WO2020080696A1 - 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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sleep disorders
preventing
extract
composition
active ingredient
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이미영
김유리
김영화
박보경
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한국 한의학 연구원
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    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating sleep disorders comprising a plant extract of the genus Proxinus as an active ingredient.
  • Sleep is a state in which consciousness is resting while eyes are closed, and it is an important process of replenishing the energy we use during the day and restoring the fatigue accumulated by physical activity. Sleep is not only the time to recover energy and fatigue, but also the time when the most important growth hormone is needed for human growth.
  • the brain in our body is responsible for all the physiological functions of life support, and the brain needs a break to maintain proper balance of activity, and most of these breaks occur during sleep.
  • the number of patients diagnosed and treated as sleep problems due to the exhausting and busy daily pace of modern life, the prevalence of obesity, and the aging of the population has increased in recent years and is expected to continue to increase in the future.
  • Insomnia is one of the most common sleep disorders. It is a symptom that complains of sleep difficulty. It is defined as difficulty sleeping, difficulty maintaining sleep, waking up quickly, or poor sleep quality. Regardless of the degree of insomnia, 3 out of 10 adults suffer from sleep disorders, and the rate is higher in women and the elderly.
  • Chronic insomnia decreases the quality of life, increases the incidence of depression by more than 10 times, and sleep disorders caused by insomnia cause problems such as hypertension, blood sugar control problems, and obesity, not only increasing the prevalence of various diseases, but also medical expenses It also has an impact on the social part of patients, such as increased spending, increased risk of accidents during the day, and reduced work performance at work.
  • the ash tree grows at the foot of the mountain or at the foot of the valley, the height is 10m, and the bark is grayish brown and has a grayish-white irregular pattern.
  • Leaves are opposite, odd numbered once in leaf shape, small leaves are 5-7, broad lanceolate, 6-15cm long, have wavy serrates on the edges, no hairs on the front side, and hairs on the back veins.
  • Flowers are male and female, but there are cases where bisexuality is mixed, and blooms in May and runs in conical inflorescences on the axilla of young branches.
  • Male flowers have 2 stamens and calyx pieces each, and female flowers have 2 to 4 calyx pieces, stamens and pistils, and the petals are upside down.
  • Fruits are fruit, 2-4cm long, ripening in September.
  • the wings of the fruit are lanceolate or long lanceolate. It is called ash tree because it turns blue when you dip it in water.
  • the bark (dermis) is used as a dry stomach, anti-inflammatory, and astringent in oriental medicine. It is distributed in Korea and China.
  • an antimicrobial composition comprising an ash tree extract or a compound separated therefrom is disclosed in Korean Patent No. 0777834, and skin containing fermentation of an ash tree extract in Korean Patent No. 1820732
  • a composition for whitening is disclosed, the composition for preventing, improving or treating sleep disorders comprising the plant extract of the genus Proxinus of the present invention as an active ingredient has not been disclosed.
  • the present invention is derived by the above-mentioned needs, the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating sleep disorders comprising a plant extract of the genus Proxinus as an active ingredient, the genus Proxinus, an active ingredient of the present invention
  • Plant extracts are calretinin , neuropeptide Y , and GAD65 in animal models of sleep disorders caused by stress.
  • GAD67 The present invention was completed by confirming that there is an effect of increasing the mRNA expression level.
  • the present invention is a plant of the genus Fraxinus rhynchophylla ; FX ) It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of sleep disorders containing the extract as an active ingredient.
  • the present invention is a family of the genus Fraxinus rhynchophylla ) It provides a health functional food composition for preventing or improving sleep disorders comprising an extract as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of sleep disorders
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of sleep disorders comprising a plant extract of the genus Fraccinus as an active ingredient, the active ingredient of the present invention, ash tree ( Fraxinus rhynchophylla ) extract contains calretinin , neuropeptide Y , and GAD65 in stress-induced sleep disorder animal models. And GAD67 It has the effect of increasing the mRNA expression level.
  • 1 is a diagram showing the progress of the sleep disorder experiment due to the electric shock of the sole and restraint stress.
  • FIG. 2 shows 100 mg / kg of ash extract and 15 mg / kg of doxepin administered to C57BL / 6 mice inducing sleep disorder due to plantar electric shock and restraint stress for 14 days and calretinin in the cerebral cortex obtained on day 17 It shows the result of measuring the mRNA expression level.
  • FIG. 3 shows Neuropeptide Y mRNA expression in cerebral cortex obtained on day 17 after administration of 100 mg / kg of ash extract and 15 mg / kg of doxepin for 14 days to C57BL / 6 mice in which sleep disorder was induced by plantar electric shock and restraint stress It shows the result of measuring the quantity.
  • ## is a statistically significant decrease in the expression level of Neuropeptide Y mRNA in the control group compared to the normal group, p ⁇ 0.01, and * is a control group and a positive control group of the ash extract of the present invention as compared to the control group.
  • the expression level of Neuropeptide Y mRNA of doxepin was statistically significantly increased, and p ⁇ 0.05.
  • FIG. 4 shows GAD65 (A) in the cerebral cortex obtained on day 17 after administration of 100 mg / kg of ash extract and 15 mg / kg of doxepin for 14 days to C57BL / 6 mice inducing sleep disorders due to sole electric shock and restraint stress.
  • GAD67 (B) It shows the result of measuring the mRNA expression level.
  • the present invention is ash tree ( Fraxinus rhynchophylla ; FX ) It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating sleep disorders comprising an extract as an active ingredient.
  • the ash tree extract may be prepared by a method comprising the following steps, but is not limited to this:
  • step (3) Concentrating and drying the filtered extract of step (2) to prepare an extract.
  • the extraction solvent is preferably selected from water, a lower alcohol of C 1 to C 4 or a mixture thereof, more preferably ethanol, even more preferably 70% (v / v) ethanol, It is not limited to this.
  • any conventional methods known in the art such as filtration, hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction, may be used as the extraction method.
  • the extraction solvent is preferably extracted by adding 1 to 20 times the weight of ash, more preferably 5 to 15 times, and even more preferably 10 times.
  • the extraction temperature is preferably 4 to 100 ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 1 to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours, and 3 hours is most preferred, but is not limited thereto.
  • the concentration of step (3) is preferably, but not limited to, a vacuum rotary concentrator or a vacuum rotary evaporator.
  • the drying is preferably dried under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, and more preferably freeze drying or not limited thereto.
  • the ash tree extract is preferably a dermis extract of ash tree bark or eggplant bark, but is not limited thereto.
  • the sleep disorder is preferably insomnia due to stress, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent in addition to the ash extract, and may be formulated into various formulations, oral or parenteral, but is not limited thereto.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc.These solid preparations include at least one excipient in one or more compounds such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose ( lactose) and gelatin. In addition, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspending agents, intravenous solutions, emulsions or syrups, etc. In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents or preservatives are included. You can.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized preparations or suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when parenterally administered, it is preferable to select an injection method for external use of the skin or intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine epidural or cerebrovascular. I never do that.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a ratio of rational benefit / risk applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, drug activity, and drug Sensitivity to treatment, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including co-drugs and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition of the present invention varies in range depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and disease severity, and the daily dosage is the amount of ash extract.
  • 0.01 to 1000 mg / kg, preferably 30 to 500 mg / kg, more preferably 50 to 300 mg / kg, can be administered 1 to 6 times a day, but the route of administration, the severity of obesity, Since the dosage may be increased or decreased depending on gender, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention is ash tree ( Fraxinus rhynchophylla ) It relates to a health functional food composition for preventing or improving sleep disorders comprising an extract as an active ingredient.
  • composition is preferably prepared in any one formulation selected from powders, granules, pills, tablets, capsules, candy, syrups, and beverages, but is not limited thereto.
  • the health functional food composition containing the ash extract of the present invention as an active ingredient may be added to the food as it is or used with other foods or food ingredients, and may be suitably used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to its purpose of use (for prevention or improvement).
  • the amount of the ash extract contained in the health functional food can be added to 0.1 to 90 parts by weight of the total weight of the health functional food.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range. .
  • the health functional food composition of the present invention is used as a beverage
  • other components other than containing the ash tree extract as the essential component in the indicated proportions
  • various flavors such as ordinary beverages, or Natural carbohydrates and the like can be contained as additional components.
  • natural carbohydrates described above include monosaccharides, for example, glucose, fructose, etc .; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc .; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the health functional food composition of the present invention in addition to the above-mentioned active ingredients, nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, colorants, enhancers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stable It may contain by adding one or more selected from a topical agent, a preservative, glycerin, a carbonic acid used in alcohol and carbonated beverages.
  • the health functional food composition of the present invention may contain flesh for the preparation of natural fruit juices and vegetable drinks. The flesh can be used independently or in combination.
  • the proportion of the various additives is not critical, but is generally selected from 0.1 to 20 parts by weight per 100 parts by weight of the ash extract of the present invention.
  • Ash bark was placed in 70% (v / v) ethanol solvent 10 to 15 times and reflux extraction was performed for 3 hours.
  • the extracted solvent was concentrated by filtering with a primary filter, followed by secondary cotton filtering, and lyophilized to powder.
  • To induce sleep disorders use the shuttle box (JEUNG DO BIO & PLANT CO, LTD, Seoul, Korea) on the soles of the mice to give an electric shock at an intensity of 0.5 mA for 2 minutes (1 second per 10 seconds) and then use acrylic
  • the mice were restrained for 2 hours in a semi-cylindrical restraint cage (JEUNG DO BIO & PLANT CO, LTD, Seoul, Korea).
  • RNAzolB Tel-Test
  • RNAzol (B) 500 ⁇ l of RNAzol (B) was added to the cerebral cortical tissue, the tissue was crushed with a homogenizer, and 50 ⁇ l of chloroform (CHCl 3 ) was added thereto, followed by mixing for 15 seconds. This was left on ice for 15 minutes, centrifuged at 13,000 rpm, and then about 200 ⁇ l of the supernatant was collected, mixed with 200 ⁇ l of 2-propanol in the same amount, slowly shaken, and left on ice for 15 minutes. This was centrifuged again at 13,000 rpm, washed with 80% ethanol and dried in a vacuum pump for 3 minutes to extract RNA.
  • CHCl 3 chloroform
  • RNA was dissolved in 20 ⁇ l of diethyl pyrocarbonate (DEPC) -treated distilled water, inactivated at 75 ° C., and used for first strand cDNA synthesis.
  • DEPC diethyl pyrocarbonate
  • 3 ⁇ g of total RNA prepared was reacted with DNase I (10 U / ⁇ l) 2 U / tube in a 37 ° C. heating block for 30 min, then denatured at 75 ° C.
  • Primer sequences of calretinin , neuropeptide Y, GAD65 , GAD67 Gene primer sequence Calretinin forward (SEQ ID NO: 1) 5'-CTAAGCTCCAGGAGTACACC-3 ' reverse (SEQ ID NO: 2) 5'-GCATTGAACTCTTCTGAGGTC-3 ' Neuropeptide Y forward (SEQ ID NO: 3) 5'-AGGCTTGAAGACCCTTCCAT-3 ' reverse (SEQ ID NO: 4) 5'-ACAGGCAGACTGGTTTCAGG-3 ' GAD65 forward (SEQ ID NO: 5) 5'-TCAACTAAGTCCCACCCTAAG-3 ' reverse (SEQ ID NO: 6) 5'-CCCTGTAGAGTCAATACCTGC-3 ' GAD67 forward (SEQ ID NO: 7) 5'-CTCAGGCTGTATGTCAGATGTTC-3 ' reverse (SEQ ID NO: 8) 5'-AAGCGAGTCACAGAGATTGGTC-3 ' GAPDH forward (SEQ ID
  • Results were expressed as mean ⁇ standard deviation, and statistical comparison between experimental groups was conducted by one-way measures analysis of variance (ANONA) through Tukey honestly Significant Difference (HSD), and p ⁇ 0.05 statistically. It was judged to be significant.
  • Example 1 Sleep disorders C57BL / 6 On the mouse Fraxinus The genera extract of calcium binding protein mRNA Effect on expression level
  • mice were orally administered for 14 days according to the above-described experimental method, and subjected to electric shock and restraint of the soles during autopsy.
  • RNA was obtained by recovering the cerebral cortex, and cDNA was generated to analyze neuropeptide Y mRNA expression through a real-time gene analyzer.
  • neuropeptide Y mRNA expression was found to be significantly decreased in the control group, and significantly increased in the group administered with the ash extract and the positive control group.
  • Example 3 Induced sleep disorder C57BL / 6 On the mouse Fraxinus
  • the genus extract is an enzyme that synthesizes GABA.
  • Ash tree extract from GAD65 (glutamic acid decarboxylase 65) in the cerebral cortex of sleep-induced C57BL / 6 mice
  • GAD67 glutamic acid decarboxylase 67
  • the oral cortex of the sample for 14 days and the electric shock and restraint of the foot are recovered, and then the cortex of the mouse is recovered at necropsy to obtain RNA, obtain cDNA, and generate GAD65 through a real-time genetic analyzer.
  • GAD67 mRNA expression levels were analyzed.

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Abstract

본 발명은 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 프락시누스속 식물 추출물은 스트레스에 의한 수면장애 동물모델에서 칼레티닌( calretinin) , 뉴로펩타이드 Y( neuropeptide Y) , GAD65 및 GAD67 mRNA 발현량을 증가시켜 수면장애를 개선하는 효과가 있으므로, 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 또는 의약품 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
수면이란 눈이 감긴 채 의식 활동이 쉬는 상태를 말하며 우리가 낮 동안에 활동하느라 사용한 에너지를 보충하고 신체활동으로 인해 쌓인 피로를 회복하는 중요한 과정이다. 수면은 에너지와 피로 회복을 하는 시간일 뿐 아니라 사람의 성장에 꼭 필요한 성장호르몬이 가장 많이 분비되는 시간이다.
우리 몸에서 뇌는 생명 유지를 위한 모든 생리적 기능을 총괄하는 곳으로 이 뇌가 적절한 활동의 균형을 유지하기 위해서는 휴식이 필요하며 이러한 휴식은 대부분 수면 시간에 이루어진다. 현대 생활의 소모적이고 바쁜 일상 속도, 비만 유병률의 증가, 인구의 고령화 등으로 수면 문제로 진단받고 치료받는 환자의 숫자는 최근 수년간 증가해왔으며 향후에도 지속적으로 증가할 것으로 예상된다.
여러 가지 수면장애 중 불면증은 매우 흔한 수면장애로 수면의 어려움을 호소하는 증상으로 잠드는 것이 어렵거나, 잠을 유지하는 것의 어려움, 빨리 깨는 것, 수면의 질이 좋지 않은 것으로 정의되고 있다. 불면증의 정도와 상관없이 성인 10명 중 3명이 수면장애에 시달리고 있으며, 여성이나 노인에게서는 그 비율이 더 높은 것으로 알려져 있다.
현대인의 수면시간이 많이 줄어든 이유는 장래에 대한 불안, 우울증, 불안장애, 스트레스와 같은 심리적 이유에 의한 정신질환 증가, 직업과 사회적 다변화에 따른 주야 간 교대 근무, 그리고 바르지 못한 생활습관 등 다양한 원인에 기인한다. 즉, 사회가 복잡해짐에 따라 할 일이 많아지고 스트레스도 늘어나면서 만성적 수면부족이 생겨난 것이다. 또한, 커피 등 카페인이 함유된 음료를 더 많이 섭취하는 것도 이유 중 하나로 꼽히고 있다. 일시적인 스트레스, 수면습관의 변화로 인한 불규칙한 수면습관 등으로 인하여 일시적인 급성불면증이 쉽게 발생하게 되며, 이러한 급성불면증은 규칙적인 수면습관을 유지하고, 불면증을 유발한 스트레스나 원인 인자를 제거하게 되면 정상적인 수면습관으로 돌아오게 된다. 하지만, 잘못된 수면습관을 유지하거나 왜곡된 불면증에 대한 대처는 매일 잠을 못 자는 만성불면증을 일으키게 된다. 만성불면증상은 삶의 질을 떨어뜨리고, 우울증의 발생을 10배 이상 증가시키며, 또한 불면증으로 인한 수면장애는 고혈압이나 혈당 조절 문제, 비만 등의 문제를 야기시켜 각종 질병의 유병률을 높일 뿐만 아니라, 의료비 지출의 증가, 주간의 사고 위험성 증가, 직장에서의 업무수행능력 저하 등 환자의 사회적인 부분에서도 영향을 미치고 있다.
한편, 물푸레나무는 산기슭이나 골짜기 물가에서 자라며, 높이는 10m이고, 나무 껍질은 회색을 띤 갈색이며 잿빛을 띤 흰 빛깔의 불규칙한 무늬가 있다. 잎은 마주나고 홀수 1회 깃꼴겹잎이고, 작은 잎은 5∼7개이며, 길이 6∼15cm의 넓은 바소 모양이고 가장자리에 물결 모양의 톱니가 있으며 앞면에 털이 없고 뒷면 맥 위에 털이 있다. 꽃은 암수딴그루이지만 양성화가 섞이는 경우도 있으며, 5월에 피고 어린 가지의 잎겨드랑이에 원추꽃차례를 이루며 달린다. 수꽃은 수술과 꽃받침조각이 각각 2개이고, 암꽃은 꽃받침조각·수술·암술이 각각 2∼4개이고 꽃잎은 거꾸로 세운 바소 모양이다. 열매는 시과이고 길이가 2∼4cm이며 9월에 익는다. 열매의 날개는 바소 모양 또는 긴 바소 모양이다. 가지를 물에 담그면 물이 푸르게 변하기 때문에 물푸레나무라고 부른다. 나무 껍질(진피)은 한방에서 건위제(健胃劑)·소염제·수렴제(收斂劑)로 사용한다. 한국·중국 등지에 분포한다.
물푸레나무 추출물 관련 기술로는 한국등록특허 제0777834호에 물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 항균 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1820732호에 물푸레나무 추출물의 발효물을 포함하는 피부 미백용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 프락시누스속 식물 추출물은 스트레스에 의한 수면장애 동물모델에서 칼레티닌( calretinin) , 뉴로펩타이드 Y( neuropeptide Y) , GAD65 및 GAD67 mRNA 발현량을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프락시누스속 식물인 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla ; FX) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프락시누스속 식물인 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla) 추출물은 스트레스에 의한 수면장애 동물모델에서 칼레티닌( calretinin) , 뉴로펩타이드 Y( neuropeptide Y) , GAD65 및 GAD67 mRNA 발현량을 증가시키는 효과가 있다.
도 1은 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의한 수면장애 실험의 진행과정을 도표로 나타낸 것이다.
도 2는 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 C57BL/6 마우스에 100mg/kg의 물푸레나무 추출물 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하고 17일째 얻은 대뇌피질에서 calretinin mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. *은 대조군(control) 대비 본 발명의 물푸레나무 추출물 투여군의 calretinin mRNA 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.05이다.
도 3은 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 C57BL/6 마우스에 100mg/kg의 물푸레나무 추출물 및 15mg/kg의 독세핀을 14일 동안 투여하고 17일째 얻은 대뇌피질에서 Neuropeptide Y mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. ##은 정상군(normal) 대비 대조군(control)의 Neuropeptide Y mRNA 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.01이고, *은 대조군(control) 대비 본 발명의 물푸레나무 추출물 투여군 및 양성대조군인 독세핀(doxepin)의 Neuropeptide Y mRNA 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 C57BL/6 마우스에 100mg/kg의 물푸레나무 추출물 및 15mg/kg의 독세핀을 14일 동안 투여하고 17일째 얻은 대뇌피질에서 GAD65(A) 및 GAD67(B) mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla ; FX) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 물푸레나무 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 물푸레나무에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이며, 더욱더 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 물푸레나무 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이고, 더욱더 바람직하게는 10배 첨가하는 것이다. 추출온도는 4~100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1~48시간인 것이 바람직하며, 1~24시간이 더욱 바람직하고, 3시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 농축은 진공 회전 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.
상기 물푸레나무 추출물은 물푸레나무 줄기 껍질 또는 가지 껍질의 진피 추출물인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 수면장애는 스트레스에 의한 불면증인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 물푸레나무 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제(base)로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 물푸레나무 추출물의 양을 기준으로 0.01~1000㎎/㎏이고, 바람직하게는 30~500㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50~300㎎/㎏이며, 하루 1~6회 투여될 수 있으나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 물푸레나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중에 포함되는 상기 물푸레나무 추출물의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.1~90 중량부로 가할 수 있다. 하지만, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 사용되는 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분인 물푸레나무 추출물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 첨가하여 함유할 수 있다. 이외에도 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기 과육은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 다양한 첨가제의 비율은 중요하진 않지만, 본 발명의 물푸레나무 추출물 100 중량부 당 0.1~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
시료제조, 준비 및 투여
물푸레나무 껍질을 10~15배의 70%(v/v) 에탄올 용매에 넣고 3시간 동안 환류추출을 실시하였다. 추출된 용매는 1차 거름망 필터 후, 2차 솜 필터하여 농축하였으며 동결건조하여 분말화하였다.
100mg/kg의 물푸레나무 추출물 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin, Sigma-Aldrihich, St. Louis, MO, USA)의 농도로 PBS에 용해하여 투여량에 맞게 분주하고 스트레스를 가하기 1시간 전에 0.1ml씩 경구투여하였다. 정상군(normal)과 스트레스 대조군(control)은 PBS를 0.1㎖씩 경구투여하였다.
스트레스에 의한 수면장애 유발 모델
무게가 20~22g인 수컷 7주령의 C57BL/6는 대한바이오링크(eumseong-gun, chungcheongbugdo, Korea)에서 공급받았고, 동물은 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 명암주기의 환경을 유지하며 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
실험은 도 1과 같이 진행되었고, 총 14일 동안 매일 AM 09:00부터 PM 01:00사이에 발바닥 전기충격과 구속 스트레스 실험을 하였다. 수면장애를 유발하기 위해 마우스의 발바닥에 셔틀박스(JEUNG DO BIO & PLANT CO, LTD, Seoul, Korea)를 사용하여 2분(10초당 1초씩) 동안 0.5mA의 세기로 전기충격을 준 후 아크릴로 제작된 반원통형의 속박장치(acrylic hemi-cylindric restraint cage, JEUNG DO BIO & PLANT CO, LTD, Seoul, Korea)에 마우스를 2시간 동안 구속하였다.
대뇌피질의 calretinin , neuropeptide Y, GAD65 , GAD67 mRNA 발현량 측정
실험 종료 후 각 실험동물로부터 적출한 대뇌피질에서의 유전자 발현 양상을 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. 마우스의 대뇌피질 조직을 RNAzolB(Tel-Test) 용액으로 RNA를 추출한 후, One-step SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 기기를 이용하여 분석하였다.
대뇌피질 조직에 RNAzol(B) 500㎕를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 chloroform(CHCl 3) 50㎕를 첨가한 후 15초 동안 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분 동안 방치한 후 13,000rpm에서 원심 분리한 후 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분 동안 방치하였다. 이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후 80% 에탄올로 수세하고 3분 동안 진공펌프에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate(DEPC)를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화시킨 후, first strand cDNA 합성에 사용하였다. 역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3㎍을 DNase I(10U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분 동안 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5㎕의 10mM dNTPs mix, 1㎕의 random sequence hexanucleotides(25pmole/25㎕), RNA 저해제로서 1㎕의 RNase inhibitor(20U/㎕), 1㎕의 100mM DTT, 4.5㎕의 5×RT buffer (250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl 2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 후 2,000rpm에서 5초 동안 원심침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR(polymerase chain reaction)에 사용하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다.
calretinin , neuropeptide Y, GAD65 , GAD67의 프라이머 서열
Gene primer sequence
Calretinin forward(서열번호 1) 5'-CTAAGCTCCAGGAGTACACC-3'
reverse(서열번호 2) 5'-GCATTGAACTCTTCTGAGGTC-3'
Neuropeptide Y forward(서열번호 3) 5'-AGGCTTGAAGACCCTTCCAT-3'
reverse(서열번호 4) 5'-ACAGGCAGACTGGTTTCAGG-3'
GAD65 forward(서열번호 5) 5'-TCAACTAAGTCCCACCCTAAG-3'
reverse(서열번호 6) 5'-CCCTGTAGAGTCAATACCTGC-3'
GAD67 forward(서열번호 7) 5'-CTCAGGCTGTATGTCAGATGTTC-3'
reverse(서열번호 8) 5'-AAGCGAGTCACAGAGATTGGTC-3'
GAPDH forward(서열번호 9) 5'-AAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3'
reverse(서열번호 10) 5'-GGTCCAGGGTTTCTTACTCCT-3'
<통계처리>
결과는 평균±표준편차(standard deviation)로 표기하였으며, 실험군 사이의 통계학적 비교는 Tukey honestly Significant Difference(HSD)을 통해 one-way measures analysis of variance (ANONA)를 시행하였으며, p<0.05는 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
실시예 1. 수면장애가 유발된 C57BL /6 마우스에서 Fraxinus 속 추출물이 칼슘 결합 단백질의 mRNA 발현량에 미치는 효과
수면장애가 유발된 C57BL/6 마우스의 대뇌피질에서 물푸레나무 추출물이 calretinin mRNA 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 실험방법에 따라, 수면장애를 유발한 C57BL/6에 경구투여 방법으로 정상군과 스트레스 대조군에 PBS를 투여하였고, 양성대조군에는 15mg/kg의 독세핀을 투여하였고, 추출물 투여군에는 100mg/kg의 물푸레나무 추출물을 투여하였다. 1시간 후에 발바닥 전기충격과 구속을 가하여 14일 동안 수면장애를 유발하였고, 부검 시 마우스의 대뇌피질을 회수하여 RNA를 얻고 cDNA를 만들어 실시간 유전자 분석기를 통해 calretinin mRNA 발현을 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, calretinin mRNA 발현량은 정상군(normal) 대비 대조군(control)에서 감소하는 경향을 보였고, 물푸레나무 추출물을 투여한 군에서는 대조군에 대비하여 통계적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 2. 수면장애가 유발된 C57BL /6 마우스에서 Fraxinus 속 추출물이 GABAergic neurons에서 발현되는 신경단백질의 mRNA 발현량에 미치는 효과
수면장애가 유발된 C57BL/6 마우스의 대뇌피질에서 물푸레나무 추출물이 neuropeptide Y mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라 14일 동안의 시료 구강투여 및 발바닥 전기충격과 구속 후 부검 시 마우스의 대뇌피질을 회수하여 RNA를 얻고 cDNA를 만들어 실시간 유전자 분석기를 통해 neuropeptide Y mRNA 발현을 분석하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, neuropeptide Y mRNA 발현은 대조군에서 유의적으로 감소하는 것으로 나타났고, 물푸레나무 추출물과 양성대조군을 투여한 군에서는 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 3. 수면장애가 유발된 C57BL /6 마우스에서 Fraxinus 속 추출물이 GABA를 합성하는 효소의 mRNA 발현에 미치는 효과
수면장애가 유발된 C57BL/6 마우스의 대뇌피질에서 물푸레나무 추출물이 GAD65(glutamic acid decarboxylase 65) 및 GAD67(glutamic acid decarboxylase 67) mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 실험방법에 따라, 14일 동안의 시료 구강투여 및 발바닥 전기충격과 구속 후 부검 시 마우스의 대뇌피질을 회수하여 RNA를 얻고 cDNA를 만들어 실시간 유전자 분석기를 통해 GAD65 및 GAD67 mRNA 발현량을 분석하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, GAD65 및 GAD67 mRNA 발현량은 대조군에서 감소하는 경향을 보였고, 물푸레나무 추출물과 양성대조군을 투여한 군에서는 증가하는 경향을 보였다.

Claims (6)

  1. 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 물푸레나무 추출물의 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수면장애는 스트레스에 의한 불면증인 것을 특징으로 하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 물푸레나무 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 물푸레나무( Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 수면 장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
PCT/KR2019/012498 2018-10-17 2019-09-26 프락시누스속 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2020080696A1 (ko)

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