TW202339777A

TW202339777A - Cd30陽性癌症之治療

Info

Publication number: TW202339777A
Application number: TW111146356A
Authority: TW
Inventors: 克里奧納Ｍ魯尼; 大衛Ｈ魁奇
Original assignee: 美國貝勒醫學院
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-10-16
Also published as: WO2023102328A3; WO2023102328A2

Abstract

本發明之實施例提供治療個體之CD30陽性癌症的方法。在特定實施例中，向該個體投與有效劑量的表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量可分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

Description

CD30陽性癌症之治療

本發明係關於醫學治療之方法。

CD30.CAR-T療法包含經遺傳修飾以表現對CD30具有特異性之嵌合抗原受體(CAR)從而靶向及殺死表現CD30跨膜醣蛋白之癌細胞的T細胞。藥品係由獲自CD30陽性淋巴瘤患者之周邊血液單核細胞(PBMC)產生。

在患有包括典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin Lymphoma；cHL)之CD30陽性血液科惡性疾病的患者中之初始1期研究中，已證明在不存在淋巴球耗竭化學療法的情況下，自體CD30.CAR-T投與為安全的，但僅少數患者具有持久反應(NCT01316146；Ramos等人, J Clin Invest. (2017) 127(9):3462-3471)。

已證明在淋巴球耗竭化學療法之後，CD30.CAR-T療法耐受良好，其在過度預治療之CD30陽性復發性或難治性典型HL患者及一些NHL患者中證實具有顯著臨床活性(NCT02917083 (RELY-30)；Ramos等人, Biol Blood Marrow Transplant 25 (2019) S7-S75, 摘要79)。

在第一態樣中，本發明提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

在第二態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

在第三態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

在一些實施例中，該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞對於該個體為同種異體的。

在第四態樣中，本發明提供一種消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

在第五態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物，其用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法中，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

在第六態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物的用途，其用以製造用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞之方法中的藥劑，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

在一些實施例中，該方法包含授受性轉移表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞。

在一些實施例中，該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞為病毒特異性T細胞。

在一些實施例中，該等病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus；EBV)具有特異性。

在一些實施例中，該第一時間點與該第二時間點相隔3天。

在一些實施例中，該劑量之50%在該第一時間點投與，且該劑量之50%在該第二時間點投與。

在一些實施例中，該劑量之50%在第0天投與，且該劑量之50%在第3天投與。

在一些實施例中，該劑量為約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該劑量為約4 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該劑量為約1 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該劑量為約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在第七態樣中，本發明提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與第一劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，且隨後向該個體投與第二劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。

在第八態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含向個體投與第一劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，且隨後向該個體投與第二劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。

在第九態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向個體投與第一劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，且隨後向該個體投與第二劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。

在一些實施例中，該等病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒具有特異性。

在一些實施例中，該第一劑量及該第二劑量相隔3天投與。

在一些實施例中，該第一劑量在第0天投與且該第二劑量在第3天投與。

在一些實施例中，該第一劑量為約2 × 10 ⁷至約2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該第二劑量為約2 × 10 ⁷至約2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約4 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約1 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在第十態樣中，本發明提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²之總劑量，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。

在第十一態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物，其用於治療個體之CD30陽性癌症的方法中，其中該方法包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²之總劑量，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。

在第十二態樣中，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物的用途，其用以製造用於治療個體之CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²之總劑量，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。

在一些實施例中，該等病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒(EBV)具有特異性。

在一些實施例中，該第一劑量及該第二劑量相隔3天投與。

在一些實施例中，該第一劑量為該總劑量之50%，且該第二劑量為該總劑量之50%。

在一些實施例中，該第一劑量及該第二劑量為約2 × 10 ⁷至約2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該總劑量為約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該總劑量為約4 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該總劑量為約1 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，該總劑量為約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。

在一些實施例中，在投與該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之前，向該個體投與淋巴球耗竭化學療法。

在一些實施例中，該淋巴球耗竭化學療法包含氟達拉濱(fludarabine)及環磷醯胺。

在一些實施例中，氟達拉濱以每天15至60 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。

在一些實施例中，氟達拉濱以每天30 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。

在一些實施例中，環磷醯胺以每天250至1000 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。

在一些實施例中，環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。

在一些實施例中，氟達拉濱以每天30 mg/m ²之劑量向個體投與且環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量向個體投與，持續3個連續日。

在一些實施例中，該淋巴球耗竭化學療法包含環磷醯胺及苯達莫司汀(bendamustine)。

在一些實施例中，苯達莫司汀以每天35至140 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。

在一些實施例中，苯達莫司汀以每天70 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。

在一些實施例中，環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量向個體投與且苯達莫司汀以每天70 mg/m ²之劑量向個體投與，持續3個連續日。

在一些實施例中，該CD30陽性癌症係選自：血液癌症、實體癌症、造血系惡性疾病、霍奇金氏淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、未分類型周邊T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、NK-T細胞淋巴瘤、結外NK-T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、未分類型彌漫性大B細胞淋巴瘤、EBV陽性B細胞淋巴瘤、EBV陽性彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、晚期全身性肥大細胞增多症、生殖細胞腫瘤及睾丸胚胎性癌。

在一些實施例中，該CD30陽性癌症係選自：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、未分類型周邊T細胞淋巴瘤、結外NK-T細胞淋巴瘤、未分類型彌漫性大B細胞淋巴瘤及原發性縱隔大B細胞淋巴瘤。

在一些實施例中，該個體先前針對該CD30陽性癌症之療法失敗。

在一些實施例中，該CD30陽性癌症為復發性或難治性CD30陽性癌症。

在一些實施例中，該等表現CD30特異性CAR之T細胞包含CAR，其包含：(i)特異性結合於CD30之抗原結合域，(ii)跨膜域，及(iii)信號傳導域，其中該信號傳導域包含：(a)來源於CD28之胞內域的胺基酸序列，及(b)包含基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)的胺基酸序列。

在一些實施例中，該信號傳導域包含與SEQ ID NO:26具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，該跨膜域來源於CD28之跨膜域。

在一些實施例中，該跨膜域包含與SEQ ID NO:20具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO:14具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列及與SEQ ID NO:15具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，該抗原結合域包含與SEQ ID NO:18具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，該信號傳導域包含：(a)來源於CD3ζ之胞內域的胺基酸序列。

在一些實施例中，該信號傳導域包含與SEQ ID NO:25具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，該CAR另外包含提供於該抗原結合域與該跨膜域之間的鉸鏈區。

在一些實施例中，該鉸鏈區包含與SEQ ID NO:33具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，該CAR包含與SEQ ID NO:35或36具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

本發明包括所描述之態樣及較佳特徵之組合，除非此類組合為明顯不容許或明確避免的。

本申請案主張2021年12月3日申請之美國臨時專利申請案第63/285,539號之優先權，其以全文引用之方式併入本文中。

現將參考隨附圖式論述本發明之態樣及實施例。其他態樣及實施例對於熟習此項技術者將為顯而易見的。本文中提及之所有文獻均以引用的方式併入本文中。

CD30 陽性癌症 本發明係關於癌症，更尤其CD30陽性癌症之治療。

CD30 (亦稱為TNFRSF8)為由UniProt: P28908鑑別之蛋白質。CD30為腫瘤壞死因子受體超家族之單次I型跨膜醣蛋白。CD30結構及功能描述於例如van der Weyden等人, Blood Cancer Journal (2017) 7: e603以及Muta及Podack Immunol. Res. (2013) 57(1-3):151-8中，二者特此以全文引用之方式併入。

由人類TNFRSF8基因編碼之mRNA之選擇性剪接產生三種同功異型物：同功異型物1 (『長』同功異型物；UniProt: P28908-1, v1；SEQ ID NO: 1)；同功異型物2 (『細胞質』、『短』或『C30V』同功異型物，UniProt: P28908-2；SEQ ID NO: 2)，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置1至463之胺基酸序列缺失；及同功異型物3 (UniProt: P28908-3；SEQ ID NO: 3)，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置1至111及位置446之胺基酸序列缺失。SEQ ID NO:1之N端18個胺基酸形成信號肽(SEQ ID NO:4)、接著為367個胺基酸胞外域(SEQ ID NO:1之位置19至385，示於SEQ ID NO:5中)、21個胺基酸跨膜域(SEQ ID NO:1之位置386至406，示於SEQ ID NO:6中)及189個胺基酸細胞質域(SEQ ID NO:1之位置407至595，示於SEQ ID NO:7中)。

在本說明書中，「CD30」係指來自任何物種之CD30且包括來自任何物種之CD30同功異型物、片段、變異體或同源物。如本文所使用，參考蛋白質之「片段」、「變異體」或「同源物」可視情況經表徵為與參考蛋白質(例如參考同功異型物)之胺基酸序列具有至少60%、較佳70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之一者之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，參考蛋白質之片段、變異體、同功異型物及同源物之特徵可在於能夠執行參考蛋白質所執行之功能。

在一些實施例中，CD30係來自哺乳動物(例如靈長類動物(恆河猴、獼猴或人類)及/或嚙齒動物(例如大鼠或鼠類)) CD30。在較佳實施例中，CD30為人類CD30。同功異型物、片段、變異體或同源物可視情況表徵為與來自給定物種(例如人類)之未成熟或成熟CD30同功異型物之胺基酸序列具有至少70%、較佳80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之一者之胺基酸序列一致性。CD30之片段之最小長度可為10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或590個胺基酸中之一者且最大長度可為10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或595個胺基酸中之一者。

在一些實施例中，CD30包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:1、2或3具有至少70%、較佳80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之一者之胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，CD30包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:5具有至少70%、較佳80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之一者之胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，CD30之片段包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:5或19具有至少70%、較佳80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之一者之胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

本發明係關於CD30相關癌症之治療。

如本文所使用，「癌症」可指任何不合需要之細胞增殖(或任何本身藉由不合需要之細胞增殖表現之疾病)、贅瘤或腫瘤。癌症可為良性或惡性的，且可為原發性或繼發性(轉移性)的。贅瘤或腫瘤可為細胞之任何異常生長或增殖，且可位於任何組織中。癌症可為來源於例如腎上腺、腎上腺髓質、肛門、闌尾、膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳房、盲腸、中樞神經系統(包括或不包括腦)小腦、子宮頸、結腸、十二指腸、子宮內膜、上皮細胞(例如腎上皮)、膽囊、食管、膠細胞、心臟、回腸、空腸、腎、淚腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴結、淋巴母細胞、上頜骨、縱隔、腸系膜、子宮肌層、鼻咽、腸網膜、口腔、卵巢、胰臟、腮腺、周邊神經系統、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙狀結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、舌、扁桃體、氣管、子宮、外陰及/或白血球之組織/細胞之癌症。

在一些實施例中，癌症為病理學上涉及CD30之癌症。亦即，在一些實施例中，癌症為由CD30表現引起或加劇之癌症，CD30表現為風險因素之癌症，及/或CD30表現與癌症之發作、發展、進展、嚴重程度或轉移正相關之癌症。癌症之特徵可在於CD30表現，例如癌症可包含表現CD30之細胞。此類癌症可稱為CD30陽性癌症。

CD30陽性癌症可為包含表現CD30之細胞(例如在細胞表面處表現CD30蛋白之細胞)的癌症。CD30陽性癌症可能會過度表現CD30。CD30之過度表現可藉由偵測CD30之基因或蛋白質表現量來確定，該表現量大於等效非癌細胞/非腫瘤組織之表現量。給定癌症/樣品可藉由熟習此項技術者熟知的技術來評估CD30之基因/蛋白質表現，例如藉由qRT-PCR (用於基因表現)、基於抗體之分析(例如西方墨點法、流式細胞分析技術等，用於蛋白質表現)。

CD30陽性癌症描述於例如van der Weyden等人, Blood Cancer Journal (2017) 7:e603以及Muta及Podack, Immunol Res (2013), 57(1-3):151-8中，二者特此以全文引用之方式併入。CD30亦在經活化之T及B淋巴球上表現，且由各種淋巴贅瘤表現，包括典型霍奇金氏淋巴瘤及退行性大細胞淋巴瘤。對於未分類型周邊T細胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、成人T細胞白血病/淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、結外NK-T細胞淋巴瘤、各種B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(包括彌漫性大B細胞淋巴瘤，尤其EBV陽性彌漫性大B細胞淋巴瘤)及晚期全身性肥胖細胞增多症，亦已顯示CD30之可變表現。CD30表現亦已在包括生殖細胞腫瘤及睾丸胚胎性癌之一些非造血系惡性疾病中觀測到。

跨膜醣蛋白CD30為腫瘤壞死因子受體超家族之成員(Falini等人, Blood (1995) 85(1):1-14)。TNF/TNF-受體(TNF-R)超家族之成員在多個層級協調免疫反應，且CD30在調節正常淋巴細胞之功能或增殖方面發揮作用。CD30原先描述為由單株抗體Ki-1辨識之抗原，單株抗體Ki-1係藉由使小鼠免疫接種HL源性細胞株L428來培養(Muta及Podack, Immunol Res (2013) 57: 151-158)。CD30抗原表現已用於識別霍奇金氏疾病中之ALCL及Reed-Sternberg二氏細胞(Falini等人, Blood (1995) 85(1):1-14)。在CD30於淋巴瘤惡性細胞中廣泛表現之情況下，CD30因此為研發基於抗體之免疫療法及細胞療法二者之潛在目標。重要的是，CD30通常在生理條件下在正常組織上不表現，因此尤其不存在於靜止成熟或前驅B或T細胞上(Younes及Ansell, Semin Hematol (2016) 53: 186-189)。本妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin)係一種靶向CD30之抗體-藥物結合物，其最初經批准用於治療CD30陽性HL (Adcetris® US Package Insert 2018)。本妥昔單抗維多汀試驗之資料支持CD30作為CD30陽性淋巴瘤治療之治療目標，但與其使用相關之毒性受到關注。

霍奇金淋巴瘤(HL)為涉及淋巴結及淋巴系統之不常見惡性疾病。HL之發病率呈雙峰狀，大多數患者在15至30歲之間被診斷出來，隨後在55歲或更老的成年人中出現另一個高峰。在2019年，估計美國將存在8,110個新的病例(3,540個在女性中且4570個在男性中)及1,000例因此疾病所致之死亡(410例女性及590例男性) (American Cancer Society 2019)。根據美國國家癌症研究所SEER資料庫中2012-2016年的病例，美國小兒HL患者之HL發病率如下：1-4歲：0.1；5-9歲：0.3；10-14歲：1.3；15-19歲：3.3/100,000 (SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016])。

世界衛生組織(WHO)分類將HL劃分成2個主要類型：典型霍奇金淋巴瘤(cHL)及結節性淋巴球為主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在西方國家，cHL佔所有HL之95%，NLPHL佔5% (National Comprehensive Cancer Network Guidelines 2019)。

患有晚期疾病之cHL患者的一線化學療法與70%與75%之間的治癒率相關(Karantanos等人, Blood Lymphat Cancer (2017) 7:37-52)。救助化學療法後進行自體幹細胞移植(ASCT)通常用於初級療法後復發的患者。不幸的是，高達50%之cHL患者在ASCT後經歷疾病復發。ASCT後復發患者之中位總存活期為約兩年(Alinari Blood (2016) 127:287-295)。儘管進行了積極的組合化學療法，但仍有10%與40%之間的患者對救助化學療法沒有反應，且沒有隨機的臨床試驗資料支持對無反應者進行ASCT。對於對救助化學療法無反應、ASCT後復發或並非此方法之候選者的患者，預後仍然很嚴重且迫切需要新的治療方法(Keudell British Journal of Haematology (2019) 184:105-112)。

儘管大部分小兒群體(兒童、青少年及青壯年)將經當前可用之療法治癒，但小部分患者可能患有難治性或復發性疾病且需要具有可接受之安全性概況及改良之功效效益的新穎療法(Flerlage等人, Blood (2018) 132: 376-384；Kelly, Blood (2015) 126: 2452-2458；McClain及Kamdar, 在UpToDate 2019中；Moskowitz, ASCO Educational Book (2019) 477-486)。在兒童時期經高劑量化學療法治療之HL患者通常經歷諸如心臟、肺、性腺及內分泌毒性以及二級惡性贅瘤之治療相關長期後遺症(Castellino等人, Blood (2011) 117(6): 1806-1816)。

在一些實施例中，根據本發明之CD30陽性癌症可係選自：血液癌症、實體癌症、造血系惡性疾病、霍奇金氏淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、未分類型周邊T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、NK-T細胞淋巴瘤、結外NK-T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、未分類型彌漫性大B細胞淋巴瘤、EBV陽性B細胞淋巴瘤、EBV陽性彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、晚期全身性肥大細胞增多症、生殖細胞腫瘤及睾丸胚胎性癌。

CD30陽性癌症可為復發性CD30陽性癌症。如本文所使用，「復發性」癌症係指對治療(例如癌症之一線療法)有反應，但隨後例如在緩解期之後重新出現/進展之癌症。舉例而言，復發性癌症可為生長/進展被治療(例如癌症之一線療法)抑制且隨後生長/進展的癌症。

CD30陽性癌症可為難治性CD30陽性癌症。如本文所使用，「難治性」癌症係指對治療(例如癌症之一線療法)沒有反應的癌症。舉例而言，難治性癌症可為生長/進展不受治療(例如癌症之一線療法)抑制的癌症。在一些實施例中，難治性癌症可為接受針對該癌症之治療之個體對治療不呈現部分或完全反應的癌症。

在CD30陽性癌症為退行性大細胞淋巴瘤之實施例中，就用化學療法、本妥昔單抗維多汀或克唑替尼(crizotinib)進行之治療而言，癌症可為復發性或難治性的。

在CD30陽性癌症為未分類型周邊T細胞淋巴瘤之實施例中，就用化學療法或本妥昔單抗維多汀進行之治療而言，癌症可為復發性或難治性的。

在CD30陽性癌症為結外NK-T細胞淋巴瘤之實施例中，就用化學療法(有或無天冬醯胺酶)或本妥昔單抗維多汀進行之治療而言，癌症可為復發性或難治性的。

在CD30陽性癌症為未分類型彌漫性大B細胞淋巴瘤之實施例中，就用化學療法(有或無利妥昔單抗(rituximab))或CD19 CAR-T療法進行之治療而言，癌症可為復發性或難治性的。

在CD30陽性癌症為原發性縱隔B細胞淋巴瘤之實施例中，就用化學療法、免疫檢查點抑制劑(例如PD-1抑制劑)或CD19 CAR-T療法進行之治療而言，癌症可為復發性或難治性的。

EBV 陽性淋巴瘤 / 癌症本發明之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，例如CD30.CAR-EBVST，亦適用於治療EBV陽性(EBV+)淋巴瘤/癌症或EBV相關淋巴瘤/癌症。EBV+淋巴瘤/癌症或EBV相關淋巴瘤/癌症可為CD30陽性的。EBV+淋巴瘤/癌症或EBV相關淋巴瘤/癌症可為CD30陰性的。

因此，本文所揭示之方法、組合物及組合物用途亦可用於治療EBV+淋巴瘤/癌症或EBV相關淋巴瘤/癌症。在一些實施例中，EBV+淋巴瘤/癌症或EBV相關淋巴瘤/癌症為CD30陽性的。在其他實施例中，EBV+淋巴瘤/癌症或EBV相關淋巴瘤/癌症為CD30陰性的。在一些實施例中，EBV+淋巴瘤/癌症為EBV陽性B細胞淋巴瘤或EBV陽性彌漫性大細胞B細胞淋巴瘤。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：CD30陽性癌症、EBV相關癌症、血液癌症、骨髓血液科惡性疾病、造血系惡性疾病、淋巴母細胞性血液科惡性疾病、骨髓發育不良症候群、白血病、T細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、EBV相關淋巴瘤、EBV陽性B細胞淋巴瘤、EBV陽性彌漫性大B細胞淋巴瘤、與X性聯淋巴增生病症相關之EBV陽性淋巴瘤、與HIV感染/AIDS相關之EBV陽性淋巴瘤、口腔絨毛狀白斑病、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、移植後淋巴增生疾病、中樞神經系統淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、ALK陽性退行性T細胞淋巴瘤、ALK陰性退行性T細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、NK-T細胞淋巴瘤、結外NK-T細胞淋巴瘤、胸腺瘤、多發性骨髓瘤、實體癌症、上皮細胞癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌瘤(gastric carcinoma)、胃腺癌、胃腸腺癌、肝癌、肝細胞癌、膽管癌、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、口腔癌、口咽癌(oropharyngeal cancer)、口咽癌(oropharyngeal carcinoma)、口部癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌、大腸直腸癌(colorectal cancer)、大腸直腸癌(colorectal carcinoma)、大腸癌(colon cancer)、大腸癌(colon carcinoma)、子宮頸癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、鱗狀肺細胞癌、膀胱癌、尿道上皮癌、皮膚癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、腎細胞癌(renal cell cancer)、腎細胞癌(renal cell carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、間皮瘤、乳癌、腦癌、神經膠質母細胞瘤、前列腺癌、胰臟癌、肥大細胞增多症、晚期全身性肥大細胞增多症、生殖細胞腫瘤或睾丸胚胎性癌。

CD30 特異性 CARCAR 本發明係關於包含/表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞。

在一些實施例中，CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)表現為免疫細胞上之轉殖基因。

嵌合抗原受體(CAR)為提供抗原結合功能及T細胞活化功能之重組受體分子。CAR結構及工程改造綜述於例如Dotti等人, Immunol Rev (2014) 257(1)中，該文獻特此以全文引用之方式併入。

CAR包含經由跨膜域連接至信號傳導域之抗原結合域。視情況存在之鉸鏈域或間隔子域可在抗原結合域與跨膜域之間提供分離，且可充當可撓性連接子。當由細胞表現時，抗原結合域提供於胞外空間中，且信號傳導域提供於胞內空間中。

抗原結合域介導與CAR對其具有特異性之目標抗原之結合。CAR之抗原結合域可基於對CAR所靶向之抗原具有特異性之抗體的抗原結合區。舉例而言，CAR之抗原結合域可包含特異性結合至目標抗原之抗體之互補決定區(CDR)的胺基酸序列。CAR之抗原結合域可包含以下或由以下組成：特異性結合至目標抗原之抗體之輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列。抗原結合域可以包含抗體之輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列之序列的單鏈可變片段(scFv)形式提供。CAR之抗原結合域可基於其他蛋白質:蛋白質相互作用，諸如配體:受體結合來靶向抗原；例如，已使用基於IL-13之抗原結合域開發靶向IL-13Rα2之CAR (參見例如Kahlon等人2004 Cancer Res 64(24): 9160-9166)。

跨膜域提供於CAR之抗原結合域與信號傳導域之間。跨膜域提供CAR向表現CAR之細胞之細胞膜之錨定，其中抗原結合域係在胞外空間中且信號傳導域係在細胞內部。CAR之跨膜域可來源於細胞膜結合蛋白(例如CD28、CD8等)之跨膜區序列。

在本說明書通篇，『來源於』參考多肽/域/胺基酸序列之多肽、域及胺基酸序列與參考多肽/域/胺基酸序列之胺基酸序列具有至少60%、較佳70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之一者之胺基酸序列一致性。『來源於』參考多肽/域/胺基酸序列之多肽、域及胺基酸序列較佳保留參考多肽/域/胺基酸序列之功能及/或結構特性。

藉助於說明，來源於CD28之胞內域的胺基酸序列可包含與例如SEQ ID NO:26中所示之CD28之胞內域具有60%、較佳70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。此外，來源於CD28之胞內域的胺基酸序列較佳保留SEQ ID NO:26之胺基酸序列的功能特性，亦即活化CD28介導之信號傳導的能力。

給定多肽或其域之胺基酸序列可自熟習此項技術者已知之資料庫檢索，或由自熟習此項技術者已知之資料庫檢索之核酸序列決定。該等資料庫包括GenBank、EMBL及UniProt。

信號傳導域包含免疫細胞功能活化所需之胺基酸序列。CAR信號傳導域可包含CD3-ζ之胞內域的胺基酸序列，其為表現CAR之細胞之磷酸化及活化提供基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。包含其他含ITAM蛋白之序列的信號傳導域亦已用於CAR中，諸如包含FcγRI之含ITAM區的域(Haynes等人, 2001 J Immunol 166(1):182-187)。包含來源於CD3-ζ之胞內域之信號傳導域的CAR常常被稱為第一代CAR。

CAR之信號傳導域通常亦包含共刺激蛋白(例如CD28、4-1BB等)之信號傳導域以提供增強免疫細胞活化及效應功能所需之共刺激信號。具有包括額外共刺激序列之信號傳導域的CAR通常被稱為第二代CAR。在一些情況下，CAR經工程改造以提供不同胞內信號傳導路徑之共刺激。舉例而言，CD28共刺激優先活化磷脂醯肌醇3-激酶(P13K)路徑，而4-1BB共刺激觸發信號傳導係經由TNF受體相關因子(TRAF)轉接蛋白。因此，CAR之信號傳導域有時含有來源於多於一種共刺激分子之信號傳導域的共刺激序列。包含具有多個共刺激序列之信號傳導域的CAR通常被稱為第三代CAR。

視情況存在之鉸鏈區或間隔子區可在抗原結合域與跨膜域之間提供分離，且可充當可撓性連接子。此類區可為或包含可例如來源於IgG之CH1-CH2鉸鏈區的允許結合部分在不同方向定向之可撓性域。

經由工程改造以表現對特定目標抗原具有特異性之CAR，免疫細胞(通常為T細胞，以及諸如NK細胞之其他免疫細胞)可經引導以殺死表現目標抗原之細胞。表現CAR之T細胞(CAR-T細胞)與CAR-T細胞對其具有特異性之目標抗原的結合觸發胞內信號傳導且因此觸發T細胞活化。經活化CAR-T細胞經刺激以分裂且產生殺死表現目標抗原之細胞的因子。

CD30特異性CAR 由於cHL顯然對細胞免疫反應(移植物抗淋巴瘤效應)及抗體治療敏感，因此經由產生人工嵌合抗原受體(CAR)來組合兩種方法存在益處。

臨床前研究中之靶向CAR之CD30表明，經工程改造以表現此受體之T淋巴球經重新引導以殺死CD30陽性HL細胞株(Hombach等人Cancer Res. (1998) 58(6):1116-9；Savoldo等人Blood (2007) 110(7):2620-30)。除此之外，檢查潛在中靶毒性之活體外及活體內實驗表明，抗CD30 CAR-T細胞對CD30陽性淋巴瘤細胞表現出特異性細胞毒性，同時避開CD30陽性活化之HSPC及B淋巴球(Hombach等人, Mol Ther (2016) 24: 1423-1434)。

進行作為正在進行的臨床研究之一部分製造的CD30.CAR T細胞之活體外評定(NCT01316146；Ramos等人, J Clin Invest. (2017) 127(9):3462-3471；NCT02917083；Ramos等人, Biol Blood Marrow Transplant 25 (2019) S7-S75, 摘要79)經工程改造之T細胞的起始物質為來自淋巴瘤患者之周邊血液單核細胞。在此公開的研究中，所製造的CD30.CAR T細胞用與最終藥品相同之反轉錄病毒載體轉導。使用IL-2 (11種產品)或IL-7/IL-15 (11種產品)製造總共22批CD30.CAR T細胞。

截至培養第15天，在IL-7/IL-15中生長之CD30.CAR T細胞(分別為45 ± 13及1.2 × 10 ⁹± 5.5 × 10 ⁸)比在IL-2中擴增之彼等細胞(分別為27.4 ± 13及6.5 × 10 ⁸± 3.3 × 10 ⁸)自基線擴增更多且最終細胞數目更高。兩個群組中之CAR表現相當(＞89%)。

CD30.CAR T細胞之特異性活體外細胞毒性在4小時51Cr釋放分析中得到證實，使用效應子與目標之比率為40:1、20:1、10:1及5:1。HDLM-2細胞株用作CD30陽性目標細胞，而CD30陰性Raji腫瘤細胞用作對照(Ctr-T)。測試總共n=9批次在IL-2中培養之細胞，同時測試總共n=8批次在IL-7/IL-15中擴增之細胞。Ramos等人, J Clin Invest. (2017) 127(9):3462-3471之圖2D顯示平均特異性溶解，提供CD30.CAR-T之擬議作用機制的證據，如針對CD30陽性腫瘤細胞之直接、特異性細胞毒性所示。

抗原結合域「抗原結合域」係指能夠結合至目標抗原之域。本發明之CAR的目標抗原為CD30或其片段。根據本發明之抗原結合域可來源於針對CD30之抗體/抗體片段(例如Fv、scFv、Fab、單鏈Fab (scFab)、單域抗體(例如VhH)等)或另一種CD30結合分子(例如目標抗原結合肽或核酸適體、配體或其他分子)。

在一些實施例中，抗原結合域包含能夠與CD30特異性結合之抗體的抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，能夠與目標抗原結合之域包含以下或由以下組成：CD30結合肽/多肽，例如肽適體、硫氧還蛋白、單功能抗體、抗運載蛋白(anticalin)、Kunitz域、高親和性多聚體(avimer)、打結素(knottin)、菲諾體(fynomer)、阿曲體(atrimer)、DARPin、親和抗體、奈米抗體(亦即單域抗體(sdAb))、阿菲林(affilin)、犰狳重複蛋白(ArmRP)、OBody或纖維連接蛋白，綜述於例如Reverdatto等人, Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101中，其特此以全文引用之方式併入(亦參見例如Boersma等人, J Biol Chem (2011) 286:41273-85及Emanuel等人, Mabs (2011) 3:38-48)。

本發明之抗原結合域可來源於能夠與CD30特異性結合之抗體的VH及VL。抗體一般包含六個互補決定區CDR；重鏈可變區(VH)中之三個：HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，以及輕鏈可變區(VL)中之三個：LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。六個CDR共同定義抗體之互補位，其為抗體與目標抗原結合之部分。VH區及VL區在各CDR之任一側包含構架區(FR)，其為CDR提供支架。自N端至C端，VH包含以下結構：N端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C端；且VL包含以下結構：N端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C端。

VH及VL序列可以任何適合型式提供，其限制條件為抗原結合域可連接至CAR之其他域。結合本發明之抗原結合域所考慮的型式包括Carter, Nat. Rev. Immunol 2006, 6: 343-357中所描述之型式，諸如scFv、dsFV、(scFv) ₂雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、Fab、微型抗體及F(ab) ₂型式。

在一些實施例中，抗原結合域包含能夠與CD30結合之抗體/抗體片段的CDR。在一些實施例中，抗原結合域包含能夠與CD30結合之抗體/抗體片段的VH區及VL區。由抗體之VH及VL構成之部分在本文中亦可稱為可變片段(Fv)。VH及VL可提供於同一多肽鏈上，且經由連接子序列連結；此類部分被稱為單鏈可變片段(scFv)。適用於製備scFv之連接子序列為相關技術人員已知的，且可包含絲胺酸及甘胺酸殘基。

在一些實施例中，抗原結合域包含能夠與CD30結合之Fv或由其組成。在一些實施例中，抗原結合域包含能夠與CD30結合之scFv或由其組成。

在一些實施例中，CD30結合域來源於CD30配體。

本發明之CAR的CD30結合域較佳展現與CD30或其片段之特異性結合。本發明之CAR的CD30結合域較佳展現與CD30之胞外域之特異性結合。CD30結合域可來源於抗CD30抗體或其他CD30結合劑，例如CD30結合肽或CD30結合小分子。

CD30結合域可來源於抗CD30抗體之抗原結合部分。

抗CD30抗體包括HRS3及HRS4 (描述於例如Hombach等人, Scand J Immunol (1998) 48(5):497-501中)、HRS3衍生物(描述於Schlapschy等人, Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17(12): 847-860中)、BerH2 (MBL國際目錄號K0145-3，RRID:AB_590975)、SGN-30 (亦稱為cAC10，描述於例如Forero-Torres等人, Br J Haematol (2009) 146:171-9中)、MDX-060 (描述於例如Ansell等人, J Clin Oncol (2007) 25:2764-9中；亦稱為5F11、伊妥木單抗(iratumumab))及MDX-1401 (描述於例如Cardarelli等人, Clin Cancer Res. (2009) 15(10):3376-83中)以及WO 2020/068764 A1、WO 2003/059282 A2、WO 2006/089232 A2、WO 2007/084672 A2、WO 2007/044616 A2、WO 2005/001038 A2、US 2007/166309 A1、US 2007/258987 A1、WO 2004/010957 A2及US 2005/009769 A1中所描述之抗CD30抗體。

在一些實施例中，根據本發明之CD30結合域包含抗CD30抗體之CDR。在一些實施例中，根據本發明之CD30結合域包含抗CD30抗體之VH及VL區。在一些實施例中，根據本發明之CD30結合域包含有包含抗CD30抗體之VH及VL區的scFv。

存在數種不同慣例來定義抗體CDR及FR，諸如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)、Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)中所描述之慣例，及如Retter等人, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (增刊1): D671-D674中所描述之VBASE2。本文所描述之VH區及VL區的CDR及FR係根據VBASE2定義。

在一些實施例中，本發明之抗原結合域包含：併有以下CDR之VH：具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HC-CDR1 具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HC-CDR2 具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HC-CDR3，或其變體，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中之一或多者中之一個或兩個或三個胺基酸經另一胺基酸取代；及併有以下CDR之VL：具有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的LC-CDR1 具有胺基酸序列SAS之LC-CDR2 具有SEQ ID NO:13之胺基酸序列的LC-CDR3，或其變體，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中之一或多者中之一個或兩個或三個胺基酸經另一胺基酸取代。

在一些實施例中，抗原結合域包含：包含以下或由以下組成之VH：與SEQ ID NO:14之胺基酸序列具有至少80%序列一致性(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的胺基酸序列；及包含以下或由以下組成之VL：與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少80%序列一致性(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的胺基酸序列。

在一些實施例中，CD30結合域可包含以下或由以下組成：包含如本文所描述之VH序列及VL序列之單鏈可變片段(scFv)。VH序列與VL序列可共價連接。在一些實施例中，VH及VL序列藉由可撓性連接子序列連接，例如如本文所描述之可撓性連接子序列。可撓性連接子序列可連結至VH序列及VL序列之末端，藉此連接VH與VL序列。在一些實施例中，VH與VL係經由包含以下或由以下組成之連接子序列連結：SEQ ID NO:16或17之胺基酸序列。

在一些實施例中，CD30結合域包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，CD30結合域能夠例如在CD30之胞外域中與CD30結合。在一些實施例中，CD30結合域能夠與CD30之抗原決定基結合，該抗原決定基例如在根據SEQ ID NO:1編號之人類CD30之胺基酸位置185-335的區域內由抗體HRS3結合，該抗原決定基示於SEQ ID NO:19中(Schlapschy等人, Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17(12): 847-860，其特此以全文引用之方式併入)。

在一些實施例中，CD30結合域可包含以下或由以下組成：包含如本文所描述之VH序列及VL序列之單鏈可變片段(scFv)。VH序列與VL序列可共價連接。在一些實施例中，VH及VL序列藉由可撓性連接子序列連接，例如如本文所描述之可撓性連接子序列。可撓性連接子序列可連結至VH序列及VL序列之末端，藉此連接VH與VL序列。在一些實施例中，VH及VL經由包含以下或由以下組成之連接子序列連結：SEQ ID NO:16之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗原結合域(及因此CAR)為多特異性的。「多特異性」意謂抗原結合域展現與超過一個目標之特異性結合。在一些實施例中，抗原結合域為雙特異性抗原結合域。在一些實施例中，抗原結合分子包含至少兩個不同抗原結合部分(亦即至少兩個例如包含不相同VH及VL之抗原結合部分)。多特異性抗原結合域之個別抗原結合部分可例如經由連接子序列連接。

抗原結合域可結合於至少兩種不相同的目標抗原，且因此為至少雙特異性的。術語「雙特異性」意謂抗原結合域能夠特異性結合於至少兩個不同抗原性決定子。多特異性抗原結合域/CAR之目標抗原中之至少一者可為CD30。

應瞭解，根據本發明之抗原結合域(例如多特異性抗原結合域)包含能夠與抗原結合域所特異性針對之目標結合的抗原結合部分。舉例而言，能夠與CD30及除CD30以外之抗原結合之抗原結合域可包含：(i)能夠與CD30結合之抗原結合部分，及(ii)能夠與除CD30以外之目標抗原結合之抗原結合部分。

跨膜域本發明之CAR包含跨膜域。跨膜域係指由胺基酸序列形成之任何三維結構，其在生物膜例如細胞膜中為熱力學上穩定的。結合本發明，跨膜域可為跨越表現CAR之細胞之細胞膜的胺基酸序列。

跨膜域可包含以下或由以下組成：形成疏水性α螺旋或β桶之胺基酸序列。本發明之CAR之跨膜域的胺基酸序列可為或可來源於包含跨膜域之蛋白質的跨膜域之胺基酸序列。跨膜域記錄於諸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白質資訊資源(Protein Information Resource)、蛋白質資料庫(Protein Data Bank)、Ensembl及InterPro之資料庫中，及/或可例如使用諸如TMHMM (Krogh等人, 2001 J Mol Biol 305: 567-580)之胺基酸序列分析工具加以鑑別/預測。

在一些實施例中，本發明之CAR之跨膜域的胺基酸序列可為或可來源於在細胞表面處表現之蛋白質的跨膜域之胺基酸序列。在一些實施例中，在細胞表面處表現之蛋白質為受體或配體，例如免疫受體或配體。在一些實施例中，跨膜域之胺基酸序列可為或可來源於以下中之一者之跨膜域的胺基酸序列：ICOS、ICOSL、CD86、CTLA-4、CD28、CD80、I類MHC α、II類MHC α、II類MHC β、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3-ζ、TCRα、TCRβ、CD4、CD8α、CD8β、CD40、CD40L、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BB、4-1BBL、OX40、OX40L、GITR、GITRL、TIM-3、半乳糖凝集素9、LAG3、CD27、CD70、LIGHT、HVEM、TIM-4、TIM-1、ICAM1、LFA-1、LFA-3、CD2、BTLA、CD160、LILRB4、LILRB2、VTCN1、CD2、CD48、2B4、SLAM、CD30、CD30L、DR3、TL1A、CD226、CD155、CD112及CD276。在一些實施例中，跨膜為或來源於CD28、CD3-ζ、CD8α、CD8β或CD4之跨膜域的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜為或來源於CD28之跨膜域的胺基酸序列。

在一些實施例中，跨膜域包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，跨膜域包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:21之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，跨膜域包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:22之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

信號傳導域本發明之嵌合抗原受體包含信號傳導域。信號傳導域提供用於在表現CAR之細胞中啟動胞內信號傳導的序列。

信號傳導域包含含ITAM序列。含ITAM序列包含一或多個基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。ITAM包含胺基酸序列YXXL/I，其中「X」表示任何胺基酸。在含ITAM蛋白質中，序列YXXL/I通常由6至8個胺基酸分離；YXXL/I(X)6-8YXXL/I。當藉由酪胺酸激酶將磷酸酯基添加至ITAM之酪胺酸殘基中時，信號傳導級聯在細胞內啟動。

在一些實施例中，信號傳導域包含胺基酸序列YXXL/I或YXXL/I(X)6-8YXXL/I之一或多個複本。在一些實施例中，信號傳導域包含胺基酸序列YXXL/I之至少1、2、3、4、5或6個複本。在一些實施例中，信號傳導域包含胺基酸序列YXXL/I(X)6-8YXXL/I之至少1、2或3個複本。

在一些實施例中，信號傳導域包含作為或來源於具有含ITAM胺基酸序列之蛋白質之含ITAM序列之胺基酸序列的胺基酸序列。在一些實施例中，信號傳導域包含作為或來源於CD3-ζ、FcγRI、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD79α、CD79β、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIV或DAP12中之一者之胞內域之胺基酸序列的胺基酸序列。在一些實施例中，信號傳導域包含作為或來源於CD3-ζ之胞內域的胺基酸序列。

在一些實施例中，信號傳導域包含有包含以下或由以下組成之胺基酸序列：與SEQ ID NO:25之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

信號傳導域可另外包含一或多個共刺激序列。共刺激序列為向本發明之表現CAR之細胞提供共刺激之胺基酸序列。共刺激促進表現CAR之細胞在結合至目標抗原時之增殖及存活，且亦可促進藉由表現CAR之細胞進行之細胞介素產生、分化、細胞毒性功能及記憶形成。T細胞共刺激之分子機制綜述於Chen及Flies, 2013 Nat Rev Immunol 13(4):227-242中。

共刺激序列可為或可來源於共刺激蛋白之胺基酸序列。在一些實施例中，共刺激序列為作為或來源於共刺激蛋白之胞內域之胺基酸序列的胺基酸序列。

在CAR與目標抗原結合後，共刺激序列向表現CAR之細胞提供共刺激，該種共刺激為衍生該共刺激序列之共刺激蛋白在由其同源配體連接後將提供的共刺激。舉例而言，在CAR包含有包含來源於CD28之共刺激序列之信號傳導域的情況下，與目標抗原之結合在表現CAR之細胞中觸發信號傳導，該種信號傳導為CD80及/或CD86與CD28之結合將觸發的信號傳導。因此，共刺激序列能夠遞送衍生該共刺激序列之共刺激蛋白的共刺激信號。

在一些實施例中，共刺激蛋白可為B7-CD28超家族之成員(例如CD28、ICOS)或TNF受體超家族之成員(例如4-1BB、OX40、CD27、DR3、GITR、CD30、HVEM)。在一些實施例中，共刺激序列為或來源於CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40、HVEM、CD2、SLAM、TIM-1、CD30、GITR、DR3、CD226及LIGHT中之一者之胞內域。在一些實施例中，共刺激序列為或來源於CD28之胞內域。

在一些實施例中，信號傳導域包含超過一個非重疊共刺激序列。在一些實施例中，信號傳導域包含1、2、3、4、5或6個共刺激序列。多個共刺激序列可以串聯方式提供。

給定胺基酸序列是否能夠啟動由給定共刺激蛋白介導之信號傳導可例如藉由分析由該共刺激蛋白介導之信號傳導的關聯(例如表現/活性由於由該共刺激蛋白介導之信號傳導而經上調或下調之因子的表現/活性)來加以研究。

共刺激蛋白經由數個轉導路徑上調促進細胞生長、效應功能及存活之基因的表現。舉例而言，CD28及ICOS經由磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)及AKT進行信號傳導，以經由NF-κB、mTOR、NFAT及AP1/2上調促進細胞生長、效應功能及存活之基因的表現。CD28亦經由CDC42/RAC1活化AP1/2且經由RAS活化ERK1/2，且ICOS活化C-MAF。4-1BB、OX40及CD27募集TNF受體相關因子(TRAF)且經由MAPK路徑以及經由PI3K進行信號傳導。

在一些實施例中，信號傳導域包含作為或來源於CD28之共刺激序列。

在一些實施例中，信號傳導域包含有包含以下或由以下組成之共刺激序列：與SEQ ID NO:26之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

Kofler等人Mol. Ther. (2011) 19: 760-767描述一種變異CD28胞內域，其中lck激酶結合位點經突變以減少對CAR連接時IL-2產生之誘導，以便使調節性T細胞介導之對CAR-T細胞活性之抑制降至最低。變異CD28胞內域之胺基酸序列示於SEQ ID NO: 27中。

在一些實施例中，信號傳導域包含有包含以下或由以下組成之共刺激序列：與SEQ ID NO:27之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，信號傳導域包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

鉸鏈區 CAR可進一步包含鉸鏈區。鉸鏈區可提供於抗原結合域與跨膜域之間。鉸鏈區亦可稱為間隔子區。鉸鏈區為提供CAR之抗原結合域與跨膜域之可撓性鍵聯的胺基酸序列。

鉸鏈區之存在、不存在及長度已被證明會影響CAR功能(綜述於例如Dotti等人, Immunol Rev (2014) 257(1)中，同前文獻)。

在一些實施例中，CAR包含有包含以下或由以下組成之鉸鏈區：作為或來源於人類IgG1之CH1-CH2鉸鏈區的胺基酸序列；來源於CD8α之鉸鏈區，例如如WO 2012/031744 A1中所描述；或來源於CD28之鉸鏈區，例如如WO 2011/041093 A1中所描述。在一些實施例中，CAR包含來源於人類IgG1之CH1-CH2鉸鏈區的鉸鏈區。

在一些實施例中，鉸鏈區包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:29或30之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，CAR包含有包含以下或由以下組成之鉸鏈區：作為或來源於人類IgG1之CH2-CH3區(亦即Fc區)的胺基酸序列。

在一些實施例中，鉸鏈區包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:31之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

Hombach等人, Gene Therapy (2010) 17:1206-1213描述用於減少諸如單核球及NK細胞之表現FcγR之細胞之活化的變異CH2-CH3區。變異CH2-CH3區之胺基酸序列示於SEQ ID NO:32中。

在一些實施例中，鉸鏈區包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:32之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，鉸鏈區包含以下或由以下組成：作為或來源於人類IgG1之CH1-CH2鉸鏈區的胺基酸序列及作為或來源於人類IgG1之CH2-CH3區(亦即Fc區)的胺基酸序列。

在一些實施例中，鉸鏈區包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:33之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

額外序列 CAR可另外包含信號肽(亦稱為前導序列或信號序列)。信號肽通常由5至30個疏水性胺基酸之序列組成，其形成單一α螺旋。分泌蛋白及在細胞表面處表現之蛋白質通常包含信號肽。用於許多蛋白質之信號肽為已知的，且記錄於諸如GenBank、UniProt及Ensembl之資料庫中，及/或可例如使用諸如SignalP (Petersen等人, 2011 Nature Methods 8: 785-786)或Signal-BLAST (Frank及Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)之胺基酸序列分析工具加以鑑別/預測。

信號肽可存在於CAR之N端處，且可存在於新合成之CAR中。信號肽提供CAR向細胞表面之有效運輸。信號肽係藉由裂解來移除，且因此不包含於由細胞表面表現之成熟CAR中。

在一些實施例中，信號肽包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:34之胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，CAR在不同域(亦即抗原結合域、鉸鏈區、跨膜域、信號傳導域)之間包含一或多個連接子序列。在一些實施例中，CAR在域之子序列之間(例如在抗原結合域之VH與VL之間)包含一或多個連接子序列。

連接子序列為熟習此項技術者已知的，且描述於例如Chen等人, Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369中，其特此以全文引用之方式併入。在一些實施例中，連接子序列可為可撓性連接子序列。可撓性連接子序列允許由連接子序列連接之胺基酸序列的相對移動。可撓性連接子為熟習此項技術者已知的，且Chen等人, Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369中鑑別若干連接子。可撓性連接子序列通常包含高比例的甘胺酸及/或絲胺酸殘基。在一些實施例中，連接子序列包含至少一個甘胺酸殘基及/或至少一個絲胺酸殘基。在一些實施例中，連接子序列由甘胺酸及絲胺酸殘基組成。在一些實施例中，連接子序列之長度為1至2、1至3、1至4、1至5、1至10、1至20、1至30、1至40或1至50個胺基酸。

在一些實施例中，連接子序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之1、2、3、4或5個串聯複本。

CAR可另外包含其他胺基酸或胺基酸序列。舉例而言，抗原結合分子及多肽可包含一或多個胺基酸序列以促進表現、摺疊、運輸、加工、純化或偵測。舉例而言，CAR可視情況在N端或C端包含編碼His (例如6×His (SEQ ID NO:37))、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素標籤之序列。在一些實施例中，CAR包含可偵測部分，例如螢光、發光、免疫可偵測、放射、化學、核酸或酶標記。

特定例示性CAR 在本發明之一些實施例中，CAR包含以下或由以下組成：抗CD30 HRS3 scFv域之胞外部分，其連接至來源於人類IgG1之CH2-CH3之間隔子域及鉸鏈域、CD28之跨膜域及胞內域以及CD3ζ之胞內域。

在本發明之一些實施例中，CAR包含以下或由以下組成：抗原結合域，其包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列；鉸鏈區，其包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:33之胺基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列；跨膜域，其包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列；及信號傳導域，其包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在本發明之一些實施例中，CAR包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:35或36之胺基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，CAR係選自以下中所描述之CD30特異性CAR之實施例：Hombach等人Cancer Res. (1998) 58(6):1116-9；Hombach等人Gene Therapy (2000) 7:1067-1075；Hombach等人J Immunother. (1999) 22(6):473-80；Hombach等人Cancer Res. (2001) 61:1976-1982；Hombach等人J Immunol (2001) 167:6123-6131；Savoldo等人Blood (2007) 110(7):2620-30；Koehler等人Cancer Res. (2007) 67(5):2265-2273；Di Stasi等人Blood (2009) 113(25):6392-402；Hombach等人Gene Therapy (2010) 17:1206-1213；Chmielewski等人Gene Therapy (2011) 18:62-72；Kofler等人Mol. Ther. (2011) 19(4):760-767；Gilham、Abken及Pule. Trends in Mol. Med. (2012) 18(7):377-384；Chmielewski等人Gene Therapy (2013) 20:177-186；Hombach等人Mol. Ther. (2016) 24(8):1423-1434；Ramos等人J. Clin. Invest. (2017) 127(9):3462-3471；WO 2015/028444 A1或WO 2016/008973 A1，以上所有皆特此以全文引用之方式併入。

表現 CD30 特異性 CAR 之 T 細胞本發明之態樣係關於包含/表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞，尤其表現CD30特異性CAR之T細胞。

應瞭解，當細胞在本文中以單數(亦即「一/該細胞」)提及時，亦考慮此類細胞之複數/群體。

表現CAR之T細胞可表現或包含根據本發明之CAR。表現CAR之T細胞可包含或表現編碼根據本發明之CAR的核酸。應瞭解，表現CAR之細胞包含其所表現之CAR。亦應瞭解，表現編碼CAR之核酸的細胞亦表現且包含由核酸編碼之CAR。

T細胞可表現例如CD3多肽(例如CD3γ、CD3ε、CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些實施例中，T細胞為CD3+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD3+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD3+、CD8+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為T輔助細胞(TH細胞))。在一些實施例中，T細胞為細胞毒性T細胞(例如細胞毒性T淋巴球(CTL))。

產生表現 CAR 之病毒特異性免疫細胞產生表現CAR之T細胞的方法為相關技術人員所熟知。其一般涉及修飾T細胞以表現/包含CAR，例如將編碼CAR之核酸引入至T細胞中。

T細胞可根據相關技術人員熟知之方法經修飾以包含/表現本文所描述之CAR或編碼CAR之核酸。該等方法一般包含用於永久(穩定)或短暫表現經轉移核酸之核酸轉移。

可使用任何適合的基因工程改造平台來修飾根據本發明之細胞。適用於修飾細胞之方法包括使用諸如γ反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、DNA轉染、基於轉位子之基因遞送及RNA轉染之基因工程改造平台，例如如Maus等人, Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225中所描述，該文獻特此以全文引用之方式併入。

方法亦包括描述於例如Wang及Rivière Mol Ther Oncolytics. (2016) 3:16015中之方法，該文獻特此以全文引用之方式併入。適用於將核酸/載體引入細胞中之方法包括轉導、轉染及電穿孔。

活體外/離體產生/擴增表現CAR之T細胞群體的方法為相關技術人員所熟知。適合的培養條件(亦即細胞培養基、添加劑、刺激、溫度、氣體氛圍)、細胞數目、培養時段及將編碼CAR之核酸引入細胞中之方法等可藉由參考例如Hombach等人J Immunol (2001) 167:6123-6131、Ramos等人J. Clin. Invest. (2017) 127(9):3462-3471及WO 2015/028444 A1來確定，該等文獻皆特此以全文引用之方式併入。

適宜地，根據本發明之細胞培養物可維持在37℃下含有5% CO ₂之潮濕氛圍中。細胞培養物之細胞可以依可由相關技術人員容易確定之任何合適密度建立及/或維持。

可在適用於培養物體積之任何容器中，例如在細胞培養盤之孔、細胞培養燒瓶、生物反應器等中進行培養。在一些實施例中，細胞在生物反應器中，例如Somerville及Dudley, Oncoimmunology (2012) 1(8):1435-1437中所描述之生物反應器中培養，該文獻特此以全文引用之方式併入。在一些實施例中，細胞在GRex細胞培養容器中，例如GRex燒瓶或GRex 100生物反應器中培養。

該等方法可包含在提供適當共刺激及信號放大之條件下，在呈現病毒抗原肽:MHC複合物之抗原呈現細胞(APC)存在下培養包含具有抗原特異性受體(TCR)之細胞的免疫細胞群體(例如免疫細胞(例如周邊血液單核細胞；PBMC)異質群體)。APC可能會感染編碼病毒抗原/肽之病毒，或可包含/表現病毒抗原/肽，且在MHC分子之情形下呈現病毒抗原肽。刺激引起T細胞活化，且促進細胞分裂(增殖)，從而造成產生及/或擴增對病毒抗原具有特異性之T細胞群體。T細胞活化方法為相關技術人員所熟知，且詳細描述於例如Immunobiology, 第5版 Janeway CA Jr、Travers P、Walport M等人 New York: Garland Science (2001), 第8章中，該文獻以全文引用之方式併入。

與刺激前之細胞群體相比，在刺激之後獲得的細胞群體富集對病毒具有特異性之T細胞(亦即，病毒特異性T細胞存在於刺激後之群體中之頻率增加)。以此方式，對病毒具有特異性之T細胞群體由具有不同特異性之T細胞異質群體擴增/產生。對病毒具有特異性之T細胞群體可藉由刺激及後繼細胞分裂由單一T細胞產生。對病毒具有特異性之現有T細胞群體可藉由病毒特異性T細胞群體之細胞的刺激及後繼細胞分裂來擴增。

T細胞可在引入編碼CAR之核酸之前活化。舉例而言，PBMC群體內之T細胞可藉由在IL-7及IL-15存在下用呈現特定抗原之肽進行活體外刺激而特異性活化。

將核酸/載體引入細胞中可包含轉導，例如反轉錄病毒轉導。因此，在一些實施例中，核酸包含於病毒載體中，或載體為病毒載體。用病毒載體轉導免疫細胞描述於例如Simmons及Alberola-Ila, Methods Mol Biol. (2016) 1323:99-108中，其特此以全文引用之方式併入。

藥劑可用於提高轉導效率。溴化己二甲銨(凝聚胺)為一種陽離子聚合物，其常用於經由中和病毒粒子與細胞表面上表現之唾液酸殘基之間的電荷排斥來改良轉導。其他常用於增強轉導之試劑包括例如基於泊洛沙姆(poloxamer)之試劑，諸如LentiBOOST (Sirion Biotech)、重組人纖維連接蛋白(Retronectin) (Takara)、載體融合素(Vectofusin) (Miltenyi Biotech)以及SureENTRY (Qiagen)及ViraDuctin (Cell Biolabs)。

在一些實施例中，該等方法包含在包含有包含核酸之病毒載體的細胞培養基存在下離心需要引入編碼CAR之核酸的細胞(在此項技術中稱為『旋轉感染(spinfection)』)。

在一些實施例中，該等方法包含藉由電穿孔引入根據本發明之核酸或載體，例如如Koh等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids (2013) 2, e114中所描述，其特此以全文引用之方式併入。

該等方法一般包含將編碼CAR之核酸引入細胞中，及在適合於藉由細胞表現核酸/CAR之條件下培養細胞。在一些實施例中，該等方法包含培養已引入編碼CAR之核酸的T細胞以便擴增其數目。在一些實施例中，該等方法包含在IL-7及/或IL-15 (例如重組IL-7及/或IL-15)存在下培養已引入編碼CAR之核酸的T細胞。

在一些實施例中，該等方法進一步包含例如自其他細胞(例如不表現CAR之細胞)純化/分離表現CAR之T細胞。用於自異質細胞群體純化/分離免疫細胞之方法為此項技術中熟知的，且可採用例如基於FACS或MACS之方法以基於免疫細胞標記物之表現來分選細胞群體。在一些實施例中，該等方法純化/分離特定類型之細胞，例如表現CAR之CD8+ T細胞、表現CAR之CTL。

在較佳實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞可藉由包含以下之方法由PBMC群體內之T細胞產生：用肽刺激PBMC，用編碼CD30特異性CAR之病毒載體(例如γ-反轉錄病毒載體)轉導細胞，且隨後在IL-7及IL-15存在下培養細胞。

或者，在一些實施例中，使用促效性CD3及CD28抗體來活化PBMC。

根據本發明之表現CD30特異性CAR之T細胞可回應於CD30或回應於包含/表現CD30之細胞而呈現T細胞之某些功能特性。在一些實施例中，該等特性為與例如細胞毒性T細胞之效應T細胞相關之功能特性。

在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞可顯示以下特性中之一或多者：對包含/表現CD30之細胞的細胞毒性；回應於CD30刺激或回應於暴露於包含/表現CD30之細胞的增殖、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔蛋白表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現及/或FAS配體(FASL)表現；針對包含表現CD30之細胞的癌症之抗癌活性(例如對癌細胞之細胞毒性、腫瘤生長抑制、減少轉移等)。

可藉由在一段時間內分析細胞分裂或細胞數目來研究細胞增殖/群體擴增。細胞分裂可例如藉由活體外分析3H-胸苷之併入或藉由CFSE稀釋分析來分析，例如如Fulcher及Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564中所描述，其特此以全文引用之方式併入。增殖性細胞亦可藉由適當分析來分析5-乙炔基-2'-去氧尿苷(EdU)之併入來鑑別，如例如Buck等人, Biotechniques. 2008年6月; 44(7):927-9以及Sali及Mitchison, PNAS USA 2008年2月19日; 105(7): 2415-2420中所描述，兩者特此以全文引用之方式併入。

如本文所使用，「表現」可為基因表現或蛋白質表現。基因表現涵蓋DNA轉錄成RNA，且可藉由熟習此項技術者已知之各種手段量測，例如藉由定量即時PCR (qRT-PCR)或藉由基於報導子之方法量測mRNA水準。類似地，蛋白質表現可藉由此項技術中熟知之各種方法量測，例如藉由基於抗體之方法，例如藉由西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞分析技術、ELISA、ELISPOT或基於報導子之方法。

細胞毒性及細胞殺死可例如使用Zaritskaya等人, Expert Rev Vaccines (2011), 9(6):601-616中綜述之任何方法來研究，該文獻特此以全文引用之方式併入。細胞毒性活體外分析/細胞殺死分析之實例包括諸如51Cr釋放分析、乳酸去氫酶(LDH)釋放分析、溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)釋放分析及鈣黃綠素-乙醯氧基甲基(鈣黃綠素-AM)釋放分析之釋放分析。此等分析基於自溶解細胞釋放之因子之偵測來量測細胞殺死。給定細胞類型進行之細胞殺死可例如藉由共培養測試細胞與給定細胞類型且量測合適時段之後活細胞/死測試細胞之數目/比例來加以分析。

細胞可藉由在適當的活體外分析或相關癌症之活體內模型中進行分析來評估抗癌活性。

本發明之態樣及實施例尤其係關於EBV特異性免疫細胞。因此，在一些實施例中，病毒可為EBV，且病毒抗原可為EBV抗原。用於產生/擴增EBV特異性免疫細胞群體之方法描述於例如WO 2013/088114 A1；Lapteva及Vera, Stem Cells Int. (2011): 434392；Straathof等人, Blood (2005) 105(5): 1898-1904；WO 2017/202478 A1；WO 2018/052947 A1；及WO 2020/214479 A1中，以上所有皆特此以全文引用之方式併入。

該等方法涉及以下步驟：藉由呈現T細胞受體(TCR)所特異性針對之EBV抗原肽:MHC複合物的APC來刺激包含對該EBV抗原肽:MHC複合物具有特異性之TCR的T細胞。APC感染編碼EBV抗原/肽之病毒，或包含/表現EBV抗原/肽，且在MHC分子之情形下呈現EBV抗原肽。刺激引起T細胞活化，且促進細胞分裂(增殖)，從而引起對EBV抗原具有特異性之T細胞群體之產生及/或擴增。

該等方法通常包含藉由使免疫細胞群體與對應於EBV抗原之肽或呈現對應於病毒抗原之肽的APC接觸來刺激對病毒/病毒抗原具有特異性之免疫細胞。該等方法步驟可在本文中稱為「刺激」或「刺激步驟」。該等方法步驟通常涉及將細胞活體外/離體維持在培養物中，且可稱為「刺激培養」。

在一些實施例中，該等方法包含一或多個額外刺激步驟。亦即，在一些實施例中，該等方法包含一或多個其他再刺激藉由刺激步驟獲得之細胞的步驟。此類其他刺激步驟可在本文中稱為「再刺激」或「再刺激步驟」。此類方法步驟通常涉及活體外/離體擴增培養物中之細胞，且可稱為「再刺激培養」。

應瞭解，使PBMC (用於刺激)或藉由本文所描述之刺激步驟獲得之細胞群體(用於再刺激)與對應於病毒抗原之肽「接觸」一般涉及在包含該(等)肽之細胞培養基中活體外/離體培養PBMC/細胞群體。類似地，應瞭解，使PBMC/細胞群體與呈現對應於病毒抗原之肽的APC「接觸」一般涉及在細胞培養基中活體外/離體共培養APC與PBMC/細胞群體。

在一些實施例中，該等方法包含使PBMC與對應於病毒抗原(例如EBV抗原)之肽接觸。在此類實施例中，PBMC群體內之APC (例如單核球、樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞)內化(例如藉由吞噬作用、胞飲作用)、加工抗原且在I類MHC分子(交叉呈現)及/或II類MHC分子上呈現抗原以用於PBMC群體內之CD8+ T細胞及/或CD4+ T細胞的後續活化。

「對應於」參考抗原之肽包含以下或由以下組成：參考抗原之胺基酸序列。舉例而言，「對應於」EBV之EBNA1的肽包含以下或由以下組成：存在於EBNA1之胺基酸序列內之胺基酸序列(亦即為EBNA1之胺基酸序列之子序列)。本文所採用之肽之長度通常為5至30個胺基酸，例如5至25個胺基酸、10至20個胺基酸或12至18個胺基酸中之一者。在一些實施例中，肽之長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個中之一者之胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為約15個胺基酸。如本文所使用之「肽」可指包含非相同肽之群體。

在一些實施例中，該等方法採用對應於超過一種抗原之肽。在此類實施例中，存在至少一種對應於抗原中之各者的肽。舉例而言，在該等方法採用對應於EBNA1及LMP1之肽的情況下，肽包含至少一種對應於EBNA1之肽及至少一種對應於LMP1之肽。在較佳實施例中，肽之長度為15個胺基酸，有11個胺基酸重疊，且跨越所關注EBV抗原之整個蛋白質序列。在一些實施例中，EBV抗原包括EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BNLF2a、BNLF2b、BMRF2及BALF2。

在一些實施例中，該等方法採用對應於全部或部分參考抗原之肽。對應於全部給定抗原之肽涵蓋抗原之全長胺基酸序列。換言之，肽一起含有給定抗原之胺基酸序列之全部胺基酸。對應於部分給定抗原之肽涵蓋抗原之部分胺基酸序列。在一些實施例中，在肽涵蓋抗原之部分胺基酸序列的情況下，肽一起可涵蓋抗原之例如多於10%，例如多於15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%中之一者之胺基酸序列。

在一些實施例中，該等方法採用重疊肽。「重疊」肽具有共同的胺基酸，且更通常具有共同的胺基酸序列。藉助於說明，第一肽係由對應於EBNA1之胺基酸序列之位置1至15的胺基酸序列組成，且第二肽係由對應於EBNA1之胺基酸序列之位置5至20的胺基酸序列組成。第一肽及第二肽為對應於EBNA1之重疊肽，其有11個胺基酸重疊。在一些實施例中，重疊肽有1至20、5至20、8至15或10至12個中之一者之胺基酸重疊。在一些實施例中，重疊肽有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個中之一者之胺基酸重疊。在一些實施例中，重疊肽有11個胺基酸重疊。

在一些實施例中，該等方法採用長度為8至30個胺基酸、有1至20個胺基酸重疊、對應於全部或部分給定參考抗原之肽。

在一些實施例中，該等方法採用長度為15個胺基酸、有11個胺基酸重疊、對應於全部給定參考抗原之肽。此類肽之混合物在本文中可稱為給定抗原之「肽合物(pepmix)肽池」或「肽合物」。舉例而言，實例1中所使用之「EBNA1肽合物」在本文中係指一組158個有11個胺基酸重疊、跨越如UniProt: P03211-1, v1中所示之EBNA1之全長胺基酸序列的15聚體肽。

在根據本發明之各個態樣之一些實施例中，「對應於」給定病毒抗原之「肽」可為該抗原之肽合物。

在特定實施例中，該等方法採用對應於一或多種EBV抗原之肽。

在特定實施例中，該等方法採用一或多種EBV抗原之肽合物。在一些實施例中，一或多種EBV抗原係選自：EBV潛伏抗原，例如III型潛伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B或EBNA3C)、II型潛伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B或BARF1)或I型潛伏抗原(例如EBNA1或BARF1)；EBV溶解抗原，例如立即早期溶解抗原(例如BZLF1、BRLF1或BMRF1)、早期溶解抗原(例如BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU或EBNA1-FUK)及晚期溶解抗原(例如BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3或gp350)。

在根據本發明之各個態樣的一些實施例中，一或多種EBV抗原為或包含選自以下之EBV溶解抗原：BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5及BDLF3。在一些實施例中，一或多種EBV抗原為或包含選自以下之EBV溶解抗原：BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2及BDLF3。

在一些實施例中，一或多種EBV抗原為或包含選自以下之EBV潛伏抗原：EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A及LMP2B。在一些實施例中，一或多種EBV抗原為或包含選自以下之EBV潛伏抗原：EBNA1、LMP1、LMP2A及LMP2B。

在一些實施例中，一或多種EBV抗原係選自：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A及BNLF2B。

在一些實施例中，該等方法採用對應於EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A及BNLF2B之肽。在一些實施例中，該等方法採用EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A及BNLF2B之肽合物。

在一些實施例中，該等方法包含使PBMC (例如耗竭CD45RA陽性細胞之PBMC)與對應於EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A及BNLF2B之肽接觸。在一些實施例中，該等方法包含使PBMC (例如耗竭CD45RA陽性細胞之PBMC)與EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A及BNLF2B之肽合物接觸。

在一些實施例中，該等方法包含使藉由本文所描述之刺激步驟獲得之細胞群體與對應於病毒抗原之肽接觸。在此類實施例中，細胞群體內之APC (例如樹突狀細胞、巨噬細胞及B細胞)內化(例如藉由吞噬作用、胞飲作用)、加工抗原且在I類MHC分子(交叉呈現)及/或II類MHC分子上呈現抗原以用於細胞群體內之CD8+ T細胞及/或CD4+ T細胞的後續再刺激。

在一些實施例中，該等方法包含使PBMC與呈現對應於病毒抗原之肽的APC接觸。在一些實施例中，該等方法包含使藉由本文所描述之刺激步驟獲得之細胞群體與呈現對應於病毒抗原之肽的APC接觸。

在一些實施例中，該等方法包含使PBMC與EBV-LCL接觸。藉由用EBV-LCL刺激PBMC來產生EBV特異性免疫細胞描述於例如Straathof等人, Blood (2005) 105(5): 1898-1904中，該文獻以引用之方式併入上文。

EBV-LCL可藉由使PBMC感染EBV且在長期培養之後收集永生化感染EBV之細胞來製備，例如如Hui-Yuen等人, J Vis Exp (2011) 57: 3321以及Hussain及Mulherkar, Int J Mol Cell Med (2012) 1(2): 75-87中所描述(兩者均特此以全文引用之方式併入)。EBV特異性T細胞可藉由共培養自來自健康供體之血液樣品分離之PBMC與經照射之自體EBV-LCL來製備。

在刺激及再刺激中之T細胞與APC之共培養係在細胞培養基中進行。細胞培養基可為其中根據本發明之T細胞及APC可活體外/離體維持在培養物中之任何細胞培養基。適用於培養淋巴球之培養基為相關技術人員熟知的，且包括例如RPMI-1640培養基、AIM-V培養基、Iscoves培養基等。

在一些實施例中，細胞培養基可包含RPMI-1640培養基(例如高級RPMI-1640培養基)及/或克里克氏培養基(Click's medium) (亦稱為伊格爾哈姆氏胺基酸(Eagle's Ham's amino acid；EHAA)培養基)。此等培養基之組成為相關技術人員熟知的。RPMI-1640培養基之調配描述於例如Moore等人, JAMA (1967) 199:519-524中，且克里克氏培養基之調配描述於Click等人, Cell Immunol (1972) 3:264-276中。RPMI-1640培養基可獲自例如ThermoFisher Scientific，且克里克氏培養基可獲自例如Sigma-Aldrich (目錄號C5572)。高級RPMI-1640培養基可獲自例如ThermoFisher Scientific (目錄號12633012)。

在一些實施例中，該等方法涉及在包含RPMI-1640培養基及克里克氏培養基之細胞培養基中培養已與對應於病毒抗原(例如EBV抗原)之肽接觸的PBMC，或在呈現對應於病毒抗原之肽的APC存在下培養該等PBMC。在一些實施例中，該等方法涉及在包含RPMI-1640培養基及克里克氏培養基之細胞培養基中培養已與對應於病毒抗原之肽接觸的藉由本文所描述之刺激步驟獲得之細胞群體，或在呈現對應於病毒抗原之肽的APC存在下培養該細胞群體。

在一些實施例中，細胞培養基包含(按體積計) 25-65% RPMI-1640培養基及25-65%克里克氏培養基。在一些實施例中，細胞培養基包含30-60% RPMI-1640培養基及30-60%克里克氏培養基。在一些實施例中，細胞培養基包含35-55% RPMI-1640培養基及35-55%克里克氏培養基。在一些實施例中，細胞培養基包含40-50% RPMI-1640培養基及40-50%克里克氏培養基。在一些實施例中，細胞培養基包含45% RPMI-1640培養基及45%克里克氏培養基。在特定實施例中，細胞培養基包含47.5% RPMI-1640培養基及47.5%克里克氏培養基。

在一些實施例中，細胞培養基可包含一或多種細胞培養基添加劑。細胞培養基添加劑為相關技術人員熟知的，且包括富生長因子添加劑(諸如血清(例如人類血清、胎牛血清(FBS)、人類血小板溶解物、牛血清白蛋白(BSA)))、L-麩醯胺酸、細胞介素/生長因子等。

在一些實施例中，細胞培養基包含(按體積計) 2.5-20% (例如5%)富生長因子添加劑，例如5-20% FBS，例如7.5-15% FBS，或10% FBS。在一些實施例中，細胞培養基包含0.5-5% GlutaMax，例如1% GlutaMax。在一些實施例中，細胞培養基包含0.5-5%青黴素/鏈黴素，例如1%青黴素/鏈黴素。

在特定實施例中，細胞培養基包含人類血小板溶解物。在一些實施例中，細胞培養基包含(按體積計) 1-20% (例如5%)人類血小板溶解物，例如2.5-20%人類血小板溶解物，例如2.5-15%、2.5-10%或5%人類血小板溶解物。人類血小板溶解物可獲自例如Sexton Biotechnologies。

在特定實施例中，細胞培養基包含L-麩醯胺酸。在特定實施例中，細胞培養基包含0.5-10 mM L-麩醯胺酸，例如1-5 mM L-麩醯胺酸，例如2 mM L-麩醯胺酸。

根據本發明之APC可為專業APC。專業APC經特殊化用於向T細胞呈現抗原；其有效地加工且在細胞表面處呈現MHC-肽複合物，且其表現高水準之共刺激分子。專業APC包括樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞及B細胞。非專業APC為能夠向T細胞呈現MHC-肽複合物，尤其向CD8+ T細胞呈現I類MHC-肽複合物的其他細胞。

在一些實施例中，APC為能夠在I類MHC上交叉呈現藉由APC內化(例如藉由胞吞作用/吞噬作用吸收)之抗原的APC。在I類MHC上向CD8+ T細胞交叉呈現內化抗原描述於例如Alloatti等人, Immunological Reviews (2016), 272(1): 97-108中，該文獻特此以全文引用之方式併入。能夠交叉呈現之APC包括例如樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、B細胞及竇內皮細胞。

如本文中所解釋，在一些實施例中，用於刺激對病毒抗原具有特異性之免疫細胞的APC包含於包含對病毒抗原具有特異性之免疫細胞的細胞(例如PBMC)群體內，對病毒抗原具有特異性之細胞群體將自該等對病毒抗原具有特異性之免疫細胞擴增。在此類實施例中，APC可例如為單核球、樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞或細胞群體內能夠向對病毒抗原具有特異性之免疫細胞呈現抗原的任何其他細胞類型。

在一些實施例中，該等方法採用已經修飾以表現/包含病毒抗原/其肽的APC。在一些實施例中，APC可由於已與對應於病毒抗原之肽接觸且使其內化而呈現該(等)肽。在一些實施例中，APC可已經肽「脈衝」，此舉一般涉及將APC在肽存在下活體外培養足以使APC內化肽之時段。

在一些實施例中，APC可由於細胞內編碼抗原之核酸之表現而呈現對應於病毒抗原之肽。APC可由於其已感染病毒(例如在感染EBV之B細胞，例如LCL的情況下)而包含編碼病毒抗原之核酸。APC可由於已例如經由轉染、轉導、電穿孔等將編碼病毒抗原之核酸引入細胞中而包含編碼該(等)抗原之核酸。編碼病毒抗原之核酸可以質體/載體形式提供。

在一些實施例中，APC係選自經活化T細胞(ATC)、樹突狀細胞、B細胞(包括例如LCL)及人工抗原呈現細胞(aAPC)，諸如Neal等人, J Immunol Res Ther (2017) 2(1):68-79以及Turtle及Riddell Cancer J. (2010) 16(4):374-381中所描述之APC。

在一些實施例中，APC相對於將與其共培養以產生/擴增包含對病毒抗原具有特異性之免疫細胞之免疫細胞群體的細胞群體為自體的。亦即，在一些實施例中，APC係來自與獲得將與其共培養之細胞群體之個體相同的個體(或來源於獲自該相同個體之細胞)。

多株經活化T細胞(ATC)作為APC之用途及用於製備ATC之方法描述於例如Ngo等人, J Immunother. (2014) 37(4):193-203中，該文獻以引用之方式併入上文。簡言之，ATC可藉由在IL-2或IL-7及IL-15存在下用促效劑抗CD3抗體及促效劑抗CD28抗體刺激PBMC，藉由活體外非特異性活化T細胞而產生。

樹突狀細胞可根據此項技術中熟知之方法產生，例如如Ngo等人, J Immunother. (2014) 37(4):193-203中所描述。樹突狀細胞可由單核球製備，該等單核球可藉由自PBMC選擇CD14獲得。單核球可在細胞培養基中培養，從而使其分化成未成熟樹突狀細胞，該等未成熟樹突狀細胞可包含例如IL-4及GM-CSF。未成熟樹突狀細胞可藉由在IL-6、IL-1β、TNFα、PGE2、GM-CSF及IL-4存在下進行培養來成熟。

LCL可根據此項技術中熟知之方法產生，例如如Hui-Yuen等人, J Vis Exp (2011) 57: 3321以及Hussain及Mulherkar, Int J Mol Cell Med (2012) 1(2): 75-87中所描述，兩者均特此以全文引用之方式併入。簡言之，LCL可藉由在環孢素A存在下將PBMC與例如B95-8細胞之產生EBV之細胞的濃縮細胞培養物上清液一起培育來產生。

人工共刺激細胞(aCs)包括例如K562cs細胞，其為HLA陰性的且無法呈現抗原，但經工程改造以表現共刺激分子CD80、CD86、CD83及4-1BBL (描述於例如Suhoski等人, Mol Ther. (2007) 15(5):981-8中)。

在一些實施例中，刺激步驟包含使PBMC與對應於病毒抗原之肽接觸。在一些實施例中，再刺激步驟包含使對病毒抗原具有特異性之免疫細胞與呈現對應於病毒抗原之肽的自體APC以及用以提供共刺激之共刺激細胞株接觸。在一些實施例中，再刺激步驟包含使對病毒抗原具有特異性之免疫細胞與呈現對應於病毒抗原之肽的ATC接觸。

在一些實施例中，該等方法進一步採用用於在刺激及/或再刺激中增強共刺激之試劑。此類試劑包括例如表現共刺激分子(例如CD80、CD86、CD83及/或4-1BBL)之細胞，諸如LCL或K562cs細胞。在一些實施例中，表現共刺激分子之細胞為HLA陰性的非EBV複製勝任型LCL，其亦稱為「通用LCL」或「ULCL」。ULCL描述於例如US 2018/0250379 A1中。

用於增強共刺激之試劑之其他實例包括例如對由T細胞表現之共刺激受體(例如4-1BB、CD28、OX40、ICOS等)及能夠活化由T細胞表現之共刺激受體之共刺激分子(例如CD80、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL等)具有特異性的促效劑抗體。此類試劑可例如固定於珠粒上來提供。

在一些實施例中，根據本發明之刺激及/或再刺激採用ULCL。ULCL亦表現CD30以及其他共刺激分子。儘管ULCL表現EBV抗原，但其由於ULCL不表現I類或II類MHC分子而不呈現給T細胞。因此，ULCL適用於經由CD30利用CAR進行之CD30.CAR EBVST刺激以及用於活體外/離體擴增CD30.CAR EBVST之共刺激，而不刺激同種異體反應性T細胞。

在一些實施例中，ULCL用作提供抗原性刺激(例如CD30刺激)之細胞。在一些實施例中，ULCL用作提供共刺激之細胞。在一些實施例中，ULCL用作提供抗原性刺激及共刺激之細胞。在一些實施例中，ULCL經照射(例如在100戈雷下)。

在特定實施例中，本發明之方法包含在ULCL存在下培養對病毒抗原具有特異性之免疫細胞。在特定實施例中，本發明之方法包含再刺激步驟，該再刺激步驟包含在ULCL存在下培養對病毒抗原具有特異性之免疫細胞。在一些實施例中，ULCL (例如經照射之ULCL)可以如下比率與對病毒抗原具有特異性之免疫細胞共培養：對病毒抗原具有特異性之免疫細胞與ULCL之比率在1:1與1:10之間，例如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8中之一者。在一些實施例中，ULCL (例如經照射之ULCL)可以如下比率與對病毒抗原具有特異性之免疫細胞共培養：對病毒抗原具有特異性之免疫細胞與ULCL之比率在1:2與1:5之間，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5中之一者。在一些實施例中，對病毒抗原具有特異性之免疫細胞與ULCL之比率為約1:3。

在特定實施例中，本發明之方法包含在ULCL存在下培養包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞。在特定實施例中，本發明之方法包含再刺激步驟，該再刺激步驟包含在ULCL存在下培養包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞。在一些實施例中，ULCL (例如經照射之ULCL)可以如下比率與包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞共培養：包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞與ULCL之比率在1:1與1:10之間，例如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8中之一者。在一些實施例中，ULCL (例如經照射之ULCL)可以如下比率與包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞共培養：包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞與ULCL之比率在1:2與1:5之間，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5中之一者。在一些實施例中，包含/表現本文所描述之CAR (或包含/表現編碼此類CAR之核酸)之病毒特異性免疫細胞與ULCL之比率為約1:3。

在一些實施例中，再刺激步驟包含在ULCL存在下使對病毒抗原具有特異性之免疫細胞與呈現對應於病毒抗原之肽的ATC接觸。

免疫細胞群體與對應於病毒抗原之肽或呈現對應於病毒抗原之肽的APC之接觸可在一或多種細胞介素存在下進行以促進T細胞活化及增殖。在一些實施例中，刺激係在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2及/或IL-21中之一或多者存在下進行。應瞭解，向培養物中外源地添加細胞介素，且其為培養中之細胞所產生之細胞介素的補充。在一些實施例中，所添加之細胞介素為以重組方式產生之細胞介素。

因此，在一些實施例中，該等方法涉及在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2及/或IL-21中之一或多者存在下培養已與對應於病毒抗原之肽接觸的PBMC，或在呈現對應於病毒抗原之肽的APC存在下培養該等PBMC。

在一些實施例中，培養係在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2及/或IL-21存在下進行。在一些實施例中，培養係在IL-7、IL-15、IL-6及/或IL-12存在下進行。在一些實施例中，培養係在IL-7及/或IL-15存在下進行。

在一些實施例中，培養物中IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml，例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者。在一些實施例中，培養物中IL-7之最終濃度為約10 ng/ml。

在一些實施例中，培養物中IL-15之最終濃度為1-100 ng/ml，例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者。在一些實施例中，培養物中IL-15之最終濃度為約10 ng/ml。在一些實施例中，培養物中IL-15之最終濃度為10-1000 ng/ml，例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者。在一些實施例中，培養物中IL-15之最終濃度為約100 ng/ml。

在一些實施例中，培養物中IL-6之最終濃度為10-1000 ng/ml，例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者。在一些實施例中，培養物中IL-6之最終濃度為約100 ng/ml。

在一些實施例中，培養物中IL-12之最終濃度為1-100 ng/ml，例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者。在一些實施例中，培養物中IL-12之最終濃度為10 ng/ml。

在一些實施例中，IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，且IL-15之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如約10 ng/ml)。

在一些實施例中，IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，且IL-15之最終濃度為10-1000 ng/ml (例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者，例如約100 ng/ml)。

在一些實施例中，IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，IL-6之最終濃度為10-1000 ng/ml (例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者，例如約100 ng/ml)，IL-12之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，且IL-15之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)。

在一些實施例中，刺激培養物中IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，且刺激培養物中IL-15之最終濃度為10-1000 ng/ml (例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者，例如約100 ng/ml)。

在一些實施例中，刺激培養物中IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，刺激培養物中IL-6之最終濃度為10-1000 ng/ml (例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者，例如約100 ng/ml)，刺激培養物中IL-12之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，且刺激培養物中IL-15之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)。

在一些實施例中，再刺激培養物中IL-7之最終濃度為1-100 ng/ml (例如2-50 ng/ml、5-20 ng/ml或7.5-15 ng/ml中之一者，例如10 ng/ml)，且再刺激培養物中IL-15之最終濃度為10-1000 ng/ml (例如20-500 ng/ml、50-200 ng/ml或75-150 ng/ml中之一者，例如約100 ng/ml)。

根據本發明之刺激及再刺激通常涉及將T細胞與APC共培養足以使APC刺激T細胞且使T細胞經歷細胞分裂之時段。

在一些實施例中，該等方法涉及將已與對應於病毒抗原之肽接觸的PBMC培養以下時段，或將PBMC在呈現對應於病毒抗原之肽的APC存在下培養以下時段：至少1小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、4天、5天、6天或至少7天中之一者。在一些實施例中，培養時段為24小時至20天，例如48小時至14天、3天至12天、4天至11天、或6天至10天、或7天至9天中之一者。

在一些實施例中，該等方法涉及將已與對應於病毒抗原之肽接觸的藉由本文所描述之刺激步驟獲得之細胞群體培養以下時段，或將藉由本文所描述之刺激步驟獲得之細胞群體在呈現對應於病毒抗原之肽的APC存在下培養以下時段：至少1小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、4天、5天、6天或至少7天中之一者。在一些實施例中，培養時段為24小時至20天，例如48小時至14天、3天至12天、4天至11天、或6天至10天、或7天至9天中之一者。

刺激及再刺激可藉由將培養物中之細胞與其中已培養細胞之培養基分離或例如藉由添加細胞培養基稀釋培養物來結束。在一些實施例中，該等方法包含在刺激或再刺激培養結束時收集細胞之步驟。在一些實施例中，再刺激步驟可藉由以適合於達成所需百分比/濃度之細胞培養基之量添加細胞培養基(及如本文所描述之任何其他添加劑)、用於再刺激步驟之條件培養基(及任何添加劑)來建立。

在給定刺激或再刺激步驟之培養時段結束時，可收集細胞且將其與細胞培養物上清液分離。細胞可藉由離心來收集，且細胞培養物上清液可與細胞沈澱物分離。隨後，細胞沈澱物可再懸浮於細胞培養基中，例如用於再刺激步驟。在一些實施例中，細胞可在收集之後經歷洗滌步驟。洗滌步驟可包含使細胞沈澱物再懸浮於諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)之等張緩衝液中，藉由離心收集細胞，且丟棄上清液。

用於產生及/或擴增對病毒抗原具有特異性之免疫細胞群體之方法通常涉及超過一個單刺激步驟。可進行之刺激步驟之數目無上限。在一些實施例中，該等方法包含超過2、3、4或5個刺激步驟。在一些實施例中，該等方法包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個中之一者之刺激步驟。方法中之刺激步驟可彼此不同。

在一些實施例中，用於該等方法中之PBMC耗竭CD45RA陽性細胞。亦即，在一些實施例中，PBMC為「CD45RA陽性細胞耗竭之PBMC」或為「CD45RA陰性PBMC」。CD45RA陽性細胞之耗竭意欲減少所產生/擴增之細胞群體中之NK細胞及/或調節性T細胞及/或初始T細胞之數目。

在一些實施例中，該等方法包含例如在刺激步驟之前耗竭PBMC之CD45RA陽性細胞之步驟。在一些實施例中，該等方法包含例如在再刺激步驟之前耗竭藉由根據本發明之刺激步驟獲得之細胞之CD45RA陽性細胞的步驟。CD45RA陽性細胞之耗竭可藉由任何合適方法，諸如藉由磁性活化細胞分選(MACS)，例如使用Miltenyi® Biotec管柱及經抗CD45RA抗體塗佈之磁性珠粒來達成。

在一些實施例中，用於該等方法中之用於衍生APC之細胞群體耗竭CD45RA陽性細胞。亦即，在一些實施例中，用於衍生APC之細胞群體為「CD45RA陽性細胞耗竭」或「CD45RA陰性」群體。舉例而言，在其中ATC用作APC之實施例中，ATC可來源於CD45RA陽性細胞耗竭之PBMC群體或來源於CD45RA陰性PBMC群體。

核酸可藉由諸如轉導、轉染、電穿孔等此項技術中熟知之方法引入細胞中。在一些實施例中，核酸係使用包含核酸之病毒載體(例如反轉錄病毒載體)經由轉導引入細胞中。

本文所描述之方法之態樣及實施例包含修飾本文所描述之免疫細胞(例如本文所描述之病毒特異性免疫細胞)以表現/包含根據本發明之CAR。

本文所描述之方法之態樣及實施例包含修飾本文所描述之免疫細胞(例如本文所描述之病毒特異性免疫細胞)以表現/包含編碼根據本發明之CAR之核酸。

該等方法通常包含將編碼CAR之核酸引入免疫細胞中。

免疫細胞(例如病毒特異性免疫細胞)可根據相關技術人員所熟知之方法經修飾以包含/表現本文所描述之CAR或編碼本文所描述之CAR之核酸。

該等方法一般包含用於永久(穩定)或短暫表現經轉移核酸之核酸轉移。

可使用任何適合的基因工程改造平台來修飾根據本發明之細胞。適用於修飾細胞之方法包括使用諸如γ反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、DNA轉染、基於轉位子之基因遞送及RNA轉染之基因工程改造平台，例如如Maus等人, Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225中所描述，該文獻特此以全文引用之方式併入。在一些實施例中，修飾細胞以包含CAR或編碼CAR之核酸包含用包含編碼CAR之核酸之病毒載體轉導細胞。

在一些實施例中，本發明之方法採用編碼本文所描述之CAR之反轉錄病毒。

方法亦包括描述於例如Wang及Rivière Mol Ther Oncolytics. (2016) 3:16015中之方法，該文獻特此以全文引用之方式併入。

該等方法一般包含將編碼包含核酸/複數種核酸之載體/複數種載體之該一或多種核酸引入細胞中。在一些實施例中，該等方法另外包含在適合細胞表現核酸或載體之條件下培養細胞。在一些實施例中，該等方法在活體外進行。適用於將核酸/載體引入細胞中之方法包括轉導、轉染及電穿孔。

在一些實施例中，將核酸/載體引入細胞中包含轉導，例如反轉錄病毒轉導。因此，在一些實施例中，核酸包含於病毒載體中，或載體為病毒載體。用病毒載體轉導免疫細胞描述於例如Simmons及Alberola-Ila, Methods Mol Biol. (2016) 1323:99-108中，其特此以全文引用之方式併入。

用於增強轉導效率之試劑可用於本發明之方法中。溴化己二甲銨(凝聚胺)為一種陽離子聚合物，其常用於經由中和病毒粒子與細胞表面上表現之唾液酸殘基之間的電荷排斥來改良轉導。其他常用於增強轉導之試劑包括例如基於泊洛沙姆之試劑，諸如LentiBOOST (Sirion Biotech)、重組人纖維連接蛋白(Takara)、載體融合素(Miltenyi Biotech)以及SureENTRY (Qiagen)及ViraDuctin (Cell Biolabs)。

在特定實施例中，本發明之方法在用編碼本文所描述之CAR之載體/核酸進行之細胞轉導中採用載體融合素-1 (Miltenyi Biotec目錄號170-076-165)。在一些實施例中，該等方法包含使編碼本文所描述之CAR之反轉錄病毒與載體融合素-1接觸，且使要被反轉錄病毒轉導之細胞與包含反轉錄病毒及載體融合素-1之混合物接觸。

在一些實施例中，該等方法包含在包含有包含核酸之病毒載體的細胞培養基存在下離心需要引入編碼CAR之核酸的細胞(在此項技術中稱為『旋轉感染』)。

在一些實施例中，該等方法包含藉由電穿孔引入根據本發明之核酸或載體，例如如Koh等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids (2013) 2, e114中所描述，該文獻特此以全文引用之方式併入。

在一些實施例中，該等方法進一步包含例如自其他細胞(例如對病毒不具有特異性之細胞，及/或不表現CAR之細胞)純化/分離表現CAR及/或病毒特異性免疫細胞。用於自異質細胞群體純化/分離免疫細胞之方法為此項技術中熟知的，且可採用例如基於FACS或MACS之方法以基於免疫細胞標記物之表現來分選細胞群體。在一些實施例中，該方法係用於純化/分離特定類型之細胞，例如病毒特異性T細胞(例如病毒特異性CD8+ T細胞、病毒特異性CTL)或表現CAR之病毒特異性T細胞(例如表現CAR之病毒特異性CD8+ T細胞、表現CAR之病毒特異性CTL)。

本發明亦提供藉由本文所描述之方法獲得或可藉由本文所描述之方法獲得之細胞及其群體。

病毒特異性 T 細胞本發明係關於表現CD30特異性CAR之T細胞。應瞭解，當細胞在本文中以單數(亦即「一/該細胞」)提及時，亦考慮此類細胞之複數/群體。

在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞為病毒特異性T細胞。如本文所使用之「病毒特異性T細胞」係指對病毒具有特異性之T細胞。病毒特異性T細胞表現/包含能夠識別病毒抗原之肽(例如當由MHC分子呈現時)的受體(較佳T細胞受體)。病毒特異性T細胞可由於編碼此類抗原受體之內源性核酸之表現或由於已經工程改造以表現此類受體而表現/包含此類受體。病毒特異性T細胞較佳表現/包含對病毒抗原之肽具有特異性之TCR。

在一些實施例中，T細胞為CD3+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD3+、CD8+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為T輔助細胞(T _H細胞)。在一些實施例中，T細胞為細胞毒性T細胞(例如細胞毒性T淋巴球(CTL))。

病毒特異性T細胞可回應於T細胞所特異性針對之病毒抗原或回應於包含/表現病毒/抗原之細胞而呈現T細胞之某些功能特性。在一些實施例中，該等特性為與例如細胞毒性T細胞之效應T細胞相關之功能特性。

在一些實施例中，病毒特異性T細胞可顯示以下特性中之一或多者：對包含/表現T細胞所特異性針對之病毒/病毒抗原之細胞的細胞毒性；回應於T細胞所特異性針對之病毒/病毒抗原之刺激或回應於暴露於包含/表現T細胞所特異性針對之病毒/病毒抗原之細胞的增殖、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔蛋白表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現及/或FAS配體(FASL)表現。

病毒特異性T細胞表現/包含當由適當MHC分子呈現時能夠識別T細胞所特異性針對之病毒抗原之肽的TCR。病毒特異性T細胞可為CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞。

在一些實施例中，病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒具有特異性。在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞為艾司坦-巴爾病毒特異性T細胞(CD30.CAR-EBVST)。

在一些實施例中，病毒特異性免疫細胞可對艾司坦-巴爾病毒之肽/多肽具有特異性。

對病毒之抗原具有特異性之T細胞在本文中可被稱作病毒特異性T細胞(VST)。對特定病毒之抗原具有特異性之T細胞可描述為對相關病毒具有特異性；舉例而言，對EBV之抗原具有特異性之T細胞可被稱為EBV特異性T細胞或「EBVST」。

因此，在一些實施例中，病毒特異性T細胞為艾司坦-巴爾病毒特異性T細胞(EBVST)。

在一些較佳實施例中，病毒特異性免疫細胞對EBV抗原之肽/多肽具有特異性。在較佳實施例中，病毒特異性免疫細胞為艾司坦-巴爾病毒特異性T細胞(EBVST)。

EBV病毒學描述於例如Stanfield及Luftiq, F1000Res. (2017) 6:386及Odumade等人, Clin Microbiol Rev (2011) 24(1):193-209中，兩者均特此以全文引用之方式併入。

EBV經由病毒蛋白BMFR2與β1整合素之結合及病毒蛋白gH/gL與整合素avβ6及avβ8之結合來感染上皮細胞。EBV經由病毒醣蛋白gp350與CD21及/或CD35之相互作用、接著為病毒gp42與II類MHC之相互作用來感染B細胞。此等相互作用觸發病毒包膜與細胞膜之融合，從而使病毒進入細胞中。一旦進入，則病毒蛋白殼溶解且病毒基因體經轉運至細胞核。

EBV具有兩種複製模式；潛伏及溶解。潛伏週期不會產生新的感染性病毒粒子，且可在B細胞及上皮細胞中之適當位置發生。EBV基因體環形DNA作為游離基因體駐存於潛伏感染之細胞核中且藉由宿主細胞之DNA聚合酶複製。在潛伏期，僅一部分EBV之基因在三種不同的被稱為潛伏程式之模式中之一者中經表現，從而產生不同組之病毒蛋白及RNA。潛伏週期描述於例如Amon及Farrell, Reviews in Medical Virology (2004) 15(3): 149-56中，該文獻特此以全文引用之方式併入。

EBNA1蛋白及非編碼RNA EBER在潛伏程式I至III中之各者中經表現。潛伏程式II及III進一步涉及EBNALP、LMP1、LMP2A及LMP2B蛋白之表現，且潛伏程式III進一步涉及EBNA2、EBNA3A、EBNA3B及EBNA3C之表現。

EBNA1為多功能的，且在基因調節、染色體外複製及經由病毒啟動子之正及負調節進行之EBV游離型基因體維持中發揮作用(Duellman等人, J Gen Virol. (2009); 90(Pt 9): 2251-2259)。EBNA2參與潛伏病毒轉錄之調節且促進感染EBV之細胞之永生化(Kempkes及Ling, Curr Top Microbiol Immunol. (2015) 391:35-59)。EBNA-LP為天然B細胞之轉型所需，且募集轉錄因子以用於病毒複製(Szymula等人, PLoS Pathog. (2018);14(2):e1006890)。EBNA3A、EBNA3B及EBNA3C與RBPJ相互作用以影響基因表現，從而促進經感染細胞之存活及生長(Wang等人, J Virol. (2016) 90(6):2906-2919)。LMP1調節參與B細胞活化之基因之表現(Chang等人, J. Biomed. Sci. (2003) 10(5): 490-504)。LMP2A及LMP2B藉由模擬經活化B細胞受體來抑制正常B細胞信號轉導(Portis及Longnecker, Oncogene (2004) 23(53): 8619-8628)。EBER與宿主細胞蛋白形成核糖核蛋白複合物，且經提出在細胞轉型中發揮作用。

潛伏週期可根據潛伏程式I至III中之任一者在B細胞中發展，且通常自III發展至II發展至I。在感染靜止初始B細胞時，EBV進入潛伏程式III。潛伏III基因之表現活化B細胞，該B細胞變成增殖性母細胞。隨後，EBV通常藉由將表現限於基因之子集而發展至潛伏II，其引起母細胞分化成記憶B細胞。基因表現之進一步限制使EBV進入潛伏I。當記憶B細胞分裂時，EBNA1表現允許EBV複製。在上皮細胞中，僅存在潛伏II。

在初次感染時，EBV在口咽上皮細胞中複製且在B淋巴球中建立潛伏III、II及I感染。B淋巴球之EBV潛伏感染為病毒續存、於上皮細胞中之後續複製及感染性病毒於唾液中之釋放所需。B淋巴球之EBV潛伏III及II感染、口腔上皮細胞之潛伏II感染及NK細胞或T細胞之潛伏II感染可能會導致由均一EBV基因體存在及基因表現標記之惡性疾病。

B細胞中之潛伏EBV可經再活化以切換成溶解複製。溶解週期引起感染性病毒粒子產生且可在B細胞及上皮細胞中之適當位置發生，且例如由Kenney在Arvin等人, Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis; Cambridge University Press (2007)之第25章中綜述，該文獻特此以全文引用之方式併入。

溶解複製需要EBV基因體為線性的。潛伏EBV基因體為游離型的，且因此其必須經線性化以用於溶解再活化。在B細胞中，溶解複製通常僅在自潛伏再活化之後發生。

諸如BZFL1及BRLF1之立即早期溶解基因產物充當轉活化因子，從而增強其自身表現及後續溶解週期基因之表現。

早期溶解基因產物在病毒複製(例如EBV DNA聚合酶催化組分BALF5；DNA聚合酶進行性因子BMRF1、DNA結合蛋白BALF2、解螺旋酶BBLF4、引子酶BSLF1及引子酶相關蛋白BBLF2/3)及去氧核苷酸代謝(例如胸苷激酶BXLF1、dUTPase BORF2)中發揮作用。其他早期溶解基因產物起轉錄因子作用(例如BMRF1、BRRF1)，在RNA穩定性及加工中發揮作用(例如BMLF1)，或參與免疫逃避(例如抑制細胞凋亡之BHRF1)。

晚期溶解基因產物傳統上經分類為在病毒複製開始之後表現之溶解基因產物。其一般編碼諸如核衣殼蛋白之病毒粒子之結構性組分以及介導EBV結合及融合之醣蛋白(例如gp350/220、gp85、gp42、gp25)。其他晚期溶解基因產物在免疫逃避中發揮作用；BCLF1編碼IL-10之病毒同源物，且BALF1編碼與抗細胞凋亡蛋白Bcl2具有同源性之蛋白質。

如本文所使用之「EBV特異性T細胞」係指對艾司坦-巴爾病毒(EBV)具有特異性之T細胞。EBV特異性T細胞表現/包含能夠識別EBV抗原之肽(例如當由MHC分子呈現時)的受體(較佳T細胞受體)。EBV特異性T細胞較佳表現/包含對由I類MHC呈現之EBV抗原之肽具有特異性的TCR。

在一些實施例中，EBV特異性T細胞為CD3+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD3+、CD8+ T細胞。在一些實施例中，T細胞為T輔助細胞(T _H細胞))。在一些實施例中，T細胞為細胞毒性T細胞(例如細胞毒性T淋巴球(CTL))。

EBV特異性T細胞可回應於T細胞所特異性針對之EBV抗原或回應於包含/表現EBV之細胞(例如感染EBV之細胞)或相關EBV抗原而呈現T細胞之某些功能特性。在一些實施例中，該等特性為與例如細胞毒性T淋巴球(CTL)之效應T細胞相關之功能特性。

在一些實施例中，EBV特異性T細胞可顯示以下特性中之一或多者：對包含/表現T細胞所特異性針對之EBV/EBV抗原之細胞的細胞毒性；回應於T細胞所特異性針對之EBV/EBV抗原之刺激或回應於暴露於包含/表現T細胞所特異性針對之EBV/EBV抗原之細胞的增殖、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔蛋白表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現及/或FAS配體(FASL)表現。

EBV特異性T細胞較佳表現/包含當由適當MHC分子呈現時能夠識別T細胞所特異性針對之EBV抗原之肽的TCR。EBV特異性T細胞可為CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞。

對EBV具有特異性之T細胞可對例如本文所描述之EBV抗原之任何EBV抗原具有特異性。對EBV具有特異性之免疫細胞群體或包含複數個對EBV具有特異性之免疫細胞之組合物可包含對一或多種EBV抗原具有特異性之免疫細胞。

在一些實施例中，EBV抗原為EBV潛伏抗原，例如III型潛伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B或EBNA3C)、II型潛伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B或BARF1)或I型潛伏抗原(例如EBNA1或BARF1)。在一些實施例中，EBV抗原為EBV溶解抗原，例如立即早期溶解抗原(例如BZLF1、BRLF1或BMRF1)、早期溶解抗原(例如BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU或EBNA1-FUK)或晚期溶解抗原(例如BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3或gp350)。

表現 CD30 特異性 CAR 之同種異體 T 細胞本發明之態樣使用對於個體為同種異體的表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞為艾司坦-巴爾病毒特異性T細胞(CD30.CAR-EBVST)。

本發明提供一種消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

本發明亦提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物，其用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法中，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。另外，本發明提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物的用途，其用以製造用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞之方法中的藥劑，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

同種異體反應性T細胞包含能夠識別非自身MHC分子(亦即，同種異體MHC)且對其引發免疫反應之TCR。同種異體反應性T細胞可回應於表現非自身MHC分子之細胞而呈現以下特性中之一或多者：細胞增殖、生長因子(例如IL-2)表現、細胞毒性/效應因子(例如IFNγ、顆粒酶、穿孔蛋白、顆粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)表現及/或細胞毒性活性。

如本文所使用之「同種異體反應性」及「同種異體反應性免疫反應」係指針對基因上與效應免疫細胞不相同之細胞/組織/器官的免疫反應。效應免疫細胞可對表現非自身MHC/HLA分子(亦即與由效應免疫細胞編碼之MHC/HLA分子不相同之MHC/HLA分子)之細胞或包含該等細胞之組織/器官呈現同種異體反應性或同種異體反應性免疫反應。

如本文所提及之「MHC不匹配」及「HLA不匹配」個體為具有編碼不相同MHC/HLA分子之MHC/HLA基因的個體。在一些實施例中，MHC不匹配或HLA不匹配個體具有編碼不相同I類MHC α及/或II類MHC分子之MHC/HLA基因。如本文所提及之「MHC匹配」及「HLA匹配」個體為具有編碼相同MHC/HLA分子之MHC/HLA基因的個體。在一些實施例中，MHC匹配或HLA匹配個體具有編碼相同I類MHC α及/或II類MHC分子之MHC/HLA基因。

在細胞/組織/器官在本文中相對於參考個體/治療稱為同種異體的情況下，細胞/組織/器官獲自/來源於除參考個體以外之個體的細胞/組織/器官。在一些實施例中，同種異體物質包含編碼與由參考個體之MHC/HLA基因編碼之MHC/HLA分子(例如I類MHC α及/或II類MHC分子)不相同的MHC/HLA分子(例如I類MHC α及/或II類MHC分子)的MHC/HLA基因。

在細胞/組織/器官在本文中相對於治療稱為同種異體的情況下，細胞/組織/器官獲自/來源於除待治療個體以外之個體的細胞/組織/器官。在一些實施例中，同種異體物質包含編碼與由待治療個體之MHC/HLA基因編碼之MHC/HLA分子(例如I類MHC α及/或II類MHC分子)不相同的MHC/HLA分子(例如I類MHC α及/或II類MHC分子)的MHC/HLA基因。

在細胞/組織/器官在本文中相對於參考個體稱為同種異體的情況下，細胞/組織/器官在基因上與參考個體不相同，或來源於/獲自基因上不相同之個體。在細胞/組織/器官在本文中在治療個體之上下文中稱為同種異體的情況下，細胞/組織/器官在基因上與待治療之個體不相同，或來源於/獲自基因上不相同之個體。同種異體細胞/組織/器官可包含編碼與由參考個體之MHC/HLA基因編碼之MHC/HLA分子(例如I類MHC α及/或II類MHC分子)不相同的MHC/HLA分子(例如I類MHC α及/或II類MHC分子)的MHC/HLA基因。

在一些實施例中，待根據本發明之方法向個體投與的對表現/包含本文所描述之CAR (或表現/包含編碼此類CAR之核酸)之病毒具有特異性的免疫細胞係基於待治療個體之HLA/MHC概況加以選擇。

在一些實施例中，待向個體投與之細胞係基於其相對於個體為HLA/MHC匹配來加以選擇。在一些實施例中，待向個體投與之細胞係基於其相對於個體為幾乎或完全HLA/MHC匹配來加以選擇。

如本文所使用，HLA/MHC對偶基因可在其編碼具有相同胺基酸序列之多肽時經確定為『匹配』。亦即，『匹配』係在蛋白質層級確定，此與編碼多肽之核苷酸序列中之同義差異及/或非編碼區中之差異的可能存在無關。

相對於參考個體為『HLA匹配』之細胞可為：(i)在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1中8/8匹配；或(ii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1中10/10匹配；或(iii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1及HLA-DPB1中12/12匹配。相對於參考個體為『幾乎或完全HLA匹配』之細胞可為：(i)在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1中≥ 4/8 (亦即4/8、5/8、6/8、7/8或8/8)匹配；或(ii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1中≥ 5/10 (亦即5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10)匹配；或(iii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1及HLA-DPB1中≥ 6/12 (亦即6/12、7/12、8/12、9/12、10/12、11/12或12/12)匹配。細胞可相對於參考個體部分HLA匹配，當時該等細胞可：(i)在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1中≤ 4/8 (亦即1/8、2/8、3/8或4/8)匹配；或(ii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1中≤ 5/10 (亦即1/10、2/10、3/10、4/10或5/10)匹配；或(iii)在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1及HLA-DPB1中≤ 6/12 (亦即1/12、2/12、3/12、4/12、5/12或6/12)匹配。

向幾乎或完全HLA匹配(與其係同種異體起源無關)之個體投與細胞可為有利的，尤其在投與對表現/包含本文所描述之CAR (或表現/包含編碼此類CAR之核酸)之病毒具有特異性之免疫細胞以治療由免疫細胞所特異性針對之病毒感染造成或與其相關的疾病/病狀的情形下。在此等情況下，預期由宿主細胞向所投與細胞呈現病毒抗原(經由所投與細胞之天然TCR)會增加所投與細胞之活體內活化、增殖及存活且因此改良所投與細胞之治療功效。

「現成」T細胞療法產物面臨的一個常見問題為患者自身之同種異體反應性T細胞所介導的移植排斥反應。以根據本文所揭示之方法之分次劑量投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體細胞(例如CD30.CAR-EBVST)係有利的，因為其允許消除同種異體反應性T細胞。投與第一劑量之表現CD30特異性CAR之細胞使得同種異體反應性T細胞(其最初對CD30表現呈陰性)活化且行進至淋巴結，從而增殖、上調CD30表現且獲得針對表現CD30特異性CAR之供體細胞的效應(例如殺死)功能。此時CD30.CAR-EBVST不會被消除，因為同種異體反應性T細胞缺乏效應功能。在第一劑量之後2至4天投與第二劑量之表現CD30特異性CAR之細胞之後，表現CD30特異性CAR之T細胞將行進至CD30陽性腫瘤及同種異體反應性T細胞增殖位點，因為經活化T細胞將分泌募集效應細胞之趨化激素。因此，表現CD30特異性CAR之供體T細胞將能夠消除現在表現CD30之同種異體反應性T細胞。

因此，CD30.CAR-EBVST將(i)消除其在同種異體宿主中誘發之同種異體反應性T細胞，及(ii)持續足夠時間且具有消除CD30陽性癌症之必需活性。

如本文所揭示，同種異體反應性T細胞之「消除」或「耗竭」可為全部或部分的。同種異體反應性T細胞之消除可使用例如來源於個體之T細胞之流式細胞分析或混合淋巴球反應(MLR)來確定。

同種異體反應性免疫細胞之消除或耗竭可引起個體中之同種異體反應性免疫細胞之數量減少例如2倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍或更多倍。

因此，本發明提供一種消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

本發明亦提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物，其用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法中，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

本發明亦提供一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物的用途，其用以製造用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞之方法中的藥劑，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。

淋巴球耗竭化學療法本發明之態樣採用淋巴球耗竭化學療法。

如本文所使用，「淋巴球耗竭化學療法」係指用化學治療劑進行之治療，該化學治療劑在投與治療之個體內引起淋巴球(例如T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞或先天性淋巴細胞(ILC)或其前驅體)耗竭。「淋巴球耗竭化學治療劑」係指引起淋巴球耗竭之化學治療劑。

淋巴球耗竭化學療法及其在藉由授受性細胞轉移之治療方法中之用途描述於例如Klebanoff等人, Trends Immunol. (2005) 26(2):111-7及Muranski等人, Nat Clin Pract Oncol. (2006) (12):668-81中，兩者特此以全文引用之方式併入。淋巴球耗竭化學療法之目的在於耗竭接受個體之內源性淋巴球群體。

在藉由授受性轉移免疫細胞治療疾病之情形下，淋巴球耗竭化學療法通常在授受性細胞轉移之前投與，從而調節接受個體以接受授受性轉移之細胞。淋巴球耗竭化學療法被認為藉由以下方式來促進授受性轉移之細胞之持久性及活性：例如經由消除表現免疫抑制性細胞介素之細胞而產生許可環境，且產生授受性轉移之淋巴細胞之擴增及活性所需之『淋巴間隙』及恆定細胞介素(例如IL-7及IL-15)。

淋巴球耗竭化學療法中常用之化學治療劑包括例如氟達拉濱、苯達莫司汀、環磷醯胺及噴司他汀(pentostatin)。

本發明之態樣及實施例尤其係關於包含投與氟達拉濱、環磷醯胺及/或苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法。在特定實施例中，根據本發明之淋巴球耗竭化學療法包含投與氟達拉濱及環磷醯胺。在一些實施例中，淋巴球耗竭化學療法包含環磷醯胺及苯達莫司汀。在一些實施例中，淋巴球耗竭化學療法包含氟達拉濱及苯達莫司汀。

氟達拉濱為藉由干擾核糖核苷酸還原酶及DNA聚合酶來抑制DNA合成之嘌呤類似物。其常常用作用於治療白血病(尤其慢性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病)及淋巴瘤(尤其非霍奇金氏淋巴瘤)之化學治療劑。氟達拉濱可經靜脈內或經口投與。

環磷醯胺及苯達莫司汀為烷基化劑，其引起DNA鹼基之間的股內及股間交聯。其通常用作用於治療慢性淋巴球性白血病、多發性骨髓瘤及非霍奇金氏淋巴瘤之化學治療劑。苯達莫司汀及環磷醯胺通常經靜脈內投與。

治療方法本發明提供用於治療CD30陽性癌症之方法、用於此類方法中之組合物以及組合物用以製造用於此類方法中之藥劑的用途。

該等方法包含向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞。具體言之，本發明提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中第一時間點及第二時間點相隔2至4天。

本發明亦提供表現CD30特異性CAR之T細胞(例如此類細胞之組合物)，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中第一時間點及第二時間點相隔2至4天。本發明亦提供表現CD30特異性CAR之T細胞(例如此類細胞之組合物)的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向個體投與CD30特異性CAR-T細胞，其中劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中第一時間點及第二時間點相隔2至4天。

表現CD30特異性CAR之T細胞可以在兩個單獨時間點之間分開的劑量投與。該方法可包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量在兩個單獨時間點之間分開，且其中該等時間點相隔2至4天。本發明亦提供表現CD30特異性CAR之T細胞(例如此類細胞之組合物)，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含向個體投與CD30特異性CAR-T細胞，其中劑量在兩個單獨時間點之間分開，且其中該等時間點相隔2至4天。本發明亦提供表現CD30特異性CAR之T細胞(例如此類細胞之組合物)的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向個體投與CD30特異性CAR-T細胞，其中劑量在兩個單獨時間點之間分開，且該等時間點相隔2至4天。

在一些實施例中，該等方法包含向患有CD30陽性癌症之個體投與淋巴球耗竭化學療法，且隨後向該個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞。

本發明亦提供一種淋巴球耗竭化學治療劑(例如氟達拉濱、環磷醯胺及/或苯達莫司汀)，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)向個體投與淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與氟達拉濱、環磷醯胺及/或苯達莫司汀)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供淋巴球耗竭化學治療劑(例如氟達拉濱、環磷醯胺及/或苯達莫司汀)之用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與氟達拉濱、環磷醯胺及/或苯達莫司汀)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

本發明亦提供氟達拉濱，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與氟達拉濱之淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與氟達拉濱及環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供氟達拉濱之用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與氟達拉濱之淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與氟達拉濱及環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

本發明亦提供環磷醯胺，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與氟達拉濱及環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供環磷醯胺之用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與氟達拉濱及環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

本發明亦提供苯達莫司汀，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)投與包含投與苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法(例如包含環磷醯胺及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法，或包含氟達拉濱及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供苯達莫司汀之用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法(例如包含投與環磷醯胺及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法，或包含投與氟達拉濱及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法)；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

本發明亦提供氟達拉濱及環磷醯胺之組合(例如包含氟達拉濱及環磷醯胺之醫藥組合物或組合)，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與氟達拉濱及環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供氟達拉濱及環磷醯胺之組合(例如包含氟達拉濱及環磷醯胺之醫藥組合物或組合)的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與氟達拉濱及環磷醯胺之淋巴球耗竭化學療法；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

本發明亦提供環磷醯胺及苯達莫司汀之組合(例如包含環磷醯胺及苯達莫司汀之醫藥組合物或組合)，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與環磷醯胺及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供環磷醯胺及苯達莫司汀之組合(例如包含環磷醯胺及苯達莫司汀之醫藥組合物或組合)的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與環磷醯胺及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

本發明亦提供氟達拉濱及苯達莫司汀之組合(例如包含氟達拉濱及苯達莫司汀之醫藥組合物或組合)，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與氟達拉濱及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。本發明亦提供氟達拉濱及苯達莫司汀之組合(例如包含氟達拉濱及苯達莫司汀之醫藥組合物或組合)的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含：(i)向個體投與包含投與氟達拉濱及苯達莫司汀之淋巴球耗竭化學療法；及(ii)隨後向個體投與CD30特異性CAR-T細胞。

實際投與量以及投與之速率及時程將取決於待治療之癌症的性質及嚴重程度以及藥劑之性質。治療處方，例如關於劑量等之決定，屬於全科醫師及其他醫生之職責，且通常考慮到待治療之癌症、個別個體之狀況、遞送部位、投與方法及醫師已知的其他因素。上文所提及之技術及方案之實例可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins出版。

對於根據本發明之投與，細胞及化學治療劑較佳調配為藥劑或醫藥組合物，其包含熟習此項技術者熟知的醫藥學上可接受之成分，包括(但不限於)醫藥學上可接受之載劑、佐劑、賦形劑、稀釋劑、填充劑、緩衝液、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、穩定劑、增溶劑、界面活性劑(例如潤濕劑)、掩蔽劑、著色劑、調味劑及甜味劑。

如本文所使用之術語「醫藥學上可接受」係關於化合物、成分、材料、組合物、劑型等，其在合理醫學判斷之範疇內，適用於與所討論之個體(例如人類)的組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的益處/風險比相稱。各載劑、佐劑、賦形劑等在與調配物之其他成分相容的意義上亦必須為「可接受的」。適合的載劑、佐劑、賦形劑等可見於標準醫藥教材，例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990；及Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第2版, 1994中。

調配物可藉由藥劑學技術中熟知之任何方法來製備。此類方法包括使相關活性劑與構成一或多種附屬成分之載劑結合的步驟。一般而言，調配物係藉由使活性化合物與載劑(例如液體載劑、細粉狀固體載劑等)均勻且緊密地結合且隨後必要時使產物成型來製備。

本發明之細胞及化學治療劑可經調配用於根據藥劑及待治療之癌症可接受的投與模式。舉例而言，根據本發明之細胞及化學治療劑可經調配用於向個體進行血管內投與，例如靜脈內注射或輸注。適合的調配物可包含於無菌或等張介質中之所選藥劑。

根據本發明之淋巴球耗竭化學療法之療程可包含一或多種化學治療劑之多次投與。

淋巴球耗竭化學療法之療程可包含以本文所描述之劑量且持續本文所描述之天數地投與氟達拉濱及環磷醯胺。藉助於說明，淋巴球耗竭化學療法之療程可包含以每天30 mg/m ²之劑量投與氟達拉濱持續3個連續日，且以每天500 mg/m ²之劑量投與環磷醯胺持續3個連續日。

淋巴球耗竭化學療法之療程可包含以本文所描述之劑量且持續本文所描述之天數地投與環磷醯胺及苯達莫司汀。藉助於說明，淋巴球耗竭化學療法之療程可包含以每天500 mg/m ²之劑量投與環磷醯胺持續3個連續日，且以每天70 mg/m ²之劑量投與苯達莫司汀持續3個連續日。

淋巴球耗竭化學療法之療程可包含以本文所描述之劑量且持續本文所描述之天數地投與氟達拉濱及苯達莫司汀。藉助於說明，淋巴球耗竭化學療法之療程可包含以每天30 mg/m ²之劑量投與氟達拉濱持續3個連續日，且以每天70 mg/m ²之劑量投與苯達莫司汀持續3個連續日。

根據淋巴球耗竭化學療法之療程投與最後一劑化學治療劑之日可被視為淋巴球耗竭化學療法之療程完成之日。

在一些實施例中，氟達拉濱以每天5至100 mg/m ²之劑量投與，例如每天15至90 mg/m ²、每天15至80 mg/m ²、每天15至70 mg/m ²、每天15至60 mg/m ²、每天15至50 mg/m ²、每天10至40 mg/m ²、每天5至60 mg/m ²、每天10至60 mg/m ²、每天15至60 mg/m ²、每天20至60 mg/m ²或每天25至60 mg/m ²中之一者。在一些實施例中，氟達拉濱以每天20至40 mg/m ²之劑量投與，例如每天25至35 mg/m ²，例如每天約30 mg/m ²。

在一些實施例中，氟達拉濱以根據前一段落之劑量投與超過一天且少於14個連續日。在一些實施例中，氟達拉濱以根據前一段落之劑量投與2至14，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5或2至4個連續日中之一者。在一些實施例中，氟達拉濱以根據前一段落之劑量投與2至6個連續日，例如2至4個連續日，例如3個連續日。

在一些實施例中，氟達拉濱以每天15至60 mg/m ²之劑量投與2至6個連續日，例如以每天30 mg/m ²之劑量投與3個連續日。

在一些實施例中，環磷醯胺以每天250至1000 mg/m ²之劑量投與，例如每天250至750 mg/m ²、每天250至700 mg/m ²、每天250至650 mg/m ²、每天250至600 mg/m ²、每天250至550 mg/m ²、每天250至500 mg/m ²、每天300至1000 mg/m ²、每天350至1000 mg/m ²、每天400至1000 mg/m ²、每天500至1000 mg/m ²、每天550至1000 mg/m ²、每天600至1000 mg/m ²、每天650至1000 mg/m ²、每天700至1000 mg/m ²、每天750至1000 mg/m ²、每天800至1000 mg/m ²、每天850至1000 mg/m ²、或每天900至1000 mg/m ²中之一者。

在一些實施例中，環磷醯胺以根據前一段落之劑量投與超過一天且少於14個連續日。在一些實施例中，環磷醯胺以根據前一段落之劑量投與2至14，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、或2至4個中之一者之連續日。在一些實施例中，環磷醯胺以根據前一段落之劑量投與2至6個連續日，例如2至4個連續日，例如3個連續日。

在一些實施例中，環磷醯胺以每天250至1000 mg/m ²之劑量投與2至6個連續日，例如以每天500 mg/m ²之劑量投與3個連續日。

在一些實施例中，苯達莫司汀以每天10至200 mg/m ²之劑量投與，例如每天35至180 mg/m ²、每天35至160 mg/m ²、每天35至140 mg/m ²、每天35至120 mg/m ²、每天35至100 mg/m ²、每天35至80 mg/m ²、每天10至100 mg/m ²、每天15至100 mg/m ²、每天20至100 mg/m ²、每天25至100 mg/m ²、每天30至100 mg/m ²、每天35至100 mg/m ²、每天40至100 mg/m ²、每天45至100 mg/m ²、每天50至100 mg/m ²、每天55至100 mg/m ²、每天60至100 mg/m ²、或每天65至100 mg/m ²中之一者。

在一些實施例中，苯達莫司汀以根據前一段落之劑量投與超過一天且少於14個連續日。在一些實施例中，苯達莫司汀以根據前一段落之劑量投與2至14，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、或2至4個中之一者之連續日。在一些實施例中，苯達莫司汀以根據前一段落之劑量投與2至6個連續日，例如2至4個連續日，例如3個連續日。

在一些實施例中，苯達莫司汀以每天35至140 mg/m ²之劑量投與2至6個連續日，例如以每天70 mg/m ²之劑量投與3個連續日。

在一些實施例中，該等方法包含以每天15至60 mg/m ²(例如每天30 mg/m ²)之劑量投與氟達拉濱且以每天250至1000 mg/m ²(例如每天500 mg/m ²)之劑量投與環磷醯胺，持續2至6個連續日(例如3個連續日)。

在一些實施例中，該等方法包含以250至1000 mg/m ²(例如每天500 mg/m ²)之劑量投與環磷醯胺且以每天35至140 mg/m ²(例如每天70 mg/m ²)之劑量投與苯達莫司汀，持續2至6個連續日(例如3個連續日)。

在一些實施例中，該等方法包含以每天15至60 mg/m ²(例如每天30 mg/m ²)之劑量投與氟達拉濱且以每天35至140 mg/m ²(例如每天70 mg/m ²)之劑量投與苯達莫司汀，持續2至6個連續日(例如3個連續日)。

在一些實施例中，氟達拉濱及環磷醯胺可同時或依序投與。在一些實施例中，環磷醯胺及苯達莫司汀可同時或依序投與。在一些實施例中，氟達拉濱及苯達莫司汀可同時或依序投與。同時投與係指一起投與，例如以含有兩種藥劑之醫藥組合物形式(亦即以組合製劑形式)，或在彼此之後立即投與，且視情況經由相同投與途徑，例如投與至同一動脈、靜脈或其他血管。依序投與係指在與藥劑中之一者之單獨投與間隔給定時間間隔之後跟隨的另一藥劑之投與。不要求藉由相同途徑投與藥劑，但在一些實施例中為此情況。

在根據本發明之淋巴球耗竭化學療法之療程的一些實施例中，氟達拉濱及環磷醯胺係在同一天或相同日子投與。藉助於說明，在包含以每天30 mg/m ²之劑量投與氟達拉濱持續3個連續日且以每天500 mg/m ²之劑量投與環磷醯胺持續3個連續日之淋巴球耗竭化學療法之療程的實例中，氟達拉濱及環磷醯胺可在相同的3個連續日投與。在此類實例中，淋巴球耗竭化學療法之療程可被稱為在向個體投與氟達拉濱及環磷醯胺之3個連續日之最後一日完成。

淋巴球耗竭化學療法可藉由靜脈內輸注經適當的時段投與。在一些實施例中，淋巴球耗竭化學治療劑可藉由靜脈內輸注經15至60分鐘，例如20至40分鐘，例如約30分鐘之時段投與。

本發明之態樣亦包含向患有CD30陽性癌症之個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞。因此，該等方法涉及授受性細胞轉移。在一些實施例中，該等方法包含授受性轉移表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞。

授受性細胞轉移一般係指自個體獲得細胞(例如免疫細胞)之方法，通常藉由抽取血液樣本，自其中分離細胞。隨後，細胞通常經修飾及/或擴增，且隨後向同一個體(在授受性轉移自體(autologous)/自體(autogeneic)細胞之情況下)或不同個體(在授受性轉移同種異體細胞之情況下)投與。授受性細胞轉移通常旨在向個體提供具有某些所需特徵之細胞群體，或增加具有此類特徵之此類細胞在該個體體內的頻率。授受性轉移可以將細胞或細胞群體引入個體中及/或增加個體中細胞或細胞群體之頻率之目的進行。

表現CD30特異性CAR之T細胞的授受性轉移描述於例如Hombach等人 J Immunol (2001) 167:6123-6131、Ramos等人 J. Clin. Invest. (2017) 127(9):3462-3471及WO 2015/028444 A1中，其皆以引用之方式併入上文中。相關技術人員能夠藉由參考此等文獻確定適當的試劑及程序，以根據本發明之方法進行此類細胞之授受性轉移。

本發明提供包含向個體投與包含/表現CD30特異性CAR之T細胞或包含/表現編碼CD30特異性CAR之核酸之T細胞的方法。

在一些實施例中，該等方法包含修飾T細胞以包含/表現CD30特異性CAR。在一些實施例中，該等方法包含修飾T細胞以包含/表現編碼CD30特異性CAR之核酸。

在一些實施例中，該等方法包含： (a)修飾T細胞以表現或包含CD30特異性CAR，或表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸；及 (b)向個體投與經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞。

在一些實施例中，該等方法包含： (a)分離或獲得包含T細胞之免疫細胞(例如PBMC)群體； (b)修飾T細胞以表現或包含CD30特異性CAR，或表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸；及 (c)向個體投與經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞。

在一些實施例中，該等方法包含： (a)自個體分離或獲得包含T細胞之免疫細胞(例如PBMC)群體； (b)修飾T細胞以表現或包含CD30特異性CAR，或表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸；及 (c)向個體投與經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞。

在一些實施例中，自其中分離包含T細胞之免疫細胞(例如PBMC)群體的個體為投與細胞之同一個體(亦即，授受性轉移可具有自體(autologous)/自體(autogeneic)細胞)。在一些實施例中，自其中分離包含T細胞之免疫細胞(例如PBMC)群體的個體為與投與細胞之個體不同的個體(亦即，授受性轉移可具有同種異體細胞)。

在一些實施例中，該等方法可包含以下中之一或多者：自個體獲得血液樣品；自已獲自個體之血液樣品中分離包含T細胞之免疫細胞(例如PBMC)群體；在活體外或離體細胞培養中培養該等免疫細胞；修飾T細胞以表現或包含CD30特異性CAR，或表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸(例如藉由用編碼此類CAR之病毒載體或包含此類核酸之病毒載體轉導)；在活體外或離體細胞培養中培養經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞；收集/分離經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞；將經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞調配成醫藥組合物，例如藉由將細胞與醫藥學上可接受之佐劑、稀釋劑或載劑混合；向個體投與經修飾以表現或包含CD30特異性CAR或經修飾以表現或包含編碼CD30特異性CAR之核酸的T細胞，或包含此類細胞之醫藥組合物。

在一些實施例中，該等方法可另外包含處理細胞或個體以誘導/增強CAR之表現及/或誘導/增強包含/表現CAR之細胞的增殖或存活。

在一些實施例中，血液樣品可藉由靜脈切開放血術或白血球分離術獲得，兩者均為相關技術人員所熟知。藉由靜脈切開放血術獲得之血液樣品的總血量較佳為100 ml至500 ml，例如150 ml至300 ml，例如約200 ml。血液樣品採集較佳在計劃向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞之前的足夠時段進行，以產生足夠數量之表現CD30特異性CAR之T細胞以用於向個體投與之劑量。在一些實施例中，在計劃向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞之前的6至8週獲得血液樣品。

在本發明之方法中，表現CD30特異性CAR之T細胞係在已向個體投與淋巴球耗竭化學療法之後向個體投與。

在一些實施例中，在完成淋巴球耗竭化學療法之療程，例如本文所描述之淋巴球耗竭化學療法之療程之後的指定時段內，向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞。亦即，根據本發明之淋巴球耗竭化學療法之投與，在投與化學治療劑之最後一劑之日後的指定時段內，向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞。

在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞在本文所描述之淋巴球耗竭化學療法之療程完成的1至28天，例如1至21天、1至14天、1至7天、2至7天、2至5天、或3至5天中之一者內向個體投與。在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞在本文所描述之淋巴球耗竭化學療法之療程完成的2至14天內向個體投與。在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞在本文所描述之淋巴球耗竭化學療法之療程完成的3至5天內向個體投與。

CAR-T 細胞之 劑量根據本發明方法之細胞及化學治療劑之投與較佳係以「治療有效」量，此足以展示對個體之治療益處。

表現CD30特異性CAR之T細胞之投與可藉由靜脈內輸注投與。可以含有0.5至6 × 10 ⁷個細胞/毫升，例如1至3 × 10 ⁷個細胞/毫升之體積投與。

本發明之方法通常包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分(或該劑量之第二部分)在第二時間點投與，其中第一時間點及第二時間點相隔2至4天。

本發明之方法可包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量在兩個單獨時間點之間分開，且其中該等時間點相隔2至4天。

對「劑量」之提及可指每次治療應投與的細胞之總量。因此，各「治療」可涉及一個劑量，且該劑量可在複數個時間點之間分開，或在複數個時間點投與，或作為複數個「部分」在複數個時間點投與。舉例而言，「部分」可被稱為第一部分及第二部分，或稱為第一部分及剩餘部分。因此，各「劑量」可分成複數個子劑量、部分劑量或劑量之投與。

每次治療應投與的細胞之總量亦可稱為「總劑量」。因此，各「治療」可涉及一個總劑量。總劑量可包含可在複數個時間點投與之第一劑量及第二劑量。

因此，術語「劑量」或「總劑量」可用於指治療適用量或細胞數目，而非在單日之單次投與中投與的細胞數目。

對劑量「分開」之提及可係指分成兩個部分向個體投與的劑量或總劑量。舉例而言，劑量或總劑量之50%可在第0天投與，且劑量或總劑量之剩餘50%可在第2、3或4天投與。或者，劑量或總劑量之40-60%可在第0天投與，且劑量或總劑量之剩餘40-60%可在第2、3或4天投與。在一些實施例中，劑量或總劑量之40-60%在第0天投與，且劑量或總劑量之剩餘40-60%在第3天投與。

對時間點「相隔2天」之提及可意謂例如一個時間點(或第一時間點)在第0天且下一時間點(或第二時間點)在第2天。對時間點「相隔3天」之提及可意謂例如一個時間點(或第一時間點)在第0天且下一時間點(或第二時間點)在第3天。對時間點「相隔4天」之提及可意謂例如一個時間點(或第一時間點)在第0天且下一時間點(或第二時間點)在第4天。

對第一劑量及第二劑量「相隔2天」投與之提及可意謂第一劑量在第0天投與且第二劑量在第2天投與。對第一劑量及第二劑量「相隔3天」投與之提及可意謂第一劑量在第0天投與且第二劑量在第3天投與。對第一劑量及第二劑量「相隔4天」投與之提及可意謂第一劑量在第0天投與且第二劑量在第4天投與。

對「相隔2天」、「相隔3天」及「相隔4天」等之提及可意謂時間點為該天(亦即該天之24小時時段內)之任何時間(或劑量在該天(亦即該天之24小時時段內)之任何時間投與)。舉例而言，第一劑量可在第0天之任何時間投與，且第二劑量可在第2、3或4天之任何時間投與。

本發明之方法可包含向個體投與總劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中第一劑量及第二劑量相隔2至4天投與。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量相隔3天投與。

在一些實施例中，劑量之第一部分的表現CD30特異性CAR之T細胞在第一時間點投與，且劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中第一時間點與第二時間點相隔2至4天。在一些實施例中，劑量之第一部分及劑量之剩餘部分相隔3天投與。

在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞以4 × 10 ⁷個細胞/m ²至4 × 10 ⁸個細胞/m ²，例如4 × 10 ⁷個細胞/m ²、1 × 10 ⁸個細胞/m ²或4 × 10 ⁸個細胞/m ²中之一者之劑量或總劑量投與。在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞以4 × 10 ⁷個細胞/m ²之劑量或總劑量投與。在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞以4 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量或總劑量投與。

因此，在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞以4 × 10 ⁷個細胞/m ²之劑量向個體投與，其中該劑量在兩個單獨時間點之間分開，其中2 × 10 ⁷個細胞/m ²在第一時間點投與且2 × 10 ⁷個細胞/m ²在第二時間點投與。

在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞以1 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量向個體投與，其中該劑量在兩個單獨時間點之間分開，其中5 × 10 ⁷個細胞/m ²在第一時間點投與且5 × 10 ⁷個細胞/m ²在第二時間點投與。

在一些實施例中，表現CD30特異性CAR之T細胞以4 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量向個體投與，其中該劑量在兩個單獨時間點之間分開，其中2 × 10 ⁸個細胞/m ²在第一時間點投與且2 × 10 ⁸個細胞/m ²在第二時間點投與。

對表現CD30特異性CAR之T細胞在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天等投與之提及應解釋為意謂其在第0天、第1天、第2天、第3天或第4天之任何時間投與。

本發明提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，該方法包含在第0天投與50%之劑量的表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²且在第2、3或4天投與50%之劑量的表現CD30特異性CAR之T細胞。

本發明亦提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，該方法包含在第0天投與2 × 10 ⁷至2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²且在第2、3或4天投與2 × 10 ⁷至2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞。

本發明亦提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，該方法包含在第0天投與2 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²且在第2、3或4天投與2 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞。

本發明亦提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，該方法包含在第0天投與5 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²且在第2、3或4天投與5 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞。

本發明亦提供一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，該方法包含在第0天投與2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²且在第2、3或4天投與2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞。

可提供多個(例如2、3、4或更多個)劑量或總劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞。多個劑量可由預定時間間隔分隔開，其可選擇為以下中之一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多個小時或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或1、2、3、4、5或6個月。可基於個體對治療之反應及/或表現CD30特異性CAR之T細胞之可用性來作出再投與一或多個劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞的決定。

在一些實施例中，本發明之方法可包含其他治療性或預防性干預，例如額外化學療法、免疫療法、放射療法、手術、疫苗接種及/或激素療法。此類其他治療性或預防性干預可在投與根據本發明方法之淋巴球耗竭化學療法或表現CD30特異性CAR之T細胞之前、期間及/或之後進行，且可經由相同或不同投與途徑進行。

額外化學療法可使用化學實體，例如小分子醫藥、抗生素、DNA嵌入劑、蛋白質抑制劑(例如激酶抑制劑)或生物製劑，例如抗體、抗體片段、適體、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白質。藥物可調配為醫藥組合物或藥劑。調配物可包含一或多種藥物(例如一或多種活性劑)以及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。放射療法可使用電離輻射，例如使用X射線或γ射線之放射療法。

在投與根據本發明態樣之淋巴球耗竭化學療法及/或表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之前，個體可投與橋接療法。橋接療法可在血液樣品採集之後且在投與淋巴球耗竭化學療法之前向個體投與。橋接療法為經設計以使個體能夠完成根據本發明方法之治療的療法。投與橋接療法之決定係由開業醫師判斷及控制。橋接療法可包含向個體投與類固醇、化學療法、姑息性輻射療法、免疫檢查點抑制劑或抗CD30抗體中之一或多者。

在投與根據本發明方法之淋巴球耗竭化學療法之前，橋接療法之後可為清除期。清除期確保在根據本發明之淋巴球耗竭化學療法投與第一劑量之淋巴球耗竭化學治療劑之前自與橋接療法相關之毒性充分恢復。適當的清除期取決於所使用之特定橋接療法。在投與類固醇作為橋接療法的情況下，清除期可為1週。在投與化學療法作為橋接療法時，清除期可為3週。在投與姑息性輻射療法作為橋接療法時，清除期可為2週。在投與免疫檢查點抑制劑作為橋接療法時，清除期可為3週。在投與抗CD30抗體作為橋接療法的情況下，清除期可為8週。

根據本發明之治療方法之特定例示性實施例描述於下文中。

在一些實施例中，該方法包含： (i)向個體投與每天30 mg/m ²之劑量的氟達拉濱及每天500 mg/m ²之劑量的環磷醯胺，持續3個連續日， (ii)在最後一天投與氟達拉濱及環磷醯胺之後2至5天(例如2天)，以2 × 10 ⁷個細胞/m ²之劑量向個體投與第一劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞，及 (iii)在第一劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞之後2至4天(例如3天)，以2 × 10 ⁷個細胞/m ²之劑量向個體投與第二劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (i)向個體投與每天30 mg/m ²之劑量的氟達拉濱及每天500 mg/m ²之劑量的環磷醯胺，持續3個連續日，及 (ii)在最後一天投與氟達拉濱及環磷醯胺之後2至5天(例如2天)，以5 × 10 ⁷個細胞/m ²之劑量向個體投與第一劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞， (iii)在第一劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞之後2至4天(例如3天)，以5 × 10 ⁷個細胞/m ²之劑量向個體投與第二劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (i)向個體投與每天30 mg/m ²之劑量的氟達拉濱及每天500 mg/m ²之劑量的環磷醯胺，持續3個連續日，及 (ii)在最後一天投與氟達拉濱及環磷醯胺之後2至5天(例如2天)，以2 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量向個體投與第一劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞， (iii)在第一劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞之後2至4天(例如3天)，以2 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量向個體投與第二劑量之表現CD30特異性CAR之T細胞。

個體根據本發明態樣之個體可為任何動物或人類。個體較佳為哺乳動物，更佳為人類。個體可為非人類哺乳動物，但更佳為人類。個體可為患者。個體可為雄性或雌性。個體可為成年個體(年齡≥18歲)、兒科個體(年齡≤18歲)或青少年個體(年齡≥12且≤21歲；例如早期青少年(年齡≥12且≤14歲)、中期青少年(年齡≥15且≤17歲)或後期青少年(年齡≥18且≤21歲))。個體之年齡可≤75歲。

個體可患有CD30陽性癌症(例如根據本文所描述之實施例的CD30陽性癌症)。個體可患有CD30陽性腫瘤。個體可能已確定為患有CD30陽性癌症，可能已診斷患有CD30陽性癌症，可能疑似患有CD30陽性癌症，或可能有罹患CD30陽性癌症之風險。在一些實施例中，可基於確定個體患有CD30陽性癌症來選擇個體根據本發明之方法進行治療。根據修訂版反應評定準則：Lugano分類(描述於例如Cheson等人, J Clin Oncol (2014) 32: 3059-3068中，其特此以全文引用之方式併入)，個體可具有至少一個可量測之病灶。

個體可為在癌症之治療後復發的個體。個體可能對癌症之治療(例如癌症之一線療法)有反應，但癌症可能隨後重新出現/進展，例如在緩解期後。

個體可為對癌症之治療無反應之個體。個體可能對癌症之治療(例如癌症之一線療法)無反應。個體可能對癌症之治療(例如癌症之一線療法)沒有表現出部分或完全反應。

相對於衍生根據本發明方法投與之表現CD30特異性CAR之T細胞的細胞來源，個體可為自體(autogeneic)/自體(autologous)的。投與表現CD30特異性CAR之T細胞的個體可為獲得血液樣品或細胞以產生表現CD30特異性CAR之T細胞的同一個體。投與表現CD30特異性CAR之T細胞的個體可能在基因上與獲得血液樣品或細胞以產生表現CD30特異性CAR之T細胞的個體相同。投與表現CD30特異性CAR之T細胞的個體可包含編碼MHC/HLA分子之MHC/HLA基因，該等分子與獲得血液樣品或細胞以產生表現CD30特異性CAR之T細胞的個體之MHC/HLA基因編碼的MHC/HLA分子相同。

或者，相對於衍生根據本發明方法投與之表現CD30特異性CAR之T細胞的細胞來源，個體可為同種異體/非自體的。投與表現CD30特異性CAR之T細胞的個體可為與獲得血液樣品或細胞以產生表現CD30特異性CAR之T細胞的個體不同的個體。投與表現CD30特異性CAR之T細胞的個體可能在基因上與獲得血液樣品或細胞以產生表現CD30特異性CAR之T細胞的個體不相同。投與表現CD30特異性CAR之T細胞的個體可包含編碼MHC/HLA分子之MHC/HLA基因，該等分子與獲得血液樣品或細胞以產生表現CD30特異性CAR之T細胞的個體之MHC/HLA基因編碼的MHC/HLA分子相同。

個體相對於根據本發明之干預可為同種異體個體。待根據本發明進行治療/預防之個體可在基因上與衍生表現CAR之病毒特異性免疫細胞之個體不相同。待根據本發明進行治療/預防之個體可相對於衍生表現CAR之病毒特異性免疫細胞之個體為HLA不匹配的。待根據本發明進行治療/預防之個體可相對於衍生表現CAR之病毒特異性免疫細胞之個體而言為HLA匹配的。

根據本發明投與細胞之個體可相對於衍生細胞之來源為同種異體/非自體的。投與細胞之個體可為與獲得細胞以產生待投與之細胞的個體不同的個體。投與細胞之個體可在基因上與獲得細胞以產生待投與之細胞的個體不相同。

藉由根據本發明之治療達成的效果本發明之方法可藉由參考該方法所達成之治療效果及/或臨床結果來表徵。

根據本發明之方法治療個體達成以下治療效果中之一或多者：減少個體中CD30陽性癌細胞之數目；減小個體中CD30陽性腫瘤/病灶之尺寸；抑制(例如預防或減緩)個體中CD30陽性癌細胞之生長；抑制(例如預防或減緩)個體中CD30陽性腫瘤/病灶之生長；抑制(例如預防或減緩) CD30陽性癌症之發展/進展(例如至晚期或轉移)；降低個體之CD30陽性癌症之症狀的嚴重程度；增加個體之存活期(例如無進展存活期或總存活期)；減少個體中CD30陽性癌細胞之數目或活性的相關因素；及/或降低個體中之CD30陽性癌症負荷。

可根據修訂版反應評定準則：Lugano分類(描述於例如Cheson等人, J Clin Oncol (2014) 32: 3059-3068中，其以引用之方式併入上文)評估個體，以便確定其對治療之反應。在一些實施例中，根據本發明之方法治療個體達成以下中之一者：完全反應、部分反應或穩定疾病。

本發明之方法可藉由參考在群體層面上達成的效果/觀察到的反應來表徵。亦即，在一些實施例中，本發明之方法可藉由參考在向多於一個個體，例如個體群體投與治療時達成的效果/觀察到的反應來表徵。個體群體可包含2個或更多個，例如5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個中之一者或更多個個體。

在群體層面上達成的效果/觀察到的反應可依據顯示給定臨床結果(例如完全反應、部分反應、總反應(完全反應 + 部分反應)、穩定疾病、進展性疾病)之治療個體的比例(例如百分比)來表示。顯示給定臨床結果之治療個體的比例可稱為臨床結果之「比率」。藉助於說明，顯示對治療之完全反應之個體的百分比可稱為完全反應率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成50%或更高，例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%中之一者或更高的總反應率(亦即完全反應加上部分反應)，或100%的總反應率。在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成70%或更高，例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%或81%中之一者或更高的總反應率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成50%或更高，例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%中之一者或更高的完全反應率，或100%的完全反應率。在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成70%或更高，例如71%、72%、73%、74%或75%中之一者或更高的完全反應率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成50%或更低，例如45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%中之一者或更低的進展性疾病率，或0%的進展性疾病率。在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成30%或更低，例如29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%或13%中之一者或更低的進展性疾病率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成20%或更高，例如25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%中之一者或更高的1年無進展存活率，或100%的1年無進展存活率。在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成40%或更高，例如41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%或57%中之一者或更高的完全反應率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成1個月或更長時間，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月中之一者或更長時間的中位無進展存活期。在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成9個月或更長時間，例如10、11、12或13個月中之一者或更長時間的中位無進展存活期。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成90%或更高，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之一者或更高的1年總存活率，或100%的1年總存活率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成6個月或更長時間，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月中之一者或更長時間的中位總存活期。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成20%或更高，例如25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%中之一者或更高的1年持續反應率(例如在達成完全反應或部分反應之個體中)，或100%的1年持續反應率。

在一些實施例中，根據本發明之方法的治療達成1個月或更長時間，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月中之一者或更長時間的中位反應持續時間(例如在達成完全反應或部分反應之個體中)。

在本發明之實施例中，治療效果及臨床結果可藉由參考根據參考方法之治療所達成之效果/結果(例如臨床反應)來表徵。參考方法可為包含向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞的方法。

在一些實施例中，參考方法可包含在無淋巴球耗竭化學療法之先前投與的情況下藉由投與表現CD30特異性CAR之T細胞(例如以2 × 10 ⁷個細胞/m ²、1 × 10 ⁸個細胞/m ²或2 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量)來進行治療。在一些實施例中，參考方法可包含如Ramos等人, J Clin Invest. (2017) 127(9):3462-3471中所描述，或根據針對NCT01316146所描述之干預，藉由向個體投與表現CD30特異性CAR之T細胞來治療CD30陽性癌症(複製如下)：藥物： CAR.CD30 T 細胞三個劑量水準：組1，2×10^7個細胞/m^2 組2，1×10^8個細胞/m^2 組3，2×10^8個細胞/m^2；細胞投與：藉由經1至10分鐘之靜脈內注射經由周邊導管或中央導管給與CAR+活化T淋巴球。預期體積=1至50 cc。

在一些實施例中，參考方法可包含藉由投與包含投與氟達拉濱及環磷醯胺(例如以每天30 mg/m ²之劑量的氟達拉濱及每天500 mg/m ²之劑量的環磷醯胺，持續三個連續日)之淋巴球耗竭化學療法且隨後(例如在淋巴球耗竭化學療法之療程完成之2至14天內)投與表現CD30特異性CAR之T細胞(例如以2 × 10 ⁷個細胞/m ²、1 × 10 ⁸個細胞/m ²或2 × 10 ⁸個細胞/m ²之劑量)來進行治療。在一些實施例中，參考方法可包含如Ramos等人, Biol Blood Marrow Transplant 25 (2019) S7-S75, 摘要79中所描述，或根據針對NCT02917083所描述之干預來治療CD30陽性癌症(複製如下)：基因： CAR T 細胞三個劑量水準。各患者根據以下給藥時程接受CAR經修飾T細胞之一次輸注：劑量水準1：2×10^7個細胞/m ²。劑量水準2：1×10^8個細胞/m ²。劑量水準3：2×10^8個細胞/m ²。藥物： 環磷醯胺近期並未處於自體移植後之患者將接受三次日劑量之環磷醯胺(Cy：每天500 mg/m ²)，在T細胞輸注前至少48小時完成，但不遲於細胞輸注前2週。其他名稱：癌得星(Cytoxan) 藥物： 氟達拉濱並未處於自體移植後之患者將接受氟達拉濱(Flu：每天30 mg/m ²)，在T細胞輸注前至少48小時完成，但不遲於細胞輸注前2週。

與根據參考方法之治療相比，根據本發明方法之治療可能與改良之治療效果及/或改良之臨床結果相關。

根據本發明之方法的治療可達成以下中之一或多者：與根據參考方法之治療相比，較大程度減少個體中CD30陽性癌細胞之數目、較大程度減小個體中CD30陽性腫瘤/病灶之尺寸、較大程度抑制個體中CD30陽性癌細胞之生長、較大程度抑制個體中CD30陽性腫瘤/病灶之生長、較大程度抑制CD30陽性癌症之發展/進展(例如至晚期或轉移)、較大程度降低個體之CD30陽性癌症之症狀的嚴重程度、較大程度增加個體之存活期(例如無進展存活期或總存活期)、較大程度減少個體中CD30陽性癌細胞之數目或活性的相關因素及/或較大程度降低個體中之CD30陽性癌症負荷。

「較大程度」減少/抑制/增加可為高於根據參考方法之治療所達成之減少/抑制/增加水準之1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍中之一者的減少/抑制/增加。

減少/抑制可達到小於根據參考方法之治療所達成之水準之1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍的水準。

增加可達到高於根據參考方法所達成之水準之1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍中之一者的水準。

在一些實施例中，與根據參考方法之治療相比，根據本發明之方法的治療與改良之臨床結果(例如臨床反應)相關。

根據本發明之方法的治療可達成以下中之一或多者：與根據參考方法之治療相比，增加之總反應(亦即完全反應加上部分反應)率、增加之完全反應率、降低之進展性疾病率、增加之1年無進展存活率、增加之中位無進展存活期、增加之1年總存活率、增加之中位總存活期、增加之1年持續反應率或增加之中位反應持續時間。

「增加之」比率/中位數可為高於根據參考方法所達成之比率/中位數之1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍中之一者的比率/中位數。

「降低之」比率可為小於根據參考方法之治療所達成之比率之1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍的比率。

與根據參考方法之治療相比，根據本發明之方法的治療可能與顯示不良事件之個體比例降低有關。

與根據參考方法之治療相比，根據本發明之方法的治療可能與顯示以下中之一或多者的個體比例降低有關：淋巴球減少症、白血球減少症、嗜中性白血球減少症、血小板減少症、貧血、低白蛋白血症、低鈉血症、呼吸困難、皮疹、頭痛、咽炎、肺部感染、細胞介素釋放症候群、第28天出現3/4級嗜中性白血球減少症、第28天出現3/4級血小板減少症、第28天出現3/4級貧血、長期3/4級嗜中性白血球減少症(例如在第3個月)、長期3/4級血小板減少症(例如在第3個月)或長期3/4級貧血(例如在第3個月)。

序列一致性為了確定兩個或更多個胺基酸或核酸序列之間的一致性百分比，可以熟習此項技術者已知的各種方式進行成對及多序列比對，例如使用公開可用的電腦軟體，諸如ClustalOmega (Söding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960)、T-coffee (Notredame等人 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217)、Kalign (Lassmann及Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298))及MAFFT (Katoh及Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780)軟體。當使用此類軟體時，較佳使用預設參數，例如空位罰分及延伸罰分。

序列

SEQ ID NO:	描述	序列
1	人類CD30同功異型物1 (UniProt: P28908-1, v1)	MRVLLAALGLLFLGALRAFPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
2	人類CD30同功異型物2 (UniProt: P28908-2)	MSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
3	人類CD30同功異型物3 (UniProt: P28908-3)	MFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
4	人類CD30信號肽	MRVLLAALGLLFLGALRA
5	人類CD30胞外域	FPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAG
6	人類CD30跨膜域	PVLFWVILVLVVVVGSSAFLL
7	人類CD30細胞質域	CHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
8	HRS3 HC-CDR1	GYTFTTYT
9	HRS3 HC-CDR2	INPSSGCS
10	HRS3 HC-CDR3	ARRADYGNYEYTWFAY
11	HRS3 LC-CDR1	QNVGTN
	HRS3 LC-CDR2	SAS
13	HRS3 LC-CDR3	QQYHTYPLT
14	HRS3 VH	QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRRRPGHDLEWIGYINPSSGCSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSS
15	HRS3 VL	VIELTQSPKFMSTSVGDRVNVTYKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIK
16	G ₄S	GGGGS
17	HRS3 scFv連接子	SGGGSGGGGSGGGGS
18	HRS3 scFv	QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRRRPGHDLEWIGYINPSSGCSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSVIELTQSPKFMSTSVGDRVNVTYKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIK
19	HRS3抗原決定基	ATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDC
20	人類CD28跨膜域	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFII
21	人類CD3ζ跨膜域	LCYLLDGILFIYGVILTALFL
22	人類CD8α跨膜域	IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
	ITAM共有序列	YXXL/I 其中X = 任何胺基酸
	較大ITAM共有序列	YXXL/I(X) _6-8YXXL/I 其中X = 任何胺基酸
25	人類CD3ζ胞內域	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
26	人類CD28胞內域	FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
27	具有突變lck結合位點之人類CD28胞內域	FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQAYAAARDFAAYRS
28	CAR信號傳導域1	FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
29	人類IgG1 CH1-CH2鉸鏈區	EPKSCDKTHTCP
30	人類IgG1 CH1-CH2鉸鏈區C103P變異體	EPKSPDKTHTCP
31	人類IgG1 CH2-CH3鉸鏈區	PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
32	人類IgG1 CH2-CH3鉸鏈區變異體	PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK
33	CAR鉸鏈區	EPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
34	信號肽1	MDFQVQIFSFLLISASVIMS
35	CD30.CAR (不含信號肽)	QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRRRPGHDLEWIGYINPSSGCSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSVIELTQSPKFMSTSVGDRVNVTYKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
36	CD30.CAR (具有信號肽)	MDFQVQIFSFLLISASVIMSRMAQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRRRPGHDLEWIGYINPSSGCSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSVIELTQSPKFMSTSVGDRVNVTYKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

實例在以下實例中，本發明人描述CD30.CAR-EBVST之產生、T細胞中之CD30表現之動力學以及使用其中採用淋巴球耗竭化學療法及表現CD30特異性CAR之T細胞之授受性轉移的方法對CD30陽性癌症之治療。

實例 1 - 編碼 CAR 構築體之反轉錄病毒之產生

構築體名稱	CAR 域	經編碼CAR 之胺基酸序列
[1] CD30-CAR	HRS3 scFv/hIgG1鉸鏈/hIgG1 Fc/CD28 TMD/CD28 ICD/CD3ζ ICD	SEQ ID NO:35

藉由將編碼CAR之cDNA選殖至pSFG-TGFbDNRII反轉錄病毒主鏈(ATUM，Newark，CA)中來製備編碼CD30.CAR構築體之反轉錄病毒。

使用聚乙烯亞胺(PEI)將攜有CD30.CAR序列之質體pSFG_CD30CAR轉染至HEK 293 Vec-RD114細胞中。隨後，使用來自經轉染細胞之細胞培養物上清液來以5 × 10 ⁵個細胞/6孔盤之孔之密度轉導HEK 293Vec-Galv細胞(BioVec Pharma，Quebec，Canada)。

以胰蛋白酶處理293Vec-Galv_CD30-CAR細胞，且使細胞以2 × 10 ⁶個細胞/毫升之濃度再懸浮於15 ml管中。進行兩次連續稀釋，且將1.65 ml最終細胞懸浮液稀釋且與220 ml DMEM + 10% FCS混合。將兩百微升此懸浮液轉移至96孔盤之孔中，從而產生30個細胞/盤。接著，選擇且使用表現最佳之純系來產生含反轉錄病毒上清液。隨後，收集含反轉錄病毒上清液，將其過濾且儲存於-80℃下直至使用為止。

實例 2 - 來自健康供體個體之 CD30.CAR-EBVST 之產生在GMP設施中製造CD30.CAR EBVST。在獲得知情同意之後且根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)所確立之準則自七個健康的經血庫批准之供體收集約250至400 mL血液。

藉由密度梯度離心自血液分離周邊血液單核細胞(PBMC)。藉由使用與磁珠結合之臨床級抗CD45RA抗體且使用及Miltenyi耗竭管柱(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)進行磁性細胞分離來耗竭PBMC之表現CD45RA之細胞。

將1.5-2.5 × 10 ⁷個CD45RA陽性細胞耗竭之PBMC接種於G-Rex10容器中之30 ml含有47.5%先進RPMI、47.5%克里克氏(EHAA)培養基(Irvine Scientific)、2 mM L-麩醯胺酸(Thermo Fisher Scientific)及5%人類血小板溶解物(HPL；Sexton Biotechnologies)且補充有IL-7 (10 ng/ml)及IL-15 (10 ng/ml)之培養基中，且藉由用包含有11個胺基酸重疊且跨越相關抗原之整個蛋白質序列之15聚體胺基酸的重疊肽庫(肽合物)進行刺激來將其活化。自JPT Technologies (Berlin, Germany)獲得對應於EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2a及BNLF2b之肽合物。刺激採用5 ng肽合物/各抗原/1 × 10 ⁶個待刺激之細胞(亦即對於使用2 × 10 ⁷個CD45RA陽性細胞耗竭之PBMC進行之刺激，使用100 ng各肽合物)。將刺激培養物維持在37℃下5% CO ₂氛圍中。

在4至6天之後，如下用來自實例1之編碼CAR之反轉錄病毒來轉導藉由前一段落中所描述之刺激培養物產生的EBVST。使2 ml含反轉錄病毒上清液與150 µg體積為2 ml之載體融合素-1混合，得到4 ml最終體積，且將其在室溫下培育5至30 min。隨後，將反轉錄病毒:載體融合素-1混合物添加至於T75容器中之8.5 ml培養基(描述於前一段落中)中的7-10 × 10 ⁶個細胞中。將培養物維持在37℃下5% CO ₂氛圍中。

在培養第8天與第10天之間，將如前一段落中所描述之藉由轉導產生之1-2 × 10 ⁷個CD30.CAR EBVST轉移至G-Rex100容器中，且藉由以在1:2至1:5範圍內(通常約1:3)之CD30.CAR EBVST:經照射ULCL比率與經照射(在100戈雷下) ULCL (描述於實例2中)一起共培養來對其進行再刺激。ULCL表現EBV抗原及CD30以及其他共刺激分子，且因此提供具有抗原刺激及共刺激之CD30.CAR EBVST，從而誘導CD30.CAR EBVST之穩健增殖而不損失EBV特異性。

在200 ml培養基(描述於5.1部分之第3段中)中建立再刺激培養物，且視需要添加額外培養基。7至12天後，收穫CD30.CAR EBVST且將其冷凍保存以用於後續輸注。

實例 3 - CD30 表現之動力學本發明人研究宿主T細胞中之CD30表現之動力學。

藉由用來自不匹配供體之經照射同種異體多形核細胞進行1、2或3次預致敏而產生來自供體A、B及C之同種異體反應性宿主T細胞。為了評估同種異體不匹配移植物PBMC之重複遇到(稱為預致敏)是否影響宿主T細胞上之CD30表現，隨後將在第二次或第三次預致敏之後剩餘的宿主T細胞與來自用於預致敏之同一供體的移植物PBMC共培養。在共培養24、48及72小時時評估同種異體反應性宿主T細胞上之CD30表現。(n=3個供體對) (圖1)。

圖2A展示在不存在預致敏的情況下在72小時內宿主T細胞中之CD30表現。將未經預致敏之宿主T細胞與其各別不匹配移植物PBMC共培養。觀測到CD4及CD8 T細胞中表現低水準之CD30。圖2B展示經歷2輪預致敏之同種異體反應性宿主T細胞中之CD30表現。將宿主T細胞與其各別不匹配移植物PBMC共培養。觀測到與其未經預致敏之對應物相比，宿主CD4及CD8 T細胞中之CD30表現上調。圖2C展示經歷3輪預致敏之同種異體反應性宿主T細胞中之CD30表現。將宿主T細胞與其各別不匹配移植物PBMC共培養。觀測到與其未經預致敏之對應物相比，CD30表現在宿主CD4及CD8 T細胞中高度表現。用3個供體對進行實驗。總而言之，資料表明，重複暴露於同種異體不匹配移植物PBMC誘導宿主T細胞中之CD30表現之上調。在不存在此類重複暴露於同種異體不匹配移植物PBMC的情況下，宿主T細胞上之CD30表現仍較低。

在第一次刺激之後PBMC內之同種異體反應性T細胞上之CD30的顯著緩慢上調可能係由於以下事實：PBMC內之同種異體反應性T細胞之頻率非常低(中位數小於0.005%) (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.201646826)且無法藉由流式細胞分析技術偵測。然而，隨著同種異體反應性T細胞增殖且在群體內達到較高頻率，其變得可偵測。因此，在同種異體反應性T細胞充分增殖至可利用吾人之分析偵測(約0.1%)之前，無法偵測到CD30。出於此原因，分析當使用CD3及CD28抗體刺激PBMC中之所有T細胞時CD30表現之動力學。此策略顯示CD30在刺激2天內在CD4+及CD8+ T細胞兩者中上調。

圖3及圖4展示經活化T細胞上之CD30表現。圖3：經非組織培養物處理之24孔盤用CD3及CD28抗體塗佈保持過夜。經塗佈之孔用PBS洗滌，且將PBMC以1.0 × 10 ⁶個細胞/孔在補充有10% FBS及1% GlutaMAX之RPMI 1640培養基中進行培養。在指定天數時收穫細胞以用於CD30分析(N=3)。圖4：自PBMC中分選出CD4+及CD8+ T細胞，隨後將1.0 × 10 ⁵個CD4+或CD8+ T細胞與5.0 × 10 ³個經照射之同種異體類淋巴母細胞細胞株(LCL)、5.0 × 10 ³個經照射之HLA陰性ULCL共培養或保持未經刺激。細胞在96孔圓底盤中在補充有10% FBS及1% GlutaMAX之RPMI 1640培養基中進行培養。在指定天數時收穫細胞以用於CD30分析(N=3)。結果顯示CD30直至活化後若干天才表現於T細胞上。與用針對CD3及CD28之抗體廣泛活化的T細胞相比，CD30之表現在同種異體反應性T細胞上更延遲。

綜合而言，結果提供以下科學基本原理：第一劑量之CD30.CAR T細胞將活化同種異體反應性T細胞，該等T細胞將在第3天表現CD30。在表現當天，將輸注第二劑量之CD30.CAR T細胞，且該等T細胞將能夠消除在藉由第一劑量活化之後現表現CD30之同種異體反應性T細胞。CD30.CAR EBVST將以分次劑量輸注，其中第二劑量在第一劑量之後若干(例如2至4)天給與。第一劑量將活化來自患者之同種異體反應性T細胞，基於CD30動力學結果，該等T細胞應在第2至3天表現CD30。將在大約第3天輸注的第二劑量之CD30.CAR EBVST應遇到CD30+同種異體反應性T細胞且消除該等T細胞。

實例 4 - 評估同種異體 CD30 嵌合抗原受體艾司坦 - 巴爾病毒特異性 T 淋巴球 (CD30.CAR-EBVST) 在患有 復發性或難治性 CD30 陽性淋巴瘤之患者中之安全性及活性的 I 期研究研究基本原理：此方案之目的為研究藉助於嵌合抗原受體(CAR)引導至CD30抗原之同種異體T細胞的安全性及抗腫瘤活性。使用EBV特異性T細胞(EBVST)作為同種異體細胞平台。此等細胞為病毒特異性並非同種異體抗原反應性的，且在臨床研究中已顯示產生極少或不產生移植物抗宿主疾病(GvHD) (NCT01316146；Ramos等人, J Clin Invest. (2017) 127(9):3462-3471；NCT02917083；Ramos等人, Biol Blood Marrow Transplant 25 (2019) S7-S75, 摘要79)。由於其表現CD30 CAR，因此其針對CD30+腫瘤之活性應伴隨有針對宿主抗移植物排斥反應(HvG)之抗性，此係因為同種異體反應性宿主T細胞由於同種異體活化而表現CD30。

目標及終點：主要目標：為了評估在淋巴球耗竭化學療法之後，一個劑量之同種異體CD30嵌合抗原受體艾司坦巴爾病毒特異性T淋巴球(CD30.CAR-EBVST)在患有CD30+難治性/復發性霍奇金氏淋巴瘤(HL)或非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)之患者中的安全性。

次要目標：為了量測同種異體CD30.CAR-EBVST細胞在此患者群體中之初步抗腫瘤作用，包括 ● 客觀反應(OR)率(ORR) ● 反應持續時間(DR) ● 穩定疾病(SD)率 ● SD持續時間 ● 無進展存活期(PFS)

研究群體：研究群體包括年齡為12至75歲的患有復發性或難治性CD30陽性霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、ALK陰性退行性T細胞淋巴瘤或其他周邊T細胞淋巴瘤、或ALK陽性退行性T細胞淋巴瘤之成年及兒科患者。

患者可先前已接受自體及/或同種異體幹細胞移植。

研究設計：此為I期劑量遞增試驗，其經設計以評估在淋巴球耗竭化學療法之後同種異體CD30.CAR-EBVST在患有CD30+難治性/復發性HL或NHL之患者中的安全性。

研究治療：淋巴球耗竭化學療法：患者將接受三次日劑量之環磷醯胺(Cy：每天500 mg/m ²)以及氟達拉濱(Flu：每天30 mg/m ²)，在第一次T細胞輸注前至少48小時完成，但不遲於細胞輸注前2週。輸注將遵循醫院/藥房建議給與。然而，在最低限度下，環磷醯胺應歷時1小時輸注且氟達拉濱應歷時30分鐘輸注。

CD30.CAR-T細胞輸注：各患者將根據以下給藥時程接受總劑量之CAR經修飾T細胞(分成相隔2至4天之2次輸注)： ● 劑量水準1：4 × 10 ⁷個CD30.CAR-EBVST細胞 ● 劑量水準2：1 × 10 ⁸個CD30.CAR-EBVST細胞 ● 劑量水準3：4 × 10 ⁸個CD30.CAR-EBVST細胞

CD30.CAR-EBVST細胞將在每次輸注時以一半指定劑量經由IV導管輸注至靜脈中。

*** 本發明包括所描述之態樣及較佳特徵之組合，除非此類組合為明顯不容許或明確避免的。

前述描述中或以下申請專利範圍中或隨附圖式中所揭示的、以其特定形式或根據執行所揭示之功能的方式表現之特徵，或用於根據需要獲得所揭示之結果的方法或製程可單獨地或以此等特徵之任何組合用於以其不同形式實現本發明。

雖然已結合以上所描述之例示性實施例來描述本發明，但在給出本發明時許多等效修改及變化對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。因此，上文闡述之本發明之例示性實施例被認為係說明性而非限制性的。可在不偏離本發明之精神及範疇的情況下作出所描述實施例之多種改變。

為避免任何疑義，出於增強讀者理解的目的提供本文中提供之任何理論解釋。本發明人並不希望由此等理論解釋中之任一者束縛。

本文所用之任何章節標題僅出於組織目的且不應理解為限制所描述主題。

在本說明書通篇，包括隨後的申請專利範圍，除非上下文另有規定，否則詞語「包含(comprise)」及「包括(include)」及變化形式諸如「包含(comprises)」、「包含(comprising)」及「包括(including)」應理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟之群但不排除任何其他整數或步驟或整體或步驟之群。

必須指出，除非上下文另外清楚指定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。範圍可在本文中表示為自「約」一個特定值起及/或至「約」另一特定值。當表述此類範圍時，另一實施例包括自一個特定值起及/或至另一特定值。類似地，當值藉由使用先行詞「約」表示為近似值時，應理解特定值形成另一實施例。與數值有關之術語「約」為視情況存在的，且意謂例如+/-10%。

現將參考隨附圖式論述說明本發明之原理的實施例及實驗，在該等隨附圖式中：圖 1. 用於評定T細胞中之CD30表現的方法之示意圖。藉由用來自HLA不匹配供體之經照射之同種異體多形核細胞進行1、2或3次刺激而產生來自供體A、B及C之同種異體反應性宿主T細胞。為了評估同種異體不匹配移植物PBMC之重複遇到是否影響宿主T細胞上之CD30表現，隨後將在第二次或第三次加強之後剩餘的宿主T細胞與來自用於預致敏之同一供體的移植物PBMC共培養。在共培養24、48及72小時時評估同種異體反應性宿主T細胞上之CD30表現。(n=3個供體對)。圖 2. (A)將未經預致敏之宿主T細胞與其各別不匹配移植物PBMC共培養。觀測到CD4及CD8 T細胞中表現低水準之CD30。(B)經歷2輪刺激之同種異體反應性宿主T細胞與其各別不匹配移植物PBMC共培養。觀測到與其未經預致敏之對應物相比，宿主CD4及CD8 T細胞中之CD30表現上調。(C)經歷3輪刺激之同種異體反應性宿主T細胞與其各別不匹配移植物PBMC共培養。觀測到與其未經預致敏之對應物相比，CD30表現在宿主CD4及CD8 T細胞中高度表現。用3個供體對進行實驗。圖 3. 用針對CD3及CD28之抗體活化的T細胞上之CD30表現。經非組織培養物處理之24孔盤用CD3及CD28抗體塗佈保持過夜。經塗佈之孔用PBS洗滌，且將PBMC以1.0 × 10 ⁶個細胞/孔在補充有10% FBS及1% GlutaMAX之RPMI 1640培養基中進行培養。在指定天數時收穫細胞以用於CD30分析。N=3。圖 4. 同種異體反應性細胞上之CD30表現。自PBMC中分選出CD4+及CD8+ T細胞，隨後將1.0 × 10 ⁵個CD4+或CD8+ T細胞與5.0 × 10 ³個經照射之同種異體類淋巴母細胞細胞株(LCL)、5.0 × 10 ³個經照射之HLA陰性ULCL共培養或保持未經刺激。細胞在96孔圓底盤中在補充有10% FBS及1% GlutaMAX之RPMI 1640培養基中進行培養。在指定天數時收穫細胞以用於CD30分析。N=3。

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Claims

一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。
如請求項1至3中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞對於該個體為同種異體的。
一種消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法，其包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物，其用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞的方法中，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞的組合物的用途，其用以製造用於消除患有CD30陽性癌症之個體中之同種異體反應性T細胞之方法中的藥劑，其中該方法包含向該個體投與一劑量之表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該劑量分成兩個部分在兩個時間點投與，其中該劑量之第一部分在第一時間點投與且該劑量之剩餘部分在第二時間點投與，其中該第一時間點與該第二時間點相隔2至4天。
如請求項4至7中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該方法包含授受性轉移表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞。
如請求項1至8中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞為病毒特異性T細胞。
如請求項9之方法、所使用組合物或用途，其中該等病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus；EBV)具有特異性。
如請求項1至9中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一時間點與該第二時間點相隔3天。
如請求項1至10中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該劑量之50%在該第一時間點投與，且該劑量之50%在該第二時間點投與。
如請求項1至11中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該劑量之50%在第0天投與，且該劑量之50%在第3天投與。
如請求項1至12中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該劑量為約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項1至13中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該劑量為約4 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項1至13中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該劑量為約1 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項1至13中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該劑量為約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與第一劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，且隨後向該個體投與第二劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物，其用於治療CD30陽性癌症之方法中，其中該方法包含向個體投與第一劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，且隨後向該個體投與第二劑量的表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物的用途，其用以製造用於治療CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向個體投與第一劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，且隨後向該個體投與第二劑量的該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。
如請求項18至20中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞對於該個體為同種異體的。
如請求項18至21中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該方法包含授受性轉移表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞。
如請求項18至22中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞為病毒特異性T細胞。
如請求項23之方法、所使用組合物或用途，其中該等病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒具有特異性。
如請求項18至24中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一劑量及該第二劑量相隔3天投與。
如請求項18至25中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一劑量在第0天投與且該第二劑量在第3天投與。
如請求項18至26中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一劑量為約2 × 10 ⁷至約2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項18至27中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第二劑量為約2 × 10 ⁷至約2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項18至28中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項18至29中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約4 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項18至30中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約1 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項18至31中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中包含該第一劑量及該第二劑量之總劑量為約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
一種治療個體之CD30陽性癌症的方法，其包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²之總劑量，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物，其用於治療個體之CD30陽性癌症的方法中，其中該方法包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²之總劑量，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。
一種包含表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的組合物的用途，其用以製造用於治療個體之CD30陽性癌症之方法中的藥劑，其中該方法包含向該個體投與表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，其中該方法包含向該個體投與約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²之總劑量，其中該總劑量包含第一劑量及第二劑量，其中該第一劑量及該第二劑量相隔2至4天投與。
如請求項33至35中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞對於該個體為同種異體的。
如請求項33至36中任一項之方法，所使用組合物或用途，其中該方法包含授受性轉移表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之同種異體T細胞。
如請求項33至37中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞為病毒特異性T細胞。
如請求項38之方法、所使用組合物或用途，其中該等病毒特異性T細胞對艾司坦-巴爾病毒(EBV)具有特異性。
如請求項33至39中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一劑量及該第二劑量相隔3天投與。
如請求項33至40中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一劑量為該總劑量之50%，且該第二劑量為該總劑量之50%。
如請求項33至41中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該第一劑量及該第二劑量為約2 × 10 ⁷至約2 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項33至42中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該總劑量為約4 × 10 ⁷至約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項33至43中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該總劑量為約4 × 10 ⁷個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項33至44中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該總劑量為約1 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項33至45中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該總劑量為約4 × 10 ⁸個表現CD30特異性CAR之T細胞/m ²。
如請求項1至46中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中在投與該等表現CD30特異性嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之前，向該個體投與淋巴球耗竭化學療法。
如請求項47之方法、所使用組合物或用途，其中該淋巴球耗竭化學療法包含氟達拉濱(fludarabine)及環磷醯胺。
如請求項47或48之方法、所使用組合物或用途，其中氟達拉濱以每天15至60 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。
如請求項47至49中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中氟達拉濱以每天30 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。
如請求項47至50中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中環磷醯胺以每天250至1000 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。
如請求項47至51中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。
如請求項47至52中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中氟達拉濱以每天30 mg/m ²之劑量向個體投與且環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量向個體投與，持續3個連續日。
如請求項47之方法、所使用組合物或用途，其中該淋巴球耗竭化學療法包含環磷醯胺及苯達莫司汀(bendamustine)。
如請求項54之方法、所使用組合物或用途，其中環磷醯胺以每天250至1000 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。
如請求項54或55之方法、所使用組合物或用途，其中環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。
如請求項54至56中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中苯達莫司汀以每天35至140 mg/m ²之劑量投與，持續2至6個連續日。
如請求項54至57中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中苯達莫司汀以每天70 mg/m ²之劑量投與，持續3個連續日。
如請求項54至58中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中環磷醯胺以每天500 mg/m ²之劑量向個體投與且苯達莫司汀以每天70 mg/m ²之劑量向個體投與，持續3個連續日。
如請求項1至59中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該CD30陽性癌症係選自：血液癌症、實體癌症、造血系惡性疾病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、退行性大細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、未分類型周邊T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、NK-T細胞淋巴瘤、結外NK-T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、未分類型彌漫性大B細胞淋巴瘤、EBV陽性B細胞淋巴瘤、EBV陽性彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、晚期全身性肥大細胞增多症、生殖細胞腫瘤及睾丸胚胎性癌。
如請求項1至60中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該CD30陽性癌症係選自：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、未分類型周邊T細胞淋巴瘤、結外NK-T細胞淋巴瘤、未分類型彌漫性大B細胞淋巴瘤及原發性縱隔大B細胞淋巴瘤。
如請求項1至61中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該個體先前針對該CD30陽性癌症之療法失敗。
如請求項1至62中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該CD30陽性癌症為復發性或難治性CD30陽性癌症。
如請求項1至63中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該等表現CD30特異性CAR之T細胞包含CAR，其包含：(i)特異性結合於CD30之抗原結合域，(ii)跨膜域，及(iii)信號傳導域，其中該信號傳導域包含：(a)來源於CD28之胞內域的胺基酸序列，及(b)包含基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)的胺基酸序列。
如請求項64之方法、所使用組合物或用途，其中該信號傳導域包含與SEQ ID NO:26具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項64或65之方法、所使用組合物或用途，其中該跨膜域來源於CD28之跨膜域。
如請求項64至66中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該跨膜域包含與SEQ ID NO:20具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項64至67中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO:14具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列及與SEQ ID NO:15具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項64至68中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該抗原結合域包含與SEQ ID NO:18具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項64至69中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該信號傳導域包含：(a)來源於CD3ζ之胞內域的胺基酸序列。
如請求項64至70中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該信號傳導域包含與SEQ ID NO:25具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項64至71中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該CAR另外包含提供於該抗原結合域與該跨膜域之間的鉸鏈區。
如請求項72之方法、所使用組合物或用途，其中該鉸鏈區包含與SEQ ID NO:33具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項64至73中任一項之方法、所使用組合物或用途，其中該CAR包含與SEQ ID NO:35或36具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。