WO2020101400A1 - 구아니딘 유도체를 포함하는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

구아니딘 유도체를 포함하는 발모 촉진용 조성물 Download PDF

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WO2020101400A1
WO2020101400A1 PCT/KR2019/015572 KR2019015572W WO2020101400A1 WO 2020101400 A1 WO2020101400 A1 WO 2020101400A1 KR 2019015572 W KR2019015572 W KR 2019015572W WO 2020101400 A1 WO2020101400 A1 WO 2020101400A1
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WO
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hair
pharmaceutical composition
hair growth
composition
compound
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PCT/KR2019/015572
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손명진
정경숙
김성욱
국지애
이홍범
유상희
권유정
문선주
안지원
유재성
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한국생명공학연구원
이뮤노메트테라퓨틱스 인코포레이티드
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    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K8/43—Guanidines
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting hair growth, and more particularly, to a pharmaceutical composition for promoting hair growth comprising a guanidine derivative as an active ingredient.
  • the hair repeats the three-stage cycle of the growing stage (anagen), the catagen (catagen) connected to the disappearance of the hair, and the resting stage (telogen).
  • the number of hairs in the growth phase decreases and the proportion of the degenerative phase and the resting phase increases, the hair falls abnormally and hair loss progresses.
  • various attempts have been made, such as surgical procedures such as hair transplant surgery or drug therapy.
  • the surgical procedure is excellent in terms of effectiveness, but has the disadvantage that the cost is large and the surgical process is difficult, so that the economic and mental burden of the patient is very high.
  • minoxidil described in U.S. Patent No. 4,596,812 which is widely used in drug therapy, was originally used as a therapeutic agent for hypertension, but as a side effect of hair growth was reported, it began to be used as a hair growth promoting agent.
  • minoxidil has been exposed to a number of side effects such as absence of a distinct effect and contact dermatitis such as scalp pruritus, erythema and keratin (Journal of the Korean Medical Association, 56 (1), 45). Accordingly, there is a need to develop a safe therapeutic agent having excellent efficacy in preventing hair loss and promoting hair growth but without side effects.
  • the present inventors completed the present invention by establishing a composition for promoting hair growth or preventing hair loss, treating and improving hair growth, which promotes hair growth and regenerates hair follicles, by using a guanidine derivative having no toxicity as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a cosmetic composition for promoting hair growth or preventing or improving hair loss, which includes guanidine derivative or a cosmetically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a food composition for promoting hair growth, or for preventing or improving hair loss, comprising a guanidine derivative or a food acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a feed composition for promoting hair growth or preventing or improving hair loss, comprising a guanidine derivative or a food-pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the object of the present invention comprises the steps of administering a pharmaceutical composition comprising a guanidine derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to an individual in need thereof, to promote hair growth, or to provide a method for preventing or treating hair loss Is to do.
  • an object of the present invention is to provide a guanidine derivative, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or to promote hair growth of a composition comprising it as an active ingredient, or to prevent or treat hair loss.
  • an object of the present invention is to provide a use for guanidine derivatives, pharmaceutically acceptable salts thereof, or for promoting hair growth of a composition comprising it as an active ingredient, or for preventing or treating hair loss.
  • the composition of the present invention When using the composition of the present invention, compared to the commercialized minoxidil, the effect of promoting hair growth and hair follicle regeneration is excellent.
  • the composition of the present invention has superior hair growth promoting efficacy compared to the conventional guanidine derivative, and thus can be usefully used in various fields such as pharmaceutical, food, feed, and cosmetic compositions for promoting hair growth or preventing hair loss, treatment and improvement, etc. have.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of promoting a series of guanidine derivative compounds on reprogramming from mouse embryonic fibroblasts to iPSC.
  • FIG. 3 is a diagram showing the effect of promoting a series of guanidine derivative compounds on reprogramming from human foreskin fibroblasts to iPSC.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of promoting a series of guanidine derivative compounds on the maintenance of stem cell function of human embryonic stem cells.
  • Figure 5a is a visual confirmation of the growth effect of hair according to the IM compound treatment in mice.
  • Figure 5b is a graph showing the growth effect of hair according to the IM compound treatment in mice.
  • Figure 6a shows the results of confirming the effect on the hair follicle cycle according to the IM compound treatment through H & E staining in the longitudinal section of the mouse skin.
  • Figure 6b shows the change in the hair follicle cycle according to the IM compound treatment.
  • Figure 6c shows the results confirmed by H & E staining in the cross-section of the mouse skin, the effect on the hair follicle cycle according to the IM compound treatment.
  • Figure 6d confirms the effect of increasing the number of hair follicles according to the IM compound treatment.
  • FIG. 7A shows the expression levels of K15, ⁇ -catenin and Ki67 on the 7th day of IM compound treatment.
  • Figure 7b shows the results of FACS analysis of K15 / ⁇ -catenin and Ki67 / Shh on day 7 of IM compound treatment.
  • Figure 7c shows the results of histochemical analysis of K15, ⁇ -catenin and Shh on the 20th day of IM compound treatment.
  • Figure 7d shows the results of FACS analysis of K15 / ⁇ -catenin and Ki67 / Shh on the 20th day of IM compound treatment.
  • Figure 8a shows the results of comparing the histochemical analysis of K15, PDK, Ki67 and PDH on the 7th day of IM compound and minoxidil treatment.
  • Figure 8b shows the results of comparing the histochemical analysis of K15, PDK, Ki67 and PDH on the 20th day of IM compound and minoxidil treatment.
  • Figure 8c shows the results of comparing FACS analysis of K15 / PDK and Ki67 / PDH on day 7 of IM compound and minoxidil treatment.
  • Figure 8d shows the IM compound and minoxidil treatment, OXPHOS-related enzymes ( NDUS3 and ATP5B ), glycolysis-related enzymes ( HK2 and LDHA ) and stem cell function-related genes ( Wnt1a , Lef- 1 , Gli-1 and Bercy) The results of comparing the expression level of the cell ) are shown.
  • 9 is a visual confirmation of the growth effect of hair according to the IM compound treatment in mice.
  • FIG. 10 visually confirms the growth effect of hair according to the IM compound treatment in female mice.
  • Figure 11a is visually confirmed the growth effect of hair according to the IM compound treatment in male mice.
  • 11B is a visual confirmation of the growth effect of hair according to the IM compound treatment in male mice.
  • Figure 12a shows the results of histochemical analysis of K15, PDK, Ki67 and PDH on the 20th day of IM compound treatment.
  • Figure 12b shows the results of comparing FACS analysis of K15 / PDH and Ki67 / PDK on the 20th day of IM compound and minoxidil treatment.
  • Figure 13a is a visual comparison of the growth effect of hair according to the treatment of IM compound and metformin in mice.
  • 13B is a graph comparing the growth effect of hair according to the treatment of IM compound and metformin in mice.
  • Figure 14a confirms the tissue repair effect of the auricle according to the IM compound treatment.
  • 14B is a graph showing the tissue repair effect of the auricle according to the IM compound treatment.
  • An aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting hair growth or preventing or treating hair loss, comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
  • A is a single bond or -C (NH) -NH-,
  • R 1 is-(CH 2 ) n- , where n is an integer from 1 to 4,
  • R 2 is unsubstituted, or halogen, or C 6 -C 10 aryl substituted with one or more substituents selected from C 1 -C 4 alkyl.
  • the compound may be a compound of Formulas 2 to 4, but is not limited thereto:
  • the compounds of Formulas 2 to 4 are hydrophobic cationic small molecules having a guanidine or biguanide core, and each chemical name is (N-1- (2-methyl) phenethyl biguanide, N-1- (3,4-dichloro) Phenethyl biguanide and 1- (3,4-dimethylphenethyl) guanide In the following examples, each of them is designated as 'IM176OUT05' (or 'IM'), 'IM176OUT04' and 'IM177OUT02'. .
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention promotes reprogramming of animal somatic cells including humans, can maintain stem cell function, and further promotes the progress of the hair follicle cycle to accelerate hair follicle regeneration. And can increase the number of hair follicles, thereby promoting hair growth and preventing or treating hair loss.
  • stem cell function of cells plays an important role in hair growth and / or hair follicle formation, particularly through ⁇ -catenin signaling, and thus it is necessary to impart and maintain stem cell properties to maintain hair growth, hair It is known that it is an element that regulates the regeneration and / or the formation of hair follicles (Nature Cell Biology, 2017, 19: 1017-1027; In vivo, 2019, 33: 1209-1220).
  • guanidine derivative compounds promote reprogramming of somatic cells and can maintain stem cell function of stem cells, and these compounds are hair growth, hair regeneration and / or Or, by controlling the formation of hair follicles, it is possible to promote hair growth and to prevent or treat hair loss. Furthermore, in order to confirm this in more detail, these compounds are applied to the cell level and further to animal models to increase ⁇ -catenin expression in hair follicles, increase the number of hair follicles, and promote the effect of promoting actual hair growth and / or hair growth. Was confirmed.
  • promote hair growth means that hair is generated, and is used to increase the rate and amount of hair production. In addition, it means that the hair follicle function is strengthened, or the hair removal and production cycle is shortened, thereby increasing the number of hairs growing in the hair follicle, and further increasing the number of hair follicles.
  • the pharmaceutical composition may have excellent efficacy in promoting hair growth by shortening the resting period and promoting the entry of the growth phase during hair growth and drop-off cycles compared to minoxidil, which is used as a conventional hair growth promoter.
  • the composition showed no side effects, including skin problems.
  • the pharmaceutical composition may include a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof at a concentration of 1 to 5%, specifically 1 to 4% or 1 to 3% concentration It can contain as.
  • the pharmaceutical composition may promote reprogramming of cells or maintain stem cell function.
  • the pharmaceutical composition may promote regeneration of hair follicles and promote hair growth.
  • the composition is ⁇ -catenin, Shh (sonic hedgehog), HK2 (hexokinase 2), LDHA (lactate dehydrogenase A), NDUS3 (NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 3), ATP5B (ATP synthase subunit) beta), Wnt1a, lymphoid enhancer binding factor 1 (Lef-1), Gli family zinc finger 1 (Gli-1), versican, pyruvate dehydrogenase (PDH) and pyruvate dehydrogenase kinase (PDK) It is possible to increase the expression of one or more substances of choice.
  • the pharmaceutical composition is ⁇ -catenin and Shh mediating regeneration and development of hair follicles, glycolysis-related enzymes HK2 and LDHA, OXPHOS-related enzymes NDUS3 and ATP5B, and stem cell ability involved in hair follicle development- It can increase the expression of related genes Wnt1a, Lef-1, Gli-1 and versican, and it can also increase the expression of PDK, an enzyme that promotes the conversion of glycolysis and mitochondrial OXPHOS. . This may have excellent efficacy in promoting hair growth by promoting the expression of the factors with excellent effect compared to minoxidil used as a conventional hair growth promoter.
  • the pharmaceutical composition may promote expression of hair follicle development-related genes and activate various signals for hair regeneration.
  • by directly stimulating the metabolism of stem cells glycolysis can be promoted, further promoting OXPHOS.
  • the pharmaceutical composition may contribute to active energy metabolism required for hair growth.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount
  • the "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat the disease at a ratio of rational benefit / risk applicable to medical treatment. This depends on the patient's disease type, severity, age, sex, drug activity, sensitivity to the drug, time of administration, rate of administration and release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. Can be determined.
  • the pharmaceutical composition may be administered alone or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., so that the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the term "pharmaceutically acceptable salt” refers to any salt that retains the desired biological and / or physiological activity of these compounds, and that the undesired toxicological effect is minimal. It may be an acid addition salt formed using an organic acid or an inorganic acid, and the organic acid may be, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, butyric acid, isobutyric acid, trifluoroacetic acid, malic acid, maleic acid, malonic acid, fumaric acid, succinic acid, succinic acid Monoamide, glutamic acid, tartaric acid, oxalic acid, citric acid, glycolic acid, glucuronic acid, ascorbic acid, benzoic acid, phthalic acid, salicylic acid, anthranilic acid, dichloroacetic acid, aminooxy acetic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid salts It can contain.
  • the inorganic acid may include, for example, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, carbonic acid and boric acid salts, preferably in the form of hydrochloride or acetate, more preferably in the form of hydrochloride have.
  • composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the composition is sterile or sterile, and such solutions are sterile or sterile and do not cause allergies or other detrimental reactions when applied to water, buffers, isotonic agents or animals or humans, as known to those skilled in the art.
  • Other ingredients may be included.
  • pharmaceutically acceptable carrier includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial agents, antifungal agents and isotonic agents, and the like.
  • the use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art.
  • conventional media or agents that are immiscible with the active ingredient their use in therapeutic compositions is contemplated.
  • supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.
  • the composition may be prepared in a formulation such as a liquid, emulsion, suspension or cream, and may be used parenterally.
  • the amount of the composition may be used as a normal amount for the prevention and treatment of hair loss, and is preferably applied differently according to the age, sex, condition of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the rate of inactivity, and drugs used in combination.
  • the pharmaceutical composition is preferably formulated as a formulation for parenteral administration, and may be formulated and used as an external preparation for skin or a subcutaneous injection for topical hair growth.
  • the external preparation for skin may be formulated as any one selected from the group consisting of creams, gels, patches, sprays, ointments, warning agents, lotions, linen agents, pasta agents and cataplasmas. .
  • the pharmaceutical composition may be used as a subcutaneous injection, and the subcutaneous injection may be injected subcutaneously using a conventional injection needle.
  • hair can be directly injected into a desired site using a microneedle array in which a plurality of microneedles having a size of tens to hundreds of micrometers and lengths of tens to thousands of micrometers are arranged.
  • Another aspect of the present invention provides a cosmetic composition for promoting hair growth or preventing or improving hair loss, comprising the compound of Formula 1 or a cosmetically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may include, for example, hair tonic, hair cream, hair lotion, hair shampoo, hair conditioner, hair conditioner, hair spray, hair pack, hair treatment, soap, eyebrow hair growth agent, eyebrow nutrition agent, eyelash hair growth agent, eyelash nutrition agent, etc. Can be formulated.
  • the cosmetic composition may contain various ingredients blended in a conventional cosmetic composition, such as surfactants, vitamins, preservatives, thickeners, pH adjusting agents, fragrances, pigments according to each formulation.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition for promoting hair growth or preventing or improving hair loss, comprising the compound of Formula 1 or a food-pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the food composition of the present invention can be used as a health functional food.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using ingredients or ingredients having useful functionality for the human body according to the Act on Health Functional Food, and "functional” refers to the structure and function of the human body. This means taking it for the purpose of controlling nutrients or obtaining useful effects for health purposes such as physiological action.
  • the food composition of the present invention may include a conventional food additive, and the suitability as the "food additive” is applicable according to the general rules and general test methods of food additives approved by the Ministry of Food and Drug Safety unless otherwise specified. It is judged according to the standards and standards for items.
  • Items listed in the "Food Additives Revolution” include, for example, chemical additives such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid, natural additives such as chromochromate, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigment, and guar gum, And mixed preparations such as an L-sodium glutamate preparation, an alkali added additive, a preservative preparation, and a tar colorant.
  • chemical additives such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid
  • natural additives such as chromochromate, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigment, and guar gum
  • mixed preparations such as an L-sodium glutamate preparation, an alkali added additive, a preservative preparation, and a tar colorant.
  • the food composition of the present invention may contain a guanidine derivative or a food acceptable salt thereof in an amount of 0.01 to 95% by weight, preferably 1 to 80% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the guanidine derivative contained in the food composition of the present invention or a food acceptable salt thereof may be obtained by the same or similar method as the extraction method mentioned in the preparation of the pharmaceutical composition, but is not limited thereto.
  • the food composition of the present invention may be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. for the purpose of promoting hair growth and / or improving hair loss.
  • the health functional food in the form of a tablet is granulated by a conventional method, a mixture of a guanidine derivative or a food-acceptable salt thereof, an excipient, a binder, a disintegrant, and other additives, and then a lubricant, etc. It can be put into compression molding or the mixture can be directly subjected to compression molding.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a mating agent or the like as necessary, and may be coated with a suitable peeling agent if necessary.
  • hard capsules are prepared by filling ordinary hard capsules with a mixture of powders of guanidine derivatives or food-acceptable salts thereof, and additives such as excipients or granular or peeled granules thereof
  • the soft capsule may be prepared by filling a capsule base such as gelatin with a mixture of an additive such as a guanidine derivative or a food-acceptable salt and excipient thereof.
  • the soft capsule agent may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, and a preservative, if necessary.
  • the health functional food in the form of a ring can be prepared by shaping a mixture of guanidine derivatives or a food-acceptable salt, excipient, binder, disintegrant, etc. in a suitable manner, and peeling it with white sugar or other suitable peeling agent, if necessary. Alternatively, it may be coated with starch, talc or a suitable material.
  • the health functional food in the form of granules may be prepared in the form of a granular mixture of guanidine derivatives or a food-acceptable salt, excipient, binder, disintegrant, etc., and may contain flavoring agents, mating agents, etc. Can be.
  • the granular form of the health functional food is that using No. 12 (1680 ⁇ m), No. 14 (1410 ⁇ m) and No. 45 (350 ⁇ m) sieve, pass the whole No. 12 body and remain in the No. 14 body when performing the next particle size test. 5.0% or less of the total amount, and passing through the 45 body may be 15.0% or less of the total amount.
  • excipients binders, disintegrants, lubricants, mating agents, flavoring agents, etc. are described in the literature known in the art, and may include those having the same or similar functions (Korean Pharmacopoeia Commentary, Munseongsa) , Korean Council for Pharmacy, 5th edition, p33-48, 1989).
  • the type of food is not particularly limited, and examples of foods to which the extract of the present invention can be added include beverages, gums, vitamin complexes, drink agents, etc., and include all health functional foods in the ordinary sense.
  • Another aspect of the present invention provides a feed composition for promoting hair growth, or for preventing or improving hair loss, comprising the compound of Formula 1 or a food acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • feed refers to food that is consumed by animals, and may specifically mean substances that supply the organic or inorganic nutrients necessary to sustain the life of animals or to produce meat, milk, and the like. have.
  • the feed may include feed additives, and may be prepared in various forms known in the art.
  • the type of the feed is not particularly limited, and a feed commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the feed vegetable feed, such as grains, muscles, food processing by-products, algae, fiber, oils, starches, thin or grain by-products;
  • animal feeds such as proteins, inorganics, oils, minerals, oils, single-celled proteins, animal planktons, and food. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the compound of the present invention or a food acceptable salt thereof may be used as a feed additive added to the feed composition.
  • the feed additive may be intended to improve productivity or health of a target animal, but is not limited thereto.
  • the feed additive may correspond to supplementary feed under the feed management method.
  • the feed additive of the present application is additionally mixed with one or more components of organic acids such as citric acid, humic acid, adipic acid, and lactic acid, or natural antioxidants such as polyphenol, catechin, tocopherol, vitamin C, green tea extract, chitosan, and tannic acid.
  • organic acids such as citric acid, humic acid, adipic acid, and lactic acid
  • natural antioxidants such as polyphenol, catechin, tocopherol, vitamin C, green tea extract, chitosan, and tannic acid.
  • Other conventional additives such as buffers and bacteriostatic agents may be added as needed.
  • it can be formulated as a liquid, capsule, granule or tablet as needed.
  • the feed or feed additive may further include substances that exhibit various effects, such as supplementing nutrients and preventing weight loss, improving digestibility of fiber in the feed, improving oil quality, preventing reproduction disorders and improving conception rates, and preventing high-temperature stress in the summer.
  • various protein supplements such as amino acids, inorganic salts, vitamins, antioxidants, antifungals, and microbial agents, and animal protein feeds such as pulverized or crushed wheat, barley, corn, vegetable protein feeds, blood meals, meat meals, and fish meals.
  • main ingredients such as animal fats and vegetable fats, it can be used with nutritional supplements, growth promoters, digestive absorption boosters, and disease preventive agents.
  • the feed and feed additives of the present application can be fed to a number of animals, including mammals and poultry.
  • animals including mammals and poultry.
  • livestock such as cows and goats; It can be used for pets such as dogs and cats, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention comprises the step of administering a pharmaceutical composition comprising a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to an individual in need thereof, promoting hair growth, or preventing or treating hair loss Gives
  • prevention of the present invention means all actions to inhibit or delay the occurrence, spread, and recurrence of hair loss by administration of the composition of the present invention, and “treatment” improves the symptoms by administration of the composition of the present invention, or Any action that is beneficially changed.
  • the term "individual" of the present invention includes monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, mice, rabbits, rabbits or guinea pigs, including humans, who may or may not have such hair loss. Means all animals, and the disease can be effectively prevented or treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in parallel with existing therapeutic agents.
  • administration means providing a predetermined substance to a patient in any suitable way, and the route of administration of the composition of the present invention can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by any device capable of transporting the active substance to target cells.
  • Another aspect of the present invention provides a hair growth promoting or hair loss prevention or treatment use of the compound of Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a composition comprising the same as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the compound of Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a composition comprising the same as an active ingredient for promoting hair growth or for preventing or treating hair loss.
  • Minoxidil was purchased from Hyundai Pharm (Seoul, Republic of Korea) and metformin was obtained from Cayman chemical (Ann Arbor, MI, USA).
  • the chemical structural formula of the guanidine derivative and minoxidil and metformin of the present invention is shown in FIG. 1.
  • Example 1.1 Comparison of reprogramming effects of guanidine derivatives in mouse cells
  • IM176OUT05 (hereinafter referred to as IM) was treated at 10 nM, 20 nM, and 50 nM concentrations, it was confirmed that it exhibits an effect of improving reprogramming with 16.8 times, 13.9 times, and 13.7 times efficiency, respectively, and in the following experiment, Additional efficacy was evaluated using only three compounds that exhibited reprogramming enhancing effects.
  • Example 1.1 From the results of 1.3 to 10, it was confirmed that 10 nM of IM176OUT05 most efficiently improves reprogramming efficiency in the process of generating mouse and human iPSC, and also shows the efficacy of maintaining stem cell function of human embryonic stem cells. In the examples, subsequent studies were performed using the above conditions.
  • the dorsal skin hair is telogen in the hair telogen of a 7 week old C57BL / 6 mouse (Dae han BioLink, Chungbuk, Republic of Korea) using animal clippers and waxes (Veet, Oxy Reckitt Benckiser, Seoul, Republic of Korea). Hair removal. From the next day, daily 200 ⁇ l placebo (control), 1% IM, 1% minoxidil or 1% metformin was applied to the epilated area using a sterile swab. Images of each animal were captured daily, and the degree of darkness of the back part color was quantified in the same area (1.6 x 3 cm) using an Image J program. Mice were sacrificed and skin tissues on days 0, 7, 14 and 20 were obtained. Half of the tissue was used for RNA isolation, and the other half was fixed with 4% paraformaldehyde overnight for histochemical analysis.
  • Example 1.1 After the tissue fixed in Example 1.1. was immersed in 30% sucrose, it was embedded in an OCT compound (Sakura Finetek USA Inc, Torrance, CA, USA). Frozen sections were obtained using a cryostat sectioning (Leica, Wetzlar, Germany) and stained using hematoxylin (Sigma) and eosin (Sigma) (H & E) or the antibodies shown in Table 1 below. Did. Immunohistochemical analysis was performed, and fluorescence images were taken with an Olympus microscope (Olympus).
  • Tissues were digested with trypsin (Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C. for 150 minutes, then filtered with a 75 ⁇ m nylon mesh, followed by 30 ⁇ m mesh (BD Biosciences). Single cells were fixed, permeabilized and blocked according to the immunostaining protocol. Cells were stained with specific antibodies (Table 1 above) and analyzed with BD Accuri TM C6 (BD Biosciences).
  • auricle tissue repair analysis three holes were drilled in each ear with a diameter of 2 mm using a punch instrument (Fine Science Tools, British Columbia, Canada). Daily indicated concentrations of IM were applied with sterile cotton swabs. The hole area was measured with digital calipers (VWR, Radnor, PA, USA).
  • IM compound can promote hair growth without exhibiting toxicity or other side effects.
  • the hair in the resting phase was synchronized by epilation, and various concentrations of IM were applied topically to the dorsal skin of the mice daily.
  • black pigmentation and hair growth were markedly observed at the site where 1% IM was applied (FIG. 9).
  • Example 3.2 Effect of promoting hair follicle regeneration by IM176OUT05 in mice
  • K15 positive hair follicle stem cells express pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), an enzyme that promotes glycolysis, while Ki67-positive proliferating cells strongly express pyruvate dehydrogenase (PDH), an enzyme that responds to mitochondrial OXPHOS. It is said to.
  • PDK expression was detected in K15-positive stem cells of IM-treated mice, but not in control or minoxidil-treated mice (FIG. 8A).
  • the K15 + / PDK + population was not detected in the control or minoxidil-treated mice, but it was confirmed that a single cell of IM-treated mouse skin occupied 5.9% of the cell population ( Figure 8c). Through this, it was confirmed that the IM-treated mice increased the glycolytic stem cell population (K15 + / PDK + ) by at least 6.6 times or more compared to the control group.
  • the level of gene expression related to metabolism and hair regeneration was analyzed through skin tissue of each mouse group.
  • Glycolysis-related enzymes ( HK2 and LDHA ) expression was significantly induced in IM-treated mice on day 7 and significantly increased in both IM- and minoxidil-treated mice on day 20 compared to controls.
  • OXPHOS-related enzymes ( NDUS3 and The expression of ATP5B ) was increased in both IM-treated mice and minoxidil treated mice compared to the control group. This suggests that IM can promote glycolysis in the early stages of hair follicle regeneration, further promoting OXPHOS in later stages, thereby contributing to the active energy metabolism required for hair growth.

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Abstract

본 발명은 모발 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 독성이 없는 구아니딘 유도체를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 또는 탈모 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 모발의 성장을 촉진시키고 모낭을 재생시키는 효과가 우수하여 발모 촉진 또는 탈모 예방, 치료 및 개선을 위한 약학, 식품, 사료 및 화장료 조성물 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

구아니딘 유도체를 포함하는 발모 촉진용 조성물
본 발명은 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 구아니딘 유도체를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.
모발은 성장하는 단계인 성장기(anagen), 모발의 소멸과 연결되는 퇴행기(catagen) 및 성장 정지기인 휴지기(telogen)의 3단계 주기를 반복한다. 성장기의 모발의 수가 감소하고 퇴행기 및 휴지기의 비율이 증가하게 되면 비정상적으로 모발이 빠지게 되어 탈모가 진행되게 된다. 탈모를 치료하기 위한 방법으로서, 모발이식수술과 같은 외과적인 시술방법 또는 약물요법 등 다양한 시도가 이루어지고 있다. 외과적 시술방법은 효과 측면에서는 우수하나, 비용이 막대하고 수술과정이 힘들어 환자의 경제적, 정신적 부담이 매우 크다는 단점이 있다. 또한, 이는 임시적인 처방에 불과하여 근본적인 치료방법이 될 수 없다는 문제점이 있다.
또한, 약물요법에 널리 사용되고 있는 미국등록특허 4,596,812에 기재된 미녹시딜(minoxidil)은 원래 고혈압 치료제로 이용되었으나, 부작용으로 발모 현상이 보고되면서 바르는 발모 촉진제로 이용되기 시작하였다. 그러나, 미녹시딜은 뚜렷한 효과의 부재 및 두피소양증, 홍반, 각질 등의 접촉 피부염과 같은 여러 부작용의 문제가 대두되고 있다(Journal of the Korean Medical Association, 56(1), 45). 이에 따라, 탈모 방지 및 발모 촉진 효능이 우수하면서도 부작용이 없는 안전한 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 독성이 없는 구아니딘 유도체를 유효성분으로 사용함으로써, 모발의 성장을 촉진시키고 모낭을 재생시킬 수 있는 발모 촉진 또는 탈모 예방, 치료 및 개선용 조성물을 확립하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명의 목적은 구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구아니딘 유도체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 발모 촉진, 또는 탈모 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구아니딘 유도체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 발모 촉진, 또는 탈모 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구아니딘 유도체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 치료용 의약품 제조를 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물을 이용할 경우, 상용화된 미녹시딜에 비해 모발의 성장 및 모낭의 재생을 촉진시키는 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 조성물은 종래의 구아니딘 유도체에 비해서도 발모 촉진 효능이 우수하며, 이에 따라 발모 촉진 또는 탈모 예방, 치료 및 개선을 위한 약학, 식품, 사료 및 화장료 조성물 등과 같은 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 구아니딘 유도체의 화학식을 나타낸 것이다.
도 2는 마우스 배아 섬유아세포에서 iPSC로의 리프로그래밍에 대한 일련의 구아니딘 유도체 화합물의 촉진 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 인간 포피 섬유아세포에서 iPSC로의 리프로그래밍에 대한 일련의 구아니딘 유도체 화합물의 촉진 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 인간 배아줄기세포의 줄기세포능 유지에 대한 일련의 구아니딘 유도체 화합물의 촉진 효과를 나타낸 도이다.
도 5a는 마우스에서 IM 화합물 처리에 따른 모발의 성장 효과를 육안으로 확인한 것이다.
도 5b는 마우스에서 IM 화합물 처리에 따른 모발의 성장 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 IM 화합물 처리에 따른 모낭주기에 대한 효과를 마우스 피부의 종단면에서 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 IM 화합물 처리에 따른 모낭주기의 변화를 나타낸 것이다.
도 6c는 IM 화합물 처리에 따른 모낭주기에 대한 효과를 마우스 피부의 횡단면에서 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6d는 IM 화합물 처리에 따른 모낭 개수의 증가 효과를 확인한 것이다.
도 7a는 IM 화합물 처리 7일에, K15, β-카테닌 및 Ki67의 발현 정도를 확인한 것이다.
도 7b는 IM 화합물 처리 7일에, K15/β-카테닌 및 Ki67/Shh의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 IM 화합물 처리 20일에, K15, β-카테닌 및 Shh의 조직화학 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7d는 IM 화합물 처리 20일에, K15/β-카테닌 및 Ki67/Shh의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 IM 화합물 및 미녹시딜 처리 7일에, K15, PDK, Ki67 및 PDH의 조직화학 분석을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 IM 화합물 및 미녹시딜 처리 20일에, K15, PDK, Ki67 및 PDH의 조직화학 분석을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 IM 화합물 및 미녹시딜 처리 7일에, K15/PDK 및 Ki67/PDH의 FACS 분석을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8d는 IM 화합물 및 미녹시딜 처리 시, OXPHOS-관련 효소(NDUS3 및 ATP5B), 해당작용-관련 효소(HK2 및 LDHA) 및 줄기세포능-관련 유전자(Wnt1a, Lef -1, Gli-1 및 베르시칸)의 발현 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 마우스에서 IM 화합물 처리에 따른 모발의 성장 효과를 육안으로 확인한 것이다.
도 10은 암컷 마우스에서 IM 화합물 처리에 따른 모발의 성장 효과를 육안으로 확인한 것이다.
도 11a는 수컷 마우스에서 IM 화합물 처리에 따른 모발의 성장 효과를 육안으로 확인한 것이다.
도 11b는 수컷 마우스에서 IM 화합물 처리에 따른 모발의 성장 효과를 육안으로 확인한 것이다.
도 12a는 IM 화합물 처리 20일에, K15, PDK, Ki67 및 PDH의 조직화학 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12b는 IM 화합물 및 미녹시딜 처리 20일에, K15/PDH 및 Ki67/PDK의 FACS 분석을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a는 마우스에서 IM 화합물 및 메트포민의 처리에 따른 모발의 성장 효과를 육안으로 비교한 것이다.
도 13b는 마우스에서 IM 화합물 및 메트포민의 처리에 따른 모발의 성장 효과를 비교한 그래프이다.
도 14a는 IM 화합물 처리에 따른 귓바퀴의 조직 수복 효과를 확인한 것이다.
도 14b는 IM 화합물 처리에 따른 귓바퀴의 조직 수복 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019015572-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
A는 단일결합 또는 -C(NH)-NH-이고,
R1은 -(CH2)n-이며, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이고,
R2는 비치환, 또는 할로겐, 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 C6-C10 아릴임.
예컨대, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 4의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2019015572-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2019015572-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2019015572-appb-I000004
.
상기 화학식 2 내지 4의 화합물은 구아니딘 또는 비구아나이드 코어를 갖는 소수성 양이온 소분자이며, 각각의 화학명은 (N-1-(2-메틸)펜에틸비구아나이드, N-1-(3,4-디클로로)펜에틸비구아나이드 및 1-(3,4-디메틸펜에틸)구아나이드이다. 이하 실시예에서는 각각을 'IM176OUT05'(또는 'IM'으로 표기), 'IM176OUT04' 및 'IM177OUT02'으로 명명하여 사용한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, 인간을 포함한 동물 체세포의 리프로그래밍을 촉진하며, 줄기세포능을 유지할 수 있고, 나아가 모낭 주기의 진행을 촉진하여 모낭 재생을 가속화하고 모낭수를 증가시킬 수 있으므로 발모를 촉진하고 탈모를 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.
예컨대, 세포의 줄기세포능이, 특히 β-카테닌 신호전달(β-catenin signaling) 과정을 통해, 발모 및/또는 모낭의 형성에 중요한 역할을 하며 따라서 줄기세포성을 부여하고 이를 유지하는 것이 발모, 모발의 재생 및/또는 모낭의 형성을 조절하는 요소임이 알려져 있다(Nature Cell Biology, 2017, 19: 1017-1027; In vivo, 2019, 33: 1209-1220). 이와 관련하여, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 구아니딘 유도체 화합물들이 체세포의 리프로그래밍을 촉진하며, 줄기세포의 줄기세포능을 유지할 수 있음을 확인하였는 바, 이는 이들 화합물이 발모, 모발의 재생 및/또는 모낭의 형성을 조절함으로써 발모를 촉진하고 탈모를 예방 또는 치료하는 효과를 발휘할 수 있음을 나타내는 것이다. 나아가, 이를 보다 구체적으로 확인하기 위해, 이들 화합물을 세포 수준 및 나아가 동물모델에 적용하여 모낭에서 β-카테닌 발현을 증가시키며, 모낭의 수를 늘리고 실제 발모 및/또는 모발의 성장을 촉진하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발모 촉진"이란, 모발이 생성되는 것을 의미하며, 모발 생성 속도 및 생성량을 증가시키는 의미로 사용된다. 또한 모근 기능이 강화되거나, 모발의 탈락 및 생성 주기가 짧아져 모낭에서 자라는 모발의 수가 증가되고, 더 나아가 모낭의 수가 증가되는 것을 의미한다.
상기 약학 조성물은 종래 발모 촉진제로 사용되는 미녹시딜에 비해 모발의 성장 및 탈락주기 중 휴지기를 단축하고 성장기의 진입을 촉진하여 발모 촉진에 탁월한 효능을 가질 수 있다. 또한, 상기 조성물은 피부 문제를 포함하여 어떠한 부작용도 나타내지 않았다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 1 내지 5%의 농도로 포함할 수 있으며, 구체적으로 1 내지 4% 또는 1 내지 3%의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 세포의 리프로그래밍을 촉진하거나 줄기세포능을 유지하도록 할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 모낭의 재생을 촉진하고 모발의 성장을 촉진할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 β-카테닌, Shh(sonic hedgehog), HK2(hexokinase 2), LDHA(lactate dehydrogenase A), NDUS3(NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 3), ATP5B(ATP synthase subunit beta), Wnt1a, Lef-1(lymphoid enhancer binding factor 1), Gli-1(GLI family zinc finger 1), 베르시칸(versican), PDH(pyruvate dehydrogenase) 및 PDK(pyruvate dehydrogenase kinase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 발현을 증가시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 모낭의 재생 및 발달을 매개하는 β-카테닌 및 Shh, 해당작용-관련 효소인 HK2 및 LDHA, OXPHOS-관련 효소인 NDUS3 및 ATP5B, 및 모낭 발달에 관여하는 줄기세포능-관련 유전자인 Wnt1a, Lef-1, Gli-1 및 베르시칸의 발현을 증가시킬 수 있으며, 해당작용의 전환을 촉진시키는 효소인 PDK 및 미토콘드리아 OXPHOS에 반응하는 효소인 PDH의 발현 또한 증가시킬 수 있다. 이는 종래 발모 촉진제로 사용되는 미녹시딜에 비해 우수한 효과로 상기 인자들의 발현을 촉진하여 발모 촉진에 탁월한 효능을 가질 수 있다.
상기 약학 조성물은 모낭 발달 관련 유전자들의 발현을 촉진하고 모발 재생을 위한 여러 가지 신호를 활성화할 수 있다. 또한, 줄기세포의 대사를 직접적으로 자극함으로써 해당작용을 촉진시켜, OXPHOS를 더욱 촉진시킬 수 있다. 이를 통해 상기 약학 조성물은 모발 성장에 필요한 활성 에너지 대사에 기여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 상기 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 이는 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란, 상기 화합물들의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은 예를 들어 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 무기산은 예를 들어 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되거나 무균성이고, 이러한 용액은 멸균되거나 무균성이고, 물, 완충제, 등장제 또는 동물 또는 사람에게 적용할 경우, 알레르기 또는 기타 유해한 반응을 일으키지 않는, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 기타 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제, 항진균제 및 등장제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질용으로 상기 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 기술 분야에 익히 알려져 있다. 활성 성분과 비혼화성인 통상적인 매질 또는 제제 이외에, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충성 활성 성분을 당해 조성물에 혼입시킬 수도 있다.
상기 조성물은 액제, 유제, 현탁제 또는 크림제 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 비경구로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 사용량은 탈모 예방 및 치료에의 통상적인 사용량으로 사용할 수 있고, 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물 등에 따라 달리 적용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 비경구 투여용 제제로 제형화되는 것이 바람직하며, 발모를 원하는 부위에 국부적으로 사용하는 피부외용제 또는 피하주사제로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 피부외용제는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니먼트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 제형화될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 피하주사제로 사용될 수 있으며, 상기 피하주사제는 통상의 주사바늘을 이용하여 피하주사할 수 있다. 또한, 직경이 수십~수백 ㎛, 길이가 수십~수천 ㎛ 크기인 복수개의 미세바늘이 배열되어 있는 미세바늘어레이를 이용하여 발모를 원하는 부위에 직접 주사할 수도 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "화장품학적으로 허용 가능한 염"은 상기 "약학적으로 허용 가능한 염"에 정의된 바와 같다.
상기 화장료 조성물은 예를 들어, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 비누, 눈썹발모제, 눈썹영양제, 속눈썹발모제 및 속눈썹영양제 등으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 각 제형에 따라 계면활성제, 비타민, 방부제, 점증제, pH 조절제, 향료, 색소 등 통상의 화장료 조성물에 배합되는 각종 성분들을 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "식품학적으로 허용 가능한 염"은 상기 "약학적으로 허용 가능한 염"에 정의된 바와 같다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명의 식품 조성물에 함유되는 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 상기 약학적 조성물의 제조에서 언급된 추출방법과 동일 또는 유사한 방법으로 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 발모 촉진 및/또는 탈모 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 가루가 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 구아니딘 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 12호(1680 μm), 14호(1410 μm) 및 45호(350 μm) 체를 이용하여, 다음 입도시험을 수행할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0% 이하이고, 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0% 이하일 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다(대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "사료"는 동물이 섭취하는 먹이를 의미하며, 구체적으로 동물의 생명을 유지하거나 또는 고기, 젖 등을 생산하는 데에 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 사료는 사료 첨가제를 포함할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또는, 상기 본 발명의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 사료 조성물에 첨가되는 사료 첨가제로 사용될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 대상 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 사료 첨가제는 사료 관리법 상의 보조사료에 해당할 수 있다.
본 출원의 사료 첨가제는, 추가로 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 등의 유기산이나 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 필요에 따라 액상, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.
상기 사료 또는 사료 첨가제는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화, 항곰팡이, 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 출원의 사료 및 사료 첨가제는 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물에 급이될 수 있다. 예컨대, 미관을 유지 또는 개선하기 위하여, 소, 염소 등의 가축; 개, 고양이 등의 애완동물에 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 발모 촉진, 또는 탈모 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여로 탈모의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 상기 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 탈모가 발생하였거나 발생할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 발모 촉진, 또는 탈모 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 치료용 의약품 제조를 위한 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
시약준비
구아니딘의 유도체로서 (N-1-(2-메틸)펜에틸비구아나이드(이하 'IM176OUT05' 또는 'IM'으로 표기), N-1-(3,4-디클로로)펜에틸비구아나이드(이하 'IM176OUT04') 및 1-(3,4-디메틸펜에틸)구아나이드(이하 'IM177OUT02')를 합성하였다. 상기 합성은 한국공개특허 10-2016-0146852(2016. 12. 21)의 각각 실시예 22, 실시예 1 및 실시예 133과 동일한 방법으로 수행하였다. 이외에, 미녹시딜(Minoxidil)을 Hyundai Pharm(Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였고, 메트포민(Metformin)을 Cayman chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다. 상기 본 발명의 구아니딘 유도체 및 미녹시딜과 메트포민의 화학 구조식을 도 1에 나타내었다.
실시예 1. 구아니딘 유도체의 리프로그래밍 효과
실시예 1.1. 마우스 세포에서 구아니딘 유도체의 리프로그래밍 효과 비교
로테논(ETC 컴플렉스 I 억제제)의 아독성 투여량(sub-toxic dose, 10 nM)에서 효율적인 체세포 리프로그래밍을 촉진시키는 것으로 확인된 바, iPSC 생성에 대한 로테논과 본 발명의 구아니딘 유도체의 효과를 하기와 같이 비교하였다(도 2).
마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)에 OSKM 리프로그래밍 인자를 도입하여 iPSC로 리프로그래밍하는 동안, 로테논, 본 발명의 구아니딘 유도체, 및 펜포민을 표기의 농도로 처리하였다. 14일 후에, 알칼린포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 염색을 수행하고(도 2A), AP+ 콜로니 수를 정량한 결과(도 2B), IM156 및 펜포민은 리프로그래밍 촉진 효과를 나타내지 않는 반면, IM176OUT05, IM176OUT04 및 IM177OUT02의 처리에 의해 AP+ 콜로니 수가 증가하였다. 특히, IM176OUT05(이하, IM)를 10 nM, 20 nM 및 50 nM 농도로 처리시, 각각 16.8배, 13.9배 및 13.7배 효율로 리프로그래밍을 향상시키는 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이후 실험에는 상기 유효한 리프로그래밍 향상 효과를 나타낸 3종 화합물만을 사용하여 추가적인 효능을 평가하였다.
실시예 1.2. 인간 세포에서 구아니딘 유도체의 리프로그래밍 효과 확인
인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblast, HFFs)에 OSKM 리프로그래밍 인자를 도입하여 iPSC로 리프로그래밍하는 동안, 상기 실시예 1.1.로부터 마우스 세포에 대한 리프로그래밍 효과가 확인된, IM176OUT05, IM176OUT04 및 IM177OUT02을 표기의 농도로 처리하였다. 28일 후에, AP 염색을 수행하고(도 3A), AP+ 콜로니 수를 정량한 결과(도 3B), 세 화합물 모두 10 nM 농도로 처리시 가장 우수한 리프로그래밍 효능을 나타내었으며, 특히 IM176OUT05를 10 nM, 100 nM 및 500 nM 농도로 처리시, 모두 2.4배 이상의 효율로 리프로그래밍을 향상시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 1.3. 구아니딘 유도체의 줄기세포능 유지 효과 확인
또한, 본 발명의 화합물들이 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)의 줄기세포능(stemness) 유지에 미치는 효능을 확인하였다(도 4). 구체적으로, hESC를 무조건 배지(unconditioned medium, UM)에 배양시키는 경우 줄기세포능을 잃고 AP 활성이 약해지게 되는 반면(도 4A), IM176OUT05, IM176OUT04 및 IM177OUT02 처리시, 저용량에서 AP 염색의 증가를 확인할 수 있었다. 특히, IM176OUT05를 10 nM 및 100 nM 농도로 처리시, 각각 7.6배 및 8.2배 향상된 줄기세포능 유지효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 4B).
이상의 실시예 1.1. 내지 1.3.의 결과로부터 공통적으로 10 nM의 IM176OUT05가 가장 효율적으로 마우스 및 인간 iPSC 생성 과정에서 리프로그래밍 효율을 향상시킴은 물론, 인간 배아줄기세포의 줄기세포능 유지 효능을 나타냄을 확인하였는 바, 이후 실시예에서는 상기 조건을 이용하여 후속 연구를 수행하였다.
실시예 2. IM176OUT05의 모발 재생 효과 시험
실시예 2.1. 모발 재생 모델
7주령 C57BL/6 마우스(Dae han BioLink, Chungbuk, Republic of Korea)의 모발 휴지기(telogen)에서 등쪽 피부 털을 동물용 클리퍼, 및 왁스(Veet, Oxy Reckitt Benckiser, Seoul, Republic of Korea)를 사용하여 제모하였다. 다음날부터, 매일 200 μl 위약(대조군), 1% IM, 1% 미녹시딜 또는 1% 메트포민을 살균된 면봉을 이용하여 제모된 부위에 적용하였다. 각 동물의 이미지를 매일 캡처하고, Image J program을 이용하여 동일한 영역(1.6 x 3 cm)에서 등 부위 색의 어두운 정도를 정량화하였다. 마우스를 희생시키고, 0, 7, 14 및 20일째의 피부 조직을 수득하였다. 조직의 절반을 RNA 분리에 사용하였고, 나머지 절반을 조직화학 분석을 위해 하룻밤 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다.
실시예 2.2. 조직학적 분석
상기 실시예 1.1.에서 고정시킨 조직을 30% 수크로오스에 침지시킨 후, OCT 화합물(Sakura Finetek USA Inc, Torrance, CA, USA)에 임베디드(embedded)시켰다. 저온유지장치(cryostat sectioning)(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 동결 절편을 수득하였고, 헤마톡실린(Sigma) 및 에오신(Sigma)(H&E) 또는 하기 표 1에 제시된 각각의 항체를 이용하여 염색하였다. 면역조직화학 분석을 수행하였고, Olympus 현미경(Olympus)으로 형광 이미지를 촬영하였다.
항체 카탈로그 번호 회사명 희석배율
anti-Cytokeratin 15 ab52816 abcam 1:100
anti-β-catenine c ab32572 abcam 1:200
anti-β-catenine(FACS) ab22656 abcam 1:500
anti-Ki67 ab15580 abcam 1:200
anti-shh(IHC) sc-9024 Santacruz 1:80
anti-shh(FACS) ab135240 abcam 1:300
anti-PDK sc-7140 Santacruz 1:50
anti-PDH(rabbit IgG) sc-292543 Santacruz 1:50
anti-PDH(mouse IgG) sc-377092 Santacruz 1:50
Normal Rabbit IgG #2729 Cell signaling technology 1:500
anti-Histon H3 #4620 Cell signaling technology 1:50
anti-trimethyl-Histone H3(Lys4) 04-745 Millipore 1:200
anti- trimethyl-Histone H3(Lys27) 07-449 Millipore 1:200
anti-dimethyl-Histone H3(Lys9) 07-441 Millipore 1:200
anti-NANOG A300-397A Bethyl Lab 1:250
anti-SSEA1 MAB2155 R&D Systems 1:200
실시예 2.3. 정량적 조직형태계측
모발주기 단계를 정확하게 분류하기 위한 지침에 따라, 각 마우스(n > 10)의 종단면에서의 H&E 염색 현미경 사진으로 개개의 모낭을 분류하여 모발주기를 정량화하였다. 각각의 군에서 모발 성장기(anagen)의 백분율을 계산하였다. 동일 영역(1300 μm 너비)에서의 모낭을 각 마우스(n > 10)의 횡단면에서의 H&E 염색 현미경 사진으로 계수하였다.
실시예 2.4. FACS 분석
마우스에 PBS를 관류시켜 혈액을 제거한 후, 피부 조직을 수확하여 작게 조각내었다. 조직을 트립신(Thermo Fisher Scientific)에 150분 동안 37℃에서 분해시킨 이후에 75 μm 나일론 메쉬로 여과한 후, 30 μm 메쉬(BD Biosciences)로 여과하였다. 단일 세포를 면역염색 프로토콜에 따라 고정시키고, 투과화하고, 차단시켰다. 세포를 특정 항체(상기 표 1)로 염색하고, BD AccuriTM C6(BD Biosciences)으로 분석하였다.
실시예 2.5. 귓바퀴 펀치(punch) 분석
귓바퀴 조직 수복 분석을 위해, 펀치 기구(Fine Science Tools, British Columbia, Canada)를 이용하여 각 귀에 2 mm 직경으로 3개의 구멍을 뚫었다. 매일 지시된 농도의 IM을 살균된 면봉으로 적용하였다. 구멍 면적을 digital calipers(VWR, Radnor, PA, USA)로 측정하였다.
통계학적 분석
모든 수치는 반복 실험된 3개 이상의 독립적인 생물학적 데이터를 대표한다. 모든 동물 실험은 n > 5의 처리군에서 독립적으로 6회 반복 실험되었다. Student's t-test를 군간 비교를 위해 사용되며, p < 0.05는 통계적 유의성을 나타낸다.
실시예 3. IM176OUT05의 모발 재생 효과 확인
실시예 3.1. 마우스에서 IM176OUT05에 의한 모발의 성장 촉진 효과
IM 화합물이 독성 또는 다른 부작용을 나타내지 않으면서도 모발의 성장을 촉진시킬 수 있는지에 대한 여부를 마우스 실험을 통해 확인하였다. 7주령 C57BL/6 마우스에서 휴지기 단계의 모발을 제모함으로써 동기화시켰고, 다양한 농도의 IM을 매일 마우스의 등쪽 피부에 국소 도포하였다. 9일째에, 1% IM을 적용한 부위에서 검은색 색소 침착 및 모발 성장이 현저하게 확인되었다(도 9).
또한, IM 및 종래 발모 촉진제인 미녹시딜의 효능을 비교한 결과, 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 모발 성장을 촉진시킨다는 것을 확인하였다. 특히, IM은 암컷 마우스에서 모발 성장에 대한 강력한 촉진 효과를 보였다. 구체적으로, IM 처리 8일째에, 대조군 또는 미녹시딜-처리 마우스에 비해 IM-처리 마우스에서 피부색이 분명히 어두워진 것을 확인할 수 있었다. 또한, 10일째에, IM 처리에 의해 모발 성장이 확연히 촉진되었다(도 5). 이와는 별개로 독립적인 실험을 추가로 수행한 결과, 암컷 마우스에서 IM이 미녹시딜보다 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 10). 반면에, 수컷 마우스에서는 IM의 효과가 미녹시딜과 유사한 것으로 나타났다(도 11a 및 도 11b).
이외에도, 모발 성장에 대해 IM과 다른 비구아나이드 유도체인 메트포민을 비교한 결과, 8일째부터 대조군에 비해 메트포민-처리 마우스의 등쪽 피부의 어둠 강도가 다소 증가하였으나 현저한 효과를 나타내지는 않았다(도 13a 및 도 13b).
실험 동안 IM-처리 마우스에서 피부 문제를 포함한 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다.
실시예 3.2. 마우스에서 IM176OUT05에 의한 모낭 재생 촉진 효과
조직형태계측을 통해 조직을 분석한 결과, IM이 모낭주기의 진행을 자극시킨다는 것을 확인하였다(도 6a). 20일째에 종단면에서, 대조군 마우스에서 모낭의 대부분이 성장기 III에 정량적으로 나타난 반면, IM-처리 마우스에서는 모낭의 대부분이 성장기 후기 단계인 성장기 V 및 VI 단계에서 주로 나타난 것을 확인하였다(도 6b). 또한, 7일째에 횡단면에서, 대조군에 비해 IM-처리 마우스에서 모낭의 수가 현저히 증가하였으며(도 6c), 20일째에 대조군에 비해 IM-처리 마우스 또는 미녹시딜-처리 마우스에서의 모낭 수가 현저히 많은 것으로 나타났다(도 6d). 더욱이, 7일째에, 모낭 줄기세포의 마커인 케라틴 15(K15)가 대조군 또는 미녹시딜-처리 마우스에 비해 IM-처리 마우스의 모낭 돌출부 영역에서 강하게 발현되었다(도 7a).
또한, 7일째에, 모낭 재생을 매개하는 β-카테닌의 발현이 IM-처리 마우스에서 증가한 것으로 나타났다. 이때, IM-처리 마우스에서 Ki67-양성 증식세포가 확인되었으며, 이는 모낭주기 및 증식전구세포의 추가 증식(expansion)이 IM에 의해 증가되었다는 것을 나타낸다(도 7a). K15+/β-카테닌+ 집단을 FACS 분석으로 정량화한 결과, 대조군, IM-처리 마우스 및 미녹시딜-처리 마우스 피부의 단일 세포에서 각각 3.2%, 11.7% 및 6.0%의 세포 집단을 점유하였다(도 7b). 이는, 대조군에 비해 IM-처리 마우스에서 3.7배 증가한 수준이다(도 7b).
20일까지, K15 및 β-카테닌은 모든 마우스 군에서 강하게 검출되었고(도 7c), K15+/β-카테닌+ 집단은 모든 군에서 24% 이상으로 나타났다(도 7d). 모낭 발달을 위한 또 다른 필수요소인 Shh(Sonic hedgehog)가 IM-처리 마우스 또는 미녹시딜-처리 마우스에서 명확하게 검출되었다(도 7c). 7일째에, 모든 마우스 군에서 Ki67+/Shh+ 집단이 5% 미만으로 나타났지만(도 7b), 20일째에 대조군, IM-처리 또는 미녹시딜-처리 마우스 피부의 단일 세포에서 각각 13.8%, 36.7% 및 34%로 증가하였다(도 7d). 20일째에, Ki67+/Shh+ 집단은 대조군에 비해 IM-처리 마우스에서 2.7배 증가하였다(도 7d).
실시예 3.3. IM176OUT05에 의한 모낭 재생 초기 단계에서의 줄기세포 대사 및 증식전구세포의 증식 활성 효과
K15 양성 모낭 줄기세포는 해당작용 전환을 촉진시키는 효소인 피루베이트 탈수소효소 키나아제(PDK)를 발현하는 반면, Ki67-양성 증식 세포는 미토콘드리아 OXPHOS에 반응하는 효소인 피루베이트 탈수소효소(PDH)를 강하게 발현하는 것으로 알려져 있다. 7일째에, PDK 발현이 IM-처리 마우스의 K15-양성 줄기세포에서 검출되었지만, 대조군 또는 미녹시딜-처리 마우스에서는 검출되지 않았다(도 8a). 7일째에 FACS 분석을 수행한 결과, K15+/PDK+ 집단은 대조군 또는 미녹시딜-처리 마우스에서는 검출되지 않았지만, IM-처리 마우스 피부의 단일 세포에서는 5.9%의 세포 집단으로 점유된 것을 확인할 수 있었다(도 8c). 이를 통해, IM-처리 마우스가 대조군에 비해 적어도 6.6배 이상 해당작용 줄기세포 집단(K15+/PDK+)을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
7일째에, PDH 발현이 IM-처리 마우스의 Ki67-양성 증식세포에서 명확히 확인되었고(도 8a), 20일째에는 모든 군의 증식세포에서 매우 높게 검출되었다(도 8b). 또한, 7일째에 Ki67+/PDH+ 집단은 IM-처리 마우스에서 13.7% 증가한 것으로 나타난 반면, 대조군 및 미녹시딜-처리 마우스에서는 각각 5.0% 및 8.3%로 낮게 나타났다(도 8c). 이어서, 각 마커의 상호 발현 패턴을 분석한 결과, 20일째에 IM-처리 마우스에서 각각 독립적으로 K15/PDH 및 Ki67/PDK 발현이 검출되었으며(도 12a), 이는 PDK 발현 해당작용 K15-양성 모낭 줄기세포와 PDH 발현 OXPHOS-의존적 Ki67-양성 증식세포가 서로 명백히 구분된다는 것을 나타낸다. 더욱이, FACS 분석을 통해, PDK+ 세포 집단 및 Ki67+ 세포 집단이 명확히 분리되었으며, 각각의 집단은 20일째에 IM-처리 또는 미녹시딜-처리에 의해 증가된다는 것을 확인할 수 있었다(도 12b). PDH+ 세포 및 K15+ 세포의 분리된 집단 또한 20일째에 IM-처리 또는 미녹시딜-처리에 의해 증가된 것을 검출하였다(도 12b).
실시예 3.4. IM176OUT05에 의한 대사 및 모발 재생과 관련된 유전자의 발현 효과
대사 및 모발 재생과 관련된 유전자 발현 정도를 각 마우스 군의 피부 조직을 통해 분석하였다. 해당작용-관련 효소(HK2 및 LDHA)의 발현은 7일째에 IM-처리 마우스에서 현저하게 유도되었고, 20일째에 대조군과 비교하여 IM-처리 및 미녹시딜-처리 마우스 모두에서 유의하게 증가되었다. 이 단계에서, OXPHOS-관련 효소(NDUS3 및 ATP5B)의 발현은 대조군에 비해 IM-처리 마우스 및 미녹시딜 처리 마우스 모두에서 증가되었다. 이는 IM이 모낭 재생 초기 단계에서의 해당작용을 촉진시켜, 이후 단계에서의 OXPHOS를 더욱 촉진시킬 수 있으며, 이를 통해 모발 성장에 필요한 활성 에너지 대사에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 모낭 발달에 관여하는 줄기세포능-관련 유전자(Wnt1a, Lef -1, Gli -1 및 베르시칸(versican))의 발현은 7일째에 IM-처리 마우스 피부에서 현저히 상향조절되었고, 미녹시딜-처리 마우스 또한 대조군에 비해 Wnt1a, Lef -1 및 Gli - 1)의 발현이 다소 증가하였다. 20일째에, IM-처리 마우스 및 미녹시딜 처리 마우스 모두 대조군에 비해 상기 줄기세포능-관련 유전자가 현저하여 유도되었다(도 8d).
실시예 3.5. IM176OUT05에 의한 조직 재생 효과
조직 재생에 대한 IM의 영향을 귓바퀴 조직 수복을 통해 관찰하였다. 그 결과, IM은 용량의존적으로 귓바퀴의 상처 면적을 감소시키는 것을 확인하였다. 이를 통해, IM은 모발 성장 이외에도 조직 재생을 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다(도 14). 이를 통해, IM은 탈모로 손상된 모낭 조직을 복구할 수 있으며, 야기될 수 있는 손상을 사전에 예방할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019015572-appb-I000005
    상기 화학식 1에서,
    A는 단일결합 또는 -C(NH)-NH-이고,
    R1은 -(CH2)n-이며, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이고,
    R2는 비치환, 또는 할로겐, 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 C6-C10 아릴임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 4의 화합물인 것인, 약학 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019015572-appb-I000006
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019015572-appb-I000007
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019015572-appb-I000008
    .
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 1 내지 5%의 농도로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 세포의 리프로그래밍을 촉진하거나 줄기세포능을 유지하는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 모낭의 재생을 촉진하거나 모발의 성장을 촉진하는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    β-카테닌, Shh(sonic hedgehog), HK2(hexokinase 2), LDHA(lactate dehydrogenase A), NDUS3(NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 3), ATP5B(ATP synthase subunit beta), Wnt1a, Lef-1(lymphoid enhancer binding factor 1), Gli-1(GLI family zinc finger 1), 베르시칸(versican), PDH(pyruvate dehydrogenase) 및 PDK(pyruvate dehydrogenase kinase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시키는 것인, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 피부외용제로 제형화되는 것인, 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 피부외용제는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니먼트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  10. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 기재된 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 발모 촉진용, 또는 탈모 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 발모 촉진, 또는 탈모 예방 또는 치료 방법.
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