CN115996734A - 使用表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞治疗和预防癌症 - Google Patents

使用表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞治疗和预防癌症 Download PDF

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Abstract

本发明公开了使用病毒特异性免疫细胞治疗和预防癌症，所述病毒特异性免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的氨基酸序列。

Description

使用表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞治疗和预防癌症
本申请要求2020年4月27日提交的US 63/015,769的优先权，其内容和要素对于所有目的以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学和细胞生物学，还涉及医学治疗和预防的方法。
背景
尽管自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞在恶性血液病中获得成功，但仍存在更广泛使用这种潜在治愈性疗法的障碍。生产失败、输液前疾病进展和过高的成本证明对许多人来说是令人望而却步的。迫切需要立即可用的CAR T细胞选项。
来源于健康供体的“现成”T细胞产品可快速施用，将改善可及性，并降低过继细胞免疫治疗的成本。然而，“现成”CAR T细胞疗法的开发受到两个主要缺陷的阻碍：来自无关供体的多克隆活化CAR T细胞引起移植物抗宿主病(GVHD)的可能性，以及受体同种异体反应性T细胞对同种异体CAR T细胞的排斥。
概述
在第一方面，本公开内容提供了一种病毒特异性免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含与SEQ ID NO：26具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自CD28的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO：20具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：14具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：15具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：18具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含：(a)衍生自CD3ζ的胞内结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含与SEQ ID NO：25具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR还包含提供在抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。
在一些实施方案中，铰链区包含与SEQ ID NO：33具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO：35或36具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞包含CAR，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域，或病毒特异性免疫细胞包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域。
本公开内容还提供了一种病毒特异性免疫细胞，其包含：嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)特异性结合CD30的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的信号传导结构域；
其中所述病毒特异性免疫细胞包含CAR，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域，或所述病毒特异性免疫细胞包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞包含多于一种非相同CAR或编码多于一种非相同CAR的核酸。
在一些实施方案中，除CD30之外的靶抗原是癌细胞抗原。
在一些实施方案中，除CD30之外的靶抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38、BCMA、间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。
在一些实施方案中，除CD30之外的靶抗原是CD19。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞是病毒特异性T细胞。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞对EB病毒(EBV)具有特异性。
本公开内容还提供了一种产生病毒特异性免疫细胞的方法，包括：
修饰病毒特异性免疫细胞以包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含与SEQ ID NO：26具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自CD28的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO：20具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：14具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：15具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：18具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含：(a)衍生自CD3ζ的胞内结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含与SEQ ID NO：25具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR还包含提供在抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。
在一些实施方案中，铰链区包含与SEQ ID NO：33具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO：35或36具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞包含CAR，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域，或病毒特异性免疫细胞包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域。
本发明还提供了一种产生病毒特异性免疫细胞的方法，包括：
修饰病毒特异性免疫细胞以包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的信号传导结构域；
其中所述病毒特异性免疫细胞包含CAR，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域，或所述病毒特异性免疫细胞包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，该方法还包括：
修饰病毒特异性免疫细胞以包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含与除CD30之外的靶抗原特异性结合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞包含多于一种非相同CAR或编码多于一种非相同CAR的核酸。
在一些实施方案中，除CD30之外的靶抗原是癌细胞抗原。
在一些实施方案中，除CD30之外的靶抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38、BCMA、间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。
在一些实施方案中，除CD30之外的靶抗原是CD19。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞是病毒特异性T细胞。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞对EB病毒(EBV)具有特异性。
本公开内容还提供了通过根据本公开内容的方法获得或可获得的病毒特异性免疫细胞。
本公开内容还提供了包含根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物，其用于医学治疗或预防的方法。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物，其用于治疗或预防癌症的方法。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
本公开内容还提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，癌症选自：CD30阳性癌症、EBV相关癌症、血液学癌症、髓系血液恶性肿瘤、造血恶性肿瘤、淋巴母细胞血液恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征、白血病、T细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、EBV相关淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与X连锁淋巴细胞增殖性疾病相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV阳性淋巴瘤、口腔毛状白斑、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、中枢神经系统淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK阴性间变性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、NK-T细胞淋巴瘤、淋巴结外NK-T细胞淋巴瘤、胸腺瘤、多发性骨髓瘤、实体瘤、上皮细胞癌、胃肿瘤、胃癌、胃腺癌、胃肠道腺癌、肝癌、肝细胞癌、胆管癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌、口腔癌、口咽肿瘤、口咽癌、口癌、喉癌、鼻咽癌、食管癌、结直肠肿瘤、结直肠癌、结肠肿瘤、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、皮肤癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞肿瘤、肾细胞癌、卵巢肿瘤、卵巢癌、间皮瘤、乳腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、肥大细胞增多症、晚期全身性肥大细胞增多症、生殖细胞瘤或睾丸胚胎癌。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物，其用于治疗或预防以同种异体反应性免疫反应为特征的疾病或病况的方法。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物在制备用于治疗或预防以同种异体反应性免疫反应为特征的疾病或病况的药物中的用途。
本公开内容还提供了治疗或预防以同种异体反应性免疫反应为特征的疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，以同种异体反应性免疫反应为特征的疾病或病况是与同种异体移植相关联的疾病或病况。
在一些实施方案中，疾病或病况是移植物抗宿主病(GVHD)。
在一些实施方案中，疾病或病况是移植物排斥。
在一些实施方案中，该方法包括在收获同种异体移植物之前向同种异体移植物的供体受试者施用治疗性或预防有效量的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，该方法包括向同种异体移植物的受体受试者施用治疗或预防有效量的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，该方法包括使同种异体移植物与治疗或预防有效量的病毒特异性免疫细胞或组合物接触。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物，其用于通过同种异体移植治疗或预防疾病或病况的方法。
本公开内容还提供了根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物在制备用于通过同种异体移植治疗或预防疾病或病况的药物中的用途。
本公开内容还提供了通过同种异体移植治疗或预防疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗性或预防有效量的根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，该方法包括在收获同种异体移植物之前向同种异体移植物的供体受试者施用治疗性或预防有效量的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，该方法包括向同种异体移植物的受体受试者施用治疗或预防有效量的病毒特异性免疫细胞或药物组合物。
在一些实施方案中，该方法包括使同种异体移植物与治疗或预防有效量的病毒特异性免疫细胞或组合物接触。
在一些实施方案中，同种异体移植包括同种异体免疫细胞的过继转移。
在一些实施方案中，疾病或病况是T细胞功能异常病症、癌症或感染性疾病。
本公开内容还提供了杀伤同种异体反应性免疫细胞的方法，包括使同种异体反应性免疫细胞与根据本公开内容的病毒特异性免疫细胞或药物组合物接触。
描述
本发明人开发了一种CAR修饰的病毒特异性T细胞(CAR-VST)方法，用于在不引起GVHD的情况下消除恶性血液病，并避免同种异体排斥反应。
本公开内容提供了消除同种异体反应性T细胞以保护同种异体组织(包括现成细胞疗法)免受移植排斥或治疗GVHD的策略。
CD30已被鉴定为同种异体反应性T细胞的标志物，因此本发明人通过工程改造治疗性T细胞以表达针对CD30的嵌合抗原受体(CAR)(CD30.CAR)来靶向它们。表达CD30.CAR的VST可用于使用同种异体治疗的方法，以降低受体受试者的同种异体反应性免疫反应。
将同种异体T细胞施用到HLA不匹配的受体中具有同种异体反应性免疫反应(如GVHD)的风险，因为一部分T细胞固有地具有同种异体反应性。本发明人使用病毒特异性T细胞(VST)作为表达CD30.CAR的平台细胞，因为它们已被证明在同种异体受体中很少引起GVHD，这可能是其限制性TCR库的结果。具体而言，EB病毒特异性T细胞(EBVST)已被施用至超过300例同种异体受体而无任何GVHD证据。
此外，表达CD30.CAR的VST本身已被保护免受受体中同种异体反应性T细胞的排斥，因此可直接用作现成治疗，例如用于治疗CD30+癌症。
因此，CD30.CAR VST将(i)消除它们在同种异体宿主中引发的同种异体反应性T细胞，和(ii)持续足够的时间和具有必要的活性以消除CD30阳性癌症，而不引起GVHD。
表达CD30.CAR的VST也可经工程改造以靶向其他靶抗原，例如通过工程改造以表达对除CD30之外的其他靶抗原具有特异性的CAR。此类细胞可用作用于治疗例如表达相关靶抗原的癌症的现成治疗，因为它们能够杀死表达靶抗原的细胞，并且也能够消除表达CD30的同种异体T细胞。
病毒特异性免疫细胞
本公开内容涉及病毒特异性免疫细胞，特别是EB病毒(EBV)特异性免疫细胞。应理解，在细胞在本文中以单数形式提及(即“一个/一种/该细胞”)的情况下，还涵盖多个此类细胞/此类细胞的群体。
如本文所使用的“病毒特异性免疫细胞”是指对病毒具有特异性的免疫细胞。病毒特异性免疫细胞表达/包含能够识别病毒抗原的肽(例如当由MHC分子呈递时)的受体(优选地，T细胞受体)。病毒特异性免疫细胞可由于编码该抗原受体的内源性核酸的表达或由于已被工程改造以表达此类受体而表达/包含此类受体。病毒特异性免疫细胞优选地表达/包含对病毒抗原的肽具有特异性的TCR。
免疫细胞可以是造血来源的细胞，例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴样细胞(ILC)或其前体。免疫细胞可表达例如CD3多肽(例如CD3γ、CD3ε、CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞，例如CD3+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD3+ T细胞、CD4+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD3+ T细胞、CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞为T辅助细胞(TH细胞)。在一些实施方案中，T细胞为细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。
病毒特异性T细胞可响应于T细胞对其具有特异性的病毒抗原或响应于包含/表达病毒/抗原的细胞的T细胞展现某些功能特性。在一些实施方案中，所述特性为与效应T细胞例如细胞毒性T细胞相关的功能特性。
在一些实施方案中，病毒特异性T细胞可展现以下特性中的一个或多个：对包含/表达T细胞对其具有特异性的病毒/病毒抗原的细胞具有细胞毒性；响应于用T细胞对其具有特异性的病毒/病毒抗原进行的刺激或响应于对包含/表达T细胞对其具有特异性的病毒/病毒抗原的细胞的暴露的增殖、IFNγ表达、CD107a表达、IL-2表达、TNFα表达、穿孔蛋白表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达和/或FAS配位体(FASL)表达。
病毒特异性T细胞表达/包含当由适当MHC分子呈递时能够识别T细胞对其具有特异性的病毒抗原的肽的TCR。病毒特异性T细胞可以是CD4+ T细胞及/或CD8+ T细胞。
病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒可以是任何病毒。举例而言，病毒可以是dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssRNA病毒(例如小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)、(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、棒状病毒)、ssRNA-RT病毒(例如逆转录病毒)或dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。具体地，本公开内容涵盖以下科的病毒：腺病毒科、疱疹病毒科、乳头状瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、小病毒科、星状病毒科、杯状病毒科、小核糖核酸病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、肝炎病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、副黏液病毒科、棒状病毒科及呼肠孤病毒科。在一些实施方案中，病毒选自EB病毒、腺病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、人类巨细胞病毒、8型人类疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、B型肝炎病毒、小病毒B19、人类星状病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、A型肝炎病毒、脊髓灰白质炎病毒、鼻病毒、重度急性呼吸道症候群病毒、C型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、TBE病毒、德国麻疹病毒、E型肝炎病毒、人类免疫缺乏病毒、流感病毒、拉沙病毒、克里米亚刚果出血热病毒、汉坦病毒、伊波拉病毒、马堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、小核糖核酸病毒、呼吸道融合细胞病毒、狂犬病病毒、D型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁虱热病毒及班纳病毒。
在一些实施方案中，病毒选自EB病毒(EBV)、腺病毒、巨细胞病毒(CMV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞可对例如选自以下的病毒的肽/多肽具有特异性：EB病毒(EBV)、腺病毒、巨细胞病毒(CMV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。
对病毒的抗原具有特异性的T细胞可在本文中称为病毒特异性T细胞(VST)。对特定病毒的抗原具有特异性的T细胞可被描述为对相关病毒具有特异性；举例而言，对EBV的抗原具有特异性的T细胞可被称为EBV特异性T细胞或“EBVST”。
因此，在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞为EB病毒特异性T细胞(EBVST)、腺病毒特异性T细胞(AdVST)、巨细胞病毒特异性T细胞(CMVST)、人类乳头状瘤病毒(HPVST)、流感病毒特异性T细胞、麻疹病毒特异性T细胞、B型肝炎病毒特异性T细胞(HBVST)、C型肝炎病毒特异性T细胞(HCVST)、人类免疫缺乏病毒特异性T细胞(HIVST)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特异性T细胞(LCMVST)或单纯疱疹病毒特异性T细胞(HSVST)。
在一些优选实施方案中，病毒特异性免疫细胞对EBV抗原的肽/多肽具有特异性。在优选实施方案中，病毒特异性免疫细胞为EB病毒特异性T细胞(EBVST)。
EBV病毒学描述于例如Stanfield and Luftiq,F1000Res.(2017)6:386和Odumade等人,Clin Microbiol Rev(2011)24(1):193-209中，其均在此以全文引用的方式并入本文。
EBV通过病毒蛋白BMFR2与β1整合素的结合和病毒蛋白gH/gL与整合素avβ6和avβ8的结合来感染上皮细胞。EBV通过病毒糖蛋白gp350与CD21和/或CD35的相互作用、随后病毒gp42与II类MHC的相互作用来感染B细胞。这些相互作用触发病毒包膜与细胞膜的融合，从而使病毒进入细胞中。一旦进入，则病毒衣壳溶解并且病毒基因组被转运至核。
EBV具有两个复制模式；潜伏和溶解。潜伏循环不引起病毒粒子产生，并且可在适当位置发生在B细胞和上皮细胞中。EBV基因组环形DNA作为附加体驻存于细胞核中并且被宿主细胞的DNA聚合酶复制。在潜伏期，仅一部分EBV的基因在三种不同的被称为潜伏程序的模式中的一种中表达，从而产生不同组的病毒蛋白和RNA。潜伏循环描述于例如Amon andFarrell,Reviews in Medical Virology(2004)15(3):149–56中，该文献在此以全文引用的方式并入。
EBNA1蛋白和非编码RNA EBER在潜伏程序I-III中的每一个中被表达。潜伏程序II和III进一步涉及EBNALP、LMP1、LMP2A和LMP2B蛋白的表达，并且潜伏程序III进一步涉及EBNA2、EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C的表达。
EBNA1为多功能的，并且在基因调节、染色体外复制和通过病毒启动子的正和负调节进行的EBV游离型基因组维持中发挥作用(Duellman等人,J Gen Virol.(2009)；90(Pt9):2251-2259)。EBNA2参与潜伏病毒转录的调节并且促进感染EBV的细胞的永生化(Kempkes and Ling,Curr Top Microbiol Immunol.(2015)391:35-59)。EBNA-LP是天然B细胞的转型所需的，并且募集转录因子以用于病毒复制(Szymula等人,PLoS Pathog.(2018)；14(2):e1006890)。EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C与RBPJ相互作用以影响基因表达，从而促进被感染细胞的存活和生长(Wang等人,J Virol.(2016)90(6):2906-2919)。LMP1调节参与B细胞活化的基因的表达(Chang等人,J.Biomed.Sci.(2003)10(5):490-504)。LMP2A和LMP2B通过模拟活化的B细胞受体来抑制正常B细胞信号传导(Portis and Longnecker,Oncogene(2004)23(53):8619-8628)。EBER与宿主细胞蛋白形成核糖核蛋白复合物，并且被提议在细胞转化中发挥作用。
潜伏循环可根据潜伏程序I至III中的任一个在B细胞中发展，并且通常自III发展至II发展至I。在感染静止幼稚B细胞时，EBV进入潜伏程序III。潜伏III基因的表达活化B细胞，该B细胞变成增殖性母细胞。随后，EBV通常通过将表达限于基因子集，从而引起母细胞分化为记忆B细胞来发展至潜伏II。基因表达的进一步限制使EBV进入潜伏I。当记忆B细胞分裂时，EBNA1表达允许EBV复制。在上皮细胞中，仅存在潜伏II。
在初次感染中，EBV在口咽上皮细胞中复制并且在B淋巴细胞中建立潜伏III、II和I感染。B淋巴细胞的EBV潜伏感染是病毒续存、在上皮细胞中的后续复制和感染性病毒在唾液中的释放所需的。B淋巴细胞的EBV潜伏III和II感染、口腔上皮细胞的潜伏II感染和NK细胞或T细胞的潜伏II感染可能会导致由均一EBV基因组存在和基因表达标记的恶性肿瘤。
B细胞中的潜伏EBV可被再活化以切换成溶解复制。溶解循环引起感染性病毒粒子产生并且可在适当位置发生在B细胞和上皮细胞中，并且例如由Kenney在Arvin等人,HumanHerpesviruses:Biology,Therapy and Immunoprophylaxis；Cambridge UniversityPress(2007)的第25章中综述，该文献在此以全文引用的方式并入。
溶解复制需要EBV基因组为线性的。潜伏EBV基因组为游离型的，并且因此其必须被线性化以用于溶解再活化。在B细胞中，溶解复制通常仅在从潜伏再活化之后发生。
诸如BZFL1和BRLF1的立即早期溶解基因产物充当转活化因子，从而增强其自身表达和后续溶解循环基因的表达。
早期溶解基因产物在病毒复制(例如EBV DNA聚合酶催化组分BALF5；DNA聚合酶进行性因子BMRF1、DNA结合蛋白BALF2、解螺旋酶BBLF4、引发酶BSLF1和引发酶相关蛋白BBLF2/3)和去氧核苷酸代谢(例如胸苷激酶BXLF1、dUTPase BORF2)中发挥作用。其他早期溶解基因产物起转录因子作用(例如BMRF1、BRRF1)，在RNA稳定性和加工中发挥作用(例如BMLF1)，或参与免疫逃避(例如抑制细胞凋亡的BHRF1)。
晚期溶解基因产物传统上被分类为在病毒复制开始之后表达的那些。其一般编码病毒粒子的结构性组分诸如核衣壳蛋白以及介导EBV结合和融合的糖蛋白(例如gp350/220、gp85、gp42、gp25)。其他晚期溶解基因产物在免疫逃避中发挥作用；BCLF1编码IL-10的病毒同源物，并且BALF1编码与抗细胞凋亡蛋白Bcl2具有同源性的蛋白。
如本文所使用的“EBV特异性免疫细胞”是指对EB病毒(EBV)具有特异性的免疫细胞。EBV特异性免疫细胞表达/包含能够识别EBV抗原的肽(例如当由MHC分子呈递时)的受体(优选地，T细胞受体)。EBV特异性免疫细胞优选地表达/包含对由I类MHC呈递的EBV抗原的肽具有特异性的TCR。
在一些实施方案中，EBV特异性免疫细胞为T细胞例如CD3+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD3+ T细胞、CD4+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD3+ T细胞、CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞为T辅助细胞(TH细胞)。在一些实施方案中，T细胞为细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。
EBV特异性T细胞可响应于T细胞对其具有特异性的EBV抗原或响应于包含/表达EBV的细胞(例如感染EBV的细胞)或相关EBV抗原的T细胞展现某些功能特性。在一些实施方案中，所述特性为与效应T细胞例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)相关的功能特性。
在一些实施方案中，EBV特异性T细胞可展现以下特性中的一个或多个：对包含/表达T细胞对其具有特异性的EBV/EBV抗原的细胞具有细胞毒性；响应于用T细胞对其具有特异性的EBV/EBV抗原进行的刺激或响应于对包含/表达T细胞对其具有特异性的EBV/EBV抗原的细胞的暴露的增殖、IFNγ表达、CD107a表达、IL-2表达、TNFα表达、穿孔蛋白表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达和/或FAS配位体(FASL)表达。
EBV特异性T细胞优选地表达/包含当由适当MHC分子呈递时能够识别T细胞对其具有特异性的EBV抗原的肽的TCR。EBV特异性T细胞可以是CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
对EBV具有特异性的免疫细胞可对任何EBV抗原例如本文所描述的EBV抗原具有特异性。对EBV具有特异性的免疫细胞群体或包含对EBV具有特异性的多个免疫细胞的组合物可包含对一种或多种EBV抗原具有特异性的免疫细胞。
在一些实施方案中，EBV抗原为EBV潜伏抗原例如III型潜伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B或EBNA3C)、II型潜伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B或BARF1)或I型潜伏抗原(例如EBNA1或BARF1)。在一些实施方案中，EBV抗原为EBV溶解抗原例如立即早期溶解抗原(例如BZLF1、BRLF1或BMRF1)、早期溶解抗原(例如BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU或EBNA1-FUK)或晚期溶解抗原(例如BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3或gp350)。
嵌合抗原受体
本公开内容涉及包含/表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒特异性免疫细胞。
嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合功能和T细胞活化功能的重组受体分子。CAR结构和工程改造综述于例如Dotti等人,Immunol Rev(2014)257(1)中，该文献在此以全文引用的方式并入。
CAR包含通过跨膜结构域连接至信号传导结构域的抗原结合结构域。任选的铰链结构域或间隔子结构域可在抗原结合结构域与跨膜结构域之间提供分离，并且可充当柔性接头。当由细胞表达时，抗原结合结构域提供在胞外空间中，并且信号传导结构域在细胞内。
抗原结合结构域介导与CAR对其具有特异性的靶抗原的结合。CAR的抗原结合结构域可基于对CAR所靶向的抗原具有特异性的抗体的抗原结合区。举例而言，CAR的抗原结合结构域可包含特异性结合靶抗原的抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列。CAR的抗原结合结构域可包含以下或由以下组成：特异性结合靶抗原的抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列。抗原结合结构域可以以包含抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列的序列的单链可变片段(scFv)形式提供。CAR的抗原结合结构域可基于其他蛋白质:蛋白质相互作用诸如配体:受体结合靶向抗原；举例而言，靶向IL-13Rα2的CAR已使用基于IL-13的抗原结合结构域开发(参见例如Kahlon等人2004Cancer Res 64(24):9160-9166)。
跨膜结构域提供在CAR的抗原结合结构域与信号传导结构域之间。跨膜结构域提供CAR向表达CAR的细胞的细胞膜的锚定，其中抗原结合结构域在胞外空间中并且信号传导结构域在细胞内部。CAR的跨膜结构域可衍生自细胞膜结合蛋白(例如CD28、CD8等)的跨膜区序列。
在整个本说明书中，“衍生自”参考多肽/结构域/氨基酸序列的多肽、结构域和氨基酸序列与参考多肽/结构域/氨基酸序列的氨基酸序列具有至少60％、优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性。“衍生自”参考多肽/结构域/氨基酸序列的多肽、结构域和氨基酸序列优选地保留参考多肽/结构域/氨基酸序列的功能和/或结构特性。
作为示例，衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列可包含与例如如SEQ ID NO：26中所示的CD28的胞内结构域具有60％、优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此外，衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列优选地保留SEQ ID NO：26的氨基酸序列的功能特性，即活化CD28介导的信号传导的能力。
给定多肽或其结构域的氨基酸序列可从本领域技术人员已知的数据库检索，或由从本领域技术人员已知的数据库检索的核酸序列决定。此类数据库包括Genbank、EMBL和UniProt。
信号传导结构域包含免疫细胞功能活化所需的氨基酸序列。CAR信号传导结构域可包含提供免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)以用于表达CAR的细胞的磷酸化和活化的CD3-ζ的胞内结构域的氨基酸序列。包含其他含ITAM蛋白的序列的信号传导结构域还用于CAR中，诸如包含FcγRI的含ITAM区的结构域(Haynes等人,2001 J Immunol 166(1):182-187)。包含衍生自CD3-ζ的胞内结构域的信号传导结构域的CAR常常被称为第一代CAR。
CAR的信号传导结构域通常还包含共刺激性蛋白(例如CD28、4-1BB等)的信号传导结构域以提供增强免疫细胞活化和效应功能所需的共刺激性信号。具有包括额外共刺激性序列的信号传导结构域的CAR常常被称为第二代CAR。在一些情况下，CAR被工程改造以提供不同胞内信号传导途径的共刺激。举例而言，CD28共刺激优先活化磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)途径，而4-1BB共刺激通过TNF受体相关因子(TRAF)衔接蛋白来触发信号传导。因此，CAR的信号传导结构域有时含有衍生自超过一种共刺激性分子的信号传导结构域的共刺激性序列。包含具有多个共刺激性序列的信号传导结构域的CAR常常被称为第三代CAR。
任选的铰链区或间隔子区可在抗原结合结构域与跨膜结构域之间提供分离，并且可充当柔性接头。此类区域可以是或包含可例如衍生自IgG的CH1-CH2铰链区的允许结合部分在不同方向定向的柔性结构域。
通过工程改造以表达对特定靶抗原具有特异性的CAR，免疫细胞(通常为T细胞，以及其他免疫细胞诸如NK细胞)可被导引以杀伤表达靶抗原的细胞。表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)与CAR-T细胞对其具有特异性的靶抗原的结合触发胞内信号传导并且因此触发T细胞活化。活化的CAR-T细胞被刺激以分裂并且产生引起对表达靶抗原的细胞的杀伤的因子。
抗原结合结构域
“抗原结合结构域”是指能够结合靶抗原的区域。靶抗原可例如为肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。本公开内容的抗原结合结构域可衍生自针对靶抗原或另一靶抗原结合分子(例如靶抗原结合肽或核酸适体、配体或其他分子)的抗体/抗体片段(例如Fv、scFv、Fab、单链Fab(scFab)、单结构域抗体(例如VhH)等)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含能够特异性结合靶抗原的抗体的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，能够结合靶抗原的区域包含以下或由以下组成：抗原结合肽/多肽，例如肽适体、硫氧还蛋白、monobody、anticalin、Kunitz结构域、avimer、knottin、fynomer、atrimer、DARPin、affibody、纳米抗体(即单结构域抗体(sdAb))、affilin、犰狳重复蛋白(ArmRP)、OBody或纤连蛋白-综述于例如Reverdatto等人,Curr Top Med Chem.2015；15(12):1082-1101中，该文献在此以全文引用的方式并入(还参见例如Boersma等人,J Biol Chem(2011)286:41273-85和Emanuel等人,Mabs(2011)3:38-48)。
本公开内容的抗原结合结构域一般包含能够特异性结合靶抗原的抗体的VH和VL。抗体一般包含六个互补决定区CDR；三个在重链可变区(VH)中：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，并且三个在轻链可变区(VL)中：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。六个CDR一起界定抗体的互补位，该互补位为结合靶抗原的抗体的一部分。VH区和VL区在各CDR的任一侧包含构架区(FR)，此类FR为CDR提供支架。从N端至C端，VH包含以下结构：N端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C端；并且VL包含以下结构:N端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C端。
VH和VL序列可以以任何合适形式提供，条件是抗原结合结构域可连接至CAR的其他结构域。结合本公开内容的抗原结合结构域涵盖的形式包括描述于Carter,Nat.Rev.Immunol(2006),6:343-357中的形式，诸如scFv、dsFV、(scFv)2双特异性抗体(diabody)、三特异性抗体(triabody)、四特异性抗体(tetrabody)、Fab、微型抗体和F(ab)2形式。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含能够结合靶抗原的抗体/抗体片段的CDR。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含能够结合靶抗原的抗体/抗体片段的VH区和VL区。包含抗体的VH和VL的部分还可在本文中被称为可变片段(Fv)。VH和VL可提供在同一多肽链上，并且通过接头序列连结；此类部分被称为单链可变片段(scFv)。适用于制备scFv的接头序列为技术人员已知，并且可包含丝氨酸和甘氨酸残基。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含以下或由以下组成：能够结合靶抗原的Fv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含以下或由以下组成：能够结合靶抗原的scFv。
抗原结合结构域(和因此CAR)对其具有特异性的靶抗原可以是任何靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是其表达/活性或其上调的表达/活性与疾病或病症(例如癌症、感染性疾病或自体免疫疾病)正相关的抗原。靶抗原优选在表达靶抗原的细胞的细胞表面处被表达。应理解，CAR引导表达CAR的细胞针对表达靶抗原的细胞/组织的效应活性，CAR包含对该靶抗原具有特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，靶抗原可以是癌细胞抗原。癌细胞抗原为由癌细胞表达或过度表达的抗原。癌细胞抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌细胞抗原的表达可能与癌症相关。癌细胞抗原可由癌细胞异常表达(例如，癌细胞抗原可在具有异常定位的情况下表达)，或可在具有异常结构的情况下由癌细胞表达。癌细胞抗原可能够引发免疫反应。在一些实施方案中，抗原在癌细胞的细胞表面处被表达(即，癌细胞抗原为癌细胞表面抗原)。在一些实施方案中，由本文所描述的抗原结合分子结合的抗原的一部分呈递于癌细胞的外表面上(即为胞外的)。癌细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方案中，癌细胞抗原是其表达与癌症症状的发展、恶化或严重程度相关的抗原。癌症相关抗原可能与癌症的病因或病理相关，或可能由于癌症而异常表达。在一些实施方案中，癌细胞抗原是其表达例如与通过可比较的非癌细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的非癌细胞)进行的表达水平相比由癌细胞上调(例如在RNA和/或蛋白质水平上)的抗原。在一些实施方案中，癌症相关抗原可能优先由癌细胞表达，并且不由可比较的非癌细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的非癌细胞)表达。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是突变的致癌基因或突变的肿瘤抑制基因的产物。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是过度表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的癌抗原、癌胚抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。
Zarour HM,DeLeo A,Finn OJ,等人,Categories of Tumor Antigens.In:KufeDW,Pollock RE,Weichselbaum RR,等人,editors.Holland-Frei Cancer Medicine.第6版.Hamilton(ON):BC Decker；2003综述了癌细胞抗原。癌细胞抗原包括癌胚抗原：CEA、未成熟层连结蛋白受体、TAG-72；癌病毒抗原，诸如HPV E6和HPV E7；过度表达的蛋白质：BING-4、钙活化氯离子通道2、周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、HER2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、存活素；睾丸癌抗原：BAGE、CAGE、GAGE、MAGE、SAGE、XAGE、CT9、CT10、NY-ESO-1、PRAME、SSX-2；谱系限制性抗原：MART1、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1/2、MC1R、前列腺特异性抗原；突变的抗原：β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII；翻译后改变的抗原：MUC1、独特型抗原：Ig、TCR。其他癌细胞抗原包括热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)、葡萄糖调节的蛋白78(GRP78)、波形蛋白、核仁素、胎儿腺泡胰脏蛋白(FAPP)、碱性磷酸酶胎盘样2(ALPPL-2)、siglec-5、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)和亲环蛋白B。
在一些实施方案中，癌细胞抗原是描述于Zhao and Cao,Front Immunol.(2019)10:2250中的癌细胞抗原，该文献在此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，癌细胞抗原选自CD30、CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38、BCMA、间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。
在一些实施方案中，癌细胞抗原是由血液恶性肿瘤的细胞表达的抗原。在一些实施方案中，癌细胞抗原选自CD30、CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38和BCMA。
在一些实施方案中，癌细胞抗原是由实体肿瘤的细胞表达的抗原。在一些实施方案中，癌细胞抗原选自间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。
在一些实施方案中，癌细胞抗原是CD19。CD19是B细胞标记物，并且是例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)治疗的有用靶标—参见例如Wang等人,Exp Hematol Oncol.(2012)1:36。
在一些实施方案中，抗原结合结构域(和因此CAR)是多特异性的。“多特异性”意指抗原结合结构域展现与超过一个靶标的特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域是双特异性抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合分子包含至少两个不同抗原结合部分(即至少两个抗原结合部分，例如包含非相同VH和VL)。多特异性抗原结合结构域的个体抗原结合部分可例如通过接头序列连接。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至少两个非相同靶抗原，并且因此为至少双特异性的。术语“双特异性”意指抗原结合结构域能够特异性结合少两个不同抗原决定簇。在一些实施方案中，多特异性抗原结合结构域/CAR的靶抗原中的至少一个为CD30。
靶抗原中的每一个可独立地为如本文所描述的靶抗原。在一些实施方案中，各靶抗原独立地为如本文所描述的癌细胞抗原。
应理解，本公开内容的抗原结合结构域(例如多特异性抗原结合结构域)包含能够结合抗原结合结构域对其具有特异性的一个或多个靶标的抗原结合部分。举例而言，能够结合CD30和除CD30之外的抗原的抗原结合结构域可包含：(i)能够结合CD30的抗原结合部分，和(ii)能够结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合部分。
在本公开内容的方面和实施方案中，靶抗原为CD30。因此，在本公开内容的一些方面和实施方案中，抗原结合结构域为CD30结合结构域。
CD30(还称为TNFRSF8)是由UniProt:P28908标识的蛋白质。CD30是肿瘤坏死因子受体超家族的单通道I型跨膜糖蛋白。CD30结构和功能描述于例如van der Weyden等人,Blood Cancer Journal(2017)7:e603以及Muta and Podack Immunol.Res.(2013)57(1-3):151-8中，其均在此以全文引用的方式并入。
由人类TNFRSF8基因编码的mRNA的替代剪接产生三种同种型：同种型1(“长”同种型；UniProt:P28908-1，v1；SEQ ID NO：1)；同种型2(“细胞质”、“短”或“C30V”同种型，UniProt:P28908-2；SEQ ID NO：2)，其中对应于SEQ ID NO：1的位置1至463的氨基酸序列缺失；和同种型3(UniProt:P28908-3；SEQ ID NO：3)，其中对应于SEQ ID NO：1的位置1至111和位置446的氨基酸序列缺失。SEQ ID NO：1的N端18个氨基酸形成信号肽(SEQ ID NO：4)、接着为367个氨基酸的胞外结构域(SEQ ID NO：1的位置19至385，示于SEQ ID NO：5中)、21个氨基酸的跨膜结构域(SEQ ID NO：1的位置386至406，示于SEQ ID NO：6中)和189个氨基酸的细胞质结构域(SEQ ID NO：1的位置407至595，示于SEQ ID NO：7中)。
在本说明书中，“CD30”是指来自任何物种的CD30并且包括来自任何物种的CD30同种型、片段、变体或同源物。如本文所使用的参考蛋白的“片段”、“变体”或“同源物”可任选地被表征为与参考蛋白(例如参考同种型)的氨基酸序列具有至少60％、优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，参考蛋白的片段、变体、同种型和同源物的特征可在于执行参考蛋白所执行的功能的能力。
在一些实施方案中，CD30来自哺乳动物(例如灵长类动物(恒河猴、猕猴或人类)和/或啮齿动物(例如大鼠或鼠类)CD30)。在优选实施方案中，CD30为人类CD30。同种型、片段、变体或同源物可任选地被表征为与来自给定物种例如人类的未成熟或成熟CD30同种型的氨基酸序列具有至少70％、优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性。CD30的片段的最小长度可以是10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或590个氨基酸中的一个并且最大长度可以是10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或595个氨基酸中的一个。
在一些实施方案中，CD30包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：1、2或3具有至少70％、优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD30包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：5具有至少70％、优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD30的片段包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：5或19具有至少70％、优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本公开内容的CAR的CD30结合结构域优选地展现与CD30或其片段的特异性结合。本公开内容的CAR的CD30结合结构域优选地展现与CD30的胞外结构域的特异性结合。CD30结合结构域可衍生自抗CD30抗体或其他CD30结合剂例如CD30结合肽或CD30结合小分子。
CD30结合结构域可衍生自抗CD30抗体的抗原结合部分。
抗CD30抗体包括HRS3和HRS4(描述于例如Hombach等人,Scand J Immunol(1998)48(5):497-501中)、HRS3衍生物(描述于Schlapschy等人,Protein Engineering,Designand Selection(2004)17(12):847-860中)、BerH2(MBL国际目录号K0145-3，RRID:AB_590975)、SGN-30(也称为cAC10，描述于例如Forero-Torres等人,Br J Haematol(2009)146:171-9中)、MDX-060(描述于例如Ansell等人,J Clin Oncol(2007)25:2764-9中；也称为5F11、伊妥木单抗)和MDX-1401(描述于例如Cardarelli等人,Clin Cancer Res.(2009)15(10):3376-83中)以及WO 2020/068764 A1、WO 2003/059282 A2、WO 2006/089232 A2、WO2007/084672 A2、WO 2007/044616 A2、WO 2005/001038 A2、US 2007/166309 A1、US 2007/258987 A1、WO 2004/010957 A2和US 2005/009769 A1中所描述的抗CD30抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的CD30结合结构域包含抗CD30抗体的CDR。在一些实施方案中，本公开内容的CD30结合结构域包含抗CD30抗体的VH区和VL区。在一些实施方案中，本公开内容的CD30结合结构域包含有包含抗CD30抗体的VH区和VL区的scFv。
存在数个用于界定抗体CDR和FR的不同惯例，诸如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)、Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)中所描述的那些；和如Retter等人,Nucl.Acids Res.(2005)33(suppl 1):D671-D674中所描述的VBASE2。本文所描述的抗体的VH区和VL区的CDR和FR根据VBASE2界定。
在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合结构域包含：
并入以下CDR的VH：
具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代；和
并入以下CDR的VL：
具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的LC-CDR3，
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：
VH，其包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列；和
VL，其包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD30结合结构域可包含以下或由以下组成：包含如本文所描述的VH序列和VL序列的单链可变片段(scFv)。VH序列与VL序列可共价连接。在一些实施方案中，VH序列与VL序列通过柔性接头序列例如如本文所描述的柔性接头序列连接。柔性接头序列可连结至VH序列和VL序列的末端，由此连接VH序列与VL序列。在一些实施方案中，VH与VL通过包含以下或由以下组成的接头序列连结：SEQ ID NO：16或17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD30结合结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD30结合结构域能够例如在CD30的胞外结构域中结合CD30。在一些实施方案中，CD30结合结构域能够结合示于SEQ ID NO：19中的例如在根据SEQ IDNO：1编号的人类CD30的氨基酸位置185-335的区域内的由抗体HRS3结合的CD30的表位(Schlapschy等人,Protein Engineering,Design and Selection(2004)17(12):847-860，该文献在此以全文引用的方式并入)。
在一些实施方案中，靶抗原为CD19。因此，在本公开内容的一些方面和实施方案中，抗原结合结构域为CD19结合结构域。
CD19是由UniProt P15391-1,v6标识的蛋白质。在本说明书中，“CD19”是指来自任何物种的CD19并且包括来自任何物种的CD19同种型(例如P15391-2)、片段、变体(包括突变体)或同源物。
CD19结合结构域可衍生自抗CD19抗体的抗原结合部分。抗CD19抗体包括描述于例如Zola等人,Immunology and Cell Biology(1991)69:411-422中的FMC63。
在一些实施方案中，本公开内容的CD19结合结构域包含抗CD19抗体的CDR。在一些实施方案中，本公开内容的CD19结合结构域包含抗CD19抗体的VH区和VL区。在一些实施方案中，本公开内容的CD19结合结构域包含有包含抗CD19抗体的VH区和VL区的scFv。
在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合结构域包含：
并入以下CDR的VH：
具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代；和
并入以下CDR的VL：
具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的LC-CDR3，
或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：
VH，其包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列；和
VL，其包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合结构域可包含以下或由以下组成：包含如本文所描述的VH序列和VL序列的单链可变片段(scFv)。VH序列与VL序列可共价连接。在一些实施方案中，VH序列与VL序列通过柔性接头序列例如如本文所描述的柔性接头序列连接。柔性接头序列可连结至VH序列和VL序列的末端，由此连接VH序列与VL序列。在一些实施方案中，VH与VL通过包含以下或由以下组成的接头序列连结：SEQ ID NO：16或45的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合结构域能够例如在CD19的胞外结构域中结合CD19。在一些实施方案中，CD19结合结构域能够结合由抗体FMC63结合的CD19的表位。
跨膜结构域
本公开内容的CAR包含跨膜结构域。跨膜结构域是指由在生物膜例如细胞膜中热力学上稳定的氨基酸序列形成的任何三维结构。结合本公开内容，跨膜结构域可以是跨越表达CAR的细胞的细胞膜的氨基酸序列。
跨膜结构域可包含以下或由以下组成：形成疏水性α螺旋体或β-筒状体的氨基酸序列。本公开内容的CAR的跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可衍生自包含跨膜结构域的蛋白质的跨膜结构域的氨基酸序列。跨膜结构域记录于诸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、Protein Information Resource、Protein Data Bank、Ensembl和InterPro的数据库中，和/或可例如使用诸如TMHMM(Krogh等人,2001J Mol Biol 305:567-580)的氨基酸序列分析工具识别/预测。
在一些实施方案中，本公开内容的CAR的跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可衍生自在细胞表面处表达的蛋白质的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，在细胞表面处表达的蛋白质是例如免疫受体或配体的受体或配体。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可衍生自以下中的一个的跨膜结构域的氨基酸序列：ICOS、ICOSL、CD86、CTLA-4、CD28、CD80、I类MHCα、II类MHCα、II类MHCβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3-ζ、TCRαTCRβ、CD4、CD8α、CD8β、CD40、CD40L、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BB、4-1BBL、OX40、OX40L、GITR、GITRL、TIM-3、半乳糖凝集素9、LAG3、CD27、CD70、LIGHT、HVEM、TIM-4、TIM-1、ICAM1、LFA-1、LFA-3、CD2、BTLA、CD160、LILRB4、LILRB2、VTCN1、CD2、CD48、2B4、SLAM、CD30、CD30L、DR3、TL1A、CD226、CD155、CD112和CD276。在一些实施方案中，跨膜结构域是或衍生自CD28、CD3-ζ、CD8α、CD8β或CD4的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域是或衍生自CD28的跨膜结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：20或48的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
信号传导结构域
本公开内容的嵌合抗原受体包含信号传导结构域。信号传导结构域提供用于在表达CAR的细胞中引发胞内信号传导的序列。
含ITAM的序列
信号传导结构域包含含ITAM的序列。含ITAM的序列包含一个或多个免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。ITAM包含氨基酸序列YXXL/I(SEQ ID NO：23)，其中“X”指代任何氨基酸。在含ITAM的蛋白中，根据SEQ ID NO：23的序列常常间隔6至8个氨基酸：YXXL/I(X)6- 8YXXL/I(SEQ ID NO：24)。当通过酪氨酸激酶将磷酸基团添加至ITAM的酪氨酸残基中时，在细胞内引发信号传导级联。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含根据SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，信号传导结构域包含根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列的至少1、2、3、4、5或6个拷贝。在一些实施方案中，信号传导结构域包含根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列的至少1、2或3个拷贝。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含作为或衍生自具有含ITAM的氨基酸序列的蛋白质的含ITAM的序列的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号传导结构域包含作为或衍生自CD3-ζ、FcγRI、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD79α、CD79β、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIV或DAP12中的一个的胞内结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号传导结构域包含作为或衍生自CD3-ζ的胞内结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
共刺激性序列
信号传导结构域可另外包含一个或多个共刺激性序列。共刺激性序列是提供本公开内容的表达CAR的细胞的共刺激的氨基酸序列。共刺激促进表达CAR的细胞在结合靶抗原时的增殖和存活，并且还可促进通过表达CAR的细胞进行的细胞因子产生、分化、细胞毒性功能和记忆形成。T细胞共刺激的分子机制综述于Chen and Flies,(2013)Nat RevImmunol 13(4):227-242中。
共刺激性序列可以是或可衍生自共刺激性蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激性序列是作为或衍生自共刺激性蛋白的胞内结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。
在CAR与靶抗原结合后，共刺激性序列向表达CAR的细胞提供会由衍生共刺激性序列的共刺激性蛋白在其同源配体接合时提供的种类的共刺激。举例而言，在包含含有衍生自CD28的共刺激性序列的信号传导结构域的CAR情况下，与靶抗原的结合在表达CAR的细胞中触发会通过CD80和/或CD86与CD28的结合触发的种类的信号传导。因此，共刺激性序列能够递送衍生共刺激性序列的共刺激性蛋白的共刺激信号。
在一些实施方案中，共刺激性蛋白可以是B7-CD28超家族的成员(例如CD28、ICOS)或TNF受体超家族的成员(例如4-1BB、OX40、CD27、DR3、GITR、CD30、HVEM)。在一些实施方案中，共刺激性序列是或衍生自CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40、HVEM、CD2、SLAM、TIM-1、CD30、GITR、DR3、CD226和LIGHT中的一个的胞内结构域。在一些实施方案中，共刺激性序列是或衍生自CD28的胞内结构域。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含超过一个非重叠共刺激性序列。在一些实施方案中，信号传导结构域包含1、2、3、4、5或6个共刺激性序列。多个共刺激性序列可以以串联方式提供。
给定氨基酸序列是否能够引发由给定共刺激性蛋白介导的信号传导可例如通过分析由共刺激性蛋白介导的信号传导的相关性(例如表达/活性由于由共刺激性蛋白介导的信号传导而被上调或下调的因子的表达/活性)来进行研究。
共刺激性蛋白通过数个转导途径上调促进细胞生长、效应功能和存活的基因的表达。举例而言，CD28和ICOS通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和AKT进行信号传导以通过NF-κB、mTOR、NFAT和AP1/2上调促进细胞生长、效应功能和存活的基因的表达。CD28还通过CDC42/RAC1活化AP1/2并且通过RAS活化ERK1/2，并且ICOS活化C-MAF。4-1BB、OX40和CD27募集TNF受体相关因子(TRAF)并且通过MAPK途径以及通过PI3K进行信号传导。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含作为或衍生自CD28的共刺激性序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，该共刺激性序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
Kofler等人Mol.Ther.(2011)19:760-767描述变体CD28胞内结构域，其中lck激酶结合位点被突变以便减少对CAR接合时IL-2产生的诱导，以便最小化对CAR-T细胞活性的调节性T细胞介导的抑制。变体CD28胞内结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO：27中。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，该共刺激性序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含作为或衍生自4-1BB的共刺激性序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，该共刺激性序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
铰链区
CAR可进一步包含铰链区。铰链区可提供在抗原结合结构域与跨膜结构域之间。铰链区还可被称为间隔子区。铰链区是向CAR的抗原结合结构域与跨膜结构域提供柔性键联的氨基酸序列。
已显示铰链区的存在、不存在和长度影响CAR功能(综述于例如Dotti等人,Immunol Rev(2014)257(1)中，同上)。
在一些实施方案中，CAR包含含有以下或由以下组成的铰链区：作为或衍生自人类IgG1的CH1-CH2铰链区的氨基酸序列；衍生自CD8α的铰链区，例如如WO 2012/031744 A1中所描述；或衍生自CD28的铰链区，例如如WO 2011/041093 A1中所描述。在一些实施方案中，CAR包含衍生自人类IgG1的CH1-CH2铰链区的铰链区。
在一些实施方案中，铰链区包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含衍生自人类IgG4的CH1-CH2铰链区的铰链区。
在一些实施方案中，铰链区包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含铰链区，该铰链区包含以下或由以下组成：作为或衍生自人类IgG1的CH2-CH3区(即Fc区)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，铰链区包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
Hombach等人,Gene Therapy(2010)17:1206-1213描述用于减少表达FcγR的细胞诸如单核细胞和NK细胞的活化的变体CH2-CH3区。变体CH2-CH3区的氨基酸序列示于SEQ IDNO：32中。
在一些实施方案中，铰链区包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，铰链区包含以下或由以下组成：作为或衍生自人类IgG1的CH1-CH2铰链区的氨基酸序列和作为或衍生自人类IgG1的CH2-CH3区(即Fc区)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，铰链区包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
额外序列
信号肽
CAR可额外包含信号肽(也称为前导序列或信号序列)。信号肽通常由形成单一α螺旋体的5-30个疏水性氨基酸的序列组成。分泌蛋白和在细胞表面处表达的蛋白质常常包含信号肽。用于许多蛋白质的信号肽为已知的，并且记录于诸如GenBank、UniProt和Ensembl的数据库中，和/或可例如使用诸如SignalP(Petersen等人,2011Nature Methods 8:785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl,2008 Bioinformatics 24:2172-2176)的氨基酸序列分析工具进行识别/预测。
信号肽可存在于CAR的N端处，并且可存在于新合成的CAR中。信号肽提供CAR向细胞表面的有效运输。信号肽通过裂解来移除，并且因此不包含在由细胞表面表达的成熟CAR中。
在一些实施方案中，信号肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：51的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
接头序列和另外的功能性序列
在一些实施方案中，CAR在不同区域(即抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、信号传导结构域)之间包含一个或多个接头序列。在一些实施方案中，CAR在结构域的子序列之间(例如在抗原结合结构域的VH与VL之间)包含一个或多个接头序列。
接头序列是技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人,Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10):1357-1369中，该文献在此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许由接头序列连接的氨基酸序列的相对移动。柔性接头是技术人员已知的，并且数个柔性接头在Chen等人,Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10):1357-1369中得到鉴定。柔性接头序列常常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，接头序列的长度为1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-20、1-30、1-40或1-50个氨基酸。
在一些实施方案中，接头序列包含以下或由以下组成：示于SEQ ID NO：16或45中的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列包含以下或由以下组成：示于SEQ ID NO：16或45中的氨基酸序列的1、2、3、4或5个串联拷贝。
CAR可额外包含另外的氨基酸或氨基酸序列。举例而言，抗原结合分子和多肽可包含一个或多个氨基酸序列以促进表达、折叠、运输、加工、纯化或检测。举例而言，CAR可任选地在N端或C端处包含编码His(例如6×His)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素标签的序列。在一些实施方案中，CAR包含例如荧光标记、发光标记、免疫可检测标记、放射标记、化学标记、核酸标记或酶标记的可检测部分。
具体示例性CAR
在本公开内容的一些实施方案中，CAR包含以下或由以下组成：
包含以下或由以下组成的抗原结合结构域：与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
包含以下或由以下组成的铰链区：与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
包含以下或由以下组成的跨膜结构域：与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和
包含以下或由以下组成的信号传导结构域：与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开内容的一些实施方案中，CAR包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：35或36的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR选自以下中所描述的CD30特异性CAR的实施方案：Hombach等人,Cancer Res.(1998)58(6):1116-9,Hombach等人,Gene Therapy(2000)7:1067-1075,Hombach等人,J Immunother.(1999)22(6):473-80,Hombach等人,Cancer Res.(2001)61:1976-1982,Hombach等人,J Immunol(2001)167:6123-6131,Savoldo等人,Blood(2007)110(7):2620-30,Koehler等人,Cancer Res.(2007)67(5):2265-2273,Di Stasi等人,Blood(2009)113(25):6392-402,Hombach等人,Gene Therapy(2010)17:1206-1213,Chmielewski等人,Gene Therapy(2011)18:62-72,Kofler等人,Mol.Ther.(2011)19(4):760-767,Gilham,Abken and Pule.Trends in Mol.Med.(2012)18(7):377-384,Chmielewski等人,Gene Therapy(2013)20:177-186,Hombach等人,Mol.Ther.(2016)24(8):1423-1434,Ramos等人,J.Clin.Invest.(2017)127(9):3462-3471,WO 2015/028444 A1或WO 2016/008973A1，以上所有均在此以全文引用的方式并入。
在本公开内容的一些实施方案中，CAR包含以下或由以下组成：
包含以下或由以下组成的抗原结合结构域：与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
包含以下或由以下组成的铰链区：与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
包含以下或由以下组成的跨膜结构域：与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和
包含以下或由以下组成的信号传导结构域：与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开内容的一些实施方案中，CAR包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：52或53的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
表达CAR的病毒特异性免疫细胞
本公开内容涉及包含/表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒特异性免疫细胞。
表达CAR的病毒特异性免疫细胞可表达或包含本公开内容的CAR。表达CAR的病毒特异性免疫细胞可包含或表达编码本公开内容的CAR的核酸。应理解，表达CAR的细胞包含其表达的CAR。还应理解，表达编码CAR的核酸的细胞还表达并且包含由核酸编码的CAR。
包含本公开内容的CAR/编码本公开内容的CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞可通过参考细胞的功能特性进行表征。
在一些实施方案中，包含本公开内容的CAR/编码本公开内容的CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞展现以下特性中的一个或多个：
(a)响应于表达CAR对其具有特异性的靶抗原的细胞、响应于感染病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒的细胞和/或响应于呈递病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒抗原的肽的细胞的一种或多种细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔蛋白、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表达、增殖/群体扩增和/或生长因子(例如IL-2)表达；
(b)对表达CAR对其具有特异性的靶抗原的细胞、感染病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒的细胞和/或呈递病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒抗原的肽的细胞的细胞毒性；
(c)对不表达CAR对其具有特异性的靶抗原的细胞、未感染病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒的细胞和/或不呈递病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒抗原的肽的细胞无细胞毒性(即高于基线)；
(d)对包含表达CAR对其具有特异性的靶抗原的细胞的癌症、包含感染病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒的细胞的癌症和/或包含呈递病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒抗原的肽的细胞的癌症的抗癌活性(例如对癌细胞的细胞毒性、肿瘤生长抑制、转移减少等)；和
(e)对例如表达CAR对其具有特异性的靶抗原的同种异体反应性免疫细胞的同种异体反应性免疫细胞的细胞毒性。
细胞增殖/群体扩增可通过在一段时间内分析细胞分裂或细胞数目来进行研究。细胞分裂可例如通过3H-胸苷并入的体外分析或通过CFSE稀释分析来进行分析，例如如Fulcher and Wong,Immunol Cell Biol(1999)77(6):559-564中所描述，该文献在此以全文引用的方式并入。增殖细胞还可通过5-乙炔基-2'-去氧尿苷(EdU)并入的通过适当测定的分析来进行识别，如例如Buck等人,Biotechniques.2008年6月；44(7):927-9以及Saliand Mitchison,PNAS USA 2008年2月19日；105(7):2415-2420中所描述，其均在此以全文引用的方式并入。
如本文所使用的“表达”可以是基因或蛋白质表达。基因表达涵盖DNA向RNA的转录，并且可通过本领域技术人员已知的各种手段来进行测量，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或通过基于报告因子的方法测量mRNA含量。类似地，蛋白质表达可通过本领域中熟知的各种方法，例如通过基于抗体的方法，例如通过免疫印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报告因子的方法来进行测量。
细胞毒性和细胞杀伤可例如使用Zaritskaya等人,Expert Rev Vaccines(2011),9(6):601-616中所综述的方法中的任一种来进行研究，该文献在此以全文引用的方式并入。细胞毒性体外测定/细胞杀伤测定的实例包括释放测定，诸如51Cr释放测定、乳酸脱氢酶(LDH)释放测定、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)释放测定和钙黄绿素-乙酰氧基甲基(钙黄绿素-AM)释放测定。这些测定基于从裂解细胞释放的因子的检测来测量细胞杀伤。通过给定细胞类型的细胞杀伤可例如通过共培养测试细胞与给定细胞类型并且测量合适时间段之后活细胞/死测试细胞的数目/比例来进行分析。
可通过在适当的体外测定或癌症的体内模型中进行分析来进行评估细胞的抗癌活性。
在一些实施方案中，本公开内容的表达CD30特异性CAR的、EBV特异性免疫细胞呈现以下特性中的一个或多个：
(a)响应于表达CD30的细胞、响应于感染EBV的细胞和/或响应于呈递EBV抗原的肽的细胞的一种或多种细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔蛋白、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表达；
(b)对表达CD30的细胞、感染EBV的细胞和/或呈递EBV抗原的肽的细胞的细胞毒性；
(c)对不表达CD30的细胞、未感染EBV的细胞和/或不呈递EBV抗原的肽的细胞无细胞毒性(即高于基线)；
(d)对包含表达CD30的细胞的癌症、包含感染EBV的细胞的癌症和/或包含呈递EBV抗原的肽的细胞的癌症的抗癌活性(例如对癌细胞的细胞毒性、肿瘤生长抑制、转移减少等)；和
(e)对同种异体反应性免疫细胞例如表达CD30的同种异体反应性免疫细胞的细胞毒性。
在本公开内容的各个方面的一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞可包含/表达超过一种(例如2、3、4种等)CAR。
在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞可包含/表达超过一种非相同CAR。包含/表达超过一种非相同CAR的病毒特异性免疫细胞可包含/表达对非相同靶抗原具有特异性的CAR。举例而言，本文中的实施例4描述包含/表达CD30特异性CAR和CD19特异性CAR的病毒特异性免疫细胞。非相同靶抗原中的每一个可独立地是如本文所描述的靶抗原。在一些实施方案中，每个非相同靶抗原独立地是如本文所描述的癌细胞抗原。
在一些实施方案中，非相同靶抗原中的一个是CD30。在一些实施方案中，包含/表达超过一种非相同CAR的病毒特异性免疫细胞包含：CD30特异性CAR和对除CD30之外的靶抗原具有特异性的CAR。
产生表达CAR的病毒特异性免疫细胞
用于体外/离体生成/扩增病毒特异性免疫细胞群体的方法是技术人员所熟知的。典型培养条件(即细胞培养基、添加剂、温度、气态氛围)、细胞数目、培养时间段等可通过参考例如Ngo等人,J Immunother.(2014)37(4):193-203来确定，该文献在此以全文引用的方式并入。
适宜地，本公开内容的细胞培养物可维持在37℃下含有5％CO2的湿润氛围中。细胞培养物的细胞可以如可由技术人员容易地确定的任何合适密度建立和/或维持。举例而言，培养物可以以～0.5×106至～5×106个细胞/毫升培养物(例如～1×106个细胞/毫升)的初始密度建立。
培养可在适用于培养物体积的任何容器中，例如在细胞培养板的孔、细胞培养烧瓶、生物反应器等中进行。在一些实施方案中，细胞在生物反应器例如Somerville andDudley,Oncoimmunology(2012)1(8):1435-1437中所描述的生物反应器中培养，该文献在此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，细胞在GRex细胞培养容器例如GRex烧瓶或GRex 100生物反应器中培养。
此类方法一般包括在提供适当共刺激和信号放大以便引起活化和扩增的条件下在存在呈递病毒抗原肽:MHC复合物的抗原呈递细胞(APC)的情况下培养包含具有抗原特异性受体的细胞的免疫细胞群体(例如免疫细胞(例如外周血单核细胞：PBMC)异质群体)。APC可能会感染编码或可包含/表达一种或多种病毒抗原/肽的病毒，并且在MHC分子的情形下呈递病毒抗原肽。刺激引起T细胞活化，并且促进细胞分裂(增殖)，从而引起对病毒抗原具有特异性的T细胞群体的生成和/或扩增。T细胞活化方法为技术人员所熟知并且详细描述于例如Immunobiology,第5版Janeway CA Jr,Travers P,Walport M,等人New York:Garland Science(2001),第8章中，该文献以全文引用的方式并入。
与刺激前的细胞群体相比，对在刺激后获得的细胞群体富集病毒特异性T细胞(即病毒特异性T细胞在刺激后的群体中以增加的频率呈现)。以此方式，病毒特异性T细胞群体从具有不同特异性的T细胞异质群体中扩增/生成。病毒特异性T细胞群体可通过刺激和后续细胞分裂由单一T细胞生成。现存的病毒特异性T细胞群体可通过对病毒特异性T细胞群体的细胞的刺激和后续细胞分裂扩增。
本公开内容的方面和实施方案特别地涉及EBV特异性免疫细胞。因此，在一些实施方案中，病毒可以是EBV，并且一种或多种病毒抗原可以是一种或多种EBV抗原。用于生成/扩增EBV特异性免疫细胞群体的方法描述于例如WO 2013/088114 A1；Lapteva and Vera,Stem Cells Int.(2011):434392；Straathof等人,Blood(2005)105(5):1898-1904；WO2017/202478 A1；WO 2018/052947 A1；和WO 2020/214479 A1中，以上所有均在此以全文引用的方式并入。
该方法涉及其中由呈递T细胞受体(TCR)对其具有特异性的EBV抗原肽:MHC复合物的APC刺激包含对EBV抗原肽:MHC复合物具有特异性的TCR的T细胞的步骤。APC感染编码或包含/表达一种或多种EBV抗原/肽的病毒，并且在MHC分子的情形下呈递EBV抗原肽。刺激引起T细胞活化，并且促进细胞分裂(增殖)，从而引起对EBV抗原具有特异性的T细胞群体的生成和/或扩增。
该方法通常包括通过使免疫细胞群体与对应于一种或多种EBV抗原的一种或多种肽或呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC接触来刺激对病毒/病毒抗原具有特异性的免疫细胞。该方法步骤可在本文中被称为“刺激”或“刺激步骤”。该方法步骤通常涉及将细胞体外/离体维持在培养物中，并且可被称为“刺激培养”。
在一些实施方案中，该方法包括一个或多个额外刺激步骤。即，在一些实施方案中，该方法包括一个或多个另外的再刺激通过刺激步骤获得的细胞的步骤。此类另外刺激步骤可在本文中被称为“再刺激”或“再刺激步骤”。此类方法步骤通常涉及将细胞体外/离体维持在培养物中，并且可被称为“再刺激培养”。
应理解，使PBMC(用于刺激)或通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体(用于再刺激)与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽“接触”一般涉及在包含一种或多种肽的细胞培养基中体外/离体培养PBMC/细胞群体。类似地，应理解，使PBMC/细胞群体与呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC“接触”一般涉及在细胞培养基中体外/离体共培养APC与PBMC/细胞群体。
在一些实施方案中，该方法包括使PBMC与对应于一种或多种病毒抗原(例如一种或多种EBV抗原)的一种或多种肽接触。在此类实施方案中，PBMC群体内的APC(例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)内化(例如通过吞噬作用、胞饮作用)、加工抗原并且在I类MHC分子(交叉呈递)和/或II类MHC分子上呈递抗原以用于PBMC群体内的CD8+ T细胞和/或CD4+ T细胞的后续活化。
“对应于”参考抗原的肽包含以下或由以下组成：参考抗原的氨基酸序列。举例而言，“对应于”EBV的EBNA1的肽包含以下或由以下组成：存在于EBNA1的氨基酸序列内的氨基酸序列(即为EBNA1的氨基酸序列的子序列)。本文所采用的肽的长度通常为5-30个氨基酸，例如5-25个氨基酸、10-20个氨基酸或12-18个氨基酸中的一个。在一些实施方案中，肽的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中的一个。在一些实施方案中，肽的长度为约15个氨基酸。如本文所使用的“肽”可指包含非相同肽的群体。
在一些实施方案中，该方法采用对应于超过一种抗原的肽。在此类实施方案中，存在至少一种对应于抗原中的每一个的肽。举例而言，在该方法采用对应于EBNA1和LMP1的肽的情况下，肽包含至少一种对应于EBNA1的肽和至少一种对应于LMP1的肽。
在一些实施方案中，该方法采用对应于全部或部分参考抗原的肽。对应于全部给定抗原的肽涵盖抗原的全长氨基酸序列。换言之，肽一起含有给定抗原的氨基酸序列的全部氨基酸。对应于部分给定抗原的肽涵盖抗原的部分氨基酸序列。在一些实施方案中，在肽涵盖抗原的部分氨基酸序列的情况下，肽可一起涵盖抗原的例如多于10％，例如多于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法采用重叠肽。“重叠”肽共同具有氨基酸，并且更通常共同具有氨基酸的序列。作为实例，第一肽由对应于EBNA1的氨基酸序列的位置1至15的氨基酸序列组成，并且第二肽由对应于EBNA1的氨基酸序列的位置5至20的氨基酸序列组成。第一肽和第二肽是重叠11个氨基酸的对应于EBNA1的重叠肽。在一些实施方案中，重叠肽重叠1-20、5-20、8-15或10-12个中的一个的氨基酸。在一些实施方案中，重叠肽重叠1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个中的一个的氨基酸。在一些实施方案中，重叠肽重叠11个氨基酸。
在一些实施方案中，该方法采用长度为5-30个氨基酸、重叠1-20个氨基酸、对应于全部或部分给定参考抗原的肽。
在一些实施方案中，该方法采用长度为15个氨基酸、重叠11个氨基酸、对应于全部给定参考抗原的肽。对于给定抗原，此类肽的混合物可在本文中称为“肽混合物(pepmix)肽池”或“肽混合物”。举例而言，实施例1中所使用的“EBNA1肽混合物”在本文中指如UniProt:P03211-1,v1中所示的重叠11个氨基酸、跨越EBNA1的全长氨基酸序列的一组158个15聚体肽。
在本公开内容的各个方面的一些实施方案中，“对应于给定病毒抗原的肽”可以是抗原的肽混合物。
在具体实施方案中，该方法采用对应于一个或多个EBV抗原的肽。在具体实施方案中，该方法采用一个或多个EBV抗原的肽混合物。在一些实施方案中，一个或多个EBV抗原选自：EBV潜伏抗原，例如III型潜伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B或EBNA3C)、II型潜伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B或BARF1)或I型潜伏抗原(例如EBNA1或BARF1)；EBV溶解抗原，例如立即早期溶解抗原(例如BZLF1、BRLF1或BMRF1)、早期溶解抗原(例如BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU或EBNA1-FUK)和晚期溶解抗原(例如BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3或gp350)。
在本公开内容的各个方面的一些实施方案中，一个或多个EBV抗原是或包含选自以下的EBV溶解抗原：BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3。在一些实施方案中，一个或多个EBV抗原是或包含选自以下的EBV溶解抗原：BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3。
在一些实施方案中，一个或多个EBV抗原是或包含选自以下的EBV潜伏抗原：EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A和LMP2B。在一些实施方案中，一个或多个EBV抗原是或包含选自以下的EBV潜伏抗原：EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。
在一些实施方案中，一个或多个EBV抗原选自：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。
在一些实施方案中，该方法采用对应于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的肽。在一些实施方案中，该方法采用EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的肽混合物。
在一些实施方案中，该方法包括使PBMC(例如耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC)与对应于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的一种或多种肽接触。在一些实施方案中，该方法包括使PBMC(例如耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC)与EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的肽混合物接触。
在一些实施方案中，该方法包括使通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽接触。在此类实施方案中，细胞群体内的APC(例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)内化(例如通过吞噬作用、胞饮作用)、加工抗原并且在I类MHC分子(交叉呈递)和/或II类MHC分子上呈递抗原以用于细胞群体内的CD8+ T细胞和/或CD4+ T细胞的后续再刺激。
在一些实施方案中，该方法包括使PBMC与呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC接触。在一些实施方案中，该方法包括使通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体与呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC接触。
在一些实施方案中，该方法包括使PBMC与EBV-LCL接触。通过用EBV-LCL刺激PBMC进行的EBV特异性免疫细胞产生描述于例如Straathof等人,Blood(2005)105(5):1898-1904中，该文献以引用的方式并入上文。
EBV-LCL可通过使PBMC感染EBV并且在长期培养之后收集永生化感染EBV的细胞来制备，例如如Hui-Yuen等人,J Vis Exp(2011)57:3321以及Hussain and Mulherkar,Int JMol Cell Med(2012)1(2):75-87中所描述(其均在此以全文引用的方式并入)。EBV特异性T细胞可通过共培养从来自健康供体的血液样品分离的PBMC与自体γ照射的EBV-LCL来制备。
在刺激和再刺激中的T细胞与APC的共培养在细胞培养基中进行。细胞培养基可以是其中本公开内容的T细胞和APC可体外/离体维持在培养物中的任何细胞培养基。适用于培养淋巴细胞的培养基为技术人员所熟知，并且包括例如RPMI-1640培养基、AIM-V培养基、Iscoves培养基等。
在一些实施方案中，细胞培养基可包括RPMI-1640培养基(例如Advanced RPMI-1640培养基)和/或Click培养基(也称为Eagle's Ham's氨基酸(EHAA)培养基)。这些培养基的组成为技术人员所熟知。RPMI-1640培养基的配方描述于例如Moore等人,JAMA(1967)199:519-524中，并且Click培养基的配方描述于Click等人,Cell Immunol(1972)3:264-276中。RPMI-1640培养基可获自例如ThermoFisher Scientific，并且Click培养基可获自例如Sigma-Aldrich(目录号C5572)。Advanced RPMI-1640培养基可获自例如ThermoFisherScientific(目录号12633012)。
在一些实施方案中，该方法涉及在包含RPMI-1640培养基和Click培养基的细胞培养基中培养已与对应于一种或多种病毒抗原(例如一种或多种EBV抗原)的一种或多种肽接触的PBMC或在存在呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC情况下培养PBMC。在一些实施方案中，该方法涉及在包含RPMI-1640培养基和Click培养基的细胞培养基中培养已与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽接触的通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体或在存在呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC情况下培养通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体。
在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积计)25％-65％RPMI-1640培养基和25％-65％Click培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含30％-60％RPMI-1640培养基和30％-60％Click培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含35％-55％RPMI-1640培养基和35％-55％Click培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含40％-50％RPMI-1640培养基和40％-50％Click培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含45％RPMI-1640培养基和45％Click培养基。在具体实施方案中，细胞培养基包含47.5％RPMI-1640培养基和47.5％Click培养基。
在一些实施方案中，细胞培养基可包含一种或多种细胞培养基添加剂。细胞培养基添加剂为技术人员所熟知，并且包含抗生素(例如青霉素、链霉素)、富含生长因子的添加剂(诸如血清(例如人类血清、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)))、L-谷氨酰胺、细胞因子/生长因子等。
在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积计)2.5％-20％(例如5％)富含生长因子的添加剂，例如5％-20％FBS，例如7.5％-15％FBS或10％FBS。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.5％-5％GlutaMax，例如1％GlutaMax。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.5％-5％Pen/Strep，例如1％Pen/Strep。
在具体实施方案中，细胞培养基包含人类血小板裂解物。在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积计)1％-20％(例如5％)人类血小板裂解物，例如2.5％-20％人类血小板裂解物，例如2.5％-15％、2.5％-10％或5％人类血小板裂解物。人类血小板裂解物可获自例如Sexton Biotechnologies。
在具体实施方案中，细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在具体实施方案中，细胞培养基包含0.5-10mM L-谷氨酰胺，例如1-5mM L-谷氨酰胺，例如2mM L-谷氨酰胺。
本公开内容的APC可以是专职性APC。专职性APC被特殊化用于向T细胞呈递抗原；它们有效加工并且在细胞表面处呈递MHC-肽复合物，并且表达高水平的共刺激性分子。专职性APC包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。非专职性APC是能够向T细胞呈递MHC-肽复合物，特别是向CD8+ T细胞呈递I类MHC-肽复合物的其他细胞。
在一些实施方案中，APC是能够在I类MHC上交叉呈递通过APC内化(例如通过胞吞作用/吞噬作用吸收)的抗原的APC。在I类MHC上向CD8+ T细胞交叉呈递内化抗原描述于例如Alloatti等人,Immunological Reviews(2016),272(1):97-108中，该文献在此以全文引用的方式并入。能够交叉呈递的APC包括例如树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞和肝窦内皮细胞。
如本文中所阐述，在一些实施方案中，用于刺激对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞的APC包含在细胞(例如PBMC)群体内，该细胞群体包含对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞，对一种或多种病毒抗原具有特异性的细胞群体将从此类细胞群体扩增。在此类实施方案中，APC可以是例如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞或能够向对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞呈递一种或多种抗原的细胞群体内的任何其他细胞类型。
在一些实施方案中，该方法采用已被修饰以表达/包含一种或多种病毒抗原/其一种或多种肽的APC。在一些实施方案中，APC可由于已与一种或多种肽接触并且使其内化而呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽。在一些实施方案中，APC可已被一种或多种肽“负载(pulse)”，这一般涉及在存在一种或多种肽的情况下体外培养APC持续足以使APC内化一种或多种肽的时间段。
在一些实施方案中，APC可由于细胞内编码抗原的核酸的表达而呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽。APC可由于其已感染病毒(例如，在感染EBV的B细胞(例如LCL)情况下)而包含编码一种或多种病毒抗原的核酸。APC可由于已例如通过转染、转导、电穿孔等将编码一种或多种病毒抗原的核酸引入细胞中而包含编码一种或多种病毒抗原的核酸。编码一种或多种病毒抗原的核酸可以以质粒/载体形式提供。
在一些实施方案中，APC选自活化的T细胞(ATC)、树突状细胞、B细胞(包括例如LCL)和人工抗原呈递细胞(aAPC)，诸如Neal等人,J Immunol Res Ther(2017)2(1):68-79以及Turtle and Riddell Cancer J.(2010)16(4):374-381中所描述的那些。
在一些实施方案中，APC相对于将与其共培养的细胞群体以用于生成/扩增包含对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞的免疫细胞群体而言为自体的。即，在一些实施方案中，APC来自与产生将与其共培养的细胞群体的个体相同的个体(或衍生自获自该相同个体的细胞)。
多克隆活化T细胞(ATC)作为APC的用途和用于制备ATC的方法描述于例如Ngo等人,J Immunother.(2014)37(4):193-203中，该文献以引用的方式并入上文。简言之，可通过在存在IL-2的情况下用激动剂抗CD3抗体和激动剂抗CD28抗体刺激PBMC，通过体外非特异性活化T细胞生成ATC。
树突状细胞可根据本领域中熟知的方法生成，例如如Ngo等人,J Immunother.(2014)37(4):193-203中所描述。树突状细胞可由单核细胞制备，此类单核细胞可通过从PBMC选择CD14获得。单核细胞可在细胞培养基中培养，从而使其分化成未成熟树突状细胞，此类未成熟树突状细胞可包含例如IL-4和GM-CSF。未成熟树突状细胞可通过在存在IL-6、IL-1β、TNFα、PGE2、GM-CSF和IL-4的情况下进行培养来成熟。
LCL可根据本领域中熟知的方法生成，例如如Hui-Yuen等人,J Vis Exp(2011)57:3321以及Hussain和Mulherkar,Int J Mol Cell Med(2012)1(2):75-87中所描述，其均在此以全文引用的方式并入。简言之，LCL可通过在存在环孢素A的情况下将PBMC与产生EBV的细胞例如B95-8细胞的浓缩细胞培养物上清液一起孵育来产生。
人工抗原呈递细胞(aAPC)包括例如被工程改造以表达共刺激性分子CD80、CD86、CD83和4-1BBL的K562cs细胞(描述于例如Suhoski等人,Mol Ther.(2007)15(5):981-8中)。
在一些实施方案中，刺激步骤包括使PBMC与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽接触。在一些实施方案中，再刺激步骤包括使对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞与呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC接触。在一些实施方案中，再刺激步骤包括使对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞与呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的ATC接触。
在一些实施方案中，该方法进一步采用用于在刺激和/或再刺激中增强共刺激的试剂。此类试剂包括例如表达共刺激性分子(例如CD80、CD86、CD83和/或4-1BBL)的细胞，诸如LCL或K562cs细胞。在一些实施方案中，表达共刺激性分子的细胞是HLA阴性、EBV复制无能型LCL，其也被称为“通用LCL”或“uLCL”。uLCL描述于例如US 2018/0250379 A1中。
用于增强共刺激的试剂的其他实例包括例如对由T细胞表达的共刺激性受体(例如4-1BB、CD28、OX40、ICOS等)和能够活化由T细胞表达的共刺激性受体的共刺激性分子(例如CD80、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL等)具有特异性的激动剂抗体。此类试剂可例如固定于珠粒上来提供。
在一些实施方案中，本公开内容的刺激和/或再刺激采用uLCL。uLCL表达EBV抗原并且还表达CD30以及其他共刺激性分子。因此，uLCL可用于提供EBV抗原性刺激、经由CD30通过CAR的CD30.CAR EBVST的刺激以及用于体外/离体扩增CD30.CAR EBVST的共刺激。
在一些实施方案中，uLCL用作提供抗原性刺激(例如EBV和/或CD30刺激)的细胞。在一些实施方案中，uLCL用作提供共刺激的细胞。在一些实施方案中，uLCL用作提供抗原性刺激和共刺激的细胞。在一些实施方案中，uLCL被照射(例如在100戈瑞)。在一些实施方案中，呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC是uLCL。
在具体实施方案中，本公开内容的方法包括在存在uLCL的情况下培养对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞。在具体实施方案中，本公开内容的方法包括再刺激步骤，该再刺激步骤包括在存在uLCL的情况下培养对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞。在一些实施方案中，uLCL(例如被照射的uLCL)可用于与对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞以1:1至1:10，例如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8中的一个的对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞与uLCL的比率共培养。在一些实施方案中，uLCL(例如被照射的uLCL)可用于与对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞以1:2至1:5，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5中的一个的对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞与uLCL的比率共培养。在一些实施方案中，对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞与uLCL的比率为～1:3。
在具体实施方案中，本公开内容的方法包括在存在uLCL的情况下培养包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞。在具体实施方案中，本公开内容的方法包括再刺激步骤，该再刺激步骤包括在存在uLCL的情况下培养包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞。在一些实施方案中，uLCL(例如被照射的uLCL)可用于与包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞以1:1至1:10，例如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8中的一个的包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞与uLCL的比率共培养。在一些实施方案中，uLCL(例如被照射的uLCL)可用于与包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞以在1:2至1:5，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5中的一个的包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞与uLCL的比率共培养。在一些实施方案中，包含/表达本文所描述的CAR(或包含/表达编码此类CAR的核酸)的病毒特异性免疫细胞与uLCL的比率为～1:3。
在一些实施方案中，再刺激步骤包括在存在uLCL的情况下使对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞与呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的ATC接触。
免疫细胞群体与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽或呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC的接触可在存在一种或多种细胞因子以辅助T细胞活化和增殖的情况下进行。在一些实施方案中，刺激在存在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21中的一个或多个的情况下进行。应理解，细胞因子被外源地添加至培养物中，并且另外添加至由培养物中的细胞产生的细胞因子中。在一些实施方案中，所添加的细胞因子为以重组方式产生的细胞因子。
因此，在一些实施方案中，该方法涉及在存在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21中的一个或多个的情况下，培养已与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽接触的PBMC或在存在呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC情况下培养PBMC。
在一些实施方案中，培养在存在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21的情况下进行。在一些实施方案中，培养在存在IL-7、IL-15、IL-6和/或IL-12的情况下进行。在一些实施方案中，培养在存在IL-7和/或IL-15的情况下进行。
在一些实施方案中，培养物中的IL-7的最终浓度为1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个。在一些实施方案中，培养物中的IL-7的最终浓度为约10ng/ml。
在一些实施方案中，培养物中的IL-15的最终浓度为1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个。在一些实施方案中，培养物中的IL-15的最终浓度为约10ng/ml。在一些实施方案中，培养物中的IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml，例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个。在一些实施方案中，培养物中的IL-15的最终浓度为约100ng/ml。
在一些实施方案中，培养物中的IL-6的最终浓度为10-1000ng/ml，例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个。在一些实施方案中，培养物中的IL-6的最终浓度为约100ng/ml。
在一些实施方案中，培养物中的IL-12的最终浓度为1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个。在一些实施方案中，培养物中的IL-12的最终浓度为10ng/ml。
在一些实施方案中，IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如约10ng/ml)。
在一些实施方案中，IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个，例如约100ng/ml)。
在一些实施方案中，IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，IL-6的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个，例如约100ng/ml)，IL-12的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)。
在一些实施方案中，刺激培养物中的IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，并且刺激培养物中的IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个，例如约100ng/ml)。
在一些实施方案中，刺激培养物中的IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，刺激培养物中的IL-6的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个，例如约100ng/ml)，刺激培养物中的IL-12的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，并且刺激培养物中的IL-15的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)。
在一些实施方案中，再刺激培养物中的IL-7的最终浓度为1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中的一个，例如10ng/ml)，并且再刺激培养物中的IL-15的最终浓度为10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中的一个，例如约100ng/ml)。
本公开内容的刺激和再刺激通常涉及共培养T细胞与APC持续足以使APC刺激T细胞并且使T细胞经历细胞分裂的时间段。
在一些实施方案中，该方法涉及培养已与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽接触的PBMC或在存在呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC情况下培养PBMC，持续至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天或至少7天中的一个的时间段。在一些实施方案中，培养时间段为24小时至20天，例如48小时至14天、3天至12天、4天至11天、或6天至10天、或7天至9天中的一个。
在一些实施方案中，该方法涉及培养已与对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽接触的通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体或在存在呈递对应于一种或多种病毒抗原的一种或多种肽的APC情况下培养通过本文所描述的刺激步骤获得的细胞群体，持续至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天或至少7天中的一个的时间段。在一些实施方案中，培养时间段为24小时至20天，例如48小时至14天、3天至12天、4天至11天、或6天至10天、或7天至9天中的一个。
刺激和再刺激可通过将培养物中的细胞与其中已培养细胞的培养基分离或例如通过添加细胞培养基稀释培养物来结束。在一些实施方案中，该方法包括在刺激或再刺激培养结束时收集细胞的步骤。在一些实施方案中，再刺激步骤可通过以适合于实现所需百分比/浓度的细胞培养基的量添加细胞培养基(和如本文所描述的任何其他添加剂)、用于再刺激步骤的条件培养基(和任何添加剂)来建立。
在给定刺激或再刺激步骤的培养时间段结束时，可收集细胞并且将其与细胞培养物上清液分离。细胞可通过离心来收集，并且细胞培养物上清液可与细胞沉淀分离。随后，细胞沉淀可再悬浮于细胞培养基中，例如用于再刺激步骤。在一些实施方案中，细胞可在收集之后经历洗涤步骤。洗涤步骤可包括使细胞沉淀再悬浮于等渗缓冲液诸如磷酸缓冲盐水(PBS)中，通过离心收集细胞，并且丢弃上清液。
用于生成和/或扩增对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞群体的方法通常涉及超过一个单刺激步骤。可进行的刺激步骤的数目无上限。在一些实施方案中，该方法包括超过2、3、4或5个刺激步骤。在一些实施方案中，该方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个中的一个的刺激步骤。方法中的刺激步骤可彼此不同。
在一些实施方案中，用于该方法中的PBMC耗尽CD45RA阳性细胞。即，在一些实施方案中，PBMC为“CD45RA阳性细胞耗尽的PBMC”或为“CD45RA阴性PBMC”。CD45RA阳性细胞的耗尽意欲减少所生成/扩增的细胞群体中的NK细胞和/或调节性T细胞的数目。
在一些实施方案中，该方法包括例如在刺激步骤之前耗尽PBMC的CD45RA阳性细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法包括例如在再刺激步骤之前耗尽通过本公开内容的刺激步骤获得的细胞的CD45RA阳性细胞的步骤。CD45RA阳性细胞的耗尽可通过任何合适方法，诸如通过磁性活化细胞分选(MACS)，例如使用
Figure BDA0004016141880000551
Biotec管柱和磁性抗CD45RA抗体涂布的珠粒来实现。
在一些实施方案中，用于该方法中的用于衍生APC的细胞群体耗尽CD45RA阳性细胞。即，在一些实施方案中，用于衍生APC的细胞群体为“CD45RA阳性细胞耗尽”或“CD45RA阴性”群体。举例而言，在其中ATC用作APC的实施方案中，ATC可衍生自CD45RA阳性细胞耗尽的PBMC群体或衍生自CD45RA阴性PBMC群体。
在一些实施方案中，该方法进一步包括修饰对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞以增加细胞中的IL-7介导的信号传导。已显示IL-7介导的信号传导增加肿瘤特异性T细胞的存活和抗肿瘤活性-参见例如Shum等人,Cancer Discov.(2017)7(11):1238-1247和WO 2018/038945 A1中。
在一些实施方案中，该方法进一步包括将WO 2018/038945 A1(其在此以全文引用的方式并入)中所描述的实施方案的核酸引入PBMC或对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞中。在一些实施方案中，该方法包括将核酸引入PBMC或对一种或多种病毒抗原具有特异性的免疫细胞中，其中核酸编码多肽以用于增加细胞内的STAT5介导的信号传导。
在一些实施方案中，核酸编码包含以下的多肽：(i)促进多肽均二聚化的区域和(ii)IL-7Rα的胞内结构域。
在一些实施方案中，促进多肽均二聚化的区域包含以下或由以下组成：在多肽单体之间提供二硫键形成的氨基酸序列。在一些实施方案中，促进多肽均二聚化的区域包含以下或由以下组成：WO 2018/038945 A1的根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24中的一个的氨基酸序列(参见例如WO 2018/038945 A1的段落[0074]至[0076])。
IL-7Rα的胞内结构域可包含以下或由以下组成：对应于UniProt:P16871-1,v1的位置265至459的氨基酸序列。
核酸可通过本领域中熟知的方法诸如转导、转染、电穿孔等引入细胞中。在一些实施方案中，核酸使用包含核酸的病毒载体(例如逆转录病毒载体)通过转导引入细胞中。
在一些实施方案中，该方法包括用包含编码多肽的核酸的病毒载体转导PBMC或对一种或多种EBV抗原具有特异性的免疫细胞，该多肽包含(i)促进多肽均二聚化的区域和(ii)IL-7Rα的胞内结构域。
本文所描述的方法的方面和实施方案包含修饰本文所描述的免疫细胞(例如本文所描述的病毒特异性免疫细胞)以表达/包含本公开内容的CAR。
本文所描述的方法的方面和实施方案包含修饰本文所描述的免疫细胞(例如本文所描述的病毒特异性免疫细胞)以表达/包含编码本公开内容的CAR的核酸。
这样的方法通常包括将编码CAR的核酸引入免疫细胞中。
免疫细胞(例如病毒特异性免疫细胞)可根据技术人员所熟知的方法被修饰以包含/表达本文所描述的CAR或编码本文所描述的CAR的核酸。该方法一般包括用于永久(稳定)或短暂表达被转移的核酸的核酸转移。
任何合适的基因工程改造平台均可用于修饰本公开内容的细胞。适用于修饰细胞的方法包括使用诸如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因递送和RNA转染的基因工程改造平台，例如如Maus等人,Annu Rev Immunol(2014)32:189-225中所描述，该文献在此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，修饰细胞以包含CAR或编码CAR的核酸包括用包含编码CAR的核酸的病毒载体转导细胞。
在一些实施方案中，本公开内容的方法采用编码本文所描述的CAR的逆转录病毒。
方法还包括描述于例如Wang和Rivière Mol Ther Oncolytics.(2016)3:16015中的方法，该文献在此以全文引用的方式并入。
该方法一般包括将编码包含核酸/多种核酸的载体/多种载体的该核酸/多种核酸引入细胞中。在一些实施方案中，该方法另外包括在适用于由细胞表达一种或多种核酸或一种或多种载体的条件下培养细胞。在一些实施方案中，该方法在体外进行。适用于将一种或多种核酸/一种或多种载体引入细胞中的方法包括转导、转染和电穿孔。
在一些实施方案中，将一种或多种核酸/一种或多种载体引入细胞中包括转导例如逆转录病毒转导。因此，在一些实施方案中，一种或多种核酸包含在一种或多种病毒载体中，或一种或多种载体是一种或多种病毒载体。用病毒载体进行的免疫细胞转导描述于例如Simmons和Alberola-Ila,Methods Mol Biol.(2016)1323:99-108中，该文献在此以全文引用的方式并入。
用于增强转导效率的试剂可用于本公开内容的方法中。海美溴铵(聚凝胺)是常用于通过中和病毒粒子与在细胞表面上表达的唾液酸残基之间的电荷排斥来改进转导的阳离子聚合物。其他常用于增强转导的试剂包括例如基于泊洛沙姆的试剂，诸如LentiBOOST(Sirion Biotech)、重组人纤连蛋白(Takara)、Vectofusin(Miltenyi Biotech)以及SureENTRY(Qiagen)和ViraDuctin(Cell Biolabs)。
在具体实施方案中，本公开内容的方法在用编码本文所描述的CAR的载体/核酸进行的细胞转导中采用Vectofusin-1(Miltenyi Biotec目录号170-076-165)。在一些实施方案中，该方法包括使编码本文所描述的CAR的逆转录病毒与Vectofusin-1接触，并且使要被逆转录病毒转导的细胞与包含逆转录病毒和Vectofusin-1的混合物接触。
在一些实施方案中，该方法包括在存在包含含有核酸的病毒载体的细胞培养基的情况下对其中需要引入编码CAR的核酸的细胞进行离心(在本领域中称为“spinfection”)。
在一些实施方案中，该方法包括通过电穿孔引入本公开内容的核酸或载体，例如如Koh等人,Molecular Therapy-Nucleic Acids(2013)2,e114中所描述，该文献在此以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，该方法进一步包括例如从其他细胞(例如对病毒不具有特异性的细胞和/或不表达CAR的细胞)纯化/分离表达CAR的和/或病毒特异性的免疫细胞。用于从异质细胞群体纯化/分离免疫细胞的方法为本领域中众所周知的，并且可采用例如用于基于免疫细胞标记物的表达来分选细胞群体的基于FACS或MACS的方法。在一些实施方案中，该方法用于纯化/分离特定类型的细胞例如病毒特异性T细胞(例如病毒特异性CD8+ T细胞、病毒特异性CTL)或表达CAR的病毒特异性T细胞(例如表达CAR的病毒特异性CD8+ T细胞、表达CAR的病毒特异性CTL)。
本公开内容还提供通过本文所描述的方法获得或可获得的细胞和其群体。
组合物
本公开内容进一步提供包含一种或多种本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞(例如本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞群体)的组合物。
本文所描述的细胞可被配制为用于临床用途的药物组合物或药剂并且可包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。组合物可被配制用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、瘤内、皮下、皮内、鞘内、经口或经皮施用途径，经皮施用途径可包括注射或输注。
合适的制剂可在无菌或等渗培养基中包含细胞。药剂和药物组合物可以以流体(包括凝胶)形式配制。流体制剂可被配制用于通过注射或输注(例如通过导管)施用至人类或动物身体的选择区域。
在一些实施方案中，组合物被配制用于注射或输注至例如血管或肿瘤中。
本公开内容还提供用于产生药学上有用的组合物的方法，此类产生方法可包括选自以下的一个或多个步骤：产生本文所描述的细胞；分离本文所描述的细胞；和/或混合本文所描述的细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。
举例而言，本公开内容的另一方面涉及配制或产生用于治疗疾病/病况(例如癌症)的药剂或药物组合物的方法，该方法包括通过混合本文所描述的细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂来配制药物组合物或药剂。
MHC变异和匹配
I类MHC分子是α链和β2-微球蛋白(B2M)的非共价异二聚体。α链具有命名为α1、α2和α3的三个结构域。α1结构域和α2结构域一起形成与由I类MHC分子呈递的肽结合的槽，以形成肽:MHC复合物。在人类中，I类MHCα链由人类白血球抗原(HLA)基因编码。存在三个主要HLA基因座(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和三个次要基因座(HLA-E、HLA-F和HLA-G)。
I类MHCα链为多态的，并且不同α链能够结合并且呈递不同肽。编码I类MHCα多肽的基因高度可变，因此来自不同受试者的细胞常常表达不同I类MHC分子。
此可变性对个体之间的器官移植和过继性细胞转移有影响。具有移植物或过继性转移的细胞的受体的免疫系统将非自身MHC分子识别为外来的，从而触发针对移植物或过继性转移的细胞的免疫反应，这可能会导致移植排斥。可替代地，要被移植的细胞群体/组织/器官中的细胞可含有免疫细胞，其识别受体MHC分子为外来的，从而触发针对受体组织的免疫反应，这可能会导致移植物抗宿主疾病(GVHD)。
同种异体反应性T细胞包含能够识别非自身MHC分子(即同种异体MHC)并且对其引发免疫反应的TCR。同种异体反应性T细胞可响应于表达非自身MHC分子的细胞呈现以下特性中的一个或多个：细胞增殖、生长因子(例如IL-2)表达、细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔蛋白、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)表达和/或细胞毒性活性。
如本文所使用的“同种异体反应性”和“同种异体反应性免疫反应”是指针对在基因上与效应免疫细胞不相同的细胞/组织/器官的免疫反应。效应免疫细胞可对表达非自身MHC/HLA分子(即与由效应免疫细胞编码的MHC/HLA分子不相同的MHC/HLA分子)的细胞或包含此类细胞的组织/器官呈现同种异体反应性或同种异体反应性免疫反应。
如本文所提及的“MHC错配”和“HLA错配”受试者是具有编码非相同MHC/HLA分子的MHC/HLA基因的受试者。在一些实施方案中，MHC错配或HLA错配受试者具有编码非相同I类MHCα和/或II类MHC分子的MHC/HLA基因。如本文所提及的“MHC匹配”和“HLA匹配”受试者是具有编码相同MHC/HLA分子的MHC/HLA基因的受试者。在一些实施方案中，MHC匹配或HLA匹配受试者具有编码相同I类MHCα和/或II类MHC分子的MHC/HLA基因。
在细胞/组织/器官在本文中相对于参考受试者/治疗而言被称为同种异体的情况下，细胞/组织/器官获自/衍生自除参考受试者以外的受试者的细胞/组织/器官。在一些实施方案中，同种异体物质包含编码MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)的MHC/HLA基因，此类MHC/HLA分子与由参考受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)不相同。
在细胞/组织/器官在本文中相对于治疗而言被称为同种异体的情况下，细胞/组织/器官获自/衍生自除要被治疗的受试者以外的受试者的细胞/组织/器官。在一些实施方案中，同种异体物质包含编码MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)的MHC/HLA基因，此类MHC/HLA分子与由要被治疗的受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)不相同。
在细胞/组织/器官在本文中相对于参考受试者而言被称为自体(autologus)的情况下，细胞/组织/器官获自/衍生自参考受试者的细胞/组织/器官。在细胞/组织/器官在本文中相对于参考受试者而言被称为自体等基因(autogeneic)的情况下，细胞/组织/器官在基因上与参考受试者相同或衍生自/获自基因上相同的受试者。在细胞/组织/器官在本文中在治疗受试者(例如通过向受试者施用自体细胞进行治疗)的情形下被称为自体的情况下，细胞/组织/器官获自/衍生自要被治疗的受试者的细胞/组织/器官。在细胞/组织/器官在本文中在治疗受试者的情形下称为自体等基因的情况下，细胞/组织/器官在基因上与要被治疗的受试者相同或衍生自/获自基因上相同的受试者。自体衍生和自体细胞/组织/器官包含编码MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)的MHC/HLA基因，此类MHC/HLA分子与由参考受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)相同。
在细胞/组织/器官在本文中相对于参考受试者而言被称为同种异体的情况下，细胞/组织/器官在基因上与参考受试者不相同或衍生自/获自基因上不相同的受试者。在细胞/组织/器官在本文中在治疗受试者的情形下称为同种异体的情况下，细胞/组织/器官在基因上与要被治疗的受试者不相同或衍生自/获自基因上不相同的受试者。同种异体细胞/组织/器官可包含编码MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)的MHC/HLA基因，此类MHC/HLA分子与由参考受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子(例如I类MHCα和/或II类MHC分子)不相同。
在一些实施方案中，要根据本公开内容的方法施用至受试者的对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞基于要被治疗的受试者的HLA/MHC概况进行选择。
在一些实施方案中，要被施用至受试者的细胞基于其就受试者而言为HLA/MHC匹配来进行选择。在一些实施方案中，要被施用至受试者的细胞基于其就受试者而言为几乎或完全HLA/MHC匹配来进行选择。
如本文所使用的HLA/MHC等位基因可在其编码具有相同氨基酸序列的多肽时被确定为“匹配”。即，“匹配”在蛋白质水平上确定，这与编码多肽的核苷酸序列中的同义差异和/或非编码区中的差异的可能存在无关。
相对于参考受试者而言“HLA匹配”的细胞可以是：(i)在HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1中8/8匹配；或(ii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1和HLA-DQB1中10/10匹配；或(iii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1和HLA-DPB1中12/12匹配。相对于参考受试者而言“几乎或完全HLA匹配”的细胞可以是：(i)在HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1中≥4/8(即4/8、5/8、6/8、7/8或8/8)匹配；或(ii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1和HLA-DQB1中≥5/10(即5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10)匹配；或(iii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1和HLA-DPB1中≥6/12(即6/12、7/12、8/12、9/12、10/12、11/12或12/12)匹配。
向几乎或完全HLA匹配(与其是同种异体来源无关)的受试者施用细胞可以是有利的，尤其在施用对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞以治疗由免疫细胞对其具有特异性的病毒感染引起或与其相关的疾病/病况的情形下。在这些情况下，预期由宿主细胞向所施用细胞呈递病毒抗原(通过所施用细胞的天然TCR)会增加所施用细胞的活化、体内增殖和存活并且因此改进所施用细胞的治疗功效。
使用表达CAR的病毒特异性免疫细胞的方法
本文所描述的表达CAR的病毒特异性免疫细胞(例如本文所描述的表达CD30特异性CAR的EBV特异性T细胞(CD30.CAR EBVST))可用于治疗性和/或预防性方法中。
提供用于治疗/预防受试者的疾病/病况的方法，其包括向受试者施用表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞。
还提供用于医学治疗/预防方法中的表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞。还提供用于用以治疗/预防疾病/病况的方法中的表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞。还提供表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞用于制造药剂的用途，该药剂用于用以治疗/预防疾病/病况的方法中。
应理解，该方法一般包括向受试者施用表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞群体。在一些实施方案中，表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞可以以包含此类细胞的药物组合物形式施用。
具体地，涵盖表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞在用于通过过继性细胞转移(ACT)治疗/预防疾病/病况的方法中的用途。
表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞特别适用于用以通过同种异体移植治疗疾病/病况的方法中。
如本文所使用的“同种异体移植”是指移植至具有在基因上与受体受试者不相同的细胞、组织或器官的受体受试者。细胞、组织或器官可来自或可衍生自在基因上与受体受试者不相同的供体受试者的细胞、组织或器官。同种异体移植不同于自体移植，该自体移植是指来自/衍生自在基因上与受体受试者相同的供体受试者的细胞、组织或器官的移植。
应理解，过继性同种异体免疫细胞转移为同种异体移植的一种形式。在一些实施方案中，表达CAR的病毒特异性免疫细胞用作用以通过同种异体移植治疗/预防疾病/病况的方法中的治疗剂/预防剂。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物的施用优选以“治疗有效”或“预防有效”量进行，此量足以向受试者显示治疗效益或预防效益。所施用的实际量以及施用速度和时程将取决于疾病/病况的性质和严重程度以及所施用的具体物品。治疗处方(例如对剂量的决定等)属于全科医师和其他医生的责任，并且通常考虑要被治疗的疾病/病症、个体受试者的病况、递送部位、施用方法和医师已知的其他因素。上文所提及的技术和方案的实例可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。
可提供多次剂量。多次剂量可间隔预定时间间隔，该预定时间间隔可被选择为以下中的一个：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多个小时、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天、或1、2、3、4、5或6个月。举例而言，剂量可每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予一次。
在一些实施方案中，治疗可进一步包括其他治疗性或预防性干预例如化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。此类其他治疗性或预防性干预可在本公开内容所涵盖的疗法之前、期间和/或之后进行，并且其他治疗性或预防性干预的递送可通过与本公开内容的疗法不同的施用途径进行。
取决于要被治疗的病况，施用可单独进行或与其他治疗组合同时或依序进行。本文所描述的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可与另一治疗性干预同时或依序施用。
同时施用是指将两个或更多个治疗性干预例如以含有两种活性剂的药物组合物(即组合制剂)形式或彼此紧接地并且任选地通过相同施用途径一起施用至例如相同动脉、静脉或其他血管。
依序施用是指在与一个或多个其他治疗性干预的单独施用间隔给定时间间隔之后跟随的一个治疗性干预的施用。不要求通过相同途径施用疗法，但在一些实施方案中施用途径相同。时间间隔可以是任何时间间隔。
过继性细胞转移一般指通常通过抽取从其中分离细胞的血液样品从个体获得细胞(例如免疫细胞)的方法。随后，细胞通常被修饰和/或扩增，并且随后施用至相同个体(在自体/自体等基因细胞的过继性转移的情况下)或不同个体(在同种异体细胞的过继性转移的情况下)。治疗通常旨在向受试者提供具有某些所需特征的细胞群体，或增加该受试者中具有此类特征的此类细胞的频率。可以以将细胞或细胞群体引入受试者中和/或增加受试者中细胞或细胞群体的频率的目的进行过继性转移。
免疫细胞的过继性转移描述于例如Kalos and June(2013),Immunity 39(1):49-60以及Davis等人(2015),Cancer J.21(6):486-491中，其均在此以全文引用的方式并入。技术人员能够决定用于过继性转移本公开内容的细胞的适当试剂和程序，例如参考Dai等人,2016 J Nat Cancer Inst 108(7):djv439，该文献以全文引用的方式并入。
本公开内容提供包括向受试者施用包含/表达本公开内容的CAR的病毒特异性免疫细胞或包含/表达编码本公开内容的CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞的方法。
在一些实施方案中，该方法包括生成对病毒具有特异性的免疫细胞或生成/扩增对病毒具有特异性的免疫细胞群体。在一些实施方案中，该方法包括修饰对病毒具有特异性的免疫细胞以包含/表达本公开内容的CAR。在一些实施方案中，该方法包括修饰对病毒具有特异性的免疫细胞以包含/表达编码本公开内容的CAR的核酸。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用被修饰以表达/包含本公开内容的CAR(或被修饰以表达/包含编码此类CAR的核酸)的对病毒具有特异性的免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：
(a)修饰对病毒具有特异性的免疫细胞以表达或包含本公开内容的CAR或以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸，和
(b)向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：
(a)分离或获得对病毒具有特异性的免疫细胞；
(b)修饰对病毒具有特异性的免疫细胞以表达或包含本公开内容的CAR或以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸，和
(c)向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：
(a)从受试者分离免疫细胞(例如PBMC)；
(b)生成/扩增对病毒具有特异性的免疫细胞群体；
(c)修饰对病毒具有特异性的免疫细胞以表达或包含本公开内容的CAR或以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸，和
(d)向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸的EBV特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：
(a)修饰EBV特异性免疫细胞以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸，和
(b)向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸的EBV特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：
(a)分离或获得EBV特异性免疫细胞；
(b)修饰EBV特异性免疫细胞以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸，和
(c)向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸的EBV特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：
(a)从受试者分离免疫细胞(例如PBMC)；
(b)生成/扩增EBV特异性免疫细胞群体；
(c)修饰EBV特异性免疫细胞以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸，和
(d)向受试者施用被修饰以表达或包含本公开内容的CD30特异性CAR或被修饰以表达或包含编码本公开内容的CD30特异性CAR的核酸的EBV特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，从其分离免疫细胞(例如PBMC)的受试者为与施用细胞的受试者相同的受试者(即，过继性转移可以是自体/自体等基因细胞的)。在一些实施方案中，从其分离免疫细胞(例如PBMC)的受试者为与施用细胞的受试者不同的受试者(即，过继性转移可以是同种异体细胞的)。
在一些实施方案中，该方法可包括以下中的一个或多个：
从受试者获得血液样品；
将免疫细胞(例如PBMC)与已从受试者获得的血液样品分离；
生成/扩增对病毒具有特异性的免疫细胞群体(例如通过在存在包含/表达一种或多种病毒抗原/肽的细胞(例如APC)的情况下培养PBMC，或通过在存在感染病毒的细胞(例如APC)的情况下培养PBMC)；
在体外或离体细胞培养物中培养对病毒具有特异性的免疫细胞；
修饰对病毒具有特异性的免疫细胞以表达或包含本公开内容的CAR或以表达或包含编码本公开内容的CAR的核酸(例如通过用编码此类CAR的病毒载体或包含此类核酸的病毒载体进行转导)；
在体外或离体细胞培养物中培养表达/包含本公开内容的CAR或表达/包含编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞；
收集/分离表达/包含本公开内容的CAR或表达/包含编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞；
将表达/包含本公开内容的CAR或编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞配制成药物组合物，这例如通过混合此类细胞与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体来进行；
向受试者施用表达/包含本公开内容的CAR或表达/包含编码本公开内容的CAR的核酸的对病毒具有特异性的免疫细胞或包含此类细胞的药物组合物。
在一些实施方案中，该方法可额外包括处理细胞或治疗受试者以诱导/增强CAR表达和/或诱导/增强包含/表达CAR的病毒特异性免疫细胞的增殖或存活。
治疗性和/或预防性方法可有效地减少疾病/病况的发展或进展，缓解疾病/病况的症状，或减少疾病/病况的病变。该方法可有效地预防疾病/病况的进展，例如以预防疾病/病况恶化，或减缓疾病/病况的发展速率。在一些实施方案中，该方法可引起疾病/病况改善，例如疾病/病况的症状严重程度减轻或疾病/病况的严重程度/活性的一些其他相关减少。在一些实施方案中，该方法可预防疾病/病况进展成晚期(例如慢性期或转移)。
应理解，本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞的治疗性和预防性效用延伸至任何疾病/病况的治疗/预防，该治疗/预防将从表达/过度表达CAR靶抗原的细胞数目/活性和/或感染病毒的细胞数目/活性的减少衍生治疗效益或预防效益。
在一些实施方案中，要根据本公开内容进行治疗/预防的疾病/病况为病理学上涉及免疫细胞对其具有特异性的病毒的疾病/病况。即，在一些实施方案中，疾病/病况是由病毒感染引起或加剧的疾病/病况、感染病毒为风险因素的疾病/病况和/或感染病毒与疾病/病况的发作、发展、进展和/或严重程度正相关的疾病/病况。
在一些实施方案中，要根据本公开内容进行治疗/预防的疾病/病况病理学上涉及CAR靶抗原。即，在一些实施方案中，疾病/病况是因靶抗原的表达/过度表达引起或加剧的疾病/病况、靶抗原的表达/过度表达为危险因素的疾病/病况和/或靶抗原的表达/过度表达与疾病/病况的发作、发展、进展、严重程度正相关的疾病/病况。
疾病/病况可以是病理学上涉及CD30或表达/过度表达CD30的细胞的疾病/病况，例如表达/过度表达CD30的细胞与疾病/病况的发作、发展或进展和/或疾病/病况的一种或多种症状的严重程度正相关、或CD30表达/过度表达为疾病/病况的发作、发展或进展的风险因素的疾病/病况。
要根据本公开内容进行治疗/预防的疾病/病况可以是特征在于EBV感染的疾病/病况。举例而言，疾病/病况可以是病理学上涉及EBV或感染EBV的细胞的疾病/病况，例如EBV感染与疾病/病况的发作、发展或进展和/或疾病/病况的一种或多种症状的严重程度正相关、或EBV感染为疾病/病况的发作、发展或进展的风险因素的疾病/病况。
治疗的目的可在于以下中的一个或多个：减少病毒负荷，减少病毒阳性细胞(例如EBV阳性细胞)的数目/比例，减少表达/过度表达CAR靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)的数目/比例，降低病毒阳性细胞(例如EBV阳性细胞)的活性，降低表达/过度表达CAR靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)的活性，延迟/预防疾病/病况的症状发作/进展，减轻疾病/病况的症状的严重程度，减少病毒阳性细胞(例如EBV阳性细胞)的存活/生长，减少表达/过度表达CAR靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)的存活/生长，或增加受试者存活。
在一些实施方案中，可基于例如在周边中或在受疾病/病况影响的器官/组织(例如其中显现疾病/病况的症状的器官/组织)中对病毒(例如EBV)、感染病毒(例如EBV)的细胞或表达/过度表达CAR靶抗原(例如CD30)的细胞的检测、或通过对病毒阳性癌细胞(例如EBV阳性癌细胞)的检测或对表达/过度表达CAR靶抗原(例如CD30)的癌细胞的检测选择受试者用于本文所描述的治疗。疾病/病况可能会影响任何组织或器官或器官系统。在一些实施方案中，疾病/病况可能会影响数个组织/器官/器官系统。
在一些实施方案中，可基于受试者感染EBV或包含感染EBV的细胞的判定选择受试者用于本公开内容的疗法/预防。在一些实施方案中，可基于受试者包含表达/过度表达CD30的细胞，例如表达/过度表达CD30的癌细胞的判定选择受试者用于本公开内容的疗法/预防。
在一些实施方案中，向受试者施用淋巴细胞耗尽化学疗法，之后施用对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞。
即，在一些实施方案中，治疗/预防本公开内容的疾病/病况的方法包括：(i)向受试者施用淋巴细胞耗尽化学疗法，和(ii)随后施用对表达/包含本公开内容的CAR或表达/包含编码本公开内容的CAR的核酸的病毒具有特异性的免疫细胞。
如本文所使用的“淋巴细胞耗尽化学疗法”是指用化学治疗剂进行的治疗，该化学治疗剂在施用治疗的受试者内引起淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴样细胞(ILC)或其前体)耗尽。“淋巴细胞耗尽化学治疗剂”是指引起淋巴细胞耗尽的化学治疗剂。
淋巴细胞耗尽化学疗法和其在通过过继性细胞转移进行的治疗方法中的用途描述于例如Klebanoff等人,Trends Immunol.(2005)26(2):111-7以及Muranski等人,NatClin Pract Oncol.(2006)(12):668-81中，其均在此以全文引用的方式并入。淋巴细胞耗尽化学疗法的目的在于耗尽接受受试者的内源性淋巴细胞群体。
在通过过继性转移免疫细胞治疗疾病的情形下，淋巴细胞耗尽化学疗法通常在过继性细胞转移之前施用，以调节受体受试者接受过继性转移的细胞。淋巴细胞耗尽化学疗法被认为通过例如通过消除表达免疫抑制性细胞因子的细胞产生许可环境和产生过继性转移淋巴细胞的扩增和活性所需的“淋巴空间”来促进过继性转移的细胞的续存和活性。
常用于淋巴细胞耗尽化学疗法中的化学治疗剂包括例如氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、苯达莫司汀(bedamustine)和喷司他汀(pentostatin)。
本公开内容的方面和实施方案特别地涉及包含氟达拉滨和/或环磷酰胺施用的淋巴细胞耗尽化学疗法。在具体实施方案中，本公开内容的淋巴细胞耗尽化学疗法包含氟达拉滨和环磷酰胺施用。
氟达拉滨是通过干扰核糖核苷酸还原酶和DNA聚合酶来抑制DNA合成的嘌呤类似物。其常常用作用于治疗白血病(特别是，慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病)和淋巴瘤(特别是，非霍奇金氏淋巴瘤)的化学治疗剂。氟达拉滨可静脉内或经口施用。
环磷酰胺是在DNA碱基之间引起不可逆的链内和链间交联的烷化剂。其常常用作用于治疗包括淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤的癌症的化学治疗剂。环磷酰胺可静脉内或经口施用。
本公开内容的淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程可包含一种或多种化学治疗剂的多次施用。淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程可包含以本文所描述的剂量并且持续本文所描述的天数施用氟达拉滨和环磷酰胺。作为实例，淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程可包含以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续3个连续日，并且以500mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续3个连续日。
根据淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程施用最后一剂化学治疗剂的日子可被视为淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程完成的日子。
在一些实施方案中，氟达拉滨以5至100mg/m2/天，例如15至90mg/m2/天、15至80mg/m2/天、15至70mg/m2/天、15至60mg/m2/天、15至50mg/m2/天、10至40mg/m2/天、5至60mg/m2/天、10至60mg/m2/天、15至60mg/m2/天、20至60mg/m2/天或25至60mg/m2/天中的一个的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨以20至40mg/m2/天，例如25至35mg/m2/天，例如约30mg/m2/天的剂量施用。
在一些实施方案中，氟达拉滨以根据前一段落的剂量施用超过一天并且少于14个连续日。在一些实施方案中，氟达拉滨以根据前一段落的剂量施用2至14，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5或2至4个连续日中的一个。在一些实施方案中，氟达拉滨以根据前一段落的剂量施用2至6个连续日，例如2至4个连续日，例如3个连续日。
在一些实施方案中，氟达拉滨以15至60mg/m2/天的剂量施用2至6个连续日，例如以30mg/m2/天的剂量施用3个连续日。
在一些实施方案中，环磷酰胺以50至1000mg/m2/天，例如100至900mg/m2/天、150至850mg/m2/天、200至800mg/m2/天、250至750mg/m2/天、300至700mg/m2/天、350至650mg/m2/天、400至600mg/m2/天或450至550mg/m2/天中的一个的剂量施用。在一些实施方案中，环磷酰胺以400至600mg/m2/天，例如450至550mg/m2/天，例如约500mg/m2/天的剂量施用。
在一些实施方案中，环磷酰胺以根据前一段落的剂量施用超过一天并且少于14个连续日。在一些实施方案中，环磷酰胺以根据前一段落的剂量施用2至14，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5或2至4个连续日中的一个。在一些实施方案中，环磷酰胺以根据前一段落的剂量施用2至6个连续日，例如2至4个连续日，例如3个连续日。
在一些实施方案中，环磷酰胺以400至600mg/m2/天的剂量施用2至6个连续日，例如以500mg/m2/天的剂量施用3个连续日。
在一些实施方案中，氟达拉滨和环磷酰胺可同时或依序施用。同时施用是指例如以含有两种药剂的药物组合物形式(即以组合制剂形式)一起或在彼此之后立即并且任选地通过相同施用途径施用至例如同一动脉、静脉或其他血管。依序施用是指药剂中的一个的施用在与其他药剂的单独施用间隔给定时间间隔之后。不要求通过相同途径施用药剂，但在一些实施方案中施用途径相同。
在本公开内容的淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程的一些实施方案中，氟达拉滨和环磷酰胺在相同的一天或数天施用。作为实例，在包含以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续3个连续日并且以500mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续3个连续日的淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程的实例中，氟达拉滨和环磷酰胺可在相同3个连续日施用。在此类实例中，据称淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程可在3个连续日的最后一日完成，在当日氟达拉滨和环磷酰胺被施用至个体。
在一些实施方案中，对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞在淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程完成之后规定时间段内施用至个体。
在一些实施方案中，对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞在本文所描述的淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程完成1至28天，例如1至21天、1至14天、1至7天、2至7天、2至5天或3至5天中的一个之内施用至受试者。在一些实施方案中，对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞在本文所描述的淋巴细胞耗尽化学疗法的疗程完成2至14天内(例如3至5天内)施用至受试者。
在一些实施方案中，对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞以1×107个细胞/m2至1×109个细胞/m2，例如2×107个细胞/m2至1×109个细胞/m2、2.5×107个细胞/m2至8×108个细胞/m2、3×107个细胞/m2至6×108个细胞/m2或4×107个细胞/m2至4×108个细胞/m2中的一个的剂量施用。
在一些实施方案中，对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞以4×107个细胞/m2、1×108个细胞/m2或4×108个细胞/m2的剂量施用。
对表达/包含本文所描述的CAR(或表达/包含编码此类CAR的核酸)的病毒具有特异性的免疫细胞的施用可通过静脉内输注来施用。施用可以以1ml至50ml的体积进行，并且可在1min至10min的时间段内进行。
在一些实施方案中，要根据本公开内容进行治疗/预防的疾病为癌症。
癌症可指任何不想要的细胞增殖(或通过不想要的细胞增殖显示自身的任何疾病)、赘生物或肿瘤。癌症可以是良性或恶性的并且可以是原发性或继发性(转移性)的。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖并且可位于任何组织中。癌症可以是来源于例如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食管、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、肠网膜、口腔、卵巢、胰脏、腮腺、外周神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴和/或白血球的组织/细胞的癌症。
肿瘤可以是神经或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可来源于中枢或外周神经系统，例如神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤中。非神经系统癌症/肿瘤可来源于任何其他非神经组织，实例包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰脏癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤。
在一些实施方案中，癌症选自：实体癌、血液癌、胃癌症(gastric cancer)(例如胃癌(gastric carcinoma)、胃腺癌、胃肠腺癌)、肝癌(肝细胞癌、胆管癌)、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、口腔癌症(oral cavity cancer)(例如口咽癌症(oropharyngeal cancer)(例如口咽癌(oropharyngeal carcinoma))、口腔癌(oral cancer)、喉癌、鼻咽癌、食道癌)、结肠直肠癌症(colorectal cancer)(例如结肠直肠癌(colorectal carcinoma))、结肠癌症(colon cancer)、结肠癌(colon carcinoma)、子宫颈癌、前列腺癌、肺癌(例如NSCLC、小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺细胞癌)、膀胱癌、尿道上皮癌、皮肤癌(例如黑色素瘤、晚期黑色素瘤)、肾细胞癌症(renal cell cancer)(例如肾细胞癌(renal cellcarcinoma))、卵巢癌症(ovarian cancer)(例如卵巢癌(ovarian carcinoma))、间皮瘤、乳癌、脑癌(例如神经胶质母细胞瘤)、前列腺癌、胰脏癌、骨髓血液恶性肿瘤、淋巴母细胞性血液恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、胸腺瘤或多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方案中，癌症是病理学上涉及免疫细胞对其具有特异性的病毒的癌症。即，在一些实施方案中，癌症是由病毒感染引起或加剧的癌症、病毒感染为风险因素的癌症和/或病毒感染与癌症的发作、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。
EBV感染涉及数种癌症，如例如Jha等人,Front Microbiol.(2016)7:1602中所综述，该文献在此以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，要被治疗/预防的癌症为EBV相关癌症。在一些实施方案中，癌症为由EBV感染引起或加剧的癌症、EBV感染为风险因素的癌症和/或EBV感染与癌症的发作、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。癌症的特征可在于EBV感染，例如癌症可包含感染EBV的细胞。此类癌症可称为EBV阳性癌症。
可根据本公开内容进行治疗/预防的EBV相关癌症包括B细胞相关癌症(诸如伯基特氏淋巴瘤)、移植后淋巴增生疾病(PTLD)、中枢神经系统淋巴瘤(CNS淋巴瘤)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和与免疫缺乏症相关的EBV相关淋巴瘤(包括例如与X连锁淋巴增生病症相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV阳性淋巴瘤和口腔毛状白斑)和上皮细胞相关癌症诸如鼻咽癌(NPC)和胃癌(GC)。
在一些实施方案中，癌症选自淋巴瘤(例如EBV阳性淋巴瘤)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC；例如EBV阳性HNSCC)、鼻咽癌(NPC；例如EBV阳性NPC)和胃癌(GC；例如EBV阳性GC)。
在一些实施方案中，癌症为病理学上涉及CAR靶抗原的癌症。即，在一些实施方案中，癌症为由靶抗原表达引起或加剧的癌症、靶抗原表达为风险因素的癌症和/或靶抗原表达与癌症的发作、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。癌症的特征可在于靶抗原表达，例如癌症可包含表达靶抗原的细胞。此类癌症可被称为靶抗原阳性癌症。
靶抗原“阳性”癌症可以是包含表达靶抗原(例如在细胞表面处)的细胞的癌症。靶抗原“阳性”癌症可能会过度表达靶抗原。靶抗原的过度表达可通过检测大于等效非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平的靶抗原的基因表达水平或蛋白质表达水平来进行测定。
在一些实施方案中，靶抗原为如本文所描述的癌细胞抗原。在一些实施方案中，靶抗原为CD30。
在一些实施方案中，癌症为病理学上涉及CD30的癌症。即，在一些实施方案中，癌症为由CD30表达引起或加剧的癌症、CD30表达为风险因素的癌症和/或CD30表达与癌症的发作、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。癌症的特征可在于CD30表达，例如癌症可包含表达CD30的细胞。此类癌症可被称为CD30阳性癌症。
CD30阳性癌症可以是包含表达CD30的细胞(例如在细胞表面处表达CD30蛋白的细胞)的癌症。CD30阳性癌症可能会过度表达CD30。CD30的过度表达可通过检测大于等效非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平的CD30的基因表达水平或蛋白质表达水平来进行测定。
CD30阳性癌症描述于例如van der Weyden等人,Blood Cancer Journal(2017)7:e603以及Muta and Podack,Immunol Res(2013),57(1-3):151-8中，其均在此以全文引用的方式并入。CD30在被活化T和B淋巴细胞的小子集上表达并且由包括经典霍奇金氏淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的各种淋巴赘生物表达。对于周边T细胞淋巴瘤(未另列出)(PTCL-NOS)、成人T细胞白血病/淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、结外NK-T细胞淋巴瘤、各种B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤，特别是EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤)和晚期全身性肥胖细胞增多症，还已显示CD30的可变表达。CD30表达还已在包括生殖细胞肿瘤和睾丸胚胎性癌的一些非造血恶性肿瘤中观察到。
跨膜糖蛋白CD30是肿瘤坏死因子受体超家族的成员(Falini等人,Blood(1995)85(1):1-14)。TNF/TNF-受体(TNF-R)超家族的成员在多个水平下协调免疫反应，并且CD30在调节正常淋巴细胞的功能或增殖方面发挥作用。CD30最初被描述为由单克隆抗体Ki-1识别的抗原，单克隆抗体Ki-1通过使小鼠免疫接种HL源性细胞系L428来培养(Muta andPodack,Immunol Res(2013)57:151-158)。CD30抗原表达已用于识别霍奇金氏疾病中的ALCL和Reed-Sternberg细胞(Falini等人,Blood(1995)85(1):1-14)。在淋巴瘤恶性细胞中广泛表达的情况下，CD30因此是开发基于抗体的免疫疗法和细胞疗法两者的潜在靶标。重要的是，CD30通常在生理条件下在正常组织上不表达，因此尤其不存在于静止成熟或前体B或T细胞上(Younes and Ansell,Semin Hematol(2016)53:186-189)。作为靶向CD30的抗体-药物缀合物的本妥昔单抗维多汀(Brentuximab vedotin)起初被批准用于治疗CD30阳性HL(
Figure BDA0004016141880000771
US Package Insert 2018)。本妥昔单抗维多汀试验的数据支持CD30作为CD30阳性淋巴瘤治疗的治疗靶标，尽管与其使用相关的毒性受到关注。
霍奇金淋巴瘤(HL)是涉及淋巴结和淋巴系统的不常见恶性肿瘤。HL的发生率为双峰的，其中所诊断的大部分患者在15岁与30岁之间，接着为年龄为55岁或更大的成年人中的另一峰。在2019年，估计美国将存在8,110个新的病例(3,540个在女性中并且4570个在男性中)和1,000例因此疾病所致的死亡(410例女性和590例男性)(美国癌症协会2019)。基于美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)的SEER数据库中的2012-2016个病例，美国小儿HL患者的HL发生率如下：1-4岁：0.1；5-9岁：0.3；10-14岁：1.3；15-19岁：3.3/100,000(SEER Cancer Statistics Review，1975-2016])。世界卫生组织(WHO)分类将HL划分成2个主要类型：经典霍奇金淋巴瘤(cHL)和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在西方国家，cHL占全部HL的95％并且NLPHL占5％(National Comprehensive CancerNetwork Guidelines 2019)。
用于患有晚期疾病的cHL患者的第一线化学疗法与在70％与75％之间的治愈率相关(Karantanos等人,Blood Lymphat Cancer(2017)7:37-52)。救助化学疗法、接着自体干细胞移植物(ASCT)常用于在初级疗法之后复发的患者中。不幸地，至多50％的cHL患者在ASCT之后经历疾病复发。在ASCT之后复发的患者的中值总存活为约二年(Alinari Blood(2016)127:287-295)。不管侵袭性组合化学疗法如何，10％至40％的患者对救助化学疗法不实现反应，并且无反应者中不存在支持ASCT的随机化临床试验数据。对于对救助化学疗法无反应、在ASCT之后复发或不是用于此方法的候选者的患者，预后继续不乐观并且迫切需要新的治疗方法(Keudell British Journal of Haematology(2019)184:105-112)。
尽管大部分小儿群体(儿童、青少年和青壮年)将被当前可用的疗法治愈，但小部分患者可能患有难治性或复发性疾病并且需要具有可接受的安全概况和改进的功效效益的新颖疗法(Flerlage等人,Blood(2018)132:376-384；Kelly,Blood(2015)126:2452-2458；McClain and Kamdar,in UpToDate 2019；Moskowitz,ASCO Educational Book(2019)477-486)。在儿童时期被高剂量化学疗法治疗的HL患者通常经历治疗相关长期后遗症诸如心脏、肺、性腺和内分泌毒性以及二级恶性赘生物(Castellino等人,Blood(2011)117(6):1806-1816)。
在一些实施方案中，CD30阳性癌症可选自：实体癌、血液癌、造血恶性肿瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK阴性间变性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(例如PTCL-NOS)、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、NK-T细胞淋巴瘤(例如结外NK-T细胞淋巴瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤-NOS)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、晚期全身性肥大细胞增多症、生殖细胞肿瘤和睾丸胚胎性癌。
在一些实施方案中，癌症选自：CD30阳性癌症、EBV相关癌症、血液癌、骨髓血液恶性肿瘤、造血恶性肿瘤、淋巴母细胞性血液恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征、白血病、T细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、EBV相关淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与X连锁淋巴增生病症相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV阳性淋巴瘤、口腔毛状白斑、伯基特氏淋巴瘤、移植后淋巴增生疾病、中枢神经系统淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK阴性间变性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、NK-T细胞淋巴瘤、结外NK-T细胞淋巴瘤、胸腺瘤、多发性骨髓瘤、实体癌、上皮细胞癌、胃癌、胃肿瘤、胃腺癌、胃肠腺癌、肝癌、肝细胞癌、胆管癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、口腔癌、口咽癌、口咽肿瘤、口腔肿瘤、喉癌、鼻咽癌、食道癌、结肠直肠癌、结肠直肠肿瘤、结肠癌、结肠肿瘤、子宫颈癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺细胞癌、膀胱癌、尿道上皮癌、皮肤癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌、肾细胞肿瘤、卵巢癌、卵巢肿瘤、间皮瘤、乳癌、脑癌、神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、胰脏癌、肥大细胞增多症、晚期全身性肥大细胞增多症、生殖细胞肿瘤或睾丸胚胎性癌。
在一些实施方案中，癌症可以是复发性癌症。如本文所使用的“复发性”癌症是指对治疗(例如第一线癌症疗法)有反应、但随后例如在缓解期之后重现/进展的癌症。举例而言，复发性癌症可以是其生长/进展受治疗(例如第一线癌症疗法)抑制并且随后生长/进展的癌症。
在一些实施方案中，癌症可以是难治性癌症。如本文所使用的“难治性”癌症是指尚未对治疗(例如第一线癌症疗法)有反应的癌症。举例而言，难治性癌症可以是其生长/进展不受治疗(例如第一线癌症疗法)抑制的癌症。在一些实施方案中，难治性癌症可以是接受针对该癌症的治疗的受试者对治疗不呈现部分或完全反应的癌症。
在癌症为间变性大细胞淋巴瘤的实施方案中，就用化学疗法、本妥昔单抗维多汀或克唑替尼(crizotinib)进行的治疗而言，癌症可以是复发性或难治性的。在癌症为外周T细胞淋巴瘤的实施方案中，就用化学疗法或本妥昔单抗维多汀进行的治疗而言，癌症可以是复发性或难治性的。在癌症为结外NK-T细胞淋巴瘤的实施方案中，就用化学疗法(有或无天冬酰胺酶)或本妥昔单抗维多汀进行的治疗而言，癌症可以是复发性或难治性的。在癌症为弥漫性大B细胞淋巴瘤的实施方案中，就用化学疗法(有或无利妥昔单抗)或CD19 CAR-T疗法进行的治疗而言，癌症可以是复发性或难治性的。在癌症为原发性纵隔B细胞淋巴瘤的实施方案中，就用化学疗法、免疫检查点抑制剂(例如PD-1抑制剂)或CD19 CAR-T疗法进行的治疗而言，癌症可以是复发性或难治性的。
根据本公开内容的方法的癌症治疗实现以下治疗作用中的一个或多个：减少受试者的癌细胞数目，减少受试者的癌性肿瘤/病灶尺寸，抑制(例如防止或减缓)受试者的癌细胞生长，抑制(例如防止或减缓)受试者的癌性肿瘤/病灶生长，抑制(例如防止或减缓)癌症发展/进展(例如至晚期，或转移)，减轻受试者的癌症症状的严重程度，增加受试者的存活(例如无进展存活或总存活)，减少受试者的癌细胞的数目或活性的关联，和/或减少受试者的癌症负荷。
可根据修订版反应评估标准评估受试者：卢加诺分类(Lugano Classification)(描述于例如Cheson等人,J Clin Oncol(2014)32:3059-3068中，该文献以引用的方式并入上文)，以便确定其对治疗的反应。在一些实施方案中，根据本公开内容的方法的受试者的治疗实现以下中的一个：完全反应、部分反应或稳定疾病。
在一些实施方案中，癌症治疗进一步包含化学疗法和/或放射疗法。
化学疗法和放射疗法分别指用药物进行的癌症治疗或用电离放射进行的癌症治疗(例如使用X射线或γ射线进行的放射疗法)。药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物剂(例如抗体、抗体片段、适体、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白质)。药物可被配制为药物组合物或药剂。制剂可包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
化学疗法可涉及超过一种药物的施用。药物可取决于要被治疗的病况而单独地或与其他治疗组合地同时或依序施用。
化学疗法可通过一种或多种施用途径施用，例如肠胃外、静脉注射、经口、皮下、皮内或瘤内施用。
化学疗法可根据治疗方案施用。治疗方案可以是化学疗法施用的预定时间表、计划、流程或排程，其可由医师或医疗人员制备并且可被调整以适应需要治疗的患者。治疗方案可指示以下中的一个或多个：向患者施用的化学疗法的类型；每个药物或放射的剂量；施用之间的时间间隔；每个治疗的时长；任何治疗假期的数目和性质(若存在)等。对于协同疗法，可提供指示如何施用每个药物的单一治疗方案。
化学治疗性药物可选自：阿贝西利(Abemaciclib)、乙酸阿比特龙(AbirateroneAcetate)、艾比西特(Abitrexate)(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定化纳米粒子制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼(Acalabrutinib)、AC-T、阿德曲斯(Adcetris)(本妥昔单抗维多汀(Brentuximab Vedotin))、ADE、阿多曲妥珠单抗-美坦新(Ado-TrastuzumabEmtansine)、阿霉素(Adriamycin)(盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride))、二顺丁烯二酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、阿飞尼妥(Afinitor)(依维莫司(Everolimus))、艾克尼扎(Akynzeo)(奈妥吡坦(Netupitant)和盐酸帕洛诺司琼(PalonosetronHydrochloride))、阿尔达拉(Aldara)(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、Alecensa(阿来替尼(Alectinib))、艾乐替尼、阿仑单抗(Alemtuzumab)、爱宁达(Alimta)(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、阿利琼帕(Aliqopa)(盐酸考班昔布(Copanlisib Hydrochloride))、注射用爱克兰(Alkeran)(盐酸美法仑(MelphalanHydrochloride))、爱克兰锭剂(美法仑)、阿乐喜(Aloxi)(盐酸帕洛诺司琼)、阿伦布里格(Alunbrig)(布加替尼(Brigatinib))、安伯氯林(Ambochlorin)(氯芥苯丁酸)、安伯洛林(Amboclorin)(氯芥苯丁酸)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑(Anastrozole)、阿匹坦(Aprepitant)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、阿丽米克斯(Arimidex)(阿那曲唑)、阿诺新(Aromasin)(依西美坦(Exemestane))、阿拉侬(Arranon)(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、阿瑞拉(Arzerra)(奥伐木单抗(Ofatumumab))、天冬酰胺酶菊欧文菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿瓦斯汀(Avastin)(贝伐单抗(Bevacizumab))、阿维鲁单抗(Avelumab)、西卡思罗(Axicabtagene Ciloleucel)、阿西替尼(Axitinib)、阿扎胞苷(Azacitidine)、巴文西亚(Bavencio)(阿维鲁单抗)、BEACOPP、贝森(Becenum)(卡莫司汀(Carmustine))、贝牛达克(Beleodaq)(贝利司他(Belinostat))、贝利司他、盐酸苯达莫司汀(BendamustineHydrochloride)、BEP、贝松萨(Besponsa)(英妥珠单抗奥佐米星(InotuzumabOzogamicin))、贝伐单抗、贝瑟罗汀(Bexarotene)、百克沙(Bexxar)(托西莫单抗(Tositumomab)和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、BiCNU(卡莫司汀)、博莱霉素(Bleomycin)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、博啉妥(Blincyto)(博纳吐单抗)、硼替佐米(Bortezomib)、伯舒立夫(Bosulif)(伯舒替尼(Bosutinib))、伯舒替尼、本妥昔单抗维多汀(Brentuximab Vedotin)、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、硫酸布他卡因(Busulfan)、白舒非(Busulfex)(硫酸布他卡因)、卡巴他赛(Cabazitaxel)、卡博米泰(Cabometyx)(苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、苹果酸卡博替尼、CAF、卡昆司(Calquence)(阿卡替尼(Acalabrutinib))、坎帕斯(Campath)(阿仑单抗(Alemtuzumab))、开普拓(Camptosar)(盐酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride))、卡培他滨(Capecitabine)、CAPOX、氟脲嘧啶霜剂(Carac)(局部氟尿嘧啶)、卡铂(Carboplatin)、卡铂-紫杉醇、卡非佐米(Carfilzomib)、卡莫布瑞斯(Carmubris)(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入剂、康士得(Casodex)(比卡鲁胺(Bicalutamide))、CEM、塞利替尼(Ceritinib)、柔红霉素(Cerubidine)(盐酸道诺霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、卉妍康(Cervarix)(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗(Cetuximab)、CEV、氯芥苯丁酸、氯芥苯丁酸-普赖松(CHLORAMBUCIL-PREDNISONE)、CHOP、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、克拉芬(Clafen)(环磷酰胺)、氯法拉滨(Clofarabine)、克罗法莱(Clofarex)(氯法拉滨)、氯拉(Clolar)(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、考美曲克(Cometriq)(苹果酸卡博替尼)、盐酸考班昔布(Copanlisib Hydrochloride)、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(Cosmegen)(放线菌素D)、柯托里克(Cotellic)(考比替尼)、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、塞夫斯(Cyfos)(异环磷酰胺)、丝兰扎(Cyramza)(雷莫芦单抗(Ramucirumab))、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质粒、赛德萨-U(Cytosar-U)(阿糖胞苷)、赛托克森(Cytoxan)(环磷酰胺)、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、达克金(Dacogen)(地西他滨(Decitabine))、放线菌素D、达雷木单抗(Daratumumab)、达拉兰西(Darzalex)(达雷木单抗)、达沙替尼(Dasatinib)、盐酸道诺霉素、盐酸道诺霉素与阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠(Defibrotide Sodium)、德菲特利奥(Defitelio)(去纤苷钠)、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素迪夫托斯(Denileukin Diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、德泊噻(DepoCyt)(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松(Dexamethasone)、盐酸右雷佐生(DexrazoxaneHydrochloride)、迪奴图单抗(Dinutuximab)、多烯紫杉醇、多希(Doxil)(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、艾弗得士(Efudex)(局部氟尿嘧啶)、埃立特(Elitek)(拉布立酶(Rasburicase))、艾伦斯(Ellence)(盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、艾洛汀(Eloxatin)(奥沙利铂(Oxaliplatin))、艾曲波帕乙醇胺(Eltrombopag Olamine)、止敏吐(Emend)(阿匹坦(Aprepitant))、艾洛替(Empliciti)(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸艾那尼布(Enasidenib Mesylate)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、艾必妥(Erbitux)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾瑞布林(Eribulin Mesylate)、艾丽维吉(Erivedge)(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸埃罗替尼(Erlotinib Hydrochloride)、欧文纳兹(Erwinaze)(天冬酰胺酶菊欧文菌)、益护尔(Ethyol)(胺磷汀)、凡毕复(Etopophos)(磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate))、依托泊苷、磷酸依托泊苷、艾瓦西特(Evacet)(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司(Everolimus)、伊维斯他(Evista)(盐酸雷诺昔酚(Raloxifene Hydrochloride))、优维宁(Evomela)(盐酸美法仑)、依西美坦(Exemestane)、5-FU(氟尿嘧啶注射剂)、5-FU(局部氟尿嘧啶)、法乐通(Fareston)(托瑞米芬(Toremifene))、法瑞达克(Farydak)(帕比诺他(Panobinostat))、法洛德克斯(Faslodex)(氟维司群(Fulvestrant))、FEC、富马乐(Femara)(来曲唑(Letrozole))、非格司亭(Filgrastim)、氟达拉(Fludara)(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、氟普克斯(Fluoroplex)(局部氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶注射剂、局部氟尿嘧啶、氟他胺(Flutamide)、氟莱克斯(Folex)(甲氨蝶呤)、氟莱克斯PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、弗洛汀(Folotyn)(普拉曲沙(Pralatrexate))、FU-LV、氟维司群、加德西(Gardasil)(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、加泽瓦(Gazyva)(阿托珠单抗(Obinutuzumab))、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin)、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、吉诺特夫(Gilotrif)(二顺丁烯二酸阿法替尼)、格列维克(Gleevec)(甲磺酸伊马替尼(ImatinibMesylate))、格立得(Gliadel)(卡莫司汀植入剂)、格立得粉片(卡莫司汀植入剂)、谷卡匹酶(Glucarpidase)、乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、哈拉温(Halaven)(甲磺酸艾瑞布林(Eribulin Mesylate))、汉曼戈(Hemangeol)(盐酸普萘洛尔(PropranololHydrochloride))、赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、和美新(Hycamtin)(盐酸拓朴替康(Topotecan Hydrochloride))、爱治(Hydrea)(羟脲)、羟脲、超CVAD、艾博兰斯(Ibrance)(帕博昔布(Palbociclib))、替伊莫单抗替歇坦(Ibritumomab Tiuxetan)、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、依克鲁西格(Iclusig)(盐酸普纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、艾达米星(Idamycin)(盐酸艾达霉素(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸艾达霉素(Idarubicin Hydrochloride)、艾德昔布(Idelalisib)、恩西地平(Idhifa)(甲磺酸艾那尼布(Enasidenib Mesylate))、艾菲克斯(Ifex)(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(Ifosfamidum)(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、依布鲁维卡(Imbruvica)(依鲁替尼)、英飞凡(Imfinzi)(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特(Imiquimod)、安门利吉(Imlygic)(塔里穆尼拉赫韦克(TalimogeneLaherparepvec))、因塔(Inlyta)(阿西替尼(Axitinib))、英妥珠单抗奥佐米星(Inotuzumab Ozogamicin)、重组干扰素α-2b、白介素-2(阿地白介素)、内含子A(重组干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗与托西莫单抗、伊匹单抗(Ipilimumab)、艾瑞莎(Iressa)(吉非替尼(Gefitinib))、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、伊斯达斯(Istodax)(罗米地辛(Romidepsin))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、柠檬酸依萨佐米(Ixazomib Citrate)、艾克斯普拉(Ixempra)(伊沙匹隆(Ixabepilone))、杰克菲(Jakafi)(磷酸卢利替尼(RuxolitinibPhosphate))、JEB、杰维坦(Jevtana)(卡巴他赛(Cabazitaxel))、卡德克拉(Kadcyla)(阿多曲妥珠单抗-美坦新)、雷洛昔芬(Keoxifene)(盐酸雷诺昔酚)、凯望斯(Kepivance)(帕利夫明(Palifermin))、可瑞达(Keytruda)(派姆单抗(Pembrolizumab))、击癌利(Kisqali)(瑞博昔布(Ribociclib))、金里亚(Kymriah)(替沙津鲁(Tisagenlecleucel))、凯普罗里斯(Kyprolis)(卡非佐米(Carfilzomib))、乙酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、拉特维(Lartruvo)(奥拉单抗(Olaratumab))、来那度胺(Lenalidomide)、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、冷韦纳(Lenvima)(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、甲酰四氢叶酸钙、瘤可宁(Leukeran)(氯芥苯丁酸)、乙酸亮丙立德(Leuprolide Acetate)、禄斯得停(Leustatin)(克拉屈滨(Cladribine))、勒武兰(Levulan)(胺基乙酰丙酸)、林福利嗪(Linfolizin)(氯芥苯丁酸)、力得(LipoDox)(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀(Lomustine)、朗斯弗(Lonsurf)(曲氟尿苷(Trifluridine)和盐酸替吡嘧啶(Tipiracil Hydrochloride))、卢普龙(Lupron)(乙酸亮丙立德)、长效卢普龙(Lupron Depot)(乙酸亮丙立德)、长效卢普龙-派德(Lupron Depot-Ped)(乙酸亮丙立德)、灵帕杂(Lynparza)(奥拉帕尼(Olaparib))、玛奇博(Marqibo)(硫酸长春新碱脂质体)、甲基苄肼(Matulane)(盐酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride))、盐酸甲基二(氯乙基)胺、乙酸甲地孕酮、美凯尼(Mekinist)(曲美替尼(Trametinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、美司钠(Mesna)、美斯莱(Mesnex)(美司钠)、梅塞唑拉斯通(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、美西特(Mexate)(甲氨蝶呤)、美西特-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林(Midostaurin)、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、米托曲士(Mitozytrex)(丝裂霉素C)、MOPP、莫唑比(Mozobil)(普乐沙福(Plerixafor))、木斯塔根(Mustargen)(盐酸甲基二(氯乙基)胺)、突变霉素(丝裂霉素C)、马利兰(Myleran)(硫酸布他卡因)、麦洛萨(Mylosar)(阿扎胞苷)、麦罗塔(Mylotarg)(吉妥珠单抗奥佐米星)、纳米粒子紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定化纳米粒子制剂)、温诺平(Navelbine)(酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate))、莱西单抗(Necitumumab)、奈拉滨(Nelarabine)、尼欧萨(Neosar)(环磷酰胺)、顺丁烯二酸来那替尼(Neratinib Maleate)、乐宁克斯(Nerlynx)(顺丁烯二酸来那替尼)、奈妥吡坦(Netupitant)与盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron Hydrochloride)、纽拉思塔(Neulasta)(聚乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastim))、优保津(Neupogen)(非格司亭(Filgrastim))、雷沙瓦(Nexavar)(甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate))、尼兰得隆(Nilandron)(尼鲁胺(Nilutamide))、尼罗替尼(Nilotinib)、尼鲁胺、恩莱瑞(Ninlaro)(柠檬酸依萨佐米(Ixazomib Citrate))、甲苯磺酸尼拉帕尼单水合物(Niraparib Tosylate Monohydrate)、纳武单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(Nolvadex)(柠檬酸他莫昔芬(Tamoxifen Citrate))、乃普雷特(Nplate)(罗米司亭(Romiplostim))、阿托珠单抗、奥多唑(Odomzo)(索尼得吉(Sonidegib))、OEPA、奥伐木单抗(Ofatumumab)、OFF、奥拉帕尼(Olaparib)、奥拉单抗(Olaratumab)、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、昂卡司帕(Oncaspar)(培门冬酶(Pegaspargase))、盐酸昂丹司琼(Ondansetron Hydrochloride)、安能得(Onivyde)(盐酸伊立替康脂质体)、恩塔克(Ontak)(地尼白介素迪夫托斯)、奥普迪沃(Opdivo)(纳武单抗)、OPPA、奥希替尼(Osimertinib)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定化纳米粒子制剂、PAD、帕博昔布、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼与奈妥吡坦、帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium)、帕尼单抗、帕比诺他(Panobinostat)、帕拉普特(Paraplat)(卡铂)、铂尔定(Paraplatin)(卡铂)、盐酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、PCV、PEB、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、聚乙二醇化干扰素α-2b、PEG-内含子(聚乙二醇化干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium)、帕杰它(Perjeta)(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、普拉迪诺(Platinol)(顺铂)、顺氯胺铂(Platinol-AQ)(顺铂)、普乐沙福、泊利度胺(Pomalidomide)、泊马斯特(Pomalyst)(泊利度胺)、盐酸普纳替尼(PonatinibHydrochloride)、泊特纳(Portrazza)(莱西单抗(Necitumumab))、普拉曲沙(Pralatrexate)、普赖松、盐酸丙卡巴肼、普留净(Proleukin)(阿地白介素)、博力加(Prolia)(地诺单抗(Denosumab))、普若玛塔(Promacta)(艾曲波帕乙醇胺(EltrombopagOlamine))、盐酸普萘洛尔、普罗旺(Provenge)(西普卢塞尔-T(Sipuleucel-T))、嘌呤托(Purinethol)(巯基嘌呤)、普利坦(Purixan)(巯基嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷诺昔酚、雷莫芦单抗、拉布立酶(Rasburicase)、R-CHOP、R-CVP、重组人类乳头状瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人类乳头状瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人类乳头状瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼(Regorafenib)、雷利斯托(Relistor)(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、雷利米得(Revlimid)(来那度胺)、赫玛瑞斯(Rheumatrex)(甲氨蝶呤)、瑞博昔布、R-ICE、美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗)、美罗华海瑟拉(Rituxan Hycela)(利妥昔单抗和人类玻尿酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗与人类玻尿酸酶、盐酸罗拉吡坦(RolapitantHydrochloride)、罗米地辛(Romidepsin)、罗米司亭(Romiplostim)、红比霉素(Rubidomycin)(盐酸道诺霉素)、卢布拉卡(Rubraca)(樟脑磺酸卢卡帕尼(RucaparibCamsylate))、樟脑磺酸卢卡帕尼、磷酸卢利替尼(Ruxolitinib Phosphate)、雷德帕斯(Rydapt)(米哚妥林(Midostaurin))、司兰索(Sclerosol)胸膜内气雾剂(滑石)、司妥昔单抗(Siltuximab)、西普卢塞尔-T、长效索马杜林(Somatuline Depot)(乙酸兰瑞肽)、索尼得吉、甲苯磺酸索拉非尼、斯宾塞(Sprycel)(达沙替尼(Dasatinib))、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、史特瑞陀克(Steritalc)(滑石)、斯蒂瓦加(Stivarga)(瑞戈非尼(Regorafenib))、苹果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)、纾癌特(Sutent)(苹果酸舒尼替尼)、塞拉曲(Sylatron)(聚乙二醇化干扰素α-2b)、塞文特(Sylvant)(司妥昔单抗)、塞瑞博(Synribo)(高三尖杉酯碱)、塔博洛得(Tabloid)(硫鸟嘌呤)、TAC、塔芬拉(Tafinlar)(达拉非尼(Dabrafenib))、泰格莎(Tagrisso)(奥希替尼(Osimertinib))、滑石、塔里穆尼拉赫韦克(Talimogene Laherparepvec)、柠檬酸他莫昔芬、塔拉滨PFS(Tarabine PFS)(阿糖胞苷)、得舒缓(Tarceva)(盐酸埃罗替尼)、塔格瑞汀(Targretin)(贝瑟罗汀(Bexarotene))、塔希纳(Tasigna)(尼罗替尼(Nilotinib))、紫杉醇(紫杉醇)、克癌易(Taxotere)(多烯紫杉醇)、泰圣奇(Tecentriq)(阿特珠单抗)、特莫多(Temodar)(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司(Temsirolimus)、沙立度胺(Thalidomide)、沙洛米得(Thalomid)(沙立度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派(Thiotepa)、替沙津鲁(Tisagenlecleucel)、托拉克(Tolak)(局部氟尿嘧啶)、盐酸拓朴替康、托瑞米芬(Toremifene)、托瑞斯(Torisel)(替西罗莫司)、托西莫单抗与碘I 131托西莫单抗、托泰克特(Totect)(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、特瑞达(Treanda)(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷与盐酸替吡嘧啶、曲塞诺克斯(Trisenox)(三氧化二砷)、泰克泊(Tykerb)(二甲苯磺酸拉帕替尼)、优尼图辛(Unituxin)(迪奴图单抗(Dinutuximab))、三乙酸尿苷、VAC、戊柔比星(Valrubicin)、戊斯塔尔(Valstar)(戊柔比星)、凡德他尼(Vandetanib)、VAMP、瓦鲁比(Varubi)(盐酸罗拉吡坦(Rolapitant Hydrochloride))、维必施(Vectibix)(帕尼单抗)、VeIP、长春碱(Velban)(硫酸长春花碱)、万珂(Velcade)(硼替佐米)、维尔萨(Velsar)(硫酸长春花碱)、维罗非尼(Vemurafenib)、维耐托克(Venclexta)(维纳妥拉(Venetoclax))、维纳妥拉、韦尔泽尼奥(Verzenio)(阿贝马昔布)、韦亚德(Viadur)(乙酸亮丙立德)、维达扎(Vidaza)(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、文卡萨PFS(Vincasar PFS)(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉(Vismodegib)、维斯托加德(Vistogard)(三乙酸尿苷)、沃纳克(Voraxaze)(谷卡匹酶)、伏立诺他(Vorinostat)、维曲特(Votrient)(盐酸帕唑帕尼)、维克斯(Vyxeos)(盐酸道诺霉素和阿糖胞苷脂质体)、韦康瑞林(Wellcovorin)(甲酰四氢叶酸钙)、夏克瑞(Xalkori)(克唑替尼(Crizotinib))、截瘤达(Xeloda)(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、西盖瓦(Xgeva)(地诺单抗)、西奥弗果(Xofigo)(二氯化镭223)、希坦迪(Xtandi)(恩杂鲁胺)、易沃伊(Yervoy)(伊匹单抗)、伊斯卡他(Yescarta)(阿昔卡巴坦西洛塞尔(Axicabtagene Ciloleucel))、翁德利斯(Yondelis)(曲贝替定(Trabectedin))、扎尔拉普(Zaltrap)(阿柏西普(Ziv-Aflibercept))、扎尔西奥(Zarxio)(非格司亭)、则乐(Zejula)(甲苯磺酸尼拉帕尼单水合物)、泽波拉夫(Zelboraf)(维罗非尼)、泽娃灵(Zevalin)(替伊莫单抗替歇坦)、新内卡(Zinecard)(盐酸右雷佐生)、阿柏西普、枢复宁(Zofran)(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(Zoladex)(乙酸戈舍瑞林)、唑来膦酸(ZoledronicAcid)、佐林扎(Zolinza)(伏立诺他)、唑美塔(Zometa)(唑来膦酸)、泽利格(Zydelig)(艾德昔布)、载卡迪(Zykadia)(塞利替尼)和兹替伽(Zytiga)(乙酸阿比特龙)。
EBV感染还涉及各种自体免疫疾病诸如多发性硬化症和全身性红斑狼疮(SLE；参见例如Ascherio and Munger Curr Top Microbiol Immunol.(2015)；390(Pt 1):365-85)的发展/进展，并且最近已显示EBV抗原EBNA2与作为SLE、多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠病、1型糖尿病、幼年特发性关节炎和乳糜泻的发展的风险因素涉及在内的基因区域相关(Harley等人,Nat Genet.(2018)50(5):699-707)。
因此，在一些实施方案中，要根据本公开内容进行治疗/预防的疾病/病况选自：自体免疫疾病、SLE、多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎性肠病、1型糖尿病、幼年特发性关节炎和乳糜泻。
本公开内容的方面和实施方案涉及包含对超过一种非相同靶抗原具有特异性的一种或多种CAR的表达CAR的病毒特异性免疫细胞。在一些实施方案中，包含对CD30具有特异性的CAR的病毒特异性免疫细胞包含对除CD30之外的抗原具有特异性的CAR。举例而言，本文中的实施例4描述包含CD30特异性CAR和CD19特异性CAR的病毒特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，要根据本发明进行治疗/预防的癌症是包含表达非相同靶抗原中的一个或多个的细胞的癌症。在一些实施方案中，癌症是表达非相同靶抗原两者或每一个的癌症。
与同种异体反应性免疫反应的治疗/预防相关的应用
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于涉及同种异体移植的方法中，例如以治疗/预防受试者的疾病/病况。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物适用于用以减少/预防同种异体反应性免疫反应(特别是，T细胞介导的同种异体反应性免疫反应)和其不利后果的方法中。
同种异体反应性T细胞表达CD30。Chan等人,J Immunol(2002)169(4):1784-91鉴定表达CD30的T细胞为在CD30同种异体免疫反应中发挥重要作用的活化T细胞(还表达CD25和CD45RO)的子集。CD30表达和表达CD30的T细胞的增殖响应于同种异体抗原而增加。Chen等人,Blood(2012)120(3):691-6鉴定CD8+ T细胞子集上的CD30表达为GVHD的潜在生物标记物，并且提议CD30为GVHD的治疗靶标。
此外，病毒特异性T细胞具有比多克隆活化T细胞(ATC)更多的限制性TCR库，并且因此不大可能在施用至同种异体个体后引起GVHD。此种情况在同种异体EBV特异性T细胞(EBVST)研究中由GVHD的低发生率反映。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物特别适用于涉及同种异体移植的方法以及同种异体移植物的加工/生产中。
具体地，涵盖用于产生并且施用用于包含同种异体物质施用的治疗性和预防性方法中的“现成”材料的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物。
如上文所阐述，本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞适用于通过过继性细胞转移来治疗/预防疾病/病况。本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞在过继性转移之后不太容易受受体的T细胞介导的同种异体反应性免疫反应的影响，并且因此展现转移后受体中增强的增殖/存活以及优良治疗性/预防性作用。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物还可用于包括除本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞以外的同种异体细胞的同种异体移植的方法中。具体地，本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于耗尽同种异体移植物(细胞群体、组织和器官)和同种异体反应性免疫细胞(例如同种异体反应性T细胞)的受试者。
在这样的方法中，表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于调节供体和/或受体受试者，和/或可用于同种异体移植物的治疗以减少/预防同种异体移植之后的同种异体反应性免疫反应。
要被同种异体移植的细胞、组织和器官包括例如免疫细胞(例如过继性细胞转移)、心脏、肺、肾、肝、胰脏、肠、面部、角膜、皮肤、造血干细胞(骨髓)、血液、手、腿、阴茎、骨、子宫、胸腺、朗格罕氏岛(islets of Langerhans)、心瓣膜和卵巢。要被同种异体移植的细胞群体、组织或器官可被称为“同种异体移植物”。
要通过同种异体移植进行治疗/预防的疾病/病况可以是会从同种异体移植衍生治疗效益或预防效益的任何疾病/病况。在一些实施方案中，要通过同种异体移植进行治疗/预防的疾病/病况可例如是T细胞功能异常病症、癌症、感染性疾病或自体免疫疾病。
T细胞功能异常病症可以是正常T细胞功能受损、从而导致个体对病原性抗原的免疫反应下调的疾病/病况，此类病原性抗原例如由外源性物质诸如微生物、细菌和病毒的感染生成，或由呈某些疾病状态，诸如呈癌症的某些形式(例如呈肿瘤相关抗原形式)的宿主生成。T细胞功能异常病症可包含T细胞耗竭或T细胞无能。T细胞耗竭包含CD8+ T细胞无法响应于抗原刺激来增殖T细胞或发挥T细胞效应功能(诸如细胞毒性和细胞因子(例如IFNγ)分泌)的状态。耗竭性T细胞的特征还可在于T细胞耗竭的一种或多种标记物例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3的持续表达。T细胞功能异常病症可显现为感染或不能建立针对感染的有效免疫反应。感染可以是慢性的、持续的、潜伏的或缓慢的，并且可以是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的结果。因此，可向患有细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。细菌感染的实例包括幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)感染。病毒感染的实例包括HIV、乙型肝炎或丙型肝炎的感染。T细胞功能异常病症可能与癌症诸如肿瘤免疫逃逸相关。许多人类肿瘤表达由T细胞识别并且能够诱导免疫反应的肿瘤相关抗原。
感染性疾病可以是例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方案中，可能特别需要治疗慢性/持续性感染，例如在此类感染与T细胞功能异常或T细胞耗竭相关的情况下。众所周知，T细胞耗竭是许多慢性感染(包括病毒、细菌和寄生虫)期间以及癌症中出现的T细胞功能异常的状态(Wherry Nature Immunology Vol.12,No.6,p492-499,June2011)。可治疗的细菌感染的实例包括芽孢杆菌属的几个种(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、梭菌属的几个种(Clostridium spp.)、棒状杆菌属的几个种(Corynebacterium spp.)、霍乱弧菌(Vibrio chloerae)、葡萄球菌属的几个种(Staphylococcus spp.)、链球菌属的几个种(Streptococcus spp.)、埃希氏菌(Escherichia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、耶尔森菌(Yersinia)、欧文菌(Erwina)、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌属的种(Listeria sp)、幽门螺旋杆菌、分枝杆菌(mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的感染。举例而言，细菌感染可以是败血症或肺结核。可治疗的病毒感染的实例包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒和人类乳头状瘤病毒(HPV)感染。可治疗的真菌感染的实例包括交链孢属的种(Alternaria sp)、曲霉菌属的种(Aspergillus sp)、假丝酵母属的种(Candida sp)和组织胞浆菌属的种(Histoplasmasp)的感染。真菌感染可以是真菌性败血症或组织胞浆菌病。可治疗的寄生虫感染的实例包括疟原虫属物种(Plasmodium species)(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、约氏疟原虫(Plasmodium yoeli)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)或夏氏夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi))感染。寄生虫感染可以是诸如疟疾、利什曼虫病(leishmaniasis)和弓形虫病的疾病。
在一些实施方案中，疾病/病况为自体免疫疾病。在此类实施方案中，治疗可旨在减少自体免疫效应细胞的数目。在一些实施方案中，自体免疫疾病选自：1型糖尿病、乳糜泻、格雷夫氏病(Graves'disease)、炎性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物还可用于治疗/预防同种异体反应性免疫反应和特征在于同种异体反应性免疫反应的疾病/病况。
特征在于同种异体反应性免疫反应的疾病和病况包括由与同种异体移植相关的同种异体反应性免疫反应引起或加剧的疾病/病况。此类疾病/病况包括移植物抗宿主疾病(GVHD)和移植排斥，并且详细描述于Perkey and Maillard Annu Rev Pathol.(2018)13:219-245中，该文献在此以全文引用的方式并入。
移植物抗宿主疾病(GVHD)可在同种异体移植大量供体免疫细胞之后发生，并且涉及供体来源的免疫细胞针对同种异体受体细胞/组织/器官的反应性。移植排斥是指在移植之后受体免疫系统破坏移植的细胞/组织/器官。在移植排斥是同种异体移植物的情况下，其可被称为同种异体移植排斥。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于耗尽同种异体移植物中的同种异体反应性T细胞，此类同种异体反应性T细胞可另外在同种异体移植时在受体中导致移植物抗宿主疾病(GVHD)。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于耗尽同种异体移植物供体中的同种异体反应性T细胞(例如在收获/收集同种异体移植物之前)，此类同种异体反应性T细胞可另外在同种异体移植时在受体中导致GVHD。
本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于耗尽同种异体移植物受体中的同种异体反应性T细胞，此类同种异体反应性T细胞可另外引起/促成移植排斥。
本公开内容提供治疗/预防同种异体移植后的移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，该方法包括向同种异体移植物的供体受试者施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物。本公开内容还提供治疗/预防同种异体移植后的移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，该方法包括使同种异体移植物与本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物接触。该方法的目的在于减弱/移除同种异体反应性免疫细胞在同种异体移植中建立针对同种异体移植物受体的细胞、组织和/或器官的同种异体反应性免疫反应的能力。
本公开内容提供治疗/预防同种异体移植后的移植排斥的方法，该方法包括向同种异体移植物的受体受试者施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物。该方法的目的在于减弱/移除受体受试者建立针对同种异体移植物的同种异体反应性免疫反应的能力。表达CAR的病毒特异性免疫细胞可用于消除受体中另外影响针对供体细胞、组织和/或器官的同种异体反应性免疫反应的免疫细胞。
本公开内容提供包含耗尽同种异体移植物的同种异体反应性免疫细胞(例如同种异体反应性T细胞)的方法，该方法包括使同种异体移植物(例如要被移植的细胞群体、组织或器官)与本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物接触。该方法可包括向同种异体移植物的供体受试者施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物。该方法的目的在于减弱/移除同种异体反应性免疫细胞在同种异体移植中建立针对同种异体移植物受体的细胞、组织和/或器官的同种异体反应性免疫反应的能力。
在一些实施方案中，该方法包括以下中的一个或多个：
从受试者获得/收集细胞群体、组织或器官；
使细胞群体、组织或器官与本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物接触；
在存在本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞的情况下体外或离体培养细胞群体、组织或器官；
收获/收集耗尽同种异体反应性免疫细胞的细胞群体、组织或器官；和
向受试者移植/施用耗尽同种异体反应性免疫细胞的细胞群体、组织或器官。
本公开内容还提供包括耗尽受试者的同种异体反应性免疫细胞(例如同种异体反应性T细胞)的方法，该方法包括向受试者施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物。受试者可以是同种异体移植物的供体受试者，或可以是同种异体移植物的预期受体受试者。
在一些实施方案中，该方法包括以下中的一个或多个：
向受试者施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物，以便耗尽受试者的同种异体反应性免疫细胞；
从已施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的受试者获得/收集细胞群体、组织或器官；和
向受试者移植/施用耗尽同种异体反应性免疫细胞的细胞群体、组织或器官。
在一些实施方案中，该方法包括以下中的一个或多个：
向受试者施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物，以便耗尽受试者的同种异体反应性免疫细胞；和
向先前已施用本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的受试者移植/施用细胞群体、组织或器官。
同种异体反应性免疫细胞耗尽可引起同种异体移植物或受试者中的同种异体反应性免疫细胞的数量减少例如2倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍或更多倍。
该方法可体外或离体或在受试者中体内进行。体外或离体进行的方法步骤可包括体外或离体细胞培养。
该方法可进一步包括产生本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物的方法步骤。
在一些实施方案中，向同种异体移植的受体受试者进行的本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的施用和同种异体移植同时(即在同一时间或在例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内)进行。
在一些实施方案中，向同种异体移植的受体受试者进行的本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的施用和同种异体移植依序进行。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的施用同同种异体移植之间的时间间隔可以是包括数小时、数天、数周、数月或数年的任何时间间隔。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物可在同种异体移植之前或之后施用至受体受试者。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物优选在同种异体移植之前施用至受体受试者。
在一些实施方案中，向同种异体移植的供体受试者进行的本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的施用和从受试者进行的同种异体移植物的收集(即细胞、组织和/或器官的收集)同时(即在同一时间或在例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内)进行。在一些实施方案中，向同种异体移植的供体受试者进行的本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的施用和从受试者进行的同种异体移植物的收集(即细胞、组织和/或器官的收集)依序进行。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的施用同同种异体移植物的收集之间的时间间隔可以是包括数小时、数天、数周、数月或数年的任何时间间隔。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物可在同种异体移植物的收集之前或之后施用至供体受试者。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物优选在同种异体移植物的收集之前施用至供体受试者。
在一些实施方案中，该方法包括用于治疗/预防同种异体反应性免疫反应、移植排斥和/或GVHD的额外干预。
在一些实施方案中，用于治疗/预防同种异体反应性、移植排斥和/或GVHD的方法包括免疫抑制性和/或淋巴细胞耗尽性疗法的施用，该疗法诸如为用以下进行的治疗：皮质类固醇(例如泼尼松龙、氢化可的松)、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如环孢素、他克莫司(tacrolimus))、抗增殖剂(例如咪唑硫嘌呤、霉酚酸)和/或mTOR抑制剂(例如西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus))。
在一些实施方案中，用于治疗/预防同种异体反应性和/或移植排斥的方法包括抗体疗法，诸如用以下进行的治疗：单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab))、抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白)和/或抗CD20抗体(例如利妥昔单抗(rituximab))。
在一些实施方案中，用于治疗/预防同种异体反应性和/或移植排斥的方法包括输血和/或骨髓移植。
在本文公开的方法的情况下，本公开内容还提供用于这样的方法中的本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物。还提供本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物用于制造用于这样的方法中的产品(例如药物)的用途。
在一些实施方案中，相较于采用一种或多种免疫抑制剂的方法而言，本公开内容的各个方面的方法引起非同种异体反应性免疫细胞的较少的耗尽和/或增加的存活。例如，本发明方法可用于在同种异体移植物的受体受试者或同种异体移植物中保存/维持非同种异体反应性免疫细胞腔室。
在包含同种异体移植的本公开内容的方法的一些实施方案中，本发明方法与相较于涉及免疫抑制剂治疗的方法而言用于同种异体移植的受体受试者中非同种异体反应性免疫细胞的增加的数目/比例相关。在包含同种异体免疫细胞的过继性转移的本公开内容的方法的一些实施方案中，本发明方法与相较于涉及免疫抑制剂治疗的方法而言用于同种异体免疫细胞的受体受试者中非同种异体反应性免疫细胞的增加的数目/比例相关。
在包含同种异体移植的本公开内容的方法的一些实施方案中，本发明方法与相较于涉及免疫抑制剂治疗的方法而言同种异体移植物中非同种异体反应性免疫细胞的增加的数目/比例相关。
本公开内容还提供用于以下方法中的本公开内容的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物：
杀伤表达CAR对其具有特异性的靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)；
杀伤感染病毒特异性免疫细胞对其具有特异性的病毒或呈递该病毒的抗原的肽的细胞(例如感染EBV或呈递EBV抗原的肽的细胞)；和/或
杀伤同种异体反应性免疫细胞(例如表达CD30的T细胞)。
本公开内容还提供此类表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物在该方法中的用途和使用表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物以达到此类目的的方法。
受试者
根据本公开内容的方面的受试者可以是任何动物或人类。受试者优选为哺乳动物，更优选为人类。受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选为人类。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是患者。受试者可能已被诊断患有需要治疗的本文所描述的疾病/病况，可能疑似患有此类疾病/病况，或可能处于发展/感染此类疾病/病况的风险。
在本公开内容的实施方案中，受试者优选为人类受试者。在一些实施方案中，要根据本公开内容的治疗性或预防性方法进行治疗的受试者为患有本文所描述的疾病/病况或处于发展本文所描述的疾病/病况的风险的受试者。在本发明的实施方案中，基于此类疾病/病况的某些标志物的表征，受试者可被选择用于根据该方法进行的治疗。
受试者可就本公开内容的干预而言为同种异体受试者。要根据本公开内容进行治疗/预防的受试者可在基因上与衍生表达CAR的病毒特异性免疫细胞的受试者不相同。要根据本公开内容进行治疗/预防的受试者可相对于衍生表达CAR的病毒特异性免疫细胞的受试者而言是HLA错配的。要根据本公开内容进行治疗/预防的受试者可相对于衍生表达CAR的病毒特异性免疫细胞的受试者而言是HLA匹配的。
根据本公开内容施用细胞的受试者可相对于衍生细胞的来源而言是同种异体/非自体的。施用细胞的受试者可以是与产生细胞以用于生产要被施用的细胞的受试者不同的受试者。施用细胞的受试者可在基因上与产生细胞以用于生产要被施用的细胞的受试者不相同。
施用细胞的受试者可包含编码MHC/HLA分子的MHC/HLA基因，此类MHC/HLA分子与由产生细胞以用于生产要被施用的细胞的受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子不相同。施用细胞的受试者可包含编码MHC/HLA分子的MHC/HLA基因，此类MHC/HLA分子与由产生细胞以用于生产要被施用的细胞的受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子相同。
在一些实施方案中，施用细胞的受试者相对于产生细胞以用于生产要被施用的细胞的受试者而言是HLA匹配的。在一些实施方案中，施用细胞的受试者相对于产生细胞以用于生产要被施用的细胞的受试者而言是几乎或完全HLA匹配的。
在一些实施方案中，在HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1中，受试者是≥4/8(即4/8、5/8、6/8、7/8或8/8)匹配。在一些实施方案中，在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1和HLA-DQB1中，受试者是≥5/10(即5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10)匹配。在一些实施方案中，在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1和HLA-DPB1中，受试者是≥6/12(即6/12、7/12、8/12、9/12、10/12、11/12或12/12)匹配。在一些实施方案中，在HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1中，受试者是8/8匹配。在一些实施方案中，在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1和HLA-DQB1中，受试者是10/10匹配。在一些实施方案中，在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1和HLA-DPB1中，受试者是12/12匹配。
序列同一性
用于确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比的目的的成对和多个序列比对可以以本领域技术人员已知的各种方式，例如使用公开可用计算机软件来实现，所述软件诸如ClustalOmega(
Figure BDA0004016141880001001
J.2005,Bioinformatics 21,951-960)、T-coffee(Notredame等人,2000,J.Mol.Biol.(2000)302,205-217)、Kalign(Lassmann andSonnhammer 2005,BMC Bioinformatics,6(298))和MAFFT(Katoh and Standley 2013,Molecular Biology and Evolution,30(4)772–780软件。当使用此类软件时，优选使用默认参数例如缺口罚分和延伸罚分。
序列
Figure BDA0004016141880001011
Figure BDA0004016141880001021
Figure BDA0004016141880001031
Figure BDA0004016141880001041
本发明包括所描述的方面和优选特点的组合，当此类组合明显不允许或明确被避免时除外。
本文所使用的栏目标题仅出于组织目的并且不应解释为限制所描述的主题。
现将参考附图借助于实施例示出本发明的方面和实施方案。其他方面和实施方案将对本领域技术人员明显。本文所提及的所有文献均以引用的方式并入本文中。
在整个包括所附权利要求书的本说明书中，除非上下文另外要求，否则“包含”一词和诸如“包括”和“含有”的变化形式将理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。
必须注意，除非上下文另外清楚地指示，否则如本说明书和随附权利要求书中所使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括多个提及物。范围可在本文中表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示此类范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解，特定值形成另一个实施方案。
在本文公开核酸序列的情况下，还明确涵盖其反向互补序列。
本文所描述的方法可体外或体内进行。在一些实施方案中，本文所描述的方法在体外进行。术语“体外”意欲涵盖用于培养物中的细胞进行的实验，而术语“体内”意欲涵盖用完整多细胞生物进行的实验。
序列表
<110>  贝勒医学院
<120>  使用表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞治疗和预防癌症
<130>  BAYM.P0308WO2 (BLG 20.080; 007921554)
<140>  TBD
<141>  2021-04-27
<150>  US 63/015,769
<151>  2020-04-27
<160>  53
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  595
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  1
Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu
1               5                   10                  15
Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn
            20                  25                  30
Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys
        35                  40                  45
Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp
    50                  55                  60
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg
65                  70                  75                  80
Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met
            100                 105                 110
Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His
        115                 120                 125
Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
    130                 135                 140
Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln
                165                 170                 175
Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met
            180                 185                 190
Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu
        195                 200                 205
Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys
225                 230                 235                 240
Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys
                245                 250                 255
Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro
            260                 265                 270
Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile
        275                 280                 285
Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro
    290                 295                 300
Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys
305                 310                 315                 320
Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn
                325                 330                 335
Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln
            340                 345                 350
Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr
        355                 360                 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
    370                 375                 380
Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly
385                 390                 395                 400
Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile
                405                 410                 415
Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys
            420                 425                 430
Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg
        435                 440                 445
Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met
    450                 455                 460
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
465                 470                 475                 480
Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser
                485                 490                 495
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
            500                 505                 510
Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly
        515                 520                 525
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
    530                 535                 540
Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
545                 550                 555                 560
Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
                565                 570                 575
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
            580                 585                 590
Ser Gly Lys
        595
<210>  2
<211>  132
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  2
Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr
1               5                   10                  15
Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn
        35                  40                  45
Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val
    50                  55                  60
Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His
                85                  90                  95
Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val
            100                 105                 110
Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Lys
    130
<210>  3
<211>  483
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  3
Met Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe
1               5                   10                  15
His Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala
            20                  25                  30
Gln Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala
        35                  40                  45
Cys Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro
    50                  55                  60
Gln Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr
65                  70                  75                  80
Met Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys
                85                  90                  95
Leu Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser
            100                 105                 110
Asp Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp
        115                 120                 125
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg
    130                 135                 140
Cys Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met
                165                 170                 175
Ile Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr
            180                 185                 190
Pro Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu
        195                 200                 205
Lys Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys
    210                 215                 220
Asn Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr
225                 230                 235                 240
Gln Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro
                245                 250                 255
Thr Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp
            260                 265                 270
Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val
        275                 280                 285
Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg
    290                 295                 300
Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro
305                 310                 315                 320
Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Leu Arg
                325                 330                 335
Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met
            340                 345                 350
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
        355                 360                 365
Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser
    370                 375                 380
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
385                 390                 395                 400
Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly
                405                 410                 415
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
            420                 425                 430
Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
        435                 440                 445
Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
    450                 455                 460
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
465                 470                 475                 480
Ser Gly Lys
<210>  4
<211>  18
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  4
Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu
1               5                   10                  15
Arg Ala
<210>  5
<211>  367
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  5
Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn Pro Ser
1               5                   10                  15
His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys Pro Met
            20                  25                  30
Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp Cys Arg
        35                  40                  45
Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg Cys Thr
    50                  55                  60
Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro Cys
65                  70                  75                  80
Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His Ser Val
            100                 105                 110
Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln Lys Asn
        115                 120                 125
Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys Ala Ser
    130                 135                 140
Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln Ala Lys
145                 150                 155                 160
Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met Pro Val
                165                 170                 175
Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu Thr Arg
            180                 185                 190
Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp Pro Gly
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys Arg Lys
    210                 215                 220
Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys Thr Ala
225                 230                 235                 240
Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro Cys Ala
                245                 250                 255
Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile Cys Ala
            260                 265                 270
Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro Ile Cys
        275                 280                 285
Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys Asp Thr
    290                 295                 300
Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr
305                 310                 315                 320
Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu
                325                 330                 335
Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala
            340                 345                 350
Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly
        355                 360                 365
<210>  6
<211>  21
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  6
Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Ala Phe Leu Leu
            20
<210>  7
<211>  189
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  7
Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu
1               5                   10                  15
Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser
            20                  25                  30
Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr
        35                  40                  45
Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu
    50                  55                  60
Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu
                85                  90                  95
Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr
            100                 105                 110
Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu
        115                 120                 125
Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu
    130                 135                 140
Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu
145                 150                 155                 160
Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu
                165                 170                 175
Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
            180                 185
<210>  8
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  8
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr
1               5
<210>  9
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  9
Ile Asn Pro Ser Ser Gly Cys Ser
1               5
<210>  10
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  10
Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10                  15
<210>  11
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  11
Gln Asn Val Gly Thr Asn
1               5
<210>  12
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  12
Ser Ala Ser
1
<210>  13
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  13
Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  14
<211>  123
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Thr Ile His Trp Val Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Cys Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  15
<211>  107
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  15
Val Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Val Thr Tyr Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  16
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  16
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  17
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  17
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  18
<211>  245
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Thr Ile His Trp Val Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Cys Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ile Glu Leu Thr Gln
    130                 135                 140
Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Val Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln
                165                 170                 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg
            180                 185                 190
Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
        195                 200                 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr
    210                 215                 220
Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Leu Glu Ile Lys
                245
<210>  19
<211>  151
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  19
Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu
1               5                   10                  15
Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser
            20                  25                  30
Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro
        35                  40                  45
Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr
    50                  55                  60
Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg
65                  70                  75                  80
Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr
                85                  90                  95
Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser
            100                 105                 110
Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr
        115                 120                 125
Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys
145                 150
<210>  20
<211>  24
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  20
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
            20
<210>  21
<211>  21
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  21
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Phe Leu
            20
<210>  22
<211>  28
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  22
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
            20                  25
<210>  23
<211>  4
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2)..(3)
<223>  Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa为L或I
<400>  23
Tyr Xaa Xaa Xaa
1
<210>  24
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2)..(3)
<223>  Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa为L或I
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (5)..(9)
<223>  Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(12)
<223>  Xaa不存在或为任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14)..(15)
<223>  Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa为L或I
<400>  24
Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
<210>  25
<211>  112
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  25
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
            20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
            100                 105                 110
<210>  26
<211>  44
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  26
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
1               5                   10                  15
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
        35                  40
<210>  27
<211>  44
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  27
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
1               5                   10                  15
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala
            20                  25                  30
Tyr Ala Ala Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
        35                  40
<210>  28
<211>  156
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  28
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
1               5                   10                  15
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
        35                  40                  45
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
    50                  55                  60
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
65                  70                  75                  80
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
                85                  90                  95
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
            100                 105                 110
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
        115                 120                 125
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
    130                 135                 140
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145                 150                 155
<210>  29
<211>  12
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  29
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1               5                   10
<210>  30
<211>  12
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  30
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1               5                   10
<210>  31
<211>  221
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  31
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1               5                   10                  15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
            20                  25                  30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
        35                  40                  45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
    50                  55                  60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65                  70                  75                  80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                85                  90                  95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            100                 105                 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
        115                 120                 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                165                 170                 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
            180                 185                 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        195                 200                 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val
    210                 215                 220
<210>  32
<211>  223
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  32
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
1               5                   10                  15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr
            20                  25                  30
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        35                  40                  45
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
    50                  55                  60
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                85                  90                  95
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            100                 105                 110
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
        115                 120                 125
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
                165                 170                 175
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
            180                 185                 190
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
        195                 200                 205
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys
    210                 215                 220
<210>  33
<211>  232
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  33
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  34
<211>  20
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  34
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Ile Met Ser
            20
<210>  35
<211>  666
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Thr Ile His Trp Val Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Cys Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ile Glu Leu Thr Gln
    130                 135                 140
Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Val Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln
                165                 170                 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg
            180                 185                 190
Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
        195                 200                 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr
    210                 215                 220
Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp
                245                 250                 255
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
            260                 265                 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
        275                 280                 285
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
    290                 295                 300
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
305                 310                 315                 320
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
                325                 330                 335
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
            340                 345                 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
        355                 360                 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
    370                 375                 380
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
385                 390                 395                 400
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
                405                 410                 415
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
            420                 425                 430
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
        435                 440                 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
    450                 455                 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465                 470                 475                 480
Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
                485                 490                 495
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
            500                 505                 510
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
        515                 520                 525
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
    530                 535                 540
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
545                 550                 555                 560
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
                565                 570                 575
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
            580                 585                 590
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
        595                 600                 605
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
    610                 615                 620
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
625                 630                 635                 640
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
                645                 650                 655
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
            660                 665
<210>  36
<211>  689
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  36
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Ile Met Ser Arg Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Arg Arg Pro
    50                  55                  60
Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Cys
65                  70                  75                  80
Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp
                85                  90                  95
Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu
            100                 105                 110
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr
        115                 120                 125
Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Val Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val
                165                 170                 175
Gly Asp Arg Val Asn Val Thr Tyr Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr
            180                 185                 190
Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu
        195                 200                 205
Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
    210                 215                 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln
225                 230                 235                 240
Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro
                245                 250                 255
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro
            260                 265                 270
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
        275                 280                 285
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
    290                 295                 300
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
305                 310                 315                 320
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
                325                 330                 335
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
            340                 345                 350
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
        355                 360                 365
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
    370                 375                 380
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
                405                 410                 415
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
            420                 425                 430
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
        435                 440                 445
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
    450                 455                 460
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
465                 470                 475                 480
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
                485                 490                 495
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val
            500                 505                 510
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
        515                 520                 525
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
    530                 535                 540
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
545                 550                 555                 560
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
                565                 570                 575
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
            580                 585                 590
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
        595                 600                 605
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
    610                 615                 620
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
625                 630                 635                 640
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
                645                 650                 655
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
            660                 665                 670
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
        675                 680                 685
Arg
<210>  37
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  37
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
1               5
<210>  38
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  38
Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
1               5
<210>  39
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  39
Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  40
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  40
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1               5
<210>  41
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  41
His Thr Ser
1
<210>  42
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  42
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>  43
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  43
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  44
<211>  107
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
            100                 105
<210>  45
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  46
<211>  263
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  46
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
        35                  40                  45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
    50                  55                  60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65                  70                  75                  80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
                85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
            100                 105                 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
    130                 135                 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
                165                 170                 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
            180                 185                 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
        195                 200                 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
    210                 215                 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225                 230                 235                 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
                245                 250                 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
            260
<210>  47
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  47
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys
1               5                   10                  15
<210>  48
<211>  29
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  48
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
            20                  25
<210>  49
<211>  42
<212>  PRT
<213>  智人
<400>  49
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
            20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
        35                  40
<210>  50
<211>  154
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  50
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
            20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
        35                  40                  45
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
    50                  55                  60
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
                85                  90                  95
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
            100                 105                 110
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
        115                 120                 125
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
    130                 135                 140
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145                 150
<210>  51
<211>  21
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  51
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro
            20
<210>  52
<211>  440
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
        115                 120                 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
    130                 135                 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145                 150                 155                 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
            180                 185                 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
        195                 200                 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
    210                 215                 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro
                245                 250                 255
Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
            260                 265                 270
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
        275                 280                 285
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
    290                 295                 300
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
305                 310                 315                 320
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
                325                 330                 335
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
            340                 345                 350
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
        355                 360                 365
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
    370                 375                 380
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
385                 390                 395                 400
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
                405                 410                 415
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
            420                 425                 430
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
        435                 440
<210>  53
<211>  461
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成构建体
<400>  53
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
        35                  40                  45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
    50                  55                  60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65                  70                  75                  80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
                85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
            100                 105                 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
    130                 135                 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
                165                 170                 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
            180                 185                 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
        195                 200                 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
    210                 215                 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225                 230                 235                 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
                245                 250                 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
            260                 265                 270
Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
        275                 280                 285
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
    290                 295                 300
Val Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
305                 310                 315                 320
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
                325                 330                 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
            340                 345                 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
        355                 360                 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
    370                 375                 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385                 390                 395                 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
                405                 410                 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
            420                 425                 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
        435                 440                 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
    450                 455                 460
附图简要说明
现将参考附图讨论示出本发明的原理的实施方案和实验。
图1.显示细胞的HLA-A2和CD3表达的散点图，此类细胞在培养以下7天之后获得：来源于HLA-A2阳性受试者的未被转导的EBVST(左上图)或来源于HLA-A2阳性受试者的被CD30-CAR构建体转导的EBVST(右上图)；或在共培养以下7天之后获得：来源于HLA-A2阴性受试者的同种异体反应性T细胞和来源于HLA-A2阳性受试者的未被转导的EBVST(左下图)或来源于HLA-A2阳性受试者的被CD30-CAR构建体转导的EBVST(右下图)。
图2A和2B.显示7天之后(2A)EBVST(即CD3+，HLA-A2阳性)细胞和(2B)同种异体反应性T细胞(即CD3+，HLA-A2阴性)细胞的细胞计数的条形图。
图3.显示细胞的HLA-A2和CD71表达的散点图，此类细胞在包含以下的共培养物中7天之后获得：HLA-A2阳性PBMC和来源于HLA-A2阴性受试者的未被转导(NT；左上图)、被CD30-CAR构建体转导(CD30.CAR；右上图)、被CD19-CAR构建体转导(CD19.CAR；左下图)或被CD30-CAR和CD19-CAR构建体转导(CD30+CD19.CAR；右下图)的EBVST。
图4.显示由从4个代表性供体采集的血液样品制备的CD30.CAR EBVST的增殖的图。该图显示在培养物中生长的细胞的累积倍数扩增。
图5A和5B.显示如通过51Cr释放测定所测定，在以所指示比率共培养CD30.CAREBVST(效应子)和51Cr标记的靶细胞(靶标)之后，CD30.CAR EBVST对(5A)CD30阴性BJAB伯基特淋巴瘤细胞和(5B)CD30阳性HDLM2霍奇金淋巴瘤细胞的细胞毒性的图。
图6A和6B.显示如通过ELISpot分析所测定，由从4个代表性供体采集的血液样品制备的CD30.CAR EBVST对EBV抗原的反应性的图。用EBV潜伏抗原的肽(潜伏)、EBV溶解抗原的肽(溶解)刺激细胞，或不用抗原(阴性)刺激细胞，并且测定每5×104个细胞的斑点形成单位数值。(6A)显示未被编码CD30.CAR的逆转录病毒转导的EBVST的反应性。(6B)显示CD30.CAR EBVST(被编码CD30.CAR的逆转录病毒转导)的反应性。
图7.显示在CD30.CAR EBVST输注前和在输注后6周进行的1号患者的PET扫描的结果的代表性图像。
图8.显示在CD30.CAR EBVST输注前和在输注后6周进行的2号患者的PET和CT扫描的结果的代表性图像。
图9.显示如通过qRT-PCR所测定，在CD30.CAR EBVST输注前(之前)和在输注后的所指示时间段获得的血液样品内的外周血细胞中的载体拷贝数目的表。
图10.显示如通过ELISpot分析所测定，在淋巴细胞耗尽之前(LD前)和在CD30.CAREBVST输注后的所指示时间段1号患者的外周血内细胞对不同抗原的特异性的分析结果的条形图。用EBV潜伏抗原的肽(潜伏)、EBV溶解抗原的肽(溶解)、针对其他病毒的抗原的肽(其他病毒)、肿瘤相关抗原(TAA)抗原的肽刺激在所指示时间点从血液样品分离的PBMC，或未用抗原刺激此类PBMC(无肽混合物)，并且测定每3×105个细胞的斑点形成单位数值。
实施例
在以下实施例中，本发明人描述表达CD30.CAR的EBVST的生成、其针对癌细胞的效应子活性和其对同种异体排斥的抗性。
实施例1：生成编码CAR构建体的逆转录病毒
Figure BDA0004016141880001071
通过将编码CAR的cDNA克隆至pSFG-TGFbDNRII逆转录病毒主链(ATUM，Newark，CA)中来制备编码CD30.CAR构建体的逆转录病毒。
使用聚乙烯亚胺(PEI)将携带CD30.CAR序列的质粒pSFG_CD30CAR转染至HEK293Vec-RD114细胞中。随后，使用来自转染的细胞的细胞培养物上清液来以5×105个细胞/6孔板的孔的密度转导HEK 293Vec-Galv细胞(BioVec Pharma，Quebec，Canada)。
以胰蛋白酶处理293Vec-Galv_CD30-CAR细胞，并且使细胞以2×106个细胞/毫升的浓度再悬浮于15ml管中。进行两次连续稀释，并将1.65ml最终细胞悬浮液稀释并与220mlDMEM+10％FCS混合。将两百微升此悬浮液转移至96孔板的孔中，从而产生30个细胞/板。接着，选择并且使用表现最佳的克隆以生成含逆转录病毒的上清液。随后，收集含逆转录病毒的上清液，将其过滤并且储存于-80℃下直至使用为止。
通过将编码CD19.CAR的DNA克隆克隆至pSFG逆转录病毒主链中来产生编码CD19.CAR构建体的逆转录病毒。使用聚乙烯亚胺(PEI)，使用携带CD19.CAR序列的质粒85bCD19C转染HEK 293Vec-RD114细胞。随后，收集含逆转录病毒的上清液，将其过滤并且储存于-80℃下直至使用为止。
实施例2：生成表达CAR的EBV特异性T细胞
根据标准Ficoll-Paque密度梯度离心法从获自健康供体或淋巴瘤患者的血液样品分离外周血单核细胞(PBMC)。
生成ATC
通过添加0.5ml的1mg/ml抗体的1:1000稀释液来将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28激动剂抗体涂布至组织培养板的孔上，并且在37℃下孵育2-4小时或在4℃下孵育过夜。通过在被抗CD3/CD28激动剂抗体涂布的板上在细胞培养基(含有44.5％Advanced RPMI培养基、44.5％Click培养基、10％FBS和1％GlutaMax)中培养来刺激1×106个PBMC(在2ml培养基/孔中)。将细胞维持在37℃下5％CO2氛围中。次日，将1ml的细胞培养基用含有20ng/ml IL-7和20ng/ml IL-15的新鲜细胞培养基置换。为了将ATC维持在培养物中，每2-4天，视需要补充细胞培养基和细胞因子，或收获ATC并且将其再铺板于具有细胞因子的新鲜细胞培养基中。在第7-10天之间收获ATC并且将其用于实验中以用EBVST对其进行再刺激。
通用LCL
通过在利用B细胞的EBV转化制备的类淋巴母细胞系的细胞中对编码I类HLA和II类HLA分子的基因进行靶向敲除来获得缺乏I类HLA和II类HLA的表面表达的LCL(即HLA阴性LCL)。进一步修饰HLA阴性细胞以敲除EBV复制所需的基因。通过该方法获得的所得细胞在本文中被称为通用LCL(uLCL)。
扩增和转导EBV特异性T细胞(EBVST)
通过使用CD45RA MACS微珠(Miltenyi Biotec)进行磁性细胞分离来耗尽来自健康供体的PBMC的表达CD45RA的细胞。通过在补充有IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的含有44.5％-47％Advanced RPMI、44.5％-47％Click培养基、10％FBS或5％富含生长因子的添加剂和1％GlutaMax的细胞培养基中用获自JPT Technologies的EBNA1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-EBNA1)、LMP1肽混合物(JPT目录号PM-EBV-LMP1)和LMP2肽混合物(JPT目录号PM-EBV-LMP2)(重叠11个氨基酸、跨越相关抗原的完整氨基酸序列的重叠15聚体氨基酸肽库)刺激2×106个耗尽CD45RA的PBMC(在2ml培养基/孔中)来扩增EBV特异性T细胞。将EBVST维持在37℃下5％CO2氛围中。
在4-6天之后，如下用实施例1中所描述的编码CAR的逆转录病毒转导EBVST。
将含逆转录病毒的上清液(0.5-1ml/孔)添加至被重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)(Takara)预涂布的非组织培养物处理的24孔板中。在2000×g下对板进行离心60-90min之后，移除逆转录病毒上清液，并且以0.25-0.5×106个细胞/孔再铺板细胞。
在培养8-10天之后，通过在存在uLCL的情况下与负载了被照射的肽的自体活化T细胞(ATC)一起共培养来再刺激细胞。简言之，在37℃下在CTL培养基中将2×106个ATC与肽混合物一起孵育(10ng肽混合物/1×106个ATC)30min，并且随后在30Gy下对其进行照射，并且将其收获。随后，在含有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的CTL培养基中使负载了肽的ATC与培养物中的细胞和uLCL(在100Gy下被照射)以1:1:5的反应细胞:负载了肽的ATC:被照射的uLCL比率混合。具体地，在24孔组织培养板的孔中的2mL CTL培养基中培养1×105个反应细胞、1×105个负载了肽的ATC和0.5×106个被照射的uLCL。
为了将EBVST维持在培养物中，每2-4天，视需要补充细胞培养基和细胞因子，或收获EBVST并且将其再铺板于具有细胞因子的新鲜细胞培养基中。在第15-20天之间收获EBVST并且将其用于混合淋巴细胞反应(MLR)测定中。
实施例3：评估CD30特异性CAR消除同种异体反应性T细胞并且保护同种异体VST免 受排斥的能力
本发明人研究CD30.CAR表达对VST抵抗体外同种异体排斥的能力的影响。
生成致敏的同种异体反应性T细胞
在30戈瑞照射用于生成EBVST的来自同一健康供体的1-2×106个PBMC(每孔)，并且将其在补充有IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的含有44.5％Advanced RPMI、44.5％Click培养基、10％血清和1％GlutaMax的细胞培养基中与来自错配供体(具有不同HLA-A2表达)的1×106个PBMC(每孔)一起共培养。通过在第6-10天在被抗CD3/CD28激动剂抗体涂布的板上铺板0.5×106个细胞(在2ml细胞培养基中)来再刺激从错配供体的PBMC扩增的致敏的同种异体反应性T细胞。为了将同种异体反应性T细胞维持在培养物中，每2-4天，视需要补充细胞培养基和细胞因子，或收获同种异体反应性T细胞并且将其再铺板于具有细胞因子的新鲜细胞培养基中。在第13-17天之间收获同种异体反应性T细胞并且将其与EBVST一起用于混合淋巴细胞反应(MLR)测定中。
为了体外评估同种异体排斥，在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中将来自HLA-A2阴性受试者的0.2×104个PBMC同种异体反应性T细胞与以下一起共培养：
(i)由用于对同种异体反应性T细胞进行致敏的HLA-A2阳性受试者的PBMC生成的0.2×104个EBVST，或
(ii)由用于对同种异体反应性T细胞进行致敏的HLA-A2阳性受试者的PBMC生成、另外用编码CD30特异性CAR的构建体转导的0.2×104个EBVST。
将人类IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)添加至MLR测定中。
在7天之后进行流式细胞分析，并且使用计数珠粒测定绝对细胞数目。可基于HLA-A2表达在共培养之后获得的群体中识别来源于不同受试者的T细胞。使用Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter)以获取事件，并且使用Kaluza分析软件(Beckman Coulter)以用于数据分析和图形表示。
如图1中所示，在与来源于HLA-A2阴性受试者的同种异体反应性T细胞一起共培养7天之后(左下图)来源于HLA-A2阳性受试者的未被转导(NT)的EBVST数目与当在不存在同种异体反应性T细胞的情况下培养此类EBVST时(左上图)相比极大地减少。相反地，在与同种异体反应性T细胞一起共培养7天之后(右下图)CD30.CAR EBVST数目与当在不存在同种异体反应性T细胞的情况下培养此类EBVST时(右上图)相比增加。
图2显示流式细胞术数据的定量。在存在同种异体反应性T细胞的情况下未被转导的EBVST(NT)大部分被消除，而表达CD30.CAR的EBVST对由同种异体反应性T细胞进行的消除具有抗性(图2A)。另外，同种异体反应性T细胞群体(CD3+，HLA-A2阴性)的定量显示，相对于未被转导的EBVST情况而言，CD30.CAR EBVST减少同种异体反应性T细胞的数目(图2B)。
因此，表达CD30.CAR的EBVST被显示具有减少同种异体反应性T细胞的数目并且受保护以免受同种异体排斥的能力。
实施例4：表征表达CD19特异性CAR和CD30特异性CAR的EBV特异性T细胞
本发明人产生并且表征被工程改造以表达CD19.CAR和CD30.CAR两者的病毒特异性T细胞，并且检查其是否可在混合淋巴细胞反应中消除同种异体反应性T细胞。
简言之，在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中将耗尽表达CD19和CD56的细胞的来自HLA-A2阳性受试者的1×105个PBMC的群体与以下一起共培养：
(i)由HLA-A2阴性受试者的PBMC生成的0.1×105个EBVST，或
(ii)由HLA-A2阴性受试者的PBMC生成、另外被编码(a)CD30.CAR、(b)CD19.CAR或(c)CD30.CAR和CD19.CAR两者(CD30+CD19.CAR)的构建体转导的0.1×105个EBVST。
将人类IL-2以20IU/ml添加至MLR测定中。
如图3中所示，与未被转导(NT)的EBVST(左上图)和CD19.CAR EBVST(左下图)相比，截至第7天，CD30.CAR EBVST(右上图)和CD30+CD19.CAR EBVST(右下图)两者均极大地减少HLA-A2+同种异体反应性T细胞(通过活化标记物CD71区分)的比例(并且因此避免其的排斥)。
因此，本发明人提供用于使用被靶抗原(在本实施例中为CD19)特异性CAR和CD30特异性CAR两者转导的EBVST生成对给定靶抗原具有特异性的“现成”CAR T细胞的新颖方法。此类双CAR-EBVST体外消除同种异体反应性T细胞的能力表明其可能够避免排斥并且长期存留于体内同种异体受体中。
实施例5：使用CD30.CAREBVST治疗癌症
5.1产生并且表征由健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST
在GMP设施中制造CD30.CAR EBVST。在获得知情同意之后并且根据《赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)》所确立的准则从七个健康的血库批准的供体收集约250至400mL血液。
通过密度梯度离心从血液分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用与磁珠缀合的临床级抗CD45RA抗体并且使用和Miltenyi耗尽管柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)进行磁性细胞分离来耗尽PBMC的表达CD45RA的细胞。
将耗尽CD45RA阳性细胞的1.5-2.5×107个PBMC接种于G-Rex10容器中的30ml补充有IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的含有47.5％Advanced RPMI、47.5％Click(EHAA)培养基(Irvine Scientific)、2mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific)和5％人类血小板裂解物(HPL；Sexton Biotechnologies)的培养基中，并且通过用包含重叠11个氨基酸并且跨越相关抗原的整体蛋白序列的15聚体氨基酸的重叠肽库(肽混合物)进行刺激来将其活化。从JPT Technologies(Berlin,Germany)获得对应于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2a和BNLF2b的肽混合物。刺激采用5ng肽混合物/各抗原/1×106个要被刺激的细胞(即对于使用2×107个耗尽CD45RA阳性细胞的PBMC进行的刺激，使用100ng各肽混合物)。将刺激培养物维持在37℃下5％CO2氛围中。
在4-6天之后，如下用实施例1中所描述的编码CAR的逆转录病毒转导由前一段落中所描述的刺激培养物产生的EBVST。使2ml含逆转录病毒上清液与150μg体积为2ml的Vectofusin-1混合，得到4ml最终体积，并且将其在室温下孵育5-30min。随后，将逆转录病毒:Vectofusin-1混合物添加至T75容器中的8.5ml培养基中的7-10×106个细胞(描述于前一段落中)中。将培养物维持在37℃下5％CO2氛围中。
在培养第8天与第10天之间，将如前一段落中所描述的通过转导产生的1-2×107个CD30.CAR EBVST CD30.CAR EBVST转移至G-Rex100容器中，并且通过以在1:2至1:5范围内(通常约1:3)的CD30.CAR EBVST与被照射的uLCL的比率与被照射(在100戈瑞)的uLCL(描述于实施例2中)一起共培养来对其进行再刺激。ULCL表达EBV抗原和CD30以及其他共刺激性分子，并且因此提供伴随抗原刺激和共刺激的CD30.CAR EBVST，从而诱导CD30.CAREBVST的稳健增殖而不损失EBV特异性。
在200ml培养基(描述于5.1部分的第3段中)中建立再刺激培养物，并且视需要添加额外培养基。7至12天后，收获CD30.CAR EBVST并且将其冷冻保存以用于后续输注。
针对从4个代表性健康供体受试者制备的CD30.CAR EBVST的体外增殖能力、针对表达CD30的和CD30阴性的癌细胞系的体外细胞毒性并且为了测定其针对不同EBV抗原的特异性对其进行评估。
分析CD30.CAR EBVST增殖
在培养期间，通过在培养期间的各种时间点(第0、6、10、17、18和19天)使用血细胞计数器计数细胞数目来测定CD30.CAR EBVST增殖，并且计算累积倍数扩增。
图4显示由4个不同健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST在体外培养中充分扩增，足以在～17-20天内获得治疗剂量的CD30.CAR EBVST。扩增的细胞在77％至99％细胞上表达CD30.CAR(数据未示出)。
分析CD30.CAR EBVST细胞毒性
使用铬-51(51Cr)释放测定来测量CD30.CAR EBVST的细胞毒性特异性。简言之，将靶细胞即CD30阴性BJAB伯基特淋巴瘤细胞或CD30阳性HDLM2霍奇金淋巴瘤细胞与51Cr一起孵育一小时。使用未被转导的EBVST或被CD30.CAR转导的EBVST作为效应子并且在96孔板的孔中以40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1的效应子:靶标比率将其与靶标一起孵育。在孵育4-6小时之后，收获共培养物上清液，并且用γ计数器检测51Cr释放。使用下式由一式三份的平均值测定特异性裂解百分比：[(实验释放-自发性释放)/(最大释放-自发性释放)]×100。
图5显示CD30.CAR EBVST实质上对CD30阴性伯基特淋巴瘤BJAB细胞系的细胞无细胞毒性，但对CD30阳性霍奇金淋巴瘤HDLM2细胞系的细胞展现高细胞毒性。
分析CD30.CAR EBVST对EBV抗原的反应性
进行IFN-γELISpot分析以评估从四个不同健康供体受试者制备的CD30.CAREBVST对用EBV抗原进行的刺激的反应。
测量响应于用EBV潜伏循环抗原(EBNA1、LMP1、LMP2和BARF1)和EBV溶解循环抗原(BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2a和BNLF2b)的肽混合物(获自JPTTechnologies,Berlin,Germany)进行的刺激的IFN-γ产生。简言之，将CD30.CAR EBVST以5×104个细胞/孔一式二份地铺板于96孔MultiScreen板(MilliporeSigma)的孔中。使用总计0.1μg肽/孔进行刺激。在37℃下5％CO2中孵育16-20小时之后，使板针对IFN-γ+斑点显影并且传送至ZellNet Consulting(Fort Lee,NJ)以进行定量。抗原特异性反应的频率被表示为斑点形成单位(SFU)/5×104个细胞。
图6显示由4个不同健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST保持其针对EBV抗原的特异性。
所有四个CD30.CAR EBVST株均通过功能释放标准，该功能释放标准为响应于用潜伏EBV抗原和溶解EBV抗原两者进行的刺激产生多于100个IFNγ斑点形成单位(SFU)/105个细胞和呈20:1的效应子:靶标比率的针对CD30阳性霍奇金淋巴瘤细胞系HDLM2的大于20％的特异性细胞裂解。
5.2施用CD30.CAR EBVST作为用于CD30+淋巴瘤的同种异体过继性细胞疗法
患有CD30+难治性或复发性霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK阴性间变性T细胞淋巴瘤或其他外周T细胞淋巴瘤的年龄为12-75岁的患者符合此研究中的治疗条件。
患者接受三次日剂量的环磷酰胺(Cy：500mg/m2/天)以及氟达拉滨(Flu：30mg/m2/天)以诱发淋巴细胞减少症，在CD30.CAR EBVST细胞输注前至少48小时、但不超过输注前2周完成。
在研究第0天，患者通过约1至10分钟内的静脉内输注接受体积为1至50ml的其计划单次剂量的同种异体CD30.CAR EBVST。向患者施用具有最佳I类和II类HLA匹配的CD30.CAR EBVST。
在本研究中向总计五个患者施用同种异体CD30.CAR EBVST细胞。三个患者接受4×107个CD30.CAR EBVST细胞的剂量水平1(DL1)。两个患者接受1×108个CD30.CAR EBVST细胞的剂量水平2(DL2)。
除由医师给予注射外，根据血液产品施用的机构标准进行监测。输注后监测患者至少3小时。评估患者的不良事件，包括临床状态和实验室数据的变化。具体地，评估患者的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的相关性，此类相关性已在一些CAR-T细胞免疫疗法中观察到。
在以下时间点从患者收集血液样品：在研究前、输注后3-4小时、第0天细胞输注后1、2、3、4和6周以及3个月。分析样品以便评估CD30.CAR EBVST的续存和功效。
患者中没有一个经历剂量限制性毒性，并且未观察到任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或移植物抗宿主疾病(GVHD)。
施用同种异体CD30.CAR EBVST的患者中的临床反应
在输注前和在第0天输注之后6-8周时进行诊断成像以记录可测量疾病和对疗法的反应(通过PET扫描、CT扫描、MRI和核成像)。
向1号患者的左肘窝中静脉内注射11.9mCi的FDG(注射时的血糖含量为99mg/dL)。从颅盖中间至近端股骨获得PET和CT图像，并且随后融合图像，其中在轴面、冠状面和矢状面进行多平面重建并且进行三维重建。
向2号患者静脉内注射7.29mCi的FDG(注射时的血糖含量为99mg/dL)。约60min后，使用PET-CT扫描仪，利用CT衰减校正技术获取颅底至近端大腿的图像。使用低剂量技术获得CT层面，并且获得多平面重新格式化图像。
图7和8显示两个CD30.CAR EBVST治疗的患者中的临床反应。1号患者的图像显示疾病的数个区域的解析度并且2号患者的图像显示疾病的标记减轻，其指示用同种异体CD30.CAR EBVST进行的治疗在这些患者中的治疗功效。
分析施用后的CD30.CAR载体拷贝数目
通过实时qPCR定量编码CD30.CAR的逆转录病毒的整合基因组。从在数个时间点(在淋巴细胞耗尽之前、3小时、第1周、第2周、第3周、第4周、第6周和第3个月)从患者采集的外周血样品分离PBMC。在根据制造商说明书用QIAamp DNA血液小型试剂盒(Qiagen)从PBMC提取DNA之后，用与逆转录病毒载体内的特异性序列互补的引物和探针(AppliedBiosystems)扩增DNA。使用编码转基因的质粒的连续稀释液建立标准曲线。根据制造商说明书使用ABI7900HF实时PCR系统(Applied Biosystems)进行扩增。
图9显示1号患者和2号患者的CD30.CAR转基因的载体拷贝数目，并且表明CD30.CAR EBVST不在体内扩增并且在这些患者中的外周血中迅速变得不可检测。
分析施用同种异体CD30.CAR EBVST的患者中的表位扩展
为了评估表位扩展，在数个时间点从1号患者收集免疫细胞，并且用肿瘤相关抗原对其进行刺激以测定其在输注同种异体CD30.CAR EBVST之前和之后的反应性。
从在数个时间点(在淋巴细胞耗尽之前、3小时、第1周、第2周、第3周、第4周、第6周和第3个月)从患者采集的外周血样品分离PBMC，并且将此类PBMC用于基本上如上文实施例5.1中所描述进行的ELISpot测定中，不同之处在于PBMC以3×105/孔铺板并且除了评估EBV潜伏抗原和溶解抗原之外，还使用两个额外组的抗原刺激PBMC：(1)一组来自“其他病毒”的抗原的肽混合物(腺病毒蛋白六邻体和五邻体以及CMV蛋白PP65)，和(2)一组对应于肿瘤相关抗原(TAA)MAGE-A4、NY-ESO、PRAME、SSX2和存活素的肽混合物。
图10显示1号患者在任何时间点均不对肿瘤相关抗原有反应，此种情况表明1号患者中不存在表位扩展。此结果表明，用同种异体CD30.CAR EBVST进行的治疗不敏化患者的针对这些其他肿瘤抗原的免疫系统。
5.3结论
本发明人已显示，由健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST可被扩增至足够数目并且保留其TCR和CD30.CAR两者的功能并且保持EBV特异性和消除CD30阳性肿瘤细胞的能力，这与其作为用于患有CD30+癌症的患者的现成治疗的用途一致。
发现CD30.CAR EBVST为安全的，并且展现针对同种异体受体中的体内CD30阳性淋巴瘤的治疗功效。尽管表达CAR的细胞在外周血中的续存受限并且在不存在表位扩展至其他肿瘤相关抗原的迹象的情况下，观察到临床反应。

Claims (22)

1.用于治疗或预防癌症的方法的病毒特异性免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的氨基酸序列。
2.包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的氨基酸序列。
3.一种治疗或预防癌症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的病毒特异性免疫细胞，所述病毒特异性免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸，其中所述CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述使用的病毒特异性免疫细胞、根据权利要求2所述的用途或根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传导结构域包含与SEQ ID NO：26具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述跨膜结构域衍生自CD28的跨膜结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO：20具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：14具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：15具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：18具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述信号传导结构域包含：(a)衍生自CD3ζ的胞内结构域的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述信号传导结构域包含与SEQ ID NO：25具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述CAR还包含提供在所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。
12.根据权利要求1至11中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述铰链区包含与SEQ ID NO：33具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述CAR包含与SEQ ID NO：35或36具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述病毒特异性免疫细胞包含CAR，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域，或所述病毒特异性免疫细胞包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域。
15.根据权利要求1至14中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中：
CAR包含：(i)与CD30特异性结合的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的信号传导结构域；和
其中所述病毒特异性免疫细胞包含CAR，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域，或所述病毒特异性免疫细胞包含编码CAR的核酸，所述CAR包含特异性结合除CD30之外的靶抗原的抗原结合结构域。
16.根据权利要求14或权利要求书15所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述病毒特异性免疫细胞包含多于一种非相同CAR或编码多于一种非相同CAR的核酸。
17.根据权利要求14至16中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中除CD30之外的靶抗原是癌细胞抗原。
18.根据权利要求14至17中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述除CD30之外的靶抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38、BCMA、间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。
19.根据权利要求14至18中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中除CD30之外的靶抗原是CD19。
20.根据权利要求1至19中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述病毒特异性免疫细胞是病毒特异性T细胞。
21.根据权利要求1至20中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中所述病毒特异性免疫细胞对EB病毒(EBV)具有特异性。
22.根据权利要求1至21中任一项所述使用的病毒特异性免疫细胞、用途或方法，其中癌症选自：CD30阳性癌症、EBV相关癌症、血液学癌症、髓系血液恶性肿瘤、造血恶性肿瘤、淋巴母细胞血液恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征、白血病、T细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、EBV相关淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与X连锁淋巴细胞增殖性疾病相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV阳性淋巴瘤、口腔毛状白斑、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、中枢神经系统淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、NK-T细胞淋巴瘤、淋巴结外NK-T细胞淋巴瘤、胸腺瘤、多发性骨髓瘤、实体瘤、上皮细胞癌、胃肿瘤、胃癌、胃腺癌、胃肠道腺癌、肝癌、肝细胞癌、胆管癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌、口腔癌、口咽肿瘤、口咽癌、口癌、喉癌、鼻咽癌、食管癌、结直肠肿瘤、结直肠癌、结肠肿瘤、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌、皮肤癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞肿瘤、肾细胞癌、卵巢肿瘤、卵巢癌、间皮瘤、乳腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、肥大细胞增多症、晚期全身性肥大细胞增多症、生殖细胞瘤或睾丸胚胎癌。
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