WO2019212327A1 - 시트러스 과피 추출물을 포함하는 카페인에 의한 수면장애 개선용 조성물 - Google Patents

시트러스 과피 추출물을 포함하는 카페인에 의한 수면장애 개선용 조성물 Download PDF

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WO2019212327A1
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caffeine
citrus
extract
sleep disorders
composition
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PCT/KR2019/095002
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박지호
이윤정
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(주)노아스
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    • A23F5/24—Extraction of coffee; Coffee extracts; Making instant coffee
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives

Definitions

  • the present invention relates to citrus (Citrus) peel extract to a composition for improving sleep disorders due to containing caffeine as an active ingredient.
  • Caffeine is an alkaloid found in the fruits, leaves, and seeds of some plants. It is found in seeds, tea leaves, cacao and cola.
  • Caffeine is found in a variety of foods, including coffee, chocolate, cola, tea, soft drinks, tonic drinks, and medicines. Coffee is the most popular beverage among caffeine-containing foods.
  • Coffee contains approximately 50-150 mg of caffeine in 200 mL quantities.
  • Caffeine contained in coffee has effects such as fatigue recovery and arousal effects, so modern people who are tired of stress and fatigue drink more than one cup a day.
  • An object of the present invention is to provide a citrus (Citrus) food compositions, sleep disorders improved by caffeine containing rind extract.
  • Another object of the present invention is to provide a citrus (Citrus) Peel Extract, sleeping disorders for prevention and treatment
  • the pharmaceutical composition of the caffeine containing is to provide a citrus (Citrus) Peel Extract, sleeping disorders for prevention and treatment.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object relates to a food composition, sleep disorders improved by caffeine containing citrus (Citrus) peel extract.
  • citrus is a whole name over in three of tangerine and of citrus (Citrus), citrus (Fortunella), taengja in (Pontirus), or lysine (Narigin), carry angiogenin (Naringenin), Hesperidin, Tangeretin, Nobiletin and various compounds.
  • the citrus is a fruit and immature fruit of citrus fruits such as tangerine, kumquat, mandarin, tangerine, sweetie, citron, young mandarin orange, cheonhyehyang, calamansi, pomelo, Hallabong, orange, lemon, grapefruit, lime, citron It does not specifically limit as long as it belongs to a Citrus plant.
  • Naringin (naringin) contained in the citrus is a glycoside of the flavonoid pigment, and has excellent antimicrobial activity because it acts as a strong bacteriostatic and antimicrobial action through antioxidant action, metal blockade action, ascorbic acid synergy.
  • naringenin The naringenin (Naringenin) is known to have anti-inflammatory, antioxidant, anti-cancer activity as well as antibacterial and antiviral activity.
  • Hesperidin is known to lower blood pressure and blood sugar by lipolytic action, and to lower blood LDL cholesterol levels through capillary potentiation and fat metabolism improvement.
  • Tangeretin (Tangeretin) is known to have anti-inflammatory, antioxidant, and anticancer activity with neuroprotective action.
  • the nobiretin (Nobiletin) is effective as a treatment for asthma by regulating lipid metabolism and relaxing bronchial smooth muscle, it is known to have an effect to prevent heart disease.
  • the “skin” refers to the shell covering the outside of the flesh, in the botanical sense is divided into surgical (exocarp), mesothelial (mesocarp) and endothelial (endocarp), the skin of the citrus according to the invention is surgical and mesothelial It shall be referred to.
  • the skin of the citrus of the present invention may be the dermis, but is not limited thereto.
  • citrus Unshiu Peel is a medicinal herb that is defined as the ripe fruit peel of tangerine, and refers to dried pericarp.
  • the dermis and the dermis may be used interchangeably.
  • extract is to separate the active ingredient contained in the extract material by contacting the solvent and the extraction material under specific conditions, the extract may include the active ingredient in the raw material by the extraction process for the citrus rind extract. .
  • the citrus rind extract may be extracted according to a conventional method known in the art for extracting the extract from natural products, that is, using a conventional solvent under the conditions of conventional temperature, pressure.
  • the citrus peel extract may be extracted using water, alcohol, ethyl acetate acetone, nucleic acid, dichloromethane or a mixed solvent thereof, and more specifically, water may be used.
  • the extraction method may use a variety of methods, such as hot water extraction, cold needle extraction, reflux extraction, ultrasonic extraction, preferably hot water extraction, but is not limited thereto.
  • Caffeine (1,3,7-trimetnylxanthine) of the present invention is a psychoactive substance widely used as a central nervous system stimulant is present in coffee trees, cacao fruit and the like and is also included in cola, chocolate and the like.
  • the caffeine is a substance that acts as an inhibitor of adenosine and adenosine receptors (Adenosine A1 Receptor and Adenosine A2a Receptor) binding.
  • the adenosine is a neuromodulator that promotes sleep and inhibits arousal by inhibiting production of neurotransmitters and promoting GABA (gamma-aminobutyric acid) production.
  • the GABA gamma-aminobutyric acid
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • anxiety relief convulsion prevention or amelioration, sedation, and sleep induction and amelioration effects
  • sleep disorders may be caused by inactivation of GABA.
  • caffeine stimulates the central and peripheral nervous system to help improve concentration and prevent drowsiness, but excessive ingestion may cause sleep disorders such as nervousness, excitement or insomnia and may also affect the endocrine system. have.
  • the citrus rind extract competitively acts with caffeine to antagonize adenosine receptors, thereby inhibiting the production of neuroactive substances and effectively increasing the production of GABA to achieve anti-insomnia effects.
  • antagonist is a content of a similar binding site surrounding a specific binding site (binding site) to compete.
  • the citrus rind extract may prevent or improve sleep disorders caused by caffeine, and more specifically, may minimize sleep disorders caused by caffeine.
  • “Sleep” in the present invention is an important physiological function of the brain-developed animals, and refers to behaviors essential for survival.
  • the brain must be able to process high-level information only with good sleep.
  • “sleep disorder” is a condition characterized by waking up unrecovered, waking up in the middle of the night, having trouble waking up after waking up, having difficulty falling asleep or waking up too early, etc. It is a disease reported to affect about 15% of all Korean adults annually.
  • Sleep disorders are widely used as meaning any and all types of sleep loss. Sleep disorders can last acute or chronically.
  • the sleep disorder may include all kinds of sleep disorders known in the art, and may be a sleep disorder caused by stress, health condition, pain, medication, jet lag or noise, and specifically, sleep caused by caffeine. It may be a disorder.
  • prevention means all actions that inhibit or delay the occurrence of sleep disorders in advance. Prevention can be complete or partial. In this case, the degree of sleep disorder of the individual may mean a phenomenon of decreasing as compared with the case where the composition for preventing or improving sleep disorder is not used.
  • “Improvement” in the present invention means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, for example the extent of symptoms.
  • By using the citrus peel or dermis extract of the present invention includes all the actions that improve or beneficially alter the symptoms of sleep disorders.
  • the citrus peel extract is to use a substance derived from natural products as it is, such as chemicals, fatal side effects due to its ingestion or administration can be minimized.
  • the sleep disorder may be insomnia caused by caffeine or circadian rhythm sleep disorders.
  • insomnia refers to a condition in which alone or multiple symptoms of unrelieved symptoms occur when it is difficult to fall asleep or wakes up frequently or wakes up in the morning. It has been known that insomnia may occur when taking caffeine, and the composition of the present invention has been found to improve the reduction of sleep time by caffeine (FIG. 6), and may be used for improving insomnia.
  • circadian rhythm sleep disorders are disorders caused by a problem in the body organs that govern circadian rhythms or by a misalignment between internal circadian rhythms and external factors.
  • Representative diseases include delayed or advanced sleep phase syndrome, and may be caused by changing the biological cycle due to the influence of physiological or neurological activity by a compound such as caffeine. It was confirmed that the composition of the present invention can mitigate the neuronal activity caused by caffeine, it can improve the circadian rhythm sleep disorder caused by the life cycle change by caffeine.
  • the form of the food may be coffee, but is not limited thereto.
  • the coffee may be ground coffee or instant coffee, and the form of the coffee is not particularly limited.
  • the coffee may include nocaffeine coffee.
  • Coffee beans may be made from Jamaican Blue Mountain, Indonesian Jewisha, Colombian Soprimo, Guatemala Antigua, Kenya Arabica, Brazilian Santos, Ethiopian Mocha Yegachev. These beans can be dried and ground after roasting to be used for roasting.Roasting is roasting by heating the green beans. The coffee beans are heated to create a physical and chemical change in the internal structure of the coffee beans to determine the unique taste and aroma of coffee. It is processing.
  • Instant coffee may be added to the coffee beans sugars and fats and the like.
  • the sugar is any one selected from white sugar, glucose, dextrin, fructose, oligosaccharide, propolis, trehalose, sorbitol, xylitol, mannrol, mantirol, ramnirol, inosol, erythrol, paratinos and quersirol The above can be used.
  • fat or oil may use any one or more selected from powdered milk, skim milk powder, and plant powder.
  • Coffee containing the extract of citrus rind of the present invention can not only prevent sleep disorder, which is one of the side effects caused by coffee, but also inhibit neuronal hyperactivity caused by caffeine overdose.
  • the citrus rind extract is added to or included in the coffee, thereby not altering the original taste of the coffee, and by competing with caffeine can minimize the insomnia effect that can be caused by caffeine.
  • Foods to which the citrus peel extract of the present invention can be added include dairy products, including various types of soups, meat, bread, chocolate, snacks, candy, confectionary, ramen, pizza, other noodles, gums, ice cream, as well as the coffee , Beverages, tea, drink, alcoholic beverages and vitamin complexes.
  • the liquid component added in addition to the citrus rind extract of the present invention is not limited thereto, and may include various flavors or natural carbohydrates as additional components, as in general beverages.
  • Natural carbohydrates described above include monosaccharides (e.g. glucose, fructose, etc.), disaccharides (e.g. maltose, sucrose, etc.) and polysaccharides (e.g. conventional sugars such as dextrins, cyclodextrins, etc.), and xylitol, sorbitol And sugar alcohols such as erythritol.
  • the kind of food may be a food additive
  • the food additive refers to a substance used by food additives, mixing, infiltration or other methods for manufacturing, processing, or preserving food.
  • the food additives are natural and synthetic, and can be classified according to their function and use.
  • the form of the food additive may include powder, granule, tablet, capsule or liquid form, but is not limited to the above form.
  • the type of the food may specifically be a health functional food.
  • the dietary supplement includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickening. Agent, pH adjuster, stabilizer, preservative, glycerin, alcohol, carbonation agent used in carbonated beverages and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain fruit flesh for the production of fruit and vegetable drinks. These components may be used alone or in combination, and the ratio of such additives may be selected in the range of 0.001 to 50 parts by weight per total weight of the composition.
  • the health functional food is a food that emphasizes the bioregulatory function of the food and is a food which has added value to act and express a specific purpose by using physical, biochemical and biotechnological methods.
  • the components of the health functional food are designed and processed to fully exercise the body control functions related to biological defense and control of body rhythm, prevention and recovery of diseases to the living body, and are acceptable food supplement additives, sweeteners or functional foods. It may contain a raw material.
  • the citrus rind extract of the present invention When used as a nutraceutical (or nutraceutical beverage additive), the citrus rind extract may be added as it is or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the citrus rind extract may be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or improvement, therapeutic treatment).
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating sleep disorders caused by caffeine, comprising a citrus rind extract.
  • the sleep disorder may be insomnia or circadian rhythm sleep disorders caused by caffeine.
  • “Sleep Disorder”, “Insomnia” and “Circadian Rhythm Sleep Disorder” are as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the citrus rind extract of the present invention for administration.
  • the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • compositions of the present invention can be applied in any formulation, more specifically oral formulation.
  • Parenteral formulations may be in the form of sprays, such as injections, applications, aerosols, and the like.
  • Another aspect of the invention relates to a method of treating sleep disorders comprising administering a pharmaceutical composition comprising a citrus peel extract to a subject in need thereof in a pharmaceutically effective amount.
  • the sleep disorder may be insomnia or circadian rhythm sleep disorder caused by caffeine.
  • “Sleep Disorder”, “Insomnia” and “Circadian Rhythm Sleep Disorder” are as described above.
  • “Pharmaceutically effective amount” as used herein means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level refers to a patient's sexually transmitted disease, age, type of disease, severity, drug Can be determined according to the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of treatment, factors including the drug used concurrently and other factors well known in the medical field.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the term "individual" of the present invention includes animals or humans with sleep disorders whose symptoms can be ameliorated by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. By administering a therapeutic composition according to the invention to an individual, sleep disorders can be effectively prevented and treated.
  • administration means introducing any substance into a human or animal by any suitable method, and the route of administration of the therapeutic composition according to the present invention is via any general route as long as it can reach the target tissue. Oral or parenteral administration.
  • the therapeutic composition according to the present invention can be administered by any device that the active ingredient can move to the target cell.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention exhibits an effect of calming excessive neuronal activity caused by caffeine and at the same time improving sleep disorders.
  • the composition of the present invention can inhibit the caffeine neuronal activity in a short time, and thus suppress the continuous action of caffeine.
  • it can be widely used for stabilizing nerve activity induced by caffeine and improving sleep disorders.
  • Figure 1 shows the result of confirming the components contained in the dermal sample through HPLC.
  • FIG. 2 shows the HPLC quantitative analysis of Hesperidin (Hesperidin) contained in the dermis.
  • Figure 3 shows the results of HPLC quantitative analysis of narirutin (Narirutin) contained in the dermis.
  • Figure 4 shows the contents of hesperidin and narirutin contained in the dermal sample (10mg).
  • Figure 5 shows the hippocampal tissue section culture process.
  • FIG. 6 shows the microelectrode array (MEA) setting process of hippocampal tissue.
  • FIG. 7 shows a spike detection process (B) using a microelectrode array (MEA) experimental protocol (A) and a band pass filter.
  • MEA microelectrode array
  • Figure 8 shows the results confirmed that the neuronal activity by caffeine was alleviated when the dermis extract treatment (A: neuronal activity when caffeine treatment, B: neuronal activity when caffeine and dermis extract treatment, C: caffeine alone treatment and caffeine and dermis Comparison of pre-washed neuronal activity in extract treatment, D: caffeine alone and post-washed neuronal activity in caffeine and dermal extract treatment).
  • Figure 9 shows the results confirmed that the neuronal activity by caffeine in the treatment of hesperidin, narirutin or a mixture thereof contained in the dermis extract was relieved (A: neuronal activity in caffeine treatment, B: neuronal activity in caffeine and hesperidin treatment, C: neuronal activity upon treatment with caffeine and narirutin, D: neuronal activity upon treatment with caffeine, hesperidin and nariroutine).
  • Figure 10 shows the results of confirming that the neuronal activity by caffeine is alleviated upon treatment of hesperidin, narirutin or a mixture thereof contained in the dermis extract before and after caffeine washing (A: before caffeine washing, B: caffeine washing) after).
  • FIG 11 shows an experimental procedure of oral administration and recording of SD rats for sleep time measurement (A: oral administration of SD rats, B: recording process for measurement of sleep time).
  • Figure 12 shows the results confirmed that the sleep time was recovered when the dermis extract treatment.
  • HPLC confirmed the compound contained in the dermis extract of the present invention. Specifically, the dermis extract was measured using reverse phase HPLC (Vltimate 3000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) consisting of an autosampler, a binary pump, and a PDA detector. Reversed phase HPLC columns were C18 (Discovery C18, 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm; Sigma, MO, USA). The injection dose was 10 ⁇ L injected at a rate of 0.8 mL / min.
  • the mobile phases A and B used 100% tertiary distilled water and 100% acetonitrile, respectively, and the composition of the gradient elution was 90% A / 10% B, 5 to 5 at 0 to 5 minutes. 75% A / 25% B at 14 minutes, 40% A / 60% B at 14 to 25.5 minutes, 20% A / 80% B at 25.5 to 30.5 minutes, 90% A / 10% B at 30.5 to 35 minutes Proceeded. All compounds were detected at 280 nm wavelength and the analysis temperature was maintained at 40 °C. The data of the sample test solution collected through HPLC / PDA was confirmed by comparing the retention time of the standard and the UV spectrum waveform.
  • narirutin narirutin
  • hesperidin hesperidin
  • the content of the narirutin and hesperidin in the dermis extract was calculated (FIGS. 2 and 3), and as a result, the content of narirutin and hesperidin contained in the dermal extract 400 ⁇ g / ml was 136 ⁇ g / ml and 40 ⁇ g / ml, respectively It was confirmed that (Fig. 4).
  • Hippocampal organotypic slice culture (HOSC)
  • the organotypic culture of brain hippocampal slices using thin films has already been widely used. Specifically, the brain hippocampus was extracted from Sprague Dawley white young rats (Orientbio Co., Seungnam, Korea) between 5 and 7 days of age and sliced to 350 ⁇ m thickness using tissue ablation (Mickle Laboratory Engineering Co., UK). Five to six slices were placed in a thin film insert (Millicell-CM; Millipore, Mass.) With 0.4 ⁇ m holes and placed in a 6-well plate (SPL Life Sciences Co., Korea) at 5 ° C at 36 ° C. 2 (Dong-A Co., Seoul, Korea) was maintained in the incubator maintaining.
  • the brain hippocampal cultures cultured using pins were carefully separated from the culture thin-film inserts, and then coated with 0.01% polyethylenimine (polyethylenimine, Sigma, St. Louis, Mo, USA), 10 x 8 microns with a diameter of 10 ⁇ m and an interval of 100 ⁇ m. It was placed on a microelectrode array (MEA; Multi Channel Systems, Germany).
  • polyethylenimine polyethylenimine, Sigma, St. Louis, Mo, USA
  • aCSF 114 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3 , 10 mM glucose, 3 mM KCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 20 mM
  • the artificial spinal cord solution into which 5% CO 2 and 95% O 2 mixed gas was injected was perfused at a rate of 3 mL / min, and the MEA and artificial spinal cord solution were maintained at 33 ° C (FIG. 6). ).
  • the stabilized hippocampal tissue was recorded for 3 minutes, followed by artificial cerebrospinal fluid or 1 mM caffeine and assay samples (dermal extract 400 ⁇ g / ml, containing 1 mM caffeine (Sigma, St. Louis, Mo, USA)).
  • Artificial cerebrospinal fluid containing 40 ⁇ g / ml of hesperidin and 136 ⁇ g / ml of narirutin) was perfused under the same conditions for 20 minutes, and then burned for 3 minutes.Washed for 20 minutes with only artificial cerebrospinal fluid and recorded for 3 minutes. Minutes of data were obtained.
  • the hippocampal MEA reads data through a total of 60 channels at a sampling rate of 25 kHz per channel and is recorded by a computer using the MC_Rack and MC_Data Tool (Multi Channel Systems, GmbH) software. To extract meaningful spikes from all the recorded signals, a four-step band pass filter was used.
  • X represents an RMS value for noise
  • ⁇ is a factor that determines each threshold.
  • the threshold is composed of three factors (0.6, 1 and 3). If the value of ⁇ is greater than 0.6, a significant spike is obtained, and the threshold level at this time is -21.63 ⁇ V. This process was performed using the MATLAB (Mathworks Inc., Natick, Massachusetts, USA) program for all 60 channels (Fig. 7).
  • the dermis extract of the present invention exhibited the effect of reducing neuronal activity by inhibiting the effect of caffeine increased continuously as described above.
  • hesperidin, narirutin, or a mixture thereof contained in the dermis extract was treated with caffeine, respectively.
  • hesperidin and narirutin were found to be able to inhibit the increase of caffeine-induced neuronal activity.
  • neuronal activity was more effectively inhibited when treated together with hesperidin and narirutin (FIG. 9).
  • the neuronal activity shown in the case of caffeine treatment continues to appear even after washing the caffeine, which may lead to a long time instead of a short time, and the neural activity by caffeine continues. It indicates the possibility of side effects.
  • Sprague Dawley rat was selected as 6 weeks old and was purchased from Orient Bio (Seongnam, Korea). In order to keep the experimental environment constant, one animal per cage was kept in a cage. The experimental animals were acclimated for one day in an environment where 25 ° C, 50% humidity, lighting (12 hours light / dark) was automatically maintained, and free of negative water and diet. All procedures followed the policies of the Animal Research Ethics Committee of Kyung Hee University and the regulations on animal testing (IRB approval number: KHUASP (SE) -17-039).
  • sleep times were measured during the days when SD rats were originally required to sleep.
  • the sleep time was measured by recording a cage for 5 hours using a camcorder (Sony Co., Tokyo, Japan) from 10 am, and the measurement time was referred to the previous study.
  • a total of three plants were recorded each day, one in each group, and only one object was placed in each cage so as not to affect each other.
  • the illuminance of the space to measure was kept constant, humidity 50%, temperature 25 °C, and sound insulation was maintained.
  • the sleep pattern and time are determined by using the Multi-Channel Stopwatch (Techsys Co. Seoul, Korea) as a sleep state when the rat closes its eyes and lasts for at least 5 minutes in a prone position. The time from the time point until the end of the sleep was measured by adding up (FIG. 11).
  • the dermis extract of the present invention has the effect of calming the excessive neuronal activity by caffeine and at the same time improve sleep disorders, in particular over the effect of inhibiting the neuronal activity of caffeine in a short time. It indicates that even a continuous action can be suppressed. Accordingly, the dermis extract of the present invention can be widely used for stabilizing neuronal activity induced by caffeine and improving sleep disorders.
  • the extract of Citrus rind has similar properties and can exhibit anti-insomnia effect in common.

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Abstract

본 발명은 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카페인으로 인한 수면장애 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

시트러스 과피 추출물을 포함하는 카페인에 의한 수면장애 개선용 조성물
본 발명은 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카페인으로 인한 수면장애 개선용 조성물에 관한 것이다.
카페인(Caffeine)은 일부 식물의 열매, 잎, 씨앗 등에 함유된 알칼로이드(alkaloid)의 일종으로 커피 열매의 씨앗, 찻잎, 카카오와 콜라 열매 등에 들어있다.
카페인은 커피, 초콜릿, 콜라, 차, 소프트드링크, 강장 음료 및 약품 등 다양한 식품에 함유되어 있으며, 커피는 카페인이 함유되어 있는 식품 중 가장 대중적인 음료로 각광받고 있다.
커피는 200mL 기준으로 대략 50~150 mg의 카페인을 함유하고 있다. 커피에 함유된 카페인은 피로회복 및 각성 작용 등의 효과를 나타내므로, 스트레스와 피로에 지친 현대인들은 하루에 한 잔 이상 커피를 마시고 있다.
하지만 카페인을 다량 복용하거나 심신이 허약한 사람이 카페인을 복용하는 경우, 불안, 신경과민, 불면증, 두통, 심장 떨림, 심계항진 등이 발생할 수 있다(한국등록특허 제10-1265253호).
따라서 카페인으로 인한 수면장애 등의 부작용을 최소화할 수 있는 새로운 식음 제품을 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있으나, 대중들의 기호를 충족시킬 수 있도록 카페인의 함량을 유지하면서 카페인에 의한 부작용을 보완할 수 있는 방법은 아직까지 부재한 실정이다.
본 발명의 목적은 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 “시트러스( Citrus)”의 사전적 의미는 귤과의 귤속( Citrus), 귤속( Fortunella), 탱자속( Pontirus)의 3속에 걸친 총괄적 명칭이며, 나리진(Narigin), 나르제닌(Naringenin), 헤스페리딘(Hesperidin), 탄제레틴(Tangeretin), 노비레틴(Nobiletin) 등 다양한 화합물을 포함한다.
상기 시트러스는 귤, 금귤, 만다린, 탠저린, 스위티, 시트론, 영귤, 천혜향, 칼라만시, 포멜로, 한라봉, 오렌지, 레몬, 자몽, 라임, 유자 등의 시트러스 계열에 포함되는 과일 및 이들의 미숙과를 지칭하며, 귤속( Citrus) 식물에 속하는 한 특별히 제한되지 않는다.
상기 시트러스에 함유된 나린진(naringin)은 플라보노이드 색소의 배당체로서 항산화 작용, 금속봉쇄 작용, 아스콜빈산 상승작용을 통해 강력한 정균 및 항균 작용을 하므로 항균 활성이 우수하다.
상기 나르제닌(Naringenin)은 항균, 항바이러스 활성뿐만 아니라, 항염증, 항산화, 항암 활성이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 헤스페리딘(Hesperidin)은 지질 분해 작용으로 혈압 및 혈당을 낮추고, 모세혈관 강화작용, 지방대사 개선작용을 통해 혈중 LDL 콜레스테롤 수치를 낮추는 것으로 알려져 있다.
상기 탄제레틴(Tangeretin)은 신경보호 작용과 함께, 항염증, 항산화, 항암 활성이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 노비레틴(Nobiletin)은 지질대사를 조절하고 기관지 평활근을 이완시켜 천식 치료제로서 효과가 있으며, 심장질환 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다.
상기 “과피”는 과육의 외측을 덮고 있는 껍질을 의미하는 것으로, 식물학적인 의미에서 외과피(exocarp), 중과피(mesocarp) 및 내과피(endocarp)로 나누어지며, 본 발명에 따른 시트러스의 과피는 외과피 및 중과피를 지칭하는 것으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 시트러스의 과피는 진피일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “진피( Citrus Unshiu Peel)”는 귤나무의 잘 익은 열매 껍질로 정의되어 있는 약재로서, 과피를 건조시킨 것을 말한다. 본 발명에서 진피와 과피는 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 헤스피리딘, 나리루틴 또는 이들의 혼합물을 처리한 경우 카페인에 의한 신경 활성이 완화 또는 억제됨을 확인하였는 바(도 9 및 도 10), 구체적으로 상기 상기 시트러스( Citrus) 과피 추출물은 헤스페리딘 및 나리루틴 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 “추출물”은 용매와 추출 재료를 특정 조건하에서 접촉시킴으로써 추출 재료에 함유된 유효성분을 분리해낸 것으로, 상기 추출물은 시트러스 과피 추출물에 대한 추출 공정에 의해 원료 내의 유효성분을 포함할 수 있다.
상기 시트러스 과피 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다.
구체적으로, 상기 시트러스 과피 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 보다 구체적으로는 물을 사용할 수 있다.
상기 추출 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 카페인(1,3,7-trimetnylxanthine)은 중추신경계통 각성제로 널리 사용되는 향정신성 물질로 커피 나무, 카카오 열매 등에 존재하며 콜라, 초콜릿 등에도 포함되어있다. 상기 카페인은 아데노신과 아데노신 수용체(Adenosine A1 Receptor 및 Adenosine A2a Receptor)결합의 억제제로 작용하는 물질이다.
상기 아데노신은 신경 조절자로 신경전달물질의 생성 억제 및 GABA(감마-아미노부티르산) 생성 촉진을 통해 수면을 촉진하고 각성을 억제하는 물질이다.
상기 GABA(감마-아미노부티르산)은 불안 완화, 경련 예방 또는 개선, 진정작용, 및 수면 유도 및 개선 효과와 관련이 있으며 GABA의 불활성화에 의해 수면장애가 발생할 수 있다.
상기 GABA와 카페인이 함께 작용하면 카페인의 효과가 보다 우월하여 카페인에 의해 아데노신 수용체가 억제되고, 억제된 아데노신 수용체는 신경전달물질을 과발현시키고 GABA의 생성을 억제한다.
이에 따라, 카페인의 적당한 섭취는 중추신경계와 말초신경계를 자극하여 집중력 향상, 졸음 방지에 도움을 주지만 과하게 섭취할 경우에 신경과민, 흥분 또는 불면 등의 수면 장애를 유발하며 내분비계에도 영향을 미칠 수 있다.
상기 시트러스 과피 추출물은 카페인과 경쟁적으로 작용하여 아데노신 수용체를 길항시킴으로써 신경활성 물질의 생성을 억제하고 GABA의 생성을 효과적으로 증가시켜 항불면 효과를 구현할 수 있다. 상기 “길항”은 구조가 유사한 물질끼리 한정된 특정 결합 부위(binding site)를 둘러싸고 경합하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 진피 외 다른 종류의 시트러스 과피 추출물도 신경 활성을 완화시키는 효과가 있는지 여부를 확인한 결과, 진피 추출물과 유사하거나 동등한 수준으로 신경 활성 정도가 완화되는 것을 확인하였다.
또한 구체적으로, 상기 시트러스 과피 추출물은 카페인으로 인한 수면 장애를 예방 또는 개선할 수 있으며 보다 구체적으로, 카페인으로 인한 수면장애를 최소화시킬 수 있다.
본 발명에서 "수면"은 뇌가 발달된 동물들의 중요한 생리기능으로서, 생존을 위해 불가결한 행동을 말한다. 뇌는 질 좋은 수면이 있어야 비로소 고차원의 정보를 처리할 수 있는 능력을 발휘할 수 있다.
본 발명에서 “수면장애”는 회복되지 않은 채로 기상하는 것, 한밤중에 기상하는 것, 깬 후 다시 잠드는 데 어려움을 겪는 것, 잠드는 데 어려움을 겪는 것 또는 너무 일찍 기상하는 것 등으로 특징지어지는 병태를 의미하고, 우리나라 연간 전체 성인 가운데 약 15 % 정도에 영향을 주는 것으로 보고된 질환이다.
상기 수면장애는 임의의 및 모든 수면 상실의 유형 및 등급을 의미하는 것으로서 널리 사용되고 있다. 수면 장애는 급성 또는 만성으로 지속될 수 있다.
상기 수면장애는 당업계에서 알려져 있는 모든 종류의 수면장애를 포함할 수 있고, 스트레스, 건강 상태, 통증, 투약, 시차증(jet lag) 또는 소음 등에 의한 수면장애일 수 있으며, 구체적으로 카페인에 의한 수면장애일 수 있다.
본 발명에서 “예방”이란 수면장애의 발생을 사전에 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우 개체의 수면장애 정도가 상기 수면장애 예방 또는 개선용 조성물을 사용하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.
본 발명에서 “개선”이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 시트러스 과피 또는 진피 추출물을 이용하여 수면장애 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 포함한다.
상기 시트러스 과피 추출물은 화학물질 등과 달리 천연물 유래의 물질을 그대로 이용하는 것이므로, 이의 섭취 내지 투여에 따른 치명적인 부작용이 최소화될 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)인 것일 수 있다.
본 발명에서, “불면증”은 잠들기 어렵거나 자다가 자주 깨거나 아침에 일어나면 개운하지 않은 증상을 단독 또는 복합적으로 보이는 상태를 말한다. 카페인 복용시 상기 불면증이 발생될 수 있음은 알려진 바 있으며, 본 발명의 조성물은 카페인에 의한 수면 시간 감소를 개선시키는 것을 확인하였는 바(도 6), 상기 불면증 개선 용도로 활용될 수 있다.
본 발명에서, “일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)”는 일주기 리듬을 관장하는 신체기관에 문제가 생기거나 혹은 내적인 일주기 리듬과 외부적 요인 사이에 정렬이 깨지면서 생기는 장애이다. 대표적인 질환으로 지연성 혹은 전진성 수면위상 증후군 등이 있으며, 카페인 등과 같은 화합물에 의해 생리활성 또는 신경활성이 영향을 받음으로 인하여 생체 주기가 바뀌면서 발생될 수 있다. 본 발명의 조성물은 카페인에 의한 신경 활성을 완화시킬 수 있음을 확인하였는 바, 카페인에 의한 생체 주기 변화에 따른 일주기리듬 수면장애를 개선시킬 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 식품의 형태는 커피일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 커피는 원두커피 또는 인스턴트 커피일 수 있으며, 커피의 형태는 특별히 제한되지 않는다. 또한 구체적으로, 상기 커피는 노카페인 커피를 포함할 수 있다.
원두커피는 자메이카 블루마운틴, 인도네시아 토라자, 콜롬비아 수프리모, 과테말라 안티구아, 케냐 아라비카, 브라질 산토스, 에티오피아 모카 예가체프 등의 원두를 사용할 수 있다. 이러한 원두는 생두를 건조시켜, 로스팅 후에 분쇄하여 사용할 수 있으며, 로스팅은 생두를 가열하여 볶는 것으로, 커피 생두에 열을 가하여 생두 내부 조직에 물리적, 화학적 변화를 일으킴으로써 커피 특유의 맛과 향을 결정하는 가공처리이다.
인스턴트 커피는 원두커피에 당류 및 유지 등이 더 첨가될 수 있다. 이때, 당류는 백설탕, 포도당, 덱스트린, 과당, 올리고당, 프로폴리스, 트레할로스, 솔비톨, 자일리톨, 만니롤, 만티롤, 람니롤, 이노시롤, 에리스리롤, 파라티노스 및 쿠에르시롤 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 유지는 분유, 탈지분유 및 식물 성분말 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 시트러스 과피 추출물을 포함하는 커피는 커피에 의한 부작용 중 하나인 수면장애를 방지할 뿐 아니라, 카페인 과다 복용에 의한 신경 과다 활성을 억제시킬 수 있다. 특히, 상기 시트러스 과피 추출물은 커피에 첨가되거나 포함됨으로써 커피 본연의 맛을 변질시키지 않으며, 카페인과 경쟁적으로 작용함으로써 카페인에 의해 유발될 수 있는 불면 효과를 최소화할 수 있다.
본 발명의 시트러스 과피 추출물을 첨가할 수 있는 식품은 상기 커피 뿐 아니라 소세지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 본 발명의 시트러스 과피 추출물 외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.
상기 식품의 종류는 식품 첨가제일 수 있으며, 상기 식품 첨가제는 식품의 제조, 가공, 또는 보존을 위해 식품에 첨가, 혼합, 침윤 기타의 방법에 의해 사용되는 물질을 의미한다. 상기 식품 첨가제는 천연물과 합성품이 있으며, 기능과 용도에 따라 분류할 수 있다. 상기 식품첨가제의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태를 포함할 수 있으며, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
본 발명의 시트러스 과피 추출물을 건강기능식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 시트러스 과피 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 시트러스 과피 추출물을의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 시트러스 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)인 것일 수 있다.
“수면장애”, “불면증”, “일주기리듬 수면장애” 는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 본 발명의 시트러스 과피 추출물 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 보다 구체적으로 경구용 제형일 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 시트러스 과피 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 수면장애의 치료방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애인 것일 수 있다.
“수면장애”, “불면증”, “일주기리듬 수면장애” 는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 수면장애를 가진 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 수면장애를 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 카페인에 의한 과다한 신경활성을 진정시킴과 동시에 수면장애를 개선시키는 효과를 나타내며, 특히 단시간에서의 카페인의 신경 활성을 억제하는 효과를 넘어서 카페인의 지속적 작용까지도 억제할 수 있음에 따라, 카페인에 의해 유도된 신경 활성을 안정시킴과 함께 수면장애를 개선시키는 용도로 널리 활용될 수 있다.
도 1은 진피 샘플 내 함유된 성분을 HPLC를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 진피에 함유된 헤스페리딘(Hesperidin)의 HPLC 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 진피에 함유된 나리루틴(Narirutin)의 HPLC 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 진피 샘플(10mg)에 함유된 헤스페리딘 및 나리루틴의 함량을 나타낸 것이다.
도 5는 해마 조직 절편 배양 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 해마조직의 마이크로일렉트로드 어레이(MEA) 셋팅 과정을 나타낸 것이다.
도 7은 마이크로일렉트로드 어레이(MEA) 실험 프로토콜(A) 및 band pass filter를 이용한 스파이크 검출 과정(B)을 나타낸 것이다.
도 8은 진피 추출물 처리시 카페인에 의한 신경 활성이 완화된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 카페인 처리시 신경 활성, B: 카페인 및 진피 추출물 처리시 신경 활성, C: 카페인 단독 처리 및 카페인 및 진피 추출물 처리시의 워싱 전 신경활성 비교, D: 카페인 단독 처리 및 카페인 및 진피 추출물 처리시의 워싱 후 신경활성 비교).
도 9는 진피 추출물에 함유된 헤스페리딘, 나리루틴 또는 이의 혼합물 처리시 카페인에 의한 신경 활성이 완화된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 카페인 처리시 신경 활성, B: 카페인 및 헤스페리딘 처리시 신경 활성, C: 카페인 및 나리루틴 처리시 신경 활성, D: 카페인, 헤스페리딘 및 나리루틴 처리시 신경활성).
도 10은 진피 추출물에 함유된 헤스페리딘, 나리루틴 또는 이의 혼합물 처리시 카페인에 의한 신경 활성이 완화된 것을 확인한 결과를 카페인 워싱 전 및 워싱 후로 비교하여 나타낸 것이다(A: 카페인 워싱 전, B: 카페인 워싱 후).
도 11은 수면시간 측정을 위해 SD rat에 경구투여 및 녹화를 하는 실험과정을 나타낸 것이다(A: SD rat에 경구투여 과정, B: 수면시간 측정을 위한 녹화 과정).
도 12는 진피 추출물 처리시 수면시간이 회복된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예. 진피 추출물의 제조
시트러스의 진피(Gio Herb Co., Yangju, Korea) 100g에 10배(w/v)의 증류수를 가하여 121℃에서 40분간 열수추출하였다. 추출액은 Whatman No. 1 필터 페이퍼 (Whatman International Ltd., Maidstone, UK)를 이용하여 여과하였으며, 걸러진 추출액은 농축기(Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40 ℃에서 5시간 동안 농축시켰다. 농축된 추출액은 동결건조기(Ilsin Bio Co., Yangju., Korea)로 -70 ℃, 5 mTorr에서 7일간 동결건조 시킨 후 글라인더(Ilsin Bio Co., Yangju., Korea)로 분쇄하여 실험에 이용하였다. 위의 과정을 통해 진피를 열수추출 하였을 때 수율은 9.8% 이다.
원물 (g) 추출물 (g) 수율 (%; 추출물/원물)
진피 100 9.8 9.8
실험예 1. 진피 추출물 내의 함유 성분 확인
HPLC를 이용하여 본 발명의 진피 추출물에 함유되어 있는 화합물을 확인하였다. 구체적으로, 진피 추출물을 오토샘플러(autosampler), 바이너리 펌프(binary pump), PDA 디텍터(PDA deterctor)로 구성된 역상 HPLC(Vltimate 3000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 이용하여 측정하였다. 역상 HPLC컬럼은 C18 (Discovery C18, 5 μm, 4.6 × 250 mm; Sigma, MO, USA)을 사용하였다. 주입 용량은 10μL를 0.8mL/min의 속도로 주입하였다.
HPLC에서 용매(mobile phase) A와 B는 각각 100% 3차 증류수 및 100% 아세토나이트릴을 사용하였으며 기울기 용리(gradient elution)의 구성은 0 내지 5분에서는 90% A/10% B, 5 내지 14 분에서는 75% A/25% B, 14 내지 25.5분에서는 40% A/60% B, 25.5 내지 30.5분에서는 20% A/80% B, 30.5 내지 35분에서는 90% A/10% B 로 진행하였다. 모든 화합물은 280nm파장에서 검출하였으며, 분석 온도는 40℃로 유지하였다. HPLC/PDA를 통하여 수집된 검체 시험 용액의 데이터는 표준품의 retention time과 UV spectrum 파형을 비교하여 확인하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 사용한 진피 샘플에서는 나리루틴(narirutin) 및 헤스페리딘(hesperidin)이 포함되어 있는 것을 확인하였다.
또한, 진피 추출물 내의 상기 나리루틴 및 헤스페리딘의 함량을 계산하였으며(도 2 및 도 3), 그 결과 진피 추출물 400μg/ml 에 함유된 나리루틴 및 헤스페리딘의 함량은 각각 136 μg/ml 및 40 μg/ml 임을 확인하였다(도 4).
실험예 2. 신경활성 측정
1-1. 해마 조직 절편 배양(Hippocampal organotypic slice culture, HOSC)
박막을 사용하여 뇌 해마의 절편을 organotypic 배양하는 하는 방법은 이미 일반적으로 많이 사용하는 방법을 사용하였다. 구체적으로, 뇌 해마는 5일령에서 7일령 사이의 Sprague Dawley 흰 어린 쥐(Orientbio Co., Seungnam, Korea)로부터 적출하였고 조직 박절기를 이용하여 350μm 두께로 절편내었다(Mickle Laboratory Engineering Co., UK). 5조각에서 6조각을 0.4μm 구멍을 갖고 있는 박막 insert (Millicell-CM; Millipore, MA) 안에 배치한 후, 6-well plate(SPL Life Sciences Co., Korea)에 넣고 36°C 로 5% CO 2(Dong-A Co., Seoul, Korea)를 유지하는 배양기에서 배양하였다. 배양액(MEM; Welgene, Gyeongsan, South Korea), 20mM HEPES (Sigma, St. Louis, Mo, USA), 25% Hank's balanced salt solution(HBSS; Welgene, Gyeongsan, South Korea), 6 g/L D-glucose(Sigma, St. Louis, Mo, USA), 1mM L-glutamine(Sigma, St. Louis, Mo, USA), 25% horse serum(Welgene, Gyeongsan, South Korea) 과 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, USA), pH=7.1)은 이틀에 한번 씩 갈아주었고 배양 기간은 12~14일이며 이후 실험에 사용하였다(도 5).
1-2. MEA 탐침으로 배양된 뇌해마 조직의 이동
핀을 이용하여 배양된 뇌해마 절편을 배양 박막 insert로부터 조심스럽게 분리한 후, 0.01% 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, Sigma, St. Louis, Mo, USA)으로 코팅된 직경 10 μm, 간격 100 μm인 8x8 마이크로일렉트로드 어레이(microelectrode array, MEA; Multi Channel Systems, Germany)에 올려놓았다. 절편은 멸균된 인공 척수용액(aCSF; 114 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 20 mM HEPES, pH=7.4, Sigma, Louis, Mo, USA)에서 15 분 동안 5% CO 2 및 95% O 2 혼합가스 (Dong-A Co., Seoul, Korea)를 주입하며 33 °C를 유지한 상태로 안정화시켰다. 이후에 뇌 해마를 포함한 MEA를 MEA1060(Multi Channel Systems Inc., Reutlingen, Germany) 증폭장치에 장착하고, MEA 속 인공 척수용액은 Ag/AgCl 으로 접지를 시켰다. 이후에 실험하는 동안은 5% CO 2 및 95% O 2 혼합가스를 투입시킨 인공 척수 용액을 3 mL/min의 속도로 관류시켰으며, MEA와 인공 척수 용액은 33°C로 유지하였다(도 6).
1-3. 신경 활성 측정
안정화가 끝난 해마 조직을 3 분 동안 레코딩(recording) 하였으며, 이후 1 mM의 카페인(Sigma, St. Louis, Mo, USA)이 포함된 인공 뇌척수액 또는 1mM 카페인 및 분석샘플(진피 추출물 400 μg/ml, 헤스페리딘 40 μg/ml, 나리루틴 136 μg/ml) 이 포함된 인공 뇌척수액을 각각 20 분 동안 동일한 조건으로 관류한 후 3분 레코딩 하였고, 다시 인공 뇌척수액만으로 20 분간 워싱한 후 3분을 레코딩하여 총 9 분간의 데이터를 얻었다.
해마조직이 있는 MEA는 총 60개 채널을 통해 각 채널 당 25kHz의 sampling 속도로 데이터를 읽어내며, MC_Rack 및 MC_Data Tool(Multi Channel Systems, GmbH) 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터를 통해 기록된다. 기록된 전체 신호들 중 의미있는 스파이크(spike)를 추출하기 위해 4단계의 band pass filter를 이용하였으며, 식은 아래와 같다.
[식 1]
Figure PCTKR2019095002-appb-img-000001
상기 식에서 X는 노이즈(noise)에 대한 실효값(RMS)을 나타내며, ĸ는 각 각의 임계값(threshold)을 결정하는 인자이다. 여기서는 총 3개의 인자로 threshold를 구성하였다(0.6, 1 및 3). ĸ값이 0.6이상인 경우 의미있는 스파이크(spike)로 하였으며, 이 때의 threshold level은 -21.63 μV 이다. 이 과정은 60개 전 channel을 대상으로 MATLAB(Mathworks Inc., Natick, Massachusetts, USA) 프로그램을 이용하여 수행하였다(도 7).
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 카페인에 의한 신경 활성이 진피 추출물을 처리한 경우 완화되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 카페인을 처리한 경우 신경 활성이 증가되었으며, 카페인을 처리한 후 워싱하더라도 카페인의 작용이 지속되어 신경 활성이 200% 이상 증가되었다(도 8A). 반면, 카페인 및 진피 추출물을 함께 처리한 경우, 카페인만 처리한 경우에 비해 신경 활성 정도가 현저히 감소되었으며, 카페인 단독 처리시와 달리 워싱한 후에도 신경 활성의 지속적 증가가 나타나지 않음에 따라 신경 활성의 유의적 증가 없이 유지되는 것을 확인하였다(도 8B). 카페인을 단독 처리한 경우 및 카페인 및 진피 추출물을 함께 처리한 경우 각각에 대하여 워싱 전, 워싱 후끼리 비교한 경우에도 진피 추출물을 처리시 현저한 신경 활동 감소 효과가 나타남을 확인하였다(도 8C 및 도 8D).
특히, 카페인을 처리 후 워싱한 후에도 신경에서의 카페인에 의한 활성은 증가되는 바, 이는 카페인이 신경에 미치는 활성 작용이 단시간에 짧게 나타나기 보다는 지속적으로 이어짐을 나타내는 것이다. 본 발명의 진피 추출물은 상기와 같이 지속적으로 이어지면서 증가되는 카페인의 효과를 억제시킴으로써 신경 활성을 감소시키는 효과를 나타내었다.
또한, 진피 추출물 내에 함유되어 있는 성분인 헤스페리딘, 나리루틴 또는 이의 혼합물을 각각 카페인과 함께 처리한 결과, 헤스페리딘과 나리루틴은 모두 카페인으로 인한 신경 활성의 증가를 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 나아가, 헤스페리딘 및 나리루틴을 각각 처리할 때보다 함께 처리했을 때 신경 활성이 더 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 9).
구체적으로, 카페인을 처리한 경우 신경 활성이 증가되었으며, 카페인을 처리한 후 워싱하더라도 카페인의 작용이 지속되어 신경 활성이 200% 이상 증가되었다(도 9A). 반면, 카페인 및 헤스페리딘 40 μg/ml(진피 400 μg/ml에 함유된 양)을 함께 처리한 경우, 카페인만 처리한 경우에 비해 신경 활성 정도가 현저히 감소되었으며, 카페인 단독 처리시와 달리 워싱한 후에도 신경 활성의 지속적 증가가 나타나지 않음에 따라 신경 활성의 유의적 증가 없이 유지되는 것을 확인하였다(도 9B). 카페인 및 나리루틴 136 μg/ml(진피 400 μg/ml에 함유된 양)을 함께 처리한 경우에도 마찬가지로 카페인만 처리한 경우에 비해 신경 활성 정도가 현저히 감소되었으며, 카페인 단독 처리시와 달리 워싱한 후에도 신경 활성의 지속적 증가가 나타나지 않음에 따라 신경 활성의 유의적 증가 없이 유지되는 것을 확인하였다(도 9C). 나아가, 카페인과 함께 헤스페리딘 40 μg/ml 및 나리루틴 136 μg/ml을 처리한 경우 신경 활성 감소 효과가 더욱 증가되는 것을 확인하였다(도 9D).
상기 결과를 통해 헤스페리딘 및 나리루틴 성분이 신경 활성을 완화시킬 수 있으며, 두 성분을 모두 함유하고 있는 진피 추출물은 카페인으로 인한 신경 활성을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
나아가, 도 10에 나타난 바와 같이, 카페인을 처리한 경우 나타난 신경 활성은 카페인을 워싱한 이후에도 지속적으로 나타나며, 이는 카페인에 의한 신경 활성 작용이 단시간이 아닌 장시간 이어질 수 있으며, 신경 활성이 장시간 이어짐에 따른 부작용의 발생 가능성을 나타내는 것이다.
반면, 카페인 단독 처리의 경우와 달리 헤스페리딘, 나리루틴, 헤스페리딘 및 나리루틴의 혼합물을 함께 처리한 경우 워싱한 이후에도 신경 활성 억제 효과가 지속됨을 확인하였는 바, 이는 카페인에 의해 유도된 신경 활성이 카페인이 제거된 이후에도 이어지는 것을 억제할 수 있음을 나타내는 것이다(도 10).
실험예 3. 수면장애 개선 효과 확인
3-1. 실험동물
실험동물로는 Sprague Dawley rat 6주령을 선정하였으며, ㈜오리엔트 바이오 (Seongnam, Korea)에서 구입하였다. 실험환경을 일정하게 유지하기 위해, 한 케이지 당 실험동물은 1개체씩 넣어 사육하였다. 실험동물은 25℃, 습도 50%, 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되고 음수와 식이가 자유롭게 공급되는 환경에서 하루 동안 적응기간을 거쳤다. 모든 과정은 경희대학교 실험동물 윤리위원회의 방침과 동물실험관련 규정을 따랐다(IRB 승인번호: KHUASP(SE)-17-039).
2-2. 수면시간 측정
15개체의 SD rat들을 3군으로 나누어 실험을 수행하였다(n=5). 1군에는 물을 경구투여 하였고, 2군에는 카페인(20mg/Kg)을 경구투여 하였으며, 3군에는 진피 추출물(100mg/Kg) 및 카페인(20mg/Kg)을 함께 경구투여 하였다.
설치류가 본래 야행성이라는 점에 착안하여, 수면시간은 SD rat이 본래 수면을 취해야 할 주간동안 측정하였다. 경구투여가 끝난 후, 오전 10시부터 캠코더 (Sony Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 케이지를 녹화하여 수면 시간을 측정하였으며, 측정시간은 선행 연구를 참고하였다. 하루에 각 군별로 1개체씩 총 3개체의 녹화를 진행하였으며, 개체 간에 서로 영향을 받지 않도록 각 케이지 당 1개체씩만 놓았다. 그리고 측정하는 공간의 조도는 일정하게 유지하였으며, 습도 50%, 온도 25℃를 유지하고, 방음을 유지하였다. 수면 패턴 및 시간은 Multi-Channel Stopwatch(Techsys Co. Seoul, Korea)를 이용하여 rat이 눈을 감고, 옆으로 동그랗게 엎드려있는 자세로 5분 이상 지속할 경우를 수면 상태로 판정하여, 수면을 시작하는 시점부터 수면을 끝마칠 때까지의 시간들을 합산하여 측정하였다(도 11).
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 카페인을 처리한 경우 수면시간은 정상 대조군에 비해 약 20~30% 수준으로 감소되었으나, 카페인과 진피 추출물을 함께 처리한 경우 수면시간이 약 4배 이상 회복되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 진피 추출물은 카페인에 의한 과다한 신경활성을 진정시킴과 동시에 수면장애를 개선시키는 효과를 나타냄을 확인한 것으로서, 특히 단시간에서의 카페인의 신경 활성을 억제하는 효과를 넘어서 카페인의 지속적 작용까지도 억제할 수 있음을 나타내는 것이다. 이에 따라, 본 발명의 진피 추출물은 카페인에 의해 유도된 신경 활성을 안정시킴과 함께 수면장애를 개선시키는 용도로 널리 활용될 수 있다.
본 실험의 결과들은 평균 ± 표준오차 (S.E.M)으로 나타내었다. 각 군의 계산된 spike 값들이나 이들을 비율로 변환한 후, 그룹 간의 차이를 조사하기 위해서 ANOVA Tukey 사후검정을 실시하였다. p<0.05, p<0.01, p<0.001일 때, 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 있다고 보았다.
실험예 4. 시트러스 과피 추출물의 항불면 활성 확인
시트러스 과피 추출물이 항불면 효과를 가지는지 확인하고자, 만다린, 탠저린, 스위티, 시트론, 영귤, 천혜향, 칼라만시, 포멜로, 한라봉, 오렌지, 레몬, 자몽, 라임, 유자 과피 추출물에 대해 실험예 2 및 실험예 3의 실험을 반복 수행하였다.
실험 결과, 각 상기 각각의 과피 추출물은 실시예 1의 진피 추출물과 비교하여 일부 차이는 있었으나, 유사하거나 동등하거나 수준의 수면장애 개선 효과를 구현하였다. 이를 통해, 시트러스( Citrus)의 과피 추출물은 유사한 특성을 가지며 공통적으로 항불면 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시트러스( Citrus)는 귤, 금 귤, 만다린, 탠저린, 스위티, 시트론, 영귤, 천혜향, 칼라만시, 포멜로, 한라봉, 오렌지, 레몬, 자몽, 라임 및 유자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시트러스( Citrus) 과피 추출물은 헤스페리딘 및 나리루틴 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 커피인 것인, 식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 식품 첨가제인 것인, 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)인 것인, 식품 조성물.
  8. 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 시트러스( Citrus) 과피 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 예방, 개선 또는 치료방법.
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