KR101119311B1 - 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 감귤과피로부터 유기용매를 이용하여 조추출액을 얻는 단계;

(b) 상기 조추출액을 건고한 후 물을 넣어 현탁하고, 이를 냉각하여 여과하는 단계; 및

(c) 여과 후 남은 고형분을 동결건조하여 조헤스페리딘을 얻는 단계; 및

(d) 상기 조헤스페리딘을 물에 현탁시킨 후 pH를 증가시켜 헤스페리딘을 완전히 용해하고, pH를 중성영역으로 감소시켜 헤스페리딘을 결정화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법을 제공한다.

헤스페리딘, 항비만, 당부가

Description

감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법{PURIFICATION METHOD OF HESPERIDIN FROM MANDARIN PEEL}

본 발명은 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법 및 동 방법에 의해 얻은 헤스프리딘을 함유한 비만억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감귤과피로부터 고수율 및 고순도의 헤스페리딘을 얻는 것이 가능하고, 이에 의해 얻은 헤스페리딘을 시클로덱스트린을 이용하여 포접하고, 여기에 당전이효소를 반응시켜 얻어지는 당부가 헤스페리딘을 함유하는 비만억제용 조성물에 관한 것이다.

비만은 단순히 비만자체의 심각성 보다 이로 인해 유발되는 당뇨병, 동맥경화, 심혈관계 질환과 고지혈증 등과 같은 대사성질환이 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 비만은 체내 잉여 에너지가 중성지방 및 기타 지방대사물의 형태로 지방조직에 저장됨으로서 일차적으로 나타나며, 이러한 에너지대사의 불균형에 따른 종합적인 대사이상에 의해 유발되는 질병으로서 식이조절뿐만 아니라 식욕조절 호르 몬 대사, 지방세포분화, 지방합성 및 분해과정 그리고 열생성반응 등 다양한 측면에서의 접근이 요구되고 있다. 하지만 그동안 비만 치료를 위해 개발된 약물들은 효과에 비해 부작용이 심각해 항비만 효과는 높고 부작용이 적은 새로운 작용기전을 가진 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.

헤스페리딘은 다음에 나타낸 화학구조를 갖고 있고 모세혈관의 강화, 출혈 예방, 혈압 조정 등의 생리작용을 지닌 비타민 P로서, 또한 황색색소로서 옛날부터 알려져 있으며 식품, 의약품, 화장품 등에 이용되고 있다.

상기 구조식을 갖는 헤스페리딘의 용도는 단순히 영양소로서의 비타민 P 강화제에 머물지 않고 그 화학구조, 생리작용으로 부터 단독으로 또는 그 밖의 비타민 등과 병용하여, 예컨대 황색 착색제, 산화 방지제, 안정제, 품질 개량제, 자외선 흡수제 등으로서 음식물 등에, 또한 비루스성 질환, 세균성 질환, 순환기 질환, 악성 종양 등의 감수성 질환의 예방제, 치료제, 즉 항감수성 질환제에, 나아가서는 황색 착색제, 안정제, 산화방지제, 자외선 흡수제, 멜라닌 생성 억제제 등의 피부 순화제, 피부 색백제 등으로서 화장품에까지 미치고, 그 범위는 극히 넓다.

하지만, 헤스페리딘의 이와 같은 광범위한 용도에도 불구하고 아직까지 비만억제활성과 관련한 어떠한 보고도 제시되고 있지 않으며, 더욱이 현재까지 실시되 고 있는 헤스페리딘의 정제방법은 나리루틴(narirutin)과 같은 수용성 플라보노이드와 함께 추출되어 순수분리가 어려우며, 헤스페리딘은 물에 녹기 어렵워 이용상의 제약이 매우 크다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 그 목적은 감귤과피로부터 고수율 및 고순도의 헤스페리딘을 얻을 수 있는 헤스페리딘의 정제방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 과정에 의해 정제된 헤스페리딘을 베타-시클로덱스트린을 이용하여 포접한 후, 여기에 당전이효소를 반응시켜 얻어지는 당부가 헤스페리딘을 활성성분으로 함유하는 비만억제용 조성물을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) (a) 감귤과피로부터 유기용매를 이용하여 조추출액을 얻는 단계;

(b) 상기 조추출액을 건고한 후 물을 넣어 현탁하고, 이를 냉각하여 여과하는 단계; 및

(c) 여과 후 남은 고형분을 동결건조하여 조헤스페리딘을 얻는 단계;

(d) 상기 조헤스페리딘을 물에 현탁시킨 후 pH를 증가시켜 헤스페리딘을 완전히 용해하고, pH를 중성영역으로 감소시켜 헤스페리딘을 결정화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.

(2) 제1항에 있어서,

유기용매는 70% 내지 90% 에탄올인 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.

(3) 제1항에 있어서,

단계 (c)에서의 헤스페리딘의 용해는 pH 11.0 내지 11.5로 조정하는 것에 의해 완전히 용해하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.

(4) 제1항에 있어서,

단계 (a)에서 얻은 조추출물에 헥산을 첨가 교반하여 카로티노이드를 제거하는 단계를 포함하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.

(5) 단계 (c)의 결정화 과정은 2회 반복실시하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.

(6) 제1항 내지 제5항에서 선택된 어느 한 항에 의해 얻은 헤스페리딘에 베타-시클로덱스트린 및 당전이 효소를 첨가반응시켜 얻어진 당부가 헤스페리딘을 활성성분으로 함유하는 비만억제용 조성물.

(7) 제6항에 있어서, 베타-시클로덱스트린을 헤스페리딘의 중량을 기준으로 2.5 내지 3.5 중량부 첨가하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 항비만억제용 조성물.

(8) 제6항에 있어서, 상기 당부가 헤스페리딘은

물에 시클로덱스트린을 헤스페리딘의 중량을 기준으로 3 내지 9 중량부 첨가하여 용해한 후, 용액의 pH를 11.0 내지 11.5로 조정하여 헤스페리딘을 완전히 용해하는 단계;

pH를 4.5 내지 5.0으로 조정하고 냉각한 후, 침전물을 제거하여 여액을 얻는 단계; 및

여액에 당전이효소를 첨가하여 당전이 반응시켜 얻은 것을 특징으로 하는 비만억제용 조성물.

(9) 제7항에 있어서,

당전이효소는 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제인 것을 특징으로 하는 항비만억제용 조성물.

본 발명에 의하면, 감귤과피로부터 고수율 및 고순도의 헤스페리딘을 얻는 것이 가능하고, 이에 의해 얻은 헤스페리딘을 시클로덱스트린을 이용하여 포접시킨 화합물은 항비만활성이 매우 우수한 특성을 발휘한다.

본 발명은 (a) 감귤과피로부터 유기용매를 이용하여 조추출액을 얻는 단계;

(b) 상기 조추출액을 건고한 후 물을 넣어 현탁하고, 이를 냉각하여 여과하 는 단계; 및

(c) 여과 후 남은 고형분을 동결건조하여 조헤스페리딘을 얻는 단계; 및

(d) 상기 조헤스페리딘을 물에 현탁시킨 후 pH를 증가시켜 헤스페리딘을 완전히 용해하고, pH를 중성영역으로 감소시켜 헤스페리딘을 결정화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻은 헤스페리딘에 베타-시클로덱스트린을 포접시킨 후, 여기에 당전이효소를 첨가반응시켜 얻어진 당부가 헤스페리딘을 활성성분으로 함유하는 항비만억제용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 단계별로 보다 상세하게 설명하기로 한다.

감귤과피로부터 조추출액을 얻는 과정에서 사용되어지는 유기용매는 에탄올, 또는 물과 에탄올의 혼합용매로서 바람직하게는 70 내지 90% 알코올, 보다 바람직하게는 70% 알코올을 사용한다.

추출과정 사용되는 감귤과피는 감귤을 구입하여 과육과 과피를 분리한 후, 분리한 과피를 건조하여 이를 그라인더 등으로 분쇄한 것을 이용할 수 있다. 이때 상기 추출용매의 사용량은 분쇄된 과피무게의 10 내지 20배 정도면 충분하고, 75 내지 85℃에서 2 내지 4시간 환류추출하는 방법을 사용할 수 있다. 추출물을 여과하고 추출물에 함유되어 있는 카로티노이드 및 비극성 물질을 제거하기 위하여 여 과한 추출액에 동량의 헥산을 넣고 흔든 후 헥산층을 제거한다. 이러한 과정은 2회 이상 반복하여 헥산층을 제거하는 것이 좋다.

상기 조추출액에서 헤스페리딘을 분리하기 위하여 추출액을 로터리 진공증발기를 이용하여 건고하고, 여기에 증류수를 넣어 현탁시킨다. 이 과정에서 나리루틴(narirutin) 등의 수용성 플라보노이드 등을 제거할 수 있으며, 현탁액을 약 12℃로 냉각시킨 후 여과하여 헤스페리딘을 함유한 고형분을 얻게 된다. 이러한 과정에 의해 얻어진 고형분은 동결건조되며, 본 발명에서는 이러한 동결건조물을 조헤스페리딘(crude hesperidin)으로 정의한다.

본 발명에서는 상기 조헤스페리딘으로부터 헤스페리딘을 고수율, 고순도로 정제하기 위하여 상기 조헤스페리딘을 물에 현탁시킨 후 pH를 증가시켜 헤스페리딘을 완전히 용해하고, pH를 중성영역으로 감소시켜 헤스페리딘을 결정화한다.

상기 과정에서 조헤스페리딘에 함유된 헤스페리딘의 완전한 용해를 위해 NaOH 등을 이용하여 pH를 11.0 내지 11.5, 바람직하게는 11.2 내지 11.4, 가장 바람직하게는 11.3으로 높이고, 용액의 pH를 중성영역인 7.0 수준으로 낮추어 헤스페리딘을 결정화한다. 순도를 보다 높이기 위하여 이러한 결정화 과정은 적어도 2회 이상 반복되어진다.

상기 과정을 통해 간단하면서도 경제적으로 감귤과피로부터 헤스페리딘을 고 수율, 고순도로 정제하는 것이 가능하다.

본 발명은 상기 과정을 통해 얻은 고수율, 고순도의 헤스페리딘을 함유하는 비만억제용 조성물을 제공한다.

본 발명 비만억제용 조성물에 함유되어지는 헤스페리딘은 베타-시클로덱스트린으로 포접한 후 당전이효소를 이용하여 당을 부가시킨 헤스페리딘의 형태(G-헤스페리딘이라 한다)가 사용된다.

이를 위해 물에 베타-시클로덱스트린을 헤스페리딘의 중량을 기준으로 3 내지 9 중량부 첨가하여 용해한 후, 용액의 pH를 11.0 내지 11.5로 조정하여 헤스페리딘을 완전히 용해한다. 베타-시클로덱스트린을 3 중량부 미만으로 첨가할 경우 당전이효율이 떨어져 원하는 수율을 얻기 어렵고, 9 중량부를 초과할 경우 초과에 따른 수율 개선효과가 미미하여 상기 범위로 하는 것이 바람직하다. 이중에서 특히 본 발명 실험결과에 의하면 신속한 체내흡수를 위한 소장조건에서의 β-글루코시다제에 의한 아글리콘화가 베타-시클로덱스트린 3배 첨가군에서 매우 신속하게 이루어져 가장 우수한 체내흡수가 용이한 형태의 G-헤스페리딘을 제공할 수 있는 것으로 확인되어 보다 바람직하게는 베타-시클로덱스트린을 2.5 내지 3.5 중량부로 첨가하는 것이며, 가장 바람직하게는 3.0중량부 첨가하는 것이다.

이후 용액의 pH를 4.5 내지 5.0, 바람직하게는 4.8 내지 5.0, 가장 바람직하게는 pH 4.9로 재조정하고 12℃ 정도로 까지 냉각한다. 냉각에 의해 얻어진 침전 물은 제거하고, 얻어진 여액에 당전이효소를 첨가하여 당전이 반응을 진행시킨다. 당전이효소는 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(CGTase)가 사용되어질 수 있으며, 당전이반응은 60 내지 70℃에서 밤샘 진행하여 수행되고, 이에 의해 당이 부가된 G-헤스페리딘을 얻을 수 있다.

이와 같이 얻어지는 G-헤스페리딘은 물에 대한 용해도가 높고, 헤스페리딘 내지 헤스페리틴에 비하여 비만억제활성이 월등히 우수하다.

본 발명의 비만억제용 조성물은 상기 과정을 통해 당이 부가된 헤스페리딘을 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 만일 0.01 중량% 미만으로 첨가될 경우 첨가에 따른 비만억제활성을 기대하기 곤란하고, 10 중량%를 초과할 경우에는 추가 첨가에 따른 상승효과를 기대하기 곤란하여 상기 범위로 하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 비만억제용 조성물은 정제, 레커칠된 정제, 당 코팅된 정제, 경질 및 연질 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로서 경구적으로 투여될 수 있다. 이러한 형태의 제제는 비경구적으로도 투여될 수 있다. 또한 예를 들어, 좌약의 형태로 직장으로 투여되거나, 주사액의 형태로 비경구적으로도 투여될 수 있다. 활성성분은 위와 같은 경구 또는 비경구 투여제의 제형으로 각 활성 성분 모두를 함유하는 형태로 제형화되거나, 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있는 단일 물질의 특별한 조합으로 개별적으로 투여될 수도 있다. 정제, 래커칠된 정 제, 당 코팅된 정제 및 캡슐을 제조하기 위하여, 약제학적으로 불활성인 무기 또는 유기 부형제가 본 발명의 제형을 위해 첨가될 수 있다. 이러한 부형제로는 락토스, 옥수수전분 또는 이들의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 이들의 염을 들 수 있다. 상기 캡슐에 적합한 부형제로는 식물성유, 왁스, 지방, 반고체 또는 액체 폴리올을 들 수 있다. 용액 및 시럽을 제조하는데 적절한 부형제는 예를 들어, 물, 폴리올, 수크로스, 전화당글루코스 등이다. 주사액에 적합한 부형제로는 물, 알코올, 글리세롤, 식물성유를 들 수 있다. 좌약에 적합한 부형제로는 천연유 또는 경화유, 왁스, 지방, 반액체 또는 액체의 폴리올을 들 수 있다.

또한 본 발명에 따른 제형은 필요에 따라 방부제, 용해제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 향미제, 삼투압 조절제, 완충제, 코팅제 및/또는 산화방지제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 사람의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 활성성분은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 G-헤스페리딘을 포함하는 식품조성물을 포함한다. 상 기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 당부가 헤스페리딘의 양은 일반적으로 본 발명의 건강보조식품 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 1 내지 25 g, 바람직하게는 2 내지 15 g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 활성성분을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야 채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 30 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예 및 실험예는 본 발명의 이해를 위해 예시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하지는 아니함을 유의해야 한다.

<실시예 1> 감귤과피로부터 헤스페리딘 추출

감귤은 과육과 과피를 분리하여 사용하였으며 분리한 과피는 50℃ 드라이 오븐에서 건조한 후 다시 동결건조하여 냉동보관하며 사용하였다. 건조한 감귤 과피는 그라인더를 이용하여 분쇄하였으며 분쇄된 과피 무게의 20배의 70% 에탄올을 넣고 80℃에서 3시간 동안 환류추출하여 여과하였다. 추출물에 포함되어 있는 카로티노이드 및 비극성 물질의 제거를 위하여 여과한 추출액에 동량의 헥산을 넣고 쉐이킹하여 헥산층은 제거하였다. 2회반복하여 헥산층을 제거하였다.

감귤과피 70% 에탄올 추출물에서 헤스페리딘을 분리하기 위하여 추출액을 로터리진공증발기로 건고하고 증류수(DW)를 넣어 현탁시킨 후 12℃로 냉각하여 여과하였다. 여과 후 남은 고형분을 동결건조하여 조헤스페리딘(crude hesperidin)을 얻었다.

이와 같은 방법으로 제조한 70% 에탄올 추출물의 경우 수용성 성분인 나리루틴과 당류가 헤스페리딘과 함께 추출되어 헤스페리딘의 순도는 8.5%로 매우 낮게 나타났다.

조헤스페리딘을 물에 녹일 경우 헤스페리딘은 물에 거의 녹지 않지만 나리루틴은 잘 녹는 것을 알 수 있었다. 이러한 점을 이용하여 나리루틴 성분 및 수용성 당류를 제거하고자 증류수를 이용하여 세척하여 순도를 8.5%에서 63.0%로 크게 높일 수 있었다.

헤스페리딘의 불순물을 제거하고 순도를 높이고자 NaOH로 pH를 11.3으로 높여 헤스페리딘을 완전히 물에 용해시킨 후 다시 pH를 7.0으로 조정하고 12℃로 냉각하여 헤스페리딘을 결정화시켰다. 여과하고 남은 고형분을 얻어 동결건조하여 감귤 과피 추출 헤스페리딘을 얻었다. 1회 결정화 실시 후 수율은 감소하였으나 순도는 스탠다드와 비교하여 약 15% 증가하여 78.7%로 나타났다. 따라서, 더욱 순도를 높여보고자 결정화를 2회 실시해 본 결과 수율은 약 0.4% 감소하였으나 순도는 88.7%로 증가하였다(표 1).

<표 1> 헤스페리딘 추출 단계별 수율 및 순도

	수율(%)	순도(%)
70% 에탄올 추출물	34.9	8.5
증류수로 세척	4.8	63.0
결정화 1회	3.8	78.7
결정화 2회	3.4	88.7

이와 같이 70% EtOH, 세척, pH 조절 등 간단하면서도 경제적인 추출방법을 통하여 감귤껍질로부터 표준품(약 80%)보다 순도가 더 높은 헤스페리딘을 추출하는 공정을 확립하였다.

<실시예 2> 당부가 헤스페리딘(G-헤스페리딘)의 제조

헤스페리딘의 용해도가 낮아 체내 흡수율이 낮고 식품소재로 적용하는데 어려운 점을 해결하기 위하여 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(CGTase)를 이용하여 플라보노이드에 당을 부가시키는 방법을 이용하였다. 헤스페리딘은 아글리콘(aglycone)인 헤스페리딘에 당인 루티노스(글루코스+람노스)가 결함되어 있는 상태로써 루티노스의 글루코스에 당전이가 이루어져 글루코스가 1~10개까지 결합될 수 있다. G-헤스페리딘은 글루코스가 결합함에 따라 용해도가 매우 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 본 실시예에서는 감귤 과피에서 추출하여 제조한 헤스페리딘을 이용하여 당부가 실험을 하였다.

먼저 효소처리할 헤스페리딘 1g을 1L의 증류수에 현탁시킨 후 β-시클로덱스트린을 각각 3, 5, 9g씩 가하고 70℃로 가온하여 β-시클로덱스트린을 용해시켰다. 이 용액에 15% NaOH 용액을 가하여 pH 11.3으로 조정하고 헤스페리딘을 완전히 용해시킨 후 헤스페리딘을 β-시클로덱스트린으로 포접시켰다. β-시클로덱스트린으로 포접된 헤스페리딘 함유액에 20%의 HCl을 첨가하여 pH 4.9가 되게 조정하고 12℃가 될 때 까지 냉각하였다. 냉각하여 생긴 침전물을 여과하여 제거하고 여액을 얻었다. 얻어진 여액에 15% NaOH용액을 첨가하여 pH 5.5로 조정하고 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(CGTase)를 0.1ml 첨가하여 60℃에서 밤샘하여 당전이 반응을 일으켰다. 반응이 끝난 후 반응액은 90℃이상의 온도로 5분간 가열하여 CGTase를 실활시켰다.

다공성 흡착 수지인 Amberlite XAD7HP를 이용하여 당전이 반응에 이용되지 않고 남은 시클로덱스트린을 제거하였다. Amberlite XAD7HP은 칼럼에 채워 미리 증류수로 활성화시켜 사용하였다. 당전이 반응이 끝난 반응액을 칼럼에 로딩후 증류수를 칼럼에 통과시켜 레진에 흡착되지 않은 당을 제거한 다음 에탄올을 통과시켜 레진에 흡착되어 있는 플라보노이드 및 플라보노이드 글리코사이드를 용출하여 얻었다. 에탄올은 증발시키고 동결건조하여 정제된 플라보노이드 글리코사이드를 얻었다. 위의 방법으로 얻은 플라보노이드 글리코사이드는 HPLC를 이용하여 당전이 정도를 측정하였다. HPLC 분석 조건은 아래 표 2와 같다.

<표 2> HPLC를 이용한 G-헤스페리딘 분석 조건

장치	Jasco PU-990 Pump/ Jasco 851-AS sampler Jasco 807-IT Integrator (Japan) Sedex 55 Light Scattering Detector (France)
칼럼	Water μ Bondapak C18
유속	0.5ml/min
UV 검출기	280nm
용매	A; 물 B; 메탄올 C; 아세트산
등용매	A : B : C = 65 : 30 : 5

상기와 같이 시클로덱스트린의 첨가량 별로 G-헤스페리딘의 당부가 정도를 HPLC로 측정해본 결과 시클로덱스트린을 9배 첨가한 것이 가장 당부가 반응은 많이 일어난 것으로 나타났다. 3, 9배의 시클로덱스트린을 첨가하여 제조한 G-헤스페리딘에 함유된 헤스페리딘의 농도를 계산한 결과, 시클로덱스트린 3배 첨가군은 약 29.2 mol%, 시클로덱스트린 9배 첨가군은 약 23.2 mol%로 나타났다.

<표 3> G-헤스페리딘의 조성

	몰비(%)
	CD 3배	CD 9배
헤스페리딘	31.325	24.272
G-1-헤스페리딘	23.224	21.965
G-2-헤스페리딘	21.019	22.476
G-3-헤스페리딘	11.716	12.499
G_4-헤스페리딘	7.512	12.874
G-5-헤스페리딘	5.204	5.914

위의 결과로 볼 때 시클로덱스트린의 첨가량이 증가할수록 당부가가 잘 이루어져 G-헤스페리딘의 생성 정도는 증가하지만 헤스페리딘과 결합하지 않은 채 남아 XAD7 통과 후에도 제거 되지 않는 당의 함량이 증가하는 것으로 생각되어진다.

<실험예 1> G-헤스페리딘의 용해도

G-헤스페리딘의 수용화능을 비교한 결과, 3배 첨가군이나 9배 첨가군의 100ppm 또는 1,000ppm 농도에서의 수용화 비율은 큰 차이가 없었으며(표 4), 신속한 체내흡수를 위한 소장조건에서의 β-글루코시다제에 의한 아글리콘화도 CD 3배 첨가군에서 신속하게 이루어져 체내흡수가 용이한 형태의 G-헤스페리딘인 것으로 확인된다(표 5)

<표 4> G-헤스페리딘의 수용성

	상등액에서의 수용성 헤스페리딘의 농도(%)
	100ppm	1000ppm
헤스페리딘	1.8	1.6
G-헤스페리딘 (CD 3배)	97.7	89.4
G-헤스페리딘 (CD 9배)	97.0	95.8

<표 5> G-헤스페리딘의 β-글루코시다제 처리에 의한 헤스페리딘 조성 변화

	헤스페리딘 (건조 G-헤스페리딘에서의 몰%)		헤스페르딘의 헤스페리틴 전환율(%)	G-1 헤스페리딘의 헤스페리틴 전환율(%)
	β-글루코시다제 처리전	β-글루코시다제 처리후
G-헤스페리딘 (3)	29.2	18.7	64.0	25.0
G-헤스페리딘 (9)	23.2	12.8	55.5	28.4

<실험예 2> 동물실험

실험방법

(1) 동물 및 식이

실험동물은 4주령의 sprague-dawley종 수컷 흰쥐를 분양받아 1주일간 고형사료로 적응기간을 주며, 적응기간 중 물과 고형식이는 자유로이 섭취하도록 공급하였고, 식이는 4℃에서 보관하며 사용하였다. 실험동물들은 환경 조절된 사육실에서 분리사육하였으며, 각 실험군당 10마리로 하였다. 고지방ㆍ고콜레스테롤 사료는 아래 표 7과 같이 지방 45%cal에 콜레스테롤 1%를 포함시켜 제조하여 공급하였으며 일반식이는 AIN-93으로 하였다. 샘플은 물에 녹여 정해진 시간에 한 마리당 1ml씩 하루 1회 경구투여 하였다. 샘플의 농도는 아래 표 6과 같이 헤스페리딘 기준으로 동일한 양을 산정하여 그룹별로 투여하였다. 경구투여한 G-헤스페리딘의 농도는 25mg/ml로 하였으며 헤스페리딘과 헤스페리딘을 헤스페리니다제(hesperinidase)로 처리하여 얻은 헤스페리틴의 농도는 G-헤스페리딘 25mg/ml 중에 포함된 양을 환산하여 같은 농도로 계산하여 투여하였다. 대조군은 샘플 대신 증류수로 경구투여 하였다. 체중은 일주일 간격으로 측정하였다.

<표 6> 동물실험 경구투여 샘플농도

	G-헤스페리딘	헤스페리딘	헤스페리틴
mg/ml/1day	25.0	16.0	8.0

<표 7> 동물실험 고형식이 조성

Kcal	AIN-93	HFHC(45%cal (Lard 20%) + 콜레스테롤 1%)
카제인	800	800
콘스타치	1590	620
수크로스	400	200
덱스트로스	528	528
셀룰로스	0	0
대두유	630	225
돼지기름(lard)	0	1575
미네랄 믹스	0	0
비타민 믹스	40	40
TBHQ	0	0
L-시스틴	12	12
타타르산수소콜린	0	0
콜레스테롤	0	90
kg당 kcal	4000	4828

(2) 시료 채취 및 처리

실험은 총 5주간 지속하였으며 혈액은 안와채혈법으로 얻었으며 체혈 후 간조직을 적출하였다. 채혈한 혈액은 3000rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석시료로 사용하였다. 분석시까지 냉장보관하였다. 간조직은 적출하여 지질 추출 시 까지 -70℃에서 냉동보관하였다.

(3) 간지질 추출

간의 지질은 Folch 등의 방법을 따라 간 1g에 10배 용량의 용매(클로로포름 : 메탄올 = 2 : 1)를 가하여 반복추출하고 용매를 휘발시켜 지질을 얻었으며 추출한 지질은 에탄올 10ml로 정용하여 분석시료로 사용하였다.

(4) 지질 및 콜레스테롤 분석

혈청과 추출한 간지질의 지질 성분 분석은 네오딘벳랩에 의뢰하여 아래의 표 8과 같은 방법으로 분석하였다.

<표 8> 혈청 및 간조직의 지질 분석 방법

검사명	검사장비	검사시약	검사방법
TG	BS-400 (Mindray,China)	ELItech(France)	Enzmatic, colorimetry
T.Chol			Enzymatic,colorimetry
HDL-Chol	Hitachi7180 (Hitachi,Japan)		선택저해법
LDL-Chol			효소법

실험결과

HPLC를 이용하여 분석한 결과 G-헤스페리딘에 포함된 헤스페리딘의 양은 64.29%로 나타났으며 헤스페리틴은 33.38%로 나타났다. 이러한 결과로 헤스페리딘은 25mg의 64.29%인 16mg/ml, 헤스페리틴은 33.38%인 8mg/ml의 농도로 실험을 하였다.

고지방, 고콜레스테롤 다이어트 SD 래트의 G-헤스페리딘, 헤스페리딘 및 헤스페리틴의 투여로 인한 체중변화는 G-헤스페리딘과 헤스페리딘 투여군에서 대조군에 비해 체중과 간조직의 무게가 약간 감소되는 것으로 관찰되었으나 헤스페리틴 투여로는 변화가 없었다.

<표 9> 체중 및 간무게 변화

	체중(g)	간무게(g)
고지방군	495.51±17.83	22.83±2.00
G-헤스페리딘	471.55±25.90	21.33±3.37
헤스페리딘	471.46±38.06	20.32±2.94
헤스페리틴	494.69±47.23	23.83±3.07

5주간 실험 후의 혈청 지질의 변화를 살펴보면 중성지방의 경우, 고지방군에 비해 G-헤스페리딘군과 헤스페리딘은 약 20% 감소하였으나 헤스페리틴 투여군에서는 거의 변화가 없었으며 총콜레스테롤은 고지방군에 비해 G-헤스페리딘군이 약 30% 감소한 반면 헤스페리딘은 약 18%, 헤스페리틴에서 약 7% 감소하였다. HDL-콜레스테롤의 경우, G-헤스페리딘이 가장 높았으며, 헤스페리딘과 헤스페리틴에서는 별 차이가 없었다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량은 모든 플라보노이드 투여군에서 고지방식이군에 비해 다소 감소된 경향을 보였다.

<표 10> 혈청 TG 및 TC함량 변화 [단위(mg/dL)]

	TG	TC	HDL-C	LDL-C
고지방군	58.60±10.92	73.60±16.16	16.08±3.11	45.80±14.74
G-헤스페리딘	49.00±8.91	56.18±9.07	19.25±6.85	32.25±8.06
헤스페리딘	50.61±4.83	62.50±17.54	16.50±2.65	35.25±5.91
헤스페리틴	57.50±6.14	68.50±7.59	17.75±2.22	39.25±19.05

간조직의 지질 성분의 결과를 살펴보면 중성지방의 경우, 헤스페리딘과 헤스페리틴 투여군의 경우 고지방군과 거의 차이가 없는 것으로 나타났으며 G-헤스페리딘군은 고지방군에 비해 약 10.3% 감소하였다. 총콜레스테롤 함량은 G-헤스페리딘군은 고지방군에 비해 약 17% 감소하였으며 헤스페리딘 13%. 이상과 같은 결과를 종합하면 헤스페리딘이 간의 중성지방 생성 억제능은 G-헤스페리딘에서 가장 효율적인 것으로 사료되며 이는 G-헤스페리딘의 수용화 정도 및 이에 따른 체내흡수력이 헤스페리딘과 헤스페리틴에 비해 높은 것에서 기인한 것으로 추측된다.

<표 11> 간조직의 TG 및 TC함량 변화 [ 단위(mg/g 간무게)]

	TG	TC
고지방군	79.74±4.70	27.18±5.61
G-헤스페리딘	72.25±3.05	23.13±2.14
헤스페리딘	78.08±8.69	23.98±4.64
헤스페리틴	80.85±1.70	26.23±3.28

간조직에서의 TG합성과 TC합성에 관여되는 것으로 알려진 전사인자인 C/EBP- α와 콜레스테롤 합성효소인 HMG-CoA 리덕타제의 발현정도를 RT-PCR을 이용하여 측정하였다(도 2, 3). C./EBP-α는 지방세포분화를 촉진시키는 인자로서 도 2에서 볼 수 있듯이 고지방식이군(PC)에서는 발현이 왕성하였으나 정상식이군과 고지방식이 + G-헤스페리딘 투여군에서는 발현이 상당히 억제 되었다. 특히 G-헤스페리딘을 경구투여함으로 C/EBP-α의 발현이 약 40% 억제되어 G-헤스페리딘 투여가 간에서 지방조직으로의 분화를 억제하는 것으로 나타났다.

G-헤스페리딘 투여에 따른 HMG-CoA 리덕타제의 mRNA 발현량을 살펴보았다. 6주간의 실험 후 간을 적출하여 간조직의 HMG-CoA 리덕타제의 mRNA 발현량을 측정한 결과 일반사료를 섭취시킨 군(NC)에 비해 고지방군(PC)은 약 339.2% 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 고콜레스테롤 사료의 섭취에 의해 체내 콜레스테롤이 풍부해져서 간에서 콜레스테롤을 생성시킬 필요성이 감소함에 따라 콜레스테롤을 생합성 과정에서 작용하는 rate-limiting enzyme인 HMG-CoA 리덕타제의 mRNA 발현량도 낮아진 것에서 기인하는 것이다. 또한, G-헤스페리딘의 투여군의 mRNA 발현은 고지방군에 비해 약 144% 가량 증가한 것으로 나타났다. 이는 G-헤스페리딘의 투여에 의해 체내 콜레스테롤의 흡수가 저해되어 체내 콜레스테롤 수치가 감소하여 간의 mRNA 발현량이 증가한 것으로 간주할 수 있다.

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 헤스페리딘 중량대비 시클로덱스트린(CD) 3배 첨가(위)와 9배(아래) 첨가하여 제조한 G-헤스페리딘의 HPLC 크로마토그램이다.

도 2는 식이에 따른 간에서의 CEBP-α 발현정도를 보여주는 실험결과이다.

NC: 일반식이 PC: 고지방, 고콜레스테롤 식이. G: HF, HC+G-헤스페리딘

도 3은 식이에 따른 간에서의 HMG-CoA 리덕타제의 발현량을 측정한 실험결과이다.

NC: 일반식이 PC: 고지방, 고콜레스테롤 식이. G: HF, HC+G-헤스페리딘

Claims (10)

1. (a) 감귤과피로부터 70% 내지 90% 에탄올을 이용하여 조추출액을 얻는 단계;

   (b) 상기 조추출액을 건고한 후 물을 넣어 현탁하고, 이를 냉각하여 여과하는 단계; 및

   (c) 여과 후 남은 고형분을 동결건조하여 조헤스페리딘을 얻는 단계; 및

   (d) 상기 조헤스페리딘을 물에 현탁시킨 후 pH를 11.0 내지 11.5로 증가시켜 헤스페리딘을 완전히 용해하고, pH를 7.0으로 감소시켜 헤스페리딘을 결정화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   단계 (a)에서 얻은 조추출물에 헥산을 첨가 교반하여 카로티노이드를 제거하는 단계를 포함하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.
5. 제 1항에 있어서,

   단계 (d)의 결정화 과정은 2회 반복실시하는 것을 특징으로 하는 감귤과피로부터 분리된 헤스페리딘의 정제방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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