WO2020085459A1 - 抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤 - Google Patents

抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤 Download PDF

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salt
antioxidant
glycation
inflammatory
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内田　浩二
秀 居原
優希 垣花
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国立大学法人東京大学
公立大学法人大阪
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates

Definitions

  • the present invention relates to an antioxidant, an anti-glycation agent or an anti-inflammatory agent useful in the fields of medicine, food and the like.
  • Carnosine ( ⁇ -alanyl-L-histidine), Anserine ( ⁇ -alanyl-L-1-methylhistidine), Valenin ( ⁇ -alanyl-L-3-methylhistidine), Homocarnosine ( ⁇ -aminobutyryl-L-histidine) And homoanserin ( ⁇ -aminobutyryl-L-1-methylhistidine) are dipeptides found in various vertebrate tissues, especially skeletal muscle and central nervous system, and both have histidine residues having an imidazole ring. , Imidazole-containing dipeptide, imidazole dipeptide and the like.
  • Carnosine has a basic metal chelating action and an antioxidant action, and is widely distributed in the olfactory tissue in the brain, and as a carrier for Cu and Zn ions essential for olfaction, or as lactic acid production accompanying exercise. It has been considered to be an important substance for maintaining the biological equilibrium of. Furthermore, in recent years, it has been reported that carnosine has an anti-glycation action and an anti-fatigue action as well as an antioxidant action.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In particular, elimination of reactive oxygen species (ROS) that promotes aging, lifestyle-related diseases, and fatigue, inhibition of production of final glycation end products (AGEs) associated with hyperglycemia, neuronal cell death in Alzheimer-type dementia and ischemia has been attracting attention for its prevention effect (Non-Patent Documents 1 and 2)
  • the present inventors have found that the 2-oxoimidazole-containing dipeptide is present in the body, and when oxidative stress is applied, the 2-oxoimidazole-containing dipeptide is produced in vivo depending on the oxidative stress. It was reported that when carnosine was reacted with ascorbic acid, copper ions and oxygen, a 2-oxoimidazole-containing dipeptide was produced (Non-patent documents 3-7).
  • An object of the present invention is to provide a stronger antioxidant, an anti-glycation agent, and an anti-inflammatory agent, which substitute for the imidazole-containing dipeptide.
  • the present inventor has examined the antioxidative action, antiglycation action, and antiinflammatory action of various peptides, and as a result of being an oxidant of imidazole-containing dipeptide exhibiting antioxidative action, the antioxidative action is weak.
  • the present inventors have completed the present invention by discovering that the 2-oxoimidazole-containing dipeptide, which was expected to be present, had extremely strong antioxidant action, anti-glycation action, and anti-inflammatory action as compared with the imidazole-containing dipeptide.
  • the present invention provides the following inventions [1] to [35].
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof [ 1]
  • An antioxidant, an anti-glycation agent or an anti-inflammatory agent containing an imidazole-containing dipeptide or a salt thereof and a 2-oxolated substance [4] The antioxidant, anti-glycation agent or anti-inflammatory agent according to claim 3, wherein the imidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from carnosine, anserine, varenin, homocarnosine, homoanserin and salts thereof.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin , Rutin, isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol, which are one or more selected from [3] or [4].
  • Anti-inflammatory agent is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin , Rutin, isoflavone, nobile
  • An antioxidant food composition, an anti-glycation food composition, or an anti-inflammatory food composition which comprises a 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof as an active ingredient.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof
  • the antioxidant food composition, the anti-glycation food composition or the anti-inflammatory food composition as described above.
  • An antioxidant food composition, an anti-glycation food composition or an anti-inflammatory food composition containing an imidazole-containing dipeptide or a salt thereof and a 2-oxolated substance.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin , Rutin, isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol [8] is an antioxidant food composition or anti-glycation [8] A food composition or an anti-inflammatory food composition.
  • a 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof for producing an antioxidant, an anti-glycation agent or an anti-inflammatory agent.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof [ 11] Use as described.
  • the imidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from carnosine, anserine, varenin, homocarnosine, homoanserin and salts thereof.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin
  • the use of [13] or [14] which is one or more selected from the group consisting of, rutin, isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol.
  • a 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof for producing an antioxidant food, an anti-glycation food or an anti-inflammatory food.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof [ 16] Use as described.
  • the imidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from carnosine, anserine, varenin, homocarnosine, homoanserin and salts thereof.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof [ 21] The compound described in the above.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin
  • the composition according to [23] or [24] which is one or more selected from the group consisting of, rutin, isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol.
  • a 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof [ 26] Use as described. [28] Use of a composition containing an imidazole-containing dipeptide or a salt thereof and a 2-oxolated substance as an antioxidant food, anti-glycation food or anti-inflammatory food.
  • imidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from carnosine, anserine, varenin, homocarnosine, homoanserin and salts thereof.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin
  • the use according to [28] or [29] which is one or more selected from rutin, isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol.
  • An antioxidant, anti-glycation or anti-inflammatory method which comprises administering an effective amount of a 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from 2-oxocarnosine, 2-oxoanserin, 2-oxovalenin, 2-oxohomocarnosine, 2-oxohomoanserin and salts thereof [ 31] The method described.
  • An antioxidant, anti-glycation or anti-inflammatory method which comprises administering an effective amount of a composition containing an imidazole-containing dipeptide or a salt thereof and a 2-oxolated substance.
  • the imidazole-containing dipeptide or a salt thereof is a dipeptide selected from carnosine, anserine, varenin, homocarnosine, homoanserin and salts thereof.
  • 2-oxo compound is ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin
  • the method of [33] or [34] which is one or more selected from the group consisting of, rutin, isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide exhibits markedly stronger antioxidant action, anti-glycation action and anti-inflammatory action than the imidazole-containing dipeptide, and various diseases based on the antioxidant action, anti-glycation action and anti-inflammatory action, for example, , Diabetes, diabetic complications, hypertension, hyperlipidemia, arteriosclerosis, liver disease, digestive system disease, cerebral dysfunction disease, cardiovascular disease, cardiac function decline, cancer, atopic dermatitis, Alzheimer type It is useful as a medicine, quasi drug, cosmetics, food, etc. for the prevention or treatment of dementia, Parkinson's disease, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, neurodegeneration due to motor neuron disease, skin aging, osteoporosis, etc. .
  • FIG. 2 shows the DPPH radical scavenging activity of a peptide containing 2-oxoimidazole. Data are presented as ⁇ mol of Trolox equivalent (TEAC) per mmOl of sample.
  • Figure 3 shows consumption of 2-oxoimidazole-containing dipeptides by incubation with DPPH. 2 shows the protective effect of 2-oxoimidazole-containing dipeptides against rotenone-induced neuronal cell death. It shows a nitric oxide production inhibitory action by a dipeptide containing 2-oxoimidazole. The anti-nitration effect
  • the active ingredient of the antioxidant, anti-glycation agent or anti-inflammatory agent of the present invention is 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof.
  • 2-oxocarnosine ( ⁇ -alanyl-L-2-oxohistidine), 2-oxoanserin ( ⁇ -alanyl-L-1-methyl-2-oxohistidine), 2-oxovalenin as 2-oxoimidazole-containing dipeptides ( ⁇ -alanyl-L-3-methyl-2-oxohistidine), 2-oxohomocarnosine ( ⁇ -aminobutyryl-L-2-oxohistidine) and 2-oxohomoanserin ( ⁇ -aminobutyryl-L-1-methyl) -2-oxohistidine).
  • 2-oxocarnosine and 2-oxoanserin are preferable.
  • Examples of salts of 2-oxoimidazole-containing dipeptides include acid addition salts such as hydrochlorides, sulfates, nitrates and acetates of these dipeptides, and basic salts such as sodium salts, potassium salts and calcium salts.
  • acid addition salts such as hydrochlorides, sulfates, nitrates and acetates of these dipeptides
  • basic salts such as sodium salts, potassium salts and calcium salts.
  • 2-oxoimidazole-containing dipeptides or salts thereof may be used alone or in combination of two or more.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof can be produced, for example, by reacting an imidazole dipeptide with ascorbic acid, copper ions and oxygen as described in Non-Patent Documents 4 and 6 above. More specifically, a 2-oxoimidazole-containing dipeptide is obtained by adding ascorbic acid and copper ions to a solution containing the imidazole dipeptide and introducing oxygen gas.
  • the reaction solvent include water and various buffer solutions.
  • the copper ion a water-soluble copper compound such as copper chloride or copper sulfate may be used to supply the copper ion to the reaction solution.
  • the oxygen may be introduced by bubbling oxygen into the reaction solution.
  • reaction involves the oxidation of the imidazole ring at the 2-position by molecular oxygen after abstraction of a hydrogen atom from the imidazole ring of the imidazole dipeptide by ascorbic acid and copper ions.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide can be purified from the reaction solution using an ion exchange resin or the like. Conversion of the 2-oxoimidazole-containing dipeptide to a salt can be performed by a conventional method.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof as shown in the Examples below, has an antioxidant activity which is several thousand times stronger than that of the imidazole dipeptide, and is even stronger than that of glutathione or ascorbic acid. Have.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof also has a stronger anti-glycation action than the imidazole dipeptide.
  • 2-oxoimidazole dipeptide or a salt thereof has a stronger anti-inflammatory action than imidazole dipeptide.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof has extremely strong radical scavenger activity (DPPH radical scavenging activity), rotenone-induced neuronal cell death protection activity, and anti-nitration activity (tyrosine) compared to imidazole dipeptides. Nitration inhibitory action).
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof has a stronger protein glycosylation-inhibitory action than the imidazole dipeptide.
  • 2-oxoimidazole dipeptide or a salt thereof has a stronger nitric oxide production inhibitory action than imidazole dipeptide.
  • the 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof is useful as an antioxidant, an anti-glycation agent and an anti-inflammatory agent. That is, the antioxidant, anti-glycation agent or anti-inflammatory agent of the present invention is a preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by oxidative stress in vivo, diseases caused by glycation in vivo and diseases caused by inflammation in vivo.
  • diseases caused by glycation include diabetes, diabetic complications, arteriosclerosis, hyperlipidemia, Alzheimer's-type recognition certificate, skin aging (spots, wrinkles, etc.), hypertension, osteoporosis and the like.
  • the active ingredient of the antioxidant, anti-glycation agent, anti-inflammatory agent of the present invention is a 2-oxoimidazole-containing dipeptide or a salt thereof
  • a combination of ingredients capable of producing a 2-oxoimidazole-containing dipeptide in vivo is also possible.
  • Examples of such a combination of components include a combination of an imidazole dipeptide and a 2-oxo compound.
  • Examples of the 2-oxo compound include ascorbic acid, vitamin E, glutathione, catechin, N-acetylcysteine, butylhydroxyanisole, quercetin, bilirubin, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, astaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, anthocyanin, tannin, rutin. , Isoflavone, nobiletin, hesperidin, chlorogenic acid, sesamin, curcumin, and resveratrol.
  • the form of the antioxidant, anti-glycation agent or anti-inflammatory agent of the present invention may be a form that is orally ingested or administered, and may be a drug, quasi drug, food composition (functional food, Includes food for specified health uses), cosmetics, etc. More specific forms of these forms include powders, fine granules, granules, tablets, capsules, liquid preparations (elixirs, limonades, syrups, emulsions, suspensions, solutions, drinks, etc. ), Gels, therapeutic foods, beverages, confectionery, food additives and the like.
  • the antioxidant, anti-glycation agent or anti-inflammatory agent of the present invention may be compounded with other additives used as medicines, quasi drugs, foods, cosmetics.
  • additives include excipients, lubricants, binders, antioxidants, fragrances, seasonings, sweeteners, colorants, thickening stabilizers, colorants, bleaches, fungicides, preservatives.
  • examples include agents, gum bases, enzymes, brighteners, acidulants, emulsifiers, isotonic agents, buffers, solubilizers, stabilizers and the like.
  • functional components such as amino acids, unsaturated fatty acids, vitamins, trace metals, glucosamine and chondroitin sulfate may be added.
  • the intake amount or dose of the active ingredient in the antioxidant, anti-glycation agent or anti-inflammatory agent of the present invention varies depending on the age, body weight, symptoms, etc. of the ingesting human, but for example, 1 mg / day or more and 10 g / day or less It is preferably 5 mg / day or more and 5 g / day or less, more preferably 10 mg / day or more and 3 g / day or less.
  • the daily intake or dose may be taken or administered once, or may be taken or administered in three divided doses.
  • the content of the active ingredient per administration unit or intake unit is preferably 2% by mass or more and 100% by mass or less, more preferably 5% by mass or more and 90% by mass or less, and 5% by mass or more and 80% by mass or less. More preferable.
  • one administration unit or one ingestion unit means one tablet, for example, if it is a tablet.
  • the active ingredient intake, dose, and content are the imidazole dipeptide intake, dose, and content.
  • Example 1 (measurement of antioxidant activity) (1) Method (Preparation of SH-SY5Y cell line overexpressing CARNS)
  • the CARNS gene (NP_00159694) was amplified from human brain cDNA using primers.
  • the amplified CARNS gene was cloned into the pENTR / D-TOPO vector using the directional TOPO cloning system (Gateway Cloning Technology, Thermo Fischer Scientific).
  • the CARNS gene was subcloned into the cDNA3.2 / nFLAG-DEST expression plasmid by the LR reaction (Thermo Fischer Scientific).
  • SH-SY5Y cells were cultured under the following conditions.
  • TBARS The amount of TBARS was determined according to the method reported by Masaki et al. (Arch Biochem Biophys 269,390-399). Brains (about 10 mg) were homogenized in 0.4 ml PBS containing 1% Triton X-100. After centrifugation at 18,800 g for 20 minutes at 4 ° C, 0.35 ml of PBS containing 1% Triton X-100 was added to 50 ⁇ l of the supernatant, and 0.8 ml of 0.375% 2-thiobarbituric acid, 15% was added. Trichloroacetic acid, 2% ethanol, 250 mM HCl, and 0.4% butyl hydroxytoluene were mixed and then boiled for 15 minutes.
  • the sample was centrifuged (18,800 g, 5 minutes) and the fluorescence intensity was analyzed by a fluorescence detector (excitation wavelength 515 nm, fluorescence wavelength 553 nm). Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) was used as a standard.
  • Example 2 Mouse macrophage-like cells RAW264.7 were seeded in 96 wells at 5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured overnight. Carnosine or 2-oxocarnosine was added and incubated for 1 hour. 100 ng / mL of Escherichia coli cell wall lipopolysaccharide (LPS) was added and cultured for 24 hours. The nitrite concentration in the medium derived from the produced nitric oxide was measured. As a result, as shown in FIG. 4, 2-oxocarnosine significantly reduced the amount of nitric oxide produced by LPS treatment of macrophages. The effect was significantly stronger than that of carnosine.
  • LPS Escherichia coli cell wall lipopolysaccharide
  • Example 3 Carnosine, 2-oxocarnosine, anserine, 2-oxoanserin (final concentration 2.5 ⁇ M) and tyrosine (final concentration 10 ⁇ M) were mixed. Peroxynitrite (final concentration 10 ⁇ M), which is a type of active nitrogen oxide, was added and incubated for 5 minutes. The production amount of nitrotyrosine, which is a nitrate of tyrosine, was quantified by LC-MSMS. As a result, as shown in FIG. 5, 2-oxocarnosine and 2-oxoanserin showed a strong anti-nitration effect. This anti-nitration effect was not observed with carnosine or anserine.
  • Example 4 A phosphate buffer containing 1 mg / mL BSA, 5 mM dehydroascorbic acid (DHA), 1 mM glycolaldehyde (GA), and 10 ⁇ M carnosine or 2-oxocarnosine was incubated at 37 ° C. for 4 days. The cross-reactivity of this reaction solution with an anti-GA modified protein IgG antibody (GAK2) prepared from GA-KLH immunized mice was confirmed by ELISA. As a result, as shown in FIG. 6, 2-oxocarnosine showed a stronger protein glycosylation inhibitory effect than carnosine.

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Abstract

イミダゾール含有ジペプチドに代わる、より強力な抗酸化剤、抗糖化剤及び抗炎症剤を提供することを課題とする。　本発明は、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩を有効成分とする抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤に関する。

Description

抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤
　本発明は、医薬、食品等の分野で有用な抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤に関する。
　カルノシン（β－アラニル―Ｌ－ヒスチジン）、アンセリン（β－アラニル－Ｌ－1－メチルヒスチジン）、バレニン（β－アラニル－Ｌ－３－メチルヒスチジン）、ホモカルノシン（γ－アミノブチリル－Ｌ－ヒスチジン）及びホモアンセリン（γ－アミノブチリル－Ｌ－1－メチルヒスチジン）は、種々の脊椎動物組織、特に骨格筋及び中枢神経系に存在するジペプチドであり、いずれもイミダゾール環を有するヒスチジン残基を有することから、イミダゾール含有ジペプチド、イミダゾールジペプチドなどと呼ばれている。
　カルノシンは、塩基性の金属キレート作用及び抗酸化作用を有し、脳内では嗅覚組織に多く分布していることから嗅覚に必須のＣｕ、Ｚｎイオンの運搬体として、あるいは運動に伴う乳酸生成としての生体平衡維持にとって重要な物質と考えられてきた。
　さらに近年、カルノシンは、抗酸化作用と共に抗糖化作用や抗疲労作用などを有することが報告されている。特に、老化や生活習慣病、疲労を促進する活性酸素種（ＲＯＳ）の消去作用、高血糖に伴う最終糖化産物（ＡＧＥｓ）の生成抑制作用、アルツハイマー型認知症や虚血状態での脳神経細胞死の防止効果などが注目されている（非特許文献１、２）
　さらに、最近、本発明者らは、２－オキソイミダゾ－ル含有ジペプチドが生体内に存在すること、酸化ストレスをかけると、酸化ストレスに依存して生体内で２－オキソイミダゾール含有ジペプチドが生成すること、カルノシンに、アスコルビン酸、銅イオン及び酸素を反応させると、２－オキソイミダゾール含有ジペプチドが生成すること（非特許文献３－７）を報告した。
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１３（１-２），１４５－１５０（２００５） Ｓｔｒｏｋｅ，３８（１１），３０２３－３０３１（２００７） 第７０回日本酸化ストレス学会学術集会（２０１７年６月２１日） ２０１７年度生命科学系学会合同年次大会（２０１７年１１月１５日） レドックス研究会２０１８（２０１８年４月２４日） 第１８回日本ＮＯ学会（２０１８年５月１７日） 第１６回レドックス・ライフイノベーションシンポジウム（２０１８年８月３０日）
　本発明の課題は、イミダゾール含有ジペプチドに代わる、より強力な抗酸化剤、抗糖化剤及び抗炎症剤を提供することにある。
　そこで本発明者は、種々のペプチド類の抗酸化作用、抗糖化作用、抗炎症作用について検討してきたところ、抗酸化作用を示すイミダゾール含有ジペプチドの酸化体であることから、抗酸化作用は弱いであろうと予想された２－オキソイミダゾール含有ジペプチドが、イミダゾール含有ジペプチドに比べて極めて強力な抗酸化作用、抗糖化作用及び抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の発明［１］～［３５］を提供するものである。
［１］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩を有効成分とする抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
［２］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［１］記載の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
［３］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
［４］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項３記載の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
［５］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［３］又は［４］記載の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
［６］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩を有効成分とする抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
［７］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［６］記載の抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
［８］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
［９］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項８記載の抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
［１０］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［８］は［９］記載の抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
［１１］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤製造のための使用。
［１２］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［１１］記載の使用。
［１３］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤製造のための使用。
［１４］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［１３］記載の使用。
［１５］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［１３］又は［１４］載の使用。
［１６］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の、抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品製造のための使用。
［１７］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［１６］記載の使用。
［１８］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物の抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品製造のための使用。
［１９］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項１８記載の使用。
［２０］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［１８］又は［１９］記載の使用。
［２１］抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤として使用するための２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩。
［２２］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［２１］記載の化合物。
［２３］抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤として使用するためのイミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物。
［２４］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［２３］記載の組成物。
［２５］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［２３］又は［２４］記載の組成物。
［２６］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品としての使用。
［２７］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［２６］記載の使用。
［２８］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物の抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品としての使用。
［２９］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［２８］記載の使用。
［３０］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［２８］又は［２９］記載の使用。
［３１］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の有効量を投与することを特徴とする抗酸化、抗糖化又は抗炎症方法。
［３２］２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソバレニン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［３１］記載の方法。
［３３］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物の有効量を投与することを特徴とする抗酸化、抗糖化又は抗炎症方法。
［３４］イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、バレニン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである［３３］記載の方法。
［３５］２-オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である［３３］又は［３４］記載の方法。
２－オキソイミダゾール含有ジペプチドは、イミダゾール含有ジペプチドよりも格段に強力な抗酸化作用、抗糖化作用及び抗炎症作用を示し、抗酸化作用、抗糖化作用及び抗炎症作用にに基づく種々の疾患、例えば、糖尿病、糖尿病合併症、高血圧症、高脂血症、動脈硬化症、肝臓疾患、消化器系疾患、脳機能障害疾患、心血管系疾患、心機能低下、癌、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、多発性硬化症、関節リウマチ、運動ニューロン病による神経変性、皮膚老化、骨粗しょう症等の予防又は治療用の医薬、医薬部外品、化粧料、食品などとして有用である。
２－オキソイミダゾール含有プチドのＤＰＰＨラジカル捕捉活性を示す。データは、サンプル１ｍｍоｌ当たりのトロロックス当量（TEAC）のμｍｏｌとして示す。 ＤＰＰＨとのインキュベーションによる２－オキソイミダゾール含有ジペプチドの消費を示す。 ロテノン誘発ニューロン細胞死に対する２－オキソイミダゾール含有ジペプチドの保護効果を示す。 ２－オキソイミダゾール含有ジペプチドによる一酸化窒素産生抑制作用を示す。 ２－オキソイミダゾール含有ジペプチドによる抗ニトロ化作用を示す。 ２－オキソイミダゾール含有ジペプチドによるタンパク質糖化阻害作用を示す。
　本発明の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤の有効成分は、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩である。
　２－オキソイミダゾール含有ジペプチドとしては、２－オキソカルノシン（β－アラニル―Ｌ－２－オキソヒスチジン）、２－オキソアンセリン（β－アラニル－Ｌ－1－メチル－２－オキソヒスチジン）、２－オキソバレニン（β－アラニル－Ｌ－３－メチル－２－オキソヒスチジン）、２－オキソホモカルノシン（γ－アミノブチリル－Ｌ－２－オキソヒスチジン）及び２－オキソホモアンセリン（γ－アミノブチリル－Ｌ－1－メチル－２－オキソヒスチジン）が挙げられる。このうち、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリンが好ましい。
　また、２－オキソイミダゾール含有ジペプチドの塩としては、これらのジペプチドの塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの塩基性塩などが挙げられる。
　これらの２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、例えば、前記非特許文献４、６に記載のように、イミダゾールジペプチドに、アスコルビン酸と銅イオンと酸素を反応させることにより、製造することができる。
　より詳細には、イミダゾールジペプチドを含有する溶液に、アスコルビン酸及び銅イオンを添加し、酸素ガスを導入することにより、２－オキソイミダゾール含有ジペプチドが得られる。
　反応溶媒としては、水、種々の緩衝液などが挙げられる。銅イオンは、塩化銅、硫酸銅などの水溶性銅化合物を用いて反応液中に銅イオンを供給すればよい。酸素の導入は、反応液中に酸素をバブリングすればよい。
　反応は、アスコルビン酸及び銅イオンにより、イミダゾールジペプチドのイミダゾール環からの水素原子の引き抜き後に、分子状酸素によるイミダゾール環の２位の酸化が行われるものと考えられる。
　反応液からの２－オキソイミダゾール含有ジペプチドの精製は、イオン交換樹脂などを用いて行うことができる。
　２－オキソイミダゾール含有ジペプチドの塩への変換は、常法によって行うことができる。
　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、後記実施例に示すように、イミダゾールジペプチドに比べて数千倍強力な抗酸化作用を有し、グルタチオンやアスコルビン酸などに比べても強力な抗酸化作用を有する。また、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、イミダゾールジペプチドよりも強力な抗糖化作用も有する。更に、２-オキソイミダゾールジペプチド又はその塩は、イミダゾールジペプチドに比べて強い抗炎症作用を有する。
　より詳細には、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、イミダゾールジペプチドに比べて、極めて強力な、ラジカルスカベンジャー活性（ＤＰＰＨラジカル消去活性）、ロテノン誘発ニューロン細胞死保護作用、抗ニトロ化作用（チロシンニトロ化抑制作用）を有する。また、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、イミダゾールジペプチドに比べて、強力なタンパク質糖化抑制作用を有する。更に、２-オキソイミダゾールジペプチド又はその塩は、イミダゾールジペプチドに比べて、強力な一酸化窒素産生抑制作用を有する。
　従って、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩は、抗酸化剤、抗糖化剤及び抗炎症剤として有用である。すなわち、本発明の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤は、生体内のおける酸化ストレスによって生じる疾患、生体内における糖化によって生じる疾患及び生体内の炎症によって生じる疾患の予防及び/又は治療剤として有用である。ここで、酸化ストレス、糖化又は炎症によって生じる疾患としては、糖尿病、糖尿病合併症、高血圧症、高脂血症、動脈硬化症、肝臓疾患（慢性肝炎、肝硬変、NASHなど）、消化器系疾患（消化性潰瘍、炎症性腸疾患、クローン病など）、脳機能障害疾患（脳梗塞後遺症、脳血流障害、各種認知症など）、心血管系疾患、心機能低下、癌、パーキンソン病、多発性硬化症、関節リウマチ、アルツハンマー型認知症などが挙げられる。糖化によって生じる疾患としては、糖尿病、糖尿病合併症、動脈硬化症、高脂血症、アルツハイマー型認知証、皮膚老化（シミ、しわなど）、高血圧症、骨粗しょう症などが挙げられる。
　本発明の抗酸化剤、抗糖化剤抗炎症剤の有効成分は、２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩であるが、生体内で２－オキソイミダゾール含有ジペプチドを生成することができる成分の組み合わせでもよい。そのような成分の組み合わせとしては、イミダゾールジペプチドと２-オキソ化物質の組み合わせが挙げられる。イミダゾールジペプチドと２-オキソ化物質とを併用すれば、投与されたイミダゾールジペプチドは、生体内で、２-オキソ化物質と、血液中の銅イオンと酸素の作用により、２－オキソイミダゾール含有ジペプチドが生成する。
　２-オキソ化物質としては、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
　本発明の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤の形態としては、通常、経口的に摂取又は投与される形態であればよく、医薬品、医薬部外品、食品組成物（機能性食品、特定保健用食品などを含む）、化粧品などが含まれる。これらの形態のより具体的な形態としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液状製剤（エリキシル剤、リモナーデ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、ドリンク剤など）、ゲル状剤、治療用食品、飲料、菓子、食品添加物などが挙げられる。
　本発明の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤には、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品として使用される他の添加剤を配合することができる。そのような添加剤としては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定剤、発色剤、漂白剤、防カビ剤、防腐剤、ガムベース、酵素、光沢剤、酸味料、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤などが挙げられる。また、アミノ酸類、不飽和脂肪酸、ビタミン類、微量金属類、グルコサミン、コンドロイチン硫酸などの機能性成分を配合してもよい。
　本発明の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤における有効成分の摂取量又は投与量は、摂取するヒトの年齢、体重、症状などによって異なるが、例えば、１ｍｇ/日以上１０ｇ/日以下が好ましく、５ｍｇ/日以上５ｇ/日以下がより好ましく、１０ｍｇ/日以上３ｇ/日以下がさらに好ましい。この一日あたりの摂取量又は投与量は、一回で摂取又は投与してもよいし、３回程度に分けて摂取又は投与してもよい。
　また、一投与単位又は一摂取単位当たりの有効成分の含有量は、２質量％以上１００質量％以下が好ましく、５質量％以上９０質量％以下がより好ましく、５質量％以上８０質量％以下がさらに好ましい。ここで、一投与単位又は一摂取単位とは、例えば錠剤であれば、一錠の意味である。
　イミダゾールジペプチドと酸化物質を併用する場合における有効成分の摂取量、投与量、含有量は、イミダゾールジペプチドの摂取量、投与量、含有量である。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１（２-オキソイミダゾール含有ジペプチドの製造）
　イミダゾールジペプチドのイミダゾール環の酸化は、アスコルビン酸銅イオン系により行った。１０mMカルノシン又はホモカルノシン、２００mMリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ ７．２)、２００mMアスコルビン酸、および２mM CuSO4を含む反応混合物(5mL)を室温でインキュベートした。酸素ガスを混合物中に３０分間バブリングした。
　酸化されたイミダゾールジペプチドを、以下の条件下で精製した。Scherzo SS-C18カラム(６．０×１００mm)を用い、１．５mL/分の流速、溶媒Ａ(０．１%ギ酸を含有する水)および溶媒Ｂ（５０%アセトニトリルおよび１００mMギ酸アンモニウムを含有する水)(０分で０％Ｂ;２０分で９０%Ｂ)の直線勾配で溶出し、溶出を２５０nmでの吸光度によってモニターした。生成物の化学構造を、LC-ESI-MS/MSおよびNMR分析によって特定した。
　２‐オキソカルノシン：
1 NMR(D2O): δH2.54(dt, J = 3.5Hz,2H),2.66(dd, J = 8.2Hz,1H),2.80(dd, J = 5.5Hz,1H),3.06(t,J=6.8Hz,2H),4.41(dd,J=4.7Hz,1H),6.12(s,1H),δC31.34,35.83,39.70,56.61 84 (m, 1H), 3.05 (s, 3H), 4.26 (dd, J = 4.7 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H); δC 29.10, 31.92, 175.47, 179.10.
　２‐オキソアンセリン：1H NMR (D2O): δH 2.26 (dt, J = 3.1 Hz, 2H), 2.60 (dd, J = 10 Hz, 1H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.84 (m, 1H), 3.05 (s, 3H), 4.26 (dd, J = 4.7 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H); δC 29.10, 31.92, 37.67, 38.87, 55.07, 117.95, 129.67, 155.86, 175.47, 179.10.
　２-オキソホモカルノシン:
1H NMR (D2O): δH 1.72-1.75 (m, 2H), 2.21 (dt, J = 3.5 Hz, 2H), 2.53 (dd, J = 8.2 Hz, 1H), 2.76-2.81 (m, 3H), 4.23 (dd, J = 4.7 Hz, 1H), 6.08 (S, 1H); δC 24.41, 29.46, 33.86, 40.21, 55.46, 116.34, 129.51, 164.25, 175.61, 178.91.
実施例１（抗酸化活性の測定）
（１）方法
（ＣＡＲＮＳを過剰発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株の調製）
ＣＡＲＮＳ遺伝子(NP_00159694)を、プライマーを用いてヒト脳cDNAから増幅した。増幅したＣＡＲＮＳ遺伝子を、指向性ＴＯＰＯクローニングシステム(Gateway Cloning Technology, Thermo Fischer Scientific)を用いてpENTR/D-TOPOベクターにクローニングした。ＣＡＲＮＳ遺伝子を、LR反応(Thermo Fischer Scientific)によってcDNA3.2/nFLAG-DEST発現プラスミドにサブクローニングした。ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞を、以下の条件で培養した。10% FBSを添加したDMEM (和光純薬工業、大阪、日本)中37℃。
　ポリエチレンイミンMax (Polysciences, Inc., PA, USA)を用いて
CARNS/pcDNA3.2/nFLAG-DESTで細胞をトランスフェクトした。その後、細胞を400μg/mlのG418を含む培地中で培養した。トランスフェクションの4週間後、生存クローンを単離し、大量に増殖させた。FLAGタグ化CARNSの発現を、抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich, MO, USA)を用いたウエスタンブロットによって分析した。CARNSを恒常的に過剰発現する安定な細胞株を選択し、400μg/mlのG418を含む培地中で維持した。
（細胞処理）
　ＣＡＲＮＳを安定に発現するＳＨ―ＳＹ５Ｙ細胞および対照細胞を９６ウェルプレートに２．０×１０4細胞/ウェルの密度で播種した。また、LC-ESI-MS/MS分析用に、１００mm皿に4.0×106細胞/皿を播種した。カルノシンの抗酸化能を調べるために、細胞を種々の濃度のＨ2Ｏ２またはロテノンで２４時間処理した。細胞生存率は、ＭＴＴ法を用いて測定した。
　2-オキソカルノシンの形成を分析するために、細胞を１５０μMのＨ2Ｏ２または２．５μMのロテノンで様々な時間処理した。２-オキソカルノシンの形成に対するＲＯＳの効果を調べるために、細胞を、２００U/mLのPEGcatalaseを用いて、または用いずに１時間前処理した。PBSで5回洗った後、細胞を１５０μMのＨ2Ｏ２または２．５μMのロテノンで2時間処理した。細胞をPBSで２回洗浄し、安定な同位体標識標準を含有する水中８０%アセトニトリル１mL中の細胞溶解物を、スクレーパーを使用することによって回収した。１８，８００g、４℃で２０分間遠心分離した後、上清を回収し、乾燥し、１００mM ＨＣｌに溶解し、Oasis MCXカートリッジ(Waters)に供した。試料を溶出し、LC-ESI-MS/MSに供した。
（ＴＢＡＲＳ）
　TBARSの量は、Masakiらによって報告された方法（Arch Biochem Biophys 269,390-399）に従って決定した。脳(約１０mg)を、１% Triton X-100を含む０．４mlのPBS中でホモジナイズした。１８，８００g、４℃で２０分間遠心分離した後、５０μlの上清に１% Triton X-100を含むPBS０．３５mlを加え、０．８mlの０．３７５% ２-チオバルビツール酸、１５%トリクロロ酢酸、２%エタノール、２５０mM ＨＣｌ、および０．４%ブチルヒドロキシトルエンと混合し、次いで１５分間煮沸した。冷却後、サンプルを遠心分離し(１８，８００g、５分)、蛍光強度を蛍光検出器で分析した(励起波長515nm、蛍光波長553nm)。マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)を標準として使用した。
（抗酸化活性の測定）
　DPPHラジカルに対する２-オキソカルノシンの捕捉効果を測定した。簡潔には、μM範囲のカルノシン、２-オキソカルノシン、アンセリン、２－オキソアンセリン、グルタチオン、またはアスコルビン酸塩を含有する反応混合物を、４０%エタノールを含有する１２mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH ７．４)中の１００μM DPPH (Alfa Aesar, MA)と共に、室温で３０分間インキュベートした。５４０nmでの吸光度を、Model 680プレートリーダー(Bio-Rad, CA, USA)によって測定した。Trolox (MERCK, Darmstadt, Germany)を標準として使用した。ラジカルスカベンジング活性を、試料のミリモル当たりのトロロックス当量μmolで評価した。TEACは、DPPHラジカル溶液に対する試料溶液のスカベンジングパーセンテージに従って式により計算した。2-オキソ-ルノシンの消費および生成物の形成をLC-ESI-S/MSによってモニターした。
（細胞毒性）
　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、ＭＴＴアッセイのために９６ウェルプレートに１．０×１０4細胞/ウェルの密度でプレーティングした。酸化ストレスに対する２－オキソカルノシンの細胞保護効果を試験するために、細胞を５０μMカルノシンまたは２－オキソカルノシンで３時間前処理し、次いで細胞を２μMロテノンで２４時間処理した。細胞生存率は、ＭＴＴ法を用いて測定した。
（統計処理）
　全ての実験を少なくとも３回行った。個々の実験の値を平均±SDとして示す。統計的有意性は、GraphPad Prismソフトウェアを用いて、One-way ANOVA（または１元配置分散分析）、Two-way ANOVA（または２元配置分散分析）、またはスチューデントのt検定によって決定した。P<0.05を有意とみなした。
（２）結果
　ＤＰＰＨラジカル補捉活性を図１に示す。また、ＤＰＰＨとのインキュベーションによる２－オキソカルノシンの消費を図２に示す。
　カルノシンは無視できる程度の抗酸化活性を示した(TEAC値=0.0088μmol/mmol)。しかし、２－オキソカルノシンのTEACは、カルノシンよりもはるかに大きかった(３５，０００倍)(図１)。さらに、２－オキソカルノシンは、グルタチオンおよびアスコルビン酸塩などの内因性抗酸化剤よりも強いフリーラジカル捕捉活性を示した。安定なラジカル、1,1-ジフェニル2-ピクリルヒドラジル(DPPH)とのインキュベーションは、２－オキソカルノシンの消費を生じた(図２)。
　ロテノン誘導ニューロン細胞死に対する保護効果を図３に示す。
　２－オキソカルノシンは、カルノシンに比べて強い、ロテノン誘導ニューロン細胞死に対する保護効果を示した。
実施例２
　マウスマクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４．７を５×１０4cells/wellで９６wellに播種し、通夜培養した。カルノシン又は２－オキソカルノシンを添加し、１時間インキュベートした。大腸菌細胞壁リポ多糖（ＬＰＳ）１００nｇ/mLを添加し、２４時間培養した。産生される一酸化窒素に由来する培地中の亜硝酸濃度を測定した。
　その結果、図４に示すように、マクロファージのＬＰＳ処理により生じる一酸化窒素産生量が、２－オキソカルノシンによって有意に減少した。その効果は、カルノシンに比べて有意に強かった。
実施例３
　カルノシン、２－オキソカルノシン、アンセリン、２－オキソアンセリン（終濃度２.５μM）とチロシン（終濃度１０μM）を混合した。活性窒素酸化物の一種であるパーオキシナイトライト（終濃度１０μM）を添加し、５分間インキュベートした。ＬＣ-ＭＳＭＳで、チロシンのニトロ化物であるニトロチロシンの生成量を定量した。
　その結果、図５に示すように、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリンは、強力な、抗ニトロ化効果を示した。また、この抗ニトロ化効果は、カルノシン、アンセリンでは認められなかった。
　実施例４
　ＢＳＡ　１mg/mL、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）５mM、グリコールアルデヒド（ＧＡ）１mM、及びカルノシン又は２－オキソカルノシン　１０μMを含むリン酸緩衝液を、３７℃で、４日間インキュベートした。この反応液に対して、ＧＡ-ＫＬＨ免疫マウスより作製した抗ＧＡ修飾タンパク質ＩｇＧ抗体（ＧＡＫ２）との交差反応性をＥＬＩＳＡで確認した。
　その結果、図６に示すように、２－オキソカルノシンは、カルノシンよりも強力なタンパク質糖化阻害効果を示した。
 

Claims (35)

  1. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩を有効成分とする抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
  2. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項１記載の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
  3. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２－オキソ化物質を含有する抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
  4. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項３記載の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
  5. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項３又は４記載の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤。
  6. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩を有効成分とする抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
  7. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項６記載の抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
  8. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２－オキソ化物質を含有する抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
  9. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項８記載の抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
  10. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項８又は９記載の抗酸化食品組成物、抗糖化食品組成物又は抗炎症食品組成物。
  11. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤製造のための使用。
  12. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２-オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項１１記載の使用。
  13. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物の抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤製造のための使用。
  14. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項１３記載の使用。
  15. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項１３又は１４記載の使用。
  16. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の、抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品製造のための使用。
  17. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２-オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項１６記載の使用。
  18. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２-オキソ化物質を含有する組成物の抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品製造のための使用。
  19. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項１８記載の使用。
  20. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項１８又は１９記載の使用。
  21. 　抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤として使用するための２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩。
  22. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２-オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項２１記載の化合物。
  23. 　抗酸化剤、抗糖化剤又は抗炎症剤として使用するためのイミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２－オキソ化物質を含有する組成物。
  24. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項２３記載の組成物。
  25. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項２３又は２４記載の組成物。
  26. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品としての使用。
  27. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２－オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項２６記載の使用。
  28. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２－オキソ化物質を含有する組成物の抗酸化食品、抗糖化食品又は抗炎症食品としての使用。
  29. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項２８記載の使用。
  30. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項２８又は２９記載の使用。
  31. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩の有効量を投与することを特徴とする抗酸化、抗糖化又は抗炎症方法。
  32. 　２－オキソイミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、２－オキソカルノシン、２－オキソアンセリン、２－オキソホモカルノシン、２-オキソホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項２６記載の方法。
  33. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩と２－オキソ化物質を含有する組成物の有効量を投与することを特徴とする抗酸化、抗糖化又は抗炎症方法。
  34. 　イミダゾール含有ジペプチド又はその塩が、カルノシン、アンセリン、ホモカルノシン、ホモアンセリン及びこれらの塩から選ばれるジペプチドである請求項３３記載の方法。
  35. 　２－オキソ化物質が、アスコルビン酸、ビタミンＥ、グルタチオン、カテキン、N-アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、クエルセチン、ビリルビン、βカロテン、リコペン、ルテイン、アスタキサンチン、β-クリプトキサンチン、アントシアニン、タンニン、ルチン、イソフラボン、ノビレチン、ヘスぺリジン、クロロゲン酸、セサミン、クルクミン、及びレスベラトロールから選ばれる１種又は２種以上である請求項３３又は３４記載の方法。
     
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