KR20230016183A - 키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 특이적 면역 세포 - Google Patents

키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 특이적 면역 세포 Download PDF

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KR20230016183A
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데이비드 에이치. 콱
클리오나 엠. 루니
카를로스 에이. 라모스
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베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

키메라 항원 수용체(CAR), 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포로서, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 신호전달 영역을 포함하고, 상기 신호전달 영역은 (a) CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열, 및 (b) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포가 개시된다. 또한 상기 세포를 제조하는 방법 및 상기 세포를 포함하는 조성물이 개시된다.

Description

키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포
본 출원은 2020년 4월 27일 출원된 US 63/015,769로부터의 우선권을 주장하며, 상기의 내용 및 요소들은 모든 이유로 인해 본원에 참조로 편입되어 있다.
기술분야
본 발명은 분자 및 세포 생물학에 관한 것이며, 또한 의학적 치료 및 예방 방법에 관한 것이다.
혈액암에서 자가유래 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR) T 세포의 성공에도 불구하고, 이와 같이 잠재적으로 치유력이 있는 요법이 좀 더 폭넓게 사용되는 것을 막는 장애물이 존재한다. 제조 실패, 주입 이전의 질환의 진행 및 과도한 비용 때문에 많은 이들에게 허용되지 않고 있다. 즉각적으로 활용 가능한 CAR T 세포 선택에 대한 시급한 요구가 존재한다.
신속하게 투여될 수 있는, 건강한 공여자에서 유래된 '기성규격품(Off-the-shelf)' T 세포 제품이 접근성을 개선하고 입양(adoptive) 세포 면역요법의 비용을 감소시킬 것이다. 하지만, '기성규격품' CAR T 세포 요법의 발전은, 하기 2가지 주요 위험에 의해 방해를 받아 왔다: 대숙주성 이식편 질환(graft versus host diseas)(GVHD)을 유발하는 비관련 공여체의 다클론성으로 활성화된 CAR T 세포에 대한 잠재기, 및 수혜자 동종반응성(alloreactive) T-세포에 의한 동종이계(allogeneic) CAR T 세포의 거부 반응.
제1 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포를 제공하며, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 신호전달 영역을 포함하고, 상기 신호전달 영역은 (a) CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열, 및 (b) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)(ITAM)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 CD28의 막관통 영역으로부터 유래된다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 서열번호 20과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 14와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열, 및 서열번호 15와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 (a) CD3ζ의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 25와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 추가로 상기 항원-결합 영역 및 상기 막관통 영역 사이에 제공되는 경첩 부위를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 서열번호 35 또는 36과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포를 제공하며, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 영역을 포함하고;
상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 하나 이상의 비-동일성 CAR, 또는 하나 이상의 비-동일성 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 암 세포 항원이다.
일부 양태에서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1R, CD4, CD7, CD38, BCMA, 메소텔린, EGFR, GPC3, MUC1, HER2, GD2, CEA, EpCAM, LeY 및 PSCA로부터 선택된다.
일부 양태에서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19이다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 바이러스-특이적 T 세포이다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV)에 대해 특이적이다.
본 발명은 또한 바이러스-특이적 면역 세포를 제조하는 방법을 제공하며,
키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록, 바이러스-특이적 면역 세포를 변형하는 단계를 포함하고, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 신호전달 영역을 포함하고, 상기 신호전달 영역은 (a) CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열, 및 (b) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 CD28의 막관통 영역으로부터 유래된다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 서열번호 20과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 14와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열, 및 서열번호 15와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 (a) CD3ζ의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 25와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 추가로 상기 항원-결합 영역 및 상기 막관통 영역 사이에 제공되는 경첩 부위를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 서열번호 35 또는 36과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 바이러스-특이적 면역 세포를 제조하는 방법을 제공하며,
키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록, 바이러스-특이적 면역 세포를 변형하는 단계를 포함하고, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 영역을 포함하고;
상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은, 추가로, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록, 바이러스-특이적 면역 세포를 변형하는 단계를 포함하며, 상기 CAR는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 하나 이상의 비-동일성 CAR, 또는 하나 이상의 비-동일성 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 암 세포 항원이다.
일부 양태에서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1R, CD4, CD7, CD38, BCMA, 메소텔린, EGFR, GPC3, MUC1, HER2, GD2, CEA, EpCAM, LeY 및 PSCA로부터 선택된다.
일부 양태에서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19이다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 바이러스-특이적 T 세포이다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 엡스테인-바 바이러스(EBV)에 대해 특이적이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 획득된 또는 획득될 수 있는 바이러스-특이적 면역 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제를 제공한다.
본 발명은 또한 의학적 치료 또는 예방의 방법에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원 또는 예방차원의 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 암은 CD30-양성 암, EBV-관련 암, 혈액암, 골수성 혈액 악성종양, 조혈성 악성종양, 림프아구 혈액 악성종양, 골수이형성 증후군, 백혈병, T 세포 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 급성 림프아구 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, B 세포 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종, EBV-관련 림프종, EBV-양성 B 세포 림프종, EBV-양성 미만성 거대 B 세포 림프종, X-연결 림프증식성 장애와 연관된 EBV-양성 림프종, HIV 감염/AIDS와 연관된 EBV-양성 림프종, 구강모 백반증, 버킷 림프종, 이식후 림프증식성 질환, 중추신경계 림프종, 역형성 거대 세포 림프종, T 세포 림프종, ALK-양성 역형성 T 세포 림프종, ALK-음성 역형성 T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종, NK-T 세포 림프종, 결절외 NK-T 세포 림프종, 흉선종, 다발성 골수종, 고형암, 상피세포암, 위암, 위암종, 위선암종, 위장선암종, 간암, 간세포 암종, 담관암종, 두경부암, 두경부 편평 세포 암종, 구강암(oral cavity cancer), 구강인두암, 구강인두 암종, 구강암(oral cancer), 후두암, 비인두 암종, 식도암, 결장직장암, 결장직장 암종, 결장암, 결장 암종, 자궁경부 암종, 전립선암, 폐암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐 선암, 편평 폐 세포 암종, 방광암, 요로상피암종, 피부암, 흑색종, 진행성 흑색종, 신장세포암, 신장세포 암종, 난소암, 난소 암종, 중피종, 유방암, 뇌암, 교아종, 전립선암, 췌장암, 비만세포증, 진행성 전신 비만세포증, 생식 세포 종양 또는 고환 배아 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 동종반응성 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 동종반응성 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서의, 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 동종반응성 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 동종반응성 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 병태는 동종이식과 연관된 질환 또는 병태이다.
일부 양태에서, 상기 질환 또는 병태는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)이다.
일부 양태에서, 상기 질환 또는 병태는 이식편 거부 반응이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 상기 동종이식편을 수확하기 전에 동종이식편을 위해 공여자 대상체에게 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 동종이식편을 위해 수혜자 대상체에게 상기 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 동종이식편을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 상기 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 동종이식에 의한 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 동종이식에 의한 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서의, 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 동종이식에 의한 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 동종이식편을 수확하기 전에 동종이식편을 위해 공여자 대상체에게 상기 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 동종이식편을 위해 수혜자 대상체에게 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 동종이식편을 치료차원의 또는 예방차원의 유효량으로 상기 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 동종이식은 동종이계 면역 세포의 입양 전달을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 질환 또는 병태는 T 세포 기능 장애, 암 또는 전염성 질환이다.
본 발명은 또한 동종반응성 면역 세포를 사멸하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 동종반응성 면역 세포를 본 발명에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
설명
본 발명의 발명가들은 GVHD를 유발하지 않고, 동종유래 세포 거부 반응을 회피하면서 혈액암의 제거를 위한 CAR-변형 바이러스 특이성 T 세포(CAR-VST) 접근법을 발전시켰다.
본 발명은 기성규격품 세포 요법을 비롯하여 동종이계 조직을 이식편 거부 반응에서 보호하기 위해, 또는 GVHD를 치료하기 위해 동종반응성 T-세포를 제거하는 전략을 제공한다.
CD30이 동종반응성 T-세포의 표지자로 식별된 바 있어서, 본 발명의 발명가들은 CD30을 겨냥한 항원 수용체(CAR)(CD30.CAR)를 발현하도록 치료적 T 세포를 조작함으로써, 이들을 표적화하였다. VST를 발현하는 CD30.CAR는 수혜자 대상체에서 동종반응성 면역 반응을 감소시키기 위해 동종이계 요법을 사용하는 방법에서 활용될 수 있다.
동종이계 T 세포를 HLA-불일치 수혜자에게 투여하는 단계는 상기 T 세포의 일부는 본질적으로 동종반응성을 소유하기 때문에 CVHD와 같은 동종반응성 면역 반응의 위험을 수반한다. 본 발명의 발명가들은 바이러스 특이적 T 세포(VST)가 동종이계 수혜자에서 GVHD를 거의 유발하지 않는 것으로 나타났기에, CD30.CAR을 발현하기 위한 플랫폼 세포로서 VST를 사용하였는데, 이는 이의 제한된 TCR 레퍼토리의 결과일 가능성이 있다. 특히, 엡스테인-바 바이러스-특이적 T 세포(EBVST)가 300명 넘는 동종이계 수혜자에게 투여되었으나, GVHD의 징후가 전혀 없었다.
추가로, CD30.CAR 발현 VST는 상기 수혜자에서 동종반응성 T-세포에 의한 거부 반응로부터 스스로를 보호하기 때문에, 예를 들어, CD30+ 암의 치료를 위해 기성규격품 요법으로서 직접 사용될 수 있다.
따라서, CD30.CAR VST는 (i) 동종이계 숙주에서 이들이 이끌어내는 동종반응성 T-세포를 제거하고, (ii) GVHD를 유발하지 않으면서, CD30-양성 암을 제거하기에 충분한 시간 동안 및 필요한 활성으로 지속될 것이다.
CD30.CAR 발현 VST는 또한, 예를 들어, CD30 이외의 추가적인 표적 항원(들)에 특이적인 CAR을 발현하도록 조작함을 통해, 추가적인 표적 항원을 표적화하기 위해 조작될 수 있다. 상기 세포는 표적 항원(들)을 발현하는 세포를 살해할 수 있고 CD30-발현 동종이계 T 세포를 제거할 수 있기에, 관련 표적 항원(들)을 발현하는 암의 치료를 위한 기성규격품 요법으로 유용하다.
바이러스-특이적 면역 세포
본 발명은 바이러스-특이적 면역 세포, 특히, 엡스테인-바 바이러스(EBV)-특이적 면역 세포에 관한 것이다. 세포가 본원에 단일형(즉, '세포')으로 언급되는 경우, 상기 세포의 복수형/집단 또한 고려됨이 이해될 것이다.
본원에 사용된 '바이러스-특이적 면역 세포'는 바이러스에 특이적인 면역 세포를 가리킨다. 바이러스-특이적 면역 세포는 바이러스의 항원의 펩타이드(예를 들어, MHC 분자에 의해 제공되는 경우)를 인식할 수 있는 수용체(바람직하게는, T 세포 수용체)를 발현하거나/포함한다. 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 이와 같은 항원 수용체를 인코딩하는 내인성 핵산의 발현의 결과로서 또는 이와 같은 수용체를 발현하도록 조작된 것의 결과로서, 이와 같은 수용체를 발현하거나 포함할 수 있다. 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 바람직하게는 바이러스의 항원의 펩타이드에 특이적인 TCR를 발현하거나 또는 포함한다.
상기 면역 세포는 조혈 기원의 세포, 예를 들어, 호중성 백혈구, 호산구, 호염기성 세포, 수상돌기 세포, 림프구, 또는 단핵 백혈구일 수 있다. 림프구는 예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 선천적 림프성 세포(ILC), 또는 이들의 전구체일 수 있다. 상기 면역 세포는 예를 들어, CD3 폴리펩타이드(예를 들어, CD3γ, CD3ε, CD3ζ, 또는 CD3δ), TCR 폴리펩타이드(TCRα 또는 TCRβ), CD27, CD28, CD4 또는 CD8를 발현할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 면역 세포는 T 세포, 예를 들어, CD3+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 CD3+, CD8+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 T 헬퍼 세포(TH 세포)이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL))이다.
바이러스-특이적 T 세포는 상기 T 세포에 특이적인 바이러스 항원에 반응하여, 또는 상기 바이러스/항원을 포함하거나 발현하는 세포에 반응하여, T 세포의 일 특정 기능적 특성들을 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, 상기 특성들은 효과기 T 세포, 예를 들어, 세포독성 T 세포와 연관된 기능적 특성들이다.
일부 양태에서, 바이러스-특이적 T 세포가 하기 특성들 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 상기 T 세포에 특이적인 바이러스/바이러스 항원으로의 자극에 반응하여, 또는 상기 T 세포에 특이적인 바이러스/바이러스 항원을 포함하거나 발현하는 세포에 노출에 반응하여, 상기 T 세포에 특이적인 바이러스/바이러스 항원을 포함하거나 또는 발현하는 세포에 대한 세포독성; 증식, IFNγ 발현, CD107a 발현, IL-2 발현, TNFα 발현, 퍼포린 발현, 그란자임 발현, 그라눌리신 발현, 및/또는 FAS 리간드(FASL) 발현.
바이러스-특이적 T 세포는 적절한 MHC 분자에 의해 제공되는 경우 상기 T 세포에 특이적인 바이러스 항원의 펩타이드를 인식할 수 있는 TCR를 발현하거나 포함한다. 바이러스-특이적 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스는 임의의 바이러스일 수 있다. 예를 들면, 상기 바이러스는 dsDNA 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스), ssRNA 바이러스(예를 들어, 파르보바이러스), dsRNA 바이러스(예를 들어, 레오바이러스), (+)ssRNA 바이러스(예를 들어, 피코르나바이러스, 토가바이러스), (-)ssRNA 바이러스(예를 들어, 오쏘마이소바이러스, 라브도바이러스), ssRNA-RT 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스) 또는 dsDNA-RT 바이러스(예를 들어, 헤파드나바이러스)일 수 있다. 특히, 본 발명은 아데노비리대, 헤르페스비리대, 파필로마비리대, 폴리오마비리대, 폭스비리대, 헤파드나비리대, 파르보비리대, 아스트로비리대, 칼리시비리대, 피코르나비리대, 코로나비리대, 플라비비리대, 토가비리대, 헤페비리대, 레트로비리대, 오쏘마이소비리대, 아레나비리대, 분야비리대, 필로비리대, 파라믹소비리대, 라브도비리대 및 레오비리대 과의 바이러스를 고려한다. 일부 양태에서, 상기 바이러스는 엡스테인-바 바이러스, 아데노바이러스, 단순포진 유형 1 바이러스, 단순포진 유형 2 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 인간 거대 세포바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 유형 8, 인간 유두종바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 천연두, 간염 B 바이러스, 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노르워크 바이러스, 콕사키바이러스, 간염 A 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 간염 C 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트나일 바이러스, TBE 바이러스, 루벨라 바이러스, 간염 E 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 독감 바이러스, 라사 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 한탄 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 파라독감 바이러스, 피코르나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 광견 바이러스, 간염 D 바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스, 및 바타 바이러스로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 바이러스는 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 독감 바이러스, 홍역 바이러스, 간염 B 바이러스(HBV), 간염 C 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 또는 단순포진 바이러스(HSV)로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 바이러스, 예를 들어, 엡스테인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 독감 바이러스, 홍역 바이러스, 간염 B 바이러스(HBV), 간염 C 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 또는 단순포진 바이러스(HSV)로부터 선택되는 바이러스의 펩타이드/폴리펩타이드에 특이적일 수 있다.
바이러스의 항원에 특이적인 T 세포는 본원에서 바이러스-특이적 T 세포(VST)로 불릴 수 있다. 특정 바이러스의 항원에 특이적인 T 세포는 관련 바이러스에 특이적이라고 기술될 수 있어서; 예를 들면, EBV의 항원에 특이적인 T 세포는 EBV-특이적 T 세포, 또는 'EBVST'라고 불릴 수 있다.
이에 따라, 일부 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 엡스테인-바 바이러스-특이적 T 세포(EBVST), 아데노바이러스-특이적 T 세포(AdVST), 거대세포바이러스-특이적 T 세포(CMVST), 인간 유두종 바이러스(HPVST), 독감 바이러스-특이적 T 세포, 홍역 바이러스-특이적 T 세포, 간염 B 바이러스-특이적 T 세포(HBVST), 간염 C 바이러스-특이적 T 세포(HCVST), 인간 면역결핍 바이러스-특이적 T 세포(HIVST), 림프구성 맥락수막염 바이러스-특이적 T 세포(LCMVST), 또는 단순포진 바이러스-특이적 T 세포(HSVST)이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 EBV 항원의 펩타이드/폴리펩타이드에 특이적이다. 바람직한 양태에서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 엡스테인-바 바이러스-특이적 T 세포(EBVST)이다.
EBV 바이러스학이, 예를 들어, Stanfield and Luftiq, F1000Res.(2017) 6:386 및 Odumade et al., Clin Microbiol Rev(2011) 24(1):193-209에 기술되었고, 이들 문헌 전체는 본원에 참조로 편입되어 있다.
EBV는 β1 인테그린에 바이러스 단백질 BMFR2의 결합, 및 인테그린 avβ6 및 avβ8과 바이러스 단백질 gH/gL의 결합을 통해 상피 세포를 감염시킨다. EBV는 CD21 및/또는 CD35와 바이러스 당단백질 gp350의 상호작용과, 이어서 MHC 클래스 II와 바이러스 gp42의 상호작용을 통해 B 세포를 감염시킨다. 이와 같은 상호작용들은 세포막과 바이러스 외피의 융합을 촉발시킴으로써, 상기 바이러스가 상기 세포에 진입하게 한다. 일단 진입하면, 상기 바이러스 캡시드가 용해되고 상기 바이러스 게놈이 핵으로 수송된다.
EBV는 복제가 잠재기 및 용해성의 두 가지 모드를 갖는다. 잠재기 주기는 비리온의 생산을 야기하지 않고, B 세포 및 상피 세포에서 발생할 수 있다. 상기 EBV 게놈 원형 DNA는 에피솜으로 세포 핵에 머물고, 상기 숙주 세포의 DNA 중합효소에 의해 복사된다. 잠재기의 경우, EBV의 유전자들 중 일부만이 잠재기 프로그램으로 알려진 세 가지 상이한 패턴 중 하나로 발현되고, 이것으로 구별되는 바이러스 단백질 및 RNA의 세트가 생산된다. 잠재기 주기는 예를 들어, Amon and Farrell, Reviews in Medical Virology (2004) 15(3): 149-56에 기술되었고, 이는 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
EBNA1 단백질 및 비코딩 RNA EBER가 잠재기 프로그램 I 내지 III 각각에서 발현된다. 잠재기 프로그램 II 및 III은 추가로 EBNALP, LMP1, LMP2A 및 LMP2B 단백질의 발현을 수반하고, 잠재기 프로그램 III은 추가로 EBNA2, EBNA3A, EBNA3B 및 EBNA3C의 발현을 수반한다.
EBNA1은 다기능성이며, 바이러스 촉진 유전자의 양성 및 음성 조절을 통한 EBV 에피솜 게놈의 유전자 조절, 염색체외 복제 및 유지에서 역할을 한다 (Duellman et al., J Gen Virol.(2009); 90(Pt 9): 2251-2259). EBNA2는 잠재기 바이러스 전사의 조절에 관여되고, EBV에 감염된 세포의 불멸화에 기여한다 (Kempkes and Ling, Curr Top Microbiol Immunol. (2015) 391:35-59). EBNA-LP는 천연 B 세포의 변형을 위해 요구되며, 바이러스 복제를 위한 전사 인자들을 모집한다 (Szymula et al., PLoS Pathog.(2018);14(2):e1006890). EBNA3A, 3B 및 3C는 RBPJ와 상호작용하여 유전자 발현에 영향을 미침으로써, 감염된 세포의 생존 및 성장에 기여한다 (Wang et al., J Virol.(2016) 90(6):2906-2919). LMP1은 B 세포 활성에 관여된 유전자의 발현을 조절한다 (Chang et al., J. Biomed. Sci.(2003) 10(5): 490-504). LMP2A 및 LMP2B는 상기 활성화된 B 세포 수용체를 모방함으로써 정상적인 B 세포 신호 형질 도입을 억제한다 (Portis and Longnecker, Oncogene(2004) 23(53): 8619-8628). EBER는 숙주 세포 단백질과 리보뉴클레오단백질 복합체를 형성하고, 세포 변형에서 역할을 하기 위해 제안된다.
상기 잠재기 주기는 B 세포에서 잠재기 프로그램 I 내지 III 중 임의의 것에 따라 진행될 수 있고, 일반적으로 III에서 II로, 그리고 I로 진행된다. 휴면 중인 미처리(naive) B 세포의 감염 시, EBV는 잠재기 프로그램 III에 진입한다. 잠재기 III 유전자의 발현은 상기 B 세포를 활성화하고, 이것이 증식 중인 아세포(blast)가 된다. 이어서, EBV는 전형적으로 발현을 하위집합의 유전자로 제한함으로써 잠재기 II로 진행되고, 이것이 아세포의 메모리 B 세포로의 분화를 유발한다. 유전자 발현의 추가적인 제한으로 인해 EBV는 잠재기 I에 진입한다. 메모리 B 세포가 분열될 때 EBNA1 발현으로 EBV가 복제된다. 상피 세포에서는 잠재기 II만이 발생한다.
일차 감염에서, EBV는 구강인두 상피 세포에서 복제되고, B-림프구에서 잠재기 III, II, 및 I 감염을 성립시킨다. 바이러스 지속성, 추후 상피 세포에서의 복제, 및 타액으로의 감염성 바이러스의 방출을 위해 B-림프구의 EBV 잠재기 감염이 필요하다. B-림프구의 EBV 잠재기 III 및 II 감염, 구강 상피 세포의 잠재기 II 감염, 및 NK- 또는 T 세포의 잠재기 II 감염은 균일한 EBV 게놈 존재 및 유전자 발현으로 표지되는 악성 종양을 야기할 수 있다.
B 세포에서 잠재기 EBV가 재활성화되어 용해성 복제로 전환될 수 있다. 용해기는 감염성 비리온의 생산을 야기하고, B 세포 및 상피 세포에서 일어날 수 있으며, 예를 들어, Kenney in Chapter 25 of Arvin et al., Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis; Cambridge University Press (2007)에 의해 검토되었는데, 이는 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
용해성 복제를 위해서는 상기 EBV 게놈이 선형이어야 한다. 상기 잠재기 EBV 게놈은 에피솜이고, 따라서 이는 용해성 재활성화를 위해 반드시 선형화되어야 한다. B 세포에서, 용해성 복제는 일반적으로 잠재기에서 재활성화 후에만 발생한다.
즉각적인 초기 용해성 유전자 생성물, 예컨대 BZFL1 및 BRLF1은 트랜스활성화 인자로 작용하여, 이들 자신의 발현을, 그리고 후기(later) 용해기 유전자의 발현을 향상시킨다.
초기 용해성 유전자 생성물은 바이러스 복제(예를 들어, EBV DNA 중합효소 촉매작용성 성분 BALF5; DNA 중합효소 진행도 인자 BMRF1, DNA 결합 단백질 BALF2, 나선효소 BBLF4, 프라이메이스(primase) BSLF1, 및 프리마제(primase)-관련 단백질 BBLF2/3) 및 데옥시뉴클레오타이드 대사(예를 들어, 타이미딘 키나아제 BXLF1, dUTPase BORF2)에 역할을 한다. 다른 초기 용해성 유전자 생성물은 전사 인자(예를 들어, BMRF1, BRRF1)로 작용하거나, RNA 안정성 및 가공에 역할을 하거나(예를 들어, BMLF1), 또는 면역 회피에 관여된다 (예를 들어, BHRF1로, 이는 세포자살을 억제한다).
말기(late) 용해성 유전자 생성물은 전통적으로 바이러스 복제의 시작 후 발현되는 것으로 분류된다. 이들은 일반적으로 EBV 결합 및 융합을 매개하는 당단백질 뿐만 아니라 뉴클레오캡시드 단백질과 같은 비리온의 구조적 성분(예를 들어, gp350/220, gp85, gp42, gp25)를 인코딩한다. 다른 말기 용해성 유전자 생성물은 면역 회피에 역할을 하고; BCLF1은 IL-10의 바이러스 동족체를 인코딩하고, BALF1은 세포자살 저항 단백질 Bcl2와 상동성을 갖는 단백질을 인코딩한다.
본원에 사용된 'EBV-특이적 면역 세포'는 엡스테인-바 바이러스(EBV)에 특이적인 면역 세포를 가리킨다. EBV-특이적 면역 세포는 EBV의 항원의 펩타이드(예를 들어, MHC 분자에 의해 제공되는 경우)를 인식할 수 있는 수용체(바람직하게는, T 세포 수용체)를 발현하거나 포함한다. 상기 EBV-특이적 면역 세포는 바람직하게는 MHC 클래스 I에 의해 제공되는 EBV 항원의 펩타이드에 특이적인 TCR를 발현하거나 포함한다.
일부 양태에서, 상기 EBV-특이적 면역 세포는 T 세포, 예를 들어, CD3+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 CD3+, CD8+ T 세포이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 T 헬퍼 세포(TH 세포))이다. 일부 양태에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL))이다.
EBV-특이적 T 세포는 상기 T 세포에 특이적인 EBV 항원에 대응하여, 또는 EBV(예를 들어, EBV에 감염된 세포) 또는 상기 관련 EBV 항원을 포함하거나 또는 발현하는 세포에 대응하여, T 세포의 특정한 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, 상기 특성들은 효과기 T 세포, 예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL)와 연관된 기능적 특성이다.
일부 양태에서, EBV-특이적 T 세포는 하기 특성들 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 상기 T 세포에 특이적인 EBV/EBV 항원으로의 자극에 반응하여, 또는 상기 T 세포에 특이적인 EBV/EBV 항원을 포함하거나 발현하는 세포에 노출에 반응하여 상기 T세포에 특이적인 EBV/EBV 항원을 포함하거나 발현하는 세포에 대한 세포독성; 증식, IFNγ 발현, CD107a 발현, IL-2 발현, TNFα 발현, 퍼포린 발현, 그란자임 발현, 그라눌리신 발현, 및/또는 FAS 리간드(FASL) 발현.
EBV-특이적 T 세포는 적절한 MHC 분자에 의해 제공되는 경우 바람직하게는 상기 T 세포에 특이적인 EBV 항원의 펩타이드를 인식할 수 있는 TCR를 발현하거나 포함한다. EBV-특이적 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
EBV에 특이적인 면역 세포는 임의의 EBV 항원, 예를 들어, 본원에 기술된 EBV 항원에 특이적일 수 있다. EBV에 특이적인 면역 세포의 집단, 또는 EBV에 특이적인 다수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 하나 이상의 EBV 항원에 특이적인 면역 세포를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, EBV 항원은 EBV 잠재기 항원, 예를 들어, 유형 III 잠재기 항원(예를 들어, EBNA1, EBNA-LP, LMP1, LMP2A, LMP2B, BARF1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B 또는 EBNA3C), 유형 II 잠재기 항원(예를 들어, EBNA1, EBNA-LP, LMP1, LMP2A, LMP2B 또는 BARF1), 또는 유형 I 잠재기 항원(예를 들어, EBNA1 또는 BARF1)이다. 일부 양태에서, EBV 항원은 EBV 용해성 항원, 예를 들어, 즉각적인 초기 용해성 항원(예를 들어, BZLF1, BRLF1 또는 BMRF1), 초기 용해성 항원(예를 들어, BMLF1, BMRF1, BXLF1, BALF1, BALF2, BARF1, BGLF5, BHRF1, BNLF2A, BNLF2B, BHLF1, BLLF2, BKRF4, BMRF2, FU 또는 EBNA1-FUK), 또는 말기 용해성 항원(예를 들어, BALF4, BILF1, BILF2, BNFR1, BVRF2, BALF3, BALF5, BDLF3 또는 gp350)이다.
키메라 항원 수용체
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능 두 가지를 제공하는 재조합 수용체 분자이다. CAR 구조물 및 조작은, 예를 들면, Dotti et al., Immunol Rev(2014) 257(1)에서 검토되었으며, 이는 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
CAR는 막관통 영역을 통해 신호전달 영역에 연결된 항원-결합 영역을 포함한다. 선택적 경첩 또는 스페이서 영역이 항원-결합 영역 및 막관통 영역 사이의 분리를 제공할 수도 있고, 유연한 링커 역할을 할 수도 있다. 세포에 의해 발현되는경우, 항원-결합 영역이 세포외 공간에 제공되고, 상기 신호전달 영역은 세포내에 존재한다.
상기 항원-결합 영역은 CAR에 특이적인 표적 항원에 결합을 가능하게 한다. CAR의 항원-결합 영역은 상기 CAR가 표적으로 삼는 항원에 특이적인 항체의 항원-결합 부위를 토대로 할 수 있다. 예를 들면, CAR의 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체의 상보성 결정 부위(CDR)에 대한 아미노산 서열을 포함한다. CAR의 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어질 수 있다. 항원-결합 영역은 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위 아미노산 서열의 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 절편(scFv)으로 제공될 수 있다. CAR의 항원-결합 영역은 다른 단백질:단백질 상호작용, 예컨대 리간드:수용체 결합을 토대로 항원을 표적화할 수 있어서, 예를 들면 IL-13Rα2-표적화 CAR가 IL-13을 토대로 항원-결합 영역을 사용하여 개발된 바 있다 (예를 들어, Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64(24): 9160-9166 참조).
상기 막관통 영역은 CAR의 항원-결합 영역 및 신호전달 영역 사이에 제공된다. 상기 막관통 영역은 상기 항원-결합 영역이 세포외 공간에 존재하고 신호전달 영역이 세포 내에 존재하는 가운데, 상기 CAR을 발현하는 세포의 세포막에 상기 CAR을 고정시키는 것을 허용한다. CAR의 막관통 영역은 세포막-결합 단백질에 대한 막관통 부위 서열에서 유래될 수도 있다 (예를 들어, CD28, CD8 등).
본 명세서에 걸쳐, 기준 폴리펩타이드/영역/아미노산 서열에서 '유래된' 양이온, 폴리펩타이드, 영역 및 아미노산 서열은 기준 폴리펩타이드/영역/아미노산 서열의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나이다. 기준 폴리펩타이드/영역/아미노산 서열에서 '유래된' 폴리펩타이드, 영역 및 아미노산 서열은 바람직하게는 상기 기준 폴리펩타이드/영역/아미노산 서열의 기능적 및/또는 구조적 특성들을 보유한다.
예시로서, CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열은, 예를 들어, 서열번호 26에 나타낸 바와 같이, CD28의 세포내 영역과 아미노산 서열 동일성이 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 더 나아가, CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 26의 아미노산 서열의 기능적 특성, 즉, CD28-매개 신호전달을 활성화하는 능력을 보유한다.
소정의 폴리펩타이드 또는 이의 영역의 아미노산 서열은 당해기술의 숙련가에게 공지된 데이터베이스에서 검색될 수 있고, 또는 여기서 검색된 핵산 서열에서 결정될 수 있다. 이와 같은 데이터베이스는 GenBank, EMBL 및 UniProt을 포함한다.
상기 신호전달 영역은 면역 세포 기능의 활성화를 위해 요구되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 CAR 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이는 CAR-발현 세포의 인산화 반응 및 활성화를 위한 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 제공한다. 다른 ITAM-함유 단백질의 서열을 포함하는 신호전달 영역, 예컨대 FcγRI의 ITAM 함유 부위를 포함하는 영역이 또한 CAR에 활용된 바 있다 (Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187). CD3-ζ의 세포내 영역으로부터 유래된 신호전달 영역을 포함하는 CAR가 종종 1세대 CAR라 불린다.
CAR의 신호전달 영역은 또한 전형적으로 면역 세포 활성화 및 효과기 기능을 향상시키기 위해 필요한 보조자극 신호를 제공하기 위해, 보조자극성 단백질(예를 들어, CD28, 4-1BB 등)의 신호전달 영역을 포함한다. 추가적인 보조자극성 서열을 포함하는 신호전달 영역을 갖는 CAR는 종종 2세대 CAR라 불린다. 일부 경우에, CAR는 상이한 세포내 신호전달 경로의 보조자극을 허용하도록 조작된다. 예를 들면, CD28 보조자극은 바람직하게는 포스파티딜리노시톨 3-키나아제(P13K) 경로를 활성화하는 반면, 4-1BB 보조자극은 TNF 수용체 연관 인자(TRAF) 어댑터 단백질을 통해 신호전달을 촉발한다. 따라서, CAR의 신호전달 영역은 때때로 하나 이상의 보조자극성 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 보조자극성 서열을 함유한다. 다수의 보조자극성 서열과 함께 신호전달 영역을 포함하는 CAR는 종종 3세대 CAR이라 불린다.
선택적 경첩 또는 스페이서 부위가 항원-결합 영역과 막관통 영역 사이에 분리를 제공할 수도 있고, 유연한 링커로 작용할 수도 있다. 이와 같은 부위는 결합 모이어티가 상이한 방향들로 향하도록 허용하는 유연한 영역이거나 또는 이를 포함하는데, 이는 예를 들어, IgG의 CH1-CH2 경첩 부위에서 유래될 수 있다.
특정 표적 항원에 특이적인 CAR을 발현하기 위한 조작을 통해, 면역 세포(전형적으로는 T 세포이지만, NK 세포와 같은 다른 면역 세포도 포함)는 표적 항원을 발현하는 세포를 살해하도록 지시받을 수 있다. CAR-발현 T 세포(CAR-T 세포)에 특이적인 표적 항원에 이것의 결합이 세포내 신호전달을 촉발하고, 결과적으로 T 세포의 활성을 촉발한다.　상기 활성화된 CAR-T 세포는 상기 표적 항원을 발현하는 세포의 살해를 야기하는 인자들을 분열 및 생산하도록 자극된다.
항원-결합 영역
'항원-결합 영역'은 표적 항원에 결합할 수 있는 영역을 가리킨다. 상기 표적 항원은 예를 들어, 펩타이드/폴리펩타이드, 당단백질, 지방단백질, 글리칸, 당지질, 지질, 또는 이들의 절편일 수 있다. 본 발명에 따른 항원-결합 영역은 표적 항원, 또는 또 다른 표적 항원-결합 분자(예를 들어, 표적 항원-결합 펩타이드 또는 핵산 압타머, 리간드 또는 다른 분자)를 겨냥하는 항체/항체 절편(예를 들어, Fv, scFv, Fab, 단일 사슬 Fab(scFab), 단일 영역 항체(예를 들어, VhH) 등)에서 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 항체의 항체 중쇄 가변 부위(VH) 및 항체 경쇄 가변 부위(VL)를 포함한다. 일부 양태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 상기 영역은 항원-결합 펩타이드/폴리펩타이드, 예를 들어, 펩타이드 압타머, 티오레독신, 모노바디, 안티칼린, 쿠니츠(Kunitz) 영역, 아비머, 크노틴, 파이노머, 아트리머, DARPin, 아피바디, 나노바디(즉, 단일-영역 항체(sdAb)), 아필린, 아르마딜로 반복 단백질(ArmRP), OBody 또는 피브로넥틴을 포함하거나 또는 이들로 이루어지며, 예를 들어, Reverdatto et al., Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101에서 검토되었으며, 이는 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다 (또한 예를 들어, Boersma et al., J Biol Chem(2011) 286:41273-85 및 Emanuel et al., Mabs (2011) 3:38-48 참조).
본 발명의 항원-결합 영역은 일반적으로 상기 표적 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 항체의 VH 및 VL을 포함한다. 항체는 일반적으로 상보성 결정 부위 CDR 6개; 중쇄 가변 부위(VH)에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3와 같이 3개, 및 경쇄 가변 부위(VL)에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3와 같이 3개를 포함한다. 6개 CDR는 함께 상기 표적 항원에 결합하는 항체의 일부인, 상기 항체의 파라토프를 정의한다. VH 부위 및 VL 부위는 각 CDR의 측면 중 하나에 기본틀 부위(FR)를 포함하는데, 이는 CDR를 위한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다. N-말단에서 C-말단까지, VH는, N 말단-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C 말단의 구조를 포함하며; VL은, N 말단-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C 말단의 구조를 포함한다.
상기 항원-결합 영역이 CAR의 다른 영역에 연결될 수 있는 경우, VH 및 VL 서열이 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 영역과 관련하여 고안된 형태는 Carter, Nat. Rev. Immunol(2006), 6: 343-357에 기술된 것들, 예컨대 scFv, dsFV, (scFv)2 이중체, 삼중체, 사중체, Fab, 미니바디 및 F(ab)2 형태를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 항체/항체 절편의 CDR를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 항체/항체 절편의 VH 부위 및 VL 부위을 포함한다. 항체의 VH 및 VL로 구성된 모이어티 역시 본원에서 가변 절편(Fv)으로 불릴 수 있다. 상기 VH 및 VL은 동일한 폴리펩타이드 사슬 상에 제공되어 링커 서열을 통해 결합될 수 있는데; 이와 같은 모이어티는 단일 사슬 가변 절편(scFvs)으로 불린다. scFv의 제조를 위한 적합한 링커 서열이 당해기술의 숙련가에게 알려져 있고, 세린 및 글리신 잔기를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 Fv를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 scFv를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
상기 항원-결합 영역(및 따라서 CAR)에 특이적인 표적 항원은 임의의 표적 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 표적 항원은 이의 발현/활성, 또는 상향조절된 발현/활성이 질환 또는 장애(예를 들어, 암, 전염병 또는 자가면역 질환)와 분명히 관련이 있는 항원이다. 상기 표적 항원은 바람직하게는 상기 표적 항원을 발현하는 세포의 세포 표면에서 발현된다. 상기 CAR는 CAR에 포함된 특이적 항원-결합 영역의 표적 항원을 발현하는 세포/조직에 CAR을 발현하는 세포의 효과기 활성을 겨냥함이 이해될 것이다.
일부 양태에서, 표적 항원은 암 세포 항원일 수 있다. 암 세포 항원은 암 세포에 의해 발현 또는 과발현되는 항원이다. 암 세포 항원은 임의의 펩타이드/폴리펩타이드, 당단백질, 지방단백질, 글리칸, 당지질, 지질, 또는 이들의 절편일 수 있다. 암 세포 항원의 발현은 암과 연관이 있을 수 있다. 암 세포 항원은 비정상적으로 암 세포에 의해 발현될 수도 있고(예를 들어, 상기 암 세포 항원은 비정상적 국지화를 가지고 발현될 수 있음), 또는 암 세포에 의해 비정상적인 구조를 가지고 발현될 수도 있다. 암 세포 항원은 면역 반응을 초래할 수도 있다. 일부 양태에서, 상기 항원은 암 세포의 세포 표면에서 발현된다 (즉, 상기 암 세포 항원은 암 세포 표면 항원이다). 일부 양태에서, 본원에 기술된 항원-결합 분자에 의해 결합되는 항원의 일부가 암 세포의 외측 표면(즉 세포외)에 나타난다. 상기 암 세포 항원은 암-관련 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 암 세포 항원은 이의 발현이 암의 발전, 진행 또는 증상의 중증도와 연관된 항원이다. 상기 암-관련 항원은 상기 암의 원인 또는 병리학과 연관이 있을 수도 있고, 또는 암의 결과로서 비정상적으로 발현될 수도 있다. 일부 양태에서, 상기 암 세포 항원은 이의 발현이, 예를 들어, 비교할 만한 비암성 세포(예를 들어, 동일한 조직/세포 유형에서 유래된 비암성 세포)에 의한 발현 수준과 비교하여, 암의 세포에 의해 상향조절된(예를 들어, RNA 및/또는 단백질 수준) 항원이다. 일부 양태에서, 상기 암-관련 항원은 바람직하게는 암성 세포에 의해 발현될 수 있으나, 비교할 만한 비암성 세포(예를 들어, 동일한 조직/세포 유형에서 유래된 비암성 세포)에 의해서는 발현되지 않는다. 일부 양태에서, 상기 암-관련 항원은 돌연변이된 종양유전자 또는 돌연변이된 종양 억제자 유전자의 생성물일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 암-관련 항원은 과발현된 세포 단백질, 종양유전자 바이러스에 의해 생산된 암 항원, 태아종양 항원, 또는 세포 표면 당지질 또는 당단백질의 생산물일 수 있다.
암 세포 항원이 Zarour HM, DeLeo A, Finn OJ, et al. Categories of Tumor Antigens. In: Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, et al., editors. Holland-Frei Cancer Medicine. 6th edition. Hamilton (ON): BC Decker; 2003에서 검토되었다. 암 세포 항원은 하기 태아종양 항원을 포함한다: CEA, 미성숙 라미닌 수용체, TAG-72; 종양바이러스 항원, 예컨대 HPV E6 및 E7; 과발현된 단백질: BING-4, 칼슘-활성화 염화물 채널 2, 사이클린-B1, 9D7, Ep-CAM, EphA3, HER2/neu, 텔로머라제, 메소텔린, SAP-1, 수르비빈; 암-고환 항원: BAGE, CAGE, GAGE, MAGE, SAGE, XAGE, CT9, CT10, NY-ESO-1, PRAME, SSX-2; 혈통 제한된 항원: MART1, Gp100, 타이로시나아제, TRP-1/2, MC1R, 전립선 특이적 전립선 항원; 돌연변이된 항원: β-카테닌, BRCA1/2, CDK4, CML66, 피브로넥틴, MART-2, p53, Ras, TGF-βRII; 번역후 변형된 항원: MUC1, 이디오타입 항원: Ig, TCR. 다른 암 세포 항원은 열 충격 단백질 70(HSP70), 열 충격 단백질 90(HSP90), 글루코오스-조절 단백질 78(GRP78), 비멘틴, 뉴클레올린, 페토-아시나르 췌장 단백질(FAPP), 알칼린 포스파타아제 태반-유사 2(ALPPL-2), 시글렉-5, 스트레스-유도 인단백질 1(STIP1), 단백질 타이로신 키나아제 7(PTK7), 및 사이클로필린 B를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 암 세포 항원은, 전체가 본원에 참조로 편입된, Zhao and Cao, Front Immunol.(2019) 10: 2250에 기술된 암 세포 항원이다. 일부 양태에서, 암 세포 항원은 CD30, CD19, CD20, CD22, ROR1R, CD4, CD7, CD38, BCMA, 메소텔린, EGFR, GPC3, MUC1, HER2, GD2, CEA, EpCAM, LeY 및 PSCA로부터 선택된다.
일부 양태에서, 암 세포 항원은 혈액 종양의 세포에 의해 발현된 항원이다. 일부 양태에서, 암 세포 항원은 CD30, CD19, CD20, CD22, ROR1R, CD4, CD7, CD38 및 BCMA로부터 선택된다.
일부 양태에서, 암 세포 항원은 고체 종양의 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 양태에서, 암 세포 항원은 메소텔린, EGFR, GPC3, MUC1, HER2, GD2, CEA, EpCAM, LeY 및 PSCA로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 암 세포 항원은 CD19이다. CD19는 B 세포의 표지자이고, 예를 들어, B 세포 림프종, 급성 림프아구 백혈병(ALL), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 치료를 위한 유용한 표적이다- 예를 들어, Wang et al., Exp Hematol Oncol.(2012) 1:36 참조.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역(및 따라서 CAR)은 다중특이성을 갖는다. '다중특이성'은 상기 항원-결합 영역이 하나 이상의 표적에 특이적 결합을 보임을 의미한다. 일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 이중 특이적 항원-결합 영역이다. 일부 양태에서, 상기 항원-결합 분자는 적어도 2개의 상이한 항원-결합 모이어티(즉, 적어도 2개의 항원-결합 모이어티, 예를 들어, 비-동일성 VH 및 VL을 포함함)를 포함한다. 개별 다중특이적 항원-결합 영역의 항원-결합 모이어티가, 예를 들어, 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 적어도 2개의 비-동일성 표적 항원에 결합되고, 그래서 적어도 이중특이성을 갖는다. 용어 '이중 특이성'은 상기 항원-결합 영역이 적어도 2개의 뚜렷한 항원 결정인자에 특이적으로 결합될 수 있음을 의미한다. 일부 양태에서, 다중특이성 항원-결합 영역/CAR에 대한 표적 항원들 중 적어도 하나는 CD30이다.
상기 표적 항원들 각각은 독립적으로 본원에 기술된 표적 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 각각의 표적 항원은 독립적으로 본원에 기술된 암 세포 항원이다.
본 발명에 따른 항원-결합 영역(예를 들어, 다중특이성 항원-결합 영역)이 상기 항원-결합 영역에 특이적인 표적(들)에 결합될 수 있는 항원-결합 모이어티를 포함함이 이해될 것이다. 예를 들면, CD30 및 CD30 이외의 항원에 결합될 수 있는 항원-결합 영역은 (i) CD30에 결합될 수 있는 항원-결합 모이어티, 및 (ii) CD30 이외의 표적 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 측면 및 양태에서, 상기 표적 항원은 CD30이다. 이에 따라, 본 발명의 일부 측면 및 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 CD30-결합 영역이다.
CD30(TNFRSF8이라고도 알려짐)은 UniProt: P28908에 의해 식별된 단백질이다. CD30은 종양 괴사 인자 수용체 상과의 단일 통과, 유형 I 막관통 당단백질이다. CD30 구조체 및 기능이 예를 들어, van der Weyden et al., Blood Caner Journal(2017) 7: e603 and Muta and Podack Immunol. Res. (2013) 57(1-3):151-8에 기술되었고, 이들 문헌 전체는 본원에 참조로 편입되어 있다.
인간 TNFRSF8 유전자에 의해 인코딩된 mRNAn의 대안적 스플라이싱이 하기의 3가지 이소형을 생산한다: 이소형 1('긴' 이소형; UniProt: P28908-1, v1; 서열번호 1), 서열번호 1의 위치 1 내지 463에 대한 아미노산 서열이 결여된 이소형 2('세포질', '짧은' 또는 'C30V' 이소형, UniProt: P28908-2; 서열번호 2) 및 서열번호 1의 위치 1 내지 111 및 위치 446에 상응하는 아미노산 서열이 결여된 이소형 3(UniProt: P28908-3; 서열번호 3). 서열번호 1의 상기 N-말단 18개 아미노산이 신호 펩타이드(서열번호 4)를 형성하고, 이어서 367개 아미노산 세포외 영역(서열 번호 5에 나타난, 서열 번호 1의 위치 19 내지 385), 21개 아미노산 막관통 영역(서열 번호 6에 나타난, 서열 번호 1의 위치 386 내지 406) 및 189개 아미노산 세포질 영역(서열 번호 7에 나타난, 서열 번호 1의 위치 407 내지 595)이 존재한다.
본 명세서에서, 'CD30'은 임의의 종의 CD30을 가리키고, 임의의 종의 CD30 이소형, 절편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 본원에 사용된 기준 단백질의 '절편', '변이체' 또는 '동족체'는 선택적으로 상기 기준 단백질(예를 들어, 기준 이소형)의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나인 것을 특징으로 할 수도 있다. 일부 양태에서, 기준 단백질의 절편, 변이체, 이소형 및 동족체는 상기 기준 단백질에 의해 수행되는 기능을 수행할 수 있는 능력에 의해 특징지을 수 있다.
일부 양태에서, 상기 CD30은 포유류(예를 들어, 영장류(붉은털 원숭이, 사이노몰구스, 또는 인간) 및/또는 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) CD30)에서 유래된다. 바람직한 양태에서, 상기 CD30은 인간 CD30이다. 이소형, 절편, 변이체 또는 동족체는 선택적으로 소정의 종, 예를 들어, 인간에서 유래된 미성숙 또는 성숙 CD30 이소형의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나인 것이 특징일 수 있다. CD30의 절편의 최소 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 590개 아미노산 중 하나일 수 있고, 최대 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 595개 아미노산 중 하나일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 CD30은 서열번호 1, 2 또는 3과 아미노산 서열 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 CD30은 서열번호 5와 아미노산 서열 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, CD30의 절편은 서열번호 5 또는 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
본 발명의 CAR의 CD30-결합 영역은 바람직하게는 CD30 또는 이의 절편에 대한 특이적 결합을 보인다. 본 발명의 CAR의 CD30-결합 영역은 바람직하게는 CD30의 세포외 영역에 대한 특이적 결합을 보인다. 상기 CD30-결합 영역은 항-CD30 항체 또는 기타 CD30-결합 제제, 예를 들어, CD30-결합 펩타이드 또는 CD30-결합 소분자에서 유래될 수 있다.
상기 CD30-결합 영역은 항-CD30 항체의 항원-결합 모이어티에서 유래될 수 있다.
항-CD30 항체는 HRS3 및 HRS4(예를 들어, Hombach et al., Scand J Immunol (1998) 48(5):497-501), Schlapschy et al., Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17(12): 847-860에 기술된 HRS3 유도체, BerH2(MBL International Cat# K0145-3, RRID:AB_590975), SGN-30(cAC10으로도 알려짐, 예를 들어, Forero-Torres et al., Br J Haematol(2009) 146:171-9에 기술됨), MDX-060(예를 들어, Ansell et al., J Clin Oncol(2007) 25:2764-9에 기술됨; 5F11, 이라투무맙으로도 알려짐), 및 MDX-1401(예를 들어, Cardarelli et al., Clin Cancer Res.(2009) 15(10):3376-83에서 기술됨) 및 WO 2020/068764 A1, WO 2003/059282 A2, WO 2006/089232 A2, WO 2007/084672 A2, WO 2007/044616 A2, WO 2005/001038 A2, US 2007/166309 A1, US 2007/258987 A1, WO 2004/010957 A2 및 US 2005/009769 A1에 기술된 항-CD30 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 CD30-결합 영역은 항-CD30 항체의 CDR를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 CD30-결합 영역은 항-CD30 항체의 VH 및 VL 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 CD30-결합 영역은 항-CD30 항체의 VH 및 VL 부위를 포함하는 scFv를 포함한다.
항체 CDR 및 FR를 정의하기 위한 여러 가지 상이한 협약이 존재하는 데, 예컨대, Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)에 기술된 것들과 Retter et al., Nucl. Acids Res.(2005) 33(suppl 1): D671-D674에 기술된 VBASE2가 존재한다. 본원에 기술된 항체의 VH 부위 및 VL 부위의 CDR 및 FR가 VBASE2에 따라 정의된다.
일부 양태에서, 본 발명의 상기 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
하기 CDR를 편입한 VH:
서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 이들의 변이체로, 이는 HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에 하나 또는 두 개 또는 세 개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 것이고; 및
하기 CDR를 편입한 VL:
서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 이들의 변이체로, LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에 하나 또는 두 개 또는 세 개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은
서열번호 14의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 VH; 및
서열번호 15의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 VL
을 포함한다.
일부 양태에서, CD30-결합 영역은 본원에 기술된 VH 서열 및 VL 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 절편(scFv)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어질 수 있다. 상기 VH 서열 및 VL 서열은 공유결합으로 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 VH 및 VL 서열은 유연한 링커 서열, 예를 들어, 본원에 기술된 유연한 링커 서열에 의해 연결된다. 상기 유연한 링커 서열은 VH 서열 및 VL 서열의 단부에 결합됨으로써, VH 및 VL 서열을 연결할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 VH 및 VL은 서열번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 링커 서열을 통해 결합된다.
일부 양태에서, 상기 CD30-결합 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 CD30-결합 영역은 CD30에, 예를 들어, CD30의 세포외 영역에 결합될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 CD30-결합 영역은 예를 들어, 서열번호 19에 나타낸, 서열번호 1에 따라 넘버링된 인간 CD30의 아미노산 위치 185 내지 335의 부위 내에서, 항체 HRS3에 의해 결합된 CD30의 에피토프에 결합될 수 있다 (Schlapschy et al., Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17(12): 847-860, 전체가 본원에 참조로 편입됨).
일부 양태에서, 상기 표적 항원은 CD19이다. 이에 따라, 본 발명의 일부 측면 및 양태에서, 상기 항원-결합 영역은 CD19-결합 영역이다.
CD19는 UniProt P15391-1, v6에 의해 식별되는 단백질이다. 본 명세서에서, 'CD19'는 임의의 종에서 유래된 CD19를 지칭하며, 임의의 종에서 유래된 CD19 이소형(예를 들어, P15391-2), 절편, 변이체(돌연변이체 포함) 또는 동족체를 포함한다.
상기 CD19-결합 영역은 항-CD19 항체의 항원-결합 모이어티에서 유래될 수 있다. 항-CD19 항체는 예를 들어, Zola et al., Immunology and Cell Biology (1991) 69:411-422에 기술된 FMC63을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 CD19-결합 영역은 항-CD19 항체의 CDR를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 CD19-결합 영역은 항-CD19 항체의 VH 및 VL 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 CD19-결합 영역은 항-CD19 항체의 VH 및 VL 부위를 포함하는 scFv를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 항원-결합 영역은 하기를 포함한다:
하기 CDR를 편입한 VH:
서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 이들의 변이체로, HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에 하나 또는 두 개 또는 세 개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 것이고; 및
하기 CDR를 편입한 VL:
서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 이들의 변이체로, LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에 하나 또는 두 개 또는 세 개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
일부 양태에서, 상기 항원-결합 영역은
서열번호 43의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 VH; 및
서열번호 44의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 VL
을 포함한다.
일부 양태에서, CD19-결합 영역은 본원에 기술된 VH 서열 및 VL 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 절편(scFv)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어질 수 있다. 상기 VH 서열 및 VL 서열은 공유결합으로 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 VH 및 VL 서열은 유연한 링커 서열, 예를 들어, 본원에 기술된 유연한 링커에 의해 연결된다. 상기 유연한 링커 서열은 VH 서열 및 VL 서열의 단부에 결합됨으로써, VH 및 VL 서열을 연결한다. 일부 양태에서, 상기 VH 및 VL은 서열번호 16 또는 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 링커 서열을 통해 결합된다.
일부 양태에서, 상기 CD19-결합 영역은 서열번호 46의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 CD19-결합 영역은 예를 들어, CD19의 세포외 영역에서 CD19에 결합될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 CD19-결합 영역은 항체 FMC63에 의해 결합된 CD19의 에피토프에 결합될 수 있다.
막관통 영역
본 발명의 CAR는 막관통 영역을 포함한다. 막관통 영역은 생물학적 막, 예를 들어, 세포 막에서 열역학적으로 안정적인 아미노산의 서열에 의해 형성된 임의의 3차원 구조물을 가리킨다. 본 개시와 연결하여, 상기 막관통 영역은 상기 CAR을 발현하는 세포의 세포 막에 걸친 아미노산 서열일 수 있다.
상기 막관통 영역은 소수성 알파 나선 또는 베타 배럴을 형성하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 CAR의 막관통 영역의 아미노산 서열은 막관통 영역을 포함하는 단백질의 막관통 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래된 것일 수 있다. 막관통 영역은 GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, Protein Information Resource, Protein Data Bank, Ensembl, 및 InterPro와 같은 데이터베이스에 기록되어 있고, 예를 들어, TMHMM(Krogh et al., 2001 J Mol Biol 305: 567-580)과 같은 아미노산 서열 분석을 사용하여 식별/예측될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 CAR의 막관통 영역의 아미노산 서열은 세포 표면에서 발현되는 단백질의 막관통 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래된 것일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 세포 표면에서 발현된 단백질은 수용체 또는 리간드, 예를 들어, 면역 수용체 또는 리간드이다. 일부 양태에서, 상기 막관통 영역의 아미노산 서열은 ICOS, ICOSL, CD86, CTLA-4, CD28, CD80, MHC 클래스 I α, MHC 클래스 II α, MHC 클래스 IIβ, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3-ζ, TCRα TCRβ, CD4, CD8α, CD8β, CD40, CD40L, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 4-1BBL, OX40, OX40L, GITR, GITRL, TIM-3, 갈렉틴 9, LAG3, CD27, CD70, LIGHT, HVEM, TIM-4, TIM-1, ICAM1, LFA-1, LFA-3, CD2, BTLA, CD160, LILRB4, LILRB2, VTCN1, CD2, CD48, 2B4, SLAM, CD30, CD30L, DR3, TL1A, CD226, CD155, CD112 및 CD276 중 하나의 막관통 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 막관통은 CD28, CD3-ζ, CD8α, CD8β 또는 CD4의 막관통 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래된다. 일부 양태에서, 상기 막관통은 CD28의 막관통 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래된다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 서열번호 20 또는 48의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 막관통 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
신호전달 영역
본 발명의 키메라 항원 수용체는 신호전달 영역을 포함한다. 상기 신호전달 영역 CAR을 발현하는 세포에서 세포내 신호전달을 개시하기 위한 서열을 제공한다.
ITAM-함유 서열
상기 신호전달 영역은 ITAM-함유 서열을 포함한다. ITAM-함유 서열은 하나 이상의 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. ITAM은 아미노산 서열 YXXL/I(서열번호 23)을 포함하며, 여기서 'X'는 임의의 아미노산을 가리킨다. ITAM-함유 단백질에서, 서열번호 23에 따른 서열은 6 내지 8개 아미노산; YXXL/I(X)6-8YXXL/I(서열번호 24)에 의해 종종 분리된다. 인산염 작용기가 타이로신 키나아제에 의해 ITAM의 타이로신 잔기에 첨가된 경우, 신호전달 캐스케이드가 상기 세포 내에서 개시된다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 23 또는 서열번호 24에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 23에 따른 아미노산 서열의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 카피를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 24에 따른 아미노산 서열의 적어도 1, 2, 또는 3개 카피를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 ITAM-함유 아미노산 서열을 갖는 단백질의 ITAM-함유 서열 의 아미노산 서열이거나 이것에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 CD3-ζ, FcγRI, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD79α, CD79β, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIV 또는 DAP12 중 하나의 세포내 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 영역이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 25의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
보조자극성 서열
상기 신호전달 영역은 추가로 하나 이상의 보조자극성 서열을 포함할 수 있다. 보조자극성 서열은 본 발명의 CAR을 발현하는 세포의 보조자극을 허용하는 아미노산 서열이다. 보조자극은 표적 항원에 결합 시 CAR-발현 세포의 증식 및 생존을 촉진하고, 또한 CAR-발현 세포에 의한 사이토킨 생산, 분화, 세포독성 기능 및 메모리 형성을 촉진할 수도 있다. T 세포 보조자극의 분자 기전작용이 Chen and Flies, (2013) Nat Rev Immunol 13(4):227-242에서 검토되었다.
보조자극성 서열은 보조자극성 단백질의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 보조자극성 서열은 보조자극성 단백질의 세포내 영역의 아미노산 서열이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열이다.
CAR의 표적 항원 결합 시, 상기 보조자극성 서열은 상기 보조자극성 서열이 이의 유사한(cognate) 리간드에 의한 결찰 시 유래되는 보조자극성 단백질에 의해 제공될 종류의 CAR을 발현하는 세포에 보조자극을 제공한다. 예로서, CD28에서 유래된 보조자극성 서열을 포함하는 신호전달 영역을 포함하는 CAR의 경우, 표적 항원에 결합은 CD80 및/또는 CD86의 CD28 결합에 의해 촉발될 종류의 CAR 발현 세포에서의 신호전달을 촉발한다. 따라서, 보조자극성 서열은 상기 보조자극성 서열이 유래된 보조자극성 단백질의 보조자극 신호를 전달할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 보조자극성 단백질은 B7-CD28 슈퍼패밀리(예를 들어, CD28, ICOS)의 일원, 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리(예를 들어, 4-1BB, OX40, CD27, DR3, GITR, CD30, HVEM)의 일원일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 보조자극성 서열은 CD28, 4-1BB, ICOS, CD27, OX40, HVEM, CD2, SLAM, TIM-1, CD30, GITR, DR3, CD226 및 LIGHT 중 하나의 세포내 영역이거나 또는 이것에서 유래된다. 일부 양태에서, 상기 보조자극성 서열은 CD28의 세포내 영역이거나 또는 이것에서 유래된다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 하나 이상의 비-중첩 보조자극성 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 보조자극성 서열을 포함한다. 복수의 보조자극성 서열이 나란히 제공될 수 있다.
주어진 아미노산 서열이 주어진 보조자극성 단백질에 의해 매개된 신호전달을 개시할 수 있는지 여부가, 예를 들어, 상기 보조자극성 단백질에 의해 매개되는 신호전달의 상관관계를 분석함으로써(예를 들어, 상기 보조자극성 단백질에 의해 매개된 신호전달의 결과로서, 발현/활성이 상향조절되거나 또는 하향조절되는 인자의 발현/활성), 조사될 수 있다.
보조자극성 단백질는 여러 형질 도입 경로를 통해 세포 성장, 효과기 기능 및 생존을 촉진하는 유전자의 발현을 상향조절한다. 예를 들면, CD28 및 ICOS는 포스파티딜리노시톨 3 키나아제(PI3K) 및 AKT를 통해 신호를 전달하여 NF-κB, mTOR, NFAT 및 AP1/2를 통해 세포 성장, 효과기 기능 및 생존을 촉진하는 유전자의 발현을 상향조절한다. CD28 역시 CDC42/RAC1를 통해 AP1/2를, RAS를 통해 ERK1/2를 활성화하고, ICOS는 C-MAF를 활성화한다. 4-1BB, OX40, 및 CD27은 TNF 수용체 연관 인자(TRAF)를 모집하고, PI3K 뿐만 아니라 MAPK 경로를 통해 신호를 전달한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 CD28이거나 또는 이것에서 유래된 보조자극성 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 26의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 보조자극성 서열을 포함한다.
Kofler et al. Mol. Ther.(2011) 19: 760-767은 CAR 결찰 시 IL-2 생산의 도입을 감소시키기 위해, CAR-T 세포 활성의 조절적 T 세포-매개 억제를 최소화하기 위해, lck 키나아제 결합 자리가 돌연변이된 변이체 CD28 세포내 영역을 기술한다. 상기 변이체 CD28 세포내 영역의 아미노산 서열이 서열번호 27에 나타나 있다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 27의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 보조자극성 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 28의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 4-1BB이거나 또는 이것에서 유래된 보조자극성 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 49의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 보조자극성 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 50의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
경첩 부위
상기 CAR는 추가로 경첩 부위를 포함할 수 있다. 상기 경첩 부위는 상기 항원-결합 영역과 상기 막관통 영역 사이에 제공될 수 있다. 상기 경첩 부위는 또한 스페이서 부위로 불릴 수도 있다. 경첩 부위는 CAR의 항원-결합 및 막관통 영역의 유연한 연결을 허용하는 아미노산 서열이다.
경첩 부위의 존재, 부재 및 길이가 CAR 기능에 영향을 미침이 나타난 바 있다 (예를 들어, Dotti et al., Immunol Rev(2014) 257(1) 외에서 검토됨).
일부 양태에서, 상기 CAR는 인간 IgG1의 CH1-CH2 경첩 부위이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 경첩 부위, 예를 들어, WO 2012/031744 A1에 기술된 CD8α에서 유래된 경첩 부위, 또는 예를 들어, WO 2011/041093 A1에 기술된 CD28에서 유래된 경첩 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CAR는 인간 IgG1의 CH1-CH2 경첩 부위에서 유래된 경첩 부위를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 29 또는 30의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 인간 IgG4의 CH1-CH2 경첩 부위에서 유래된 경첩 부위를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 47의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 인간 IgG1의 CH2-CH3 부위(즉, Fc 부위)이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 경첩 부위를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 31의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
Hombach et al., Gene Therapy(2010) 17:1206-1213은 FcγR-발현 세포, 예컨대 단핵 백혈구 및 NK 세포의 활성화 감소를 위한 변이체 CH2-CH3 부위를 기술한다. 변이체 CH2-CH3 부위의 아미노산 서열이 서열번호 32에 나타나 있다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 32의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 인간 IgG1의 CH1-CH2 경첩 부위이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열 및 인간 IgG1의 CH2-CH3 부위(즉, Fc 부위)이거나 또는 이것에서 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 경첩 부위는 서열번호 33의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
추가적인 서열
신호 펩타이드
상기 CAR가 추가로 신호 펩타이드(선두(leader) 서열 또는 신호 서열로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 단일 알파 나선을 형성하는 5 내지 30개의 소수성 아미노산으로 이루어진 서열로 보통 이루어진다. 분비된 단백질 및 세포 표면에서 발현된 단백질은 종종 신호 펩타이드를 포함한다. 신호 펩타이드는 여러 단백질로 인해 알려져 있고, GenBank, UniProt 및 Ensembl과 같은 데이터베이스에 기록되어 있으며, 및/또는 예를 들어, 신호P(Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786) 또는 신호-아세포(Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)와 같은 아미노산 서열 분석 도구를 사용하여, 식별/예측될 수 있다.
상기 신호 펩타이드는 CAR의 N-말단에 존재할 수도 있고 새로 합성된 CAR 내에 존재할 수도 있다. 상기 신호 펩타이드는 세포 표면으로의 CAR의 효율적인 운송을 가능하게 한다. 신호 펩타이드는 쪼개짐에 의해 제거되고, 그렇기 때문에 상기 세포 표면에 의해 발현된 성숙한 CAR에 포함되지 않는다.
일부 양태에서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 34의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 51의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
링커 서열 및 추가적인 기능적 서열
일부 양태에서, 상기 CAR는 상이한 영역들(즉, 상기 항원-결합 영역, 경첩 부위, 막관통 영역, 신호전달 영역) 사이의 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CAR는 상기 영역들의 하위 서열들 사이(예를 들어, 항원-결합 영역의 VH 및 VL 사이)에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다.
링커 서열은 당해기술의 숙련가에게 알려져 있고, 예를 들면 Chen et al., Adv Drug Deliv Rev(2013) 65(10): 1357-1369에 기술되어 있으며, 이는 전체가 참조로 본원에 편입되었다. 일부 양태에서, 링커 서열는 유연한 링커 서열일 수 있다. 유연한 링커 서열은 상기 링커 서열에 의해 연결된 아미노산 서열들의 상대적 움직임을 가능하게 한다. 유연한 링커가 당해기술의 숙련가에게 알려져 있고, 그 중 여러 개가 Chen et al., Adv Drug Deliv Rev(2013) 65(10): 1357-1369에서 식별되었다. 유연한 링커 서열은 높은 비율의 글리신 및/또는 세린 잔기를 종종 포함한다. 일부 양태에서, 상기 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및/또는 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 링커 서열은 길이가 1 내지 2개, 1 내지 3개, 1 내지 4개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 20개, 1 내지 30개, 1 내지 40개 또는 1 내지 50개 아미노산이다.
일부 양태에서, 링커 서열은 서열번호 16 또는 45에 나타난 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 일부 양태에서, 링커 서열은 서열번호 16 또는 45에 나타난 아미노산 서열의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 나란한 카피를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
상기 CAR는 추가로 아미노산 또는 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항원-결합 분자 및 폴리펩타이드는 발현, 접힘, 운송, 처리, 정제 또는 검출을 용이하게 하는 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 CAR는 선택적으로 N- 또는 C- 말단에서 His(예를 들어, 6XHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 바이오틴 태크를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 CAR는 검출가능 모이어티, 예를 들어, 형광, 발광, 면역-검출가능, 방사성, 화학, 핵산 또는 효소 표지를 포함한다.
특정 예시적 CAR
본 발명의 일부 양태에서, 상기 CAR는
서열번호 18의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 항원-결합 영역;
서열번호 33의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 경첩 부위;
서열번호 20의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 막관통 영역; 및
서열번호 28의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 신호전달 영역
을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
본 발명의 일부 양태에서, 상기 CAR는 서열번호 35 또는 36의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 CAR는 Hombach et al. Caner Res.(1998) 58(6):1116-9, Hombach et al. Gene Therapy(2000) 7:1067-1075, Hombach et al. J Immunother.(1999) 22(6):473-80, Hombach et al. Caner Res.(2001) 61:1976-1982, Hombach et al. J Immunol(2001) 167:6123-6131, Savoldo et al. Blood(2007) 110(7):2620-30, Koehler et al. Cancer Res.(2007) 67(5):2265-2273, Di Stasi et al. Blood(2009) 113(25):6392-402, Hombach et al. Gene Therapy(2010) 17:1206-1213, Chmielewski et al. Gene Therapy(2011) 18:62-72, Kofler et al. Mol. Ther.(2011) 19(4):760-767, Gilham, Abken and Pule. Trends in Mol. Med.(2012) 18(7):377-384, Chmielewski et al. Gene Therapy(2013) 20:177-186, Hombach et al. Mol. Ther.(2016) 24(8):1423-1434, Ramos et al. J. Clin. Invest.(2017) 127(9):3462-3471, WO 2015/028444 A1 또는 WO 2016/008973 A1에 기술된 CD30-특이적 CAR의 양태로부터 선택되며, 이들 문헌은 모두 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 상기 CAR는
서열번호 46의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진항원-결합 영역;
서열번호 47의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 경첩 부위;
서열번호 48의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 막관통 영역; 및
서열번호 50의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 신호전달 영역
을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
본 발명의 일부 양태에서, 상기 CAR는 서열번호 52 또는 53의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
CAR-발현, 바이러스-특이적 면역 세포
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포에 관한 것이다.
CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포는 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함할 수 있다. CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 또는 발현할 수 있다. CAR-발현 세포는 이것이 발현하는 CAR을 포함함이 이해될 것이다. 또한 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하는 세포 역시 상기 핵산에 의해 인코딩되는 CAR을 발현하고 포함함이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 CAR/CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포는 상기 세포의 기능적 특성들에 대한 참조에 의해 특징지어질 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 CAR/CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포는
(a) 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스에 감염된 세포에 반응하여, 및/또는 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스의 항원의 펩타이드를 제공하는 세포에 반응하여, 하나 이상의 세포독성/효과기 인자(예를 들어, IFNγ, 그란자임, 퍼포린, 그라눌리신, CD107a, TNFα, FASL)의 발현, 증식/집단 팽창, 및/또는 CAR에 특이적인 표적 항원을 발현하는 세포에 반응한 성장 인자(예를 들어, IL-2) 발현;
(b) CAR에 특이적인 표적 항원을 발현하는 세포, 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스에 감염된 세포, 및/또는 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스의 항원의 펩타이드를 제공하는 세포에 대한 세포독성;
(c) CAR에 특이적인 표적 항원을 발현하지 않는 세포, 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스에 감염되지 않은 세포, 및/또는 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스의 항원의 펩타이드를 제공하지 않는 세포에 대해, 세포독성 없음(즉, 기준선 위);
(d) CAR에 특이적인 표적 항원을 발현하는 세포를 포함하는 암, 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스에 감염된 세포를 포함하는 암, 및/또는 상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스의 항원의 펩타이드를 제공하는 세포를 포함하는 암에 대한 항암 활성(예를 들어, 암 세포에 대한 세포독성, 종양 성장 억제, 전이 감소 등); 및
(e) 동종반응성 면역 세포, 예를 들어, CAR에 특이적인 표적 항원을 발현하는 동종반응성 면역 세포에 대한 세포독성
과 같은 특성 중 하나 이상을 보여준다.
세포 증식/집단 팽창은 세포 분열 또는 일정 기간에 걸친 세포의 수를 분석함으로써 조사될 수 있다. 세포 분열은 예를 들어, Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol(1999) 77(6): 559-564에 기술된 바와 같이, 예를 들면, 3H-타이미딘의 편입의 시험관내 분석에 의해, 또는 CFSE 희석 분석에 의해, 분석될 수 있고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 증식 중인 세포는 또한 예를 들어, Buck et al., Biotechniques. 2008 Jun; 44(7):927-9, and Sali and Mitchison, PNAS USA 2008 Feb 19; 105(7): 2415-2420에 기술된 바와 같이, 적절한 검정에 의해 5-에티닐-2'데옥시우리딘 (EdU)의 편입의 분석에 의해 식별될 수 있고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
본원에 사용된 '발현'은 유전자 또는 단백질 발현일 수 있다. 유전자 발현은 DNA에서 RNA로의 전사를 아우르고, 당해 기술의 숙련가에게 알려진 다양한 수단에 의해, 예를 들면 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)에 의한 mRNA의 수준을 측정함으로써, 또는 리포터-기반 방법에 의해, 측정될 수 있다. 이와 유사하게, 단백질 발현은 당해 기술에 알려진 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면 웨스턴블롯, 면역조직화학법, 면역화학법, 유세포 분석, ELISA, ELISPOT, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다.
세포독성 및 세포 살해는 예를 들면, Zaritskaya et al., Expert Rev Vaccines(2011), 9(6):601-616에서 검토된 임의의 방법들을 사용하여 조사될 수 있고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 세포독성/세포 살해 검정의 시험관내 검정의 예에는 51Cr 방출 검정, 락테이트 디하이드로게나아제(LDH) 방출 검정, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 방출 검정 및 칼세인-아세톡시메틸(칼세인-AM) 방출 검정과 같은 방출 검정이 포함된다. 이들 검정은 용해된 세포에서 방출된 인자들의 검출을 기반으로, 세포 살해를 측정한다. 소정의 세포 유형에 의한 세포 살해는 예를 들어, 상기 소정의 세포 유형으로 시험대상 세포를 공동배양하고 적정 기간 후 생존능 세포/사멸 시험대상 세포의 수/비율을 측정함으로써 분석될 수 있다.
세포는 암의 적절한 시험관내 검정 또는 체내 모형에서 분석에 의해 항암 활성에 대해 평가될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 CD30-특이적 CAR-발현, EBV-특이적 면역 세포는
(a) EBV에 감염된 세포에 반응하여, 및/또는 EBV 항원의 펩타이드를 제공하는 세포에 반응하여, CD30을 발현하는 세포에 반응하는 하나 이상의 세포독성/효과기 인자(예를 들어, IFNγ, 그란자임, 퍼포린, 그라눌리신, CD107a, TNFα, FASL)의 발현;
(b) CD30을 발현하는 세포, EBV에 감염된 세포, 및/또는 EBV 항원의 펩타이드를 제공하는 세포에 대한 세포독성;
(c) CD30을 발현하지 않는 세포, EBV에 감염되지 않은 세포, 및/또는 EBV 항원의 펩타이드를 제공하지 않는 세포에 대한 세포독성 없음(즉, 기준선 위);
(d) CD30을 발현하는 세포를 포함하는 암, EBV에 감염된 세포를 포함하는 암, 및/또는 EBV 항원의 펩타이드를 제공하는 세포를 포함하는 암에 대한 항암 활성(예를 들어, 암 세포에 대한 세포 독성, 종양 성장 억제, 전이 감소 등); 및
(e) 동종반응성 면역 세포, 예를 들어, CD30을 발현하는 동종반응성 면역 세포에 대한 세포독성
과 같은 특성들 중 하나 이상을 나타낸다.
본 발명의 다양한 측면에 따른 일부 양태에서, 바이러스-특이적 면역 세포는 하나 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4개 등) CAR을 포함하거나 발현할 수 있다.
일부 양태에서, 바이러스-특이적 면역 세포는 둘 이상의 비-동일성 CAR을 포함하거나 발현할 수 있다. 하나 이상의 비-동일성 CAR을 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포는 비-동일성 표적 항원에 특이적인 CAR을 포함하거나 발현할 수 있다. 예를 들면, 본원의 실시예 4가 CD30-특이적 CAR 및 CD19-특이적 CAR을 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포를 기술한다. 상기 비-동일성 표적 항원들 각각은 독립적으로 본원에 기술된 표적 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 각각의 비-동일성 표적 항원은 독립적으로 본원에 기술된 암 세포 항원이다.
일부 양태에서, 상기 비-동일성 표적 항원들 중 하나는 CD30이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 비-동일성 CAR을 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30-특이적 CAR, 및 CD30 이외의 표적 항원에 특이적인 CAR을 포함한다.
CAR-발현, 바이러스-특이적 면역 세포의 생산
시험관내/생체외에서 바이러스-특이적 면역 세포의 집단의 생성/팽창 방법이 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 전형적인 배양 조건(즉, 세포 배지, 첨가제, 온도, 기체상 대기), 세포 수, 배양 기간 등이 예를 들어, Ngo et al., J Immunother.(2014) 37(4):193-203을 참조로 결정될 수 있고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
간편하게, 본 발명에 따른 세포의 배양은 5% CO2를 함유한 가습 대기에서 37℃로 유지될 수 있다. 세포 배양액에서의 세포는, 당해기술의 숙련가에 의해 손쉽게 결정될 수 있듯이, 임의의 적합한 밀도로 성립 및/또는 유지될 수 있다. 예를 들면, 배양액은 상기 배양액의 최초 밀도가 ~0.5×106 내지 ~5×106 세포/ml(예를 들어, ~1×106 세포/ml)로 성립될 수 있다.
배양은 상기 배양액의 부피에 적합한 임의의 용기, 예를 들어, 세포 배양플레이트의 웰, 세포 배양 플라스크, 생물 반응 장치 등에서 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 생물 반응 장치, 예를 들어, Somerville and Dudley, Oncoimmunology(2012) 1(8):1435-1437에 기술된 생물 반응 장치에서 배양되고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 일부 양태에서, 세포는 GRex 세포 배양 용기, 예를 들어, GRex 플라스크 또는 GRex 100 생물 반응 장치에서 배양된다.
상기 방법은 일반적으로 활성화 및 팽창을 유발하기 위해, 적절한 보조자극 및 신호 증폭을 제공하는 조건 하에서, 바이러스 항원 펩타이드:MHC 복합체를 제공하는 항원-제공 세포(APC)의 존재하에 항원-특이적 수용체를 갖는 세포를 포함하는 면역 세포(예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 이질계 집단)의 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 상기 APC는 인코딩 바이러스에 감염될 수도 있고, 또는 바이러스 항원/펩타이드(들)을 포함하거나 발현할 수 있고, MHC 분자의 맥락에서 바이러스 항원 펩타이드를 제공할 수도 있다. 자극은 T 세포 활성화을 유발하고, 세포 분열(증식)을 촉진함으로써, 상기 바이러스 항원에 특이적인 T 세포 집단의 생성 및/또는 팽창을 초래한다. T 세포 활성화의 과정은 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있고, Immunobiology, 5th Edn. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al. New York: Garland Science(2001), Chapter 8에 상세히 기술되었으며, 상기 문헌은 전체가 참조로 편입되어 있다.
자극 후 획득된 세포들 집단은, 자극 전 집단과 비교하여, 상기 바이러스에 특이적인 T 세포가 더욱 풍부하다 (즉, 상기 바이러스-특이적 T 세포가 자극 후 집단에서 증가된 빈도로 존재함). 이런 방식으로, 상기 바이러스에 특이적인 T 세포의 집단이 상이한 특이성들을 갖는 T 세포의 이질적 집단에서 팽창/생성된다. 바이러스에 특이적인 T 세포의 집단이 자극 및 결과적인 세포 분열에 의해 단일 T 세포에서 생산될 수 있다. 기존의 바이러스에 특이적인 T 세포 집단은 바이러스-특이적 T 세포의 집단의 세포들의 자극 및 결과적인 세포 분열에 의해 팽창될 수 있다.
본 발명의 측면 및 양태는 특히 EBV-특이적 면역 세포에 관한 것이다. 이에 따라, 일부 양태에서, 상기 바이러스는 EBV일 수 있고, 상기 바이러스 항원(들)은 EBV 항원(들)일 수 있다. EBV-특이적 면역 세포의 집단을 생성/팽창하는 방법이 예를 들어, WO 2013/088114 A1, Lapteva and Vera, Stem Cells Int.(2011): 434392, Straathof et al., Blood(2005) 105(5): 1898-1904, WO 2017/202478 A1, WO 2018/052947 A1 및 WO 2020/214479 A1에 기술되어 있고, 이들 문헌 모두는 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
상기 방법은 EBV 항원 펩타이드:MHC 복합체에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 세포가 상기 TCR에 특이적인 EBV 항원 펩타이드:MHC 복합체를 제공하는 APC에 의해 자극받는 단계를 수반한다. 상기 APC는 인코딩 바이러스에 감염되거나 또는 EBV 항원/펩타이드(들)을 포함하거나 발현하고, MHC 분자의 맥락에서 EBV 항원 펩타이드를 제공한다. 자극은 T 세포 활성화를 유발시키고 세포 분열(증식)을 촉진함으로써, EBV 항원에 특이적인 T 세포 집단의 생성 및/또는 팽창을 초래한다.
상기 방법은 전형적으로 면역 세포 집단을 EBV 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들) 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC와 접촉시킴으로써 바이러스/바이러스 항원에 특이적인 면역 세포를 자극하는 단계를 포함한다. 이와 같은 단계는 본원에서 '자극' 또는 '자극 단계'로 불릴 수 있다. 이와 같은 단계는 전형적으로 시험관내 /생체외 배양물에서 상기 세포의 유지를 수반하고, 이는 '자극 배양'이라고 불릴 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 자극 단계를 포함한다. 다시 말해, 일부 양태에서, 상기 방법은 자극 단계에 의해 획득된 세포를 재자극하는 하나 이상의 추가적인 단계를 포함한다. 이와 같은 추가적인 자극 단계는 본원에서 '재자극' 또는 '재자극 단계'라 불릴 수 있다. 이와 같은 단계는 전형적으로 시험관내/생체외, 배양물 중 세포의 유지를 수반하고, 이는 '재자극 배양물'로 불릴 수 있다.
PBMC(자극을 위해) 또는 본원에 기술된 자극 단계에 의해 획득된 세포 집단(재자극을 위해)을 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)과 '접촉'시키는 단계가 일반적으로 상기 펩타이드(들)을 포함하는 세포 배지 중에 시험관내/생체외 PBMC/세포 집단을 배양하는 단계를 수반함이 이해될 것이다. 이와 유사하게, PBMC/세포 집단을 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC와 '접촉'시키는 단계가 일반적으로 세포 배지 중 APC 및 시험관내/생체외 PBMC/세포 집단을 공동배양하는 단계를 수반한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 PBMC를 바이러스 항원(들)(예를 들어, EBV 항원(들))에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 양태에서, PBMC의 집단(예를 들어, 수상돌기 세포, 대식세포 및 B 세포) 내 APC는, PBMC 집단 내 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 추후 활성화를 위해, MHC 클래스 I 분자(교차 제공) 및/또는 MHC 클래스 II 분자 상에 상기 항원을 내면화(예를 들어, 식균 작용, 음세포작용), 처리 및 제공한다,
기준 항원에 '상응하는' 펩타이드는 상기 기준 항원의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 예를 들면, EBV의 EBNA1에 '상응하는' 펩타이드는 EBNA1의 아미노산 서열 내에서 발견되는 아미노산의 서열(즉, EBNA1의 아미노산 서열의 하위서열)을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 본원에서 활용된 펩타이드는 전형적으로 길이가 5 내지 30개 아미노산, 예를 들어, 5 내지 25개 아미노산, 10 내지 20개 아미노산, 또는 12 내지 18개 아미노산 중 하나이다. 일부 양태에서, 펩타이드는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 중 하나이다. 일부 양태에서, 펩타이드는 길이가 약 15개 아미노산이다. 본원에 사용된 '펩타이드'는 비-동일성 펩타이드들을 포함하는 집단을 가리킬 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 항원에 상응하는 펩타이드를 활용한다. 이와 같은 양태에서, 상기 항원들 각각에 상응하는 적어도 하나의 펩타이드가 존재한다. 예를 들면, 상기 방법이 EBNA1 및 LMP1에 상응하는 펩타이드를 활용하는 경우, 상기 펩타이드는 EBNA1에 상응하는 적어도 하나의 펩타이드와 LMP1에 상응하는 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 기준 항원의 전체 또는 일부에 상응하는 펩타이드를 활용한다. 소정의 항원들 전체에 상응하는 펩타이드들은 상기 항원의 아미노산 서열의 전장을 차지한다. 이는 상기 펩타이드들이 상기 소정의 항원의 아미노산 서열 중 전체 아미노산을 함유함을 말하는 것이다. 소정의 항원의 일부에 상응하는 펩타이드들은 상기 항원의 아미노산 서열의 일부를 차지한다. 일부 양태에서, 펩타이드들이 상기 항원의 아미노산 서열의 일부를 차지하는 경우, 이들 펩타이드들은 함께 상기 항원의 아미노산 서열의 예를 들어, 10% 초과, 예를 들어, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 하나를 초과하여 차지할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 중첩하는 펩타이드들을 활용한다. '중첩하는' 펩타이드들은 공통된 아미노산 및 좀 더 전형적으로는 아미노산 서열을 갖는다. 예로서, 제1 펩타이드는 EBNA1의 아미노산 서열의 위치 1 내지 15에 상응하는 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 펩타이드는 EBNA1의 아미노산 서열의 위치 5 내지 20에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 제1 및 제2 펩타이드는 EBNA1에 상응하고, 11개 아미노산이 중첩하는, 중첩하는 펩타이드이다. 일부 양태에서, 중첩하는 펩타이드는 1 내지 20, 5 내지 20, 8 내지 15 또는 10 내지 12개 아미노산 중 하나만큼 중첩된다. 일부 양태에서, 중첩하는 펩타이드들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 중 하나만큼 중첩된다. 일부 양태에서, 중첩하는 펩타이드들은 11개 아미노산만큼 중첩된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 길이가 5 내지 30개 아미노산이고, 1 내지 20개 아미노산만큼 중첩되고, 소정의 기준 항원의 전부 또는 일부에 상응하는 펩타이드들을 활용한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 길이가 15개 아미노산이고, 11개 아미노산만큼 중첩되고, 소정의 기준 항원의 전부에 상응하는 펩타이드들을 활용한다. 이와 같은 펩타이드들의 혼합물이 본원에서 소정의 항원에 대한 '펩혼합물 펩타이드 풀' 또는 '펩혼합물'로 불릴 수 있다. 예를 들면, 본원의 실시예 1에서 사용된 'EBNA1 펩혼합물'은 UniProt: P03211-1, v1에 나타난 대로 EBNA1에 대한 아미노산 서열의 전장에 걸친, 11개 아미노 산에 의한 158, 15mer 펩타이드들 중첩의 풀을 가리킨다.
본 발명의 다양한 측면에 따른 일부 양태에서, 소정의 바이러스 항원에 '상응하는 펩타이드들'은 상기 항원에 대한 펩혼합물일 수 있다.
특정 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 EBV 항원에 상응하는 펩타이드들을 활용한다.
특정 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 EBV 항원에 대한 펩혼합물을 활용한다. 일부 양태에서, 상기 하나 이상의 EBV 항원은, EBV 잠재기 항원, 예를 들어, 유형 III 잠재기 항원(예를 들어, EBNA1, EBNA-LP, LMP1, LMP2A, LMP2B, BARF1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B 또는 EBNA3C), 유형 II 잠재기 항원(예를 들어, EBNA1, EBNA-LP, LMP1, LMP2A, LMP2B 또는 BARF1), 또는 유형 I 잠재기 항원(예를 들어, EBNA1 또는 BARF1), EBV 용해성 항원, 예를 들어, 즉각적인 초기 용해성 항원(예를 들어, BZLF1, BRLF1 또는 BMRF1), 초기 용해성 항원(예를 들어, BMLF1, BMRF1, BXLF1, BALF1, BALF2, BARF1, BGLF5, BHRF1, BNLF2A, BNLF2B, BHLF1, BLLF2, BKRF4, BMRF2, FU 또는 EBNA1-FUK) 및 말기 용해성 항원(예를 들어, BALF4, BILF1, BILF2, BNFR1, BVRF2, BALF3, BALF5, BDLF3 또는 gp350)으로부터 선택된다.
본 발명의 다양한 측면에 따른 일부 양태에서, 상기 하나 이상의 EBV 항원은 BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BXLF1, BALF1, BALF2, BGLF5, BHRF1, BNLF2A, BNLF2B, BHLF1, BLLF2, BKRF4, BMRF2, BALF4, BILF1, BILF2, BNFR1, BVRF2, BALF3, BALF5 및 BDLF3으로부터 선택된 EBV 용해성 항원들이거나 또는 이들을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 하나 이상의 EBV 항원은 BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BALF2, BNLF2A, BNLF2B, BMRF2 및 BDLF3으로부터 선택된 EBV 용해성 항원이거나 또는 이들을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 하나 이상의 EBV 항원들은 EBNA1, EBNA-LP, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, BARF1, LMP1, LMP2A 및 LMP2B로부터 선택된 EBV 잠재기 항원이거나 또는 이들을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 하나 이상의 EBV 항원은 EBNA1, LMP1, LMP2A 및 LMP2B로부터 선택된 EBV 잠재기 항원이거나 또는 이들을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 하나 이상의 EBV 항원은 EBNA1, LMP1, LMP2, BARF1, BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2A 및 BNLF2B로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 EBNA1, LMP1, LMP2, BARF1, BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2A 및 BNLF2B에 상응하는 펩타이드를 활용한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 EBNA1, LMP1, LMP2, BARF1, BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2A 및 BNLF2B에 대한 펩혼합물을 활용한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 PBMC(예를 들어, CD45RA-양성 세포가 고갈된 PBMC)를 EBNA1, LMP1, LMP2, BARF1, BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2A 및 BNLF2B에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 PBMC(예를 들어, CD45RA-양성 세포가 고갈된 PBMC)를 EBNA1, LMP1, LMP2, BARF1, BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2A 및 BNLF2B에 대한 펩혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 자극 단계에 의해 획득된 세포 집단을 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 양태에서, 세포 집단 내 APC(예를 들어, 수상돌기 세포, 대식세포 및 B 세포)가, 세포 집단 내에서 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 추후 재자극을 위해, MHC 클래스 I 분자(교차 제공) 및/또는 MHC 클래스 II 분자 상에 상기 항원을 내재화(예를 들어, 식균 작용, 음세포작용에 의해), 처리 및 제공한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 PBMC를 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 자극 단계에 의해 획득된 세포의 집단을 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 PBMC를 EBV-LCL과 접촉시키는 단계를 포함한다. PBMC를 EBV-LCL로 자극함으로써 EBV-특이적 면역 세포를 생산하는 것이 예를 들어, Straathof et al., Blood(2005) 105(5): 1898-1904에 기술되며, 상기 문헌은 앞서 참조로 편입되어 있다.
EBV-LCL는, 예를 들어, Hui-Yuen et al., J Vis Exp (2011) 57: 3321, and Hussain and Mulherkar, Int J Mol Cell Med (2012) 1(2): 75-87(두 문헌 모두 전체가 본원에 참조로 편입됨)에 기술된 바와 같이, PBMC를 EBV로 감염시키고, 이어서 장기간의 배양 후, 불멸화된 EBV 감염 세포를 수집함으로써 제조될 수 있다. EBV-특이적 T 세포는 건강한 공여자의 혈액샘플에서 단리된 PBMC와 자가유래, 감마-방사능 처리된 EBV-LCL의 공동 배양에 의해 제조될 수 있다.
자극 및 재자극에서 T 세포 및 APC의 공동배양은 세포 배지에서 수행된다. 상기 세포 배지는 본 발명에 따른 T 세포 및 APC가 시험관내/생체외 배양물에 유지될 수 있는 임의의 세포 배지이다. 림프구의 배양물에 사용하기에 적합한 배지가 당해기술의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 여기에는 예를 들면, RPMI-1640 배지, AIM-V 배지, Iscoves 배지 등이 포함된다.
일부 양태에서, 세포 배지는 RPMI-1640 배지(예를 들어, 어드밴스드 RPMI-1640 배지) 및/또는 클릭스 배지(이글스 햄스 아미노산(EHAA) 배지로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 이들 배지의 조성물은 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다. RPMI-1640 배지의 제형이 예를 들어, Moore et al., JAMA(1967) 199:519-524에 기술되었고, 클릭스 배지의 제형이 Click et al., Cell Immunol(1972) 3:264-276에 기술되었다. RPMI-1640 배지는 예를 들어, ThermoFisher Scientific에서 구입 가능하고, 클릭스 배지는 예를 들어, Sigma-Aldrich(카탈로그 번호 C5572)에서 구입가능하다. 어드밴스드 RPMI-1640 배지는 예를 들어, ThermoFisher Scientific(카탈로그 번호 12633012)에서 구입 가능하다.
일부 양태에서, 상기 방법은 RPMI-1640 배지 및 클릭스 배지를 포함하는 세포 배지에서, 바이러스 항원(들)(예를 들어, EBV 항원(들))에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉한 바 있거나, 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC의 존재하에 PBMC를 배양하는 단계를 수반한다. 일부 양태에서, 상기 방법은, RPMI-1640 배지 및 클릭스 배지를 포함하는 세포 배지에서, 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉된 바 있거나, 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC의 존재하에, 본원에 기술된 자극 단계에 의해 획득된 세포의 집단을 배양하는 단계를 수반한다.
일부 양태에서, 상기 세포 배지는 RPMI-1640 배지 25 내지 65부피% 및 클릭스 배지 25 내지 65부피%를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 RPMI-1640 배지 30 내지 60% 및 클릭스 배지 30 내지 60%를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 RPMI-1640 배지 35 내지 55% 및 클릭스 배지 35 내지 55%를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 RPMI-1640 배지 40 내지 50% 및 클릭스 배지 40 내지 50%를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 RPMI-1640 배지 45% 및 클릭스 배지 45%를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 세포 배지는 RPMI-1640 배지 47.5% 및 클릭스 배지 47.5%를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 세포 배지는 하나 이상의 세포 배지 첨가제를 포함할 수 있다. 세포 배지 첨가제는 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 항체(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신), 성장 인자 풍부 첨가제, 예컨대 혈청(예를 들어, 인간 혈청, 소 태아 혈청(FBS), 소 혈청 알부민(BSA)), L-글루타민, 사이토카인/성장 인자 등을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 세포 배지는 부피당 성장 인자 풍부 첨가제 2.5 내지 20%(예를 들어, 5%), 예를 들어, FBS 5 내지 20%, 예를 들어, FBS 7.5 내지 15%, 또는 FBS 10%를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 GlutaMax 0.5 내지 5%, 예를 들어, GlutaMax 1%를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 Pen/Strep 0.5~5%, 예를 들어, Pen/Strep 1%를 포함한다.
특정 양태에서, 상기 세포 배지는 인간 혈소판 용해물을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 세포 배지는 (부피당) 인간 혈소판 용해물 1 내지 20%(예를 들어, 5%), 예를 들어, 인간 혈소판 용해물 2.5 내지 20%, 예를 들어, 인간 혈소판 용해물 2.5 내지 15%, 2.5 내지 10%, 또는 5%를 포함한다. 인간 혈소판 용해물은 예를 들어, Sexton Biotechnologies에서 구입 가능하다.
특정 양태에서, 상기 세포 배지는 L-글루타민을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 세포 배지는 0.5 내지 10mM L-글루타민, 예를 들어, 1 내지 5mM L-글루타민, 예를 들어, 2mM L-글루타민을 포함한다.
본 발명에 따른 APC는 전문적인 APC일 수 있다. 전문적인 APC는 T 세포에 항원을 제공하는 데 특화되어 있고; 이는 세포 표면에서 MHC-펩타이드 복합체를 처리하고 제공하는 데 효율적이고, 높은 수준의 보조자극성 분자를 발현한다. 전문적인 APC는 수상돌기 세포(DC), 대식세포, 및 B 세포를 포함한다. 비-전문적인 APC는T 세포에 MHC-펩타이드 복합체를 제공할 수 있는, 특히 CD8+ T 세포에 MHC 클래스 I-펩타이드 복합체를 제공할 수 있는 다른 세포이다.
일부 양태에서, 상기 APC는 APC에 의해 내면화된 항원(예를 들어, 세포내 섭취/식균 작용에 의해 섭취된)의 MHC 클래스 I 상에서 교차 제공(cross-presentation)할 수 있는 APC이다. CD8+ T 세포에 내면화된 항원의 MHC 클래스 I 상에서의 교차 제공이 예를 들어, Alloatti et al., Immunological Reviews(2016), 272(1): 97-108에 기술되었고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 교차 제공할 수 있는 APC는 예를 들어, 수상돌기 세포(DC), 대식세포, B 세포 및 동모양 혈관내피 세포를 포함한다.
본원에 설명된 바와 같이, 일부 양태에서, 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 자극하기 위한 APC는 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 포함하는 세포(예를 들어, PBMC)의 집단 내에 포함되고, 여기서부터 바이러스 항원(들)에 특이적인 세포의 집단이 팽창될 것이다. 이와 같은 양태에서, APC는 예를 들어, 수상돌기 세포, 대식세포, B 세포, 또는 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포에 항원(들)을 제공할 수 있는 세포의 집단 내의 임의의 다른 세포 유형일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 바이러스 항원(들)/이것의 펩타이드(들)을 발현하거나 포함하도록 변형된 바 있는 APC를 활용한다. 일부 양태에서, 상기 APC는 상기 펩타이드(들)과 접촉된 바 있고 그들을 내면화한 바 있음의 결과로, 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)를 제공할 수 있다. 일부 양태에서, APC는 상기 펩타이드(들)로 '펄스될(pulsed)' 수도 있었는데, 이는 일반적으로 APC가 상기 펩타이드(들)을 내면화하기에 충분한 기간 동안, 상기 펩타이드(들)의 존재하에 시험관내에서 APC를 배양하는 단계를 수반한다.
일부 양태에서, 상기 APC는 상기 세포 내에서 상기 항원을 인코딩하는 핵산을 발현한 결과로, 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공할 수 있다. APC는 바이러스에 감염된 결과로서(예를 들어, EBV-감염 B 세포, 예를 들어, LCL의 경우에) 상기 바이러스 항원(들)을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. APC는 상기 항원(들)을 인코딩하는 핵산이, 예를 들어, 형질감염, 형질 도입, 전기천공 등을 통해, 상기 세포에 도입된 결과로써, 바이러스 항원(들)을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 바이러스 항원(들)을 인코딩하는 핵산은 플라스미드/벡터로 제공될 수 있다.
일부 양태에서, APC는 활성화된 T 세포(ATC), 수상돌기 세포, B 세포(예를 들어, LCL을 포함함) 및 인공 항원 제공 세포(aAPC), 예컨대 Neal et al., J Immunol Res Ther(2017) 2(1):68-79 and Turtle and Riddell Caner J.(2010) 16(4):374-381에 기술된 것들로부터 선택된다.
일부 양태에서, APC는 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 포함하는 면역 세포의 집단의 생성/팽창을 위해 APC와 공동배양될 세포의 집단과 관련하여 자가유래이다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 APC는 APC가 함께 공동배양될 세포 집단이 획득되었던 대상체와 동일한 대상체에서 유래된다 (또는 상기 대상체에서 획득된 세포에서 유래된다).
APC로서 다클론성 활성화된 T 세포(ATC)의 용도 및 ATC를 제조하는 방법이 예를 들어, Ngo et al., J Immunother.(2014) 37(4):193-203에 기술되었고, 상기 문헌은 앞서 본원에 참조로 편입되어 있다. 요약하면, ATC는 IL-2의 존재하에 작용제 항-CD3 및 작용제 항-CD28 항체로 PBMC를 자극함으로써, T 세포를 시험관내에서 비특이적으로 활성화함으로써 생성될 수 있다.
수상돌기 세포는, 예를 들어, Ngo et al., J Immunother.(2014) 37(4):193-203에 기술된 바와 같이, 당해 기술에 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다. 수상돌기 세포는 PBMC에서 CD14 선택에 의해 획득될 수 있는 단핵 백혈구에서 제조될 수 있다. 상기 단핵 백혈구는 미성숙 수상돌기 세포로 분화를 유발하고, 예를 들어, IL-4 및 GM-CSF를 포함할 수 있는 세포 배지에서 배양될 수 있다. 미성숙 수상돌기 세포는 IL-6, IL-1β, TNFα, PGE2, GM-CSF 및 IL-4의 존재하의 배양에 의해 성숙될 수 있다.
LCL은 예를 들어, Hui-Yuen et al., J Vis Exp (2011) 57: 3321, and Hussain and Mulherkar, Int J Mol Cell Med (2012) 1(2): 75-87에 기술된 바와 같이, 당해 기술에 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있으며, 상기 두 가지 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 요약하면, LCL은 사이클로스포린 A의 존재하에, EBV를 생산하는 세포, 예를 들면 B95-8 세포의 농축된 세포 배양 상청액으로 PBMC를 배양함으로써 생산될 수 있다.
인공 항원 제공 세포(aAPC)는 보조자극성 분자 CD80, CD86, CD83 및 4-1BBL(예를 들어, Suhoski et al., Mol Ther.(2007) 15(5):981-8에 기술됨)을 발현하도록 조작된, 예를 들어, K562cs 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 자극 단계가 PBMC를 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 재자극 단계가 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 재자극 단계가 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 ATC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 추가로 자극 및/또는 재자극에서 보조자극을 향상시키기 위한 제제를 활용한다. 이와 같은 제제에는 예를 들어, 보조자극성 분자를 발현하는 세포(예를 들어, CD80, CD86, CD83 및/또는 4-1BBL), 예컨대 예를 들어, LCL 또는 K562cs 세포가 포함된다. 일부 양태에서, 보조자극성 분자를 발현하는 세포는 HLA-음성, EBV 복제-불능 LCL이고, 이들은 또한 '보편적 LCL' 또는 'uLCL'로 불린다. uLCL은 예를 들어, US 2018/0250379 A1에 기술되었다.
보조자극을 향상시키기 위한 제제의 다른 예에는 예를 들어, T 세포(예를 들어, 4-1BB, CD28, OX40, ICOS 등)에 의해 발현된 보조자극성 수용체에 특이적인 작용제 항체 및 T 세포(예를 들어, CD80, CD86, CD83, 4-1BBL, OX40L, ICOSL 등)에 의해 발현된 보조자극성 수용체를 활성화할 수 있는 보조자극성 분자가 포함된다. 이와 같은 제제는, 예를 들어, 비즈 상에 부동화되어 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 자극 및/또는 재자극은 uLCL을 활용한다. ULCL은 기타 보조자극성 분자들과 함께, EBV 항원을 발현하고, 또한 CD30을 발현한다. 따라서, uLCL은 EBV 항원 자극, CD30을 통한 CAR로 CD30.CAR EBVST의 자극, 및 또한 CD30.CAR EBVST의 시험관내/생체외 팽창을 위한 보조자극을 제공하는 데 유용하다.
일부 양태에서, 상기 uLCL은 항원성 자극(예를 들어, EBV 및/또는 CD30 자극)을 제공하는 세포로서 활용된다. 일부 양태에서, 상기 uLCL은 보조자극을 제공하는 세포로 활용된다. 일부 양태에서, 상기 uLCL은 항원성 자극 및 보조자극을 제공하는 세포로서 활용된다. 일부 양태에서, 상기 uLCL은 (예를 들어, 100 그레이에서) 방사능 처리된다. 일부 양태에서, 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC는 uLCL이다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법은 uLCL의 존재하에 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법은 uLCL의 존재하에 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재자극 단계를 포함한다. 일부 양태에서, uLCL(예를 들어, 방사능 처리된 uLCL)은 1:1 및 1:10 사이, 예를 들어, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 1:5, 1:5.5, 1:6, 1:6.5, 1:7, 1:7.5 또는 1:8 중 하나의 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포 대 uLCL의 비로, 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포와의 공동 배양에 활용될 수 있다. 일부 양태에서, uLCL(예를 들어, 방사능 처리된 uLCL)은 1:2 및 1:5 사이, 예를 들어, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5 또는 1:5 중 하나의 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포 대 uLCL의 비로, 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포와 공동 배양하는 데 활용될 수 있다. 일부 양태에서, 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포 대 uLCL의 비는 ~1:3이다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법은 uLCL의 존재하에, CAR을 포함하거나 발현하는(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법은 uLCL의 존재하에, 본원에 기술된 CAR을 포함하거나 발현하는(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재자극 단계를 포함한다. 일부 양태에서, uLCL(예를 들어, 방사능 처리된 uLCL)은 1:1 및 1:10 사이, 예를 들어, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 1:5, 1:5.5, 1:6, 1:6.5, 1:7, 1:7.5 또는 1:8 중 하나의 본원에 기술된 CAR을 포함하거나 발현하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포 대 uLCL의 비로, 본원에 기술된 CAR을 포함하거나 발현하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포와의 공동 배양에 활용될 수 있다. 일부 양태에서, uLCL(예를 들어, 방사능 처리된 uLCL)은 1:2 및 1:5 사이, 예를 들어, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5 또는 1:5 중 하나의 본원에 기술된 CAR을 포함하거나 발현하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포 대 uLCL의 비로, 본원에 기술된 CAR을 포함하거나 발현하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포와의 공동 배양에 활용될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 포함하거나 발현하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는) 바이러스-특이적 면역 세포 대 uLCL의 비는 ~1:3이다.
일부 양태에서, 재자극 단계는 uLCL의 존재하에 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포를 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 ATC와 접촉시키는 단계를 포함한다.
면역 세포 집단을 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들), 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC와 접촉시키는 단계는 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 수행되어, T 세포 활성화 및 증식을 용이하게 할 수 있다. 일부 양태에서, 자극은 IL-7, IL-15, IL-6, IL-12, IL-4, IL-2 및/또는 IL-21 중 하나 이상의 존재하에 수행된다. 배양에서 상기 세포에 의해 생산된 사이토카인과 더불어 상기 사이토카인이 상기 배양물에 외인성으로 첨가됨이 이해될 것이다. 일부 양태에서, 상기 첨가된 사이토카인은 재조합으로 생성된 사이토카인이다.
이에 따라, 일부 양태에서, 상기 방법은 IL-7, IL-15, IL-6, IL-12, IL-4, IL-2 및/또는 IL-21 중 하나 이상의 존재하에 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)과 접촉된 바 있는 PBMC를, 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC의 존재하에 PBMC를 배양하는 단계를 수반한다.
일부 양태에서, 배양은 IL-7, IL-15, IL-6, IL-12, IL-4, IL-2 및/또는 IL-21의 존재하에 이루어진다. 일부 양태에서, 배양은 IL-7, IL-15, IL-6 및/또는 IL-12의 존재하에 이루어진다. 일부 양태에서, 배양은 IL-7 및/또는 IL-15의 존재하에 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1 내지 100ng/ml, 예를 들어, 2 내지 50ng/ml, 5 내지 20ng/ml 또는 7.5 내지 15ng/ml 중 하나이다. 일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 약 10ng/ml이다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 1~100ng/ml, 예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나이다. 일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 약 10ng/ml이다. 일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 10~1000ng/ml, 예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나이다. 일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 약 100ng/ml이다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-6의 최종 농도는 10~1000ng/ml, 예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나이다. 일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-6의 최종 농도는 약 100ng/ml이다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-12의 최종 농도는 1~100ng/ml, 예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml이다. 일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-12의 최종 농도는 10ng/ml이다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, IL-15의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 약 10ng/ml)이다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, IL-15의 최종 농도는 10~1000ng/ml(예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나, 예를 들어, 약 100ng/ml)이다.
일부 양태에서, 상기 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, IL-6의 최종 농도는 10~1000ng/ml(예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나, 예를 들어, 약 100ng/ml)이고, IL-12의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, IL-15의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이다.
일부 양태에서, 상기 자극 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, 상기 자극 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 10~1000 ng/ml(예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나, 예를 들어, 약 100ng/ml)이다.
일부 양태에서, 상기 자극 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, 상기 자극 배양물 중 IL-6의 최종 농도는 10~1000ng/ml(예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나, 예를 들어, 약 100ng/ml)이고, 상기 자극 배양물 중 IL-12의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, 상기 자극 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이다.
일부 양태에서, 상기 재자극 배양물 중 IL-7의 최종 농도는 1~100ng/ml(예를 들어, 2~50ng/ml, 5~20ng/ml 또는 7.5~15ng/ml 중 하나, 예를 들어, 10ng/ml)이고, 상기 재자극 배양물 중 IL-15의 최종 농도는 10~1000ng/ml(예를 들어, 20~500ng/ml, 50~200ng/ml 또는 75~150ng/ml 중 하나, 예를 들어, 약 100ng/ml)이다.
본 발명에 따른 자극 및 재자극은 전형적으로 APC가 T 세포를 자극하기에 충분하고 상기 T 세포가 세포 분열을 겪기에 충분한 기간 동안 T 세포 및 APC의 공동 배양을 수반한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 또는 적어도 7일 중 하나의 기간 동안, 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)에 접촉된 바 있는 PBMC를, 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC의 존재하에 PBMC를 배양하는 단계를 수반한다. 일부 양태에서, 배양은 24시간 내지 20일, 예를 들어, 48시간 내지 14일, 3일 내지 12일, 4 내지 11일, 또는 6 내지 10일 또는 7 내지 9일의 기간 동안 이루어진다.
일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 또는 적어도 7일 중 하나의 기간 동안, 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)에 접촉된 바 있는, 또는 바이러스 항원(들)에 상응하는 펩타이드(들)을 제공하는 APC의 존재하에, 본원에 기술된 자극 단계에 의해 획득된 세포의 집단을 배양하는 단계를 수반한다. 일부 양태에서, 배양은 24시간 내지 20일, 예를 들어, 48시간 내지 14일, 3일 내지 12일, 4 내지 11일, 또는 6 내지 10일 또는 7 내지 9일의 기간 동안 이루어진다.
자극 및 재자극은 배양 중인 세포를 이들이 배양된 배지에서 분리하거나, 또는 상기 배양물을 예를 들어, 세포 배지의 첨가에 의해 희석함으로써 종료될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 자극 또는 재자극 배양의 종료 시 상기 세포를 수집하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 재자극 단계가 상기 재자극 단계를 위한 세포 배지, 조정된(conditioned) 배지(및 임의의 첨가제)의 바람직한 백분율/농도를 달성하기에 적절한 양으로 세포 배지(및 본원에 기술된 임의의 다른 첨가제)를 첨가함으로써 성립될 수 있다.
소정의 자극 또는 재자극 단계의 배양 기간의 종료 시, 상기 세포가 세포 배양 상청액에서 수집 및 분리될 수 있다. 상기 세포는 원심분리에 의해 수집될 수 있고, 상기 세포 배양 상청액은 세포 펠릿에서 분리될 수 있다. 상기 세포 펠릿은 이어서 예를 들어, 재자극 단계를 위해 세포 배지에 재현탁될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 세포는 수집 후 세척 단계를 거칠 수 있다. 세척 단계는 등장성 완충액, 예컨대 인산염-완충 식염수(PBS)에 상기 세포 펠릿을 재현탁하는 단계, 상기 세포를 원심분리에 의해 수집하는 단계, 및 상기 상청액을 폐기하는 단계를 포함할 수 있다.
바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포의 집단을 생성 및/또는 팽창하기 위한 방법은 전형적으로 2회 이상의 단일 자극 단계를 수반한다. 수행될 수 있는 자극 단계의 횟수에 상한치는 없다. 일부 양태에서, 상기 방법은 2, 3, 4 또는 5회를 초과한 자극 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15회 자극 단계 중 하나를 포함한다. 한 방법에서 자극 단계는 다른 단계와 상이할 수 있다.
일부 양태에서, 본 방명에 활용된 PBMC는 CD45RA-양성 세포가 고갈된다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 PBMC는 'CD45RA-양성 세포-고갈 PBMC' 또는 'CD45RA-음성 PBMC'이다. CD45RA-양성 세포의 고갈은 생성/팽창된 세포 집단에서 NK 세포 및/또는 조절 T 세포의 개수를 감소시키기 위해 의도된 것이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 예를 들어, 자극 단계 이전에 PBMC에서 CD45RA-양성 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 예를 들어, 재자극 이전에 본 발명에 따른 자극 단계에 의해 획득된 세포에서 CD45RA-양성 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. CD45RA-양성 세포의 고갈은 예를 들면 Miltenyi® Biotec 컬럼 및 자성 항-CD45RA 항체-도포 비즈를 사용하여, 임의의 적합한 방법, 예컨대 자성-활성화된 세포 분류법(MACS)에 의해 달성될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법에 활용된 APC를 유도하기 위해 사용되는 세포의 집단에서 CD45RA-양성 세포가 고갈된다. 다시 말해서, 일부 양태에서, APC를 유도하기 위해 사용되는 상기 세포의 집단은 'CD45RA-양성 세포-고갈' 또는 'CD45RA-음성' 집단이다. 예를 들면, ATC가 APC로서 활용되는 양태에서, 상기 ATC는 CD45RA-양성 세포-고갈 PBMC의 집단에서, 또는 CD45RA-음성 PBMC의 집단에서 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 추가로 상기 세포에서 IL-7-매개 신호전달을 증가시키기 위한 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포의 변형을 포함한다. IL-7-매개 신호전달이 종양-특이적 T 세포의 생존 및 항-종양 활성을 증가시키는 것으로 나타난 바 있다- 예를 들어, Shum et al., Caner Discov.(2017) 7(11):1238-1247, 및 WO 2018/038945 A1을 참조.
일부 양태에서, 상기 방법은 추가로 WO 2018/038945 A1(상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입됨)에 기술된 양태에 따른 핵산을 PBMC 또는 상기 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 핵산을 PBMC 또는 바이러스 항원(들)에 특이적인 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 핵산은 상기 세포 내에 STAT5-매개 신호전달을 증가시키기 위한 폴리펩타이드를 인코딩한다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 (i) 폴리펩타이드의 동종이합체화(homo-dimerisation)를 용이하게 하는 영역, 및 (ii) IL-7Rα의 세포내 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드의 동종이합체화(homo-dimerisation)를 용이하게 하는 영역은 상기 폴리펩타이드의 단량체들 사이에 이황화물의 형성을 가능하게 하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드의 동종이합체화(homo-dimerisation)를 용이하게 하는 영역은 WO 2018/038945 A1의 서열번호 1 내지 24 중 하나에 따른(예를 들어, WO 2018/038945 A1의 단락 [0074] 내지 [0076] 참조) 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
IL-7Rα의 세포내 영역은 UniProt: P16871-1, v1의 위치 265 내지 459에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어질 수 있다.
상기 핵산은 당해 기술에 잘 알려진 방법, 예컨대 형질 도입, 형질 감염, 전기 천공 등에 의해 상기 세포로 도입될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 핵산은 상기 핵산을 포함하는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터)를 사용하는 형질 도입을 통해 상기 세포에 도입된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 (i) 상기 폴리펩타이드의 동종이합체화(homo-dimerisation)를 용이하게 하는 영역, 및 (ii) IL-7Rα의 세포내 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 PBMC 또는 EBV 항원(들)에 특이적인 면역 세포로 형질도입하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 방법의 측면 및 양태는 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 포함하도록 본원에 기술된 면역 세포(예를 들어, 본원에 기술된 바이러스-특이적 면역 세포)를 변형하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 방법의 측면 및 양태는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하도록 본원에 기술된 면역 세포(예를 들어, 본원에 기술된 바이러스-특이적 면역 세포)를 변형하는 단계를 포함한다.
이와 같은 방법은 전형적으로 CAR을 인코딩하는 핵산을 면역 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
면역 세포(예를 들어, 바이러스-특이적 면역 세포)는, 당해 기술에 잘 알려진 방법에 따라, 본원에 기술된 CAR 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하도록 변형될 수 있다.
상기 방법은 일반적으로 핵산 전이(transfer)를 포함하는데, 이는 상기 전이된 핵산의 영구적(안정적) 또는 일시적 발현을 위한 것이다.
임의의 적합한 유전자 조작 플랫폼이 본 발명에 따른 세포를 변형하는 데 사용될 수 있다. 세포를 변형하기 위한 적합한 방법은, 예를 들면 Maus et al., Annu Rev Immunol(2014) 32:189-225에 기술된 바와 같이, 유전 조작 플랫폼, 예컨대 감마레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, DNA 형질 감염, 트랜스포존-기반 유전자 전달 및 RNA 형질 감염의 사용을 포함하고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 일부 양태에서, CAR 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록 세포를 변형하는 단계는 세포에 상기 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 형질도입하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 CAR을 인코딩하는 레트로바이러스를 활용한다.
방법은 또한 예를 들어, Wang and Riviｅre Mol Ther Oncolytics. (2016) 3:16015에 기술된 것을 포함하고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
상기 방법은 일반적으로 핵산/벡터를 인코딩하는 다수의 핵산/이와 같은 핵산(들)을 포함하는 다수의 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 추가로 상기 세포에 의해 상기 핵산(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 시험관내 수행된다. 핵산(들)/벡터(들)을 세포에 도입하기 위한 적절한 방법은 형질도입, 형질감염 및 전기천공을 포함한다.
일부 양태에서, 핵산(들)/벡터(들)을 세포로 도입하는 단계는 형질 도입, 예를 들어, 레트로바이러스 형질 도입을 포함한다. 이에 따라, 일부 양태에서, 상기 핵산(들)은 바이러스 벡터(들)에 포함되거나, 또는 상기 벡터(들)은 바이러스 벡터(들)이다. 면역 세포에 바이러스 벡터의 형질 도입이 예를 들어, Simmons and Alberola-Ila, Methods Mol Biol.(2016) 1323:99-108에 기술되었고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
형질 도입의 효율을 향상시키기 위해 본 발명의 방법에 제제가 활용될 수 있다. 헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌)가 세포 표면에 발현되는 비리온 및 시알산 잔기 사이의 전하 반발을 중화하는 단계를 통해, 형질 도입을 개선하기 위해 보통 사용되는 양이온 중합체이다. 형질 도입을 향상시키기 위해 보통 사용되는 다른 제제에는 예를 들어, 폴록사머계 제제, 예컨대 LentiBOOST(Sirion Biotech), 레트로넥틴(Takara), 벡토퓨신(Miltenyi Biotech) 및 또한 SureENTRY(Qiagen) 및 ViraDuctin(Cell Biolabs)이 포함된다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 벡터/CAR을 인코딩하는 핵산을 세포에 형질 도입할 때 벡토퓨신-1(Miltenyi Biotec Cat No. 170-076-165)을 활용한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 CAR을 인코딩하는 레트로바이러스를 벡토퓨신-1과 접촉시키는 단계, 및 레트로바이러스를 형질도입할 세포를 레트로바이러스 및 벡토퓨신-1을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 상기 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 세포 배지의 존재하에 상기 CAR을 인코딩하는 핵산을 도입하는 것이 바람직한 세포를 원심분리하는 단계(당해 기술에서는 '스핀감염(spininfection)'이라 불림)를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 예를 들어, Koh et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids (2013) 2, e114에 기술된 바와 같이, 전기 천공에 의해 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 추가로 예를 들어, 다른 세포(예를 들어, 상기 바이러스에 특이적이지 않은 세포, 및/또는 상기 CAR을 발현하지 않는 세포)에서 CAR-발현 및/또는 바이러스-특이적 면역 세포를 정제/단리하는 단계를 포함한다. 이질적 세포 집단에서 면역 세포를 정제/단리하는 방법이 당해 기술에 잘 알려져 있고, 이는 상기 면역 세포의 표지자의 발현을 기반으로, 세포 집단을 분류하기 위한 FACS-기반 또는 MACS-기반 방법을 활용할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 특정 유형의 세포, 예를 들어, 바이러스-특이적 T 세포(예를 들어, 바이러스-특이적 CD8+ T 세포, 바이러스-특이적 CTL), 또는 CAR-발현 바이러스-특이적 T 세포(예를 들어, CAR-발현 바이러스-특이적 CD8+ T 세포, CAR-발현 바이러스-특이적 CTL)를 정제/단리하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 획득된 또는 획득될 수 있는 세포 및 이것의 집단을 제공한다.
조성물
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 하나 이상의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포(예를 들어, 이것의 집단)를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 기술된 세포는 임상적 용도를 위한 약제학적 조성물 또는 의약품으로 제형화될 수 있고, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 주사 또는 주입을 포함할 수 있는 투여의 국소, 비경구, 전신, 강내의, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추 강내, 안구내, 결막내, 종양내, 피하, 피내, 척추 강내, 경구 또는 경피 경로를 위해 제형화될 수 있다.
적합한 제형은 살균 또는 등장성 배지 중 세포를 포함할 수 있다. 의약품 및 약제학적 조성물은 유체, 예컨대 겔 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인간 또는 동물 몸의 선택된 부위에 주사 또는 주입(예를 들어, 카테터를 통해)에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물은 예를 들어, 혈관 또는 종양에 주사 또는 주입하기 위해 제형화된다.
본 발명은 또한 약제학적으로 유용한 조성물의 생산을 위한 방법을 제공하는데, 이와 같은 생산 방법은, 본원에 기술된 세포를 생산하는 단계; 본원에 기술된 세포를 단리하는 단계; 및/또는 본원에 기술된 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다
예를 들면, 본 발명의 추가적인 측면은 질환/병태(예를 들어, 암)의 치료에 사용하기 위한 의약품 또는 약제학적 조성물을 제형화 또는 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기술된 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약제학적 조성물 또는 의약품을 제형화하는 단계를 포함한다.
MHC 변이 및 일치
MHC 클래스 I 분자는 알파(α) 사슬 및 베타(β)2-마이크로글로불린(B2M)의 비공유결합 이종이량체이다. 상기 α-사슬은 α1, α2 및 α3으로 명시된 세 영역을 갖는다. 상기 α1 및 α2 영역은 함께, 펩타이드:MHC 복합체를 형성하기 위해, 상기 MHC 클래스 I 분자에 의해 제공된 펩타이드가 결합되는 홈을 형성한다. 인간에서, MHC 클래스 I α-사슬은 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자에 의해 인코딩된다. 3개의 주요한 HLA 유전자 좌(HLA-A, HLA-B 및 HLA-C) 및 3개의 작은 유전자좌(HLA-E, HLA-F 및 HLA-G)가 존재한다.
MHC 클래스 I α-사슬은 다형태이고, 상이한 α-사슬은 상이한 펩타이드들을 결합시키거나 제공할 수 있다. MHC 클래스 I α 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는 상당히 가변적으로, 그 결과로 상이한 대상체의 세포는 종종 상이한 MHC 클래스 I 분자를 발현한다.
이와 같은 가변성은 개인간 장기 이식 및 세포의 입양 전달에 대해 시사하는 바가 있다. 장기 이식 또는 입양 전달된 세포의 수혜자의 면역 체계가 비-자기 MHC 분자를 외부존재로 인식함으로써, 상기 이식체 또는 입양 전달된 세포를 겨냥한 면역 반응을 일으키고, 이는 이식편 거부 반응을 야기할 수 있다. 대안적으로, 장기 이식편이 될 세포 집단/조직/장기 중의 세포는 수혜자의 MHC 분자를 외부 존재로 인식하는 면역 세포를 함유함으로써, 수혜자 조직을 겨냥한 면역 반응을 일으키고, 이는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 야기할 수 있다.
동종반응성 T-세포는 비-자기 MHC 분자(즉, 동종이계 MHC)를 인식하고 이에 대한 면역 반응을 개시할 수 있는 TCR를 포함한다. 동종반응성 T-세포는 비-자기 MHC 분자를 발현하는 세포에 대한 반응으로, 세포 증식, 성장 인자(예를 들어, IL-2) 발현, 세포독성/효과기 인자(예를 들어, IFNγ, 그란자임, 퍼포린, 그라눌리신, CD107a, TNFα, FASL) 발현 및/또는 세포독성 활성과 같은 특성들 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 '동종반응성' 및 '동종반응성 면역 반응'은 상기 효과기 면역 세포에 유전적으로 비동일성을 보이는 세포/조직/기관을 겨냥한 면역 반응을 가리킨다. 효과기 면역 세포는 비-자기 MHC/HLA 분자(즉, 상기 효과기 면역 세포에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자에 비동일성을 보이는 MHC/HLA 분자)를 발현하는 세포, 또는 상기 세포를 포함하는 조직/기관에 대한 동종반응성 또는 동종반응성 면역 반응을 나타낼 수 있다.
본원에서 언급된 'MHC 불일치' 및 'HLA 불일치' 대상체는 비-동일성 MHC/HLA 분자를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 갖는 대상체이다. 일부 양태에서, 상기 MHC 불일치 또는 HLA 불일치 대상체는 비-동일성 MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 갖는다. 본원에서 언급된 'MHC 일치' 및 'HLA 일치' 대상체는 동일성 MHC/HLA 분자를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 갖는 대상체이다. 일부 양태에서, 상기 MHC 일치 또는 HLA 일치 대상체는 동일성 MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 갖는다.
세포/조직/기관이 본원에서 기준 대상체/치료와 관련하여 동종이계로 언급되는 경우, 상기 세포/조직/기관은 상기 기준 대상체 이외의 대상체의 세포/조직/기관에서 획득되거나 유래된다. 일부 양태에서, 동종이계 재료는 상기 기준 대상체의 MHC/HLA 유전자에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)에 비동일성을 보이는 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 포함한다.
본원에서 치료와 관련하여 세포/조직/기관이 동종이계라고 언급된 경우, 상기 세포/조직/기관은 치료 받을 대상체 이외의 대상체의 세포/조직/기관에서 획득되거나 유래된다. 일부 양태에서, 동종이계 재료는 치료 받을 대상체의 MHC/HLA 유전자에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)에 비동일성을 보이는 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 포함한다.
세포/조직/기관이 본원에서 기준 대상체와 관련하여 자가유래라 언급된 경우, 상기 세포/조직/기관은 상기 기준 대상체의 세포/조직/기관에서 획득되거나 유래된다. 세포/조직/기관이 본원에서 기준 대상체와 관련하여 자가이식편(자가이식) 이라고 언급된 경우, 세포/조직/기관은 유전적으로 상기 기준 대상체와 동일하거나, 또는 유전적으로 동일한 대상체에서 유래되거나 획득된다. 세포/조직/기관이 본원에서 대상체의 치료(예를 들어, 자가유래 세포의 투여에 의한 대상체의 치료)의 맥락에서 자가유래라고 언급된 경우, 상기 세포/조직/기관은 치료 받을 대상체의 세포/조직/기관에서 획득되거나 유래된다. 세포/조직/기관이 대상체의 치료의 맥락에서 자가이식편이라고 언급되는 경우, 상기 세포/조직/기관은 치료받을 대상체에 유전적으로 동일하거나, 또는 유전적으로 동일한 대상체에서 유래되거나 획득된다. 자가유래 및 자가이식편 세포/조직/기관은 상기 기준 대상체의 MHC/HLA 유전자에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)와 동일한 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 포함한다.
세포/조직/기관이 본원에서 기준 대상체와 관련하여 동종이계라고 언급되는 경우, 세포/조직/기관은 상기 기준 대상체와 유전적으로 비동일성이거나, 또는 유전적으로 비동일성인 대상체에서 유래되거나 획득된다. 세포/조직/기관이 본원에서 대상체의 치료의 맥락에서 동종이계라고 언급되는 경우, 상기 세포/조직/기관은 치료 받을 대상체와 유전적으로 비동일성이거나, 또는 유전적으로 비동일성인 대상체에서 유래되거나 획득된다. 동종이계 세포/조직/기관은 상기 기준 대상체의 MHC/HLA 유전자에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)와 비동일성인 MHC/HLA 분자(예를 들어, MHC 클래스 I α 및/또는 MHC 클래스 II 분자)를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 대상체에게 투여될 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하) 바이러스에 특이적인 면역 세포는 치료 받을 상기 대상체의 HLA/MHC 프로파일을 근거로 선택된다.
일부 양태에서, 상기 대상체에게 투여될 세포가 상기 대상체와 관련하여 이들이 HLA/MHC 일치임을 근거로 선택된다. 일부 양태에서, 상기 대상체에게 투여될 세포가 상기 대상체와 관련하여 이들이 거의 또는 완전한 HLA/MHC 일치인 것을 근거로 선택된다.
본원에 사용된 HLA/MHC 대립유전자는 이들이 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 인코딩할 때 '일치'하는 것으로 판단될 수 있다. 다시 말해서, '일치'는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 밀접한 차이 및/또는 비-코딩 부위에서 가능한 차이의 존재와 무관하게, 단백질 수준에서 결정된다.
기준 대상체와 관련하여 'HLA 일치'인 세포는 (i) HLA-A, -B, -C, 및 -DRB1에 걸친 8/8 일치; 또는 (ii) HLA-A, -B, -C, -DRB1 및 -DQB1에 걸친 10/10 일치; 또는 (iii) HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 및 -DPB1에 걸친 12/12 일치일 수 있다. 기준 대상체와 관련하여 '근접한 또는 완전한 HLA 일치'인 세포는 (i) HLA-A, -B, -C, 및 -DRB1에 걸친 ≥ 4/8(즉, 4/8, 5/8, 6/8, 7/8 또는 8/8) 일치; 또는 (ii) HLA-A, -B, -C, -DRB1 및 -DQB1에 걸친 ≥ 5/10(즉, 5/10, 6/10, 7/10, 8/10, 9/10 또는 10/10) 일치; 또는 (iii) HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 및 -DPB1에 걸친 ≥ 6/12(즉, 6/12, 7/12, 8/12, 9/12, 10/12, 11/12 또는 12/12) 일치일 수 있다.
근접한 또는 완전한 HLA 일치(그들이 동종이계 기원인 것과 무관하게)인 대상체에게 세포를 투여하는 것은, 상기 면역 세포에 특이적인 바이러스에 감염된 것에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환/병태의 치료를 위해 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포의 투여의 맥락에서 특히 이로울 수 있다. 이와 같은 경우에, 투여된 세포에 대한 숙주의 세포에 의한 바이러스 항원의 제공(그들의 천연 TCR를 통함)이 이의 활성화, 체내 증식 및 생존을 증가시키고, 결과적으로 그들의 치료 효능을 개선하는 것으로 기대될 터이다.
CAR-발현, 바이러스-특이적 면역 세포를 사용하는 방법
본원에 기술된 상기 CAR-발현, 바이러스-특이적 면역 세포(예를 들어, 본원에 기술된 CD30-특이적 CAR-발현 EBV-특이적 T 세포(CD30.CAR EBVST))는 치료 차원 및/또는 예방 차원의 방법에서의 용도를 밝혀내었다.
대상체에서 질환/병태를 치료/예방하기 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한 의료적 치료/예방의 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포가 제공된다. 또한 질환/병태를 치료/예방하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포가 제공된다. 또한 질환/병태를 치료/예방하는 방법에 사용하기 위한 의약품의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포의 용도가 제공된다.
상기 방법이 일반적으로 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함함이 이해될 것이다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포가 이와 같은 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
특히, 입양 세포 전달(ACT)에 의한 질환/병태를 치료/예방하기 위한 방법에서의 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포의 용도가 고려되었다.
본 발명에 따른 CAR을 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포는 동종이식에 의한 질환/병태를 치료하기 위한 방법에 특히 유용하다.
본원에 사용된 '동종이식'은 수혜자 대상체와 유전적으로 비동일성인 세포, 조직 또는 기관을 상기 수혜자 대상체에게 이식하는 것을 가리킨다. 상기 세포, 조직 또는 기관은 수혜자 대상체와 유전적으로 비동일성인 공여자 대상체의 세포, 조직 또는 기관에서 비롯되거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 동종이식은 상기 수혜자 대상체와 유전적으로 동일한 공여자 대상체에서 비롯한 또는 그에게서 유래된 세포, 조직 또는 기관의 이식을 가리키는 자가이식과는 완전히 별개이다.
동종이계 면역 세포의 입양 전달은 동종이식의 한 형태임이 이해될 것이다. 일부 양태에서, 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포는 동종이식에 의한 질환/병태를 치료/예방하기 위한 방법에서 치료/예방 제제로서 사용된다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물의 투여는 바람직하게는 '치료차원의 효과적인' 또는 '예방차원의 효과적인' 양만큼 이루어지고, 이는 상기 대상체에게 치료적 또는 예방적 이득을 보여주기에 충분하다. 실제 투여량 및 투여율 및 시간과정은 질환/병태의 속성 및 중증도 및 투여된 특정 약품에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 복용량 결정 등은 일반 주치의 및 기타 의사의 책임 하에 있고, 전형적으로 치료할 질환/장애, 개인 대상체의 상태, 전달 자리, 주치의에게 알려진 투여 방법 및 기타 인자를 고려한다. 앞서 언급된 기법 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 찾아볼 수 있다.
다중 용량이 제공될 수 있다. 다중 용량이 미리 결정된 시간 간격으로 분리될 수 있는데, 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23시간 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중 하나로 선택될 수 있다. 예로서, 용량이 7일, 14일, 21일 또는 28일(3, 2, 또는 1일을 더하거나 또는 빼거나)에 1회 주어질 수 있다.
일부 양태에서, 상기 치료는 추가로 기타 치료적 또는 예방적 개입, 예를 들어, 화학 요법, 면역요법, 방사선 요법, 외과 수술, 예방 접종 및/또는 호르몬 요법을 포함할 수 있다. 이와 같은 다른 치료적 또는 예방적 개입은 본 개시에서 아우르는 요법들 이전, 시행 중, 및/또는 이후에 일어날 수 있고, 다른 치료적 또는 예방적 개입의 전달은 본 발명의 치료와 다른 투여 경로를 통해 일어날 수 있다.
투여는 단독으로 이루어지거나 또는 치료대상 질환에 따라서 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 병행하여 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 또 다른 치료 개입과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
동시 투여는 둘 이상의 치료 개입이 함께 시행되는 것을 가리키는데, 예를 들면 두 가지 활성 제제를 함유한 약제학적 조성물(즉, 조합된 제제로)로, 또는 서로 복용 후 즉시, 및 선택적으로 동일한 투여 경로를 통해, 예를 들어, 동일한 동맥, 정맥 또는 기타 혈관으로 투여하는 것이다.
순차 투여는 하나의 치료적 개입이 시행되고, 소정의 시간 간격 후 별도로 추가적인 하나 이상의 치료 개입이 시행되는 것을 가리킨다. 상기 요법들이 동일 경로로 시행되어야 할 필요는 없으나, 다만 일부 양태에서, 그런 경우가 존재한다. 상기 시간 간격은 임의의 시간 간격일 수 있다.
입양 세포 전달은 일반적으로 세포(예를 들어, 면역 세포)가 대상체에서, 전형적으로 상기 세포가 단리된 혈액 샘플을 취함으로써, 획득된 과정을 가리킨다. 상기 세포는 이어서 전형적으로 변형 및/또는 팽창되고, 그러고 나서 동일한 대상체(자가유래/자가이식 세포의 입양 전달의 경우) 또는 상이한 대상체(동종이계 세포의 입양 전달의 경우)에 투여된다. 상기 치료는 전형적으로 바람직한 특정 특징들을 갖는 세포 집단을 대상체에게 전달하거나 상기 대상체에서 이와 같은 특징이 있는 그런 세포의 빈도를 증가시키는 것을 목표로 한다. 입양 전달은 세포 또는 세포 집단을 대상체에게 도입하거나, 및/또는 대상체에서 세포 또는 세포 집단의 빈도를 증가시키는 목표를 가지고 수행될 수 있다.
면역 세포의 입양 전달이 예를 들면, Kalos and June(2013), Immunity 39(1): 49-60, and Davis et al.(2015), Cancer J. 21(6): 486-491에 기술되었고, 이들 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 당해 기술의 숙련가는, 예를 들면 Dai et al., 2016 J Nat Cancer Inst 108(7): djv439을 참조로, 본 발명에 따른 세포의 입양 전달을 위한 적절한 시약 및 절차를 결정할 수 있으며, 상기 문헌은 전체가 참조로 편입되어 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 CAR을 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 바이러스에 특이적인 면역 세포를 생성하는 단계, 또는 바이러스에 특이적인 면역 세포 집단을 생성/팽창하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 CAR을 포함하거나 발현하도록 바이러스에 특이적인 면역 세포를 변형하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 발현하도록 바이러스에 특이적인 면역 세포를 변형하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 포함하도록 변형된(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하도록 변형된) 바이러스에 특이적인 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
(a) 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록, 바이러스에 특이적인 면역 세포를 변형하는 단계, 및
(b) 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된 바이러스에 특이적인 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
(a) 바이러스에 특이적인 면역 세포를 단리하거나 또는 획득하는 단계;
(b) 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록, 바이러스에 특이적인 면역 세포를 변형하는 단계, 및
(c) 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된 바이러스에 특이적인 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
(a) 대상체에서 면역 세포(예를 들어, PBMC)를 단리하는 단계;
(b) 바이러스에 특이적인 면역 세포의 집단을 생성/팽창하는 단계;
(c) 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록, 바이러스에 특이적인 면역 세포를 변형하는 단계, 및
(d) 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하도록 변형된 바이러스에 특이적인 면역 세포를 대상체로 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된 EBV-특이적 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
(a) 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 EBV-특이적 면역 세포를 변형하는 단계, 및
(b) 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된 EBV-특이적 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
(a) EBV-특이적 면역 세포를 단리 또는 획득하는 단계;
(b) 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 EBV-특이적 면역 세포를 변형하는 단계, 및
(c) 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된 EBV-특이적 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
(a) 대상체에서 면역 세포(예를 들어, PBMC)를 단리하는 단계;
(b) EBV-특이적 면역 세포의 집단을 생성/팽창하는 단계;
(c) 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 EBV-특이적 면역 세포를 변형하는 단계, 및
(d) 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된, 또는 본 발명에 따른 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록 변형된 EBV-특이적 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 면역 세포(예를 들어, PBMC)가 단리된 대상체가 세포가 투여되는 대상체와 동일하다 (즉, 입양 전달이 자가유래/자가이식 세포로 이루어질 수 있음). 일부 양태에서, 상기 면역 세포(예를 들어, PBMC)가 단리된 대상체가 세포가 투여되는 대상체와 상이한 대상체이다 (즉, 입양 전달이 동종이계 세포로 이루어질 수 있음).
일부 양태에서, 상기 방법은
대상체에서 혈액 샘플을 획득하는 단계;
대상체에서 획득된 바 있는 혈액 샘플에서 면역 세포(예를 들어, PBMC)를 단리하는 단계;
바이러스에 특이적인 면역 세포의 집단을 생산/팽창하는 단계(예를 들어, 상기 바이러스의 항원(들)/펩타이드(들)을 포함하거나 발현하는 세포(예를 들어, APC)의 존재하에 PBMC를 배양함으로써, 또는 상기 바이러스에 감염된 세포(예를 들어, APC)의 존재하에 PBMC를 배양함으로써);
시험관내 또는 생체외 세포 배양물에서 상기 바이러스에 특이적인 면역 세포를 배양하는 단계;
본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 또는 포함하도록, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 또는 포함하도록, 바이러스에 특이적인 면역 세포를 변형하는 단계(예를 들어, 이와 같은 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터, 또는 이와 같은 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 형질 도입함으로써);
본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 포함하는, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는 바이러스에 특이적인 면역 세포를 시험관내 또는 생체외 세포 배양물에서 배양하는 단계;
본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 포함하는, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는 바이러스에 특이적인 면역 세포를 수집하거나 단리하는 단계;
본 발명에 따른 CAR을 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는 바이러스에 특이적인 면역 세포를, 예를 들어, 상기 세포를 약제학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 또는 담체와 혼합함으로써, 약제학적 조성물로 제형화하는 단계;
본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 포함하는, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는 바이러스에 특이적인 면역 세포, 또는 이와 같은 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 전달하는 단계
중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 CAR의 발현을 유도/향상시키기 위해 및/또는 상기 CAR을 포함하거나 발현하는 바이러스-특이적 면역 세포의 증식 또는 생존을 유도/향상시키기 위해 상기 세포 또는 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 치료적 및/또는 예방적 방법은 질환/병태의 발병/진행을 경감하고, 질환/병태의 증상을 완화하고, 또는 질환/병태의 병리를 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 상기 방법은 질환/병태의 진행을 저지하는 데, 예를 들어, 상기 질환/병태의 악화를 저지하거나 또는 상기 질환/병태의 발병 속도를 늦추는 데 효과적일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 상기 질환/병태의 개선, 예를 들어, 상기 질환/병태의 증상의 중증도의 경감, 또는 상기 질환/병태의 중증도/활성의 일부 다른 상관관계의 감소를 야기할 수도 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 상기 질환/병태가 후기(예를 들어, 만성 단계 또는 전이)로 발전하는 것을 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포의 치료적 및 예방적 활용이 상기 CAR의 표적 항원을 발현/과발현하는 세포의 개수/활성 및/또는 상기 바이러스에 감염된 세포의 개수/활성의 감소에서 치료적 또는 예방적 혜택을 유도하는 임의의 질환/병태의 치료/예방으로 확장됨이 이해될 것이다.
일부 양태에서, 본 개시에 따라 치료/예방될 상기 질환/병태는 상기 면역 세포에 특이적인 바이러스가 병리학적으로 시사하는 바가 있는 질환/병태이다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 질환/병태는 바이러스의 감염으로 인해 유발 또는 악화되는 질환/병태, 상기 바이러스의 감염이 위험 인자인 질환/병태, 및/또는 상기 바이러스의 감염이 상기 질환/병태의 시작, 발병, 진행 및/또는 중증도와 분명히 연관이 있는 질환/병태이다.
일부 양태에서, 본 개시에 따라 치료/예방될 질환/병태는 상기 CAR에 대한 표적 항원이 병리적으로 시사하는 바가 있는 질환/병태이다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 질환/병태는 상기 표적 항원의 발현/과발현에 의해 유발되거나 또는 악화되는 질환/병태, 상기 표적 항원의 발현/과발현이 위험 인자인 질환/병태, 및/또는 상기 표적 항원의 발현/과발현이 상기 질환/병태의 시작, 발병, 진행, 중증도와 분명히 연관이 있는 것인 질환/병태이다.
상기 질환/병태는 CD30 또는 CD30을 발현하거나 과발현하는 세포가 병리학적으로 시사하는 바가 있는 질환/병태, 예를 들어, CD30을 발현하거나 과발현하는 세포가 상기 질환/병태의 시작, 발병 또는 진행, 및/또는 상기 질환/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 분명히 연관이 있는 질환/병태, 또는 CD30 발현/과발현이 상기 질환/병태의 시작, 발병 또는 진행의 위험 인자인 질환/병태일 수 있다.
본 개시에 따라 치료/예방될 질환/병태는 EBV 감염이 특징인 질환/병태일 수 다. 예를 들면, 상기 질환/병태는 EBV 또는 EBV에 감염된 세포가 병리학적으로 시사하는 바가 있는 질환/병태, 예를 들어, EBV 감염이 상기 질환/병태의 시작, 발병 또는 진행, 및/또는 상기 질환/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 분명히 연관이 있는 질환/병태, 또는 EBV 감염이 상기 질환/병태의 시작, 발병 또는 진행에 위험 인자인 질환/병태일 수 있다.
상기 치료는 하기 중 하나 이상을 목표로 삼을 수 있다: 바이러스 부하를 감소, 바이러스-양성 세포(예를 들어, EBV-양성 세포)의 개수/비율을 감소, 상기 CAR의 표적 항원을 발현/과발현하는 세포(예를 들어, CD30-발현 세포)의 개수/비율의 감소, 바이러스-양성 세포(예를 들어, EBV-양성 세포)의 활성의 감소, 상기 CAR의 표적 항원을 발현/과발현하는 세포(예를 들어, CD30-발현 세포)의 활성의 감소, 상기 질환/병태의 증상의 시작/진행의 지연/방지, 상기 질환/병태의 증상의 중증도의 감소, 바이러스-양성 세포(예를 들어, EBV-양성 세포)의 생존/성장의 감소, 상기 CAR의 표적 항원을 발현/과발현하는 세포(예를 들어, CD30-발현 세포)의 생존/성장의 감소 또는 상기 대상체의 생존의 증가.
일부 양태에서, 대상체는, 예를 들어, 상기 질환/병태에 영향을 받은 주변부 또는 기관/조직(예를 들어, 상기 질환/병태의 증상이 나타난 기관/조직)에서, 또는 바이러스-양성 암 세포(예를 들어, EBV-양성 암 세포)의 검출 또는 상기 CAR의 표적 항원을 발현하거나 과발현하는 암 세포(예를 들어, CD30)의 검출에 의해, 상기 바이러스(예를 들어, EBV), 상기 바이러스(예를 들어, EBV)에 감염된 세포, 또는 상기 CAR의 표적 항원(예를 들어, CD30)을 발현하거나 과발현하는 세포의 검출을 근거로, 본원에서 기술된 치료를 위해 선택될 수 있다. 상기 질환/병태는 임의의 조직 또는 기관 또는 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 양태에서, 상기 질환/병태는 여러 조직/기관/기관계에 영향을 미칠 수 있다.
일부 양태에서, 대상체는, 상기 대상체가 EBV에 감여되었는지 여부 또는 EBV에 감염된 세포가 포함되었는지 여부에 대한 판단을 기준으로, 본 발명에 따른 치료/예방을 위해 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 대상체는 상기 대상체가 CD30을 발현하거나 과발현하는 세포, 예를 들어, CD30-발현/과발현 암 세포를 포함하는지 여부에 대한 판단을 기준으로 본 발명에 따른 치료/예방을 위해 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 대상체에게 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포를 투여하기 전, 림프구 고갈 화학 요법이 시행된다.
다시 말해서, 일부 양태에서, 본 개시에 따라 질환/병태를 치료/예방하는 방법은, (i) 대상체에 림프구 고갈(lymphodepleting) 화학 요법을 시행하는 단계, 및 (ii) 추후에 본 발명에 따른 CAR을 발현하거나 포함하는, 또는 본 발명에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는 바이러스에 특이적인 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 '림프구 고갈 화학 요법'은 상기 치료가 시행되는 대상체 내에서 림프구(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 본연의 림프성 세포(ILC), 또는 이것의 전구체)의 고갈을 야기하는 화학요법적 제제로의 치료를 가리킨다. '림프구 고갈 화학요법적 제제'는 림프구 고갈을 야기하는 화학요법적 제제를 가리킨다.
입양 세포 전달에 의한 치료 방법에서 림프구 고갈 화학 요법 및 이의 용도는, 예를 들어, Klebanoff et al., Trends Immunol.(2005) 26(2):111-7 및 Muranski et al., Nat Clin Pract Oncol.(2006)(12):668-81에 기술되었고, 이들 두 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. 림프구 고갈 화학 요법의 목표는 수혜자 대상체의 내인성 림프구 집단을 고갈시키는 것이다.
면역 세포의 입양 전달에 의한 질병의 치료라는 맥락에서, 림프구 고갈 화학 요법은 전형적으로 입양 전달 세포를 투여받을 수혜자 대상체를 조절하기 위해, 입양 세포 전달 이전에 시행된다. 림프구 고갈 화학 요법은 예를 들어, 면역 억제성 사이토카인을 발현하는 세포의 제거를 통해 침투 환경을 형성함으로써, 그리고 입양 전달 림프성 세포의 팽창 및 활성을 위해 필요한 '림프성 공간'을 형성함으로써, 입양 전달 세포의 지속성 및 활성을 촉진하는 것으로 생각된다.
림프구 고갈 화학 요법에 보통 사용되는 화학요법적 제제에는 예를 들어, 플루다라빈, 사이클로포스파마이드, 베다무스틴 및 펜토스타틴이 포함된다.
본 발명의 측면 및 양태는 특히 플루다라빈 및/또는 사이클로포스파마이드의 투여를 포함하는 림프구 고갈 화학 요법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명에 따른 림프구 고갈 화학 요법은 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드의 투여를 포함한다.
플루다라빈은 리보뉴클레오타이드 환원효소 및 DNA 중합효소를 방해함으로써 DNA 합성을 억제하는 퓨린 유사체이다. 백혈병(특히 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 급성 림프구성 백혈병) 및 림프종(특히 비-호지킨 림프종)의 치료를 위한 화학 요법 제제로 종종 활용된다. 플루다라빈은 정맥내 또는 경구로 투여될 수 있다.
사이클로포스파마이드는 DNA 염기들 사이의 비가역 가닥내(intra-strand) 및 가닥간(inter-strand) 가교 결합을 유발하는 알킬화 제제이다. 이는 종종 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종을 비롯한 암의 치료를 위해 화학 요법 제제로 활용된다. 사이클로포스파마이드는 정맥내 또는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 림프구 고갈 화학 요법의 과정은 하나 이상의 화학요법적 제제의 다중 투여를 포함할 수 있다. 림프구 고갈 화학 요법의 과정은 본원에 기술된 용량으로, 본원에 기술된 일수 동안 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예시로서, 림프구 고갈 화학 요법은 3일 연속 1일 30mg/㎡의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계 및 3일 연속으로 1일 500mg/㎡의 용량으로 사이클로포스파마이드을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
림프구 고갈 화학 요법의 과정에 따라 화학 요법 제제의 최종 용량의 투여일은 림프구 고갈 화학 요법의 과정의 완료일로 간주될 수 있다.
일부 양태에서, 플루다라빈은 1일 5 내지 100mg/㎡의 용량으로, 예를 들어, 1일 15 내지 90mg/㎡, 1일 15 내지 80mg/㎡, 1일 15 내지 70mg/㎡, 1일 15 내지 60mg/㎡, 1일 15 내지 50mg/㎡, 1일 10 내지 40mg/㎡, 1일 5 내지 60mg/㎡, 1일 10 내지 60mg/㎡, 1일 15 내지 60mg/㎡, 1일 20 내지 60mg/㎡, 또는 1일 25 내지 60 mg/㎡ 중 하나의 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, 플루다라빈은 1일 20 내지 40mg/㎡, 예를 들어, 1일 25 내지 35mg/㎡, 예를 들어, 1일 약 30mg/㎡의 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 플루다라빈은 1일 초과 14일 미만 연속으로 상기 단락에 따른 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, 플루다라빈은 2 내지 14일, 예를 들어, 2 내지 13일, 2 내지 12일, 2 내지 11일, 2 내지 10일, 2 내지 9일, 2 내지 8일, 2 내지 7일, 2 내지 6일, 2 내지 5일 또는 2 내지 4일 연속 중 하나 동안 앞서 단락에 따른 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, 플루다라빈은 2 내지 6일 연속, 예를 들어, 2 내지 4일 연속, 예를 들어, 3일 연속, 앞서 단락에 따른 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 플루다라빈은 2 내지 6일 연속, 1일 15 내지 60mg/㎡의 용량으로, 예를 들어, 3일 연속, 1일 30mg/㎡의 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 사이클로포스파마이드는 1일 50 내지 1000mg/㎡, 예를 들어, 1일 100 내지 900mg/㎡, 1일 150 내지 850mg/㎡, 1일 200 내지 800mg/㎡, 1일 250 내지 750mg/㎡, 1일 300 내지 700mg/㎡, 1일 350 내지 650mg/㎡, 1일 400 내지 600mg/㎡, 또는 1일 450 내지 550mg/㎡의 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, 사이클로포스파마이드는 1일 400 내지 600mg/㎡, 예를 들어, 1일 450 내지 550mg/㎡, 예를 들어, 1일 약 500mg/㎡의 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 사이클로포스파마이드는 1일 초과 및 14일 미만 연속으로 상기 단락에 따른 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, 사이클로포스파마이드는 2 내지 14일, 예를 들어, 2 내지 13일, 2 내지 12일, 2 내지 11일, 2 내지 10일, 2 내지 9일, 2 내지 8일, 2 내지 7일, 2 내지 6일, 2 내지 5일 또는 2 내지 4일 연속, 앞서 단락에 따른 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, 사이클로포스파마이드는 2 내지 6일 연속, 예를 들어, 2 내지 4일 연속, 예를 들어, 3일 연속, 앞서 단락에 따른 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 사이클로포스파마이드는 2 내지 6일 연속, 1일 400 내지 600mg/㎡의 용량으로, 예를 들어, 3일 연속, 1일 500mg/㎡의 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 동시 투여는 예를 들면 두 가지 제제를 함유한 약제학적 조성물(즉, 조합된 제제로)로, 또는 하나 복용 후 바로 다음 것을 복용하는, 그리고 선택적으로 동일한 투여 경로를 통해, 예를 들어, 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관에 함께 투여를 가리킨다. 순차 투여는 제제들 중 하나를 투여 후 소정의 시간 간격을 두고 나머지 제제를 따로 투여하는 것을 가리킨다. 상기 제제들이 동일한 경로로 투여되어야 하는 것은 아니지만, 일부 양태에서, 동일 경로로 투여되기도 한다.
본 발명에 따른 림프구 고갈 화학 요법의 과정의 일부 양태에서, 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드는 같은 날 또는 여러 같은 날들에 투여된다. 예시로서, 3일 연속 1일 30mg/㎡의 용량으로 플루다라빈을 투여하는 단계 및 3일 연속 1일 500mg/㎡의 용량으로 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계를 포함하는 림프구 고갈 화학 요법의 과정의 예에서, 상기 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드 3일 연속 같은 날에 투여될 수 있다. 이와 같은 예에서, 림프구 고갈 화학 요법의 과정은 플루다라빈 및 사이클로포스파마이드가 상기 대상체에게 투여되는 3일 연속의 최종일에 완료된다고 이야기될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(또는 이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포가 림프구 고갈 화학 요법의 과정의 완료 후, 명시된 기간 내에 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포가 본원에 기술된 림프구 고갈 화학 요법 과정의 완료 후 1 내지 28일 이내, 예를 들어, 1 내지 21일, 1 내지 14일, 1 내지 7일, 2 내지 7일, 2 내지 5일, 또는 3 내지 5일 이내에 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포가 본원에 기술된 림프구 고갈 화학 요법의 과정의 종료 후, 2 내지 14일 이내에(예를 들어, 3 내지 5일 이내) 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포가 1×107 세포/㎡ 내지 1×109 세포/㎡, 예를 들어, 2×107 세포/㎡ 내지 1×109 세포/㎡, 2.5×107 세포/㎡ 내지 8×108 세포/㎡, 3×107 세포/㎡ 내지 6×108 세포/㎡, 또는 4×107 세포/㎡ 내지 4×108 세포/㎡ 중 하나의 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포가 4×107 세포/㎡, 1×108 세포/㎡ 또는 4×108 세포/㎡의 용량으로 투여된다.
본원에 기술된 CAR을 발현하거나 포함하는(이와 같은 CAR을 인코딩하는 핵산을 발현하거나 포함하는) 바이러스에 특이적인 면역 세포의 투여가 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 투여는 1 및 50ml의 부피로 이루어질 수 있고, 1 내지 10분에 걸쳐 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시에 따라 치료/예방되는 질병은 암이다.
암은 임의의 원치 않는 세포 증식(또는 원치 않는 세포 증식에 의해 스스로를 나타내는 임의의 질병), 신생물 또는 종양을 가리킬 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있고, 1차 또는 2차(전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있고, 임의의 조직에 위치할 수 있다. 상기 암은 예를 들어, 부신, 부신 수질, 항문, 충수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추신경계(뇌를 포함 또는 제외) 소뇌, 자궁경관, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피 세포(예를 들어, 신장 상피), 담낭, 식도, 교질 세포, 심장, 회장, 공장, 신장, 누선, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프아세포, 턱, 종격, 장간막, 자궁근, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 귀밑샘, 말초 신경계, 복막, 흉막, 전립선, 침선, S자 결장, 피부, 소장, 연조직, 비장, 위장, 고환, 흉선, 갑상선, 혀, 편도선, 기도, 자궁, 외음부, 및/또는 백혈구에서 유래된 조직/세포에서 생긴 것일 수 있다.
종양은 신경계 또는 비신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양은 중추 또는 말초 신경계, 예를 들어, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경 섬유종, 뇌실막 세포종, 신경초종(Schwannoma), 신경섬유 육종, 성상세포종 및 희소돌기아교세포종에서 기원할 수 있다. 비신경계 암/종양은 임의의 기타 비신경 조직에서 기원될 수 있는데, 예에는 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 피부 T 세포 림프종(CTCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 간세포암, 표피모양 암종, 전립선 암종, 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암종, NSCLC, 혈액 암 및 육종이 포함된다.
일부 양태에서, 상기 암은 고형암, 혈액암, 위암(예를 들어, 위암종, 위선암종, 위장선암종), 간암(간세포 암종, 담관암종), 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 세포 암종), 구강암(oral cavity cancer)(예를 들어, 구강인두암(예를 들어, 구강인두 암종), 구강암(oral cancer), 후두암, 비인두 암종, 식도암), 결장직장암(예를 들어, 결장직장 암종), 결장암, 결장 암종, 자궁경부 암종, 전립선암, 폐암(예를 들어, NSCLC, 소세포 폐암, 폐 선암, 편평폐세포 암종), 방광암, 요로상피암종, 피부암(예를 들어, 흑색종, 진전된 흑색종), 신장 세포암(예를 들어, 신장세포 암종), 난소암(예를 들어, 난소 암종), 중피종, 유방암, 뇌암(예를 들어, 교아종), 전립선암, 췌장암, 골수성 혈액 악성종양, 림프아구 혈액 악성종양, 골수형상이상 증후군(MDS), 급성 골수 백혈병(AML), 만성 골수 백혈병(CML), 급성 림프아구 백혈병(ALL), 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL), 흉선종 또는 다발성 골수종(MM)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 암은 상기 면역 세포에 특이적인 바이러스가 병리학적으로 시사하는 바가 있는 암이다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 암은 상기 바이러스의 감염에 의해 유발 또는 악화되는 암, 상기 바이러스의 감염이 위험 인자인 암, 및/또는 상기 바이러스의 감염이 상기 암의 시작, 발병, 진행, 중증도 또는 전이와 분명히 연관이 있는 암이다.
EBV 감염은 예를 들어, Jha et al., Front Microbiol.(2016) 7:1602에서 검토된 바와 같이, 여러 암에서 시사하는 바가 있고, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
일부 양태에서, 치료/예방되는 암은 EBV-관련 암이다. 일부 양태에서, 상기 암은 EBV의 감염에 의해 유발 또는 악화되는 암, EBV의 감염이 위험 인자인 암, 및/또는 EBV의 감염이 상기 암의 시작, 발병, 진행, 중증도 또는 전이와 분명히 연관이 있는 암이다. 상기 암은 EBV 감염을 특징으로 할 수 있고, 예를 들어, 상기 암은 EBV에 감염된 세포를 포함할 수 있다. 이와 같은 암은 EBV-양성 암으로 불릴 수 있다.
본 개시에 따라 치료/예방될 EBV-관련 암은 B 세포-관련 암, 예컨대 버킷 림프종, 이식 후 림프증식성 질병(PTLD), 중추신경계 림프종(CNS 림프종), 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 면역결핍과 관련된 EBV-관련 림프종(예를 들어, X-연결된 림프증식성 장애와 연관된 EBV-양성 림프종, HIV 감염/AIDS와 연관된 EBV-양성 림프종, 및 구강모 백반증), 및 상피 세포-관련 암, 예컨대 비인두 암종(NPC) 및 위암종(GC)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 암은 림프종(예를 들어, EBV-양성 림프종), 두경부 편평 세포 암종(HNSCC; 예를 들어, EBV-양성 HNSCC), 비인두 암종(NPC; 예를 들어, EBV-양성 NPC), 및 위암종(GC; 예를 들어, EBV-양성 GC)으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 암은 상기 CAR에 대한 표적 항원이 병리학적으로 시사하는 바가 있는 암이다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 암은 상기 표적 항원의 발현에 의해 유발 또는 악화되는 암, 상기 표적 항원의 암이 위험 인자인 암, 및/또는 상기 표적 항원의 발현이 상기 암의 시작, 발병, 진행, 중증도 또는 전이와 분명히 연관이 있는 암이다. 상기 암은 상기 표적 항원의 발현이 특징일 수 있고, 예를 들어, 상기 암은 상기 표적 항원을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 이와 같은 암은 표적 항원에 양성이라고 언급될 수 있다.
상기 표적 항원에 '양성'인 암은 상기 표적 항원을 발현하는 세포(예를 들어, 세포 표면에서)를 포함하는 암일 수 있다. 상기 표적 항원에 '양성'인 암은 상기 표적 항원을 발현할 수 있다. 상기 표적 항원의 과발현은 등가의 비암성 세포/비-종양 조직에 의한 발현 수준보다 높은 상기 표적 항원의 유전자 또는 단백질 발현의 수준의 검출에 의해 판단될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 표적 항원은 본원에 기술된 암 세포 항원이다. 일부 양태에서, 상기 표적 항원은 CD30이다.
일부 양태에서, 상기 암은 CD30이 병리학적으로 시사하는 바가 있는 암이다. 다시 말해서, 일부 양태에서, 상기 암은 CD30 발현에 의해 유발 또는 악화되는 암, CD30의 발현이 위험 인자인 암, 및/또는 CD30의 발현이 상기 암의 시작, 발병, 진행, 중증도 또는 전이와 분명히 연관이 있는 암이다. 상기 암은 CD30 발현이 특징일 수 있고, 예를 들어, 상기 암은 CD30을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 이와 같은 암은 CD30-양성 암이라 불릴 수 있다.
CD30-양성 암은 CD30을 발현하는 세포를 포함하는 암(예를 들어, 세포 표면에서 CD30을 발현하는 세포 단백질)이다. CD30-양성 암은 CD30을 과발현할 수 있다. CD30의 과발현은 등가의 비암성 세포/비-종양 조직에 의한 발현의 수준보다 높은 CD30의 유전자 또는 단백질 발현의 수준의 검출에 의해 판단될 수 있다.
CD30-양성 암은 예를 들어, van der Weyden et al., Blood Caner Journal (2017) 7:e603 and Muta and Podack, Immunol Res (2013), 57(1-3):151-8에 기술되었고, 상기 두 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다. CD30은 활성화된 T 및 B 림프구의 작은 소집합 상에, 그리고 다양한 림프성 신생물, 예컨대 고전적인 호지킨 림프종 및 역형성 거대 세포 림프종에 의해 발현된다. 가변적 CD30의 발현이 또한 말초 T 세포 림프종의 경우 나타난 바 있고, 달리 명시되지 않는 한(PTCL-NOS), 성인 T 세포 백혈병/림프종, 피부 T 세포 림프종(CTCL), 결절외 NK-T 세포 림프종, 다양한 B 세포 비-호지킨 림프종(예컨대 미만성 거대 B 세포 림프종, 특히 EBV-양성 미만성 거대 B 세포 림프종), 및 진전된 전신 비만세포증의 경우에 나타난 바 있다. CD30 발현은 또한 일부 비-조혈성 악성종양, 예컨대 생식 세포 종양 및 고환 배아 암종에서 관찰된 바 있다.
상기 막관통 당단백질 CD30은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(Falini et al., Blood (1995) 85(1):1-14)의 구성원이다. 상기 TNF/TNF-수용체(TNF-R) 슈퍼패밀리의 구성원들은 다양한 수준에서 면역 반응을 조율하고, CD30은 정상적인 림프성 세포의 기능 또는 증식을 조절하는 데 역할을 한다. CD30은 본래 단클론 항체, Ki-1에 의해 인식된 항원으로 기술되었는데, 이는 HL-유래 세포주, L428(Muta and Podack, Immunol Res(2013) 57: 151-158)로 마우스를 면역화함으로써 길러졌다. CD30 항원 발현이 호지킨 질병에서 ALCL 및 Reed-Sternberg 세포를 식별하기 위해 사용된 바 있다 (Falini et al., Blood(1995) 85(1):1-14). 림프종 악성 세포에서 광범위하게 발현하면서, CD30은 따라서 항체-기반 면역요법 및 세포 요법 모두를 발전시키기 위한 잠재적 표적이다. 중요한 점은 CD30이 전형적으로 생리적 조건 하의 정상적 조직에서 발현되지 않는다는 점이고, 따라서, 휴지기 성숙 또는 전구체 B 또는 T 세포 상에 부재한다는 점이 주목할 만하다 (Younes and Ansell, Semin Hematol(2016) 53: 186-189). CD30을 표적으로 삼는 항체-약물 접합체인 브렌툭시맙 베도틴이 초기에 CD30-양성 HL의 치료를 위해 승인받았다 (아드세트리스® US Package Insert 2018). 브렌툭시맙 베도틴 실험의 데이터는, 비록 CD30의 사용과 연관된 독성에 대한 우려가 있지만, CD30-양성 림프종의 치료를 위한 치료차원의 표적으로서 CD30을 뒷받침한다.
호지킨 림프종(HL)은 림프절과 림프계를 수반하는 흔치 않은 종양이다. HL의 발병율은 이원화되어 있어서, 15 및 30세 사이에 가장 많은 환자가 진단받고, 이어서 55세 이후의 성인에서 또 다른 피크를 나타낸다. 2019년, 미국에서 새로운 사례가 8,110건(여성 3,540명 남성 4570명), 그리고 이 질병으로 인한 사망이 1,000건(여성 410명 및 남성 590명)에 이를 것으로 추산된다 (미국 암 협회 2019). 국립 암 연구서의 SEER 데이터베이스의 2012년 내지 2016년 사례를 보면, 미국에서 소아 HL 환자의 경우 HL의 발병률이 다음과 같다: 10만명당 1세 내지 4세: 0.1; 5세 내지 9세: 0.3; 10세 내지 14세: 1.3; 15세 내지 19세: 3.3(SEER 암 통계 검토서, 1975-2016]). 세계보건기구(WHO)의 분류는 HL을 2가지 주요 유형으로 나눈다: 고전적 호지킨 림프종(cHL) 및 결절성 림프구-지배형 호지킨 림프종(NLPHL). 서구 사회에서, cHL이 총 HL의 95%를 차지하고 NLPHL이 5%를 차지한다 (국립 종합 암 네트워크 가이드라인 2019).
후기 질병을 가진 cHL 환자를 위해 가장 중요한 화학 요법은 치유율의 70% 내지 75%와 연관이 있다 (Karantanos et al., Blood Lymphat Cancer (2017) 7:37-52). 구조(Salvage) 화학 요법과, 이어서 자가유래 줄기 세포 이식물(Autologous Stem Cell Transplant)(ASCT)이 보통 1차 요법 후 재발한 환자에게 사용된다. 불행하게도, cHL 환자의 최대 50%가 ASCT 후 질병 재발을 경험한다. ASCT 후 재발한 환자의 평균 전반적인 생존기간은 대략 2년이다 (Alinari Blood (2016) 127:287-295). 공격적인 병용 화학 요법임에도 불구하고, 환자의 10% 내지 40%가 구조(Salvage) 화학 요법에 반응을 달성하지 못하고, 비응답자에서의 ASCT를 뒷받침할 무작위 임상실험 데이터가 존재하지 않는다. 구조(Salvage) 화학 요법에 반응하지 않고, ASCT 후 재발하거나 또는 이와 같은 접근 방법에 후보자가 아닌 환자의 경우, 예후가 계속 심각할 것이기 때문에 새로운 치료 방법이 조속히 요구된다 (Keudell British Journal of Haematology (2019) 184:105-112).
소아 집단(어린이, 청소년, 청장년)의 대다수가 현재 사용가능한 요법으로 치유되는 반면, 적은 비율의 환자가 난치성 또는 재발성 질병을 가질 수 있어서 효능 혜택이 개선된 허용되는 안전 프로파일을 가진 새로운 치료법이 요구된다 (Flerlage et al., Blood (2018) 132: 376-384; Kelly, Blood (2015) 126: 2452-2458; McClain and Kamdar, in UpToDate 2019; Moskowitz, ASCO Educational Book (2019) 477-486). 유년시절 동안 고용량 화학 요법으로 치료받은 HL 환자는 보통 제2 악성 신생물 뿐만 아니라 심장, 폐, 생식선, 및 내분비 독성과 같은 치료와 관련된 장기 후유증을 경험한다 (Castellino et al., Blood (2011) 117(6): 1806-1816).
일부 양태에서, CD30-양성 암은 고형암, 혈액암, 조혈종양, 호지킨 림프종(HL), 역형성 거대 세포 림프종(ALCL), ALK-양성 역형성 T 세포 림프종, ALK-음성 역형성 T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종(예를 들어, PTCL-NOS), T 세포 백혈병, T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종(CTCL), NK-T 세포 림프종(예를 들어, 결절외 NK-T 세포 림프종), 비-호지킨 림프종(NHL), B 세포 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(예를 들어, 미만성 거대 B 세포 림프종-NOS), 원발성 종격동 B 세포 림프종, EBV-양성 B 세포 림프종, EBV-양성 미만성 거대 B 세포 림프종, 진행성 전신 비만세포증, 생식 세포 종양 및 고환 배아 암종으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 암은 CD30-양성 암, EBV-관련 암, 혈액암, 골수성 혈액 악성종양, 조혈종양 림프아구 혈액 종양, 골수이형성 증후군, 백혈병, T 세포 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 급성 림프아구 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, B 세포 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종, EBV-관련 림프종, EBV-양성 B 세포 림프종, EBV-양성 미만성 거대 B 세포 림프종, X-연결 림프증식성 장애와 연관된 EBV-양성 림프종, HIV 감염/AIDS와 연관된 EBV-양성 림프종, 구강모 백반증, 버킷 림프종, 이식후 림프증식성 질병, 중추신경계 림프종, 역형성 거대 세포 림프종, T 세포 림프종, ALK-양성 역형성 T 세포 림프종, ALK-음성 역형성 T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종, NK-T 세포 림프종, 결절외 NK-T 세포 림프종, 흉선종, 다발성 골수종, 고형암, 상피세포암, 위암, 위암종, 위선암종, 위장선암종, 간암, 간세포 암종, 담관암종, 두경부암, 두경부 편평 세포 암종, 구강암(oral cavity cancer), 구강인두암, 구강인두 암종, 구강암(oral cancer), 후두암, 비인두 암종, 식도암, 결장직장암, 결장직장 암종, 대장암, 결장 암종, 자궁경부 암종, 전립선암, 폐암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐 선암, 편평 폐 세포 암종, 방광암, 요로상피암종, 피부암, 흑색종, 진행성 흑색종, 신장세포암, 신장세포 암종, 난소암, 난소 암종, 중피종, 유방암, 뇌암, 교아종, 전립선암, 췌장암, 비만세포증, 진행성 전신 비만세포증, 생식 세포 종양 또는 고환 배아 암종으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 암은 재발성 암일 수 있다. 본원에 사용되는 '재발성' 암은 치료(예를 들어, 상기 암에 가장 중요한 치료법)에 반응했으나, 예를 들어, 얼마 동안 차도가 있은 후, 추후에 재등장, 진행된 암을 가리킨다. 예를 들면, 재발성 암은 이의 성장/진행이 치료(예를 들어, 상기 암에 가장 중요한 치료법)에 의해 억제되었으나, 추후에 성장하고 진행된 암일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 암은 난치성 암일 수 있다. 본원에 사용되는 '난치성' 암은 치료(예를 들어, 상기 암에 가장 중요한 치료법)에 반응하지 않는 암을 가리킨다. 예를 들면, 난치성 암은 이의 성장/진행이 치료(예를 들어, 상기 암에 가장 중요한 치료법)에 의해 억제되지 않는 암일 수 있다. 일부 양태에서, 난치성 암은 상기 암에 대한 치료를 받은 대상체가 상기 치료에 부분적 또는 온전한 반응을 보이지 않는 암일 수 있다.
상기 암이 역형성 거대 세포 림프종인 양태에서, 상기 암은 화학 요법인, 브렌툭시맙 베도틴, 또는 크리조티닙과 관련하여, 재발성 또는 난치성일 수 있다. 상기 암이 말초 T 세포 림프종인 양태에서, 상기 암은 화학 요법, 즉 브렌툭시맙 베도틴으로의 치료와 관련하여 재발성 또는 난치성일 수 있다. 상기 암이 림프절외 NK-T 세포 림프종인 양태에서, 상기 암은 화학 요법(아스파라기나아제의 존재 또는 부재하에) 즉 브렌툭시맙 베도틴으로의 치료와 관련하여, 재발성 또는 난치성일 수 있다. 상기 암이 미만성 거대 B 세포 림프종인 양태에서, 상기 암은 화학 요법(리툭시맙의 존재 또는 부재하에) 즉 CD19 CAR-T 요법으로의 치료와 관련하여, 재발성 또는 난치성일 수 있다. 상기 암이 원발성 종격동 B 세포 림프종인 양태에서, 상기 암은 화학 요법, 면역 검문 억제제(예를 들어, PD-1 억제제) 또는 CD19 CAR-T 요법으로의 치료와 관련하여, 재발성 또는 난치성일 수 있다.
본 발명의 치료에 다른 암의 치료는, 상기 대상체에서 암 세포의 수 감소, 상기 대상체에서 암성 종양/병변의 크기 감소, 상기 대상체에서 암 세포의 성장 억제(예를 들어, 방지 또는 늦추기), 상기 대상체에서 암성 종양/병변의 성장 억제(예를 들어, 방지 또는 늦추기), 암의 발병/진행(예를 들어, 말기로 진행, 또는 전이)를 억제(예를 들어, 방지 또는 늦추기),상기 대상체에서 암의 증상의 중등도를 감소, 상기 대상체의 생존(예를 들어, 무-진행 생존 또는 전반적 생존)의 증가, 상기 대상체에서 암 세포의 수 또는 활성의 연관성 감소, 및/또는 상기 대상체에서 암 부담의 감소와 같은 치료 효과 중 하나를 달성한다.
대상체는 치료에 대한 그들의 반응을 판단하기 위해 반응 평가에 대한 기준 개정판: The Lugano 분류(Revised Criteria for Response Assessment: The Lugano Classification)(예를 들어, Cheson et al., J Clin Oncol(2014) 32: 3059-3068에 기술되었고, 앞서 참조로 편입됨)에 따라 평가될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 따른 대상체의 치료는, 완전한 반응, 부분적 반응, 또는 안정적 질병 중 하나를 달성한다.
일부 양태에서, 암의 치료는 추가로 화학 요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다.
화학 요법 및 방사선 요법은 각각 약물로 또는 이온화된 방사선(예를 들어, X-선 또는 γ-선을 이용한 방사선 요법)으로 암을 치료하는 것을 가리킨다. 상기 약물은 화학적 독립체, 예를 들어, 소분자 약제, 항생제, DNA 삽입제, 단백질 억제제(예를 들어, 키나아제 억제제), 또는 생물학 제제, 예를 들어, 항체, 항체 절편, 압타머, 핵산(예를 들어, DNA, RNA), 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질일 수 있다. 상기 약물은 약제학적 조성물 또는 의약품으로 제형화될 수도 있다. 상기 제형은 하나 이상의 약물(예를 들어, 하나 이상의 활성 제제)을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 포함할 수 있다.
화학 요법은 하나 이상의 약물의 투여를 수반할 수 있다. 약물은 단독으로 투여되거나 또는 치료 대상 질환에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료법과 병행하여 투여될 수 있다.
상기 화학 요법은 하나 이상의 투여 경로, 예를 들어, 복부내, 정맥내 주사, 경구, 피하, 피내 또는 종양내로 투여될 수 있다.
상기 화학 요법은 치료 요법에 따라 투여될 수 있다. 상기 치료 요법은 내과의 또는 의료진에 의해 준비될 수 있는, 소정의 화학 요법 투여의 시간표, 계획, 기획, 일정일 수 있고, 치료가 필요한 환자에 맞게 조정될 수도 있다. 상기 치료 요법은 하기 중 하나 이상을 가리킬 수도 있다: 상기 환자에게 투여할 화학 요법의 유형; 각각의 약물 또는 방사선의 용량; 투여간 시간 간격; 각 치료의 기간; 임의의 치료 휴지기(있다면)의 수 및 성격 등. 병행-요법의 경우, 각각의 약물이 어떻게 투여될 것인지를 보여주는 단일 치료 요법이 제공될 것이다.
화학요법 약물은, 아베마시클립, 아비라테론 아세테이트, 아비트렉세이트(메토트렉세이트), 아브락산(파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제형), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, 아칼라브루티닙, AC-T, 아드세트리스(브렌툭시맙 베도틴), ADE, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 아드리아마이신(독소루비신 하이드로클로라이드), 아파티닙 디말레에이트, 아피니토르(에베로리무스), 아킨제오(네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알다라(이미퀴모드), 알데슬레우킨, 알렉센사(알렉티닙), 알렉티닙, 알렘투주맙, 알림타(페메트렉스드 디소듐), 알리코파(코판리십 하이드로클로라이드), 주사용 알케란(멜팔란 하이드로클로라이드), 알케란 정제(멜팔란), 알록시(팔로노세트론 하이드로클로라이드), 알룬브리그(브리가티닙), 암보클로린(클로람부실), 암보클로린(클로람부실), 아미포스틴, 아미노레불린산, 아나스트로졸, 아프레피탄트, 아레디아(파미드로네이트 디소듐), 아리미덱스(아나스트로졸), 아로마신(엑세메스탄), 아르라논(넬라라빈), 삼산화비소, 아르제르라(오프투무맙), 아스파라기나아제 에르위니아 크리산테미, 아테졸리주맙, 아바스틴(베바시주맙), 아벨루맙, 악시캅타겐 실로류셀, 악시티닙, 아자시티딘, 바벤시오(아벨루맙), BEACOPP, 베세눔(카르무스틴), 벨레오다크(벨리노스타트), 벨리노스타트, 벤다무스틴 하이드로클로라이드, BEP, 베스폰사(이노투주맙 오조가마이신), 베바시주맙, 벡사로텐, 벡사르(토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙), 비칼루타마이드, BiCNU(카르무스틴), 블레오마이신, 블리나투모맙, 블린사이토(블리나투모맙), 보르테조밉, 보술리프(보수티닙), 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리가티닙, BuMel, 부술판, 부술펙스(부술판), 카바지탁셀, 카보메틱스(카보잔티닙-S-말레이트), 카보잔티닙-S-말레이트, CAF, 칼큐엔스(아칼라브루티닙), 캄파스(알렘투주맙), 캄프토사르(이리노테칸 하이드로클로라이드), 카페시타빈, CAPOX, 카락(플루오로우라실-토피칼), 카르보플라틴, 카르보플라틴-탁솔, 카르필조밉, 카르무브리스(카르무스틴), 카르무스틴, 카르무스틴 이식물, 카소덱스(비칼루타마이드), CEM, 세리티닙, 세루비딘(다우노루비신 하이드로클로라이드), 세르바릭스(재조합 HPV 2가 백신), 세툭시맙, CEV, 클로람부실, 클로람부실-프레드니손, CHOP, 시스플라틴, 클라드리빈, 클라펜(사이클로포스파마이드), 클로파라빈, 클로파렉스(클로파라빈), 클로라르(클로파라빈), CMF, 코비메티닙, 코메트리크(카보잔티닙-S-말레이트), 코판리십 하이드로클로라이드, COPDAC, COPP, COPP-ABV, 코스메겐(닥티노마이신), 코텔릭(코비메티닙), 크리조티닙, CVP, 사이클로포스파마이드, 시포스(이포스파미드), 시람자(라무시루맙), 시타라빈, 시타라빈 리포솜, 시토사르-U(시타라빈), 사이톡산(사이클로포스파마이드), 다브라페닙, 다카르바진, 다코겐(데시타빈), 닥티노마이신, 다라투무맙, 다르잘렉스(다라투무맙), 다사티닙, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 하이드로클로라이드 및 시타라빈 리포솜, 데시타빈, 데피브로타이드 소듐, 데피텔리오(데피브로타이드 소듐), 데가렐릭스, 데니류킨 디프티톡스, 데노수맙, DepoCyt(시타라빈 리포솜), 덱사메타손, 덱스라족산 하이드로클로라이드, 디누툭시맙, 도세탁셀, 독실(독소루비신 하이드로클로라이드 리포솜), 독소루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드 리포솜, Dox-SL(독소루비신 하이드로클로라이드 리포솜), DTIC-Dome(다카르바진), 두르발루맙, 에푸덱스(플루오로우라실-토피칼), 엘리텍(라스부리카아제), 엘렌스(에피루비신 하이드로클로라이드), 엘로투주맙, 엘록사틴(옥살리플라틴), 엘트롬보파그 올라민, 에멘드(아프레피탄트), 엠플리시티(엘로투주맙), 에나시데닙 메실레이트, 엔자루타마이드, 에피루비신 하이드로클로라이드, EPOCH, 에르비툭스(세툭시맙), 에리불린 메실레이트, 에리벳지(비스모데깁), 에를로티닙 하이드로클로라이드, 에르위나아제(아스파라기나아제 에르위니아 크리산테미), 에티올(아미포스틴), 에토포포스(에토포사이드 포스페이트), 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 에바셋(독소루비신 하이드로클로라이드 리포솜), 에베로리무스, 에비스타(라록시펜 하이드로클로라이드), 에보멜라(멜팔란 하이드로클로라이드), 엑세메스탄, 5-FU(플루오로우라실 주사), 5-FU(플루오로우라실-토피칼), 파레스톤(토레미펜), 파리닥(파노비노스탓), 파스로덱스(풀베스트란트), FEC, 페마라(레트로졸), 필그라스팀, 플루다라(플루다라빈 포스페이트), 플루다라빈 포스페이트, 플루오로플렉스(플루오로우라실-토피칼), 플루오로우라실 주사, 플루오로우라실-토피칼, 플루타마이드, 폴렉스(메토트렉세이트), 폴렉스 PFS(메토트렉세이트), 폴피리, 폴피리-베바시주맙, 폴피리-세툭시맙, 폴피리녹스, 폴폭스, 폴로틴(프랄라트렉세이트), FU-LV, 풀베스트란트, 가다실(재조합 HPV 4가 백신), 가다실 9(재조합 HPV 9가 백신), 가지바(오비누투주맙), 겔피티닙, 겜시타빈 하이드로클로라이드, 겜시타빈-시스플라틴, 겜시타빈-옥살리플라틴, 겜투주맙 오조가마이신, 겜자르(겜시타빈 하이드로클로라이드), 길로트리프(아파티닙 디말레에이트), 글리벡(이마티닙 메실레이트), 글리아델(카르무스틴 이식물), 글리아델 웨이퍼(카르무스틴 이식물), 글루카피다아제, 고세렐린 아세테이트, 할라벤(에리불린 메실레이트), 헤만게올(프로프라놀롤 하이드로클로라이드), 헤르셉틴(트라스투주맙), HPV 2가 백신, 재조합, HPV 9가 백신, 재조합, HPV 4가 백신, 재조합, 하이캄틴(토포테칸 하이드로클로라이드), 하이드레아(하이드록시우레아), 하이드록시우레아, 하이퍼-CVAD, 아이브란스(팔보시클립), 아이브리투모맙 티우세탄, 아이브루티닙, ICE, 아클루식(포나티닙 하이드로클로라이드), 아이다마이신(아이다루비신 하이드로클로라이드), 아이다루비신 하이드로클로라이드, 아이델라리십, 아이드히파(에나시데닙 메실레이트), 아이펙스(이포스파미드), 이포스파미드, 아이포스파미둠(이포스파미드), IL-2(알데슬레우킨), 이마티닙 메실레이트, 임브루비카(아이브루티닙), 임핀지(두르발루맙), 이미퀴모드, 아임라이직(탈리모겐 라헤르파렙벡), 인라이타(악시티닙), 이노투주맙 오조가마이신, 인터페론 알파-2b, 재조합, 인터루킨-2(알데슬레우킨), 인트론 A(재조합 인터페론 알파-2b), 요오드 I 131 토시투모맙 및 토시투모맙, 아이필리무맙, 아이레사(겔피티닙), 이리노테칸 하이드로클로라이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드 리포솜, 아이스토닥스(로미뎁신), 아이사베필론, 아이사조밉 시트레이트, 아이셈프라(아이사베필론), 자카피(룩소리티닙 포스페이트), JEB, 제브타나(카바지탁셀), 카드실라(아도-트라스투주맙 엠탄신), 케옥시펜(랄옥시펜 하이드로클로라이드), 케피반스(팔리페르민), 케이트루다 (펨브로리주맙), 키스콸리(리보시클립), 킴리아(티사겐렉류셀), 키프롤리스(카르필조밉), 란레오타이드 아세테이트, 라파티닙 디토실레이트, 라트루보(올라라투맙), 레날리도마이드, 렌바티닙 메실레이트, 렌비마(렌바티닙 메실레이트), 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류커란(클로람부실), 류프롤라이드 아세테이트, 류스타틴(클라드리빈), 레불란(아미노레불린산), 린폴리진(클로람부실), 리포독스(독소루비신 하이드로클로라이드 리포솜), 로무스틴, 론서프(트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드), 루프론(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-페드(류프롤라이드 아세테이트), 린파자(올라파립), 마퀴보(빈크리스틴 설페이트 리포솜), 마툴란(프로카바진 하이드로클로라이드), 메클로레타민 하이드로클로라이드, 메게스트롤 아세테이트, 메키니스트(트라메티닙), 멜팔란, 멜팔란 하이드로클로라이드, 메르캅토퓨린, 메스나, 메스넥스(메스나), 메타졸라스톤(테모졸로마이드), 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 LPF(메토트렉세이트), 메틸날트렉손 브로마이드, 멕세이트(메토트렉세이트), 멕세이트-AQ(메토트렉세이트), 미도스타우린, 미토마이신 C, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 미토자이트렉스(미토마이신 C), MOPP, 모조빌(플레릭사포르), 무스타겐(메클로레타민 하이드로클로라이드), 무타마이신(미토마이신 C), 마일레란(부술판), 마일로사(아자시티딘), 마일로타그(겜투주맙 오조가마이신), 나노입자 파클리탁셀(파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제형), 나벨빈(비노렐빈 타트레이트), 네시투무맙, 넬라라빈, 네오사(사이클로포스파마이드), 네라티닙 말레에이트, 네르린크스(네라티닙 말레에이트), 네투피탄트 및 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 네우라스타(페그필그라스팀), 네우포겐(필그라스팀), 넥사바(소라페닙 토실레이트), 닐란드론(닐루타마이드), 닐로티닙, 닐루타마이드, 닌라로(아이사조밉 시트레이트), 니라파립 토실레이트 일수화물, 니볼루맙, 놀바덱스(타목시펜 시트레이트), 엔플레이트(로미플로스팀), 오비누투주맙, 오돔조(소니데깁), OEPA, 오프투무맙, OFF, 올라파립, 올라라투맙, 오마세탁신 메페숙시네이트, 온카스파(페가스파가아제), 온단세트론 하이드로클로라이드, 오니바이드(이리노테칸 하이드로클로라이드 리포솜), 온탁(데니류킨 디프티톡스), 옵디보(니볼루맙), OPPA, 오시머티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화 나노입자 제형, PAD, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔로노세트론 하이드로클로라이드, 팔로노세트론 하이드로클로라이드 및 네투피탄트, 파미드로네이트 디소듐, 파니투무맙, 파노비노스탓, 파라플랏(카르보플라틴), 파라플라틴(카르보플라틴), 파조파닙 하이드로클로라이드, PCV, PEB, 페가스파가아제, 펙필그라스팀, 펙인터페론 알파-2b, 펙-인트론(펙인터페론 알파-2b), 펨브로리주맙, 페메트렉스드 디소듐, 퍼제타(퍼투주맙), 퍼투주맙, 플라티놀(시스플라틴), 플라티놀-AQ(시스플라틴), 플레릭사포르, 포말리도마이드, 포말리스트(포말리도마이드), 포나티닙 하이드로클로라이드, 포르트라자(네시투무맙), 프랄라트렉세이트, 프레드니손, 프로카바진 하이드로클로라이드, 프로류킨(알데슬레우킨), 프롤리아(데노수맙), 프로막타(엘트롬보파그 올라민), 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 프로벤지(시풀류셀-T), 푸리네톨(메르캅토퓨린), 푸릭산(메르캅토퓨린), 라듐 223 디클로라이드, 랄옥시펜 하이드로클로라이드, 라무시루맙, 라스부리카아제, R-CHOP, R-CVP, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 2가 백신, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 9가 백신, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 4가 백신, 재조합 인터페론 알파-2b, 레고라페닙, 레리스토(메틸날트렉손 브로마이드), R-EPOCH, 레브리미드(레날리도마이드), 류마트렉스(메토트렉세이트), 리보시클립, R-ICE, 리툭산(리툭시맙), 리툭산 하이셀라(리툭시맙 및 히알루로니다아제 인간), 리툭시맙, 리툭시맙 및 히알루로니다아제 인간, 로라피탄트 하이드로클로라이드, 로미뎁신, 로미플로스팀, 루비도마이신(다우노루비신 하이드로클로라이드), 루브라카(루카파립 캄실레이트), 루카파립 캄실레이트, 룩소리티닙 포스페이트, 라이답트(미도스타우린), 스클레오솔 흉막내 에어로졸(활석), 실툭시맙, 시풀류셀-T, 소마툴린 데포(란레오타이드 아세테이트), 소니데깁, 소라페닙 토실레이트, 스프라이셀(다사티닙), 스탠포드 V, 살균 활석 분말(활석), 스테리활석(활석), 스티바가(레고라페닙), 수니티닙 말레이트, 수텐트(수니티닙 말레이트), 실라트론(펙인터페론 알파-2b), 실반트(실툭시맙), 신리보(오마세탁신 메페숙시네이트), 타블로이드(티오구아닌), TAC, 타핀라(다브라페닙), 타그리소(오시머티닙), 활석, 탈리모겐 라헤르파렙벡, 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS(시타라빈), 타세바(에를로티닙 하이드로클로라이드), 타르그레틴(벡사로텐), 타시그나(닐로티닙), 탁솔(파클리탁셀), 탁소테레(도세탁셀), 테센트리크(아테졸리주맙), 테모다 (테모졸로마이드), 테모졸로마이드, 템시로리무스, 탈리도마이드, 탈로미드(탈리도마이드), 티오구아닌, 티오테파, 티사겐렉류셀, 토락(플루오로우라실-토피칼), 토포테칸 하이드로클로라이드, 토레미펜, 토리셀(템시로리무스), 토시투모맙 및 요오드 I 131 토시투모맙, 토텍트(덱스라족산 하이드로클로라이드), TPF, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레안다 (벤다무스틴 하이드로클로라이드), 트리플루리딘 및 티피라실 하이드로클로라이드, 트리세녹스(삼산화비소), 타이커브(라파티닙 디토실레이트), 우니툭신(디누툭시맙), 우리딘 트리아세테이트, VAC, 발루비신, 발스타(발루비신), 반데타닙, VAMP, 바루비(로라피탄트 하이드로클로라이드), 벡티빅스(파니투무맙), VeIP, 벨반(빈블라스틴 설페이트), 벨케이드(보르테조밉), 벨사(빈블라스틴 설페이트), 베무라페닙, 벤클렉스타(베네토클락스), 베네토클락스, 베르제니오(아베마시클립), 비아두(류프롤라이드 아세테이트), 비다자(아자시티딘), 빈블라스틴 설페이트, 반카사 PFS(빈크리스틴 설페이트), 빈크리스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 리포솜, 비노렐빈 타트레이트, VIP, 비스모데깁, 비스토가드(우리딘 트리아세테이트), 보락사제(글루카피다아제), 보리노스탓, 보트리엔트(파조파닙 하이드로클로라이드), 빅세오스(다우노루비신 하이드로클로라이드 및 시타라빈 리포솜), 웰코보린(류코보린 칼슘), 살코리(크리조티닙), 셀로다 (카페시타빈), 셀리리, 셀록스, 엑스게바(데노수맙), 엑소피고(라듐 223 디클로라이드), 엑스탄디(엔자루타마이드), 예르보이(아이필리무맙), 예스카타(악시캅타겐 칠로류셀), 욘델리스(트라벡테딘), 잘트랍(Ziv-아플리베르셉트), 자르시오(필그라스팀), 제줄라(니라파립 토실레이트 일수화물), 젤보라프(베무라페닙), 제발린(아이브리투모맙 티우세탄), 지네카드(덱스라족산 하이드로클로라이드), Ziv-아플리베르셉트, 조프란(온단세트론 하이드로클로라이드), 졸라덱스(고세렐린 아세테이트), 졸레드론산, 졸린자(보리노스탓), 조메타(졸레드론산), 자이델리그(아이델라리십), 자이카디아(세리티닙) 및 자이티가(아비라테론 아세테이트)로부터 선택될 수 있다.
EBV-감염은 또한 다양한 자가면역 질병, 예컨대 다발성 경화증, 및 전신성 홍반성 낭창(SLE; 예를 들어, Ascherio and Munger Curr Top Microbiol Immunol.(2015);390(Pt 1):365-85 참조)의 발병/진행에 시사하는 바가 있고, EBV 항원 EBNA2는 최근 SLE, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 궤양성대장염, 1형 당뇨병, 소아특발성 관절염 및 셀리악병(Harley et al., Nat Genet.(2018) 50(5): 699-707)의 발병에 대한 위험 인자로서 시사점이 있는 유전 부위와 연관이 있음이 보여진 바 있다.
이에 따라, 일부 양태에서, 본 개시에 따라 치료/예방되는 질환/병태는 자가면역 질병, SLE, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 궤양성대장염, 1형 당뇨병, 소아특발성 관절염 및 셀리악병으로부터 선택된다.
본 발명의 측면 및 양태는 하나 이상의 비-동일성 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 CAR을 포함하는 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포에 관한 것이다. 일부 양태에서, CD30에 특이적인 CAR을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포는 CD30 이외의 항원에 특이적인 CAR을 포함한다. 예를 들면, 본원의 실시예 4는 CD30-특이적 CAR 및 CD19-특이적 CAR을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포를 기술한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따라 치료/예방되는 암은 하나 이상의 비-동일성 표적 항원들을 발현하는 세포를 포함하는 암이다. 일부 양태에서, 상기 암은 비-동일성 표적 항원들 각각 두 가지를 발현하는 암이다.
동종반응성 면역 반응의 치료/예방에 관한 적용
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은, 예를 들어, 대상체에서 질환/병태를 치료/예방하기 위한, 동종이식을 수반하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종반응성 면역 반응(특히, T 세포-매개 동종반응성 면역 반응) 및 이의 해로운 서열을 감소/방지하기 위한 방법에 유용하다.
동종반응성 T-세포는 CD30을 발현한다. Chan et al., J Immunol(2002) 169(4):1784-91은 CD30-발현 T 세포를 CD30 동종면역 반응에서 중요한 역할을 하는 활성화된 T 세포(또한 CD25 및 CD45RO를 발현함)의 하위집합으로 식별한다. CD30 발현 및 CD30-발현 T 세포의 증식은 동종항원에 대한 반응으로 증가한다. Chen et al., Blood (2012) 120(3):691-6은 CD8+ T 세포 하위집합 상에서의 CD30 발현을 GVHD에 대한 잠재적 생물 표지자로서 인식하고, CD30을 GVHD에 대한 치료차원의 표적으로 제안한다.
바이러스-특이적 T 세포는 더 나아가 다클론성 활성화된 T 세포(ATC)보다 더 제한적인 TCR 레퍼토리를 갖기 때문에, 동종이계 대상체에게 투여 후 GVHD를 유발할 가능성이 낮다. 이는 동종이계 EBV-특이적 T 세포(EBVST)의 연구에서 GVHD의 낮은 발병율에 의해 뒷받침된다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종이식을 수반하는 방법에서, 그리고 동종이식편의 처리/생산에서 특히 유용하다.
특히, 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종이계 재료의 투여를 포함하는 치료적 및 예방적 방법에 사용하기 위한 '기성규격품' 재료의 생산 및 투여에 사용하기 위해 고안되었다.
앞서 설명된 바와 같이, 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포는 입양 세포 전달에 의한 질환/병태의 치료/예방에 유용하다. 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포는 입양 전달 후 수혜자의 T 세포-매개 동종반응성 면역 반응에 덜 민감하기 때문에, 전달 후 수혜자에게서 증식/생존의 향상을 보이고, 더 뛰어난 치료적/예방적 효과를 보인다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 또한 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 이외의 동종이계 세포의 동종이식을 포함하는 방법에서 유용하다. 특히, 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종이식편(세포, 조직 및 기관의 집단) 및 대상체에서 동종반응성 면역 세포(예를 들어, 동종반응성 T-세포)를 고갈시키는 데 유용하다.
이와 같은 방법에서, 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 공여자 및/또는 수혜자 대상체의 조절, 및/또는 동종이식 후 동종반응성 면역 반응을 감소/방지하기 위한 동종이식편의 치료에 유용하다.
동종이식될 세포, 조직 및 기관은 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, 입양 세포 전달), 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 내장, 얼굴, 각막, 피부, 조혈 줄기 세포(골수), 혈액, 손, 다리, 음경, 뼈, 자궁, 흉선, 랑게르한스 섬, 심장 밸브 및 난소를 포함한다. 동종이식되는 세포, 조직 또는 기관의 집단은 '동종이식편'이라 불릴 수 있다.
동종이식에 의해 치료/예방될 질환/병태는 동종이식에서 치료적 또는 예방적 혜택을 유도할 임의의 질환/병태일 수 있다. 일부 양태에서, 동종이식에 의해 치료/예방되는 질환/병태는 예를 들어, T 세포 기능 장애, 암, 전염병 또는 자가면역 질병일 수 있다.
T 세포 기능 장애는 정상적인 T 세포 기능이 손상되어, 예를 들어, 외인성 제제, 예컨대 미생물, 박테리아 및 바이러스에 의한 감염에 의해 생성된, 또는 일부 질병 상태에서, 예컨대 일부 암의 형태에서(예를 들어, 종양-관련 항원의 형태에서) 숙주에 의해 생성된, 병원성 항원에 대한 대상체의 면역 반응의 하향조절을 유발하는 질환/병태일 수 있다. 상기 T 세포 기능 장애는 T 세포 탈진 또는 T 세포 면역성 결핍을 포함할 수 있다. T 세포 탈진은 CD8+ T 세포가 증식을 실패하거나 또는 항원 자극에 대한 반응으로 T 세포 효과기 기능, 예컨대 세포독성 및 사이토카인(예를 들어, IFNγ) 분비를 발휘하지 못한 상태를 포함한다. 탈진된 T 세포는 또한 T 세포 탈진의 하나 이상의 표지자, 예를 들어, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3의 지속적인 발현이 특징일 수 있다. 상기 T 세포 기능 장애는 감염, 또는 감염에 대한 효과적인 면역 반응을 시작하지 못하는 것으로 밝혀질 수도 있다. 상기 감염은 만성적, 지속적, 잠재기 또는 서행일 수 있고, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염의 결과일 수 있다. 이처럼, 치료는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염이 있는 환자에게 제공될 수 있다. 박테리아 감염의 예에는 헬리코박터 파일로리균의 감염이 포함된다. 바이러스 감염의 예에는 HIV 감염, 간염 B 또는 간염 C가 포함된다. 상기 T 세포 기능 장애는 암, 예컨대 종양 면역 도피와 연관이 있을 수 있다. 여러 인간 종양은 T 세포에 의해 인식되는 종양-관련 항원을 발현하고, 면역 반응을 유도할 수 있다.
전염병은 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 기생충 감염일 수 있다. 일부 양태에서, 특히 예를 들면, 이와 같은 감염이 T 세포 고장 또는 T 세포 탈진과 연관이 있는 경우, 만성/지속적 감염을 치료하는 것이 특히 바람직할 수 있다. T 세포 탈진이 암(Wherry Nature Immunology Vol.12, No.6, p492-499, June 2011)에서 뿐만 아니라, 여러 만성 감염(바이러스, 박테리아 및 기생충 포함)에서 발생되는 T 세포 고장의 상태인 것으로 입증되었다. 치료될 수 있는 박테리아 감염의 예에는 바실루스 종, 백일해균(Bordetella pertussis), 클로스트리듐 종, 코리네박테리움 종, 비브리오 콜레라, 포도상구균(Staphylococcus spp), 연쇄상구균(Streptococcus spp), 에쉬리키아, 클렙시엘라, 프로테우스, 예르시니아, 에르위나속, 살모넬라, 리스테리아속, 헬리코박터 파일로리균, 마이코박테리아(예를 들어, 결핵균(Mycobacterium 결핵)) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 감염이 포함된다. 예를 들면, 상기 박테리아 감염은 패혈증 또는 결핵일 수 있다. 치료될 수 있는 바이러스 감염의 예에는 독감 바이러스, 홍역 바이러스, 간염 B 바이러스(HBV), 간염 C 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 림프구성 맥락 수막염 바이러스(LCMV), 단순포진 바이러스 및 인간 유두종 바이러스(HPV)에 의한 감염이 포함된다. 치료될 수 있는 진균 감염의 예에는 알타나리아 속, 아스퍼질러스 속, 칸다디아 균 및 히스토플라즈마 속에 의한 감염이 포함된다. 상기 진균 감염은 진균 패혈증 또는 히스토플라스마증일 수 있다. 치료될 수 있는 기생충 감염의 예에는 말라리아 원충 종(예를 들어, 열대열원충, 말라리아 원충 요엘리, 난형열원충, 삼일 열원충, 또는 말라리아 원충 샤바우디 샤바우디(chabaudi chabaudi)에 의한 감염이 포함된다. 상기 기생충 감염은 말라리아, 리슈만편모충증 및 톡소플라스마증과 같은 질병일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 질환/병태는 자가면역 질병이다. 이와 같은 양태에서, 상기 치료는 자가면역 효과기 세포의 수를 감소시키는 것이 목표일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 자가면역 질병은 1형 당뇨병, 셀리악병, 그레이브스병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 및 전신성 홍반성 낭창으로부터 선택된다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 또한 동종반응성 면역 반응, 및 동종반응성 면역 반응을 특징으로 하는 질환/병태의 치료/예방에 유용하다.
동종반응성 면역 반응을 특징으로 하는 질병 및 질환에는 동종이식과 연관된 동종반응성 면역 반응에 의해 유발 또는 악화되는 질환/병태가 포함된다. 이와 같은 질환/병태에는 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 및 이식편 거부반응이 포함되고, 이것이 Perkey and Maillard Annu Rev Pathol.(2018) 13:219-245에 상세히 기술되었으며, 상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 편입되어 있다.
이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 다수의 공여자 면역 세포의 동종이식 후 발생할 수 있고, 동종이계 수혜자 세포/조직/기관에 대한 공여자-유도 면역 세포의 반응성을 수반한다. 이식편 거부반응은 이식 후 수혜자의 면역계에 의한 이식된 세포/조직/기관의 파괴를 가리킨다. 이식편 거부 반응이 동종이식편에서 일어나는 경우, 동종이식편 거부반응이라 부를 수 있다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종이식편에서 동종반응성 T-세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있는데, 이는 고갈되지 않으면 동종이식 시 수혜자에게서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 야기할 수 있다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종이식편을 위해 공여자에게서 동종반응성 T-세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있는데(예를 들어, 상기 동종이식편을 수확/수집하기 전에), 이는 고갈되지 않으면 동종이식 시 수혜자에게서 GVHD를 야기할 수 있다.
본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물은 동종이식편을 위해 수혜자에게서 동종반응성 T-세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있는데, 이는 고갈되지 않으면, 이식편 거부반응을 유발/촉진할 수 있다.
본 발명은 동종이식 후 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 치료/예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 동종이식편에 대한 공여자 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 동종이식 후 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 치료/예방하는 방법을 제공하며, 동종이식편을 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 방법의 목표는 동종이식편 중 동종반응성 면역 세포가 동종이식편에 대한 수혜자의 세포, 조직 및/또는 기관에 동종반응성 면역 반응을 시작하는 능력을 감소/제거하는 것이다.
본 발명은 동종이식 후 이식편 거부반응을 치료/예방하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 동종이식편에 대한 수혜자 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 방법의 목표는 수혜자 대상체가 동종이식편에 동종반응성 면역 반응을 시작하는 능력을 감소/제거하는 것이다. 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포는 공여자 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 동종반응성 면역 반응을 유발할 수혜자의 면역 세포를 제거하는 데 유용하다.
본 발명은 동종이식편에서 동종반응성 면역 세포(예를 들어, 동종반응성 T-세포)를 고갈시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 동종이식편(예를 들어, 이식될 세포, 조직 또는 기관의 집단)을 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 상기 동종이식편에 대한 공여자 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 방법의 목표는 동종이식편 중 동종반응성 면역 세포가 동종이식편에 대한 수혜자의 세포, 조직 및/또는 기관에서 동종반응성 면역 반응을 시작하는 능력을 감소/제거하는 것이다.
일부 양태에서, 상기 방법은
대상체에서 세포, 조직 또는 기관의 집단을 획득/수집하는 단계;
세포, 조직 또는 기관의 집단을 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 접촉시키는 단계;
본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포의 존재하에 시험관내 또는 생체외에서 세포, 조직 또는 기관의 집단을 배양하는 단계;
동종반응성 면역 세포가 고갈된 세포, 조직 또는 기관의 집단을 수확/수집하는 단계; 및
동종반응성 면역 세포가 고갈된 세포, 조직 또는 기관의 집단을 대상체에 이식/투여하는 단계
중 하나 이상을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 동종반응성 면역 세포(예를 들어, 동종반응성 T-세포)를 고갈시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 대상체는 동종이식편에 대한 공여자 대상체일 수 있고, 또는 동종이식편에 대한 의도된 수혜자 대상체일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은
상기 대상체에서 동종반응성 면역 세포를 고갈시키기 위해, 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계;
본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물이 투여된 바 있는 대상체에서 세포, 조직 또는 기관의 집단을 획득/수집하는 단계; 및
동종반응성 면역 세포가 고갈된 세포, 조직 또는 기관의 집단을 대상체에 이식/투여하는 단계
중 하나 이상을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은
대상체에서 동종반응성 면역 세포를 고갈시키기 위해, 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및
본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물이 사전에 투여된 바 있는 대상체에 세포, 조직 또는 기관의 집단을 이식/투여하는 단계
중 하나 이상을 포함한다.
동종반응성 면역 세포의 고갈은 동종이식편 또는 대상체 중 동종반응성 면역 세포의 양의, 예를 들어, 2배, 10배, 100배, 1000배, 10000배 이상의 감소를 초래할 수 있다.
상기 방법은 대상체에서 시험관내 또는 생체외, 또는 체내에서 수행될 수 있다. 시험관내 또는 생체외에서 수행되는 방법의 단계는 시험관내 또는 생체외 세포 배양물을 포함할 수 있다.
상기 방법은 추가로 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물의 생산을 위한 방법 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 동종이식에 대한 수혜자 대상체에 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 투여와 동종이식이 동시에 수행된다 (즉, 동시에, 또는 예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 내에).
일부 양태에서, 동종이식에 대한 수혜자 대상체에 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 투여와 동종이식이 순차적으로 수행된다. CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 투여와 동종이식 사이의 시간 간격은 임의의 시간 간격, 예컨대 시간, 일, 주, 개월, 또는 년일 수 있다. 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물은 동종이식 이전 또는 이후에 수혜자 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물은 바람직하게는 동종이식 이전에 수혜자 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 동종이식에 대한 공여자 대상체에 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 투여와 상기 대상체에서 동종이식편의 수집(즉, 세포, 조직 및/또는 기관의 수집)이 동시에 수행된다 (즉, 동시에 또는 예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 내에). 일부 양태에서, 동종이식에 대한 공여자 대상체에 본 발명에 따른 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 투여와 상기 대상체에서 동종이식편의 수집(즉, 세포, 조직 및/또는 기관의 수집)이 순차적으로 수행된다. CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 투여와 상기 동종이식편의 수집 사이의 시간 간격은 임의의 시간 간격으로, 예컨대 시간, 일, 주, 개월, 또는 년일 수 있다. 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물은 동종이식편의 수집 이전 또는 이후에 상기 공여자 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물은 바람직하게는 상기 동종이식편의 수집 이전에 공여자 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 동종반응성 면역 반응, 이식편 거부 반응 및/또는 GVHD를 치료/예방하기 위한 추가적인 개입을 포함한다.
일부 양태에서, 동종반응성, 이식편 거부반응 및/또는 GVHD를 치료/예방하는 방법은 면역억제 및/또는 림프구 고갈 요법, 예컨대 코르티코스테로이드류(예를 들어, 프레드니솔론, 하이드로코르티손), 칼시뉴린 억제제(예를 들어, 사이클로스포린, 타크롤리무스) 항증식성 제제(예를 들어, 아자티오프리넴, 마이코페놀산) 및/또는 mTOR 억제제(예를 들어, 시롤리무스, 에베로리무스)의 투여를 포함한다.
일부 양태에서, 동종반응성 및/또는 이식편 거부반응을 치료/예방하는 방법은 항체 요법, 예컨대 단클론 항-IL-2Rα 수용체 항체(예를 들어, 바실릭시맙, 다클리주맙), 항-T 세포 항체(예를 들어, 항-흉선세포 고불린, 항-림프구 고불린) 및/또는 항-CD20 항체(예를 들어, 리툭시맙)으로의 치료를 포함한다.
일부 양태에서, 동종반응성 및/또는 이식편 거부반응을 치료/예방하는 방법은 수혈 및/또는 골수 이식을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 경우, 본 발명은 이와 같은 방법에 사용하기 위한 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물을 또한 제공한다. 또한 이와 같은 방법에 사용하기 위한 생성물(예를 들어, 의약품)의 제조에서, 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명의 다양한 측면의 방법은 면역억제제(들)을 활용하는 방법과 비교할 때, 비-동종반응성 면역 세포의 더 적은 고갈 및/또는 생존 증가를 유발한다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 동종이식편에 대한 수혜자 대상체, 또는 동종이식편에서 비-동종반응성 면역 세포 구획을 보존/유지하는 데 유용하다.
동종이식을 포함하는 본 발명의 방법의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은, 면역억제제로의 치료를 수반하는 방법과 비교할 때, 동종이식편에 대한 수혜자 대상체에서 비-동종반응성 면역 세포의 수/비율의 증가와 연관된다. 동종이계 면역 세포의 입양 전달을 포함하는 본 발명의 방법의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은, 면역억제제로의 치료를 수반하는 방법과 비교할 때, 동종이계 면역 세포에 대한 수혜자 대상체에서 비-동종반응성 면역 세포의 수/비율의 증가와 연관된다.
동종이식을 포함하는 본 발명의 방법의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 면역억제제로의 치료를 수반하는 방법과 비교할 때, 동종이식편에서 비-동종반응성 면역 세포의 수/비율의 증가와 연관된다.
본 발명은 또한
CAR에 특이적인 표적 항원을 발현하는 세포(예를 들어, CD30을 발현하는 세포)를 사멸하는 단계;
상기 바이러스-특이적 면역 세포에 특이적인 바이러스의 항원의 펩타이드에 감염된 또는 상기 펩타이드를 제공하는 세포(예를 들어, EBV에 감염된 세포 또는 EBV 항원의 펩타이드를 제공하는 세포)를 사멸하는 단계; 및/또는
동종반응성 면역 세포를 사멸하는 단계(예를 들어, CD30을 발현하는 T세포)
를 포함하는 방법을 위한, 본 발명의 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 이와 같은 방법에서 이와 같은 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물의 용도를 제공하고, 상기 방법은 이와 같은 목적으로 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포 및 조성물을 사용한다.
대상체
본 발명의 측면에 따른 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 상기 대상체는 바람직하게는 포유류, 좀 더 바람직하게는 인간이다. 상기 대상체는 비-인간 포유류일 수 있으나, 좀 더 바람직하게는 인간이다. 상기 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 상기 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 치료를 요구하는 본원에 기술된 질환/병태가 있는 것으로 진단받았을 수 있고, 이와 같은 질환/병태가 있는 것으로 의심될 수도 있고, 또는 이와 같은 질환/병태가 발병할 위험이나 질환/병태에 걸릴 위험이 있을 수 있다.
본 발명에 따른 양태에서, 상기 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 일부 양태에서, 본 발명의 치료적 또는 예방적 방법에 따라 치료받을 대상체는 본원에 기술된 질환/병태가 발병할 위험이 있거나 위험에 처한 대상체이다. 본 발병에 따른 양태에서, 대상체는 이와 같은 질환/병태의 특정 표지자에 대한 특징규명을 기반으로 상기 방법에 따른 치료를 위해 선택될 수 있다.
대상체는 본 발명에 따른 개입과 관련한 동종이계 대상체일 수 있다. 본 개시에 따라 치료/예방되는 대상체는 상기 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포가 유래된 대상체와 유전적으로 동일하지 않을 수 있다. 본 개시에 따라 치료/예방되는 대상체는 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포가 유래된 대상체와 관련하여 HLA 불일치일 수 있다. 본 개시에 따라 치료/예방되는 대상체는 CAR-발현 바이러스-특이적 면역 세포가 유래된 대상체와 관련하여 HLA 일치일 수 있다.
본 개시에 따라 세포가 투여되는 대상체는 상기 세포가 유래된/유래되었던 원천과 관련하여 동종이계/비-자가유래일 수 있다. 세포가 투여되는 대상체는 투여될 세포의 생산을 위해 세포가 획득되는/획득된 대상체와 상이한 대상체일 수 있다. 상기 세포가 투여되는 대상체는 투여될 세포의 생산을 위해 세포가 획득되는/획득된 대상체와 유전적으로 동일하지 않을 수 있다.
세포가 투여되는 대상체는 투여될 세포의 생산을 위해 세포가 획득되는/획득된 대상체의 MHC/HLA 유전자에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자와 동일하지 않은 MHC/HLA 분자를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 포함할 수 있다. 세포가 투여될 대상체는 투여될 세포의 생산을 위해 세포가 획득되는/획득된 대상체의 MHC/HLA 유전자에 의해 인코딩되는 MHC/HLA 분자와 동일한 MHC/HLA 분자를 인코딩하는 MHC/HLA 유전자를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 세포가 투여되는 대상체는 투여될 상기 세포의 생산을 위해 세포가 획득되는/획득된 대상체와 관련하여 HLA 일치이다. 일부 양태에서, 세포가 투여되는 상기 대상체는 투여될 상기 세포의 생산을 위해 세포가 획득되는/획득된 대상체와 관련하여 근접한 또는 완전한 HLA 일치이다.
일부 양태에서, 상기 대상체는 HLA-A, -B, -C, 및 -DRB1에 걸쳐 ≥ 4/8(즉 4/8, 5/8, 6/8, 7/8 또는 8/8) 일치를 보인다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 HLA-A, -B, -C, -DRB1 및 -DQB1에 걸쳐 ≥ 5/10(즉, 5/10, 6/10, 7/10, 8/10, 9/10 또는 10/10) 일치를 보인다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 및 -DPB1에 걸쳐 ≥6/12(i.e. 6/12, 7/12, 8/12, 9/12, 10/12, 11/12 또는 12/12) 일치를 보인다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 HLA-A, -B, -C, 및 -DRB1에 걸쳐 8/8 일치를 보인다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 HLA-A, -B, -C, -DRB1 및 -DQB1에 걸쳐 10/10 일치를 보인다. 일부 양태에서, 상기 대상체는 HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 및 -DPB1에 걸쳐 12/12 일치를 보인다.
서열 동일성
둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 동일성 백분율을 판단하기 위한 목적으로 쌍을 이룬 다수의 서열 정렬이 당해 기술의 숙련가에게 알려진 다양한 방법들, 예컨대 공개적으로 사용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 ClustalOmega (Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960), T-coffee(Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol.(2000) 302, 205-217), Kalign(Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)) 및 MAFFT(Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780 소프트웨어로 달성될 수 있다. 이와 같은 소프트웨어를 사용할 때, 예를 들어, 간격 페널티 및 확장 페널티에 대해서는 바람직하게는 기본 매개변수가 사용된다.
서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본 발명은 명백히 허용되지 않고, 분명하게 회피되는 조합을 제외하고, 측면들 및 바람직한 특징들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 각 부분의 소제목은 체계를 위한 것일 뿐, 기술된 주제를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
본 발명의 측면 및 양태는 수반되는 도면을 참조하여 예로서 묘사될 것이다. 추가적인 측면 및 양태가 당해 기술의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 명세서 전역에서, 이어서 나오는 청구항에 이르기까지, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단어 '포함하다' 및 이의 변형들, 예컨대 '포함하는'은 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 집합을 포함함을 암시하는 것으로 이해될 것이나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 집합이 배제되는 것은 아니다.
본 명세서와 청구항에 사용된 단일 형태 'a', 'an', 및 'the'는 문맥에서 분명하게 달리 지시되지 않는 한, 복수의 참조물을 포함한다. 범위는 본원에서 '약' 하나의 특정 값에서 및/또는 '약' 또 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이와 같은 범위가 표현되면, 또 다른 양태는 하나의 특정 값에서 나머지 특정 값까지를 포함한다. 이와 유사하게, 값이 앞서 '약'이 사용됨으로써 근사치로 표현된 경우, 특정 값이 또 다른 양태를 형성함이 이해될 것이다.
본원에 핵산 서열이 개시된 경우, 이의 역 상보(reverse complement) 또한 명백히 고려된다.
본원에 기술된 방법은 시험관내 또는 체내에서 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 방법은 시험관내 수행된다. 용어 '시험관내'는 배양물 중 세포를 사용한 실험을 아우르는 것인 반면 용어 '체내'는 본연의 다중세포 생명체를 사용한 실험을 아우르는 것이다.
본 발명의 원칙을 묘사하는 양태 및 실험이 수반되는 도면과 함께 논의될 것이다.
도 1. HLA-A2-양성 대상체에서 유래된 비-형질도입 EBVST(좌측 상단 패널) 또는 HLA-A2-양성 대상체에서 유래된 CD30-CAR 작제물 형질도입 EBVST(우측 상단 패널)의 7일 동안 배양 후; 또는 HLA-A2-음성 대상체에서 유래된 동종반응성 T-세포 및 HLA-A2-양성 대상체에서 유래된 비-형질도입 EBVST(좌측 하단 패널), 또는 HLA-A2-양성 대상체에서 유래된 CD30-CAR 작제물-형질도입 EBVST(우측 하단 패널)의 7일 공동 배양 후, 획득된 세포에 의한 HLA-A2 및 CD3의 발현을 보여주는 산포도.
도 2a 및 2b. 7일 후 (2a) EBVST(즉, CD3+, HLA-A2-양성) 및 (2B) 동종반응성 T-세포(즉, CD3+, HLA-A2-음성) 세포에 대한 세포 계수를 보여주는 바 차트.
도 3. HLA-A2-양성 PBMC와, HLA-A2-음성 대상체에서 유래된 비-형질도입(NT; 좌측 상단 패널), CD30-CAR 작제물-형질도입(CD30.CAR; 우측 상단 패널), CD19-CAR 작제물-형질도입(CD19.CAR; 좌측 하단 패널), 또는 CD30-CAR 및 CD19-CAR 작제물-형질도입(CD30+CD19.CAR; 우측 하단 패널) EBVST를 포함하는 공동배양물 중 7일 후 획득된 세포에서 HLA-A2 및 CD71의 발현을 보여주는 산포도.
도 4. 4명의 대표적인 공여자에게서 취한 혈액 샘플에서 제조된 CD30.CAR EBVST의 증식을 보여주는 그래프. 상기 그래프는 배양물에서 성장된 세포의 누적된 배수를 보여준다.
도 5a 및 5b. 표시된 비율로 CD30.CAR EBVST(효과기)와 51Cr-표지 표적 세포(표적)의 공동 배양 후, 51Cr 방출 검정에 의해 측정된 바와 같이, (5a) CD30-음성 BJAB 버킷 림프종 세포 및 (5b) CD30-양성 HDLM2 호지킨 림프종 세포에서 CD30.CAR EBVST의 세포독성을 보여주는 그래프.
도 6a 및 6b. ELISpot 분석에 의해 측정된 바와 같이, 4명의 대표적인 공여자에게서 취한 혈액 샘플에서 제조된 CD30.CAR EBVST의 EBV 항원에 대한 반응성을 보여주는 그래프. 세포는 EBV 잠재기 항원(잠재기)의 펩타이드, EBV 용해성 항원(용해성)의 펩타이드로 자극되거나 또는 항원으로 자극되지 않았고(음성), 5×104 세포당 반점 형성 단위의 수가 결정되었다. (6a)는 CD30.CAR을 인코딩하는 레트로바이러스로 형질도입되지 않은 EBVST의 반응성을 보여준다. (6b)는 (CD30.CAR을 인코딩하는 레트로바이러스로 형질도입된) CD30.CAR EBVST의 반응성을 보여준다.
도 7. CD30.CAR EBVST의 주입 이전, 그리고 주입 이후 6주차에 수행된 환자 #1의 PET 스캔 결과를 보여주는 대표적 영상.
도 8. CD30.CAR EBVST의 주입 이전, 그리고 주입 이후 6주차에 수행된 환자 #2의 PET 및 CT 스캔의 결과를 보여주는 대표적인 영상.
도 9. CD30.CAR EBVST 주입 이전(사전) 및 주입 이후 명시된 기간에 획득된 혈액 샘플 내에서 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같이, 말초 혈액 세포에서 벡터 카피 수를 보여주는 표.
도 10. ELISpot 분석에 의해 결정된 바와 같이, 림프구 고갈 전 (LD 이전) 및 CD30.CAR EBVST 주입 이후 명시된 기간에 환자 #1의 말초 혈액 내에서 상이한 항원에 대한 세포의 특이성의 분석 결과를 보여주는 바 차트. 명시된 시점에 혈액 샘플에서 단리된 PBMC는 EBV 잠재기 항원(잠재기)의 펩타이드, EBV 용해성 항원(용해성)의 펩타이드, 다른 바이러스의 항원의 펩타이드(다른 바이러스), 종양-관련 항원(TAA) 항원의 펩타이드로 자극되었고, 또는 항원으로 자극되지 않았으며(펩혼합물 없음), 3×105 세포당 반점 형성 단위의 개수가 측정되었다.
실시예
하기 실시예에서, 본 발명의 발명가들은 CD30.CAR-발현 EBVST의 생성, 이들의 암 세포에 대한 효과기 활성 및 이들의 동종유래 세포 거부반응에 대한 저항을 기술한다.
실시예 1: CAR 작제물을 인코딩하는 레트로바이러스의 생성
Figure pct00004
CAR을 인코딩하는 cDNA를 pSFG-TGFbDNRII 레트로바이러스 근간(ATUM, Newark, CA)에 클로닝함으로써, 상기 CD30.CAR 작제물을 인코딩하는 레트로바이러스를 제조하였다.
CD30.CAR 서열, pSFG_CD30CAR을 운반하는 플라시미드를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 HEK 293 Vec-RD114 세포로 형질감염시켰다. 이어서, 상기 형질감염된 세포의 세포 배양 상청액을 사용하여 6웰 플레이트에 5×105 세포/웰의 밀도로 HEK 293Vec-Galv 세포(BioVec Pharma, Quebec, Canada)에 형질도입하였다.
상기 293Vec-Galv_CD30-CAR 세포를 트립신화하고, 상기 세포를 2×106 세포/ml의 농도로 15ml 시험관에 재현탁하였다. 일련의 2개의 희석액을 제조하고, 최종 세포 현탁액 1.65ml를 희석하여 DMEM + 10% FCS 220ml와 혼합하였다. 본 현탁액 200μl를 96웰 플레이트의 웰로 옮겨, 플레이트당 세포가 30개가 되었다. 이어서 최고성능 클론을 선택하여 레트로바이러스-함유 상청액을 생성하는 데 사용하였다. 상기 레트로바이러스-함유 상청액을 추후에 수집하고 여과하여, 나중에 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
CD19.CAR을 인코딩하는 DNA를 pSFG 레트로바이러스 근간에 클로닝함으로써, CD19.CAR 작제물을 인코딩하는 레트로바이러스를 생산하였다. CD19.CAR 서열, 85bCD19C를 운반하는 플라스미드를 사용하여, 폴리에틸렌이민(PEI)를 사용하여 HEK 293 Vec-RD114 세포를 형질감염시켰다. 상기 레트로바이러스-함유 상청액을 추후에 수거 및 여과하여 나중에 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: CAR-발현 EBV-특이적 T 세포의 생성
표준 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리법에 따라, 건강한 공여자 또는 림프종 환자에게서 획득한 혈액 샘플에서 말초 혈액 단액 세포(PBMC)를 단리하였다.
ATC의 생성
1mg/ml 항체의 1:1000 희석액 0.5ml를 첨가하여 조직 배양 플레이트의 웰들 상에 항-CD3(클론 OKT3) 및 항-CD28 작용제 항체를 도포하고, 37℃에서 2 내지 4시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양하였다. 세포 배지(44.5% 후기 RPMI 배지, 44.5% 클릭스 배지, 10% FBS 및 1% GlutaMax 함유) 중 항-CD3/CD28 작용제 항체-도포 플레이트 상에서 배양을 함으로써, 1×106 PBMC(웰당 배지 2ml)를 자극하였다. 상기 세포를 5% CO2 대기 중에서 37℃로 유지하였다. 다음날, 세포 배지 1ml를 20ng/ml의 IL-7 및 20ng/ml의 IL-15를 함유한 신선한 세포 배지로 교체하였다. ATC를 배양물에 유지하기 위해, 2 내지 4일마다 세포 배양 배지 및 사이토카인을 필요한 만큼 보충하거나 또는 ATC를 수확하고 사이토카인으로 신선한 세포 배양 배지에 다시 플레이팅하였다. ATC는 7 내지 10일 사이에 EBVST로 재자극하기 위해 실험에서 수확하고 사용하였다.
보편적 LCL
B 세포의 EBV-변형에 의해 제조된 림프아구성 세포주의 세포 중 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 분자를 인코딩하는 유전자의 표적화된 녹아웃에 의해 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II의 표면 발현이 부족한 LCL(즉, HLA-음성 LCL)을 획득하였다. 상기 HLA-음성 세포는 더 나아가 EBV 복제를 위해 필요한 유전자를 녹아웃하도록 변형하였다. 상기 방법에 의해 획득된 수득 세포는 본원에서 보편적 LCL(uLCL)로 불린다.
EBV-특이적 T 세포(EBVST)의 팽창 및 형질 도입
CD45RA MACS 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)를 사용하여 자성 세포 분리에 의해 건강한 공여자의 PBMC에서 CD45RA-발현 세포를 고갈시켰다. 44.5 내지 47% 후기 RPMI, 44.5 내지 47% 클릭스 배지, 10% FBS 또는 5% 성장 인자 풍부 첨가제 및 1% GlutaMax를 함유하고 IL-7(10ng/ml) 및 IL-15(10 ng/ml)로 보충된 세포 배지에서,2×106 CD45RA-고갈 PBMC(웰당 2ml의 배지 중)를 JPT Technologies에서 획득한 EBNA1 펩혼합물(JPT 카탈로그 번호 PM-EBV-EBNA1), LMP1 펩혼합물(JPT 카탈로그 번호 PM-EBV-LMP1) 및 LMP2 펩혼합물(JPT 카탈로그 번호 PM-EBV-LMP2)(11개 아미노산에 의해 중첩된 15mer 아미노산 펩타이드 라이브러리를 중첩하고, 관련 항원의 아미노산 서열 전체에 걸친)로 자극함으로써, EBV-특이적 T 세포를 팽창시켰다. 5% CO2 대기에서 37℃로 EBVST를 유지하였다.
4 내지 6일 후, 하기와 같이 실시예 1에 기술되었던 CAR-인코딩 레트로바이러스를 인코딩하는 CAR을 EBVST에 형질도입하였다.
레트로바이러스-함유 상청액(웰당 0.5 내지 1ml)을 레트로넥틴(Takara)으로 사전 도포하고 비-조직 배양물로 처리된 24웰 플레이트에 첨가하였다. 2000×g로 60 내지 90분 동안 플레이트를 원심분리한 후, 레트로바이러스 상청액을 제거하고, 상기 세포를 웰당 0.25 내지 0.5×106 세포로 재플레이팅하였다.
배양 후 8 내지 10일 차에, 세포를 uLCL의 존재하에 방사능 처리된, 펩타이드-펄스된(pulsed) 자가유래 활성화된 T 세포(ATC)와의 공동배양으로 재자극하였다. 요약하면, 2×106 ATC를 CTL 배지에서 30분 동안 37℃에서 펩혼합물(1×106 ATC 당 10ng 펩믹스 혼합물)과 함께 배양하였고, 차후에 30Gy로 방사능 처리하고 수확하였다. 상기 펩타이드-펄스된 ATC는 이어서 IL-7(10ng/ml) 및 IL-15(100ng/ml)를 함유한 CTL 배지에서, 1:1:5의 반응자 세포 : 펩타이드-펄스된 ATC : 방사능 처리된 uLCL의 비로, 배양물 중 세포 및 uLCL(100Gy에서 방사능 처리됨)과 혼합하였다. 구체적으로, 1×105 반응자 세포, 1×105 펩타이드-펄스된 ATC 및 0.5×106 방사능 처리된 uLCL을 24웰 조직 배양 플레이트의 웰들 중 2mL CTL 배지에서 배양하였다.
배양물에서 EBVST를 유지하기 위해, 2 내지 4일마다, 세포 배지 및 사이토카인을 필요한 만큼 새로 보충하였고, EBVST를 수확하고 사이토카인과 함께 신선한 세포 배지에 다시 플레이팅하였다. EBVST는 수확하여, 15 내지 20일 사이에 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에 사용하였다.
실시예 3: 동종반응성 T-세포를 제거하고 거부반응으로부터 동종이계 VST를 보호하기 위한 CD30-특이적 CAR의 능력의 평가
본 발명의 발명가는 VST가 시험관내 동종유래 세포 거부 반응에 저항하는 능력에 CD30.CAR 발현이 미치는 영향을 연구하였다.
준비된 동종반응성 T-세포의 생성
EBVST를 생성하기 위해 사용된 동일한 건강한 공여자의 1 내지 2×106 PBMC(웰당)를 30 Gray로 방사능 처리하고, 44.5% 후기 RPMI, 44.5% 클릭스 배지, 10% 혈청, 및 1% GlutaMax를 함유하며, IL-7(10ng/ml) 및 IL-15(10ng/ml)를 보충한 세포 배지에서, 불일치 공여자(HLA-A2의 상이한 발현을 가진)의 1×106 PBMC(웰당)와 함께 공동배양하였다. 6 내지 10일 차에 항-CD3/CD28 작용제 항체-도포 플레이트 상에서 0.5×106 세포(세포 배지 2ml 중)를 플레이팅함으로써, 상기 불일치 공여자의 PBMC에서 팽창된 준비된(primed) 동종반응성 T-세포를 재자극하였다. 동종반응성 T-세포를 배양물에서 유지하기 위해, 2 내지 4일마다, 세포 배지 및 사이토카인을 필요한 만큼 보충하거나 또는 동종반응성 T-세포를 수확하여 신선한 세포 배지에서 사이토카인과 함께 다시 플레이팅하였다. 13 내지 17일 사이에 동종반응성 T-세포를 수확하여 EBVST와 함께 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에 사용하였다.
시험관내 동종유래 세포 거부 반응을 평가하기 위해, HLA-A2-음성 대상체의 0.2×104 PBMC 동종반응성 T-세포를 하기와 함께 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에서 공동배양하였다:
(i) 동종반응성 T-세포를 준비시키기 위해 사용된 HLA-A2-양성 대상체의 PBMC에서 생성한 0.2×104 EBVST, 또는
(ii) 상기 동종반응성 T-세포를 준비시키기 위해 사용된 HLA-A2-양성 대상체의 PBMC에서 생성하고, 추가로 CD30-특이적 CAR을 인코딩하는 작제물로 형질도입한 0.2×104 EBVST.
인간 IL-7(10ng/ml) 및 IL-15(10ng/ml)를 MLR 검정에 첨가하였다.
7일 후 유동 세포 측정 분석법을 수행하였고, 계수 비즈를 사용하여 절대적인 세포 수를 계산하였다. 상이한 대상체들로부터 유래된 T 세포는 HLA-A2의 발현을 근거로 공동배양된 후 획득된 집단에서 식별될 수 있다. Gallios 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 이벤트를 획득하였고, 데이터 분석 및 그래픽 표현을 위해 Kaluza 분석 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, HLA-A2-양성 대상체에서 유래된 비-형질도입(NT) EBVST의 개수가, 동종반응성 T-세포의 부재하에 배양했을 때(좌측 상단 패널)와 비교하여, HLA-A2-음성 대상체에서 유래된 동종반응성 T-세포와 7일 동안 공동배양한 후 상당히 감소하였다 (좌측 하단 패널). 반면에, CD30.CAR EBVST의 개수는, 동종반응성 T-세포의 부재하에 배양했을 때(우측 상단 패널)와 비교하여, 동종반응성 T-세포와 7일 동안 공동배양한 후(우측 하단 패널), 증가하였다.
도 2는 유동세포 분석기 데이터의 정량화를 보여준다. 상기 비-형질도입 EBVST(NT)가 동종반응성 T-세포의 존재하에 거의 제거된 것에 반해, CD30.CAR-발현 EBVST는 동종반응성 T-세포에 의한 제거에 저항하였다 (도 2a). 이와 더불어, 동종반응성 T-세포 집단(CD3+, HLA-A2-음성)의 정량화를 통해 CD30.CAR EBVST가 비-형질도입 EBVST 조건에 비해 동종반응성 T-세포의 수를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (도 2b).
따라서, CD30.CAR을 발현하는 EBVST가 동종반응성 T-세포의 수를 감소시키는 능력이 있고, 동종유래 세포 거부 반응으로부터 보호되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: CD19-특이적 CAR 및 CD30-특이적 CAR을 발현하는 EBV-특이적 T 세포의 특징 규명
본 발명의 발명가들은 CD19.CAR와 CD30.CAR 모두를 발현하도록 조작된 바이러스-특이적 T 세포를 생산하고 특징을 규명하였으며, 이들이 혼합 림프구 반응에서 동종반응성 T-세포를 제거할 수 있는지 여부를 검토하였다.
요약하면, CD19 및 CD56 발현 세포가 고갈된 HLA-A2-양성 대상체의 1×105 PBMC 집단을 하기와 함께 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에서 공동배양하였다:
(i) HLA-A2-음성 대상체의 PBMC에서 생성한 0.1×105 EBVST, 또는
(ii) HLA-A2-음성 대상체의 PBMC에서 생성하고, 추가로 (a) CD30.CAR, (b) CD19.CAR, 또는 (c) CD30.CAR 및 CD19.CAR(CD30+CD19.CAR) 모두를 인코딩하는 작제물로 형질도입한 0.1×105 EBVST.
인간 IL-2를 MLR 검정에 20 IU/ml로 첨가하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, CD30.CAR EBVST(우측 상단 패널) 및 CD30+CD19.CAR EBVST(우측 하단 패널)는, 비-형질도입(NT) EBVST(좌측 상단 패널) 및 CD19.CAR EBVST(좌측 하단 패널)와 비교하여, 7일 차에 HLA-A2+ 동종반응성 T-세포의 비율을 감소시켰다 (활성화 표지자 CD71에 의해 구별됨)(그리고 따라서 HLA-A2+ 동종반응성 T-세포에 의한 거부반응을 회피하였음).
본 발명의 발명가들은 따라서 표적 항원(본 실시예에서는 CD19)에 특이적인 CAR 및 CD30-특이적 CAR 모두로 형질도입한 EBVST를 사용하여 소정의 표적 항원에 특이적인 '기성규격품' CAR T 세포를 생성하는 신규한 방식을 제공한다. 시험관내 동종반응성 T-세포를 제거하는 이와 같은 이중 CAR-EBVST의 능력을 통해, CAR-EBVST가 체내에서 동종이계 수혜자에게서 거부반응을 피하고 장기적으로 지속될 수 있음이 시사된다.
실시예 5: CD30.CAR EBVST를 사용한 암의 치료
5.1 건강한 공여자 대상체에서 생산된 CD30.CAR EBVST의 생산 및 특징 규명
GMP 시설에서 CD30.CAR EBVST를 제조하였다. 7명의 건강한, 혈액은행 승인 공여자에게서 사전동의서를 받은 후 헬싱키 선언에 입각한 가이드라인에 따라, 혈액 약 250 내지 400mL를 채취하였다.
밀도 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 혈액에서 단리하였다. 자성 비즈에 접합된 임상등급 항-CD45RA 항체와 Miltenyi 고갈 컬럼(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 사용하여 자성 세포 분리에 의해, PBMC에서 CD45RA-발현 세포를 고갈시켰다.
G-Rex10 용기에 47.5% 후기 RPMI, 47.5% 클릭스(EHAA) 배지(Irvine Scientific), 2mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific) 및 5% 인간 혈소판 용해물(HPL; Sexton Biotechnologies)을 함유하고, IL-7(10ng/ml) 및 IL-15(10ng/ml)가 보충된 30ml 배지에, CD45RA-양성 세포가 고갈된 1.5 내지 2.5×107 PBMC를 시딩하고, 11개 아미노산에 의한 15mer 아미노산 중첩을 포함하고, 관련 항원의 전체 단백질 서열에 걸친 펩타이드 라이브러리(펩혼합물)로 자극하여 그 PBMC를 활성화하였다. EBNA1, LMP1, LMP2, BARF1, BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2a 및 BNLF2b에 상응하는 펩혼합물을 JPT Technologies(Berlin, Germany)에서 획득하였다. 자극될 1×106 세포당 각 항원에 대해 펩혼합물 5ng을 활용하여 자극하였다 (즉, CD45RA-양성 세포가 고갈된 2×107 PBMC를 사용하여 수행된 자극의 경우, 각 펩혼합물 100ng을 사용하였다). 자극 배양물을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다.
4 내지 6일 후, 앞서 단락에서 기술된 자극 배양물에 의해 생산된 EBVST를 하기와 같이, 실시예 1에 기술된 CAR-인코딩 레트로바이러스로 형질도입하였다. 레트로바이러스-함유 상청액 2ml를 부피가 2ml인 벡토퓨신-1 150μg과 혼합하여, 최종 부피 4ml를 수득하였고, 이를 실온에서 5 내지 30분 동안 배양하였다. 이어서 상기 레트로바이러스:벡토퓨신-1 혼합물을 T75 용기에 8.5 ml 배지(앞서 단락에서 기술됨) 중 7 내지 10×106 세포에 첨가하였다. 배양물을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지하였다.
배양 8 내지 10일 차에, 앞서 단락에 기술된 바와 같이 형질 도입에 의해 생산된 1 내지 2×107 CD30.CAR EBVST CD30.CAR EBVST를 G-Rex100 용기에 옮겨 담고, 1:2 내지 1:5(전형적으로 약 1:3) 범위의 CD30.CAR EBVST 대 방사능 처리된 uLCL의 비로, 방사능 처리된(100 gray에서) uLCL(실시예 2에 기술됨)과 공동배양함으로써 재자극하였다. ULCL은 EBV 항원 및 CD30을 발현하고, 뿐만 아니라 기타 보조자극성 분자를 발현하기 때문에, CD30.CAR EBVST에 항원 자극 및 보조자극을 제공하여, EBV 특이성의 손실 없이 CD30.CAR EBVST의 강력한 증식을 유도한다.
재자극 배양물을 200ml 배지(5.1의 세 번째 단락)에 성립시키고, 필요한 만큼 추가적인 배지를 첨가하였다. 7 내지 12일 후, CD30.CAR EBVST를 수확하여 추후 주입을 위해 저온보존하였다.
4명의 대표적인 건강한 공여자 대상체에서 준비한 CD30.CAR EBVST에 대해 시험관내 증식하는 능력을 평가하였고, 상이한 EBV 항원에 대한 특이성을 판단하기 위해 시험관내 CD30-발현 및 CD30-음성 암 세포주에 대한 세포독성을 평가하였다.
CD30.CAR EBVST 증식의 분석
배양 중에 다양한 시점(0, 6, 10, 17 18 및 19일차)에 혈구계를 사용하여 세포의 수를 계수하여 CD30.CAR EBVST의 증식을 측정하였고, 누적 배수 팽창을 계산하였다.
도 4는 4명의 상이한 건강한 공여자 대상체에서 생산된 CD30.CAR EBVST가 ~17 내지 20일 내에 CD30.CAR EBVST의 치료 용량을 달성하기에 충분하게, 시험관내 배양물에서 잘 팽창하였음을 보여준다. 상기 팽창된 세포는 세포의 77% 내지 99%에서 CD30.CAR을 발현하였다 (데이터가 도시되지 않음).
CD30.CAR EBVST 세포독성의 분석
크롬-51(51Cr) 방출 검정을 사용하여 CD30.CAR EBVST의 세포독성 특이성을 측정하였다. 요약하면, 표적 세포, CD30-음성 BJAB 버킷 림프종 세포 또는 CD30-양성 HDLM2 호지킨 림프종 세포 중 하나를 1시간 동안 51Cr과 배양하였다. 비-형질도입 EBVST 또는 CD30.CAR-형질도입 EBVST를 효과기로 사용하여 96웰 플레이트의 웰에서 40:1, 20:1, 10:1, 5:1 및 2.5:1의 효과기-대-표적 비로 표적과 함께 배양하였다. 4 내지 6시간 배양 후, 공동배양 상청액을 수확하고, 감마 계수기로 51Cr 방출을 검출하였다. 하기 식을 사용하여 삼중 평균에서 특이적 세포용액의 백분율을 계산하였다: [(실험적 방출 - 자발적 방출) /(최대 방출 - 자발적 방출)] × 100.
도 5는 CD30.CAR EBVST가 CD30-음성 버킷 림프종 BJAB 세포주의 세포에는 실질적으로 비-세포독성이었으나, CD30-양성 호지킨 림프종 HDLM2 세포주의 세포에 대해서는 높은 세포독성을 나타냈음을 보여준다.
EBV 항원에 대한 CD30.CAR EBVST의 반응성의 분석
4명의 상이한 건강한 공여자 대상체에서 제조한 CD30.CAR EBVST가 EBV 항원으로의 자극에 보이는 반응을 평가하기 위해 IFN-γ ELISpot 분석을 수행하였다.
EBV 잠재기 항원(EBNA1, LMP1, LMP2 및 BARF1) 및 EBV 용해성 주기 항원(BZLF1, BRLF1, BMLF1, BMRF1, BMRF2, BALF2, BNLF2a 및 BNLF2b)에 대해 펩혼합물(JPT Technologies, Berlin, Germany에서 획득)로의 자극에 대한 반응으로 IFN-γ 생산을 측정하였다. 요약하면, CD30.CAR EBVST를 96웰 MultiScreen 플레이트(MilliporeSigma)의 웰에 5×104 세포/웰로 이중으로 플레이팅하였다. 웰당 총 펩타이드 0.1μg을 사용하여 자극을 수행하였다. 5% CO2하에 37℃로 16 내지 20시간 동안 배양한 후, IFN-γ+ 반점에 대해 플레이트를 현상하고, 정량화를 위해 ZellNet Consulting(Fort Lee, NJ)에 보냈다. 항원 특이적 반응의 빈도를 5×104 세포당 반점 형성 단위(SFU)로 표현하였다.
도 6은 4명의 상이한 건강한 공여자 대상체에서 생산된 CD30.CAR EBVST가 EBV 항원에 대한 그들의 특이성을 유지했음을 보여준다.
4개의 CD30.CAR EBVST 세포주 모두 잠재기 및 용해성 EBV 항원 모두의 자극에 대한 반응으로 105 세포당 100개가 넘는 IFNγ 반점형성단위(SFU)을 생산하고, 20:1의 효과기 대 표적의 비로 CD30-양성 호지킨 림프종 세포주, 즉 HDLM2에 대해 20%가 넘는 특이적 세포용해를 생산하여 기능적 방출 기준을 통과하였다.
5.2 CD30+ 림프종에 대한 동종이계 입양 세포 요법으로서 CD30.CAR EBVST의 투여
본 연구의 치료에 참여할 자격 조건은 CD30+ 난치성 또는 재발성 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, ALK-양성 역형성 T 세포 림프종, ALK-음성 역형성 T 세포 림프종 또는 다른 말초 T-세포 림프종을 앓는 12 내지 75세 사이의 환자였다.
림프구 감소증을 유도하기 위해 환자에게 사이클로포스파마이드(Cy: 500mg/㎡/일)와 함께 플루다라빈(Flu: 30mg/㎡/일)을 하루 용량씩 3회 투여하였고, 적어도 CD30.CAR EBVST 세포 주입 48시간 전에 완료하였고, 주사 전 2주전까지는 투여하였다.
연구 시작 당일, 환자는 대략 1 내지 10분에 걸쳐 1 내지 50ml의 부피로 정맥내 주사를 통해 동종이계 CD30.CAR EBVST의 계획된 단일 용량을 투여받았다. 환자에게 HLA 클래스 I 및 클래스 II 일치가 가장 높은 CD30.CAR EBVST를 투여하였다.
본 연구에서 총 환자 5명에게 동종이계 CD30.CAR EBVST 세포를 투여하였다. 환자 3명은 4×107 CD30.CAR EBVST 세포(용량 수준 1(DL1))를 투여받았다. 환자 2명은 1×108 CD30.CAR EBVST 세포(용량 수준 2(DL2))를 투여받았다.
혈액 생성물의 투여에 관한 기관 표준에 따라 모니터링을 수행하였는데, 단 주사는 내과의에 의해 이루어졌다. 환자는 주사 후 적어도 3시간 동안 모니터링받았다. 환자는 부작용, 예컨대 임상적 상태 및 실험실 데이터의 변화에 대해 평가받았다. 특히, 환자는 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 신경독증의 상호관계에 대해 평가되었고, 이는 일부 CAR-T 세포 면역요법에서 관찰된 바 있다.
하기 시점에 환자에게서 혈액 샘플을 채취하였다: 연구 이전, 주입 후 3 내지 4시간, 0일차 세포 주입 후 1, 2, 3, 4, 및 6주 및 3개월. CD30.CAR EBVST의 지속성 및 효능을 평가하기 위해 샘플을 분석하였다.
환자들 중 어느 누구도 용량 제한 독성을 경험하지 않았고, 임의 등급의 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 대숙주성 이식편 질병(GVHD)이 관찰되지 않았다.
동종이계 CD30.CAR EBVST가 투여된 환자에서 임상 반응
측정 가능한 질병 및 주입 이전 및 시작일 주입 후 6 내지 8주 차에 요법에 대한 반응(PET 스캔, CT 스캔, MRI 및 핵 이미징을 통해)을 문서화하기 위해 진단용 영상화를 수행하였다.
환자 #1에게 좌측 전주와(antecubital fossa)(주사 시점에 혈당 수준이 99 mg/dL이었음)에 FDG 11.9 mCi를 정맥내로 주입하였다. 중맥류에서 대퇴골 근위부까지 PET 및 CT 이미지를 획득하였고, 상기 이미지를 추후에 3차원 복원과 함께 축 면, 두정면, 시상봉합면에서의 다중평면 복원과 함께, 융합하였다.
환자 #2에게는 (주사 시점에 혈당 수준이 99 mg/dL이었음) FDG 7.29 mCi를 정맥내로 주입하였다. 대략 60분 후, CT 감쇄 보정 기법을 활용하는 PET-CT를 사용하여 두개저에서부터 대퇴골 근위부까지의 이미지를 획득하였다. 저용량 기법을 사용하여 CT 슬라이스를 획득하였고, 다중면으로 포맷을 새로 한 이미지를 획득하였다.
도 7 및 도 8은 CD30.CAR EBVST로 치료 받은 두 환자에서의 임상적 반응을 보여준다. 환자 #1의 이미지는 질병의 여러 부위의 해상도를 보여주고, 환자 #2의 이미지는 이들 환자들에게 동종이계 CD30.CAR EBVST로 치료하는 경우 치료 효능을 나타내는, 표시된 질병의 감소를 보여준다.
투여 후 CD30.CAR 벡터 카피 수의 분석
CD30.CAR을 인코딩하는 레트로바이러스의 통합 게놈을 실시간 qPCR로 정량화하였다. 여러 시점(림프구 고갈 전, 3시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 6주 및 3개월)에 환자에게서 채취한 말초 혈액 샘플에서 PBMC를 단리하였다. 제조업체의 설명에 따라, QIAamp DNA 혈액 미니 키트(Qiagen)로 PBMC에서 DNA를 추출한 후, 상기 레트로바이러스 벡터 내 특이적 서열에 상보적인 프라이머 및 프로브(Applied Biosystems)로 상기 DNA를 증폭시켰다. 상기 이식유전자를 인코딩하는 플라스미드의 연속 희석액을 사용하여 표준 곡선을 성립시켰다. 제조업체의 설명에 따라, ABI7900HF 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 증폭을 수행하였다.
도 9는 환자#1 및 환자 #2에 대한 CD30.CAR 이식유전자의 벡터 카피수를 보여주고, CD30.CAR EBVST가 체내에서 팽창하지 않으며, 이들 환자의 말초 혈액에서 급속도록 검출불가능하게 됨을 시사한다.
동종이계 CD30.CAR EBVST가 투여된 환자에게서 에피토프 전파의 분석
에피토프 전파를 평가하기 위해, 여러 시점에 환자 #1에서 면역 세포를 수집하였고, 동종이계 CD30.CAR EBVST의 주입 이전 및 이후에 면역 세포의 반응성을 판단하기 위해 종양-관련 항원으로 자극하였다.
여러 시점(림프구 고갈 이전, 3시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 및 3개월)에 환자에게서 채취한 말초 혈액에서 PBMC를 단리하고, 상기 실시예 5.1에 기술된 바와 같이 본질적으로 수행된 ELISpot 검정에 사용하였는데, 단 PBMC를 웰당 3×105 만큼 플레이팅하였고, EBV 잠재기 및 용해성 항원의 평가와 더불어, PBMC를 자극하기 위해 하기의 2개의 추가적인 항원 그룹을 사용하였다; (1) '기타 바이러스'(아데노바이러스 단백질 헥손 및 펜톤, 및 CMV 단백질 PP65)에서 유래된 항원의 펩혼합물의 풀(pool), 및(2) 종양-관련 항원(TAA) MAGE-A4, NY-ESO, PRAME, SSX2, 및 수르비빈에 상응하는 펩혼합물의 풀(pool).
도 10은 환자 #1이 어느 시점에도 종양-관련 항원에 반응을 보이지 않았음을 보여주는데, 이는 환자 1#에서 에피토프 전파가 없었음을 시사한다. 이와 같은 결과는 동종이계 CD30.CAR EBVST로의 치료가 상기 환자의 면역계를 이와 같은 기타 종양 항원에 민감하게 하지 않았음을 시사한다.
5.3 결론
본 발명의 발명가들은 건강한 공여자 대상체에서 생산된 CD30.CAR EBVST가 충분한 수로 팽창되어, CD30+ 암을 앓는 환자의 경우 기성규격품 치료로서 이를 사용한 경우, 이의 TCR 및 CD30.CAR 모두의 기능이 보존되고, EBV 특이성 및 CD30-양성 종양 세포의 제거 능력이 유지됨을 보여주었다.
CD30.CAR EBVST는 안전하고, 동종이계 수혜자에게서 체내에서 CD30-양성 림프종에 대한 치료 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다. 말초 혈액에서 CAR-발현 세포의 제한적인 지속성에도 불구하고, 그리고 기타 종양-관련 항원으로의 에피토프 전파의 증거의 부재하에서, 임상적 반응이 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Baylor College of Medicine <120> Virus-Specific Immune Cells Expressing Chimeric Antigen Receptors <130> BAYM.P0308WO (BLG 20.080; 007921547) <140> TBD <141> 2021-04-27 <150> US 63/015,769 <151> 2020-04-27 <160> 53 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn 20 25 30 Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys 35 40 45 Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp 50 55 60 Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg 65 70 75 80 Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr 85 90 95 Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met 100 105 110 Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His 115 120 125 Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln 130 135 140 Lys Asn Thr Val 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Leu Pro Pro Arg 450 455 460

Claims (42)

  1. 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR), 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포로서, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 신호전달 영역을 포함하고, 상기 신호전달 영역은 (a) CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열, 및 (b) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)(ITAM)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 막관통 영역은 CD28의 막관통 영역으로부터 유래되는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 영역은 서열번호 20과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 14와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열, 및 서열번호 15와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 영역은 (a) CD3ζ의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 25와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은 상기 항원-결합 영역과 상기 막관통 영역 사이에 제공되는 경첩 부위를 추가로 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 경첩 부위는 서열번호 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호 35 또는 36과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  13. 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스-특이적 면역 세포로서, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 영역을 포함하고;
    상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 하나 이상의 비-동일성 CAR, 또는 하나 이상의 비-동일성 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 암 세포 항원인, 바이러스-특이적 면역 세포.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1R, CD4, CD7, CD38, BCMA, 메소텔린, EGFR, GPC3, MUC1, HER2, GD2, CEA, EpCAM, LeY 및 PSCA로부터 선택되는, 바이러스-특이적 면역 세포.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19인, 바이러스-특이적 면역 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 바이러스-특이적 T 세포인, 바이러스-특이적 면역 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV)에 대해 특이적인, 바이러스-특이적 면역 세포.
  20. 바이러스-특이적 면역 세포를 제조하는 방법으로서,
    키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록, 바이러스-특이적 면역 세포를 변형하는 단계를 포함하며, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 신호전달 영역을 포함하고, 상기 신호전달 영역은 (a) CD28의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열, 및 (b) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 막관통 영역은 CD28의 막관통 영역으로부터 유래되는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 영역은 서열번호 20과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 14와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열, 및 서열번호 15와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 영역은 서열번호 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 영역은 (a) CD3ζ의 세포내 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 영역은 서열번호 25와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은 상기 항원-결합 영역과 상기 막관통 영역 사이에 제공된 경첩 부위를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경첩 부위는 서열번호 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호 35 또는 36과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
  32. 바이러스-특이적 면역 세포를 제조하는 방법으로서,
    키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록, 바이러스-특이적 면역 세포를 변형하는 단계를 포함하며, 상기 CAR는 (i) CD30에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역, (ii) 막관통 영역, 및 (iii) 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 영역을 포함하고, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는, CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR, 또는 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하도록, 바이러스-특이적 면역 세포를 변형하는 단계를 포함하며, 상기 CAR은 CD30 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 영역을 포함하는, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 하나 이상의 비-동일성 CAR, 또는 하나 이상의 비-동일성 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 암 세포 항원인, 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1R, CD4, CD7, CD38, BCMA, 메소텔린, EGFR, GPC3, MUC1, HER2, GD2, CEA, EpCAM, LeY 및 PSCA로부터 선택되는, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, CD30 이외의 상기 표적 항원은 CD19인, 방법.
  38. 제20항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 바이러스-특이적 T 세포인, 방법.
  39. 제20항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-특이적 면역 세포는 엡스테인-바 바이러스(EBV)에 대해 특이적인, 방법.
  40. 제20항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득되거나 또는 획득될 수 있는 바이러스-특이적 면역 세포.
  41. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항 또는 제40항에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  42. 의학적 치료 또는 예방의 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항 또는 제40항에 따른 바이러스-특이적 면역 세포 또는 제41항에 따른 약제학적 조성물.
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