WO2020067121A1 - アルカリホスファターゼ組成物並びに脱リン酸化核酸及び標識化核酸の製造方法 - Google Patents

アルカリホスファターゼ組成物並びに脱リン酸化核酸及び標識化核酸の製造方法 Download PDF

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WO2020067121A1
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nucleic acid
alkaline phosphatase
peptide fragment
amino acid
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PCT/JP2019/037519
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正照 伊藤
洋二 上田
有樹 瀧井
麻衣 八木
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東レ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing alkaline phosphatase, and a method for producing a dephosphorylated nucleic acid and a method for producing a labeled nucleic acid using the composition.
  • Alkaline phosphatase has a catalytic function of hydrolyzing phosphate monoester and is widely used in methods for measuring the amount of biological substances such as proteins and nucleic acids (eg, immunostaining, ELISA, nucleic acid microarray, etc.). I have. For example, in the field of genetic engineering research, the 5′-end and / or 3′-end of nucleic acid using alkaline phosphatase for the purpose of pretreatment of labeling of nucleic acid such as DNA and RNA, prevention of self-ligation of vector, etc. Dephosphorylation is taking place.
  • alkaline phosphatase As an industrial production method of alkaline phosphatase, a production method mainly using bovine small intestine or large intestine as a raw material is widely adopted because of its high specific activity. Evaluation of the specific activity of alkaline phosphatase is generally performed by measuring the absorbance at 405 nm derived from p-nitrophenol generated when p-nitrophenyl phosphate is decomposed.
  • alkaline phosphatase The quality of alkaline phosphatase is evaluated based on the specific activity of alkaline phosphatase. Then, in order to obtain alkaline phosphatase having a higher specific activity than that of bovine intestine-derived alkaline phosphatase, high specific activity alkaline phosphatase is isolated in the purification process, or high specific activity is obtained by recombinant Escherichia coli using genetic engineering techniques. It produces alkaline phosphatase.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing alkaline phosphatase having high specific activity using recombinant Escherichia coli into which a gene derived from Bacillus badius has been introduced.
  • Patent Document 2 discloses a method for producing alkaline phosphatase having high specific activity and heat resistance using recombinant Escherichia coli into which a gene derived from the genus Shewanella has been introduced.
  • a dephosphorylation reagent containing alkaline phosphatase (for example, a commercially available alkaline phosphatase product) is a composition containing alkaline phosphatase and other components. The quality of the dephosphorylating reagent containing alkaline phosphatase is evaluated based on the specific activity of alkaline phosphatase.
  • a labeled nucleic acid prepared using the dephosphorylation reagent (the 5 ′ end and / or 3 ′ (A labeled nucleic acid obtained by dephosphorylating the 'end and attaching a labeling substance to the 5' end and / or 3 'end of the dephosphorylated nucleic acid) in the detection sensitivity in the nucleic acid detection method.
  • the 5 ′ end and / or 3 ′ A labeled nucleic acid obtained by dephosphorylating the 'end and attaching a labeling substance to the 5' end and / or 3 'end of the dephosphorylated nucleic acid
  • an object of the present invention is to provide a high-quality composition containing alkaline phosphatase, a method for producing a dephosphorylated nucleic acid using the composition, and a method for producing a labeled nucleic acid.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that the following impurities can be mixed in a dephosphorylation reagent containing alkaline phosphatase (for example, a commercially available alkaline phosphatase product).
  • a dephosphorylation reagent containing alkaline phosphatase for example, a commercially available alkaline phosphatase product.
  • a first peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 a second peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 a third peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • a fourth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 a fifth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a sixth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7
  • the present inventors selected the content of the first to sixth peptide fragments (preferably, the content of the first to sixth peptide fragments, and the group consisting of the seventh to ninth peptide fragments).
  • the labeled nucleic acid prepared using a dephosphorylation reagent (the 5 ′ end of the nucleic acid and the 5 ′ end of the nucleic acid by the dephosphorylation reagent). And / or dephosphorylation of the 3 ′ end, and labeling of the dephosphorylated nucleic acid with a labeling substance at the 5 ′ end and / or 3 ′ end) in the nucleic acid detection method.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a first peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a second peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • a third peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • a fifth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • a sixth peptide fragment comprising:
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of the alkaline phosphatase is represented by the following formulas (1) to (6), respectively: (X 1 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.6000 (1) (X 2 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.1800 (2) (X 3 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.2000 (3) (X 4 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.8000 (4) (X 5 /Y) ⁇ 100 ⁇ 1.6000 (5) (X 6 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.3500 (6) [
  • Y represents a peak area value of the alkaline phosphatase calculated by an automatic integration method from a chromatogram obtained by LC-UV analysis of the composition.
  • the above composition wherein [2] the composition further comprises a seventh peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, The content of the seventh peptide fragment with respect to the content of the alkaline phosphatase is represented by the following formula (7): (X 7 /Y) ⁇ 100 ⁇ 1.0000 (7) [In the formula, X 7 represents a peak area value of the seventh peptide fragment, calculated by an automatic integration method from an extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition, and Y represents Has the same meaning as described above.
  • the composition further comprises an eighth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
  • the content of the eighth peptide fragment with respect to the content of the alkaline phosphatase is represented by the following formula (8): (X 8 /Y) ⁇ 100 ⁇ 1.0000 (8)
  • X 8 represents a peak area value of the eighth peptide fragment, calculated by an automatic integration method from an extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition, and Y represents Has the same meaning as described above.
  • the composition further comprises a ninth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
  • the content of the ninth peptide fragment with respect to the content of the alkaline phosphatase is represented by the following formula (9): (X 9 / Y) ⁇ 100 ⁇ 23,000 (9)
  • X 9 represents the peak area value of the peptide fragment of the above 9 calculated by an automatic integration method from the extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition
  • Y represents It is the same as the above.
  • the composition according to any one of [1] to [3], which satisfies the following.
  • the alkaline phosphatase comprises the following (a) and (b): (A) an alkaline phosphatase having a protein molecule consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (b) having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; [1] to [5] selected from alkaline phosphatases having a protein molecule consisting of an amino acid sequence containing amino acid sequences 78 to 90, 177 to 187, 469 to 477, 516 to 528 and 534 to 551.
  • the amino acid sequence of the protein molecule of the alkaline phosphatase of (b) is one or two selected from positions 91 to 109, 93 to 105, and 529 to 531 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • composition [10] The composition according to [9], wherein the composition is a composition for dephosphorylating the nucleic acid.
  • composition further contains a dephosphorylated nucleic acid.
  • composition is a composition for preparing a labeled nucleic acid comprising the dephosphorylated nucleic acid and a labeling substance bound to the dephosphorylated nucleic acid.
  • composition further comprises a labeled nucleic acid comprising a dephosphorylated nucleic acid and a labeling substance bound to the dephosphorylated nucleic acid.
  • composition according to [13], wherein the composition is a nucleic acid sample subjected to a nucleic acid detection method.
  • nucleic acid detection method is a nucleic acid detection method using a nucleic acid microarray.
  • [17] The following steps: Preparing the composition according to any one of [1] to [8]; Providing a nucleic acid; Preparing a labeling substance; A method for producing a labeled nucleic acid, comprising: treating the nucleic acid with the composition to dephosphorylate the nucleic acid; and binding the labeling substance to the dephosphorylated nucleic acid.
  • the present invention provides a high-quality composition containing alkaline phosphatase, a method for producing a dephosphorylated nucleic acid and a method for producing a labeled nucleic acid using the composition.
  • FIG. 1 shows an extracted ion chromatogram of the first peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 2 shows an extracted ion chromatogram of the second peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 3 shows an extracted ion chromatogram of the third peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 4 shows an extracted ion chromatogram of the fourth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 5 shows an extracted ion chromatogram of the fifth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of the composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 6 shows an extracted ion chromatogram of the sixth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 7 shows an extracted ion chromatogram of the seventh peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 8 shows an extracted ion chromatogram of the eighth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of the composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 9 shows an extracted ion chromatogram of the ninth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of the composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 10 shows an extracted ion chromatogram of the first peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 11 shows an extracted ion chromatogram of the second peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 12 shows an extracted ion chromatogram of the third peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 13 shows an extracted ion chromatogram of the fourth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 14 shows an extracted ion chromatogram of the fifth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 15 shows an extracted ion chromatogram of the sixth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 16 shows an extracted ion chromatogram of the seventh peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 17 shows an extracted ion chromatogram of the eighth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 18 shows an extracted ion chromatogram of the ninth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 19 shows a chromatogram of alkaline phosphatase obtained in Example 1 by LC-UV analysis of composition E1 (purified product of composition C2).
  • number M to numerical value N used in the present specification means a range from numerical value M to numerical value N.
  • the composition of the present invention contains alkaline phosphatase.
  • the composition of the present invention may contain one kind of alkaline phosphatase, or may contain two or more kinds of alkaline phosphatases.
  • the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it has alkaline phosphatase activity.
  • the alkaline phosphatase activity is an activity of hydrolyzing a phosphate monoester bond under alkaline conditions (pH 8 to 11, for example, pH 8 to 10 or pH 9 to 11), and its reaction format is classified into EC 3.1.3.1. Is done.
  • alkaline phosphatase may have a sugar chain or may not have a sugar chain.
  • Alkaline phosphatase may be any isozyme that can exist based on differences in protein molecule structure (eg, amino acid sequence of protein molecule), sugar chain modification, and the like.
  • the alkaline phosphatase may be a monomer formed from one subunit, or an oligomer formed from two or more subunits (eg, dimer, tetramer, etc.). ).
  • the oligomer may be a homo-oligomer or a hetero-oligomer.
  • the animal from which the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention is derived is not particularly limited.
  • animals from which alkaline phosphatase is derived include cows, shrimp, and microorganisms into which a gene encoding alkaline phosphatase has been introduced. Since bovine alkaline phosphatase has high alkaline phosphatase activity, bovine is preferred as the animal from which alkaline phosphatase is derived.
  • the organ from which alkaline phosphatase is derived is preferably the small or large intestine.
  • the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention may be of a wild type or a mutant type.
  • the mutant alkaline phosphatase has, for example, a protein molecule consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of a protein molecule possessed by wild-type alkaline phosphatase.
  • the amino acid sequence of the protein molecule of the mutant alkaline phosphatase is preferably 70% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more, based on the amino acid sequence of the protein molecule of the wild-type alkaline phosphatase. More preferably it has a sequence identity of 85% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more.
  • the alkaline phosphatase comprises the following (a) and (b): (A) an alkaline phosphatase having a protein molecule consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and (b) having 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; Positions 78 to 90 of the amino acid sequence (corresponding to the fourth peptide fragment), 177 to 187 (corresponding to the first peptide fragment), 469 to 477 (corresponding to the second peptide fragment), 516 to 528 ( And alkaline phosphatase having a protein molecule consisting of an amino acid sequence containing positions 534 to 551 (corresponding to the third peptide fragment).
  • the composition of the present invention may contain one kind of alkaline phosphatase selected from the above (a) and (b), or may contain 2 kinds of alkaline phosphatase selected from the above (a) and (b). It may contain more than one alkaline phosphatase.
  • the alkaline phosphatase of the above (b) contains the positions 534 to 545 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (corresponding to the sixth peptide fragment).
  • the amino acid sequence of the protein molecule of the alkaline phosphatase (a) described above corresponds to the amino acid sequence of the protein molecule of the alkaline phosphatase derived from bovine. Therefore, the alkaline phosphatase (a) includes bovine alkaline phosphatase.
  • the amino acid sequence of the protein molecule contained in the alkaline phosphatase (b) is preferably 70% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more, and still more preferably the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10. It has a sequence identity of 85% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more.
  • the alkaline phosphatase (b) includes both wild-type alkaline phosphatase (eg, alkaline phosphatase derived from animals other than cattle, alkaline phosphatase derived from bovine having polymorphism, etc.) and mutant alkaline phosphatase.
  • the positions at which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 are positions 78 to 90, 177 to 187, and 469 to 477 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. Positions other than the 516-528 and 534-551 positions.
  • the alkaline phosphatase of the above (a) and (b) can generate first to sixth peptide fragments and the like by its decomposition.
  • the amino acid sequence of the protein molecule contained in the alkaline phosphatase of (b) is one selected from positions 91 to 109, 93 to 105 and 529 to 531 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. Or two or more are included.
  • the alkaline phosphatase of the above (b) can generate one or more of the seventh to ninth peptide fragments by its decomposition.
  • the alkaline phosphatase of (b) above corresponds to positions 86 to 109 (corresponding to the seventh peptide fragment) and 93 to 105 (corresponding to the ninth peptide fragment) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. And one or more selected from positions 516 to 531 (corresponding to the eighth peptide fragment).
  • the alkaline phosphatase of the above (b) comprises the positions 91 to 109 and 529 to 531 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the alkaline phosphatase of (b) above can generate seventh to ninth peptide fragments by its decomposition.
  • the alkaline phosphatase of (b) above corresponds to positions 86 to 109 (corresponding to the seventh peptide fragment) and 93 to 105 (corresponding to the ninth peptide fragment) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. And positions 516-531 (corresponding to the eighth peptide fragment).
  • composition of the present invention comprises a first peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a second peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a third peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 a fifth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to positions 177 to 187 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 corresponds to positions 469 to 477 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 corresponds to positions 534 to 551 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 corresponds to positions 78 to 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 corresponds to positions 516 to 528 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 corresponds to positions 534 to 545 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequences of the first to sixth peptide fragments are 177 to 187, 469 to 477, 534 to 551, 78 to 90, 516 to 528, and 534 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, respectively. It corresponds to 545th place. That is, the first to sixth peptide fragments correspond to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 at positions 177 to 187, 469 to 477, 534 to 551, 78 to 90, 516 to 528, and 534 to 534, respectively. May occur by decomposition at position 545.
  • alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention is characterized in that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is at positions 177 to 187, 469 to 477, 534 to 551, 78 to 90, 516 to 528 And positions 534-545 need not be included.
  • Alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention comprises amino acids 177 to 187, 469 to 477, 534 to 551, 78 to 90, 516 to 528 and 534 to 545 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. One or more of the positions may not be included.
  • the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention contains amino acids 177 to 187, 469 to 477, 534 to 551, 78 to 90, 516 to 528 and 534 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. It is preferred to include positions 545.
  • the first to sixth peptide fragments may be those generated by the decomposition of alkaline phosphatase not contained in the composition of the present invention, but usually, the peptide fragments of alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention. It is caused by decomposition. Therefore, in a preferred embodiment, the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention is an alkaline phosphatase capable of producing the first to sixth peptide fragments. In a preferred embodiment, the alkaline phosphatase capable of producing the first to sixth peptide fragments is selected from the alkaline phosphatases of the above (a) and (b). In this embodiment, the composition of the present invention contains one or more alkaline phosphatases selected from the alkaline phosphatases of (a) and (b) above.
  • the composition of the present invention comprises a seventh peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an eighth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, It further contains one or more peptide fragments selected from the group consisting of the ninth peptide fragment having the described amino acid sequence.
  • composition of the present invention contains all of the seventh to ninth peptide fragments.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 corresponds to positions 86 to 109 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 corresponds to positions 516 to 531 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 corresponds to positions 93 to 105 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the seventh to ninth peptide fragments correspond to positions 86 to 109, 516 to 531 and 93 to 105 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, respectively. That is, the first to sixth peptide fragments can be generated by degradation of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 at positions 86 to 109, 516 to 531 and 93 to 105, respectively. This does not mean that the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention needs to include positions 86 to 109, 516 to 531 and 93 to 105 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • Alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention may not contain one or more of amino acids 86 to 109, 516 to 531 and 93 to 105 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention preferably contains amino acids 86 to 109, 516 to 531 and 93 to 105 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10.
  • the seventh to ninth peptide fragments may be those generated by the decomposition of alkaline phosphatase not contained in the composition of the present invention, but usually the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention. It is caused by decomposition. Therefore, in a preferred embodiment, the alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention is an alkaline phosphatase capable of producing the seventh to ninth peptide fragments. In a preferred embodiment, the alkaline phosphatase capable of producing the seventh to ninth peptide fragments is selected from the alkaline phosphatases (a) and (b) described above. In this embodiment, the composition of the present invention contains one or more alkaline phosphatases selected from the alkaline phosphatases of (a) and (b) above.
  • composition of the present invention may contain peptide fragments other than the first to ninth peptide fragments.
  • Peptide fragments other than the first to ninth peptide fragments are, for example, those produced by the decomposition of alkaline phosphatase contained in the composition of the present invention.
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of alkaline phosphatase is represented by the following formulas (1) to (6), respectively: (X 1 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.6000 (1) (X 2 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.1800 (2) (X 3 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.2000 (3) (X 4 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.8000 (4) (X 5 /Y) ⁇ 100 ⁇ 1.6000 (5) (X 6 /Y) ⁇ 100 ⁇ 0.3500 (6) Meet.
  • X 1 to X 6 are each a value calculated by an automatic integration method from an extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition of the present invention.
  • Y represents the peak area value of the first to sixth peptide fragments, and Y represents the peak area value of alkaline phosphatase calculated by the automatic integration method from the chromatogram obtained by LC-UV analysis of the composition of the present invention. .
  • composition of the present invention further contains a seventh peptide fragment
  • the ratio of the content of the seventh peptide fragment to the content of alkaline phosphatase is represented by the following formula (7): (X 7 /Y) ⁇ 100 ⁇ 1.0000 (7) It is preferable to satisfy the following.
  • X 7 is the peak area of the seventh to ninth peptide fragments calculated by the automatic integration method from the extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition of the present invention. Represents a value, and Y is as defined above.
  • composition of the present invention further contains an eighth peptide fragment
  • the ratio of the content of the eighth peptide fragment to the content of alkaline phosphatase is represented by the following formula (8): (X 8 /Y) ⁇ 100 ⁇ 1.0000 (8) It is preferable to satisfy the following.
  • X 8 is a peak area value of the eighth peptide fragment calculated by an automatic integration method from an extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition of the present invention.
  • Y is as defined above.
  • the ratio of the content of the ninth peptide fragment to the content of alkaline phosphatase is determined by the following formula (9): (X 9 / Y) ⁇ 100 ⁇ 23,000 (9) It is preferable to satisfy the following.
  • X 9 represents a peak area value of the ninth peptide fragment calculated by an automatic integration method from an extracted ion chromatogram obtained by LC-MS / MS analysis of the composition of the present invention.
  • Y is as defined above.
  • LC-MS / MS analysis and LC-UV analysis showed the ratio of the content of the first peptide fragment to the content of alkaline phosphatase ((X 1 / Y) ⁇ 100), the content of the second peptide to the content of alkaline phosphatase.
  • the ratio of the content of the fragment ((X 2 / Y) ⁇ 100), the ratio of the content of the third peptide fragment to the content of alkaline phosphatase ((X 3 / Y) ⁇ 100), and the content of the alkaline phosphatase
  • the ratio of the content of the fourth peptide fragment ((X 4 / Y) ⁇ 100), the ratio of the content of the fifth peptide fragment to the content of alkaline phosphatase ((X 5 / Y) ⁇ 100), and the ratio of the content of the sixth peptide fragment to the content of alkaline phosphatase ((X 6 / Y) ⁇ 100) is, the sample is identical to the composition of the present invention It is carried out by use.
  • the LC-MS / MS analysis and the LC-UV analysis can be performed, for example, using an aqueous solution prepared from the composition of the present invention and having an alkaline phosphatase concentration of 10% by weight.
  • LC-MS / MS analysis is a type of hyphenated method.
  • the hyphenated method is a technique of connecting a chromatograph such as a gas chromatograph or a liquid chromatograph to a mass spectrometer for analysis.
  • the LC-MS / MS analysis is a technique of connecting a liquid chromatograph (LC) and a tandem mass spectrometer (MS / MS) for analysis.
  • LC liquid chromatograph
  • MS / MS tandem mass spectrometer
  • a mass spectrum is measured at regular time intervals, stored in a computer, and then the relative intensity at a specific (not limited to one type) m / z value is read out.
  • 5 is a chromatogram expressed as a function of time.
  • the m / z value of the ion used to detect the peaks of the first to ninth peptide fragments is preferably 50 to 2200, more preferably 200 to 1500, and still more preferably 300 to 1200.
  • Extracted ion chromatograms of the first to ninth peptide fragments can be created based on m / z values.
  • the m / z value of the first peptide fragment is 558.7676
  • the m / z value of the second peptide fragment is 443.7533
  • the m / z value of the third peptide fragment is 652.6623
  • the fourth peptide fragment M / z value of the second peptide fragment is 723.8572
  • m / z value of the fifth peptide fragment is 655.8148
  • m / z value of the sixth peptide fragment is 636.3282
  • the m / z value of the eighth peptide fragment is 814.4018
  • the m / z value of the ninth peptide fragment is 786.8775.
  • an extracted ion chromatogram of the peptide fragment is prepared based on the m / z value of the peak. can do.
  • LC-UV analysis is a method of connecting a liquid chromatograph (LC) to an ultraviolet detector (UV detector) for analysis.
  • LC-UV analysis alkaline phosphatase is detected as a component having an absorption at 214 nm.
  • the value of (X 1 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 0.6000 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 1 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.5000 or less, more preferably 0.3000 or less, and even more preferably 0.2000 or less.
  • the lower limit of (X 1 / Y) ⁇ 100 is the detection limit.
  • the value of (X 1 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 2 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 0.1800 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 2 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.1500 or less, more preferably 0.1200 or less, and even more preferably 0.1000 or less.
  • the lower limit of (X 2 / Y) ⁇ 100 is the detection limit.
  • the value of (X 2 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 3 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 0.2000 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 3 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.1800 or less, more preferably 0.1700 or less, and even more preferably 0.1500 or less.
  • the lower limit of (X 3 / Y) ⁇ 100 is the detection limit. However, from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the value of (X 3 / Y) ⁇ 100 (for example, separation and removal of the third peptide fragment by purification), the value of (X 3 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 4 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 0.8000 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 4 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.7000 or less, more preferably 0.6000 or less, and even more preferably 0.5000 or less.
  • the lower limit of (X 4 / Y) ⁇ 100 is the detection limit.
  • the value of (X 4 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 5 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 1.6000 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 5 / Y) ⁇ 100 is preferably at most 1.5,000, more preferably at most 1.2,000, and even more preferably at most 1.0000.
  • the lower limit of (X 5 / Y) ⁇ 100 is the detection limit.
  • the value of (X 5 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 6 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 0.3500 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 6 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.3200 or less, more preferably 0.3000 or less, and even more preferably 0.2800 or less.
  • the lower limit of (X 6 / Y) ⁇ 100 is the detection limit. However, from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the value of (X 6 / Y) ⁇ 100 (for example, separation and removal of the sixth peptide fragment by purification), the value of (X 6 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably 0.0800 or more, more preferably 0.1000 or more, and still more preferably 0.1500 or more.
  • the value of (X 7 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 1.0000 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 7 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.9000 or less, more preferably 0.8000 or less, and even more preferably 0.7000 or less.
  • the lower limit of (X 7 / Y) ⁇ 100 is the detection limit. However, from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the value of (X 7 / Y) ⁇ 100 (for example, separation and removal of the seventh peptide fragment by purification), the value of (X 7 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 8 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is 1.0000 or less, but the smaller the value, the better.
  • the value of (X 8 / Y) ⁇ 100 is preferably 0.9000 or less, more preferably 0.8000 or less, and even more preferably 0.7000 or less.
  • the lower limit of (X 8 / Y) ⁇ 100 is the detection limit.
  • the value of (X 8 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the value of (X 9 / Y) ⁇ 100 is not particularly limited as long as it is not more than 2.3000, but a smaller value is more preferable.
  • the value of (X 9 / Y) ⁇ 100 is preferably 2.000 or less, more preferably 1.5000 or less, and even more preferably 1.0000 or less.
  • the lower limit of (X 9 / Y) ⁇ 100 is the detection limit.
  • the value of (X 9 / Y) ⁇ 100 is obtained. Is preferably at least 0.0500, more preferably at least 0.0600, even more preferably at least 0.0700.
  • the peak area value of the first peptide fragment is preferably 1500 or less, more preferably 1200 or less, and even more preferably 1000 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the first peptide fragment is the detection limit value.
  • the peak area value of the first peptide fragment is preferably Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the second peptide fragment is preferably 400 or less, more preferably 380 or less, and even more preferably 350 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the second peptide fragment is the detection limit value.
  • the peak area value of the second peptide fragment is preferably Is 100 or more, more preferably 130 or more, and still more preferably 150 or more.
  • the peak area value of the third peptide fragment is preferably 500 or less, more preferably 450 or less, and even more preferably 400 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the third peptide fragment is the detection limit.
  • the peak area value of the third peptide fragment is preferably from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the peak area value of the third peptide fragment (for example, separation and removal of the third peptide fragment by purification). Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the fourth peptide fragment is preferably 2000 or less, more preferably 1800 or less, and even more preferably 1500 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the fourth peptide fragment is the detection limit.
  • the peak area value of the fourth peptide fragment is preferably from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the peak area value of the fourth peptide fragment (for example, separation and removal of the fourth peptide fragment by purification). Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the fifth peptide fragment is preferably 4500 or less, more preferably 3000 or less, and even more preferably 2500 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the fifth peptide fragment is the detection limit value.
  • the peak area value of the fifth peptide fragment is preferably from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the peak area value of the fifth peptide fragment (for example, separation and removal of the fifth peptide fragment by purification). Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the sixth peptide fragment is preferably 1000 or less, more preferably 900 or less, and even more preferably 800 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the sixth peptide fragment is the detection limit value.
  • the peak area value of the sixth peptide fragment is preferably from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the peak area value of the sixth peptide fragment (for example, separation and removal of the sixth peptide fragment by purification). Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the seventh peptide fragment is preferably 3000 or less, more preferably 2500 or less, and even more preferably 2000 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the seventh peptide fragment is the detection limit value.
  • the peak area value of the seventh peptide fragment is preferably Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the eighth peptide fragment is preferably 3000 or less, more preferably 2500 or less, and even more preferably 2000 or less.
  • the lower limit of the peak area value of the eighth peptide fragment is the detection limit value.
  • the peak area value of the eighth peptide fragment is preferably from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the peak area value of the eighth peptide fragment (for example, separation and removal of the eighth peptide fragment by purification). Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • the peak area value of the ninth peptide fragment is preferably 6,000 or less, more preferably 3,000 or less, and even more preferably 1,000 or less.
  • the lower limit of the peak area of the ninth peptide fragment is the detection limit.
  • the peak area value of the ninth peptide fragment is preferably from the viewpoint of obtaining an effect commensurate with the effort for reducing the peak area value of the ninth peptide fragment (for example, separation and removal of the ninth peptide fragment by purification). Is 100 or more, more preferably 150 or more, and still more preferably 200 or more.
  • alkaline phosphatase peak calculated by an automatic integration method from a chromatogram obtained by LC-UV analysis using an aqueous solution prepared from the composition of the present invention and having an alkaline phosphatase concentration of 10% by weight.
  • the area value is preferably 200,000 or more, more preferably 220000 or more, and still more preferably 240,000 or more.
  • the upper limit of the peak area of alkaline phosphatase is not particularly limited.
  • the peak area value of alkaline phosphatase is preferably 500,000 or less, more preferably 400,000 or less, and even more preferably 350,000 or less.
  • the composition of the present invention preferably has a specific activity of alkaline phosphatase of 2000 U / mg or more.
  • the specific activity of the alkaline phosphatase of the composition of the present invention is more preferably 2500 U / mg or more, and even more preferably 3000 U / mg or more.
  • the specific activity of the alkaline phosphatase of the composition of the present invention is measured as follows.
  • the specific activity of alkaline phosphatase can be calculated by measuring the absorbance at 405 nm derived from p-nitrophenol generated by adding alkaline phosphatase to the aqueous solution of p-nitrophenyl phosphate.
  • composition of the present invention may contain one or more other components.
  • the other components include an aqueous medium such as water, a metal salt such as a magnesium salt and a sodium salt, a surfactant, an organic acid, and glycerin.
  • composition of the present invention can be used for various uses requiring alkaline phosphatase activity, and can contain one or more other components selected according to the use.
  • the composition of the present invention contains a protein such as an antigen or an antibody.
  • the composition of the present invention can be used to label proteins such as antigens and antibodies with alkaline phosphatase. That is, in one embodiment, the composition of the present invention is a composition for labeling a protein with alkaline phosphatase. Labeling of a protein with alkaline phosphatase can be performed by reacting an alkaline phosphatase succinimide ester obtained by esterifying a carboxyl group of alkaline phosphatase with succinimide with an amino group of the protein.
  • the composition of the present invention contains a substrate for alkaline phosphatase.
  • the compositions of the present invention can be used to dephosphorylate a substrate for alkaline phosphatase. That is, in one embodiment, the composition of the present invention is a composition for dephosphorylating a substrate of alkaline phosphatase.
  • the substrate of alkaline phosphatase is not particularly limited as long as it is a compound having a phosphate monoester bond.
  • Substrates for alkaline phosphatase include, for example, nucleic acids, phospholipids, pyrophosphate and the like.
  • the phosphate monoester bond of the alkaline phosphatase substrate is hydrolyzed by alkaline phosphatase, resulting in dephosphorylation of the alkaline phosphatase substrate.
  • the compositions of the invention contain a nucleic acid.
  • the compositions of the present invention can be used to dephosphorylate nucleic acids. That is, in a preferred embodiment, the composition of the present invention is a composition for dephosphorylating nucleic acids.
  • the first to sixth peptide fragments mixed with alkaline phosphatase may have an adverse effect when dephosphorylating nucleic acids with alkaline phosphatase.
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of alkaline phosphatase satisfies the above formulas (1) to (6), respectively.
  • the relative content of the first to sixth peptide fragments is reduced. Therefore, by using the composition of the present invention, it is possible to reduce the adverse effects of the first to sixth peptide fragments that may occur when dephosphorylating nucleic acid with alkaline phosphatase, and to improve the dephosphorylation efficiency of nucleic acid. Can be improved.
  • the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the nucleic acid can be dephosphorylated.
  • the labeling efficiency when labeling the 5 'end and / or 3' end of the nucleic acid with a labeling substance can be improved. This effect is particularly remarkable when 32 P is used as a labeling substance.
  • self-ligation of the vector can be prevented by dephosphorylating the 5 'end and / or the 3' end of the vector used for DNA cloning, thereby reducing the background of the transformed cells. be able to.
  • Nucleic acid is, for example, a nucleic acid or nucleic acid derivative such as DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid).
  • nucleic acid derivative include modified nucleotides (for example, reconstitution of nucleotides and bases containing groups such as alkyl such as halogen and methyl, alkoxy such as methoxy and the like, thio and carboxymethyl, saturation of double bond, deamination, oxygenation Nucleic acid derivative) which is substituted with a sulfur molecule in the molecule.
  • the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • Examples of the DNA include chromosomal DNA, viral DNA, DNA such as bacteria and fungi, cDNA, and fragments thereof.
  • Examples of the RNA include mRNA, rRNA, small RNA, and fragments thereof.
  • the nucleic acid may be chemically synthesized DNA, RNA, or the like. Specific examples of the nucleic acid include genes such as pathogenic bacteria and viruses or a part thereof, and genes causing a genetic disease or a part thereof.
  • the nucleic acid can be prepared by, for example, extracting from a biological material, a virus, a bacterium, a mold, a food or the like by a conventional method.
  • the biomaterial include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, stool, cerebrospinal fluid, saliva, wiping fluid, and tissue fluid, cells, and tissues. Biomaterials may be of animal or plant origin.
  • the amount of the nucleic acid contained in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the intended use of the composition of the present invention (for example, detection of a target nucleic acid) and the like.
  • a nucleic acid amplification method such as PCR is performed using the nucleic acid contained in the composition of the present invention as a template.
  • the target nucleic acid can be amplified.
  • the detection sensitivity of the target nucleic acid can be improved.
  • the length (number of bases) of the nucleic acid can be appropriately adjusted according to the purpose of use of the composition of the present invention (for example, detection of a target nucleic acid).
  • the length of the nucleic acid is usually 10 to 300 bases, preferably 10 to 100 bases, and more preferably 15 to 50 bases.
  • the length of the nucleic acid can be appropriately adjusted by fragmentation.
  • the length of the nucleic acid is, for example, a length capable of hybridizing with the probe.
  • the nucleic acid is long (for example, 1500 bases or more, especially 4000 bases or more), it is preferable to adjust the length of the nucleic acid to an appropriate length by subjecting the nucleic acid to fragmentation.
  • a method for cutting nucleic acid for fragmentation for example, a method for cutting by irradiation with ultrasonic waves, a method for cutting with an enzyme, a method for cutting with a restriction enzyme, a method using a nebulizer, a method for cutting with an acid or alkali Method and the like.
  • the method of cutting with an ultrasonic wave it is possible to cut the nucleic acid into a desired length by controlling the output intensity and the irradiation time of the ultrasonic wave applied to the nucleic acid.
  • the composition of the present invention contains a dephosphorylated nucleic acid.
  • the description regarding nucleic acids is the same as above.
  • Dephosphorylated nucleic acids have a 5 'end and / or a 3' end dephosphorylated with alkaline phosphatase.
  • the composition of the present invention can be used to prepare a labeled nucleic acid comprising a dephosphorylated nucleic acid and a label bound to the dephosphorylated nucleic acid. That is, in a preferred embodiment, the composition of the present invention is a composition for preparing a labeled nucleic acid comprising a dephosphorylated nucleic acid and a labeling substance bound to the dephosphorylated nucleic acid.
  • the first to sixth peptide fragments mixed with alkaline phosphatase may have an adverse effect on dephosphorylation of nucleic acid by alkaline phosphatase and / or binding of a labeling substance to dephosphorylated nucleic acid. is there.
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of alkaline phosphatase satisfies the above formulas (1) to (6), respectively. That is, in the composition of the present invention, the relative content of the first to sixth peptide fragments is reduced.
  • the composition of the present invention when the nucleic acid is dephosphorylated with alkaline phosphatase and / or when the labeling substance is bound to the dephosphorylated nucleic acid, the first to sixth amino acids can be generated.
  • the adverse effect of the peptide fragment can be reduced, and the efficiency of dephosphorylation of the nucleic acid and / or the efficiency of labeling of the dephosphorylated nucleic acid can be improved.
  • the composition of the present invention contains a labeled nucleic acid comprising a dephosphorylated nucleic acid and a labeling substance bound to the dephosphorylated nucleic acid.
  • a labeled nucleic acid comprising a dephosphorylated nucleic acid and a labeling substance bound to the dephosphorylated nucleic acid.
  • the description regarding nucleic acids is the same as above.
  • Dephosphorylated nucleic acids have a 5 'end and / or a 3' end dephosphorylated with alkaline phosphatase.
  • the labeling substance binds to the 5 'end and / or 3' end of the dephosphorylated nucleic acid.
  • the labeling substance for example, a fluorescent dye, a fluorescent protein, a chemiluminescent substance, a metal complex, a metal fine particle, biotin, a radioisotope and the like can be used.
  • the reaction conditions for labeling the target nucleic acid can be appropriately adjusted according to the type of the labeling substance.
  • the labeling substance is a fluorescent dye
  • the fluorescent dye can be detected using a fluorescent microscope, a fluorescent scanner, or the like.
  • fluorescent dyes examples include fluorescein dyes, rhodamine dyes, Alexa Fluor (Invitrogen) dyes, BODIPY (Invitrogen) dyes, cascade dyes, coumarin dyes, eosin dyes, NBD dyes, Organic fluorescent dyes such as pyrene dyes, Texas Red dyes, and cyanine dyes are exemplified.
  • organic fluorescent dye examples include 5-carboxy-fluorescein, 6-carboxy-fluorescein, 5,6-dicarboxy-fluorescein, 6-carboxy-2 ', 4,4', 5 ', 7,7'- Hexachlorofluorescein, 6-carboxy-2 ', 4,7,7'-tetrachlorofluorescein, 6-carboxy-4', 5'-dichloro-2 ', 7'-dimethoxyfluorescein, naphthofluorescein, 5-carboxy-rhodamine , 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 5.
  • Alexa Fluor 350 Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 4
  • Alexa Fluor 514 Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor, 594, Alexa Fluor 6, 610, Alexa Fluor 6, Fluor 6 A6 Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576 / 589IPD 30/650, BODIPY 650/665 (all manufactured by Invitrogen), methoxy coumarin, eosin, NBD, pyrene, Cy5, Cy5.5, and the like Cy7.
  • the composition of the present invention contains a labeled nucleic acid comprising a dephosphorylated nucleic acid and a labeling substance bound to the dephosphorylated nucleic acid
  • the composition of the present invention is subjected to a nucleic acid detection method.
  • the labeled nucleic acid can contain a target nucleic acid to be detected and a nucleic acid other than the target nucleic acid.
  • a target nucleic acid contained in a nucleic acid sample can be detected using a labeling substance of the target nucleic acid as an index.
  • the nucleic acid detection method is not particularly limited, and can be appropriately selected from known nucleic acid detection methods.
  • the target nucleic acid can be detected using, for example, a hybridization method.
  • a target nucleic acid can be detected using a probe capable of hybridizing with the target nucleic acid.
  • the probe is contacted with a nucleic acid sample containing the target nucleic acid, the probe is hybridized with the target nucleic acid, the target nucleic acid hybridized with the probe, the target nucleic acid is The detected labeling substance can be detected as an index.
  • a nucleic acid other than the target nucleic acid is contained in the sample, it is preferable that the nucleic acid not hybridized with the probe is removed by washing or the like after the target nucleic acid is brought into contact with the probe.
  • reaction conditions for hybridization between the target nucleic acid and the probe can be appropriately adjusted according to the length of the target nucleic acid, the length of the probe, and the like.
  • the reaction time is generally 30-1200 minutes, preferably 60-360 minutes.
  • the reaction temperature is usually 25-60 ° C, preferably 30-40 ° C.
  • the reaction is usually performed in an aqueous medium such as water.
  • the amount of the target nucleic acid and the probe used is not particularly limited as long as the target nucleic acid and the probe can be hybridized and the labeling substance bound to the target nucleic acid can be detected. It can be appropriately adjusted according to the length, the type of labeling substance, and the like.
  • a nucleic acid such as DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), or LNA (Locked Nucleic Acid) or a nucleic acid derivative
  • a nucleic acid derivative include modified nucleotides (for example, reconstitution of nucleotides and bases containing groups such as alkyl such as halogen and methyl, alkoxy such as methoxy and the like, thio and carboxymethyl, saturation of double bond, deamination, oxygenation Nucleic acid derivative) which is substituted with a sulfur molecule in the molecule.
  • the probe has a base sequence complementary to at least a part of the base sequence of the target nucleic acid, and can hybridize to the target nucleic acid.
  • the probe may hybridize to the sense strand or may hybridize to the antisense strand.
  • the nucleotide sequence of the probe may be complementary to any portion of the nucleotide sequence of the target nucleic acid, but is preferably complementary to a highly specific portion of the nucleotide sequence of the target nucleic acid. That is, the base sequence of the probe is preferably complementary to the base sequence of the target nucleic acid that is not contained in other nucleic acids contained in the sample.
  • the length (base number) of the portion complementary to the base sequence of the target nucleic acid in the base sequence of the probe is not particularly limited, but is usually 10 to 150 bases, preferably 20 to 100 bases, and more preferably 20 to 70 bases. It is.
  • the probe may be composed of a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid, or may include a base sequence that is not complementary to the base sequence of the target nucleic acid.
  • the total length (total number of bases) of the probe is usually 10 to 300 bases, preferably 20 to 200 bases, and more preferably 15 to 100 bases.
  • the probe may be any of a commercially available product, a synthetic product, a preparation from a living body, and the like.
  • a nucleic acid called an oligonucleic acid having a length of up to 200 bases can be easily and artificially synthesized by a synthesizer.
  • the probe is immobilized on a support. That is, in a preferred embodiment, the nucleic acid detection method is a nucleic acid detection method using a nucleic acid microarray.
  • the nucleic acid microarray has a support and a plurality of probes immobilized on the surface of the support.
  • a labeled target nucleic acid is brought into contact with a nucleic acid microarray having a probe capable of hybridizing to the target nucleic acid, and the target nucleic acid hybridized to the probe is labeled with the target nucleic acid.
  • the substance can be detected as an index.
  • nucleic acid other than the target nucleic acid When a nucleic acid other than the target nucleic acid is contained in the sample, it is preferable that the target nucleic acid is brought into contact with the nucleic acid microarray, and then the nucleic acid not hybridized with the probe on the nucleic acid microarray is removed by washing or the like.
  • a nucleic acid microarray provided with a plurality of probes, two or more types of target nucleic acids can be simultaneously detected.
  • the support is not particularly limited as long as the probe can be immobilized.
  • the support include a slide glass, a membrane, and beads.
  • the material of the support include inorganic materials such as glass, ceramic, and silicon, and polymers such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, and silicone rubber.
  • Immobilization of the probe on the support can be performed according to a conventional method.
  • Known methods for immobilizing the probe on the support include a method of synthesizing an oligonucleic acid on the upper surface of the support, and a method of dropping and fixing an oligonucleic acid synthesized in advance to the upper surface of the support, and the like.
  • the former method includes, for example, the method of Ronald et al. (US Pat. No. 5,705,610), the method of Michel et al. (US Pat. No. 6,142,266), the method of Francesco et al. (US Pat. No. 7,037,659), and the like. Is mentioned.
  • the support is preferably made of a material that is resistant to the organic solvent.
  • a glass support having a concavo-convex structure manufactured using the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-503841 can be used.
  • the support is preferably made of a light-transmitting material in order to control DNA synthesis by irradiating light from the back surface of the support. Examples of the latter method include the method of Hirota et al. (Japanese Patent No. 3922454), a method using a glass capillary, and the like.
  • a commercially available product such as a self-made glass capillary or a micropipette (MP-005, manufactured by Micro Support Co., Ltd.) can be used.
  • a sandwich hybridization method can be used.
  • a first probe capture probe fixed to a support and a second probe (detection probe) not fixed to a support are used.
  • Each of the capture probe and the detection probe has a base sequence complementary to a different portion of the target nucleic acid, and can hybridize to a different portion of the target nucleic acid.
  • a complex is formed by hybridizing the target nucleic acid with the detection probe and the capture probe. By detecting the labeling substance contained in the complex, the target nucleic acid can be detected.
  • sequence identity between the nucleotide sequence of the detection probe and the nucleotide sequence of the capture probe is low. Sequence identity is preferably at most 20%, more preferably at most 10%.
  • identity of the two base sequences is determined by aligning the two sequences so that the bases match as much as possible (with a gap if necessary), and reducing the number of matched bases to the total number of bases (bases of the two base sequences). This is a numerical value obtained by dividing by a larger number of bases when the numbers are different, and can be easily calculated by commercially available software such as FASTA or BLAST (also provided on the Internet).
  • the signal detected in the method for detecting a target nucleic acid is compared with ambient noise.
  • a signal value obtained from a position on the support where the probe is fixed is compared with a signal value (noise value) obtained from a position on the support where the probe is not fixed.
  • the ratio between the numerical value of the above and the noise value be the S / N ratio.
  • the detection accuracy can be represented by the S / N ratio. That is, the higher the S / N ratio, the higher the detection accuracy, and the lower the S / N ratio, the lower the detection accuracy.
  • the nucleic acid detection method uses the composition of the present invention as a nucleic acid sample.
  • the detection sensitivity of the target nucleic acid can be improved. This effect is remarkable in a nucleic acid detection method using a small amount (preferably 5 to 1000 ⁇ L, more preferably 5 to 500 ⁇ L) of a nucleic acid sample.
  • the first to sixth peptide fragments contained in the nucleic acid sample may adversely affect the detection sensitivity.
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of alkaline phosphatase satisfies the above formulas (1) to (6), respectively. That is, in the composition of the present invention, the relative content of the first to sixth peptide fragments is reduced. Therefore, in a nucleic acid detection method using a small amount of a nucleic acid sample, the adverse effects of the first to sixth peptide fragments can be reduced by using the composition of the present invention as a nucleic acid sample, and the target nucleic acid can be detected. Sensitivity can be significantly improved.
  • the nucleic acid detection method is a nucleic acid detection method using a nucleic acid microarray.
  • a nucleic acid detection method using a nucleic acid microarray a small amount (preferably 5 to 1000 ⁇ L, more preferably 5 to 500 ⁇ L) of a nucleic acid sample is used. Therefore, in the nucleic acid detection method using a nucleic acid microarray, by using the composition of the present invention as a nucleic acid sample, the adverse effects of the first to sixth peptide fragments can be reduced, and the detection sensitivity of the target nucleic acid is significantly improved. Can be improved.
  • compositions of the present invention include alkaline phosphatase extract from bovine and shrimp organs, alkaline phosphatase extract from a microorganism into which a gene encoding alkaline phosphatase has been introduced, and cells of a microorganism into which a gene encoding alkaline phosphatase has been introduced. It can be produced by separating the first to sixth peptide fragments from crushed products, commercially available alkaline phosphatase products, and the like. Examples of the method for separating the first to sixth peptide fragments include dialysis, salting out, gel filtration, ultrafiltration, membrane separation, ion exchange, column chromatography, and electrophoresis.
  • first to sixth peptide fragment separation methods one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the content of the first to sixth peptide fragments with respect to the content of alkaline phosphatase can be adjusted to a desired range.
  • Column chromatography is, for example, liquid chromatography.
  • the column and the mobile phase used in the liquid chromatography are not particularly limited as long as the first to sixth peptide fragments can be separated, but it is preferable to use a reversed-phase column carrying C18.
  • the seventh to ninth peptide fragments can also be separated in the same manner as the first to sixth peptide fragments.
  • compositions of the present invention can be used in various methods where alkaline phosphatase activity is required.
  • the composition of the present invention comprises the following steps: Providing a composition of the present invention; A step of preparing a nucleic acid; and a step of treating the nucleic acid with the composition and dephosphorylating the nucleic acid.
  • the first to sixth peptide fragments mixed with alkaline phosphatase may have an adverse effect on dephosphorylation of nucleic acids by alkaline phosphatase.
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of alkaline phosphatase satisfies the above formulas (1) to (6), respectively. That is, in the composition of the present invention, the relative content of the first to sixth peptide fragments is reduced. Therefore, by treating the nucleic acid with the composition of the present invention, the efficiency of dephosphorylation of the nucleic acid can be improved.
  • the composition of the present invention comprises the following steps: Providing a composition of the present invention; Providing a nucleic acid; Preparing a labeling substance; It is used in a method for producing a labeled nucleic acid, comprising a step of treating the nucleic acid with the composition and dephosphorylating the nucleic acid; and a step of binding the labeling substance to the dephosphorylated nucleic acid.
  • the first to sixth peptide fragments mixed with alkaline phosphatase may have an adverse effect on dephosphorylation of nucleic acid by alkaline phosphatase and / or binding of a labeling substance to dephosphorylated nucleic acid. is there.
  • the ratio of the content of the first to sixth peptide fragments to the content of alkaline phosphatase satisfies the above formulas (1) to (6), respectively. That is, in the composition of the present invention, the relative content of the first to sixth peptide fragments is reduced. Therefore, by treating the nucleic acid with the composition of the present invention, the efficiency of dephosphorylation of the nucleic acid and / or the efficiency of labeling of the dephosphorylated nucleic acid can be improved.
  • reaction conditions can be appropriately adjusted.
  • the reaction time is generally 10 to 60 minutes, preferably 20 to 50 minutes.
  • the reaction temperature is usually from 20 to 60 ° C, preferably from 25 to 45 ° C.
  • the reaction is usually performed in an aqueous medium such as water.
  • the nucleic acid is, for example, DNA, RNA, or the like.
  • the labeling substance for example, a fluorescent dye, a fluorescent protein, a chemiluminescent substance, a metal complex, a metal fine particle, biotin, a radioisotope and the like can be used. Reaction conditions can be appropriately adjusted depending on the type of the labeling substance.
  • the dephosphorylated nucleic acid has a 5 ′ end and / or 3 ′ end dephosphorylated with alkaline phosphatase, and a labeling substance may be bound to the dephosphorylated 5 ′ end and / or 3 ′ end. it can.
  • the nucleic acid detection methods used in Examples and Comparative Examples are as follows.
  • the nucleic acid detection method was performed using a DNA chip (DNA microarray). Specifically, "3D-Gene” human miRNA oligo chip manufactured by Toray Industries, Inc. (corresponding to miRBase release 21) was used.
  • composition C1 alkaline phosphatase products purchased from five companies (hereinafter referred to as “composition C1” to “composition C8”) were used as the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8.
  • the alkaline phosphatase contained in each of the compositions C1 to C8 is alkaline phosphatase derived from bovine intestine.
  • the composition C1 was 2238 U / mg
  • the composition C2 was 2492 U / mg
  • the composition C3 was 2431 U / mg
  • the composition C4 was 2519 U / mg
  • the composition was 2519 U / mg.
  • the product C5 was 2411 U / mg
  • the composition C6 was 2552 U / mg
  • the composition C7 was 2448 U / mg
  • the composition C8 was 2490 U / mg.
  • the specific activity of alkaline phosphatase was measured by a method using p-nitrophenyl phosphate. Specifically, it is as follows.
  • Solution A 1 M diethanolamine buffer (pH 9.8)
  • 0.1 mL of an alkaline phosphatase aqueous solution was added, and the change in absorbance at 405 nm (37 ° C.) was measured for 3 to 5 minutes using a spectrophotometer, and the change in absorbance per unit time was determined ( ⁇ OD).
  • the absorbance change was determined for a sample to which water was added instead of the alkaline phosphatase aqueous solution ( ⁇ OD blank).
  • the alkaline phosphatase activity (U / mL) was calculated by the following equation.
  • Alkaline phosphatase activity (U / mL) ( ⁇ OD ⁇ OD blank) ⁇ 3.1 / (18.2 ⁇ 0.1 ⁇ 1.0)
  • the concentration of alkaline phosphatase in the aqueous alkaline phosphatase solution was calculated by measuring the absorbance at 214 nm.
  • the specific activity in the present invention is the activity (U / mg) per 1 mg of alkaline phosphatase, and was calculated by the above-mentioned measurement method.
  • a 10% by weight aqueous solution of alkaline phosphatase was prepared from each of the compositions C1 to C8, and LC-UV analysis and LC-MS / MS analysis were performed using this aqueous solution.
  • alkaline phosphatase 9 was calculated by the automatic integration method.
  • the peak area value of alkaline phosphatase was calculated by an automatic integration method based on the chromatogram obtained by LC-UV analysis. In the LC-UV analysis, alkaline phosphatase was detected as a component having an absorption at 214 nm.
  • FIG. 1 shows an extracted ion chromatogram of the first peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 2 shows an extracted ion chromatogram of the second peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 3 shows an extracted ion chromatogram of the third peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 4 shows an extracted ion chromatogram of the fourth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 5 shows an extracted ion chromatogram of the fifth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of the composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 6 shows an extracted ion chromatogram of the sixth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 7 shows an extracted ion chromatogram of the seventh peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 8 shows an extracted ion chromatogram of the eighth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of the composition C2 in Comparative Example 2.
  • FIG. 9 shows an extracted ion chromatogram of the ninth peptide fragment obtained by LC-MS / MS analysis of the composition C2 in Comparative Example 2.
  • Nucleic acids were dephosphorylated using the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8, and the resulting dephosphorylated nucleic acids were labeled with a cyanine-based organic fluorescent dye. Specifically, a dephosphorylation reaction and a labeling reaction were performed as follows.
  • RNA RNA extraction reagent from liquid sample kit (manufactured by Toray Industries, Inc.). The obtained extracted microRNA was used as a mother liquor, and labeled using "3D-Gene” ⁇ miRNA ⁇ labeling ⁇ kit (manufactured by Toray Industries, Inc.). 5 ⁇ L of the extracted microRNA thus obtained was added to a mixture of 0.4 ⁇ L of AP buffer and 1.0 ⁇ L of Spike Control of the above kit, and a solution to which 0.4 ⁇ L of composition C1 was further added was prepared. Next, after incubating at 37 ° C.
  • Nucleic acid was detected using the obtained labeled nucleic acid.
  • Hybridization was performed on the labeled sample RNA using a DNA chip (“3D-Gene” @ miRNA @ chip, manufactured by Toray Industries, Inc.) according to the standard protocol.
  • the DNA chip after hybridization was subjected to a microarray scanner (manufactured by Toray Industries, Inc.) to measure the fluorescence intensity.
  • the scanner settings were 100% laser output, and the photomultiplier voltage setting was AUTO.
  • Nucleic acid was detected using a DNA chip (DNA microarray) as described above. The number of effective spots on the DNA chip was determined, and the detection rate (%) was calculated.
  • compositions C2 to C4 and C8 of Comparative Examples 2 to 4 and 8 were purified by the following method, and the alkaline phosphatase compositions of Examples 1 to 4 (hereinafter referred to as “composition E1” to “composition”). Thing E4 ").
  • the purification method is as follows.
  • composition C2 (30 ⁇ L) was dialyzed three times against a dialysis buffer (1 mL, 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM ZnCl 2 ) using a dialysis cup (cutoff molecular weight 3.5K), The concentrate was collected.
  • the alkaline phosphatase fraction was recovered from the recovered solution after the gel filtration using a hydrophobic column under the following conditions.
  • Mobile phase flow rate 1.0 mL / min
  • Mobile phase A 20 mM disodium hydrogen phosphate, 3 M ammonium sulfate (50/50)
  • Mobile phase B 20 mM disodium hydrogen phosphate gradient program:
  • composition E2, composition E3, and composition E4 were similarly obtained from composition C3, composition C4, and composition C8, respectively, using methods similar to those described above.
  • composition E1 was 2490 U / mg
  • composition E2 was 2420 U / mg
  • composition E3 was 2522 U / mg
  • composition E4 was 2470 U / mg. mg.
  • the specific activity of alkaline phosphatase was measured in the same manner as described above.
  • a first peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 a second peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, based on the extracted ion chromatogram obtained by the LC-MS / MS analysis, A third peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a fourth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a fifth peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
  • alkaline phosphatase 9 was calculated by the automatic integration method.
  • the peak area value of alkaline phosphatase was calculated by an automatic integration method based on the chromatogram obtained by LC-UV analysis. In the LC-UV analysis, alkaline phosphatase was detected as a component having an absorption at 214 nm.
  • FIG. 10 shows an extracted ion chromatogram of the first peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 11 shows an extracted ion chromatogram of the second peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 12 shows an extracted ion chromatogram of the third peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 13 shows an extracted ion chromatogram of the fourth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 14 shows an extracted ion chromatogram of the fifth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 15 shows an extracted ion chromatogram of the sixth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 16 shows an extracted ion chromatogram of the seventh peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 17 shows an extracted ion chromatogram of the eighth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 18 shows an extracted ion chromatogram of the ninth peptide fragment obtained in Example 1 by LC-MS / MS analysis of the composition E1 (a purified product of the composition C2).
  • FIG. 19 shows a chromatogram of alkaline phosphatase obtained in Example 1 by LC-UV analysis of composition E1 (purified product of composition C2).
  • the chromatograms of alkaline phosphatase obtained in Examples 2 to 4 and Comparative Examples 1 to 8 by LC-UV analysis of each composition were the same as those in FIG.
  • Nucleic acids were dephosphorylated using the alkaline phosphatase compositions of Examples 1 to 4, and the resulting dephosphorylated nucleic acids were labeled with a cyanine-based organic fluorescent dye.
  • the dephosphorylation reaction and the labeling reaction were performed in the same manner as described above.
  • Nucleic acid was detected using the obtained labeled nucleic acid.
  • Nucleic acid was detected using a DNA chip (DNA microarray) as described above. The number of effective spots on the DNA chip was determined, and the detection rate (%) was calculated. The results are shown in Table 4-1 and Table 5-1.
  • Table 4-1 As shown in Table 4-1, Table 4-2, Table 5-1 and Table 5-2, it is an index of the ratio of the content of the first peptide fragment to the content of alkaline phosphatase (X 1 / Y).
  • the value of ⁇ 100 exceeds 0.6000 in the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8 (the minimum value is 0.6646 in the alkaline phosphatase composition of Comparative Example 5), whereas the value of ⁇ 100 in Examples 1 to 4 is In the alkaline phosphatase composition, it is 0.6000 or less. This is considered to be one of the main factors that caused the difference in the above effects between Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 8.
  • Table 4-1 As shown in Table 4-1, Table 4-2, Table 5-1 and Table 5-2, it is an index of the ratio of the content of the second peptide fragment to the content of alkaline phosphatase (X 2 / Y).
  • the value of ⁇ 100 exceeds 0.1800 for the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8 (the minimum value is 0.1810 for the alkaline phosphatase composition of Comparative Example 4), whereas the value of ⁇ 100 for Examples 1 to 4 is In the alkaline phosphatase composition, it is 0.1800 or less. This is considered to be one of the main factors that caused the difference in the above effects between Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 8.
  • Table 4-1 As shown in Table 4-1, Table 4-2, Table 5-1 and Table 5-2, it is an index of the ratio of the content of the third peptide fragment to the content of alkaline phosphatase (X 3 / Y).
  • the value of ⁇ 100 exceeds 0.2000 for the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8 (the minimum value is 0.2073 for the alkaline phosphatase composition of Comparative Example 6), whereas the value of ⁇ 100 for Examples 1 to 4 is In the alkaline phosphatase composition, it is 0.2000 or less. This is considered to be one of the main factors that caused the difference in the above effects between Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 8.
  • Table 4-1 As shown in Table 4-1, Table 4-2, Table 5-1 and Table 5-2, it is an index of the ratio of the content of the fourth peptide fragment to the content of alkaline phosphatase (X 4 / Y).
  • the value of ⁇ 100 exceeds 0.8000 in the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8 (the minimum value is 0.8497 in the alkaline phosphatase composition of Comparative Example 1), while the values of Examples 1 to 4 In the alkaline phosphatase composition, it is 0.8000 or less. This is considered to be one of the main factors that caused the difference in the above effects between Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 8.
  • Table 4-1 As shown in Table 4-1, Table 4-2, Table 5-1 and Table 5-2, it is an index of the ratio of the content of the fifth peptide fragment to the content of alkaline phosphatase (X 5 / Y).
  • the value of ⁇ 100 exceeds 1.6000 for the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1 to 8 (the minimum value is 1.6913 for the alkaline phosphatase composition of Comparative Example 1), while the values of Examples 1 to 4 are different. In the alkaline phosphatase composition, it is 1.6000 or less. This is considered to be one of the main factors that caused the difference in the above effects between Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 8.
  • Table 4-1 As shown in Table 4-1, Table 4-2, Table 5-1 and Table 5-2, it is an index of the ratio of the content of the seventh peptide fragment to the content of alkaline phosphatase (X 7 / Y).
  • the value of ⁇ 100 exceeds 1.0000 in the alkaline phosphatase compositions of Comparative Examples 1, 2 and 4 to 8 (however, not more than 1.0000 in Comparative Example 3), whereas the value of ⁇ 100 in Examples 1 to 4 In the phosphatase composition, it is not more than 1.0000. This is considered to be one of the causes of the difference in the effects between Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1, 2 and 4 to 8.

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Abstract

本発明は、アルカリホスファターゼを含有する高品質の組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法を提供することを目的とし、かかる目的を達成するために、本発明は、アルカリホスファターゼと、第１～第６のペプチド断片とを含有する組成物であって、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、下記式（１）～（６）：　（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００　・・・（１）　（Ｘ２／Ｙ）×１００≦０．１８００　・・・（２）　（Ｘ３／Ｙ）×１００≦０．２０００　・・・（３）　（Ｘ４／Ｙ）×１００≦０．８０００　・・・（４）　（Ｘ５／Ｙ）×１００≦１．６０００　・・・（５）　（Ｘ６／Ｙ）×１００≦０．３５００　・・・（６） ［式中、Ｘ１～Ｘ６は、それぞれ、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１～第６のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］ を満たす、前記組成物を提供する。

Description

アルカリホスファターゼ組成物並びに脱リン酸化核酸及び標識化核酸の製造方法
　本発明は、アルカリホスファターゼを含有する組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法に関する。
　アルカリホスファターゼは、リン酸モノエステルを加水分解する触媒機能を有し、タンパク質、核酸等の生体物質の量を測定する方法（例えば、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、核酸マイクロアレイ法等）において広く使用されている。例えば、遺伝子工学の研究分野においては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の標識化の前処理、ベクターの自己連結防止等を目的として、アルカリホスファターゼを使用した核酸の５’末端及び／又は３’末端の脱リン酸化が行われている。
　アルカリホスファターゼの工業的製法としては、その比活性が高いことから主としてウシの小腸又は大腸を原料とした製造方法が広く採用されている。アルカリホスファターゼの比活性の評価は、一般にｐ－ニトロフェニルリン酸が分解された際に生成するｐ－ニトロフェノール由来の４０５ｎｍの吸光度を測定することで行われる。
　アルカリホスファターゼの品質は、アルカリホスファターゼ比活性に基づいて評価されている。そして、ウシ腸由来のアルカリホスファターゼよりも比活性が高いアルカリホスファターゼを得るために、高比活性のアルカリホスファターゼを精製過程で単離したり、遺伝子工学的手法を用いて組換え大腸菌により高比活性のアルカリホスファターゼを生産したりしている。
　特許文献１には、バチルス・バディウス属由来の遺伝子を導入した組換え大腸菌を使用して高比活性を有するアルカリホスファターゼを製造する方法が開示されている。また、特許文献２には、シェワネラ属由来の遺伝子を導入した組換え大腸菌を使用して高比活性及び耐熱性を有するアルカリホスファターゼを製造する方法が開示されている。
特開平１０－２６２６７４号 国際公開第２０１２／１１５０２３号
　アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬（例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品）は、アルカリホスファターゼとともに、その他の成分を含有する組成物である。アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬の品質は、アルカリホスファターゼ比活性に基づいて評価される。
　しかしながら、ほぼ同じアルカリホスファターゼ比活性を有する脱リン酸化試薬であっても、当該脱リン酸化試薬を使用して調製された標識化核酸（当該脱リン酸化試薬により核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化し、脱リン酸化された核酸の５’末端及び／又は３’末端に標識物質を結合させることにより得られた標識化核酸）の、核酸検出法における検出感度に大きな差が生じることが判明した。すなわち、アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬の品質は、アルカリホスファターゼ比活性を指標として正確に評価できないことが判明した。
　そこで、本発明は、アルカリホスファターゼを含有する高品質の組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬（例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品）には、以下の不純物が混在し得ることを見出した。
・配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片
・配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２のペプチド断片
・配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３のペプチド断片
・配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第４のペプチド断片
・配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第５のペプチド断片
・配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第６のペプチド断片
・配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第７のペプチド断片
・配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第８のペプチド断片
・配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第９のペプチド断片
　そして、本発明者らは、第１～第６のペプチド断片の含有量（好ましくは、第１～第６のペプチド断片の含有量、並びに、第７～第９のペプチド断片からなる群から選択された１種、２種又は３種のペプチド断片の含有量）を低減させることにより、脱リン酸化試薬を使用して調製された標識化核酸（当該脱リン酸化試薬により核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化し、脱リン酸化された核酸の５’末端及び／又は３’末端に標識物質を結合させることにより得られた標識化核酸）の、核酸検出法における検出感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］アルカリホスファターゼと、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２のペプチド断片と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３のペプチド断片と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第４のペプチド断片と、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第５のペプチド断片と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第６のペプチド断片とを含有する組成物であって、
　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、下記式（１）～（６）：
　（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００　　　・・・（１）
　（Ｘ２／Ｙ）×１００≦０．１８００　　　・・・（２）
　（Ｘ３／Ｙ）×１００≦０．２０００　　　・・・（３）
　（Ｘ４／Ｙ）×１００≦０．８０００　　　・・・（４）
　（Ｘ５／Ｙ）×１００≦１．６０００　　　・・・（５）
　（Ｘ６／Ｙ）×１００≦０．３５００　　　・・・（６）
［式中、Ｘ１～Ｘ６は、それぞれ、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１～第６のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
［２］前記組成物が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第７のペプチド断片をさらに含有し、
　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第７のペプチド断片の含有量が、下記式（７）：
　（Ｘ７／Ｙ）×１００≦１．００００　　　・・・（７）
［式中、Ｘ７は、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第７のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
を満たす、［１］に記載の組成物。
［３］前記組成物が、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第８のペプチド断片をさらに含有し、
　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第８のペプチド断片の含有量が、下記式（８）：
　（Ｘ８／Ｙ）×１００≦１．００００　　　・・・（８）
［式中、Ｘ８は、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第８のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
を満たす、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］前記組成物が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第９のペプチド断片をさらに含有し、
　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第９のペプチド断片の含有量が、下記式（９）：
　（Ｘ９／Ｙ）×１００≦２．３０００　　　・・・（９）
［式中、Ｘ９は、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記９のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
を満たす、［１］～［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］前記組成物が、２０００Ｕ／ｍｇ以上のアルカリホスファターゼ比活性を有する、［１］～［４］のいずれか一つに記載の組成物。
［６］前記アルカリホスファターゼが、下記（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ；及び
（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の７８～９０位、１７７～１８７位、４６９～４７７位、５１６～５２８位及び５３４～５５１位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、［１］～［５］のいずれか一つに記載の組成物。
［７］前記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９１～１０９位、９３～１０５位及び５２９～５３１位から選択された１種又は２種以上をさらに含む、［６］に記載の組成物。
［８］前記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９１～１０９位及び５２９～５３１位をさらに含む、［６］に記載の組成物。
［９］前記組成物が、核酸をさらに含有する、［１］～［８］のいずれか一つに記載の組成物。
［１０］前記組成物が、前記核酸を脱リン酸化するための組成物である、［９］に記載の組成物。
［１１］前記組成物が、脱リン酸化核酸をさらに含有する、［１］～［８］のいずれか一つに記載の組成物。
［１２］前記組成物が、前記脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するための組成物である、［１１］に記載の組成物。
［１３］前記組成物が、脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸をさらに含有する、［１］～［８］のいずれか一つに記載の組成物。
［１４］前記組成物が、核酸検出法に供される核酸サンプルである、［１３］に記載の組成物。
［１５］前記核酸検出法が、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である、［１４］に記載の組成物。
［１６］以下の工程：
　［１］～［８］のいずれか一つに記載の組成物を準備する工程；
　核酸を準備する工程；及び
　前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法。
［１７］以下の工程：
　［１］～［８］のいずれか一つに記載の組成物を準備する工程；
　核酸を準備する工程；
　標識物質を準備する工程；
　前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程；及び
　前記脱リン酸化核酸に前記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法。
　本発明により、アルカリホスファターゼを含有する高品質の組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法が提供される。
図１は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図２は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第２のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図３は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第３のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図４は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第４のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図５は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第５のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図６は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第６のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図７は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第７のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図８は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第８のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図９は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第９のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１０は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１１は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第２のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１２は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第３のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１３は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第４のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１４は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第５のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１５は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第６のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１６は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第７のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１７は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第８のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１８は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第９のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。 図１９は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＵＶ分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムを示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下で説明する実施形態のうち２以上の実施形態を組み合わせることが可能であり、そのような組み合わせも本発明に包含される。なお、本明細書において使用される「数値Ｍ～数値Ｎ」という表現は、数値Ｍ以上数値Ｎ以下の範囲を意味する。
［アルカリホスファターゼ］
　本発明の組成物は、アルカリホスファターゼを含有する。本発明の組成物は、１種のアルカリホスファターゼを含有してもよいし、２種以上のアルカリホスファターゼを含有してもよい。
　本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼ活性を有する限り特に限定されない。アルカリホスファターゼ活性は、アルカリ性（ｐＨ８～１１、例えば、ｐＨ８～１０又はｐＨ９～１１）において、リン酸モノエステル結合を加水分解する活性であり、その反応形式は、ＥＣ３．１．３．１に分類される。
　本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼの構造（例えば、一次構造、二次構造、三次構造、四次構造等）は特に限定されない。例えば、アルカリホスファターゼは、糖鎖を有してもよいし、糖鎖を有しなくてもよい。また、アルカリホスファターゼは、タンパク質分子の構造（例えば、タンパク質分子のアミノ酸配列）、糖鎖修飾等の相違に基づいて存在し得るいずれのアイソザイムであってもよい。また、アルカリホスファターゼは、１個のサブユニットから形成されるモノマー（単量体）であってもよいし、２個以上のサブユニットから形成されるオリゴマー（例えば、２量体、４量体等）であってもよい。オリゴマーは、ホモオリゴマーであってもよいし、ヘテロオリゴマーであってもよい。
　本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼが由来する動物は特に限定されない。アルカリホスファターゼが由来する動物としては、例えば、ウシ、エビ、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物等が挙げられる。ウシ由来のアルカリホスファターゼはアルカリホスファターゼ活性が高いことから、アルカリホスファターゼが由来する動物はウシが好ましい。アルカリホスファターゼがウシに由来する場合、アルカリホスファターゼが由来する臓器は小腸又は大腸であることが好ましい。
　本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。変異型アルカリホスファターゼは、例えば、野生型アルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有する。変異型アルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列は、野生型アルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
　好ましい実施形態において、アルカリホスファターゼは、下記（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ；及び
（ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の７８～９０位（第４のペプチド断片に相当）、１７７～１８７位（第１のペプチド断片に相当）、４６９～４７７位（第２のペプチド断片に相当）、５１６～５２８位（第５のペプチド断片に相当）及び５３４～５５１位（第３のペプチド断片に相当）を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼから選択される。この実施形態において、本発明の組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）から選択される１種のアルカリホスファターゼを含有してもよいし、上記（ａ）及び（ｂ）から選択された２種以上のアルカリホスファターゼを含有してもよい。上記（ｂ）のアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の５３４～５４５位（第６のペプチド断片に相当）を含む。
　上記（ａ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列（すなわち、配列番号１０に記載のアミノ酸配列）は、ウシ由来のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列に相当する。したがって、上記（ａ）のアルカリホスファターゼには、ウシ由来のアルカリホスファターゼが包含される。
　上記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
　上記（ｂ）のアルカリホスファターゼには、野生型アルカリホスファターゼ（例えば、ウシ以外の動物に由来するアルカリホスファターゼ、多型を有するウシ由来のアルカリホスファターゼ等）及び変異型アルカリホスファターゼのいずれも含まれる。配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加される位置は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の７８～９０位、１７７～１８７位、４６９～４７７位、５１６～５２８位及び５３４～５５１位以外の位置である。
　上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼは、その分解により、第１～第６のペプチド断片等を生じ得る。
　好ましい実施形態において、上記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９１～１０９位、９３～１０５位及び５２９～５３１位から選択された１種又は２種以上を含む。この実施形態において、上記（ｂ）のアルカリホスファターゼは、その分解により、第７～第９のペプチド断片の１種又は２種以上を生じ得る。この実施形態において、上記（ｂ）のアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位（第７のペプチド断片に相当）、９３～１０５位（第９のペプチド断片に相当）及び５１６～５３１位（第８のペプチド断片に相当）から選択された１種又は２種以上を含む。
　好ましい実施形態において、上記（ｂ）のアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９１～１０９位及び５２９～５３１位を含む。この実施形態において、上記（ｂ）のアルカリホスファターゼは、その分解により、第７～第９のペプチド断片を生じ得る。この実施形態において、上記（ｂ）のアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位（第７のペプチド断片に相当）、９３～１０５位（第９のペプチド断片に相当）及び５１６～５３１位（第８のペプチド断片に相当）を含む。
［ペプチド断片］
　本発明の組成物は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２のペプチド断片と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３のペプチド断片と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第４のペプチド断片と、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第５のペプチド断片と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第６のペプチド断片とを含有する。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列（DRQVPDSAGTA）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１７７～１８７位に相当する。配列番号２に記載のアミノ酸配列（APGKALDSK）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の４６９～４７７位に相当する。配列番号３に記載のアミノ酸配列（GPQAHLVHGVQEETFVAH）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の５３４～５５１位に相当する。配列番号４に記載のアミノ酸配列（EGVSLEKREAEAE）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の７８～９０位に相当する。配列番号５に記載のアミノ酸配列（VPLASETHGGEDV）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の５１６～５２８位に相当する。配列番号６に記載のアミノ酸配列（GPQAHLVHGVQE）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の５３４～５４５位に相当する。
　第１～第６のペプチド断片のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１７７～１８７位、４６９～４７７位、５３４～５５１位、７８～９０位、５１６～５２８位及び５３４～５４５位に相当する。すなわち、第１～第６のペプチド断片は、それぞれ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１７７～１８７位、４６９～４７７位、５３４～５５１位、７８～９０位、５１６～５２８位及び５３４～５４５位の分解により生じ得る。このことは、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１７７～１８７位、４６９～４７７位、５３４～５５１位、７８～９０位、５１６～５２８位及び５３４～５４５位を含む必要があることを意味しない。本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１７７～１８７位、４６９～４７７位、５３４～５５１位、７８～９０位、５１６～５２８位及び５３４～５４５位の１種又は２種以上を含まなくてもよい。但し、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１７７～１８７位、４６９～４７７位、５３４～５５１位、７８～９０位、５１６～５２８位及び５３４～５４５位を含むことが好ましい。
　第１～第６のペプチド断片は、本発明の組成物に含有されていないアルカリホスファターゼの分解により生じたものであってもよいが、通常は、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼの分解により生じたものである。したがって、好ましい実施形態において、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、第１～第６のペプチド断片を生じ得るアルカリホスファターゼである。好ましい実施形態において、第１～第６のペプチド断片を生じ得るアルカリホスファターゼは、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択される。この実施形態において、本発明の組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択された１種又は２種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
　好ましい実施形態において、本発明の組成物は、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第７のペプチド断片、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第８のペプチド断片、及び、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第９のペプチド断片からなる群から選択される１種又は２種以上のペプチド断片をさらに含有する。
　好ましい実施形態において、本発明の組成物は、第７～第９のペプチド断片の全てを含有する。
　配列番号７に記載のアミノ酸配列（EAEAEFLIPAEEENPAFWNRQAAQ）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位に相当する。配列番号８に記載のアミノ酸配列（VPLASETHGGEDVAVF）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の５１６～５３１位に相当する。配列番号９に記載のアミノ酸配列（IPAEEENPAFWNR）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９３～１０５位に相当する。
　第７～第９のペプチド断片は、それぞれ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位、５１６～５３１位及び９３～１０５位に相当する。すなわち、第１～第６のペプチド断片は、それぞれ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位、５１６～５３１位及び９３～１０５位の分解により生じ得る。このことは、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位、５１６～５３１位及び９３～１０５位を含む必要があることを意味しない。本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位、５１６～５３１位及び９３～１０５位の１種又は２種以上を含まなくてもよい。但し、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の８６～１０９位、５１６～５３１位及び９３～１０５位を含むことが好ましい。
　第７～第９のペプチド断片は、本発明の組成物に含有されていないアルカリホスファターゼの分解により生じたものであってもよいが、通常は、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼの分解により生じたものである。したがって、好ましい実施形態において、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、第７～第９のペプチド断片を生じ得るアルカリホスファターゼである。好ましい実施形態において、第７～第９のペプチド断片を生じ得るアルカリホスファターゼは、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択される。この実施形態において、本発明の組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択された１種又は２種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
　本発明の組成物は、第１～第９のペプチド断片以外のペプチド断片を含有してもよい。第１～第９のペプチド断片以外のペプチド断片は、例えば、本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼの分解により生じたものである。
［含有量の比率］
　本発明の組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量の比率は、それぞれ、下記式（１）～（６）：
　（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００　　　・・・（１）
　（Ｘ２／Ｙ）×１００≦０．１８００　　　・・・（２）
　（Ｘ３／Ｙ）×１００≦０．２０００　　　・・・（３）
　（Ｘ４／Ｙ）×１００≦０．８０００　　　・・・（４）
　（Ｘ５／Ｙ）×１００≦１．６０００　　　・・・（５）
　（Ｘ６／Ｙ）×１００≦０．３５００　　　・・・（６）
を満たす。
　上記式（１）～（６）において、Ｘ１～Ｘ６は、それぞれ、本発明の組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第１～第６のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、本発明の組成物のＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。
　本発明の組成物が第７のペプチド断片をさらに含有する実施形態では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第７のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（７）：
　（Ｘ７／Ｙ）×１００≦１．００００　　　・・・（７）
を満たすことが好ましい。
　上記式（７）において、Ｘ７は、本発明の組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第７～９のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、上記と同義である。
　本発明の組成物が第８のペプチド断片をさらに含有する実施形態では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第８のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（８）：
　（Ｘ８／Ｙ）×１００≦１．００００　　　・・・（８）
を満たすことが好ましい。
　上記式（８）において、Ｘ８は、本発明の組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第８のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、上記と同義である。
　本発明の組成物が第９のペプチド断片をさらに含有する実施形態では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第９のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（９）：
　（Ｘ９／Ｙ）×１００≦２．３０００　　　・・・（９）
を満たすことが好ましい。
　上記式（９）において、Ｘ９は、本発明の組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第９のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、上記と同義である。
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ－ＵＶ分析は、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１のペプチド断片の含有量の比率（（Ｘ１／Ｙ）×１００）、アルカリホスファターゼの含有量に対する第２のペプチド断片の含有量の比率（（Ｘ２／Ｙ）×１００）、アルカリホスファターゼの含有量に対する第３のペプチド断片の含有量の比率（（Ｘ３／Ｙ）×１００）、アルカリホスファターゼの含有量に対する第４のペプチド断片の含有量の比率（（Ｘ４／Ｙ）×１００）、アルカリホスファターゼの含有量に対する第５のペプチド断片の含有量の比率（（Ｘ５／Ｙ）×１００）、及び、アルカリホスファターゼの含有量に対する第６のペプチド断片の含有量の比率（（Ｘ６／Ｙ）×１００）が、本発明の組成物と同一であるサンプルを使用して実施される。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ－ＵＶ分析は、例えば、本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用して実施することができる。
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、ハイフネーテッド法の一種である。ハイフネーテッド法は、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ等のクロマトグラフと質量分析装置とを接続して分析する手法である。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）とを接続して分析する手法である。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、液体クロマトグラフにより分離された分析対象成分がイオン化され、生成したイオンがタンデム質量分析装置で分離され、特定の質量イオンがフラグメント化されて検出される。
　抽出イオンクロマトグラムは、ハイフネーテッド法において、一定の時間間隔でマススペクトルを測定し、コンピュータに記憶させた後、特定の（１種類とは限らない）ｍ／ｚ値における相対強度を読み出し、時間の関数として表したクロマトグラムである。第１～第９のペプチド断片のピークを検出するために使用されるイオンのｍ／ｚ値は、好ましくは５０～２２００、さらに好ましくは２００～１５００、さらに一層好ましくは３００～１２００である。第１～第９のペプチド断片の抽出イオンクロマトグラムは、ｍ／ｚ値に基づいて作成することができる。第１のペプチド断片のｍ／ｚ値は５５８．７６７６、第２のペプチド断片のｍ／ｚ値は４４３．７５３３、第３のペプチド断片のｍ／ｚ値は６５２．６６２３、第４のペプチド断片のｍ／ｚ値は７２３．８５７２、第５のペプチド断片のｍ／ｚ値は６５５．８１４８、第６のペプチド断片のｍ／ｚ値は６３６．３２８２、第７のペプチド断片のｍ／ｚ値は９２０．７６８２、第８のペプチド断片のｍ／ｚ値は８１４．４０１８、第９のペプチド断片のｍ／ｚ値は７８６．８７５７である。ｍ／ｚ値が特定されていないペプチド断片に関しては、あるピークを示す所定のペプチド断片のアミノ酸配列分析により確認した後、当該ピークのｍ／ｚ値に基づいてペプチド断片の抽出イオンクロマトグラムを作成することができる。
　ＬＣ－ＵＶ分析は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）と紫外線検出器（ＵＶ検出器）とを接続して分析する手法である。ＬＣ－ＵＶ分析において、アルカリホスファターゼは、２１４ｎｍに吸収を有する成分として検出される。
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ－ＵＶ分析の条件は、以下の通りである。
≪ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の条件≫
＜装置構成＞
　質量分析計：ｍａＸｉｓ　ｉｍｐａｃｔ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）
＜質量分析条件＞
　イオン化方式：ＥＳＩ
　測定イオン：正イオン
　キャピラリー電圧：４５００Ｖ
　ネブライザー：２．０ｂａｒ
　ドライガス：８．０Ｌ／分
　検出器電圧：１８２３Ｖ
　測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ　５０～２２００
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
　測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ　５０～２２００
　コリジョンガス：窒素
≪ＬＣ－ＵＶ分析の条件≫
＜装置構成＞
　液体クロマトグラフ：ＬＣ－３０Ａシステム（島津製作所製）
　検出器：ＵＶ－Ｖｉｓ（１９０～９００ｎｍ、島津製作所製）
＜液体クロマトグラフィー条件＞
　カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ　ＢＥＨ　Ｃ１８　１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）カラムサイズ：２．１ｍｍ×１００ｍｍ
　カラム温度：５０℃
　移動相流速：０．２ｍＬ／分
　移動相Ａ：水／ギ酸混液（１０００：１）
　移動相Ｂ：アセトニトリル／水／ギ酸混液（９００：１００：１）
　注入量：２０μＬ
　グラジエントプログラム：
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　（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、０．６０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．５０００以下、さらに好ましくは０．３０００以下、さらに一層好ましくは０．２０００以下である。（Ｘ１／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ１／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第１のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ２／Ｙ）×１００の値は、０．１８００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ２／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．１５００以下、さらに好ましくは０．１２００以下、さらに一層好ましくは０．１０００以下である。（Ｘ２／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ２／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第２のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ２／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ３／Ｙ）×１００の値は、０．２０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ３／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．１８００以下、さらに好ましくは０．１７００以下、さらに一層好ましくは０．１５００以下である。（Ｘ３／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ３／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第３のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ３／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ４／Ｙ）×１００の値は、０．８０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ４／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．７０００以下、さらに好ましくは０．６０００以下、さらに一層好ましくは０．５０００以下である。（Ｘ４／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ４／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第４のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ４／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ５／Ｙ）×１００の値は、１．６０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ５／Ｙ）×１００の値は、好ましくは１．５０００以下、さらに好ましくは１．２０００以下、さらに一層好ましくは１．００００以下である。（Ｘ５／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ５／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第５のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ５／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ６／Ｙ）×１００の値は、０．３５００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ６／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．３２００以下、さらに好ましくは０．３０００以下、さらに一層好ましくは０．２８００以下である。（Ｘ６／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ６／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第６のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ６／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０８００以上、さらに好ましくは０．１０００以上、さらに一層好ましくは０．１５００以上である。
　（Ｘ７／Ｙ）×１００の値は、１．００００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ７／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．９０００以下、さらに好ましくは０．８０００以下、さらに一層好ましくは０．７０００以下である。（Ｘ７／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ７／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第７のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ７／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ８／Ｙ）×１００の値は、１．００００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ８／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．９０００以下、さらに好ましくは０．８０００以下、さらに一層好ましくは０．７０００以下である。（Ｘ８／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ８／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第８のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ８／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　（Ｘ９／Ｙ）×１００の値は、２．３０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ９／Ｙ）×１００の値は、好ましくは２．００００以下、さらに好ましくは１．５０００以下、さらに一層好ましくは１．００００以下である。（Ｘ９／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ９／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第９のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ９／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第１のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第１のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１５００以下、さらに好ましくは１２００以下、さらに一層好ましくは１０００以下である。第１のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第１のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第１のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第１のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第２のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第２のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは４００以下、さらに好ましくは３８０以下、さらに一層好ましくは３５０以下である。第２のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第２のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第２のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第２のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１３０以上、さらに一層好ましくは１５０以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第３のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第３のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは５００以下、さらに好ましくは４５０以下、さらに一層好ましくは４００以下である。第３のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第３のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第３のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第３のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第４のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第４のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは２０００以下、さらに好ましくは１８００以下、さらに一層好ましくは１５００以下である。第４のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第４のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第４のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第４のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第５のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第５のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは４５００以下、さらに好ましくは３０００以下、さらに一層好ましくは２５００以下である。第５のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第５のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第５のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第５のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第６のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第６のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１０００以下、さらに好ましくは９００以下、さらに一層好ましくは８００以下である。第６のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第６のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第６のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第６のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第７のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第７のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは３０００以下、さらに好ましくは２５００以下、さらに一層好ましくは２０００以下である。第７のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第７のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第７のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第７のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第８のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第８のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは３０００以下、さらに好ましくは２５００以下、さらに一層好ましくは２０００以下である。第８のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第８のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第８のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第８のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第９のペプチド断片のピーク面積値は小さいほど好ましい。第９のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは６０００以下、さらに好ましくは３０００以下、さらに一層好ましくは１０００以下である。第９のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第９のペプチド断片のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製による第９のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第９のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
　本発明の組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは２０００００以上、さらに好ましくは２２００００以上、さらに一層好ましくは２４００００以上である。アルカリホスファターゼのピーク面積値の上限値は特に限定されない。アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは５０００００以下、さらに好ましくは４０００００以下、さらに一層好ましくは３５００００以下である。
［アルカリホスファターゼ比活性］
　本発明の組成物は、２０００Ｕ／ｍｇ以上のアルカリホスファターゼ比活性を有することが好ましい。本発明の組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性は、さらに好ましくは２５００Ｕ／ｍｇ以上、さらに一層好ましくは３０００Ｕ／ｍｇ以上である。本発明の組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性は、次のようにして測定される。ｐ－ニトロフェニルリン酸水溶液にアルカリホスファターゼを添加することで生成するｐ－ニトロフェノール由来の４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、アルカリホスファターゼの比活性を算出することができる。
［その他の成分］
　本発明の組成物は、１種又は２種以上のその他の成分を含有することができる。その他の成分としては、例えば、水等の水性媒体、マグネシウム塩、ナトリウム塩等の金属塩、界面活性剤、有機酸、グリセリン等が挙げられる。
　本発明の組成物は、アルカリホスファターゼ活性が求められる様々な用途に使用することができ、用途に応じて選択された１種又は２種以上のその他の成分を含有することができる。
　一実施形態において、本発明の組成物は、抗原、抗体等のタンパク質を含有する。この実施形態において、本発明の組成物は、抗原、抗体等のタンパク質をアルカリホスファターゼで標識化するために使用することができる。すなわち、一実施形態において、本発明の組成物は、タンパク質をアルカリホスファターゼで標識化するための組成物である。アルカリホスファターゼによるタンパク質の標識化は、アルカリホスファターゼのカルボキシル基をスクシンイミドでエステル化して得られるアルカリホスファターゼスクシンイミドエステル体をタンパク質のアミノ基と反応させることにより行うことができる。
　一実施形態において、本発明の組成物は、アルカリホスファターゼの基質を含有する。この実施形態において、本発明の組成物は、アルカリホスファターゼの基質を脱リン酸化するために使用することができる。すなわち、一実施形態において、本発明の組成物は、アルカリホスファターゼの基質を脱リン酸化するための組成物である。アルカリホスファターゼの基質は、リン酸モノエステル結合を有する化合物である限り特に限定されない。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば、核酸、リン脂質、ピロリン酸等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質を本発明の組成物で処理すると、アルカリホスファターゼの基質のリン酸モノエステル結合がアルカリホスファターゼで加水分解され、アルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化が生じる。
　好ましい実施形態において、本発明の組成物は、核酸を含有する。この実施形態において、本発明の組成物は、核酸を脱リン酸化するために使用することができる。すなわち、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、核酸を脱リン酸化するための組成物である。アルカリホスファターゼに混在する第１～第６のペプチド断片は、アルカリホスファターゼで核酸を脱リン酸化する際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、上記式（１）～（６）を満たす。すなわち、本発明の組成物では、第１～第６のペプチド断片の相対的含有量が低減している。したがって、本発明の組成物を使用することにより、アルカリホスファターゼで核酸を脱リン酸化する際に生じ得る第１～第６のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、核酸の脱リン酸化効率を向上させることができる。本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化することができる。核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化することにより、核酸の５’末端及び／又は３’末端を標識物質で標識化する際の標識化効率を向上させることができる。特に、標識物質として３２Ｐを使用する際、この効果は顕著である。また、ＤＮＡクローニングに使用されるベクターの５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化することにより、ベクターのセルフライゲーションを防止することができ、これにより、形質転換細胞のバックグラウンドを低下させることができる。
　核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の核酸又は核酸誘導体である。核酸誘導体としては、例えば、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチル等のアルキル、メトキシ等のアルコキシ、チオ、カルボキシメチル等の基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換等を受けたヌクレオチド等）を含む核酸誘導体が挙げられる。核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、染色体ＤＮＡ，ウイルスのＤＮＡ，細菌、カビ等のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの断片等が挙げられる。ＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ，スモールＲＮＡ、それらの断片等が挙げられる。核酸は、化学的に合成したＤＮＡ、ＲＮＡ等であってもよい。核酸の具体例としては、病原菌、ウイルス等の遺伝子又はその一部、遺伝病の原因遺伝子又はその一部等が挙げられる
　核酸は、例えば、生体材料、ウイルス、細菌、カビ、飲食物等から常法により抽出することにより調製することができる。生体材料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、組織液等の体液、細胞、組織等が挙げられる。生体材料は、動物由来であってもよいし、植物由来であってもよい。
　本発明の組成物に含まれる核酸の量は、本発明の組成物の使用目的（例えば、標的核酸の検出）等に応じて適宜調整することができる。例えば、本発明の組成物に含まれる核酸のうち、ある核酸（標的核酸）の検出を目的とする場合、本発明の組成物に含まれる核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法を実施することにより、標的核酸を増幅させることができる。これにより、標的核酸の検出感度を向上させることができる。
　核酸の長さ（塩基数）は、本発明の組成物の使用目的（例えば、標的核酸の検出）等に応じて適宜調整することができる。例えば、核酸の検出を目的とする場合、核酸の長さは、通常１０～３００塩基、好ましくは１０～１００塩基、さらに好ましくは１５～５０塩基である。核酸の長さは、断片化処理により適宜調整することができる。核酸の長さは、例えば、プローブとハイブリダイズし得る長さである。核酸が長い場合（例えば１５００塩基以上、特に４０００塩基以上）には、核酸を断片化処理して、核酸の長さを適切な長さに調整することが好ましい。断片化処理を行う場合、生じた核酸断片から特定の核酸断片を選択する必要はなく、断片化処理物をそのまま使用することができる。
　断片化のために核酸を切断する方法としては、例えば、超音波を照射して切断する方法、酵素で切断する方法、制限酵素で切断する方法、ネブライザーを使用する方法、酸又はアルカリで切断する方法等が挙げられる。超音波で切断する方法の場合、核酸に照射する超音波の出力強度及び照射時間を制御することにより、核酸を所望の長さに切断することが可能である。
　好ましい実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸を含有する。核酸に関する説明は上記と同様である。脱リン酸化核酸は、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端を有する。この実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するために使用することができる。すなわち、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するための組成物である。アルカリホスファターゼに混在する第１～第６のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際、及び／又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、上記式（１）～（６）を満たす。すなわち、本発明の組成物では、第１～第６のペプチド断片の相対的含有量が低減している。したがって、本発明の組成物を使用することにより、アルカリホスファターゼで核酸を脱リン酸化する際、及び／又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に生じ得る第１～第６のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、核酸の脱リン酸化効率、及び／又は、脱リン酸化された核酸の標識化効率を向上させることができる。
　好ましい実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を含有する。核酸に関する説明は上記と同様である。脱リン酸化核酸は、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端を有する。標識物質は、脱リン酸化核酸の５’末端及び／又は３’末端に結合する。
　標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク、化学発光体、金属錯体、金属微粒子、ビオチン、ラジオアイソトープ等を使用することができる。標的核酸を標識化する際の反応条件は、標識物質の種類に応じて適宜調節することができる。標識物質が蛍光色素である場合、蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー等を使用して行うことができる。
　蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素、カスケード系色素、クマリン系色素、エオジン系色素、ＮＢＤ系色素、ピレン系色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素、シアニン系色素等の有機蛍光色素が挙げられる。
　有機蛍光色素の具体例としては、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，７，７’－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等が挙げられる。
　本発明の組成物が、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を含有する実施形態において、本発明の組成物は、核酸検出法に供される核酸サンプルとして使用することができる。すなわち、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、核酸検出法に供される核酸サンプルである。標識化核酸は、検出すべき標的核酸と、標的核酸以外の核酸とを含有することができる。核酸検出法では、核酸サンプルに含有される標的核酸を、標的核酸が有する標識物質を指標として検出することができる。核酸検出法は特に限定されず、公知の核酸検出法の中から適宜選択することができる。標的核酸は、例えば、ハイブリダイゼーション法を使用して検出することができる。ハイブリダイゼーション法の一実施形態では、標的核酸とハイズリダイズすることができるプローブを使用して標的核酸を検出することができる。プローブを使用する核酸検出法の一実施形態では、プローブと、標的核酸を含有する核酸サンプルとを接触させ、プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせ、プローブとハイブリダイズした標的核酸を、標的核酸が有する標識物質を指標として検出することができる。サンプルに標的核酸以外の核酸が含まれる場合、標的核酸とプローブとを接触させた後、プローブとハイブリダイズしなかった核酸を洗浄等により除去することが好ましい。
　標的核酸とプローブとをハイブリダイゼーションさせる際の反応条件は、標的核酸の鎖長、プローブの鎖長等に応じて適宜調整することができる。反応時間は、通常３０～１２００分、好ましくは６０～３６０分である。反応温度は、通常２５～６０℃、好ましくは３０～４０℃である。反応は、通常、水等の水性媒体中で行われる。
　標的核酸及びプローブの使用量は、標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションが可能であり、標的核酸に結合した標識物質を検出が可能である限り特に限定されず、標的核酸の鎖長、プローブの鎖長、標識物質の種類等に応じて適宜調整することができる。
　プローブとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の核酸又は核酸誘導体を使用することができる。核酸誘導体としては、例えば、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチル等のアルキル、メトキシ等のアルコキシ、チオ、カルボキシメチル等の基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換等を受けたヌクレオチド等）を含む核酸誘導体が挙げられる。
　プローブは、標的核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有し、標的核酸にハイブリダイズすることができる。標的核酸が二本鎖である場合、プローブはセンス鎖にハイブリダイズしてもよいし、アンチセンス鎖にハイブリダイズしてもよい。プローブの塩基配列は、標的核酸の塩基配列のうち、どの部分と相補的であってもよいが、標的核酸の塩基配列のうち、特異性が高い部分と相補的であることが好ましい。すなわち、プローブの塩基配列は、標的核酸の塩基配列のうち、サンプルに含有されるその他の核酸に含まれない塩基配列と相補的であることが好ましい。
　プローブの塩基配列のうち、標的核酸の塩基配列と相補的な部分の長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常１０～１５０塩基、好ましくは２０～１００塩基、さらに好ましくは２０～７０塩基である。プローブは、標的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列で構成されていてもよいし、標的核酸の塩基配列と相補的でない塩基配列を含んでいてもよい。プローブの全長（総塩基数）は、通常１０～３００塩基、好ましくは２０～２００塩基、さらに好ましくは１５～１００塩基である。
　プローブは、市販品、合成品、生体からの調製物等のいずれであってもよい。オリゴ核酸と呼ばれる長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
　プローブは、支持体に固定化されていることが好ましい。すなわち、好ましい実施形態において、核酸検出法は、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である。核酸マイクロアレイは、支持体と、支持体の表面に固定された複数のプローブとを有する。核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法では、標識化された標的核酸と、標的核酸にハイブリダイズし得るプローブを備える核酸マイクロアレイとを接触させ、プローブにハイブリダイズした標的核酸を、標的核酸に結合した標識物質を指標として検出することができる。サンプルに標的核酸以外の核酸が含まれる場合、標的核酸と核酸マイクロアレイとを接触させた後、核酸マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズしなかった核酸を洗浄等により除去することが好ましい。複数のプローブを備える核酸マイクロアレイを使用することにより、２種以上の標的核酸を同時に検出することができる。
　支持体はプローブを固定化し得る限り特に限定されない。支持体としては、例えば、スライドガラス、メンブレン、ビーズ等が挙げられる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマー等が挙げられる。
　支持体へのプローブの固定化は、常法に従って行うことができる。支持体にプローブを固定化する方法としては、支持体上面部でオリゴ核酸を合成する方法、あらかじめ合成しておいたオリゴ核酸を支持体上面部へ滴下し固定する方法等が公知である。前者の方法としては、例えば、Ｒｏｎａｌｄらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Ｍｉｃｈｅｌらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Ｆｒａｎｃｅｓｃｏらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）等が挙げられる。これらの方法ではＤＮＡ合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。例えば、特表平１０－５０３８４１号公報に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス製支持体を用いることができる。特にＦｒａｎｃｅｓｃｏらの方法においては、支持体の裏面から光を照射し、ＤＮＡ合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。後者の方法としては、例えば、廣田らの方法（特許第３９２２４５４号）、ガラスキャピラリーを用いる方法等が挙げられる。ガラスキャピラリーの一例としては、自作したガラスキャピラリー、マイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ－００５）等の市販製品を用いることができる。
　標的核酸の検出方法として、サンドイッチハイブリダイゼーション法を使用することができる。サンドイッチハイブリダイゼーション法では、支持体に固定された第１のプローブ（捕捉プローブ）と、支持体に固定されていない第２のプローブ（検出プローブ）とが使用される。捕捉プローブ及び検出プローブは、それぞれ、標的核酸の異なる部分に相補的な塩基配列を有し、標的核酸の異なる部分にハイブリダイゼーションすることができる。標的核酸と検出プローブ及び捕捉プローブとがハイブリダイズすることにより複合体が形成される。この複合体に含まれる標識物質を検出することにより、標的核酸を検出することができる。
　検出プローブの塩基配列と捕捉プローブの塩基配列との配列同一性は低いことが好ましい。配列同一性は、好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下である。ここで、２つの塩基配列の同一性は、塩基ができるだけ多く一致するように２つの配列を整列させ（必要に応じギャップを入れる）、一致した塩基数を全塩基数（２つの塩基配列の塩基数が異なる場合には大きい方の塩基数）で除すことにより得られる数値であり、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ等の市販のソフト（インターネットでも提供されている）により容易に算出可能である。
　標的核酸の検出方法において検出されたシグナル（例えば、検出された標識物質の強度）は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブが固定されている支持体上の位置から得られたシグナル値と、プローブが固定されていない支持体上の位置から得られたシグナル値（ノイズ値）を比較し、前者の数値とノイズ値の比をＳ／Ｎ比とする。検出精度は、Ｓ／Ｎ比によって表すことができる。すなわち、Ｓ／Ｎ比が大きいほど、検出精度が高く、Ｓ／Ｎ比が小さいほど、検出精度が低い。
　本発明の組成物が、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を含有する実施形態では、核酸検出法において本発明の組成物を核酸サンプルとして使用することにより、標的核酸の検出感度を向上させることができる。この効果は、微量（好ましくは５～１０００μＬ、さらに好ましくは５～５００μＬ）の核酸サンプルが使用される核酸検出法において顕著である。微量の核酸サンプルが使用される核酸検出法では、核酸サンプルに含まれる第１～第６のペプチド断片が検出感度に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、上記式（１）～（６）を満たす。すなわち、本発明の組成物では、第１～第６のペプチド断片の相対的含有量が低減している。したがって、微量の核酸サンプルが使用される核酸検出法において、本発明の組成物を核酸サンプルとして使用することにより、第１～第６のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、標的核酸の検出感度を顕著に向上させることができる。
　好ましい実施形態において、核酸検出法は、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である。核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法では、微量（好ましくは５～１０００μＬ、さらに好ましくは５～５００μＬ）の核酸サンプルが使用される。したがって、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法において、本発明の組成物を核酸サンプルとして使用することにより、第１～第６のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、標的核酸の検出感度を顕著に向上させることができる。
［製造方法］
　本発明の組成物は、ウシ、エビ等の臓器からのアルカリホスファターゼ抽出物、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物からのアルカリホスファターゼ抽出物、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物の菌体破砕物、市販のアルカリホスファターゼ製品等から、第１～第６のペプチド断片を分離することにより製造することができる。第１～第６のペプチド断片の分離方法としては、例えば、透析、塩析、ゲル濾過、限外濾過、膜分離、イオン交換、カラムクロマトグラフィー、電気泳動等が挙げられる。第１～第６のペプチド断片の分離方法は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品をカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量を所望の範囲とすることができる。カラムクロマトグラフィーは、例えば、液体クロマトグラフィーである。液体クロマトグラフィーで使用されるカラム及び移動相は、第１～第６のペプチド断片を分離し得る限り特に限定されないが、Ｃ１８が担持された逆相カラムを使用することが好ましい。第７～第９のペプチド断片も第１～第６のペプチド断片と同様にして分離することができる。
［使用方法］
　本発明の組成物は、アルカリホスファターゼ活性が求められる様々な方法に使用することができる。
　一実施形態において、本発明の組成物は、以下の工程：
　本発明の組成物を準備する工程；
　核酸を準備する工程；及び
　上記核酸を上記組成物で処理し、上記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法で使用される。アルカリホスファターゼに混在する第１～第６のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、上記式（１）～（６）を満たす。すなわち、本発明の組成物では、第１～第６のペプチド断片の相対的含有量が低減している。このため、本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の脱リン酸化効率を向上させることができる。
　一実施形態において、本発明の組成物は、以下の工程：
　本発明の組成物を準備する工程；
　核酸を準備する工程；
　標識物質を準備する工程；
　上記核酸を上記組成物で処理し、上記核酸を脱リン酸化する工程；及び
　上記脱リン酸化核酸に上記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法で使用される。アルカリホスファターゼに混在する第１～第６のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際、及び／又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、上記式（１）～（６）を満たす。すなわち、本発明の組成物では、第１～第６のペプチド断片の相対的含有量が低減している。このため、本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の脱リン酸化効率、及び／又は、脱リン酸化された核酸の標識化効率を向上させることができる。
　核酸を本発明の組成物で処理し、核酸を脱リン酸化する工程において、反応条件は適宜調節することができる。反応時間は、通常１０～６０分、好ましくは２０～５０　分である。反応温度は、通常２０～６０℃、好ましくは２５～４５℃である。反応は、通常、水等の水性媒体中で行われる。核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等である。核酸を本発明の組成物で処理すると、核酸の５’末端及び／又は３’末端が脱リン酸化される。
　脱リン酸化核酸に標識物質を結合させる工程において、標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク、化学発光体、金属錯体、金属微粒子、ビオチン、ラジオアイソトープ等を使用することができる。反応条件は、標識物質の種類に応じて適宜調節することができる。脱リン酸化核酸は、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端を有し、標識物質は、脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端に結合させることができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
≪ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の条件≫
　実施例及び比較例で使用されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の条件は以下の通りである。
＜装置構成＞
　質量分析計：ｍａＸｉｓ　ｉｍｐａｃｔ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）
＜質量分析条件＞
　イオン化方式：ＥＳＩ
　測定イオン：正イオン
　キャピラリー電圧：４５００Ｖ
　ネブライザー：２．０ｂａｒ
　ドライガス：８．０Ｌ／分
　検出器電圧：１８２３Ｖ
　測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ　５０～２２００
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
　測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ　５０～２２００
　コリジョンガス：窒素
≪ＬＣ－ＵＶ分析の条件≫
　実施例及び比較例で使用されたＬＣ－ＵＶ分析の条件は以下の通りである。
＜装置構成＞
　液体クロマトグラフ：ＬＣ－３０Ａシステム（島津製作所製）
　検出器：ＵＶ－Ｖｉｓ（１９０～９００ｎｍ、島津製作所製）
＜液体クロマトグラフィー条件＞
　カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ　ＢＥＨ　Ｃ１８　１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）カラムサイズ：２．１ｍｍ×１００ｍｍ
　カラム温度：５０℃
　移動相流速：０．２ｍＬ／分
　移動相Ａ：水／ギ酸混液（１０００：１）
　移動相Ｂ：アセトニトリル／水／ギ酸混液（９００：１００：１）
　注入量：２０μＬ
　グラジエントプログラム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
≪核酸検出法≫
　実施例及び比較例で使用された核酸検出法は以下の通りである。
　核酸検出法は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を使用して行った。具体的には、東レ株式会社製の“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ（ｍｉＲＢａｓｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　２１対応）を使用して行った。
［比較例１～８］
　５社から購入した８種類のアルカリホスファターゼ製品（以下「組成物Ｃ１」～「組成物Ｃ８」という。）を、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物として使用した。組成物Ｃ１～Ｃ８のそれぞれに含まれるアルカリホスファターゼは、ウシの腸管由来のアルカリホスファターゼである。組成物Ｃ１～Ｃ８のそれぞれのアルカリホスファターゼ比活性を測定したところ、組成物Ｃ１は２２３８Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ２は２４９２Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ３は２４３１Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ４は２５１９Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ５は２４１１Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ６は２５５２Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ７は２４４８Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ８は２４９０Ｕ／ｍｇであった。なお、アルカリホスファターゼ比活性は、ｐ－ニトロフェニルリン酸を使用する方法で測定した。具体的には、以下の通りである。
　下記溶液Ａ及びＢを準備した。
　溶液Ａ：１Ｍ　ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）
　溶液Ｂ：０．６７Ｍ　ｐ－ニトロフェノールリン酸水溶液
　溶液Ａ　２．９ｍＬと溶液Ｂ　０．１ｍＬとをキュベット（光路長＝１ｃｍ）に調製し、３７℃で５分間加温した。次いで、アルカリホスファターゼ水溶液　０．１ｍＬを添加し、分光光度計で４０５ｎｍ（３７℃）の吸光度変化を３～５分間測定し、単位時間あたりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤ）。対照としてアルカリホスファターゼ水溶液の代わりに水を添加したサンプルで吸光度変化を求めた（ΔＯＤブランク）。下記式によりアルカリホスファターゼ活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。
アルカリホスファターゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝（ΔＯＤ－ΔＯＤブランク）×３．１／（１８．２×０．１×１．０）
　アルカリホスファターゼ水溶液中のアルカリホスファターゼの濃度は２１４ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。２１４ｎｍにおける吸光度が０．１～１．０となるようにアルカリホスファターゼ水溶液を蒸留水で希釈し、１Ａｂｓ＝１ｍｇ／ｍＬと近似して、希釈倍率を乗じた値をアルカリホスファターゼの濃度とした。本発明における比活性とはアルカリホスファターゼ１ｍｇあたりの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、上記測定法により算出した。
　組成物Ｃ１～Ｃ８のそれぞれから、１０重量％アルカリホスファターゼ水溶液を調製し、この水溶液を使用してＬＣ－ＵＶ分析及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムに基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２のペプチド断片、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３のペプチド断片、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第４のペプチド断片、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第５のペプチド断片、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第６のペプチド断片、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第７のペプチド断片、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第８のペプチド断片、及び、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第９のペプチド断片のそれぞれのピーク面積値を自動積分法により算出した。また、ＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムに基づいて、アルカリホスファターゼのピーク面積値を自動積分法により算出した。ＬＣ－ＵＶ分析において、アルカリホスファターゼは、２１４ｎｍに吸収を有する成分として検出した。
　図１は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図２は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第２のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図３は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第３のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図４は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第４のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図５は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第５のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図６は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第６のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図７は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第７のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図８は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第８のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図９は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第９のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物を使用して核酸を脱リン酸化し、得られた脱リン酸化核酸をシアニン系有機蛍光色素で標識化した。具体的には、以下の通り、脱リン酸化反応及び標識化反応を行った。
　健常人から採血した全血を遠心分離して血清　１ｍＬ得た。血清中から“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｋｉｔ（東レ(株)製）を使用してマイクロＲＮＡを抽出した。得られた抽出マイクロＲＮＡを母液とし、“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ｍｉＲＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（東レ(株)製）を使用して標識した。得られた抽出マイクロＲＮＡ　５μＬを上記キットのＡＰ　ｂｕｆｆｅｒ　０．４μＬ及びＳｐｉｋｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　１．０μＬの混合液に添加し、さらに組成物Ｃ１を０．４μＬ添加した溶液を調製した。次いで、３７℃で４０分間インキュベートした後、氷上で２分間静置した。次いで、ＬＥ　Ｂｕｆｆｅｒ　１．２μＬ、３Ｄ－Ｇｅｎｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｌａｂｅｌ　３．０μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　２．５μＬ、Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　１．０μＬを添加し、１６℃で１時間インキュベートした後、６５℃で１５分間インキュベートして、標識化核酸を得た。組成物Ｃ２～Ｃ８を使用した脱リン酸化反応及び標識化反応も同一の抽出マイクロＲＮＡ母液を使用し、上記と同様の方法で行った。
　得られた標識化核酸を使用して核酸の検出を行った。標識した検体ＲＮＡについて、ＤＮＡチップ（“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”　ｍｉＲＮＡ　ｃｈｉｐ，東レ(株)製）を使用し、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップをマイクロアレイスキャナー（東レ(株)製）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をＡＵＴＯ設定にした。核酸の検出は、上記の通りＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を使用して行った。ＤＮＡチップにおける有効スポット数を求め、検出率（％）を算出した。ＤＮＡチップ上の全２，５８８スポットのうち、検出シグナル値からノイズ（スポットの無い箇所のシグナル値）を引いた値が１００以上のものを有効スポットとし、有効スポット数を全スポット数で除して１００を乗じた値を検出率とした。結果を表４－２及び表５－２に示す。
［実施例１～４］
　比較例２～４及び８のアルカリホスファターゼ組成物（組成物Ｃ２～Ｃ４及びＣ８）を以下の方法で精製して、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物（以下「組成物Ｅ１」～「組成物Ｅ４」という。）を得た。精製方法は、以下の通りである。
（透析工程）
　組成物Ｃ２（３０μＬ）を、透析カップ（カットオフ分子量３．５Ｋ）を使用して、透析バッファ（１ｍＬ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ　ＺｎＣｌ２）で３回透析処理し、濃縮液を回収した。
（ゲル濾過工程）
　透析処理後の濃縮液をゲル濾過カラムを使用して、バッファ（２．５ｍＬ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２，５０ｍＭ　ＫＣｌ，５５重量％　グリセリン）で濾過回収した。
（疎水カラム工程）
　ゲル濾過後の回収液から、疎水カラムを使用して、下記条件でアルカリホスファターゼ画分を回収した。
　移動相流速：１．０ｍＬ／分
　移動相Ａ：２０ｍＭ　リン酸水素二ナトリウム、３Ｍ　硫酸アンモニウム（５０／５０）
　移動相Ｂ：２０ｍＭ　リン酸水素二ナトリウム
　グラジエントプログラム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　検出器：ＵＶ２１４ｎｍ
（透析工程）
　回収したアルカリホスファターゼ画分を上記透析と同じ条件で３回透析処理し、濃縮液を回収した。
（限外濾過工程）
　回収した濃縮液を、限外濾過カラム（カットオフ分子量１０Ｋ）を使用して、バッファ（２．５ｍＬ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２，５０ｍＭ　ＫＣｌ，５５重量％　グリセリン）で濾過回収し、組成物Ｅ１を得た。
　組成物Ｅ２、組成物Ｅ３及び組成物Ｅ４も同様に、上記と同様の方法を使用して、それぞれ、組成物Ｃ３、組成物Ｃ４及び組成物Ｃ８から得た。
　実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物のアルカリホスファターゼ比活性を測定したところ、組成物Ｅ１は２４９０Ｕ／ｍｇ、組成物Ｅ２は２４２０Ｕ／ｍｇ、組成物Ｅ３は２５２２Ｕ／ｍｇ、組成物Ｅ４は２４７０Ｕ／ｍｇであった。なお、アルカリホスファターゼ比活性は、上記と同様にして測定した。
　組成物Ｅ１～Ｅ４のそれぞれから、１０重量％アルカリホスファターゼ水溶液を調製し、この水溶液を使用してＬＣ－ＵＶ分析及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムに基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２のペプチド断片、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３のペプチド断片、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第４のペプチド断片、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第５のペプチド断片、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第６のペプチド断片、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第７のペプチド断片、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第８のペプチド断片、及び、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第９のペプチド断片のそれぞれのピーク面積値を自動積分法により算出した。また、ＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムに基づいて、アルカリホスファターゼのピーク面積値を自動積分法により算出した。ＬＣ－ＵＶ分析において、アルカリホスファターゼは、２１４ｎｍに吸収を有する成分として検出した。
　図１０は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１１は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第２のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１２は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第３のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１３は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第４のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１４は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第５のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１５は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第６のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１６は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第７のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１７は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第８のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１８は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第９のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
　図１９は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ－ＵＶ分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムを示す。なお、実施例２～４及び比較例１～８において各組成物のＬＣ－ＵＶ分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムは、図１９と同様であった。
　実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物を使用して核酸を脱リン酸化し、得られた脱リン酸化核酸をシアニン系有機蛍光色素で標識化した。脱リン酸化反応及び標識化反応は、上記と同様にして行った。
　得られた標識化核酸を使用して核酸の検出を行った。核酸の検出は、上記の通りＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を使用して行った。ＤＮＡチップにおける有効スポット数を求め、検出率（％）を算出した。結果を表４－１及び表５－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物を使用して調製した核酸サンプルを核酸検出法で使用した場合、有効スポット数が１５００未満であったのに対して、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物を使用して調製した核酸サンプルを核酸検出法で使用した場合、有効スポット数が１５００以上であった。また、比較例１～８における検出率は、アルカリホスファターゼ組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性はほぼ同じであるにも関わらず、差が生じたのに対して、実施例１～４における検出率はほぼ同じであり、しかも、比較例１～８の検出率よりも高かった。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物では０．６０００を超えるのに対して（最小値は比較例５のアルカリホスファターゼ組成物における０．６６４６）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では０．６０００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～８との間で上記効果の差を生じさせた主因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第２のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ２／Ｙ）×１００の値は、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物では０．１８００を超えるのに対して（最小値は比較例４のアルカリホスファターゼ組成物における０．１８１０）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では０．１８００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～８との間で上記効果の差を生じさせた主因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第３のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ３／Ｙ）×１００の値は、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物では０．２０００を超えるのに対して（最小値は比較例６のアルカリホスファターゼ組成物における０．２０７３）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では０．２０００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～８との間で上記効果の差を生じさせた主因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第４のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ４／Ｙ）×１００の値は、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物では０．８０００を超えるのに対して（最小値は比較例１のアルカリホスファターゼ組成物における０．８４９７）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では０．８０００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～８との間で上記効果の差を生じさせた主因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第５のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ５／Ｙ）×１００の値は、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物では１．６０００を超えるのに対して（最小値は比較例１のアルカリホスファターゼ組成物における１．６９１３）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では１．６０００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～８との間で上記効果の差を生じさせた主因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第６のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ６／Ｙ）×１００の値は、比較例１～８のアルカリホスファターゼ組成物では０．３５００を超えるのに対して（最小値は比較例１のアルカリホスファターゼ組成物における０．３９１５）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では０．３５００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～８との間で上記効果の差を生じさせた主因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第７のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ７／Ｙ）×１００の値は、比較例１、２及び４～８のアルカリホスファターゼ組成物では１．００００を超えるのに対して（但し、比較例３では１．００００以下）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では１．００００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１、２及び４～８との間で上記効果の差を生じさせた副因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第８のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ８／Ｙ）×１００の値は、比較例１～３、５、７及び８のアルカリホスファターゼ組成物では１．００００を超えるのに対して（但し、比較例４及び６では１．００００以下）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では１．００００以下である。このことは、実施例１～４と比較例１～３、５、７及び８との間で上記効果の差を生じさせた副因の一つであると考えられる。
　表４－１、表４－２、表５－１及び表５－２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第９のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ９／Ｙ）×１００の値は、比較例２～４、７及び８のアルカリホスファターゼ組成物では２．３０００を超えるのに対して（但し、比較例１、５及び６では２．３０００以下）、実施例１～４のアルカリホスファターゼ組成物では２．３０００以下である。このことが、実施例１～４と比較例２～４、７及び８との間で上記効果の差を生じさせた副因の一つであると考えられる。

Claims (14)

  1. 　アルカリホスファターゼと、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる第２のペプチド断片と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる第３のペプチド断片と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる第４のペプチド断片と、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる第５のペプチド断片と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる第６のペプチド断片とを含有する組成物であって、
    　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１～第６のペプチド断片の含有量の比率が、それぞれ、下記式（１）～（６）：
    　（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００　　　・・・（１）
    　（Ｘ２／Ｙ）×１００≦０．１８００　　　・・・（２）
    　（Ｘ３／Ｙ）×１００≦０．２０００　　　・・・（３）
    　（Ｘ４／Ｙ）×１００≦０．８０００　　　・・・（４）
    　（Ｘ５／Ｙ）×１００≦１．６０００　　　・・・（５）
    　（Ｘ６／Ｙ）×１００≦０．３５００　　　・・・（６）
    ［式中、Ｘ１～Ｘ６は、それぞれ、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１～第６のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ－ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
    を満たす、前記組成物。
  2. 　前記組成物が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる第７のペプチド断片をさらに含有し、
    　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第７のペプチド断片の含有量が、下記式（７）：
    　（Ｘ７／Ｙ）×１００≦１．００００　　　・・・（７）
    ［式中、Ｘ７は、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第７のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
    を満たす、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記組成物が、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる第８のペプチド断片をさらに含有し、
    　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第８のペプチド断片の含有量が、下記式（８）：
    　（Ｘ８／Ｙ）×１００≦１．００００　　　・・・（８）
    ［式中、Ｘ８は、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第８のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
    を満たす、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　前記組成物が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる第９のペプチド断片をさらに含有し、
    　前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第９のペプチド断片の含有量が、下記式（９）：
    　（Ｘ９／Ｙ）×１００≦２．３０００　　　・・・（９）
    ［式中、Ｘ９は、前記組成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記９のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
    を満たす、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 　前記組成物が、２０００Ｕ／ｍｇ以上のアルカリホスファターゼ比活性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　前記アルカリホスファターゼが、下記（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ；及び
    （ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の７８～９０位、１７７～１８７位、４６９～４７７位、５１６～５２８位及び５３４～５５１位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
    から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　前記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９１～１０９位、９３～１０５位及び５２９～５３１位から選択された１種又は２種以上をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 　前記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の９１～１０９位及び５２９～５３１位をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  9. 　前記組成物が、核酸をさらに含有し、前記組成物が、前記核酸を脱リン酸化するための組成物である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　前記組成物が、脱リン酸化核酸をさらに含有し、前記組成物が、前記脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するための組成物である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 　前記組成物が、脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸をさらに含有し、前記組成物が、核酸検出法に供される核酸サンプルである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 　前記核酸検出法が、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 　以下の工程：
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程；
    　核酸を準備する工程；及び
    　前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程
    を含む、脱リン酸化核酸の製造方法。
  14. 　以下の工程：
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程；
    　核酸を準備する工程；
    　標識物質を準備する工程；
    　前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程；及び
    　前記脱リン酸化核酸に前記標識物質を結合させる工程
    を含む、標識化核酸の製造方法。
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