KR102139253B1 - 시트러스 과피 추출물을 포함하는 카페인에 의한 수면장애 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시트러스(Citrus) 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카페인으로 인한 수면장애 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

시트러스 과피 추출물을 포함하는 카페인에 의한 수면장애 개선용 조성물{COMPOSITION COMPRISING CITRUS PEEL EXTRACTS FOR IMPROVING SLEEP DISTURBANCE CAUSED BY CAFFEINE}

본 발명은 시트러스(Citrus) 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카페인으로 인한 수면장애 개선용 조성물에 관한 것이다.

카페인(Caffeine)은 일부 식물의 열매, 잎, 씨앗 등에 함유된 알칼로이드(alkaloid)의 일종으로 커피 열매의 씨앗, 찻잎, 카카오와 콜라 열매 등에 들어있다.

카페인은 커피, 초콜릿, 콜라, 차, 소프트드링크, 강장 음료 및 약품 등 다양한 식품에 함유되어 있으며, 커피는 카페인이 함유되어 있는 식품 중 가장 대중적인 음료로 각광받고 있다.

커피는 200mL 기준으로 대략 50~150 mg의 카페인을 함유하고 있다. 커피에 함유된 카페인은 피로회복 및 각성 작용 등의 효과를 나타내므로, 스트레스와 피로에 지친 현대인들은 하루에 한 잔 이상 커피를 마시고 있다.

하지만 카페인을 다량 복용하거나 심신이 허약한 사람이 카페인을 복용하는 경우, 불안, 신경과민, 불면증, 두통, 심장 떨림, 심계항진 등이 발생할 수 있다(한국등록특허 제10-1265253호).

따라서 카페인으로 인한 수면장애 등의 부작용을 최소화할 수 있는 새로운 식음 제품을 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있으나, 대중들의 기호를 충족시킬 수 있도록 카페인의 함량을 유지하면서 카페인에 의한 부작용을 보완할 수 있는 방법은 아직까지 부재한 실정이다.

한국공개특허 제10-2015-0081244호

본 발명의 목적은 시트러스(Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시트러스(Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 시트러스(Citrus) 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 “시트러스(Citrus)”의 사전적 의미는 귤과의 귤속(Citrus), 귤속(Fortunella), 탱자속(Pontirus)의 3속에 걸친 총괄적 명칭이며, 나리진(Narigin), 나르제닌(Naringenin), 헤스페리딘(Hesperidin), 탄제레틴(Tangeretin), 노비레틴(Nobiletin) 등 다양한 화합물을 포함한다.

상기 시트러스는 귤, 금귤, 만다린, 탠저린, 스위티, 시트론, 영귤, 천혜향, 칼라만시, 포멜로, 한라봉, 오렌지, 레몬, 자몽, 라임, 유자 등의 시트러스 계열에 포함되는 과일 및 이들의 미숙과를 지칭하며, 귤속(Citrus) 식물에 속하는 한 특별히 제한되지 않는다.

상기 시트러스에 함유된 나린진(naringin)은 플라보노이드 색소의 배당체로서 항산화 작용, 금속봉쇄 작용, 아스콜빈산 상승작용을 통해 강력한 정균 및 항균 작용을 하므로 항균 활성이 우수하다.

상기 나르제닌(Naringenin)은 항균, 항바이러스 활성뿐만 아니라, 항염증, 항산화, 항암 활성이 있는 것으로 알려져 있다.

상기 헤스페리딘(Hesperidin)은 지질 분해 작용으로 혈압 및 혈당을 낮추고, 모세혈관 강화작용, 지방대사 개선작용을 통해 혈중 LDL 콜레스테롤 수치를 낮추는 것으로 알려져 있다.

상기 탄제레틴(Tangeretin)은 신경보호 작용과 함께, 항염증, 항산화, 항암 활성이 있는 것으로 알려져 있다.

상기 노비레틴(Nobiletin)은 지질대사를 조절하고 기관지 평활근을 이완시켜 천식 치료제로서 효과가 있으며, 심장질환 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다.

상기 “과피”는 과육의 외측을 덮고 있는 껍질을 의미하는 것으로, 식물학적인 의미에서 외과피(exocarp), 중과피(mesocarp) 및 내과피(endocarp)로 나누어지며, 본 발명에 따른 시트러스의 과피는 외과피 및 중과피를 지칭하는 것으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 시트러스의 과피는 진피일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “진피(Citrus Unshiu Peel)”는 귤나무의 잘 익은 열매 껍질로 정의되어 있는 약재로서, 과피를 건조시킨 것을 말한다. 본 발명에서 진피와 과피는 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 헤스피리딘, 나리루틴 또는 이들의 혼합물을 처리한 경우 카페인에 의한 신경 활성이 완화 또는 억제됨을 확인하였는 바(도 9 및 도 10), 구체적으로 상기 상기 시트러스(Citrus) 과피 추출물은 헤스페리딘 및 나리루틴 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 “추출물”은 용매와 추출 재료를 특정 조건하에서 접촉시킴으로써 추출 재료에 함유된 유효성분을 분리해낸 것으로, 상기 추출물은 시트러스 과피 추출물에 대한 추출 공정에 의해 원료 내의 유효성분을 포함할 수 있다.

상기 시트러스 과피 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

구체적으로, 상기 시트러스 과피 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 보다 구체적으로는 물을 사용할 수 있다.

상기 추출 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 카페인(1,3,7-trimetnylxanthine)은 중추신경계통 각성제로 널리 사용되는 향정신성 물질로 커피 나무, 카카오 열매 등에 존재하며 콜라, 초콜릿 등에도 포함되어있다. 상기 카페인은 아데노신과 아데노신 수용체(Adenosine A1 Receptor 및 Adenosine A2a Receptor)결합의 억제제로 작용하는 물질이다.

상기 아데노신은 신경 조절자로 신경전달물질의 생성 억제 및 GABA(감마-아미노부티르산) 생성 촉진을 통해 수면을 촉진하고 각성을 억제하는 물질이다.

상기 GABA(감마-아미노부티르산)은 불안 완화, 경련 예방 또는 개선, 진정작용, 및 수면 유도 및 개선 효과와 관련이 있으며 GABA의 불활성화에 의해 수면장애가 발생할 수 있다.

상기 GABA와 카페인이 함께 작용하면 카페인의 효과가 보다 우월하여 카페인에 의해 아데노신 수용체가 억제되고, 억제된 아데노신 수용체는 신경전달물질을 과발현시키고 GABA의 생성을 억제한다.

이에 따라, 카페인의 적당한 섭취는 중추신경계와 말초신경계를 자극하여 집중력 향상, 졸음 방지에 도움을 주지만 과하게 섭취할 경우에 신경과민, 흥분 또는 불면 등의 수면 장애를 유발하며 내분비계에도 영향을 미칠 수 있다.

상기 시트러스 과피 추출물은 카페인과 경쟁적으로 작용하여 아데노신 수용체를 길항시킴으로써 신경활성 물질의 생성을 억제하고 GABA의 생성을 효과적으로 증가시켜 항불면 효과를 구현할 수 있다. 상기 “길항”은 구조가 유사한 물질끼리 한정된 특정 결합 부위(binding site)를 둘러싸고 경합하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 진피 외 다른 종류의 시트러스 과피 추출물도 신경 활성을 완화시키는 효과가 있는지 여부를 확인한 결과, 진피 추출물과 유사하거나 동등한 수준으로 신경 활성 정도가 완화되는 것을 확인하였다.

또한 구체적으로, 상기 시트러스 과피 추출물은 카페인으로 인한 수면 장애를 예방 또는 개선할 수 있으며 보다 구체적으로, 카페인으로 인한 수면장애를 최소화시킬 수 있다.

본 발명에서 "수면"은 뇌가 발달된 동물들의 중요한 생리기능으로서, 생존을 위해 불가결한 행동을 말한다. 뇌는 질 좋은 수면이 있어야 비로소 고차원의 정보를 처리할 수 있는 능력을 발휘할 수 있다.

본 발명에서 “수면장애”는 회복되지 않은 채로 기상하는 것, 한밤중에 기상하는 것, 깬 후 다시 잠드는 데 어려움을 겪는 것, 잠드는 데 어려움을 겪는 것 또는 너무 일찍 기상하는 것 등으로 특징지어지는 병태를 의미하고, 우리나라 연간 전체 성인 가운데 약 15 % 정도에 영향을 주는 것으로 보고된 질환이다.

상기 수면장애는 임의의 및 모든 수면 상실의 유형 및 등급을 의미하는 것으로서 널리 사용되고 있다. 수면 장애는 급성 또는 만성으로 지속될 수 있다.

상기 수면장애는 당업계에서 알려져 있는 모든 종류의 수면장애를 포함할 수 있고, 스트레스, 건강 상태, 통증, 투약, 시차증(jet lag) 또는 소음 등에 의한 수면장애일 수 있으며, 구체적으로 카페인에 의한 수면장애일 수 있다.

본 발명에서 “예방”이란 수면장애의 발생을 사전에 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우 개체의 수면장애 정도가 상기 수면장애 예방 또는 개선용 조성물을 사용하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.

본 발명에서 “개선”이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 시트러스 과피 또는 진피 추출물을 이용하여 수면장애 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 포함한다.

상기 시트러스 과피 추출물은 화학물질 등과 달리 천연물 유래의 물질을 그대로 이용하는 것이므로, 이의 섭취 내지 투여에 따른 치명적인 부작용이 최소화될 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)인 것일 수 있다.

본 발명에서, “불면증”은 잠들기 어렵거나 자다가 자주 깨거나 아침에 일어나면 개운하지 않은 증상을 단독 또는 복합적으로 보이는 상태를 말한다. 카페인 복용시 상기 불면증이 발생될 수 있음은 알려진 바 있으며, 본 발명의 조성물은 카페인에 의한 수면 시간 감소를 개선시키는 것을 확인하였는 바(도 6), 상기 불면증 개선 용도로 활용될 수 있다.

본 발명에서, “일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)”는 일주기 리듬을 관장하는 신체기관에 문제가 생기거나 혹은 내적인 일주기 리듬과 외부적 요인 사이에 정렬이 깨지면서 생기는 장애이다. 대표적인 질환으로 지연성 혹은 전진성 수면위상 증후군 등이 있으며, 카페인 등과 같은 화합물에 의해 생리활성 또는 신경활성이 영향을 받음으로 인하여 생체 주기가 바뀌면서 발생될 수 있다. 본 발명의 조성물은 카페인에 의한 신경 활성을 완화시킬 수 있음을 확인하였는 바, 카페인에 의한 생체 주기 변화에 따른 일주기리듬 수면장애를 개선시킬 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 식품의 형태는 커피일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 커피는 원두커피 또는 인스턴트 커피일 수 있으며, 커피의 형태는 특별히 제한되지 않는다. 또한 구체적으로, 상기 커피는 노카페인 커피를 포함할 수 있다.

원두커피는 자메이카 블루마운틴, 인도네시아 토라자, 콜롬비아 수프리모, 과테말라 안티구아, 케냐 아라비카, 브라질 산토스, 에티오피아 모카 예가체프 등의 원두를 사용할 수 있다. 이러한 원두는 생두를 건조시켜, 로스팅 후에 분쇄하여 사용할 수 있으며, 로스팅은 생두를 가열하여 볶는 것으로, 커피 생두에 열을 가하여 생두 내부 조직에 물리적, 화학적 변화를 일으킴으로써 커피 특유의 맛과 향을 결정하는 가공처리이다.

인스턴트 커피는 원두커피에 당류 및 유지 등이 더 첨가될 수 있다. 이때, 당류는 백설탕, 포도당, 덱스트린, 과당, 올리고당, 프로폴리스, 트레할로스, 솔비톨, 자일리톨, 만니롤, 만티롤, 람니롤, 이노시롤, 에리스리롤, 파라티노스 및 쿠에르시롤 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 유지는 분유, 탈지분유 및 식물 성분말 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 시트러스 과피 추출물을 포함하는 커피는 커피에 의한 부작용 중 하나인 수면장애를 방지할 뿐 아니라, 카페인 과다 복용에 의한 신경 과다 활성을 억제시킬 수 있다. 특히, 상기 시트러스 과피 추출물은 커피에 첨가되거나 포함됨으로써 커피 본연의 맛을 변질시키지 않으며, 카페인과 경쟁적으로 작용함으로써 카페인에 의해 유발될 수 있는 불면 효과를 최소화할 수 있다.

본 발명의 시트러스 과피 추출물을 첨가할 수 있는 식품은 상기 커피 뿐 아니라 소세지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 본 발명의 시트러스 과피 추출물 외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.

상기 식품의 종류는 식품 첨가제일 수 있으며, 상기 식품 첨가제는 식품의 제조, 가공, 또는 보존을 위해 식품에 첨가, 혼합, 침윤 기타의 방법에 의해 사용되는 물질을 의미한다. 상기 식품 첨가제는 천연물과 합성품이 있으며, 기능과 용도에 따라 분류할 수 있다. 현재 한국에 식품첨가물로 허가되어 있는 품목은 화학적 합성품 370여종, 천연첨가물 50여종이며, 주로 용도에 따라 보존료, 살균제, 산화방지제, 착색료, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 증점제(호료) 및 안정제, 피막제, 껌 기초제, 소포제, 용제, 이형제, 방충제, 품질개량제와 기타 식품제조용 첨가제 등으로 분류되어 쓰이고 있다.

상기 식품첨가제의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태를 포함할 수 있으며, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.

본 발명의 시트러스 과피 추출물을 건강기능식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 시트러스 과피 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 시트러스 과피 추출물을의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 시트러스 과피 추출물을 포함하는, 카페인에 의한 수면장애 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)인 것일 수 있다.

“수면장애”, “불면증”, “일주기리듬 수면장애” 는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 본 발명의 시트러스 과피 추출물 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 보다 구체적으로 경구용 제형일 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 카페인에 의한 과다한 신경활성을 진정시킴과 동시에 수면장애를 개선시키는 효과를 나타내며, 특히 단시간에서의 카페인의 신경 활성을 억제하는 효과를 넘어서 카페인의 지속적 작용까지도 억제할 수 있음에 따라, 카페인에 의해 유도된 신경 활성을 안정시킴과 함께 수면장애를 개선시키는 용도로 널리 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 진피 샘플 내 함유된 성분을 HPLC를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 진피에 함유된 헤스페리딘(Hesperidin)의 HPLC 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 진피에 함유된 나리루틴(Narirutin)의 HPLC 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 진피 샘플(10mg)에 함유된 헤스페리딘 및 나리루틴의 함량을 나타낸 것이다.
도 5는 7일령의 수컷 백서의 해마 절편 준비 과정을 보여주는 사진이다. (a)는 백서의 뇌 전체를 적출하는 과정을 보여주는 사진이며, (b)는 적출한 뇌로부터 해마 조직을 적출하는 과정을 보여주는 사진이며, (c)는 적출한 해마를 절편 후 인서트(insert)와 6-웰 플레이트(6-well plate)에 넣는 과정을 보여주는 사진이다.
도 6은 해마 절편의 MEA 셋팅 과정을 보여주는 사진이다. (a)는 MEA 하나의 탐침을 확대한 사진이며, (b)는 해마가 올려진 MEA에 증폭기(amplifier)가 연결된 사진이며, (c)는 해마 절편을 MEA에 올려놓은 사진이며, (d)는 어레이(array)에 위치한 각 해마의 영역을 표시한 사진이다.
도 7은 마이크로일렉트로드 어레이(MEA) 실험 프로토콜(A) 및 band pass filter를 이용한 스파이크 검출 과정(B)을 나타낸 것이다.
도 8은 진피 추출물 처리시 카페인에 의한 신경 활성이 완화된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 카페인 처리시 신경 활성, B: 카페인 및 진피 추출물 처리시 신경 활성, C: 카페인 단독 처리 및 카페인 및 진피 추출물 처리시의 워싱 전 신경활성 비교, D: 카페인 단독 처리 및 카페인 및 진피 추출물 처리시의 워싱 후 신경활성 비교).
도 9는 진피 추출물에 함유된 헤스페리딘, 나리루틴 또는 이의 혼합물 처리시 카페인에 의한 신경 활성이 완화된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 카페인 처리시 신경 활성, B: 카페인 및 헤스페리딘 처리시 신경 활성, C: 카페인 및 나리루틴 처리시 신경 활성, D: 카페인, 헤스페리딘 및 나리루틴 처리시 신경활성).
도 10은 진피 추출물에 함유된 헤스페리딘, 나리루틴 또는 이의 혼합물 처리시 카페인에 의한 신경 활성이 완화된 것을 확인한 결과를 카페인 워싱 전 및 워싱 후로 비교하여 나타낸 것이다(A: 카페인 워싱 전, B: 카페인 워싱 후).
도 11은 수면시간 측정을 위해 SD rat에 경구투여 및 녹화를 하는 실험과정을 나타낸 것이다(A: SD rat에 경구투여 과정, B: 수면시간 측정을 위한 녹화 과정).
도 12는 진피 추출물 처리시 수면시간이 회복된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예. 진피 추출물의 제조

시트러스의 진피(Gio Herb Co., Yangju, Korea) 100g에 10배(w/v)의 증류수를 가하여 121℃에서 40분간 열수추출하였다. 추출액은 Whatman No. 1 필터 페이퍼 (Whatman International Ltd., Maidstone, UK)를 이용하여 여과하였으며, 걸러진 추출액은 농축기(Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40 ℃에서 5시간 동안 농축시켰다. 농축된 추출액은 동결건조기(Ilsin Bio Co., Yangju., Korea)로 -70 ℃, 5 mTorr에서 7일간 동결건조 시킨 후 글라인더(Ilsin Bio Co., Yangju., Korea)로 분쇄하여 실험에 이용하였다. 위의 과정을 통해 진피를 열수추출 하였을 때 수율은 9.8% 이다.

	원물 (g)	추출물 (g)	수율 (%; 추출물/원물)
진피	100	9.8	9.8

실험예 1. 진피 추출물 내의 함유 성분 확인

HPLC를 이용하여 본 발명의 진피 추출물에 함유되어 있는 화합물을 확인하였다. 구체적으로, 진피 추출물을 오토샘플러(autosampler), 바이너리 펌프(binary pump), PDA 디텍터(PDA deterctor)로 구성된 역상 HPLC(Vltimate 3000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 이용하여 측정하였다. 역상 HPLC컬럼은 C18 (Discovery C18, 5 μm, 4.6 × 250 mm; Sigma, MO, USA)을 사용하였다. 주입 용량은 10μL를 0.8mL/min의 속도로 주입하였다.

HPLC에서 용매(mobile phase) A와 B는 각각 100% 3차 증류수 및 100% 아세토나이트릴을 사용하였으며 기울기 용리(gradient elution)의 구성은 0 내지 5분에서는 90% A/10% B, 5 내지 14 분에서는 75% A/25% B, 14 내지 25.5분에서는 40% A/60% B, 25.5 내지 30.5분에서는 20% A/80% B, 30.5 내지 35분에서는 90% A/10% B 로 진행하였다. 모든 화합물은 280nm파장에서 검출하였으며, 분석 온도는 40℃로 유지하였다. HPLC/PDA를 통하여 수집된 검체 시험 용액의 데이터는 표준품의 retention time과 UV spectrum 파형을 비교하여 확인하였다.

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 사용한 진피 샘플에서는 나리루틴(narirutin) 및 헤스페리딘(hesperidin)이 포함되어 있는 것을 확인하였다.

또한, 진피 추출물 내의 상기 나리루틴 및 헤스페리딘의 함량을 계산하였으며(도 2 및 도 3), 그 결과 진피 추출물 400μg/ml 에 함유된 나리루틴 및 헤스페리딘의 함량은 각각 136 μg/ml 및 40 μg/ml 임을 확인하였다(도 4).

실험예 2. 신경활성 측정

1-1. 해마 조직 절편 배양(Hippocampal organotypic slice culture, HOSC)

박막을 사용하여 뇌 해마의 절편을 organotypic 배양하는 하는 방법은 이미 일반적으로 많이 사용하는 방법을 사용하였다. 구체적으로, 뇌 해마는 5일령에서 7일령 사이의 Sprague Dawley 흰 어린 쥐(Orientbio Co., Seungnam, Korea)로부터 적출하였고 조직 박절기를 이용하여 350μm 두께로 절편내었다(Mickle Laboratory Engineering Co., UK). 5조각에서 6조각을 0.4μm 구멍을 갖고 있는 박막 insert (Millicell-CM; Millipore, MA) 안에 배치한 후, 6-well plate(SPL Life Sciences Co., Korea)에 넣고 36°C 로 5% CO₂(Dong-A Co., Seoul, Korea)를 유지하는 배양기에서 배양하였다. 배양액(MEM; Welgene, Gyeongsan, South Korea), 20mM HEPES (Sigma, St. Louis, Mo, USA), 25% Hank's balanced salt solution(HBSS; Welgene, Gyeongsan, South Korea), 6 g/L D-glucose(Sigma, St. Louis, Mo, USA), 1mM L-glutamine(Sigma, St. Louis, Mo, USA), 25% horse serum(Welgene, Gyeongsan, South Korea) 과 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, USA), pH=7.1)은 이틀에 한번 씩 갈아주었고 배양 기간은 12~14일이며 이후 실험에 사용하였다(도 5).

1-2. MEA 탐침으로 배양된 뇌해마 조직의 이동

핀을 이용하여 배양된 뇌해마 절편을 배양 박막 insert로부터 조심스럽게 분리한 후, 0.01% 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, Sigma, St. Louis, Mo, USA)으로 코팅된 직경 10 μm, 간격 100 μm인 8x8 마이크로일렉트로드 어레이(microelectrode array, MEA; Multi Channel Systems, Germany)에 올려놓았다. 절편은 멸균된 인공 척수용액(aCSF; 114 mM NaCl, 26 mM NaHCO₃, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH=7.4, Sigma, Louis, Mo, USA)에서 15 분 동안 5% CO₂ 및 95% O₂ 혼합가스 (Dong-A Co., Seoul, Korea)를 주입하며 33 °C를 유지한 상태로 안정화시켰다. 이후에 뇌 해마를 포함한 MEA를 MEA1060(Multi Channel Systems Inc., Reutlingen, Germany) 증폭장치에 장착하고, MEA 속 인공 척수용액은 Ag/AgCl 으로 접지를 시켰다. 이후에 실험하는 동안은 5% CO₂ 및 95% O₂ 혼합가스를 투입시킨 인공 척수 용액을 3 mL/min의 속도로 관류시켰으며, MEA와 인공 척수 용액은 33°C로 유지하였다(도 6).

1-3. 신경 활성 측정

안정화가 끝난 해마 조직을 3 분 동안 레코딩(recording) 하였으며, 이후 1 mM의 카페인(Sigma, St. Louis, Mo, USA)이 포함된 인공 뇌척수액 또는 1mM 카페인 및 분석샘플(진피 추출물 400 μg/ml, 헤스페리딘 40 μg/ml, 나리루틴 136 μg/ml) 이 포함된 인공 뇌척수액을 각각 20 분 동안 동일한 조건으로 관류한 후 3분 레코딩 하였고, 다시 인공 뇌척수액만으로 20 분간 워싱한 후 3분을 레코딩하여 총 9 분간의 데이터를 얻었다.

해마조직이 있는 MEA는 총 60개 채널을 통해 각 채널 당 25kHz의 sampling 속도로 데이터를 읽어내며, MC_Rack 및 MC_Data Tool(Multi Channel Systems, GmbH) 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터를 통해 기록된다. 기록된 전체 신호들 중 의미있는 스파이크(spike)를 추출하기 위해 4단계의 band pass filter를 이용하였으며, 식은 아래와 같다.

[식 1]

상기 식에서 X는 노이즈(noise)에 대한 실효값(RMS)을 나타내며, ĸ는 각 각의 임계값(threshold)을 결정하는 인자이다. 여기서는 총 3개의 인자로 threshold를 구성하였다(0.6, 1 및 3). ĸ값이 0.6이상인 경우 의미있는 스파이크(spike)로 하였으며, 이 때의 threshold level은 -21.63 μV 이다. 이 과정은 60개 전 channel을 대상으로 MATLAB(Mathworks Inc., Natick, Massachusetts, USA) 프로그램을 이용하여 수행하였다(도 7).

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 카페인에 의한 신경 활성이 진피 추출물을 처리한 경우 완화되는 것을 확인하였다.

구체적으로, 카페인을 처리한 경우 신경 활성이 증가되었으며, 카페인을 처리한 후 워싱하더라도 카페인의 작용이 지속되어 신경 활성이 200% 이상 증가되었다(도 8A). 반면, 카페인 및 진피 추출물을 함께 처리한 경우, 카페인만 처리한 경우에 비해 신경 활성 정도가 현저히 감소되었으며, 카페인 단독 처리시와 달리 워싱한 후에도 신경 활성의 지속적 증가가 나타나지 않음에 따라 신경 활성의 유의적 증가 없이 유지되는 것을 확인하였다(도 8B). 카페인을 단독 처리한 경우 및 카페인 및 진피 추출물을 함께 처리한 경우 각각에 대하여 워싱 전, 워싱 후끼리 비교한 경우에도 진피 추출물을 처리시 현저한 신경 활동 감소 효과가 나타남을 확인하였다(도 8C 및 도 8D).

특히, 카페인을 처리 후 워싱한 후에도 신경에서의 카페인에 의한 활성은 증가되는 바, 이는 카페인이 신경에 미치는 활성 작용이 단시간에 짧게 나타나기 보다는 지속적으로 이어짐을 나타내는 것이다. 본 발명의 진피 추출물은 상기와 같이 지속적으로 이어지면서 증가되는 카페인의 효과를 억제시킴으로써 신경 활성을 감소시키는 효과를 나타내었다.

또한, 진피 추출물 내에 함유되어 있는 성분인 헤스페리딘, 나리루틴 또는 이의 혼합물을 각각 카페인과 함께 처리한 결과, 헤스페리딘과 나리루틴은 모두 카페인으로 인한 신경 활성의 증가를 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 나아가, 헤스페리딘 및 나리루틴을 각각 처리할 때보다 함께 처리했을 때 신경 활성이 더 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 9).

구체적으로, 카페인을 처리한 경우 신경 활성이 증가되었으며, 카페인을 처리한 후 워싱하더라도 카페인의 작용이 지속되어 신경 활성이 200% 이상 증가되었다(도 9A). 반면, 카페인 및 헤스페리딘 40 μg/ml(진피 400 μg/ml에 함유된 양)을 함께 처리한 경우, 카페인만 처리한 경우에 비해 신경 활성 정도가 현저히 감소되었으며, 카페인 단독 처리시와 달리 워싱한 후에도 신경 활성의 지속적 증가가 나타나지 않음에 따라 신경 활성의 유의적 증가 없이 유지되는 것을 확인하였다(도 9B). 카페인 및 나리루틴 136 μg/ml(진피 400 μg/ml에 함유된 양)을 함께 처리한 경우에도 마찬가지로 카페인만 처리한 경우에 비해 신경 활성 정도가 현저히 감소되었으며, 카페인 단독 처리시와 달리 워싱한 후에도 신경 활성의 지속적 증가가 나타나지 않음에 따라 신경 활성의 유의적 증가 없이 유지되는 것을 확인하였다(도 9C). 나아가, 카페인과 함께 헤스페리딘 40 μg/ml 및 나리루틴 136 μg/ml을 처리한 경우 신경 활성 감소 효과가 더욱 증가되는 것을 확인하였다(도 9D).

상기 결과를 통해 헤스페리딘 및 나리루틴 성분이 신경 활성을 완화시킬 수 있으며, 두 성분을 모두 함유하고 있는 진피 추출물은 카페인으로 인한 신경 활성을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

나아가, 도 10에 나타난 바와 같이, 카페인을 처리한 경우 나타난 신경 활성은 카페인을 워싱한 이후에도 지속적으로 나타나며, 이는 카페인에 의한 신경 활성 작용이 단시간이 아닌 장시간 이어질 수 있으며, 신경 활성이 장시간 이어짐에 따른 부작용의 발생 가능성을 나타내는 것이다.

반면, 카페인 단독 처리의 경우와 달리 헤스페리딘, 나리루틴, 헤스페리딘 및 나리루틴의 혼합물을 함께 처리한 경우 워싱한 이후에도 신경 활성 억제 효과가 지속됨을 확인하였는 바, 이는 카페인에 의해 유도된 신경 활성이 카페인이 제거된 이후에도 이어지는 것을 억제할 수 있음을 나타내는 것이다(도 10).

실험예 3. 수면장애 개선 효과 확인

3-1. 실험동물

실험동물로는 Sprague Dawley rat 6주령을 선정하였으며, ㈜오리엔트 바이오 (Seongnam, Korea)에서 구입하였다. 실험환경을 일정하게 유지하기 위해, 한 케이지 당 실험동물은 1개체씩 넣어 사육하였다. 실험동물은 25℃, 습도 50%, 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되고 음수와 식이가 자유롭게 공급되는 환경에서 하루 동안 적응기간을 거쳤다. 모든 과정은 경희대학교 실험동물 윤리위원회의 방침과 동물실험관련 규정을 따랐다(IRB 승인번호: KHUASP(SE)-17-039).

2-2. 수면시간 측정

15개체의 SD rat들을 3군으로 나누어 실험을 수행하였다(n=5). 1군에는 물을 경구투여 하였고, 2군에는 카페인(20mg/Kg)을 경구투여 하였으며, 3군에는 진피 추출물(100mg/Kg) 및 카페인(20mg/Kg)을 함께 경구투여 하였다.

설치류가 본래 야행성이라는 점에 착안하여, 수면시간은 SD rat이 본래 수면을 취해야 할 주간동안 측정하였다. 경구투여가 끝난 후, 오전 10시부터 캠코더 (Sony Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 케이지를 녹화하여 수면 시간을 측정하였으며, 측정시간은 선행 연구를 참고하였다. 하루에 각 군별로 1개체씩 총 3개체의 녹화를 진행하였으며, 개체 간에 서로 영향을 받지 않도록 각 케이지 당 1개체씩만 놓았다. 그리고 측정하는 공간의 조도는 일정하게 유지하였으며, 습도 50%, 온도 25℃를 유지하고, 방음을 유지하였다. 수면 패턴 및 시간은 Multi-Channel Stopwatch(Techsys Co. Seoul, Korea)를 이용하여 rat이 눈을 감고, 옆으로 동그랗게 엎드려있는 자세로 5분 이상 지속할 경우를 수면 상태로 판정하여, 수면을 시작하는 시점부터 수면을 끝마칠 때까지의 시간들을 합산하여 측정하였다(도 11).

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 카페인을 처리한 경우 수면시간은 정상 대조군에 비해 약 20~30% 수준으로 감소되었으나, 카페인과 진피 추출물을 함께 처리한 경우 수면시간이 약 4배 이상 회복되는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과들은 본 발명의 진피 추출물은 카페인에 의한 과다한 신경활성을 진정시킴과 동시에 수면장애를 개선시키는 효과를 나타냄을 확인한 것으로서, 특히 단시간에서의 카페인의 신경 활성을 억제하는 효과를 넘어서 카페인의 지속적 작용까지도 억제할 수 있음을 나타내는 것이다. 이에 따라, 본 발명의 진피 추출물은 카페인에 의해 유도된 신경 활성을 안정시킴과 함께 수면장애를 개선시키는 용도로 널리 활용될 수 있다.

본 실험의 결과들은 평균 ± 표준오차 (S.E.M)으로 나타내었다. 각 군의 계산된 spike 값들이나 이들을 비율로 변환한 후, 그룹 간의 차이를 조사하기 위해서 ANOVA Tukey 사후검정을 실시하였다. p<0.05, p<0.01, p<0.001일 때, 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 있다고 보았다.

실험예 4. 시트러스 과피 추출물의 항불면 활성 확인

시트러스 과피 추출물이 항불면 효과를 가지는지 확인하고자, 만다린, 탠저린, 스위티, 시트론, 영귤, 천혜향, 칼라만시, 포멜로, 한라봉, 오렌지, 레몬, 자몽, 라임, 유자 과피 추출물에 대해 실험예 2 및 실험예 3의 실험을 반복 수행하였다.

실험 결과, 각 상기 각각의 과피 추출물은 실시예 1의 진피 추출물과 비교하여 일부 차이는 있었으나, 유사하거나 동등하거나 수준의 수면장애 개선 효과를 구현하였다. 이를 통해, 시트러스(Citrus)의 과피 추출물은 유사한 특성을 가지며 공통적으로 항불면 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 진피(Citrus unshiu Markovich peel)에 10배 무게의 물을 가하여, 121℃에서 40분간 헤스페리딘 및 나리루틴을 포함된 열수 추출물을 얻고, 이를 40℃에서 5시간 농축한 농축물을 동결건조한 것임을 특징으로 하는 카페인에 의한 수면장애 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항 방법에 의해 제조된 카페인에 의한 수면장애 예방 또는 개선용 식품 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 수면장애는 카페인에 의한 불면증 또는 일주기리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorders)인 것인, 식품 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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