11c positive (Cav+CD11b+CD11+) in CD45 positive cells (CD45+Cells) is shown.
  • FIG. 7 shows the effect of Cav-Ig on the ratio of IFN ⁇ positive (IFN ⁇ +) in CD8 positive cells (CD8+Cells).
  • the effect of Cav-Ig on the ratio of CD4-positive FoxP3-positive cells is shown.
  • the effect of Cav-Ig on the ratio of Cav-1 positive CD11b positive CD11c positive (CAV+CD11b+CD11c+) in CD45 positive cells is shown.
  • 7 shows the effect of intravenous administration of Cav-Ig on subcutaneously transplanted mouse colon cancer cells.
  • the means for establishing PD-L1 knockdown clones is shown.
  • 7 shows the effect of Cav-Ig on PD-L1 knockdown mouse colon cancer.
  • 3 shows the effect of Cav-Ig on colorectal cancer cell line CMT93.
  • the ratio of LAG-3-positive CD26-positive cells (LAG3+CD26) in CD3-positive cells (CD3+Cells) in the tumor infiltrating cells (TIL) in the colon cancer cell line CMT93 is shown.
  • the ratio of IFN ⁇ -positive cells in CD8-positive cells in colorectal cancer (CMT93) is shown.
  • the ratio of CD4-positive FoxP3-positive cells in colorectal cancer (CMT93) is shown.
  • the ratio of Cav-1 positive cells in CD45 positive DC cells in colorectal cancer is shown.
  • the effect (survival rate) of Cav-Ig on a breast cancer mouse is shown.
  • 3 shows the effect of Cav-Ig on breast cancer mice (bioimaging).
  • the ratio of LAG-3-positive CD26-positive cells (LAG3+CD26) in CD3-positive cells (CD3+Cells) in tumor infiltrating cells (TIL) in breast cancer is shown.
  • the ratio of IFN ⁇ -positive cells in CD8-positive cells in breast cancer is shown.
  • the ratio of CD4 positive FoxP3 positive cells in breast cancer is shown.
  • the ratio of Cav-1 positive cells in CD45 positive DC cells in breast cancer is shown.
  • 3 shows the effect of Cav-Ig on lung cancer (bioimaging).
  • the effect of Cav-Ig on a lymphoma (biological imaging) is shown.
  • 3 shows the effects of NT-Fc, NT ⁇ SCD-Fc, and SCD-Fc on mouse B-cell lymphoma (biological imaging).
  • CD26 was reported as a T cell surface antigen, but was later established as a T cell activation antigen.
  • CD26 has been found to be involved in the T cell signaling process as a costimulatory molecule, and it is known that the costimulatory ligand of CD26 is caveolin-1 (Cav-1). That is, CD26 is a 110-kDa membrane glycoprotein that is selectively expressed on human memory T cells and is deeply involved in caveolin-1 mediated memory T cell proliferation and inflammatory cytokine production on antigen-presenting cells. It is a molecule.
  • the amino acid sequence of caveolin 1 is known, and consists of a sequence of 178 amino acids (SEQ ID NO: 1), the 1-101th is the N-terminal region, and the 102-134th is the hydrophobic transmembrane region. .. In addition, 82-101st of the N-terminal region is a scaffolding domain.
  • the active ingredient of the immunological checkpoint inhibitor of the present invention includes a peptide fragment of the N-terminal region of caveolin 1, a peptide fragment of the scaffolding domain sequence of caveolin 1, a peptide fragment in which the scaffolding domain is deleted from the N-terminal region of caveolin 1, One or more selected from peptide fragments of the caveolin-1 binding region of CD26 and fusion proteins of any of these peptide fragments and immunoglobulin constant regions. Specifically, (1) a peptide fragment of the N-terminal region of caveolin 1 (Cav-1-NT: SEQ ID NO: 2); (2) a peptide fragment of the caveolin 1 scaffolding domain sequence (Cav-1-SCD: sequence No.
  • a fusion protein of the peptide fragment of the above (1) to (4) and an immunoglobulin constant region is more preferable, and a fusion protein of the peptide fragment of the N-terminal region of caveolin 1 and an immunoglobulin constant region is particularly preferable. Is preferred.
  • these active ingredients are known to have caveolin-1 and CD26 molecule amino acid sequences, they can be produced by various methods such as gene recombination and peptide synthesis. Further, the fusion protein can be produced by a gene recombination method as described in Patent Document 1, for example.
  • the peptide fragment or fusion protein exerts antitumor immunity by inhibiting CD26-Cav-1 signal-mediated immune checkpoint molecule activation in the cancer microenvironment, as shown in the Examples below, It has been shown that immunity is maintained for a long time as memory immunity.
  • the peptide fragment or fusion protein is useful as a therapeutic agent for not only autoimmune diseases in hyperimmune state by controlling immune abnormalities but also for tumors that have escaped immune surveillance due to immune checkpoint stimulation by CD26-Cav-1. is there.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention is effective not only for colorectal cancer but also for other cancers (for example, gastric cancer, lung cancer, pancreatic cancer). , Breast cancer, melanoma, malignant mesothelioma, uterine cancer, ovarian cancer, etc.). Furthermore, since the CD26-Cav-1 signal system has a completely different molecular mechanism from the existing immune checkpoint signals PD-1/PD-L1 and CTLA-4/CD80/CD86, the immune checkpoint inhibition of the present invention. When the agent is used in combination with PD-1 antibody, PD-L1 antibody and CTLA-4 antibody which are currently used clinically, a more effective antitumor effect can be obtained.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention should be formulated for oral or parenteral use by mixing, dissolving, emulsifying, encapsulating, lyophilizing, etc. together with a pharmaceutically acceptable carrier well known in the art. You can
  • Suitable formulations for oral administration include a liquid preparation in which the peptide fragment or the fusion protein is dissolved in an effective amount in a diluent such as water or physiological saline, a capsule or a granule containing the effective amount as a solid or granules. Powders or tablets, suspensions in which an effective amount is suspended in an appropriate dispersion medium, and emulsions in which a solution in which an effective amount is dissolved are dispersed in an appropriate dispersion medium.
  • the peptide fragment or the fusion protein is injectable solution, suspension, emulsion, cream together with a pharmaceutically acceptable solvent, excipient, binder, stabilizer, dispersant and the like. It can be formulated into a dosage form such as an agent, an ointment, an inhalant and a suppository.
  • the peptide fragment or fusion protein can be dissolved in an aqueous solution, preferably Hank's solution, Ringer's solution, or a physiologically compatible buffer such as a saline buffer.
  • the medicament of the present invention can take the form of a suspension, solution, emulsion or the like in an oily or aqueous vehicle.
  • the peptide fragment or fusion protein may be produced in the form of powder, and an aqueous solution or suspension may be prepared using sterile water or the like before use.
  • the peptide fragment or fusion protein may be powdered and made into a powder mixture with a suitable base such as lactose or starch.
  • Suppository formulations can be made by mixing the peptide fragment or fusion protein with a conventional suppository base such as cocoa butter.
  • the pharmaceutical agent of the present invention can be enclosed in a polymer matrix or the like and formulated as a sustained-release preparation.
  • the dose of the peptide fragment or fusion protein varies depending on the patient's symptoms, administration route, body weight, age, etc., but is preferably 1 ⁇ g to 500 mg per day for an adult.
  • the form of the anti-malignant tumor agent comprising the above-mentioned immune checkpoint inhibitor of the present invention and one or more kinds of antibodies selected from anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody is, for example,
  • the checkpoint inhibitor for administering the combination of the checkpoint inhibitor and the antibody simultaneously or separately, or sequentially. It may be a medicine in which the above-mentioned antibody is combined as a separate administration unit.
  • a fusion protein was produced according to the description of the Example of Patent Document 1.
  • Caveolin-1 N-terminal region fusion protein (Cav-1-NT-Fc ⁇ 1 (NT-Fc); referred to as “Cav-Ig” in the following test examples)
  • Fusion protein (Cav-1-NT ⁇ SCD-Fc ⁇ 1 (NT ⁇ SCD-Fc)) of a peptide fragment lacking the scaffolding domain and an immunoglobulin constant region, and a peptide fragment of the caveolin 1 scaffolding domain sequence and an immunoglobulin constant region
  • a fusion protein with (Cav-1-SCD-Fc ⁇ 1 (SCD-Fc)) was prepared.
  • the 1st to 101st amino acid residue portion (NT), the 1st to 82nd amino acid residue portion (NT ⁇ SCD) of the N-terminal region of human caveolin 1 and the 82nd to 101st amino acid residue portion ( SCD) was generated by PCR and incorporated into the fusion protein expression vector.
  • the 1-101 amino acid portion (NT), 1-82 amino acid portion (NT ⁇ SCD), and 82-101 amino acid portion (SCD) of caveolin-1 were in-framed. It was cloned to construct a caveolin-1-Fc fusion protein expression vector.
  • P CAG CAG promoter
  • huECDSP human E-cadherin signal peptide
  • huFc ⁇ 1 Fc portion of human IgG1 (human IgG-H chain hinge+C H 2+C H 3 portion).
  • TIL single cell suspension
  • Spleen single cell suspension
  • a single cell suspension was stained with mouse LAG-3 antibody (FITC labeled), mouse CD26 antibody (PE labeled) and mouse CD3 antibody (PerCP labeled), and LAG in CD3 positive cells was analyzed using a flow cytometer.
  • -3 positive CD26 positive cells were measured and recorded as a percentage (measurement values are indicated by dots, average values are indicated by one long horizontal line in the middle, and standard deviation values are indicated by two short horizontal lines above and below).
  • the results are shown in Figure 1.
  • LAG-3-positive CD26-positive T cells of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) were 5.08% ⁇ 1.93, and AG-3-positive CD26-positive T cells of spleen lymphocytes were 0.86% ⁇ 0.93.
  • TIL's AG-3-positive CD26-positive T cells were significantly increased (p ⁇ 0.0001, Two-tailed Student's t-test).
  • TIL Tumor infiltrating lymphocytes
  • the PD-1 positive FoxP3 positive Treg cells of TIL were 38.25% ⁇ 3.43, the PD-1 positive FoxP3 positive Treg cells of spleen lymphocytes were 5.97% ⁇ 0.66, and the PD-1 positive Treg cells of TIL were Cells were significantly increased (p ⁇ 0.0001, Two-tailed Student's t-test).
  • CD45 positive DC cells were measured using a flow cytometer and recorded as a percentage (measurement values are indicated by dots, the average value is one long horizontal line in the middle, and the standard deviation value is a short horizontal line above and below). Two are shown). The results are shown in Fig. 4.
  • Cav-1 positive DC cells of tumor infiltrating cells were 28.72% ⁇ 2.60, PD-1 positive CD8 T cells of splenic lymphocytes were 3.02% ⁇ 0.48, and TIL Cav-1 positive DC cells were There was a significant increase (p ⁇ 0.0001, Two-tailed Student's t-test).
  • TIL significantly increased LAG-3-positive CD26-positive T lymphocytes as compared to spleen, which is a control organ in the non-tumor region (FIG. 1).
  • PD-1 which is a typical immune checkpoint molecule
  • TIL Treg the expression of immune checkpoint molecule PD-1 was significantly increased as compared with the spleen in the non-tumor region (FIG. 3).
  • infiltration of Cav-1-positive DC was significantly increased in the tumor part (FIG. 4).
  • the survival rate of each group was analyzed by the Kaplan-Meier method and shown in FIG.
  • the survival period of the Cav-Ig administration group (black solid line) was significantly longer than that of the non-administration group (gray solid line) and the control Ig administration group (black dot line) (p ⁇ 0.0001, Log-rank test). ).
  • D-luciferin 150 mg/kg of mouse body weight
  • the tumor was evaluated by bioluminescence intensity in In Vivo Imaging System). Representative bioimaging pictures for each group were presented ( Figure 6). Strong bioluminescence was detected in the abdomen of the non-administered group and the control Ig-administered group, indicating that the tumor is growing. On the other hand, in the Cav-Ig administration group, bioluminescence was not observed, or even if it was observed, only slight luminescence was detected, and tumor growth was suppressed.
  • TIL tumor infiltrating cells
  • TIL single cell suspension was stained with mouse LAG-3 antibody (FITC-labeled), mouse CD26 antibody (PE-labeled) and mouse CD3 antibody (PerCP-labeled), and CD3-positive cells were stained using a flow cytometer. LAG-3-positive CD26-positive cells were counted and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 8). LAG-3-positive CD26-positive T cells of the tumor infiltrating cells were 5.08% ⁇ 1.93 in the non-administration group (black graph) and 4.87% ⁇ 1.56 in the control Ig-administered group (grey graph). , Cav-Ig administration group was 1.17% ⁇ 1.11 (black frame, white-filled graph). LAG-3-positive CD26-positive T cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • CD8 T cells were purified from a TIL single cell suspension (using mouse CD8+ T Cell Isolation Kit), and CD3 antibody and CD28 antibody were added in Monensin-added culture solution, followed by stimulation for 4 hours, and then BD Cytofix/Cytoperm Staining of intracellular interferon ⁇ (IFN ⁇ ) (FITC labeled) and cell surface CD8 (PE labeled) was performed using Kit. IFN ⁇ positive cells in CD8 positive cells were measured using a flow cytometer and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 9).
  • IFN ⁇ intracellular interferon ⁇
  • PE labeled cell surface CD8
  • IFN ⁇ -positive CD8 T cells of tumor-infiltrating lymphocytes were 44.12% ⁇ 5.48 in the non-administered group (black graph), 39.52% ⁇ 8.42 in the control Ig-administered group (grey graph), Cav- In the Ig administration group, it was 66.95% ⁇ 12.34 (black frame, white-painted graph).
  • IFN ⁇ -positive CD8 T cells in TIL were significantly increased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • TIL single cell suspension was stained with mouse CD3 antibody (FITC) and CD4 antibody (PE labeled), and then intracellular FoxP3 (APC labeled) was performed with Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit.
  • Treg cells were counted using a flow cytometer and recorded as a percentage of the number of CD3-positive T cells. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 10).
  • CD4-positive FoxP3-positive Treg cells of the tumor infiltrating lymphocytes were 9.75% ⁇ 3.28 (black graph) in the non-administered group, 10.05% ⁇ 4.60 (grey graph) in the control Ig-administered group, In the Cav-Ig administration group, it was 2.87% ⁇ 1.36 (black frame, white-filled graph).
  • CD4-positive FoxP3-positive Treg cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • TIL single cell suspension is stained with mouse CD45 antibody (PerCP labeled), mouse CD11b antibody (PE labeled), mouse CD11c antibody (PE labeled), Caveolin-1 (Cav-1) antibody (Alexa488 labeled) Then, the Cav-1 positive cells in the CD45 positive DC cells were measured using a flow cytometer and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 11). Cav-1 positive DC cells of the tumor infiltrating cells were 31.00% ⁇ 5.44 (black filled graph) in the non-administration group, 26.30% ⁇ 11.30 (grey filled graph) in the control Ig administration group, Cav.
  • D-luciferin 150 mg/kg of mouse body weight
  • the tumor was bioluminescent by the bioimaging method (Caliper IVIS Lumina II In Vivo Imaging System). The strength was evaluated. Representative bioimaging pictures for each group were presented ( Figure 13). In the non-administered group, strong bioluminescence was detected in the abdomen, indicating that the tumor is growing. On the other hand, no bioluminescence was detected in the group of mice that survived after Cav-Ig administration, and tumor growth was suppressed.
  • JCRB1496 obtained from JCRB cell bank
  • D-luciferin (150 mg/kg of mouse body weight) was intraperitoneally administered to mice 30 days after tumor inoculation, and 10 minutes later, the tumor was evaluated by bioluminescence intensity by a bioimaging method (Caliper IVIS Lumina II In Vivo Imaging System). (FIG. 14).
  • a bioimaging method Caliper IVIS Lumina II In Vivo Imaging System.
  • FIG. 14 In the control Ig-administered group, strong bioluminescence was detected in the abdomen, indicating that the tumor was growing (one patient died 25 days after tumor inoculation due to tumor growth).
  • the Cav-Ig administration group bioluminescence was not observed, or even if it was observed, only slight luminescence was detected, and tumor growth was suppressed.
  • the above results indicate that the antitumor effect of Cav-Ig is recognized not only by intra-abdominal orthotopic administration but also as a therapeutic effect via blood circulation, that is, it can be demonstrated by a method closer to the clinical administration method.
  • Test Example 6 Anti-tumor effect of Cav-Ig on PD-1/PD-L1 inhibitor resistant tumor (demonstrative example of effect of Cav-Ig exceeding existing immune checkpoint inhibitor)
  • Mouse tumor cell line CMS5a derived from mouse fibrosarcoma
  • immune checkpoint inhibitors PD-1/PD-L1 inhibitor and CTLA-4 inhibitor.
  • Tumor size was measured over time (tumor volume mm 3 was measured as 0.5 ⁇ (major axis mm) ⁇ (width mm) 2 ).
  • the time-dependent change in tumor volume of each group was shown (FIG. 15).
  • the tumors in the mouse anti-PD-1 antibody administration group, mouse anti-PD-L1 antibody administration group and mouse CTLA-4 antibody group increased with time. It was shown to be resistant to checkpoint inhibitors.
  • the Cav-Ig administration group the tumor was significantly reduced and the antitumor effect was observed. (Time 20 days after tumor inoculation: Cav-Ig vs anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody or CTLA-4 antibody or control Ab; p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey- Kramer test).
  • Test Example 7 Furthermore, in order to demonstrate that the present invention has an effect over existing immune checkpoint inhibitors (PD-1/PD-L1 inhibitors), a mouse colon cancer cell line Colon26 in which PD-L1 molecules are knocked down was established. Then, an in vivo treatment experiment was performed. ShRNA (SMARTvector Mouse Lentiviral Cd274 shRNA (Dharmacon)) or control shRNA that suppresses the expression of mouse PD-L1 is transfected with TransDux MAX Lentiviral Transfectant (System B) infected with TransDux MAX Lentiviral Transients (Systems).
  • ShRNA SMARTvector Mouse Lentiviral Cd274 shRNA (Dharmacon)
  • System B TransDux MAX Lentiviral Transfectant
  • Systems TransDux MAX Lentiviral Transients
  • Infected clones were selected by GFP luminescence and addition of puromycin drug, and PD-L1 expression was analyzed by Western blot. The effect of shRNA was examined also in the clones in which 10 ng/mL of IFN ⁇ was added to induce PD-L1 up-regulation and cultured for 24 hours. As shown in FIG. 16, a PD-L1 knockdown clone was established in Colon26 cells (lane marked with *) (hereinafter referred to as Colon26-Pdl1-KO).
  • Colon26-Pdl1-KO was subcutaneously inoculated (5 ⁇ 10 5 /mouse) in the flank of Balb/C mice, and Cav-Ig (10 ⁇ g/dose) was administered on the 7th, 9th, and 11th days, respectively.
  • Anti-PD-1 antibody 200 ⁇ g/dose
  • mouse anti-PD-L1 antibody 200 ⁇ g/dose
  • control Ab control Ab
  • Tumor size was measured over time (tumor volume mm 3 was measured as 0.5 ⁇ (major axis mm) ⁇ (width mm) 2 ). The temporal change in tumor volume of each group was shown (FIG. 17).
  • tumors increased with time, and Colon26-Pdl1-KO inhibits PD-1/PD-L1 which is an existing immune checkpoint inhibitor. It was shown to be resistant to the drug.
  • the Cav-Ig administration group the tumor was significantly reduced and the antitumor effect was observed (at 20 days after tumor inoculation: Cav-Ig vs anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody or control).
  • Cav-Ig was shown to have an antitumor effect against conventional immune checkpoint inhibitor-resistant carcinomas, and the existing PD-1/PD-L1 inhibitors were shown. It has been shown to be a novel drug that exerts an effect exceeding that of a CTLA-4 inhibitor.
  • Test Example 8 Antitumor effect of Cav-Ig on colon cancer cell line CMT93 other than Colon26
  • the Cav-Ig-administered group (black solid line) had a significantly longer survival period than the non-administered group (grey solid line) and the control Ig-administered group (black dot line) (p ⁇ 0.0001, Log-rank test). ).
  • TIL tumor infiltrating cells
  • the LAG-3-positive CD26-positive T cells of the tumor infiltrating cells were 7.28% ⁇ 3.88 in the non-administered group (filled graph) and 9.52% ⁇ 5.38 in the control Ig-administered group (filled graph).
  • Cav-Ig administration group was 1.57% ⁇ 1.43 (black-framed white-filled graph).
  • LAG-3-positive CD26-positive T cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • CD8 T cells Purify CD8 T cells from TIL single cell suspension (using mouse CD8+ T Cell Isolation Kit), add CD3 antibody and CD28 antibody in Monensin-added culture medium, and stimulate for 4 hours, then use BD Cytofix/Cytoperm Kit Then, intracellular IFN ⁇ (FITC labeled) and cell surface CD8 (PE labeled) were stained. IFN ⁇ positive cells in CD8 positive cells were measured using a flow cytometer and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 20).
  • IFN ⁇ -positive CD8 T cells in tumor-infiltrating lymphocytes were 41.7% ⁇ 10.5 in the non-administered group (black graph), 46.7% ⁇ 9.9 in the control Ig-administered group (grey graph), Cav- In the Ig administration group, it was 73.0% ⁇ 12.2 (black-framed white-filled graph).
  • IFN ⁇ -positive CD8 T cells in TIL were significantly increased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • the cell surface of the TIL single cell suspension was stained with mouse CD3 antibody (FITC) and CD4 antibody (PE labeled), and then intracellular FoxP3 (APC labeling) was performed using Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit, and the flow site was analyzed. Treg cells were counted using a meter and recorded as a percentage of the number of CD3-positive T cells. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 21).
  • CD4 positive FoxP3 positive Treg cells of the tumor infiltrating lymphocytes were 6.65% ⁇ 2.00 in the non-administered group (black graph), 7.70% ⁇ 2.50 in the control Ig administered group (gray graph), In the Cav-Ig administration group, it was 2.51% ⁇ 2.11 (black frame, white-painted graph).
  • CD4-positive FoxP3-positive Treg cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • TIL single cell suspension was stained with mouse CD45 antibody (PerCP labeled), mouse CD11b antibody (PE labeled), mouse CD11c antibody (PE labeled), Caveolin-1 (Cav-1) antibody (Alexa488 labeled) and flow Cav-1 positive cells in CD45 positive DC cells were counted using a cytometer and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 22). Cav-1 positive DC cells of tumor infiltrating cells were 28.2% ⁇ 7.5 in the non-administered group (black-filled graph), 30.8% ⁇ 8.3 in the control Ig-administered group (grey-filled graph), Cav.
  • Test Example 9 Antitumor effect of Cav-Ig on carcinomas other than colon cancer (breast cancer, lung cancer, malignant lymphoma)
  • Breast cancer cell line 4T1 JCRB1447 (obtained from JCRB cell bank)
  • the survival rate of each group was analyzed by the Kaplan-Meier method and shown in FIG.
  • the Cav-Ig-administered group (black solid line) had a significantly longer survival period than the non-administered group (grey solid line) and the control Ig-administered group (black dot line) (p ⁇ 0.0001, Log-rank test). ).
  • D-luciferin (150 mg/kg of mouse body weight) was intraperitoneally administered to a mouse on the 20th day after tumor inoculation (7 times administration of Cav-Ig or control Ig), and 10 minutes later, a bioimaging method (Caliper IVIS Lumina II In Vivo Imaging System) was performed. ), the tumor was evaluated by bioluminescence intensity. Representative bioimaging pictures for each group were presented ( Figure 24). In the control Ig-administered group, strong bioluminescence was detected in the abdomen, which indicates that the tumor is growing. On the other hand, in the Cav-Ig administration group, bioluminescence was not observed, or even if it was observed, only slight luminescence was detected, and tumor growth was suppressed. The figure shows three representative individuals.
  • TIL single cell suspension was prepared using MACS Tissue Dissociation Kits. TIL single cell suspension was stained with mouse LAG-3 antibody (FITC labeled), mouse CD26 antibody (PE labeled) and mouse CD3 antibody (PerCP labeled) and LAG-3 in CD3 positive cells using a flow cytometer. Positive CD26 positive cells were counted and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 25).
  • the LAG-3-positive CD26-positive T cells of the tumor infiltrating cells were 13.3% ⁇ 6.1 in the non-administered group (black graph) and 12.6% ⁇ 5.1 in the control Ig-administered group (grey graph).
  • Cav-Ig administration group was 4.9% ⁇ 2.1 (black frame, white-painted graph).
  • LAG-3-positive CD26-positive T cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • CD8 T cells Purify CD8 T cells from TIL single cell suspension (using mouse CD8+ T Cell Isolation Kit), add CD3 antibody and CD28 antibody in Monensin-added culture medium, and stimulate for 4 hours, then use BD Cytofix/Cytoperm Kit Then, intracellular IFN ⁇ (FITC labeled) and cell surface CD8 (PE labeled) were stained. IFN ⁇ positive cells in CD8 positive cells were measured using a flow cytometer and recorded as a percentage. The results are shown as a mean value ⁇ standard deviation (FIG. 26).
  • IFN ⁇ -positive CD8 T cells of tumor infiltrating lymphocytes were 35.7% ⁇ 9.4 (black graph) in the non-administration group, 36.8% ⁇ 6.7 (gray graph) in the control Ig administration group, Cav- In the Ig administration group, it was 58.0% ⁇ 15.5 (black-framed white-filled graph).
  • IFN ⁇ -positive CD8 T cells in TIL were significantly increased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • the cell surface of the TIL single cell suspension was stained with mouse CD3 antibody (FITC) and CD4 antibody (PE labeled), and then intracellular FoxP3 (APC labeling) was performed using Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit, and the flow site was analyzed. Treg cells were counted using a meter and recorded as a percentage of the number of CD3-positive T cells. The results are shown as a mean value ⁇ standard deviation (FIG. 27).
  • CD4 positive FoxP3 positive Treg cells of the tumor infiltrating lymphocytes were 7.25% ⁇ 3.90 (black graph) in the non-administration group, 8.30% ⁇ 4.76 (grey graph) in the control Ig administration group, In the Cav-Ig administration group, it was 2.26% ⁇ 2.25 (black frame white-painted graph).
  • CD4-positive FoxP3-positive Treg cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • TIL single cell suspension was stained with mouse CD45 antibody (PerCP labeled), mouse CD11b antibody (PE labeled), mouse CD11c antibody (PE labeled), Caveolin-1 (Cav-1) antibody (Alexa488 labeled) and flow Cav-1 positive cells in CD45 positive DC cells were counted using a cytometer and recorded as a percentage. The results are shown in the graph of mean value ⁇ standard deviation (FIG. 28). Cav-1 positive DC cells of the tumor infiltrating cells were 22.2% ⁇ 5.7 in the non-administration group (black graph), 27.3% ⁇ 8.1 gray graph in the control Ig administration group), Cav- In the Ig-administered group, it was 14.7% ⁇ 6.2, a black frame and white-painted graph). Cav-1-positive DC cells in TIL were significantly decreased in the Cav-Ig administration group (p ⁇ 0.0001, Two-way ANOVA, Tukey-Kramer test).
  • Cav-Ig was administered every other day for a total of 15 times from the 7th day after 4T1 inoculation. All of the non-administered and control Ig-administered groups died by the 30th day, but the survival rate was significantly prolonged in the Cav-Ig-administered group (FIG. 23). Further, at 7 times of drug administration (20 days after 4T1 inoculation), the tumors were increased in the non-administered and control Ig-administered groups, but the tumor growth was remarkably suppressed in the Cav-Ig-administered group. (FIG. 24). That is, the growth of the tumor was controlled by Cav-Ig and the survival period was extended.
  • the effector cells in the tumor part were analyzed, and it was found that in the lymphocytes in the tumor part of the mouse on the 20th day after 4T1 inoculation (7 times administration of control Ig or Cav-Ig), LAG-3 was observed in the Cav-Ig administration group.
  • the number of positive CD26-positive T lymphocytes was significantly reduced (Fig. 25), and at the same time, the number of IFN ⁇ -producing cytotoxic CD8 T cells was significantly increased (Fig. 26).
  • Treg and Cav-1 positive DC in the tumor part were significantly decreased (FIGS. 27 and 28). From these results, the administration of Cav-Ig decreased Cav-1 positive DCs and inhibited the immune check mechanism by LAG-3 positive CD26 positive lymphocytes.
  • antitumor immunity of the cancer microenvironment was activated, and Inhibition of proliferation was also revealed in a breast cancer model.
  • D-luciferin (150 mg/kg of mouse body weight) was intraperitoneally administered to mice on day 20 (7 times administration of Cav-Ig or control Ig) after tumor inoculation, and 10 minutes later, bioimaging (Caliper IVIS Lumina II In Vivo Imaging System) was performed. ), the tumor was evaluated by bioluminescence intensity. Representative bioimaging pictures for each group are presented ( Figure 30). In the control Ig-administered group, strong bioluminescence was detected in the abdomen, indicating that the tumor is growing. On the other hand, in the Cav-Ig administration group, bioluminescence was not observed, or even if it was observed, only slight luminescence was detected, and tumor growth was suppressed. Mice are partially shaved for easy identification of fluorescent emission.
  • Test Example 12 (Demonstration of antitumor pharmacological activity by intravenous administration of a fusion protein with a deletion of regions other than the Cav N-terminal region)
  • Mouse B-cell lymphoma cell line A20 (provided by Dr. X Chen of Medical College of Wisconsin) stably incorporating the luciferase gene was inoculated (4 ⁇ 10 4 /mouse) from the tail vein of Balb/C mice, and on day 7
  • Cav-Ig N-Fc
  • Cav deletion mutant N ⁇ SCD-Fc, SCD-Fc

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

新たな免疫チェックポイント阻害剤の提供。　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を有効成分とする免疫チェックポイント阻害剤。

Description

免疫チェックポイント阻害剤
　本発明は、新たな免疫チェックポイント阻害剤及び抗悪性腫瘍剤に関する。
　生体の免疫系は、がん細胞の抗原を認識してがん細胞を排除するエフェクターＴリンパ球などを作り出すことによって、個体の生命を維持するメカニズムを持っている。一方で、がん細胞には免疫系からの攻撃を逃れる様々な機構が備わっている。例えば、制御性リンパ球（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）・樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ，ＤＣ）などから分泌される免疫抑制因子ＩＬ－１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０）、ＴＧＦ－β（ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β）が腫瘍免疫を抑制し、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩの発現低下が生じて腫瘍特異的細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞が無力化され、さらにＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１）やＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１）などの免疫チェックポイント分子がＴ細胞表面に発現誘導されエフェクターＴリンパ球に負のシグナルを送り、その結果、抗腫瘍性Ｔ細胞機能が抑制される。また、がん細胞自身がＰＤ－１受容体のリガンドである（ＰＤ－Ｌ１　ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｄｅａｔｈ　ｌｉｇａｎｄ－１）を発現することによって免疫チェックポイント機構を活性化し、免疫監視から逃れ増殖や浸潤、転移を行っている（非特許文献１）。このような免疫監視から逃れるがん細胞を標的とするため、現在、臨床現場では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体やＣＴＬＡ－４抗体といった免疫チェックポイント阻害により抗腫瘍免疫効果を亢進させる治療が行われ一定の効果を上げている（非特許文献２）。しかしながら、既存の免疫チェックポイント阻害剤によるがん治療の奏効率は５～３０％にとどまっており、より抗腫瘍効果のある免疫チェックポイント阻害剤の開発が必要な状況にある。
　一方、カベオリン１（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）は、Ｔ細胞活性化のマーカーであるＣＤ２６の共刺激リガンドである。そして、本発明者は、ヒトカベオリン１のＮ末端領域を免疫グロブリンの定常領域に融合したタンパク質（Ｃａｖ－Ｉｇ）が、記憶抗原、同種免疫反応を抑制することを見出した（特許文献１）。また、抗カベオリン１抗体が抗腫瘍作用を示すことが報告されている（特許文献２）。
特開２０１６－６９３１４号公報 米国特許第７，６６６，４１２号明細書
Science 2015;348:74 Science 2015;348:56
　本発明の課題は、新たな免疫チェックポイント阻害剤及び抗悪性腫瘍剤を提供することにある。
　そこで本発明者は、前記課題を解決すべく種々検討した結果、カベオリン１のＮ末端領域等と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質が、がん微小環境におけるＣＤ２６－カベオリン１シグナルによる免疫チェックポイント分子活性化を阻害して抗腫瘍免疫を発揮し、さらにその抗腫瘍免疫は記憶免疫として長期間維持されることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔１２〕を提供するものである。
〔１〕カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を有効成分とする免疫チェックポイント阻害剤。
〔２〕〔１〕記載の免疫チェックポイント阻害剤を含有する抗悪性腫瘍剤。
〔３〕〔１〕記載の免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体とを組み合わせてなる抗悪性腫瘍剤。
［４］カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上の、免疫チェックポイント阻害剤製造のための使用。
〔５〕カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤の、抗悪性腫瘍剤製造のための使用。
〔６〕カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体との組み合わせの、抗悪性腫瘍剤製造のための使用。
［７］免疫チェックポイントを阻害するための、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上。
［８］悪性腫瘍を治療するための、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤。
［９］悪性腫瘍を治療するための、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体との組み合わせ。
［１０］カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上の有効量を投与することを特徴とする免疫チェックポイント阻害方法。
［１１］カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍治療方法。
［１２］カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体とを投与する悪性腫瘍治療方法。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ２６－カベオリン１シグナルによる免疫チェックポイント分子活性化を阻害して優れた抗腫瘍免疫を発揮し、さらにその抗腫瘍免疫は記憶免疫として長期間維持される。従って本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、従来知られている抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体等の免疫チェックポイント阻害剤とは異なる分子機構であり、これら従来の免疫チェックポイント阻害剤との併用により、より効果の高い抗悪性腫瘍剤となり得る。
腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）における、ＣＤ３陽性細胞（ＣＤ３＋Ｃｅｌｌｓ）中のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞（ＬＡＧ３＋ＣＤ２６）の割合を示す。 腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）における、ＣＤ８陽性細胞（ＣＤ８＋Ｃｅｌｌｓ）中のＰＤ－１の割合を示す。 腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）における、ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性細胞（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｃｅｌｌｓ）中のＰＤ－１の割合を示す。 腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）における、ＣＤ４５陽性細胞（ＣＤ４５＋Ｃｅｌｌｓ）中のＣａｖ－１陽性ＣＤ１１ｂ陽性（Ｃａｖ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）の割合を示す。 大腸癌マウスに対するＣａｖ－Ｉｇ投与群の生存期間延長効果を示す。 大腸癌マウスに対するＣａｖ－Ｉｇの投与の効果を示す。 大腸癌の細胞増殖に対するＣａｖ－Ｉｇの効果（ＭＴＴアッセイ）を示す。 ＣＤ４５陽性細胞（ＣＤ４５＋Ｃｅｌｌｓ）中のＣａｖ－１陽性ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１１ｃ陽性（Ｃａｖ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１＋）の割合に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 ＣＤ８陽性細胞（ＣＤ８＋Ｃｅｌｌｓ）中のＩＦＮγ陽性（ＩＦＮγ＋）の割合に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性細胞（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｃｅｌｌｓ）の割合に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 ＣＤ４５陽性細胞（ＣＤ４５＋Ｃｅｌｌｓ）中のＣａｖ－１陽性ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１１ｃ陽性（ＣＡＶ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）の割合に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 大腸癌マウスに対するＣａｖ－Ｉｇの長期間生存延長効果を示す。 大腸癌マウスの細胞増殖に対するＣａｖ－Ｉｇの長期間投与による効果を示す。 皮下移植マウス大腸癌細胞に対するＣａｖ－Ｉｇの静脈内投与による効果を示す。 ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害薬抵抗性腫瘍に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 ＰＤ－Ｌ１ノックダウンクローンの樹立手段を示す。 ＰＤ－Ｌ１ノックダウンマウス大腸癌に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 大腸癌細胞株ＣＭＴ９３に対するＣａｖ－Ｉｇの効果を示す。 大腸癌細胞株ＣＭＴ９３における腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）における、ＣＤ３陽性細胞（ＣＤ３＋Ｃｅｌｌｓ）中のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞（ＬＡＧ３＋ＣＤ２６）の割合を示す。 大腸癌（ＣＭＴ９３）におけるＣＤ８陽性細胞におけるＩＦＮγ陽性細胞の割合を示す。 大腸癌（ＣＭＴ９３）におけるＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性細胞の割合を示す。 大腸癌（ＣＭＴ９３）におけるＣＤ４５陽性ＤＣ細胞におけるＣａｖ－１陽性細胞の割合を示す。 乳癌マウスに対するＣａｖ－Ｉｇの効果（生存率）を示す。 乳癌マウスに対するＣａｖ－Ｉｇの効果（生体イメージング）を示す。 乳癌における腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）における、ＣＤ３陽性細胞（ＣＤ３＋Ｃｅｌｌｓ）中のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞（ＬＡＧ３＋ＣＤ２６）の割合を示す。 乳癌におけるＣＤ８陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞の割合を示す。 乳癌におけるＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性細胞の割合を示す。 乳癌におけるＣＤ４５陽性ＤＣ細胞におけるＣａｖ－１陽性細胞の割合を示す。 肺癌に対するＣａｖ－Ｉｇの効果（生体イメージング）を示す。 リンパ腫に対するＣａｖ－Ｉｇの効果（生体イメージング）を示す。 マウスＢ細胞リンパ腫に対するＮＴ－Ｆｃ、ＮＴΔＳＣＤ－Ｆｃ、ＳＣＤ－Ｆｃの効果（生体イメージング）を示す。
　ＣＤ２６はＴ細胞表面抗原として報告されたが、その後Ｔ細胞活性化抗原として確立した。そして、ＣＤ２６は共刺激分子としてＴ細胞シグナル伝達過程にも関連することが判明しており、ＣＤ２６の共刺激リガンドがカベオリン１（Ｃａｖ－１）であることが知られている。すなわち、ＣＤ２６は、１１０ｋＤａの膜糖蛋白でヒトメモリーＴ細胞に選択的に発現し、抗原提示細胞上のカベオリン１を介したメモリーＴ細胞の増殖や炎症性サイトカインの産生に深く関わっているＴ細胞分子である。
　また、カベオリン１のアミノ酸配列は知られており、１７８個のアミノ酸配列からなり（配列番号１）、１－１０１番目がＮ末端領域であり、１０２－１３４番目が疎水性の膜貫入部である。また、Ｎ末端領域のうち、８２－１０１番目がスキャホールディングドメインである。
　本発明免疫チェックポイント阻害剤の有効成分は、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上である。
　具体的には、（１）カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片（Ｃａｖ-1-ＮＴ：配列番号２）；（２）カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片（Ｃａｖ-1-ＳＣＤ：配列番号３）；（３）カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片（Ｃａｖ-1-ＮＴΔＳＣＤ：配列番号４）；（４）ＣＤ２６のカベオリン１結合領域配列のペプチド断片（配列番号５）；及び（５）これらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質が挙げられる。
　これらの有効成分のうち、前記（１）～（４）のペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質がより好ましく、特にカベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質が好ましい。
　これらの有効成分は、カベオリン１及びＣＤ２６分子のアミノ酸配列が知られているため、遺伝子組み換えやペプチド合成等種々の方法により製造可能である。また、前記融合タンパク質は、例えば特許文献１に記載のように、遺伝子組み換え法により製造することができる。
　前記ペプチド断片又は融合タンパク質は、後記実施例に示すように、がん微小環境におけるＣＤ２６－Ｃａｖ－１シグナルによる免疫チェックポイント分子活性化を阻害して抗腫瘍免疫を発揮し、さらに、その抗腫瘍免疫は記憶免疫として長期間維持されることが示された。前記ペプチド断片又は融合タンパク質は、免疫の異常をコントロールすることにより過剰免疫状態の自己免疫疾患のみならず、ＣＤ２６－Ｃａｖ－１による免疫チェックポイント刺激によって免疫監視を逃れた腫瘍に対する治療剤として有用である。免疫チェックポイント阻害による抗腫瘍免疫効果は癌腫を超えて発揮される生体監視機構であるため、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、大腸癌のみならずその他の癌（例えば、胃癌、肺癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、悪性中皮腫、子宮癌、卵巣癌等）の治療にも応用可能である。さらに、ＣＤ２６－Ｃａｖ－１シグナル系は既存の免疫チェックポイントシグナルであるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／ＣＤ８６とは全く異なる分子機構であるため、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は現在臨床で使用されているＰＤ－１抗体やＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体との併用により、より効果の高い抗腫瘍効果が得られる。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、経口又は非経口用に製剤化することができる。
　経口投与用の好適な製剤は、前記ペプチド断片又は融合タンパク質を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
　非経口投与用には、前記ペプチド断片又は融合タンパク質を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、前記ペプチド断片又は融合タンパク質を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、前記ペプチド断片又は融合タンパク質を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、前記ペプチド断片又は融合タンパク質を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、前記ペプチド断片又は融合タンパク質をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の医薬は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
　前記ペプチド断片又は融合タンパク質の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ～５００ｍｇであるのが好ましい。
　本発明の前記免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体とを組み合わせてなる抗悪性腫瘍剤の形態は、例えば前記チェックポイント阻害剤と前記抗体とを含む医薬組成物の形態のほか、前記チェックポイント阻害剤と前記抗体との組み合わせを同時に若しくは別々に、又は逐次的に投与するために前記チェックポイント阻害剤と前記抗体とをそれぞれ別の投与単位として組み合わせた医薬であってもよい。
　次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
製造例（融合タンパク質の作製）
　特許文献１の実施例の記載に従って、融合タンパク質を作製した。
　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質（Ｃａｖ－１－ＮＴ－Ｆｃγ１（ＮＴ－Ｆｃ）；以下の試験例で「Ｃａｖ－Ｉｇ」と称する）、カベオリン１Ｎ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質（Ｃａｖ－１－ＮＴΔＳＣＤ－Ｆｃγ１（ＮＴΔＳＣＤ－Ｆｃ））、及びカベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質（Ｃａｖ－１－ＳＣＤ－Ｆｃγ１（ＳＣＤ－Ｆｃ））を作製した。
　すなわち、ヒトカベオリン１のＮ端領域の内１番から１０１番目のアミノ酸残基部分（ＮＴ）、１番から８２番目のアミノ酸残基部分（ＮＴΔＳＣＤ）、８２番目から１０１番目のアミノ酸残基部分（ＳＣＤ）をＰＣＲで作成して、融合タンパク質発現ベクターに組込んだ。
　ｐＥＢ６－ＣＡＧ－ｈｕＥＣＤＳＰ－Ｆｃγ１ベクターのＨｉｎｄ　IIIサイトに、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１の１－１０１アミノ酸部分（ＮＴ）、１－８２アミノ酸部分（ＮＴΔＳＣＤ）、８２－１０１アミノ酸部分（ＳＣＤ）をＩｎ－ｆｒａｍｄｅでクローニングし、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１－Ｆｃ融合タンパク発現ベクターを構築した。Ｐ　ＣＡＧ，ＣＡＧ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｈｕＥＣＤＳＰ，ｈｕｍａｎ　Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ；ｈｕＦｃγ１，Ｆｃ　ｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ－Ｈ鎖のｈｉｎｇｅ＋ＣH２＋ＣH３部分）。
試験例１
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６（ＪＣＲＢ１４９６（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手））をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目に開腹して腫瘍部分を摘出した。腫瘍組織は、ＭＡＣＳ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓを用いて腫瘍浸潤細胞の単一細胞懸濁液（ＴＩＬ）を調整した。同様に、脾臓を摘出して単一細胞懸濁液（Ｓｐｌｅｅｎ）を調整した（ｎ＝１０）。
（１）単一細胞懸濁液をマウスＬＡＧ－３抗体（ＦＩＴＣ標識）、マウスＣＤ２６抗体（ＰＥ標識）及びマウスＣＤ３抗体（ＰｅｒＣＰ標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３陽性細胞におけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞を計測し百分率で記録した（計測値をドットで示し平均値を中間の１本の長い横線、標準偏差値を上下の短い横線２本で示した）。
　結果を図１に示す。腫瘍に浸潤したリンパ球（ＴＩＬ）のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞は５．０８％±１．９３、脾臓リンパ球のＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞は０．８６％±０．９３で、ＴＩＬのＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。
（２）単一細胞懸濁液をマウスＰＤ－１抗体（ＦＩＴＣ標識）及びマウスＣＤ８抗体（ＰＥ標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ８陽性細胞におけるＰＤ－１陽性細胞を計測し百分率で記録した（計測値をドットで示し平均値を中間の１本の長い横線、標準偏差値を上下の短い横線２本で示した）。
　結果を図２に示す。腫瘍に浸潤したリンパ球（ＴＩＬ）のＰＤ－１陽性ＣＤ８Ｔ細胞は５９．６５％±３．８０、脾臓リンパ球のＰＤ－１陽性ＣＤ８Ｔ細胞は３．２１％±０．４７で、ＴＩＬのＰＤ－１陽性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。
（３）単一細胞懸濁液をマウスＰＤ－１抗体（ＦＩＴＣ標識）及びマウスＣＤ４抗体（ＰＥ標識）で細胞表面の染色をしたのち、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔで細胞内ＦｏｘＰ３（ＡＰＣ標識）を行いＴｒｅｇを解析した。フローサイトメーターを用いてＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性細胞におけるＰＤ－１陽性細胞を計測し百分率で記録した（計測値をドットで示し平均値を中間の１本の長い横線、標準偏差値を上下の短い横線２本で示した）。
　結果を図３に示す。ＴＩＬのＰＤ－１陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞は３８．２５％±３．４３、脾臓リンパ球のＰＤ－１陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞は５．９７％±０．６６で、ＴＩＬのＰＤ－１陽性Ｔｒｅｇ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。
（４）単一細胞懸濁液をマウスＣＤ４５抗体（ＰｅｒＣＰ標識）、マウスＣＤ１１ｂ抗体（ＰＥ標識）、マウスＣＤ１１ｃ抗体（ＰＥ標識）、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１（Ｃａｖ－１）抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ４５陽性ＤＣ細胞におけるＣａｖ－１陽性細胞を計測し百分率で記録した（計測値をドットで示し平均値を中間の１本の長い横線、標準偏差値を上下の短い横線２本で示した）。
　結果を図４に示す。腫瘍浸潤細胞のＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞は２８．７２％±２．６０、脾臓リンパ球のＰＤ－１陽性ＣＤ８Ｔ細胞は３．０２％±０．４８で、ＴＩＬのＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。
（５）上記のように、ＴＩＬでは、非腫瘍部のコントロール臓器である脾臓に比べて、ＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔリンパ球が有意に増加していた（図１）。また、ＴＩＬのＣＤ８Ｔリンパ球は、非腫瘍部のコントロール臓器である脾臓に比べて、代表的な免疫チェックポイント分子であるＰＤ－１の発現が有意に上昇していた（図２）。同様に、ＴＩＬのＴｒｅｇにおいても、非腫瘍部の脾臓に比べて、免疫チェックポイント分子ＰＤ－１の発現が有意に上昇していた（図３）。また、腫瘍部ではＣａｖ－１陽性のＤＣの浸潤が有意に増加していた（図４）。これらの結果は、Ｃａｖ－１陽性ＤＣががん微小環境のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性リンパ球を刺激して免疫チェック分子ＰＤ－１の発現を増強し、腫瘍が免疫監視から逃れて増殖している可能性を示唆している。
試験例２
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６（ＪＣＲＢ１４９６（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手））をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１５回腹腔内に投与した（各群ｎ＝１０）。
（１）各群の生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で解析し図５に示した。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群（黒実線）は、非投与群（グレー実線）及びｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群（黒ドット線）に比して有意に生存期間が延長した（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ）。
（２）腫瘍接種後２０日目（Ｃａｖ－Ｉｇ又はｃｏｎｔｏｒｏｌ　Ｉｇ投与６回後）のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した。各群について代表的な生体イメージングの写真を提示した（図６）。非投与群及びｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群は生体発光は認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しておらず、腫瘍増殖が抑制されている。
（３）Ｃｏｌｏｎ２６を９６ウエルプレートに播種（１×１０4細胞／ウエル）しＣａｖ－Ｉｇ或いはｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬ）を添加して培養した（３７℃、５％　ＣＯ2）。Ｃａｖ－Ｉｇ及びｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ添加後２４時間、４８時間、７２時間目に細胞増殖をＭＴＴアッセイ法により検出した。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行い、結果は５７０ｎｍの吸光度の平均値±標準偏差を図７で示した。Ｃａｖ－Ｉｇ（実線）とｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（破線）の間には、５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬの添加濃度においても、細胞増殖に有意差は認めなかった（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。
（４）上記のように、Ｃｏｌｏｎ２６接種後７日目からＣａｖ－Ｉｇを１日おきに合計１５回投与した。非投与及びコントロールＩｇ投与群では４０日目までに全例が死亡したが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では７０％の生存率で、有意に生存率が延長した（図５）。生体イメージング法で解析したところ、非投与及びコントロールＩｇ投与群は腫瘍が増大していたが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では腫瘍の増殖が認められなかった（図６）。すなわち、Ｃａｖ－Ｉｇにより腫瘍の増殖がコントロールされた結果、マウスの長期生存がもたらされた。一方、Ｃａｖ－ＩｇをＣｏｌｏｎ２６に添加しても増殖は抑制出来なかった（図７）。これらの結果は、Ｃａｖ－ＩｇはＣｏｌｏｎ２６に直接作用しているのではなく、間接的に抗腫瘍効果を発揮していることを強く示唆している。
試験例３
　前記試験例１（４）の実験と同様にマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１５回腹腔内に投与した（各群ｎ＝１０）。Ｃｏｌｏｎ２６細胞接種後３０日目（ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ又はＣａｖ－Ｉｇ投与１０回目）に開腹して腫瘍部分を摘出した。腫瘍組織は、ＭＡＣＳ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓを用いて腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）の単一細胞懸濁液を調整した。
（１）ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＬＡＧ－３抗体（ＦＩＴＣ標識）、マウスＣＤ２６抗体（ＰＥ標識）及びマウスＣＤ３抗体（ＰｅｒＣＰ標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３陽性細胞におけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞を計測し百分率で記録した。
　結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図８）。腫瘍浸潤細胞のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞は、非投与群では５．０８％±１．９３（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では４．８７％±１．５６（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では１．１７％±１．１１（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
（２）ＴＩＬ単一細胞懸濁液からＣＤ８Ｔ細胞を純化し（マウスＣＤ８＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用）、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ添加培養液にてＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を加えて４時間刺激後、ＢＤ　Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　Ｋｉｔを用いて細胞内インターフェロンγ（ＩＦＮγ）（ＦＩＴＣ標識）及び細胞表面ＣＤ８（ＰＥ標識）の染色を行なった。フローサイトメーターを用いてＣＤ８陽性細胞におけるＩＦＮγ陽性細胞を計測し百分率で記録した。
　結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図９）。腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮγ陽性ＣＤ８Ｔ細胞は、非投与群では４４．１２％±５．４８（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では３９．５２％±８．４２（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では６６．９５％±１２．３４（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＩＦＮγ陽性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
（３）ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＣＤ３抗体（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４抗体（ＰＥ標識）で細胞表面の染色をしたのち、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔで細胞内ＦｏｘＰ３（ＡＰＣ標識）を行い、フローサイトメーターを用いてＴｒｅｇ細胞を計測しＣＤ３陽性Ｔ細胞数に対する百分率で記録した。
　結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図１０）。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞は、非投与群では９．７５％±３．２８（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では１０．０５％±４．６０（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では２．８７％±１．３６（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
（４）ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＣＤ４５抗体（ＰｅｒＣＰ標識）、マウスＣＤ１１ｂ抗体（ＰＥ標識）、マウスＣＤ１１ｃ抗体（ＰＥ標識）、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１（Ｃａｖ－１）抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ４５陽性ＤＣ細胞におけるＣａｖ－１陽性細胞を計測し百分率で記録した。
　結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図１１）。腫瘍浸潤細胞のＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞は、非投与群では３１．００％±５．４４（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では２６．３０％±１１．３０（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では９．３３％±５．１８（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
（５）上記のように、Ｃａｖ－Ｉｇによる腫瘍抑制効果のメカニズムを明らかにするため、腫瘍部のエフェクター細胞の解析を行った。Ｃｏｌｏｎ２６接種３０日目（ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ又はＣａｖ－Ｉｇ投与１０回目）のマウスの腫瘍部のリンパ球では、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群で、ＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔリンパ球が有意に減少しており（図８）、同時に、ＩＦＮγを産生する細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（図９）。また、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では、腫瘍部のＴｒｅｇとＣａｖ－１陽性ＤＣが有意に減少していた（図１０、図１１）。この結果から、Ｃａｖ－Ｉｇ投与によってＣａｖ－１陽性ＤＣが減少してＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性リンパ球による免疫チェック機構が阻害された結果、がん微小環境の抗腫瘍免疫が活性化し、腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。
試験例４
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１５回腹腔内に投与し、９０日間生存したマウスに再度、Ｃｏｌｏｎ２６細胞を腹腔に接種（１×１０4／マウス）した（Ｃａｖ－Ｉｇ群、ｎ＝１０）。コントロール群として、Ｃａｖ－Ｉｇ投与後生存マウスと同じ週齢に達したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）した（Ｎｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群）。
（１）各群の生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で解析しグラフに示した（図１２）。Ｃａｖ－Ｉｇ投与後生存マウス群（黒実線）は、非投与群（グレー実線）に比して有意に生存期間が延長した（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ）。
（２）腫瘍最接種後２０日目のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した。各群について代表的な生体イメージングの写真を提示した（図１３）。非投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与後生存マウス群は生体発光は検出されず、腫瘍増殖が抑制されている。
（３）上記のように、Ｃａｖ－Ｉｇ投与により生存が延長したマウスにおいて、抗腫瘍免疫のメモリー応答が維持されているかどうか検討した。このために、Ｃａｖ－Ｉｇ投与により長期生存したＣｏｌｏｎ２６接種マウスに、再度、Ｃｏｌｏｎ２６細胞を接種（ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇテスト）して生存率と腫瘍増殖を解析した。その結果、コントロール群では全例が死亡したが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与後の生存群では１００％の生存率であった（図１２）。また、生体イメージング法で解析したところ、コントロールＩｇ群は腫瘍が増大していたが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与後の生存群では腫瘍の増殖が認められなかった（図１３）。すなわち、Ｃａｖ－Ｉｇ投与後の生存群は、Ｃｏｌｏｎ２６に対する抗腫瘍免疫が維持されており、Ｃａｖ－Ｉｇ投与により抗腫瘍の記憶免疫が確立されていることが明らかとなった。
試験例５（Ｃａｖ－Ｉｇの静脈投与による皮下移植腫瘍に対する効果）
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６（ＪＣＲＢ１４９６（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手））をＢａｌｂ／Ｃマウスの側腹部の皮下に移植（５×１０５／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１５回尾静脈に投与した（各群ｎ＝３）。
　腫瘍接種後３０日目のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した（図１４）。ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している（１例は腫瘍増大により腫瘍接種後２５日目に死亡した）。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群は生体発光を認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しておらず、腫瘍増殖が抑制されている。
　以上の結果は、Ｃａｖ－Ｉｇの抗腫瘍効果は腹腔内の同所投与のみならず、血液循環を介した治療効果としても認められること、すなわち、臨床的な投与方法により近い方法で実証できた。
試験例６（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害薬抵抗性腫瘍に対するＣａｖ－Ｉｇの抗腫瘍効果（Ｃａｖ－Ｉｇが既存の免疫チェックポイント阻害薬を超える効果の実証例）
　免疫チェックポイント阻害薬（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害薬およびＣＴＬＡ－４阻害薬）に抵抗性のマウス腫瘍細胞株ＣＭＳ５ａ（マウス線維肉腫由来。三重大学大学院医学系研究科病態解明医学講座遺伝子・免疫細胞治療学の珠玖洋博士から供与。本細胞株に関する参考文献：Ｍｕｒａｏｋａ　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　２０１９；１２９（３）：１２７８－１２９４）をＢａｌｂ／Ｃマウスの側腹部の皮下に接種（５×１０５／マウス）し、７日目・９日目・１１日目にそれぞれＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）、マウス抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／回）（ｃｌｏｎｅ　ＲＭＰ１－１４；Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ／回）（ｃｌｏｎｅ　１０Ｆ．９Ｇ２；Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、マウスＣＴＬＡ－４抗体（１００μｇ／回）（ｃｌｏｎｅ　９Ｄ９；Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、又は、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｂ（１０μｇ／回）を尾静脈から投与した（各群ｎ＝５）。継時的に腫瘍の大きさを計測した（腫瘍体積ｍｍ３は０．５×（長径ｍｍ）×（幅ｍｍ）２で計測した）。
　各群の腫瘍体積の継時的変化を示した（図１５）。マウス抗ＰＤ－１抗体投与群、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群およびマウスＣＴＬＡ－４抗体群は時間とともに腫瘍が増大しており、上述の珠玖洋博士の文献の通り、ＣＭＳ５ａが既存の免疫チェックポイント阻害薬に耐性であることが示された。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では、有意に腫瘍が縮小しており抗腫瘍効果が認められた。（腫瘍接種後２０日目の時点：Ｃａｖ－Ｉｇ　v.s. 抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はＣＴＬＡ－４抗体又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｂ；いずれも、ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
試験例７
　さらに、本発明が既存の免疫チェックポイント阻害薬（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害薬）を超える効果をあることを実証するため、ＰＤ－Ｌ１分子をノックダウンしたマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６を樹立して、ｉｎ　ｖｉｖｏ治療実験を行った。
　マウスＰＤ－Ｌ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ＳＭＡＲＴｖｅｃｔｏｒ　Ｍｏｕｓｅ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｃｄ２７４　ｓｈＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ））またはｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｈＲＮＡをＴｒａｎｓＤｕｘ　ＭＡＸ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣｏｌｏｎ２６に感染させた。ＧＦＰ発光およびピューロマイシン薬剤添加で感染クローンを選択し、ＰＤ－Ｌ１の発現をウエスタンブロットで解析した。ＰＤ－Ｌ１の発現増強を誘導するためＩＦＮγを１０ｎｇ／ｍＬ添加して２４時間培養したクローンにおいても、ｓｈＲＮＡの効果を検討した。図１６に示すように、Ｃｏｌｏｎ２６細胞においてＰＤ－Ｌ１ノックダウンクローンを樹立した（＊で示したレーン）（以下、Ｃｏｌｏｎ２６－Ｐｄｌ１－ＫＯと呼ぶ）。
　Ｃｏｌｏｎ２６－Ｐｄｌ１－ＫＯをＢａｌｂ／Ｃマウスの側腹部の皮下に接種（５×１０５／マウス）し、７日目・９日目・１１日目にそれぞれＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）、マウス抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／回）（ｃｌｏｎｅ　ＲＭＰ１－１４；Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ／回）（ｃｌｏｎｅ　１０Ｆ．９Ｇ２；Ｌｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、又は、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｂ（１０μｇ／回）を尾静脈から投与した（各群ｎ＝５）。継時的に腫瘍の大きさを計測した（腫瘍体積ｍｍ３は０．５×（長径ｍｍ）×（幅ｍｍ）２で計測した）。
　各群の腫瘍体積の継時的変化を示した（図１７）。マウス抗ＰＤ－１抗体投与群およびマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群は時間とともに腫瘍が増大しており、Ｃｏｌｏｎ２６－Ｐｄｌ１－ＫＯが既存の免疫チェックポイント阻害薬であるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害薬に耐性であることが示された。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では有意に腫瘍が縮小しており抗腫瘍効果が認められた（腫瘍接種後２０日目の時点：Ｃａｖ－Ｉｇ　v.s. 抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｂ；いずれも、ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　以上の試験例６よび試験例７の結果から、Ｃａｖ－Ｉｇは、従来の免疫チェックポイント阻害薬耐性の癌腫に対しても抗腫瘍効果が示され、既存のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害薬およびＣＴＬＡ－４阻害薬を超える効果を発揮する新規の薬剤であることが示された。
試験例８（Ｃｏｌｏｎ２６以外の大腸癌細胞株ＣＭＴ９３に対するＣａｖ－Ｉｇの抗腫瘍効果）
　マウス大腸癌細胞株ＣＭＴ９３（ＡＴＣＣ　ＣＬＬ９３（ＡＴＣＣから入手））をＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１５回腹腔内に投与した（各群ｎ＝６）。
　各群の生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で解析し図１８に示した。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群（黒実線）は、非投与群（グレー実線）及びｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群（黒ドット線）に比して有意に生存期間が延長した（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ）。
　ＣＭＴ９３細胞接種後２０日目（ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ又はＣａｖ－Ｉｇ投与７回）に開腹して腫瘍部分を摘出した。腫瘍組織は、ＭＡＣＳ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓを用いて腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）の単一細胞懸濁液を調整した。ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＬＡＧ－３抗体（ＦＩＴＣ標識）、マウスＣＤ２６抗体（ＰＥ標識）及びマウスＣＤ３抗体（ＰｅｒＣＰ標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３陽性細胞におけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞を計測し百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図１９）。腫瘍浸潤細胞のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞は、非投与群では７．２８％±３．８８（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では９．５２％±５．３８（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では１．５７％±１．４３（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　ＴＩＬ単一細胞懸濁液からＣＤ８Ｔ細胞を純化し（マウスＣＤ８＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用）、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ添加培養液にてＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を加えて４時間刺激後、ＢＤ　Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　Ｋｉｔを用いて細胞内ＩＦＮγ（ＦＩＴＣ標識）及び細胞表面ＣＤ８（ＰＥ標識）の染色を行なった。フローサイトメーターを用いてＣＤ８陽性細胞におけるＩＦＮγ陽性細胞を計測し百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２０）。腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮγ陽性ＣＤ８Ｔ細胞は、非投与群では４１．７％±１０．５（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では４６．７％±９．９（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では７３．０％±１２．２（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＩＦＮγ陽性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＣＤ３抗体（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４抗体（ＰＥ標識）で細胞表面の染色をしたのち、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔで細胞内ＦｏｘＰ３（ＡＰＣ標識）を行い、フローサイトメーターを用いてＴｒｅｇ細胞を計測しＣＤ３陽性Ｔ細胞数に対する百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２１）。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞は、非投与群では６．６５％±２．００（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では７．７０％±２．５０（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では２．５１％±２．１１（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＣＤ４５抗体（ＰｅｒＣＰ標識）、マウスＣＤ１１ｂ抗体（ＰＥ標識）、マウスＣＤ１１ｃ抗体（ＰＥ標識）、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１（Ｃａｖ－１）抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ４５陽性ＤＣ細胞におけるＣａｖ－１陽性細胞を計測し百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２２）。腫瘍浸潤細胞のＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞は、非投与群では２８．２％±７．５（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では３０．８％±８．３（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では１０．５％±８．５（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　以上のように、大腸癌細胞株ＣＭＴ９３接種モデルでは、非投与及びコントロールＩｇ投与群では３３日目までに全例が死亡したが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では有意に生存率が延長した（図１８）。さらに、Ｃａｖ－Ｉｇによる腫瘍抑制効果のメカニズムを明らかにするため、腫瘍部のエフェクター細胞の解析を行った。ＣＭＴ９３接種２０日目（ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ又はＣａｖ－Ｉｇ投与７回目）のマウスの腫瘍部のリンパ球では、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群で、ＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔリンパ球が有意に減少しており（図１９）、同時に、ＩＦＮγを産生する細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（図２０）。また、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では、腫瘍部のＴｒｅｇとＣａｖ－１陽性ＤＣが有意に減少していた（図２１、図２２）。この結果から、Ｃｏｌｏｎ２６以外の大腸癌細胞ＣＭＴ９３においても、Ｃａｖ－Ｉｇ投与によってＣａｖ－１陽性ＤＣが減少してＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性リンパ球による免疫チェック機構が阻害された結果、がん微小環境の抗腫瘍免疫が活性化し、腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。
試験例９（大腸癌以外の癌腫（乳癌、肺癌、悪性リンパ腫）に対するＣａｖ－Ｉｇの抗腫瘍効果）
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだ乳癌細胞株４Ｔ１（ＪＣＲＢ１４４７（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手））をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１５回腹腔内に投与した（各群ｎ＝６）。
　各群の生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法で解析し図２１に示した。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群（黒実線）は、非投与群（グレー実線）及びｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群（黒ドット線）に比して有意に生存期間が延長した（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ）。
　腫瘍接種後２０日目（Ｃａｖ－Ｉｇ又はｃｏｎｔｏｒｏｌ　Ｉｇ投与７回）のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した。各群について代表的な生体イメージングの写真を提示した（図２４）。ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群は生体発光を認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しておらず、腫瘍増殖が抑制されている。図には各々代表的な３個体を提示した。
　細胞接種後２０日目（ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ又はＣａｖ－Ｉｇ投与７回）に開腹して腫瘍部分を摘出した。腫瘍組織は、ＭＡＣＳ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓを用いてＴＩＬの単一細胞懸濁液を調整した。ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＬＡＧ－３抗体（ＦＩＴＣ標識）、マウスＣＤ２６抗体（ＰＥ標識）及びマウスＣＤ３抗体（ＰｅｒＣＰ標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３陽性細胞におけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性細胞を計測し百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２５）。腫瘍浸潤細胞のＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞は、非投与群では１３．３％±６．１（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では１２．６％±５．１（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では４．９％±２．１（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　ＴＩＬ単一細胞懸濁液からＣＤ８Ｔ細胞を純化し（マウスＣＤ８＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用）、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ添加培養液にてＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体を加えて４時間刺激後、ＢＤ　Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　Ｋｉｔを用いて細胞内ＩＦＮγ（ＦＩＴＣ標識）及び細胞表面ＣＤ８（ＰＥ標識）の染色を行なった。フローサイトメーターを用いてＣＤ８陽性細胞におけるＩＦＮγ陽性細胞を計測し百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２６）。腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮγ陽性ＣＤ８Ｔ細胞は、非投与群では３５．７％±９．４（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では３６．８％±６．７（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では５８．０％±１５．５（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＩＦＮγ陽性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＣＤ３抗体（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４抗体（ＰＥ標識）で細胞表面の染色をしたのち、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔで細胞内ＦｏｘＰ３（ＡＰＣ標識）を行い、フローサイトメーターを用いてＴｒｅｇ細胞を計測しＣＤ３陽性Ｔ細胞数に対する百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２７）。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞は、非投与群では７．２５％±３．９０（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では８．３０％±４．７６（グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では２．２６％±２．２５（黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　ＴＩＬ単一細胞懸濁液をマウスＣＤ４５抗体（ＰｅｒＣＰ標識）、マウスＣＤ１１ｂ抗体（ＰＥ標識）、マウスＣＤ１１ｃ抗体（ＰＥ標識）、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１（Ｃａｖ－１）抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識）で染色し、フローサイトメーターを用いてＣＤ４５陽性ＤＣ細胞におけるＣａｖ－１陽性細胞を計測し百分率で記録した。結果は、平均値±標準偏差をグラフで示した（図２８）。腫瘍浸潤細胞のＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞は、非投与群では２２．２％±５．７（黒塗りグラフ）、ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群では２７．３％±８．１グレー塗りグラフ）、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では１４．７％±６．２黒枠白塗りグラフ）であった。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群でＴＩＬにおけるＣａｖ－１陽性ＤＣ細胞が有意に低下していた（ｐ＜０．０００１、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定）。
　以上のように、４Ｔ１接種後７日目からＣａｖ－Ｉｇを１日おきに合計１５回投与した。非投与及びコントロールＩｇ投与群では３０日目までに全例が死亡したが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では有意に生存率が延長した（図２３）。また、薬剤投与７回（４Ｔ１接種後としては２０日目）の時点で、非投与及びコントロールＩｇ投与群は腫瘍が増大していたが、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では腫瘍の増殖が著しく抑制された（図２４）。すなわち、Ｃａｖ－Ｉｇにより腫瘍の増殖がコントロールされ生存期間が延長した。さらに、腫瘍部のエフェクター細胞の解析を行ったところ、４Ｔ１接種２０日目（ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ又はＣａｖ－Ｉｇ投与７回）のマウスの腫瘍部のリンパ球では、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群で、ＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性Ｔリンパ球が有意に減少しており（図２５）、同時に、ＩＦＮγを産生する細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞が有意に増加していた（図２６）。また、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では、腫瘍部のＴｒｅｇとＣａｖ－１陽性ＤＣが有意に減少していた（図２７、図２８）。
　この結果から、Ｃａｖ－Ｉｇ投与によってＣａｖ－１陽性ＤＣが減少してＬＡＧ－３陽性ＣＤ２６陽性リンパ球による免疫チェック機構が阻害された結果、がん微小環境の抗腫瘍免疫が活性化し、腫瘍の増殖を抑制することが乳癌モデルでも明らかとなった。
試験例１０
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだ肺癌細胞株ＥＸ－３ＬＬ（ＪＣＲＢ１７１６（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手））をＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの腹腔に接種（１×１０4／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに腹腔内に投与した（各群ｎ＝３）。腫瘍接種後２０日目（Ｃａｖ－Ｉｇ又はｃｏｎｔｏｒｏｌ　Ｉｇ投与７回）のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した。各群について代表的な生体イメージングの写真を提示した（図２９）。ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では生体発光は認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しておらず、腫瘍増殖が抑制されている。マウスは、蛍光発光が識別しやすいように部分的に剃毛してある。
試験例１１
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだリンパ腫細胞株ＥＬ－４ａｄ（ＪＣＲＢ１３５２（ＪＣＲＢ細胞バンクから入手））をＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの腹腔に接種（１×１０3／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに腹腔内に投与した（各群ｎ＝３）。腫瘍接種後２０日目（Ｃａｖ－Ｉｇ又はｃｏｎｔｏｒｏｌ　Ｉｇ投与７回）のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した。各群について代表的な生体イメージングの写真を提示した（図３０）。ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群は生体発光は認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しておらず、腫瘍増殖が抑制されている。マウスは、蛍光発光が識別しやすいように部分的に剃毛してある。
　以上のように、大腸癌のほか、乳癌（図２３、２４）、肺癌（図２９）、リンパ腫（図３０）に対しても、Ｃａｖ－Ｉｇにより腫瘍の増殖がコントロールされた。このことは、Ｃａｖ－Ｉｇ免疫チェックポイント阻害による抗腫瘍免疫効果は癌腫を超えて発揮される生体監視機構であるため、Ｃａｖ－Ｉｇは、大腸癌のみならずその他の癌の治療にも応用可能であることを強く示唆している。
試験例１２（ＣａｖＮ末端領域以外の領域削除変異体融合タンパク質の静脈投与によりによる抗腫瘍性薬理活性の実証）
　ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだマウスＢ細胞リンパ腫細胞株Ａ２０（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　のＸ　Ｃｈｅｎ博士から供与）をＢａｌｂ／Ｃマウスの尾静脈から接種（４×１０４／マウス）し、７日目からＣａｖ－Ｉｇ（ＮＴ－Ｆｃ）、Ｃａｖ削除変異体（ＮＴΔＳＣＤ－Ｆｃ、ＳＣＤ－Ｆｃ）（１０μｇ／回）又はｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ（１０μｇ／回）を１日おきに合計１０回静脈内に投与した（各群ｎ＝３）。腫瘍接種後２８日目のマウスの腹腔にＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／マウス体重ｋｇ）を投与し１０分後に生体イメージング法（Ｃａｌｉｐｅｒ　ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて腫瘍を生体発光強度で評価した。各群について代表的な生体イメージングの写真を提示した（図３１）。ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｉｇ投与群は腹部に強い生体発光を検出しており腫瘍が増殖していることを示している。一方、Ｃａｖ－Ｉｇ投与群では生体発光は認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しておらず、腫瘍増殖が抑制されている。Ｃａｖ－Ｉｇ投与群（ＮＴ－Ｆｃ、ＮＴΔＳＣＤ－Ｆｃ、ＳＣＤ－Ｆｃ）では、生体発光は認めないか、認めてもわずかな発光しか検出しなかった。これらの結果より、Ｃａｖ削除変異体（ＮＴΔＳＣＤ－Ｆｃ、ＳＣＤ－Ｆｃ）でも、Ｃａｖ－Ｉｇ（ＮＴ－Ｆｃ）と同等の薬理活性があることが示された。

Claims (12)

  1. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を有効成分とする免疫チェックポイント阻害剤。
  2. 　請求項１記載の免疫チェックポイント阻害剤を含有する抗悪性腫瘍剤。
  3. 　請求項１記載の免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体とを組み合わせてなる抗悪性腫瘍剤。
  4. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上の、免疫チェックポイント阻害剤製造のための使用。
  5. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤の、抗悪性腫瘍剤製造のための使用。
  6. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体との組み合わせの、抗悪性腫瘍剤製造のための使用。
  7. 　免疫チェックポイントを阻害するための、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上。
  8. 　悪性腫瘍を治療するための、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤。
  9. 　悪性腫瘍を治療するための、カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体との組み合わせ。
  10. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上の有効量を投与することを特徴とする免疫チェックポイント阻害方法。
  11. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍治療方法。
  12. 　カベオリン１のＮ末端領域のペプチド断片、カベオリン１のスキャホールディングドメイン配列のペプチド断片、カベオリン１のＮ末端領域からスキャホールディングドメインを欠失したペプチド断片、ＣＤ２６のカベオリン１結合領域のペプチド断片、及びこれらのいずれかのペプチド断片と免疫グロブリン定常領域との融合タンパク質から選ばれる１種以上を含有する免疫チェックポイント阻害剤と、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体から選ばれる１種以上の抗体とを投与する悪性腫瘍治療方法。
PCT/JP2020/000874 2019-01-15 2020-01-14 免疫チェックポイント阻害剤 WO2020149258A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020566410A JPWO2020149258A1 (ja) 2019-01-15 2020-01-14

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019004480 2019-01-15
JP2019-004480 2019-01-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020149258A1 true WO2020149258A1 (ja) 2020-07-23

Family

ID=71613030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/000874 WO2020149258A1 (ja) 2019-01-15 2020-01-14 免疫チェックポイント阻害剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2020149258A1 (ja)
WO (1) WO2020149258A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114588273A (zh) * 2022-04-21 2022-06-07 中南大学湘雅医院 一种抑制肿瘤免疫逃逸多肽的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503321A (ja) * 2000-09-08 2005-02-03 イエール・ユニバーシテイ カベオリンペプチド及び治療薬としてのそれらの使用
JP2016069314A (ja) * 2014-09-29 2016-05-09 学校法人順天堂 免疫抑制剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005503321A (ja) * 2000-09-08 2005-02-03 イエール・ユニバーシテイ カベオリンペプチド及び治療薬としてのそれらの使用
JP2016069314A (ja) * 2014-09-29 2016-05-09 学校法人順天堂 免疫抑制剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORIMOTO, CHIKAO; OHNUMA, KEI: "Development of New Therapy for Malignant Mesothelioma Based on CD26 Molecule", JAPANESE JOURNAL OF CANCER AND CHEMOTHERAPY, vol. 43, no. 7, 2016, pages 855 - 862, XP009522623, ISSN: 0385-0684 *
OHNUMA KEI ET AL.: "Blockade of CD 26-mediated T cell costimulation with soluble caveolin-l-Ig fusion protein induces anergy in CD 4+T calls", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 386, 2009, pages 327 - 332, XP026251909, DOI: 10.1016/j.bbrc.2009.06.027 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114588273A (zh) * 2022-04-21 2022-06-07 中南大学湘雅医院 一种抑制肿瘤免疫逃逸多肽的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020149258A1 (ja) 2020-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6963051B2 (ja) 免疫療法のための組成物および方法
AU2019203823B2 (en) CS1-specific chimeric antigen receptor engineered immune effector cells
JP6858128B2 (ja) 癌治療のための免疫療法とサイトカイン制御療法との組み合わせ
JP7262403B2 (ja) 新規の細胞タグの発現
JP5960597B2 (ja) 癌治療のための併用免疫療法
JP2022069603A (ja) 免疫療法のための組成物および方法
CN113383071A (zh) 用于t细胞工程化的组合物和方法
JP2021523110A (ja) 遺伝子発現のためのナノ粒子及びその使用
JP2024073449A (ja) Ｒｏｒ－１特異的キメラ抗原受容体およびその使用
CN110191898A (zh) Cd33特异性嵌合抗原受体
CN110462040A (zh) 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达
US20190240258A1 (en) Pd-1 car nk-92 cell and preparation method and use thereof
CN109476743A (zh) 预防或缓解毒性的早期干预方法
JP2023530408A (ja) Ｃｄ７０指向性がん免疫療法のための遺伝子修飾されたナチュラルキラー細胞
US20240123007A1 (en) Hla-restricted vcx/y peptides and t cell receptors and use thereof
JP2023153866A (ja) スペーサーを含むポリペプチド組成物
TW202214706A (zh) 淋巴細胞－抗原呈現細胞共刺激物及其應用
JP2022513665A (ja) ナチュラルキラー細胞のエクスビボ増殖のための方法およびその使用方法
CA3081336A1 (en) T cell receptors for immunotherapy
KR20230016183A (ko) 키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 특이적 면역 세포
JP2022513372A (ja) シアリルルイスａを標的とするキメラ抗原受容体およびその使用
JP2022512891A (ja) 抗ｃｄ７９ｂ抗体およびキメラ抗原レセプターおよびそれらの使用方法
EP3805366A1 (en) Improved t-cell therapy method
CN113416260A (zh) 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
WO2020149258A1 (ja) 免疫チェックポイント阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20741878

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020566410

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20741878

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1