WO2020045984A1 - 타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트 - Google Patents

타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트 Download PDF

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WO2020045984A1
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strand
donor
acceptor
fret
docking
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이종진
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    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Definitions

  • the techniques disclosed herein generally relate to methods and kits for detecting target materials, and more particularly to methods and kits capable of multiple detection of target materials with very high sensitivity.
  • Biomarkers are biological indicators that can detect changes in the body using proteins, DNA, RNA, and metabolites. By detecting biomarkers contained in specific samples derived from living organisms, the normal or pathological state of living organisms can be identified, and the degree of reaction to drugs can be objectively measured. In recent years, the medical community has been in the spotlight in that it is an effective method for diagnosing various intractable diseases such as cancer, heart disease, stroke, and dementia.
  • biomarker detection technology is mainly an ELISA-based technology, and has a sensitivity of up to several tens of pg / ml. Therefore, a biomarker detection requires a certain amount or more of a biosample proportional to the sensitivity.
  • a blood amount and a kit are required in proportion to the number of biomarkers to be detected. This not only causes the psychological and physical burden of the subject due to a large amount of blood collection and the economic burden of using a plurality of detection kits, but also may cause difficulties in early diagnosis of the disease, and thus, it is necessary to simultaneously diagnose two or more biomarkers. .
  • a technology capable of high sensitivity and multiple diagnosis is required to simultaneously detect two or more biomarkers using a trace amount of a biological sample.
  • Patent Document 0001 Korean Patent No. 1143106, "Multiple biomarker set for diagnosing breast cancer, a method for detecting the same, and a breast cancer diagnostic kit including an antibody thereof" (published: September 23, 2013)
  • Patent Document 0002 Korean Laid-Open Patent No. 20170096619, “Methods and Kits for Simultaneous Detection of Multiple Diseases Based on Three-Dimensional Protein Nanoparticle Probes” (Published: 2017.08.24.)
  • the wavelength at which the absorbance of the donor fluorescent material is maximum is shorter than the wavelength at which the absorbance of the acceptor fluorescent material is maximum, and the wavelength at which the luminescence of the donor fluorescent material is maximum is light emission of the acceptor fluorescent material. Degrees may be shorter than the maximum wavelength.
  • the extinction coefficient of the donor fluorescent material at the wavelength of the excitation light for exciting the donor fluorescent material may be three times greater than the absorption coefficient of the acceptor fluorescent material.
  • the posterior radius of the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material may be 0.208 nm or more.
  • the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material may be combined with the docking strand or the separate strand by a linker.
  • the length of the linker may be less than 10nm.
  • the above-described method for detecting a target substance may further include controlling the wavelength of the optical filter such that a signal-to-noise ratio of the fluorescent signal is two or more.
  • the separate strand comprises at least one donor strand having at least one donor fluorescent material; And at least one acceptor strand having at least one acceptor fluorescent material.
  • the target material is two or more, and at least one of the donor strand or the acceptor strand has a different sequence, or the type or attachment position is different depending on the type of the target material to be detected It may have different fluorescent materials.
  • the method for detecting a target material includes removing at least one or more of the donor strand and the acceptor strand after reading the target material, and then applying a donor strand or a different acceptor strand different from the removed step;
  • the method may further include the step of reading the target materials by type.
  • the gap between the donor strand and the acceptor strand when the donor strand and the acceptor strand are simultaneously coupled to the docking strand is shorter than the persistence length of the docking strand. Can be.
  • the method for detecting a target substance is necessary for the donor strand or the acceptor strand to bind to the docking strand while maintaining a signal-to-noise ratio of the fluorescent signal of 2 or more.
  • the method may further include adjusting a concentration of the donor strand or the acceptor strand such that the time is within 10 minutes. In this case, the concentration of the donor strand or the acceptor strand may be 10 nM to 10 uM.
  • the base sequence number of the acceptor strand complementary to the docking strand may be 8 or more.
  • the base sequence number of the donor strand complementary to the docking strand may be 6 to 12.
  • the base sequence number of the acceptor strand complementary to the docking strand may be 5 or more. In this case, the number of base sequences of the donor strand complementary to the docking strand may be 3 to 9.
  • the acceptor strand or the docking strand may include two or more fluorescent materials forming fret pairs with each other in each strand.
  • the separate strand may include one or more donor strands having one or more donor fluorescent materials
  • the docking strand may include one or more acceptor fluorescent materials
  • the separate strand may include one or more acceptor strands having one or more acceptor fluorescent materials
  • the docking strand may include one or more donor fluorescent materials
  • the tag strand may include two or more fret pairs formed adjacent to the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the measurement of the fluorescence signal by the frets may be to measure the FRET efficiency defined by the following equation.
  • FRET efficiency (the intensity of light emitted by the acceptor) / (the sum of the intensity of light emitted by the donor and the acceptor)
  • measuring the FRET efficiency may include measuring brightness of light before and after photobleaching of the donor or acceptor.
  • the spacing between the fret pairs may be adjusted so as not to affect the FRET efficiency of each fret pair.
  • an interval between the fret pairs may be at least 5 nm.
  • the reading step may be to read the two or more target materials at the same time by measuring the difference in the FRET efficiency distinguished from each other according to the distance between the fluorescent materials.
  • the reading step may be to read the two or more target materials at the same time by measuring the difference in the emission spectrum by the fret (FRET) generated between different kinds of fluorescent materials.
  • FRET fret
  • the method for detecting a target material may further include measuring a concentration of the target material in the sample from the number of the target materials per unit area of an area for imaging the fluorescence signal.
  • At least one detection probe that specifically binds to a target material and has a docking strand
  • the docking strand may comprise one or more donor fluorescent materials; And at least one acceptor fluorescent substance, wherein a kit for detecting a target substance exhibiting light emission by a fret between the donor fluorescent substance and the acceptor fluorescent substance by excitation of the donor fluorescent substance is provided.
  • the tag strand may include two or more fret pairs formed adjacent to the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the present invention provides a kit for detecting a target material exhibiting light emission by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material by excitation of the donor fluorescent material.
  • a donor having at least one donor fluorescent substance comprising at least one separate strand that complementarily binds to a strand of a target nucleic acid or nucleic acid analog. Strand; And an acceptor strand including at least one acceptor fluorescent material, wherein the target material is detected to exhibit light emission by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material by excitation of the donor fluorescent material
  • a kit is provided.
  • one or more detection probes that specifically bind to a target material and having a tag strand, wherein the tag strand comprises one or more donor fluorescent materials; And at least one acceptor fluorescent substance, wherein a kit for detecting a target substance exhibiting light emission by a fret between the donor fluorescent substance and the acceptor fluorescent substance by excitation of the donor fluorescent substance is provided.
  • the method may further include a substrate for attaching the target material.
  • One or more capture probes may be fixed to the substrate to capture the target material.
  • the capture probe may have a tag strand.
  • the kit for detecting a target substance may further include a bridge strand capable of forming a pair of frets by complementarily binding with a tag strand of the detection probe and a tag strand of the capture probe.
  • 1A to 1K illustrate the principle and characteristics of FRET-PAINT.
  • 3A to 3H show the multiplexing performance of FRET-PAINT.
  • FIG. 6 shows donor strands and acceptor strands in combination with docking strands.
  • 8A shows an acceptor fluorescence signal measured with a camera.
  • 8B is a graph comparing the magnitude of the signal and the magnitude of noise.
  • FIG. 9 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers in accordance with one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 10 schematically illustrates a donor and acceptor labeled on a tag strand according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 11 illustrates an imaging process using a single molecule microscope according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 12 illustrates FRET efficiency measurements of donors and acceptors in accordance with one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 13 illustrates a tag strand labeled with two or more donor-acceptor FRET pairs according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 14 illustrates the case of a donor and acceptor combination of two or more donor-acceptor FRET pairs according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • 16 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers, according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 17 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers in accordance with one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 18 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers, according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • kits for simultaneous detection of multiple biomarkers in accordance with various embodiments of the technology disclosed herein.
  • FIG. 24 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers, according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 25 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers in accordance with one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 26 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of biomarkers according to an embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 27 schematically illustrates a kit for microRNA detection according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 28 illustrates absorbance spectrum and emission spectrum data according to an embodiment of the technology disclosed herein.
  • 29 schematically illustrates the principle of multiple biomarker simultaneous detection according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • 30 is a fluorescence image measured by varying the concentration of the donor strand in accordance with one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 31 exemplarily shows a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 32 shows the result of measuring the difference in the emission spectrum according to the distance between the donor and the acceptor.
  • 33 exemplarily shows a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • 34A to 34C show the results of measuring emission spectra of docking strands labeled with two or more acceptors.
  • 35A and 35B illustrate multiple biomarker detection methods in accordance with one embodiment of the techniques disclosed herein.
  • 36A and 36B illustrate exemplary kits for simultaneous detection of multiple biomarkers, in accordance with some embodiments of the techniques disclosed herein.
  • FIG. 37 exemplarily illustrates a method of determining the type of biomarker using a detection kit including a donor strand and an acceptor strand as shown in FIG. 36B.
  • kits for simultaneous detection of multiple biomarkers in accordance with some embodiments of the technology disclosed herein.
  • 39 exemplarily shows a kit for detecting a microRNA according to one embodiment of the technology disclosed in the present specification.
  • biomarker includes all biomaterials capable of identifying the normal or pathological state of life.
  • fret is meant herein a mechanism by which energy is transferred by resonance of two adjacent fluorescent materials. Specifically, the term refers to a phenomenon in which energy of a fluorescent material excited by light is transferred to another adjacent fluorescent material, and may include all meanings of a conventional fret recognized by those skilled in the art.
  • the term "fret efficiency” refers to representing a different energy transfer efficiency as a value according to a distance between fluorescent materials, using a phenomenon in which energy of a fluorescent material excited by light is transferred to another adjacent fluorescent material. And, it may be to include all the meaning of the conventional fret efficiency recognized by those skilled in the art.
  • the term "donor” refers to a fluorescent material that transmits energy when excited by light, and refers to a fluorescent material that absorbs or emits light having a relatively short wavelength when two or more fluorescent materials are adjacent to each other.
  • acceptor means a fluorescent material that receives energy from an excited donor, and when two or more fluorescent materials are adjacent to each other, it means a fluorescent material that absorbs or emits light having a relatively long wavelength.
  • strand is a chain of a biopolymer or a chain of a polymer synthesized by simulating a biopolymer, wherein the biopolymer may have a single- or double-stranded structure, and includes a nucleic acid, a nucleic acid analog, a polypeptide, or a carbohydrate. do.
  • the nucleic acid comprises deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), and the nucleic acid analogues are peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), morpholino nucleic acid (MNA), glycolic acid (GNA), threose Nucleic acids (TNAs).
  • Recent single-molecule fluorescence microscopy technology has made it possible to observe molecules one by one, and by applying them to biomarker detection, the sensitivity has increased by a factor of 1000 to fg / ml (Nature 473, 484-488, 2011).
  • a fluorescent material is fixed to a molecule to be observed, and a method of distinguishing different types of biomarkers using a fluorescence signal is used.
  • it is used to fix the fluorescent materials of different colors and to distinguish the types of biomarkers using the color difference, but there are about 3 to 4 kinds of fluorescent materials that can be observed by using a conventional image sensor. Therefore, when using a single-molecule fluorescence microscope technology, the sensitivity is increased by about 1000 times as compared to the conventional method to fg / ml, but the type of biomarkers that can be detected is still limited to 3 to 4 kinds.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET refers to a phenomenon in which energy of an excited state of an initially excited donor is transferred to an acceptor.
  • the donor material generally emits shorter wavelengths of light than the acceptor material, the emission wavelength of which overlaps the absorption wavelength of the acceptor.
  • the rate and efficiency of energy transfer depends on the degree of overlap of the donor emission wavelength and the acceptor absorption wavelength, the donor quantum efficiency, the relative arrangement of the donor and acceptor transition dipoles, and the distance between the donor and acceptor. .
  • the docking strand may have two DNA binding sites, which may be the sites for the donor strand and the acceptor strand, respectively.
  • the acceptor's FRET signal is used for single-molecule localization.
  • FRET-PAINT technology allows the acceptor to be excited by FRET, rather than directly, to increase the imager (donor and acceptor) concentration by several tens to hundreds of times, resulting in tens to hundreds of times faster imaging speed compared to DNA-PAINT. Can be.
  • a method for detecting a target substance includes the steps of: a) introducing a sample containing a target material into a substrate; b) specifically binding a detection probe with a docking strand to the target material; c) introducing into said docking strand at least one separate strand complementary to said docking strand, said at least one donor phosphor and at least one acceptor fluorescence in either or each of said docking strand and said separate strand Material is provided; And d) measuring all or part of an emission spectrum by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material to read the target material.
  • step a) a sample containing a target material is introduced into a substrate.
  • the substrate is an area for capturing and observing a target material, and the shape thereof is not particularly limited, but may be in the form of a plate, a spherical particle, a rod structure, and other amorphous structures, and the material may be formed of glass, quartz, plastic, or the like. Can be done.
  • the substrate may be a slide glass or a cover slip in the form of a flat glass.
  • the substrate may be a # 1 or # 1.5 coverslip.
  • the sample is not particularly limited as long as it contains a target substance to be detected, but may be tissue, blood, serum, plasma, saliva, mucosal fluid, urine, and the like. It may be obtained separately from.
  • the target material is not particularly limited as long as it is a detection target of interest, and may be, for example, a metal (Ca, Mg, Pb, etc.), a metal ion, or a biomaterial.
  • the biomaterial may be biomarkers, blood, plasma, serum, body fluids, proteins, peptides, nucleic acids, bacteria, viruses, endoplasmic reticulum, miRNA, exosomes, circulating tumor cells, and the like.
  • the target material may be a biomarker.
  • the techniques disclosed herein can be used to observe cells, tissues, organs, and the like.
  • the technology disclosed herein can be very useful for detecting biomarkers in that it is possible to quickly diagnose diseases by detecting several biomaterials in one test.
  • the biomarker may be used without limitation as long as it is used in a conventional scientific or medical field such as a biological treatment process, a pathogenic process, a measurement or evaluation of a pharmacological process for treatment, and the like, and is not particularly limited.
  • the biomarker may be, for example, a polypeptide, a peptide, a nucleic acid, a protein or a metabolite which can be detected in biological fluids such as blood, saliva, urine, and the like.
  • AFP alpha fetoprotein
  • CA15-3 CA27- 29, CA19-9, CA-125
  • calcitonin calretinin
  • carcinoembryonic antigen CEA
  • CD34 CD99
  • MIC-2 CD117
  • chromogranin cytokeratin (cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), desmin, epipithelial membrane antigen (EMA), Factor VIII, CD31, FL1, glial fibrillary acidic protein (GFAP), gCDFP-15 (gross cystic disease fluid protein) , HMB-45, human chorionic gonadotropin (hCG), immunoglobulin (immunoglobulin), inhibin, keratin (various types of
  • the sample may be diluted with a solution not containing the biomarker, and the concentration of the biomarker included in the sample may vary greatly from fg / ml to mg / ml depending on the type.
  • the biomarker may be diluted in various proportions such that an appropriate number of biomarker molecules is detected in the image sensor.
  • it can be carried out on the same sample diluted in different ratios, and most preferably can be used diluted several times in a weight ratio of 1:10 to 1000.
  • the target material may be attached directly to the substrate or may be introduced to the substrate via a capture probe attached to the substrate. Meanwhile, the substrate may be coated with a suitable polymer including polyethylene glycol (PEG) or acrylamide to prevent unwanted antigens, antibodies, fluorescent substances, etc. from adhering to the surface.
  • a suitable polymer including polyethylene glycol (PEG) or acrylamide to prevent unwanted antigens, antibodies, fluorescent substances, etc. from adhering to the surface.
  • the capture probe is a substance that specifically binds to a target material and fixes it to a substrate.
  • the capture probe may be an antibody or an aptamer, and may be, for example, a capture antibody that can specifically capture and capture a biomarker.
  • Biotin may be introduced to the surface of the capture antibody, and avidin, neutravidin, or streptavidin may be introduced to the substrate to attach the capture antibody to the substrate. have.
  • the biomarker to be detected can be directly attached to the surface of the substrate without the use of capture antibodies for the speed and convenience of the measurement process, and the biomarker molecule is fixed to the surface of the substrate to increase the accuracy of the measurement result.
  • the antibody can be attached via an antigen-antibody reaction.
  • the cover slip When the biomarker is directly attached to the surface of the substrate, for example, the cover slip may be coated with a bead solution, followed by culturing and fixing cells corresponding to the sample.
  • the capture antibody when used by adsorbing the substrate, such attachment may be achieved by diluting the capture antibody with 0.06M carbonate buffer solution or bicarbonate buffer solution having a pH of 9.5, and contacting the dilution solution with the substrate at a constant temperature for a certain time. have.
  • the capture antibody adsorbed on the substrate forms a conjugate with the biomarker in the sample when the sample or processed sample is processed on the substrate. After the conjugate is formed, the non-specifically bound antibody or contaminants are removed. It may be desirable to wash with a washing buffer such as Tween 20 or a cleaning agent such as distilled water for the purpose.
  • a detection probe having a docking strand is specifically coupled to the target material.
  • the detection probe may be an antibody or an aptamer, for example, may tag the docking strand into a detection antibody capable of specifically binding to the biomarker to be detected.
  • the 'antibody' used as the capture antibody and the detection antibody is specifically a monoclonal antibody (including monoclonal antibodies, full-length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies (polyclonal antibodies), multispecific antibodies (eg For example bispecific antibodies), and antibody fragments (eg, other regions of antibodies exhibiting variable regions and desired biological activities).
  • the antibody herein includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and may include all chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • it may include Fab, F (ab) 2, Fab ', F (ab') 2, Fv, diabody (nanobody), nanobody (nanobody) or scFv, more preferably scFv, Fab, Nanobodies and immunoglobulin molecules.
  • Attaching the docking strand to the antibody or aptamer can be carried out by binding a nucleic acid molecule with a conventional protein molecule known in the art.
  • a compound having two different reactors at the same time can be used to perform a binding reaction between a nucleic acid molecule and a protein molecule.
  • SMCC succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • the docking strand attached to the group is reacted with the SMCC and the resultant is reacted with the detection antibody
  • the docking strand can be attached to the detection antibody by reacting with the N-terminus of the detection antibody or an amine group at lysine.
  • the detection antibody may be a primary antibody and a docking strand may be attached to the primary antibody.
  • the detection antibody may be used as a combination of a primary antibody and a secondary antibody, and the docking strand may be attached to the secondary antibody.
  • the primary antibody may be an immunoglobulin that specifically binds to a biomarker and the type of antibody is not limited.
  • anti-tubulin antibodies, anti-Tom20 or anti-Th20 antibodies were used.
  • the secondary antibody means an antibody that binds to a primary antibody bound to a biomarker, and the type of antibody used is not limited. In the examples to be described later, donkey anti-rabbit IgG or donkey anti-rat IgG antibodies were used.
  • step c) at least one separate strand is introduced into the docking strand, which is complementary to the docking strand.
  • At least one donor fluorescent substance and at least one acceptor fluorescent substance may be provided in any one or each of the docking strand and the separate strand.
  • the separate strand may be divided into donor strands, acceptor strands, fret strands, and the like, depending on fluorescent materials attached to the strands, which may be complementarily bonded to the docking strands.
  • the donor strand is a strand having a fluorescent material serving as a donor
  • the acceptor strand is a strand having a fluorescent material serving as an acceptor to receive and excite the energy of the donor fluorescent material.
  • the fret strand may include a donor fluorescent material and an acceptor fluorescent material which form a fret pair with each other in one strand.
  • the separate strand comprises at least one donor strand having at least one donor fluorescent material; And at least one acceptor strand having at least one acceptor fluorescent material.
  • FRET is a phenomenon in which the energy of one fluorescent material (donor) is transferred to another fluorescent material (acceptor) when two different kinds of fluorescent materials are located very close together. This phenomenon can effectively detect a target material. have. In order for the acceptor to emit light, it must receive energy from the donor, and this occurs only when the donor strand and acceptor strand are simultaneously coupled to the docking strand, indicating that the target material is located where the acceptor's fluorescent signal appears. .
  • FIG. 1B illustrates the principle of detecting a target material using the FRET-PAINT technique using the donor strand and acceptor strand of FIG. 1A.
  • the fret occurs, the donor's energy is transferred to the acceptor, darkening the donor and the acceptor shines brightly.
  • the method divides an imager strand of DNA-PAINT into a donor strand and an acceptor strand, wherein a fluorescent signal of a donor, which is obtained by excitation of a fluorescent substance labeled with a donor strand with light of ⁇ ex wavelength, is used as an optical filter. By removing it, the fluorescent signal of the acceptor can be observed. That is, all donor fluorescent materials emit light, but are all removed by the optical filter, and the acceptor fluorescent material to be observed is not directly excited to the light of ⁇ ex wavelength that excites the donor, so that the background noise may be very low.
  • the background noise caused by the donor is negligibly small, so the concentration of the donor strand can be very high, for example, several hundred nM, which has the advantage of being several hundred times faster.
  • the separate strand may include at least one acceptor strand having at least one acceptor fluorescent material
  • the docking strand may include at least one donor fluorescent material.
  • the quantum dots when the quantum dots are introduced into the docking strand as the fluorescent material, photobleaching does not occur in the fluorescent protein, the organic fluorophore, or the like. Therefore, donor strands introduced to solve the photobleaching problem of donor phosphors are unnecessary, and background noise is reduced by not using donor strands, signal-to-noise ratio is high, the composition is simple, the economic efficiency is high, and the analysis process can be simplified. .
  • the docking strand or strand comprising the separate strand may be a nucleic acid, polypeptide, or carbohydrate.
  • the strand may be a nucleic acid in terms of complementary coupling between the docking strand and the separate strand, and easy synthesis and inexpensiveness, and easy attachment of a fluorescent substance to a desired site. It may have a single strand or a double strand that can be selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA and TNA capable of binding.
  • the docking strand is a strand coupled to the detection probe, and imager strands, donor strands and acceptor strands may be complementarily bound to the docking strands.
  • the imager strand may be used when using DNA-PAINT technology, and the donor strand and acceptor strand may be used when using FRET-PAINT technology according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • the base sequences of the imager strands may have different base sequences according to the types of biomarkers to be detected. For example, when binding to two different biomarkers, two imager strands may be used. At least one base may be different. That is, regardless of the number of types of biomarkers, the base sequences of the respective imager strands to be bound may be different according to the types of biomarkers.
  • the donor strand and the acceptor strand may each have a different base sequence according to the type of biomarker to detect.
  • N donor strands and N acceptor strands may be used, and their base sequences may be different. That is, each donor strand has at least one or more bases different from each other, and each acceptor strand that binds to different biomarkers also has at least one or more bases, and the base sequences of each donor strand and the acceptor strand are all different. Can be different.
  • the acceptor strand has the same nucleotide sequence for the entire detection biomarker, or for some biomarkers, the donor strand is different from the nucleotide sequence of the acceptor strand, detecting the biomarker
  • each may have a different base sequence.
  • the base sequences of donor strands that bind to different biomarkers each differ in at least one or more bases, but one acceptor strand having the same base sequence can be used for detection. .
  • the donor strand has the same base sequence for all biomarkers to be detected, or the same base for some biomarkers, the acceptor strand is different from the base sequence of the donor strand, the type of biomarker to detect Each may have a different base sequence. For example, when detecting two different biomarkers, acceptor strands that each bind to different biomarkers may be used to detect one donor strand, although at least one or more bases differ.
  • the docking strand may include a base sequence complementary to the donor strand and the acceptor strand.
  • the "strand" may have various forms such as a general form, a form in which a functional group is introduced to enable the attachment of the fluorescent material, or a form in which the fluorescent material is already attached.
  • the desired fluorescent substance can be attached to a desired position, and several same or different functional groups can be attached to one strand.
  • the distance between the donor and the acceptor can vary and the FRET efficiency can also vary. This property allows for multiple detection of the target material.
  • the fluorescent material is a material that is excited by external energy such as ultraviolet light, electrical energy, heat energy, and the like and converts the energy into light, and may include an organic phosphor or an inorganic phosphor.
  • organic phosphor include Rhodamine, Alexa Fluor dye, fluorescein, FITC (fluorescein isothiocyanate), 5-carboxy fluorescein (FAM), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine ( Cy) dyes, DyLight Fluor and Texas Red
  • examples of the inorganic phosphors include quantum dots.
  • the wavelength of the maximum emission spectrum of the fluorescent material coupled to the donor strand is shorter than the wavelength of the maximum absorption spectrum of the fluorescent material bound to the acceptor strand.
  • the FRET signal intensity between the donor and acceptor two phosphors is related to the distance between the two phosphors in the fret pair.
  • nucleotides comprising four bases, A, T, G and C, pentose and phosphoric acid are linearly long and two strands complementarily bind between base-bases. Any base, pentose, or phosphate of each nucleotide can be attached to any desired functional group or fluorescent material, and the distance between two adjacent bases in the DNA double helix is 0.34 nm, allowing very precise control of the fret pair distance.
  • Specific binding reaction between the target material and the detection probe or the capture probe may be carried out by a binding method by an immune reaction such as a sandwich ELISA or by a specific aptamer binding method.
  • the target material may be detected by reading the target material by measuring a fluorescence signal by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the measurement of the fluorescence signal may be a method of measuring all or part of an emission spectrum by a fret. For example, when classifying target materials by fret efficiency, only a part (mainly peak) of each phosphor spectrum may be measured, and when classifying by spectral shape, the entire spectrum may be measured.
  • Step d) includes detecting a fluorescence signal generated in step c).
  • the fluorescence signal may occur when an imager strand is coupled to a docking strand or a donor strand and an acceptor strand are simultaneously coupled. Specifically, the imager strand is coupled to the docking strand and stays for a predetermined time or is coupled to a donor strand.
  • a fluorescent signal may be generated.
  • the fluorescence signal generated as described above may be detected using a high sensitivity image sensor (EMCCD, sCMOS, iCMOS, etc.).
  • the method for detecting a target material may include removing the at least one or more of the donor strand and the acceptor strand after reading the target material, and then applying a different donor strand or a different acceptor strand to the removed step.
  • the method may further include reading the target materials by type.
  • the donor strand and the acceptor strand may be removed after combining both different strands, and one of the donor strand and the acceptor strand may be used as a common strand without being stably bonded to the docking strand. This involves removing the remaining strands that are not reliably bonded.
  • a donor strand (or acceptor strand or donor strand) which complementarily binds to a docking strand of a target to be observed in order to detect N kinds of targets is detected.
  • the acceptor strands can be repeated N times and washed again.
  • multiple biomarkers may be detected by repeatedly performing the steps c) and d) as many biomarker types as desired for detection.
  • the donor strands and the acceptor strands to which the fluorescent material is bound are combined with the donor strands, and then the generated fluorescence signal is detected.
  • the previously bound strand (s) can then be removed and the same method can be repeated using different strand (s) to detect the fluorescent signal.
  • This process may be repeated several times, preferably, the biomarker may be detected by repeating the number of biomarker types.
  • a donor strand of 9 bases can have 262,144 nucleotide sequences corresponding to 9 squared of 4, which is greater than the number of all proteins in the human body, so that all biomarkers have different docking strands and billions of base sequences. By assigning the acceptor strands all biomarkers can be measured sequentially.
  • the FRET reaction between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material can be measured in various ways.
  • the FRET efficiency or emission spectrum of the fluorescence signal that appears as soon as the donor strand binds to the docking strand is measured.
  • Biomarkers can be detected. It may take some time to detect all biomarkers (several seconds to minutes), because donor strands must be coupled to all docking strands at least once to measure the FRET efficiency or emission spectrum (several seconds to minutes). Markers can be distinguished.
  • the camera looks twice as bright as one point and cannot distinguish the FRET efficiency of each phosphor, but if two phosphors glow one at a time, the exact The location and FRET efficiency can be measured to see what the two biomarkers are. It also has the advantage of detecting multiple FRET efficiencies in one docking strand for multiple detection. If fluorescent materials with multiple FRET efficiencies emit light simultaneously, the respective FRET efficiencies are unknown.
  • the donor may be excited and the fluorescent signal may be measured while the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material are both labeled on the docking strand or both the donor strand and the acceptor strand are combined.
  • all the fluorescent molecules emit light as soon as the donor is excited, so it can be measured in a short time.
  • the distance between the fluorescent molecules is high due to the high concentration of the biomarkers, it may be difficult to accurately measure the overlapped light emitting regions. Because multiple FRET efficiencies cannot be measured at, the number of multiple detections can be reduced.
  • the emission spectrum is determined by the shape of the spectrum there may be no problem in multi-detection.
  • a kit for detecting a target substance comprises a) one or more detection probes specifically binding to the target substance and having a docking strand; And b) at least one separate strand complementary to the docking strand. At least one donor fluorescent substance and at least one acceptor fluorescent substance are provided in any one or each of the docking strand and the separate strand, and the donor fluorescent substance and the acceptor fluorescent substance are excited by excitation of the donor fluorescent substance. Light emission by frets in between can be shown.
  • a substrate for attaching the target material may be further included.
  • An appropriate coating layer may be introduced or surface modified on a substrate to exclude nonspecific binding of other materials other than the target material or to facilitate attachment of the target material.
  • the target material may be introduced in a manner that is captured directly through the capture probe attached directly to the substrate or previously attached to the substrate.
  • the kit for detecting a target substance comprises a) one or more detection antibodies having docking strands bound thereto; And b) one or more donor strands and acceptor strands to which a fluorescent substance is bound, wherein a detection antibody having the docking strands is attached to a biomarker, and the docking strands are attached to the donor strands and the acceptor strands. It may be a kit for detecting the biomarker multiple detection according to the combination of the.
  • the kit comprises: i) a substrate, ii) a capture antibody, iii) a primary detection antibody coupled to a docking strand; Or a primary detection antibody to which the docking strand is not bound and a secondary detection antibody to which the docking strand is bound, and iv) a donor strand and an acceptor strand.
  • a substrate ii) a capture antibody, iii) a primary detection antibody coupled to a docking strand; Or a primary detection antibody to which the docking strand is not bound and a secondary detection antibody to which the docking strand is bound, and iv) a donor strand and an acceptor strand.
  • it may be composed of a substrate, a capture antibody, a primary detection antibody coupled to a docking strand, a donor strand and an acceptor strand.
  • the kit may be an in vitro diagnostic product for detecting biomarkers, for example, a research use only (RUO) or an investigational use only (IUO) in vitro diagnostic (IVD) product.
  • RUO research use only
  • UOU investigational use only
  • IVD in vitro diagnostic
  • a method for detecting a target substance in which the target substance in the sample is a nucleic acid or a nucleic acid analog comprises the steps of: a) introducing a sample containing a nucleic acid or a nucleic acid analog as a target material to a substrate; b) introducing at least one separate strand complementary to the strand of the target material introduced to the substrate, wherein at least one donor fluorescent material and at least one of the strand of the target material and the separate strand Having one acceptor fluorescent material; And c) reading the target material by measuring a fluorescence signal by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the target material is a nucleic acid or a nucleic acid analog, it is equivalent to having a docking strand.
  • the target material may be RNA, miRNA (microRNA), cfDNA (cell-free or circulating free DNA), or ctDNA (circulating tumor DNA) in terms of being able to identify a normal or pathological state of life.
  • the method for detecting a target substance comprises the steps of: a) attaching one or more nucleic acids contained in a sample obtained from an individual to the surface of a substrate; b) binding the donor strand and the acceptor strand together to the nucleic acid of step a); And c) detecting the fluorescence signal generated in step b).
  • detecting the steps b) and c) by removing the pre-bound donor strands and the acceptor strands after detection of a fluorescence signal and combining different imager strands or different combinations of donor strands and acceptor strands.
  • Multiple biomarkers can be detected by repeating as many RNA types as desired.
  • the nucleic acid represents a nucleic acid that can function as a biomarker and may be a detection target, and may preferably be a non-coding RNA.
  • the non-coding RNA is a type of RNA without an amino acid code for a specific protein, and exists in various forms, unlike mRNA for translating a gene sequence, and may be generated through mRNA by-products, digests or separate transcription processes, and chromosomes. It is known to play a role in regulating activity and protein expression.
  • the RNA to be detected includes small RNAs such as miRNA, snRNA, snoRNA, aRNA, siRNA, piRNA, exRNA, scaRNA, and preferably may be micro RNA.
  • microRNA is a small non-expressing RNA molecule composed of about 22 bases, and functions to regulate RNA silencing and gene expression after transcription, which are found in various biological fluids such as blood and urine, Its numerical value changes to attract attention as a biomarker.
  • the target substance is a nucleic acid
  • the antigen cannot be captured by the antigen-antibody reaction. Therefore, the capture probe having a nucleotide sequence complementary to a portion of the nucleic acid to be detected is fixed to the substrate, and the nucleic acid is then complementarily bound to the capture probe. Attach to the surface.
  • the sample may be diluted with a solution containing no nucleic acid, and since the concentration of nucleic acid contained in the sample varies greatly depending on its type, the sample may be diluted in various ratios so that an appropriate number of nucleic acid molecules can be detected in an image sensor.
  • a donor strand and an acceptor strand are bonded together to the nucleic acid of step i).
  • the base sequence of the donor strand and the acceptor strand can be determined so as to complementarily bind to the nucleic acid single-stranded site that is not complementary to the capture probe.
  • the capture probe, donor strand and acceptor strand may be selected from DNA, RNA, PNA, LNA, and the like.
  • the fluorescent signal generated in step ii) is detected.
  • the fluorescence signal may occur when a donor strand and an acceptor strand are simultaneously bound to a single strand of nucleic acid that is not complementarily bound to the capture probe. More specifically, the imager strand binds to a single strand of nucleic acid that is not complementarily bound to the capture probe and stays for a certain time, or the fluorescent substance (donor) and the fluorescent substance bound to the acceptor strand. When the (acceptor) is located very close to a certain time by the nucleic acid, a fluorescent signal may occur.
  • the fluorescence signal generated as described above may be detected using an ultra-sensitivity image sensor (EMCCD, sCMOS, iCMOS, etc.).
  • a kit for detecting a target substance for detecting a nucleic acid or nucleic acid analog as a target substance in a sample includes at least one separate strand that complementarily binds to a strand of a nucleic acid or nucleic acid analog that is a target material.
  • the separate strand is a donor strand having at least one donor fluorescent material;
  • an acceptor strand including at least one acceptor fluorescent material, and the excitation of the donor fluorescent material may indicate light emission by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the kit for detecting a target substance comprises a) one or more donor strands and acceptor strands to which a fluorescent substance is bound and for binding the imager strand or the donor strand and the acceptor strand to a nucleic acid. It may be a kit for detecting a biomarker multiple detection according to.
  • the kit may further comprise a substrate for attaching the nucleic acid.
  • the capture probe having a base sequence complementary to a portion of the nucleic acid to be detected may be fixed to the substrate.
  • the substrate may be surface treated to attach the capture probe.
  • FRET-PAINT is superior to the conventional DNA-PAINT as follows.
  • the same experiment was performed using two FRET pairs (Cy3-Cy5 and Alexa488-Cy5) .
  • the Alexa488-Cy5 FRET pair has a Cynt-Cy5 when the donor strand and the acceptor strand have a gap of 2nt.
  • the FRET pair confirmed that the fluorescence signal was the highest when the gap between the donor strand and the acceptor strand was 6 nt (see Example 1-1 and FIG. 1D).
  • the donor strands and acceptor strands were treated sequentially, and simultaneously treated with the donor strands. It was confirmed that the case of sequentially processing the acceptor strands was more effective for multiplexed imaging (see Examples 1-3, FIGS. 3A-3H).
  • the individual molecules are well separated in the range of 10 pg / mg to 400 pg / ml, and the biomarker concentration can be measured. Overlapping began to confirm that the correct concentration could not be determined. After dilution at an appropriate ratio to approximately 100 pg / ml concentration, the number of molecules was measured and divided by the dilution ratio to determine the biomarker concentration was confirmed that the original biomarker concentration can be accurately measured. It was confirmed that accurate measurement is possible in the range of biomarker concentrations (a few pg / ml to several tens ng / ml) which are widely used at present (see Examples 1-4 and 4A to 4C).
  • using a single-molecule fluorescence microscope and FRET-PAINT system can detect a variety of biomarkers from a very small amount of biological fluid with a 1000 times higher sensitivity than the conventional method, thereby eliminating the problem of conventional biomarker diagnosis. It can be useful for early diagnosis of various diseases including cancer.
  • the donor and acceptor are selected such that the wavelength at which the absorbance of the donor is maximum is shorter than the wavelength at which the acceptor is maximum, and the wavelength at which the donor has maximum emission is shorter than the wavelength at which the acceptor is maximum.
  • energy can be transferred from the donor to the acceptor, and since the wavelength of the maximum absorbance of the donor is shorter than the wavelength of the maximum absorbance of the acceptor, it selectively excites only the donor using excitation light of a specific wavelength. It is possible.
  • the maximum luminescence of the donor is shorter than the maximum luminescence of the acceptor, the fluorescence signal of the donor can be removed using an optical filter, a prism, a diffraction grating, and the like. Can be.
  • R is the distance between the donor and the acceptor
  • R 0 Form radius
  • Equation 2 ⁇ is a constant representing the influence of the dipole orientation, n is a constant representing the refractive index of the medium.
  • ⁇ D is the quantum yield of the donor phosphor, depending on the type of donor phosphor.
  • J DA is a spectral overlap integral, which can be defined as in Equation 3 below.
  • Equation 3 ⁇ A is the extinction coefficient of the acceptor fluorescent material, and F D is the fluorescence emission intensity of the donor fluorescent molecule. Since it depends on the degree of overlap between the emission spectrum of the donor phosphor and the absorption spectrum of the acceptor phosphor, it is an important factor in determining R 0 with ⁇ D.
  • the extinction coefficient of the donor at the wavelength of the excitation light used to excite the donor is at least 3 times, preferably at least 5 times, more preferably 10, than the extinction coefficient of the acceptor.
  • Donors and acceptors can be defined to be more than twice as large. In this case, most acceptors can be excited by energy from donors by frets rather than excitation light. The larger the absorbance ratio of the donor to the acceptor is, the greater the signal-to-noise ratio is because the acceptor is excited by the fret rather than the excitation light. Therefore, the larger the absorption coefficient ratio of the donor to the absorption coefficient of the acceptor is, the more preferable.
  • the FRET efficiency between the donor and the acceptor is preferably 0.05 or more so that the fluorescent signal can be distinguished from the background noise.
  • the donor and acceptor phosphor when observing an acceptor signal as in the target material detection method described above, it is preferable to determine the donor and acceptor phosphor so that the donor and acceptor Forster radius (or Forster distance) is, for example, 0.208 nm or more. .
  • the donor and acceptor may have a donor and acceptor Forster radius (or forster distance) of, for example, 0.83 nm or more. It is desirable to determine the fluorescent material.
  • the FRET efficiency is 0.05 at 0.34 nm when the Forster radius is 0.208 nm or more. It can be abnormal. If the forster radius is smaller than this, the FRET efficiency converges to zero at a distance of 1 bp, making it difficult to observe the acceptor signal. The larger the forster radius, the higher the FRET efficiency at the same distance, and therefore the brighter the acceptor, the larger the forster radius is desirable.
  • the Forster radius is preferably 0.83 nm or more. The larger the Forster radius, the larger the Forster radius is.
  • the gap between the donor strand and the acceptor strand is shorter than the persistence length of the single stranded docking strand. desirable.
  • the distance between the base-base of a DNA double strand is 0.34 nm
  • the distance between the base-base of a single strand is more than 0.5 nm, compared to 50 nm in duration. It is only a few nm.
  • the persistence length is a distance in which a polymer chain such as DNA maintains a linear state and may vary depending on the structure of the polymer chain, the charge, and the concentration of salt in the buffer. If the length of the gap is longer than the length of the single-stranded docking strand, the docking strand can be broken somewhere in the gap, in which case the distance between the donor-acceptor can be much closer than the intended distance, so that the intended fluorescent signal Cannot be obtained, which may cause problems. Therefore, it is desirable that the length of the gap is shorter than the duration of the docking strand so that the docking strand can remain straight.
  • a flexible linker may be placed between the strand and the phosphor when attaching the phosphor to the strand. Fluorescent molecules can be freely rotated by the linker so that a constant brightness can be maintained regardless of the direction in which the observer observes.
  • the linker may include one or more flexible or rotatable repeating units, such as —CH 2 — or —CH 2 CH 2 O—.
  • the linker may have a length of 0.1 nm or more and a maximum of 10 nm or less. As the length of the linker increases, the position at which the fluorescent molecules are observed changes significantly, and thus, when the linker is too long, it may be difficult to distinguish it from nearby target materials. Therefore, it is desirable to limit the length of the linker to 10 nm or less.
  • hydrophilic fluorescent materials such as Alexa and CF
  • hydrophobic fluorescent materials such as Cy and quantum dots
  • hydrophilic fluorescent materials are close enough to interact with each other, only hydrophilic fluorescent materials or hydrophilic fluorescent materials can be used. It is preferable to use a combination of a substance and a hydrophobic fluorescent substance. When the distance between the hydrophobic phosphors is very close, the fluorescence signal may become unstable due to hydrophobic interaction between the two (Cy3-Cy5 in FIG. 1D).
  • a stabilizing material such as Cyclooctatetraene (COT), nitrobenzyl alcohol (NBA), trolox, or the like may be attached or included in the buffer to the fluorescent material itself or near the fluorescent material.
  • COT Cyclooctatetraene
  • NBA nitrobenzyl alcohol
  • trolox or the like
  • a material for removing oxygen may be included in the buffer to prevent photobleaching of the phosphor by oxygen.
  • an optical filter can properly remove the light emission wavelength of the donor to minimize the fluorescence signal from the donor.
  • the wavelength of the optical filter may be controlled such that the signal-to-noise ratio (SNR) of the fluorescent signal is two or more.
  • SNR signal-to-noise ratio
  • the cut-on wavelength of a long-pass filter, the cut-off wavelength of a short-pass filter, the start wavelength of a band-pass or band-rejection filter may be longer than or equal to a wavelength with an acceptor emission spectrum of 0.01 and a donor emission spectrum of 0.01. It may be shorter or equal to the wavelength.
  • ⁇ min may represent a wavelength at which the emission spectrum of the acceptor is 0.01
  • ⁇ max may represent a wavelength at which the emission spectrum of the donor is 0.01.
  • a long-pass dichroic mirror or dichroic filter that passes a wavelength longer than a specific wavelength to remove the donor signal and accept an acceptor signal, or use a short-pass dichroic mirror or dichroic filter that passes a wavelength shorter than a specific wavelength.
  • band-pass dichroic mirrors or dichroic filters can be used that pass or reflect a specific wavelength range.
  • a long-pass dichroic filter that passes a wavelength longer than the cut on wavelength may be described.
  • the cut-on wavelength of the filter is shorter than ⁇ min , the acceptor signal passing through the optical filter may be While the same, the donor signal increases, so the signal-to-noise ratio can be lowered. Therefore, the cut-on wavelength is preferably longer than or equal to ⁇ min . If the cut-on wavelength of the filter is larger than ⁇ max , the donor signal passing through the optical filter is the same while the acceptor signal is reduced, so the signal-to-noise ratio may be lowered. Therefore, the cut-on wavelength is preferably shorter or equal to ⁇ max .
  • the signal-to-noise ratio may be defined as follows.
  • 8A shows an acceptor fluorescence signal measured with a camera.
  • a cross-section is drawn along the white dotted line as shown in FIG. 8B.
  • 8B is a graph comparing the magnitude of the signal and the magnitude of noise.
  • the amplitude of the Gaussian function obtained by fitting this graph to the Gaussian function can be defined as a signal.
  • the histogram of the values of all the remaining pixels without the acceptor fluorescence signal follows the normal distribution.
  • SNR signal to noise ratio
  • the donor strand concentration is greater than or equal to 10 nM, such that the average time required for the donor strand to bind to the docking strand under the optical donor-acceptor fluorescent material combination and optical filter is at least 10 nM.
  • the donor strand concentration such that the signal-to-noise ratio) is 2 or more, may be 10 uM or less.
  • the donor strand In order for the acceptor to signal, the donor strand must be coupled to the docking strand.
  • the average time required for the donor strand to bind to the docking strand is inversely proportional to the concentration of the donor strand around the docking strand, as shown in Equation 4 below.
  • the donor strand In order to accurately detect the target material, the donor strand must be bound to the docking strand at least five times or more, and in consideration of economy, it is preferable that the concentration of the donor strand is 10 nM or more in order to complete the whole measurement within 10 minutes.
  • the concentration of the donor strand is 10 uM or less, preferably 5 uM or less.
  • acceptor strands are retained for a long time after binding to the docking strands, so the acceptor strand concentration is less than 1 uM.
  • the length of the donor strand or acceptor strand it is possible to adjust the time maintained after the coupling to the docking strand. If the binding of the acceptor strands to the docking strands is kept stable for a long time, imaging can be performed quickly when the donor strands are inserted, thereby reducing the detection time. If imaging times are the same, applying a low concentration of donor strand may facilitate biomarker detection.
  • the number of nucleotide sequences complementary to the docking strand is preferably 6 or more and 12 or less for the donor strand and 8 or more for the acceptor strand.
  • donor strands of 7 to 9 nt in length are typically used to complementarily bind to the docking strands, but shorter lengths are possible with higher concentrations of cations in the buffer, and longer lengths with lower cation concentrations.
  • the length of actual complementary binding is 7, but if the mismatch sequence without complementary binding is inserted in the middle, the total length can be made as long as it is expressed as the number of complementary bonds rather than the total length. desirable.
  • the number of base sequences complementary to the docking strand is preferably 3 or more and 9 or less for donor strands and 5 or more for acceptor strands. Since the XNAs are stronger than DNA and RNA, they can be utilized with fewer complementary bonds, thereby reducing the number of complementary sequences.
  • the length of the docking strand is preferably at least as long as the donor strand and acceptor strand can achieve the intended complementary coupling. As described above, if a mismatch sequence or gap (single-stranded DNA portion) is added, the length can be increased as much as the minimum length.
  • the acceptor strand may be made long so as not to remain long or separate after being bound to the docking strand, and the acceptor phosphor itself may be attached directly to the docking strand. Unlike donors, which are always excited by the excitation light and emit light, the acceptor emits light only when the donor strand and the acceptor strand are coupled to the docking strand at the same time, thereby reducing the risk of photobleaching.
  • the acceptor strand When the donor strand is bound to the docking strand, the acceptor strand is already bound to the docking strand, so use a relatively long acceptor strand to increase the probability that the acceptor will shine by FRET and have a shorter donor strand than the acceptor strand. Can be selected.
  • the probability that the acceptor strand is bound to the docking strand is a / (a + b). a may be increased as the acceptor strand length increases, and as the salt concentration increases, b may decrease as the acceptor strand concentration increases. If the probability is 1, then the acceptor signals each time the donor strand joins the docking strand. On the other hand, if the probability is 0.5, then the acceptor will only signal 0.5 when the donor strand is coupled to the docking strand, so the donor strand must combine twice as long to get the same acceptor signal. As a result, the higher the probability, that is, the larger the a or the smaller the b, the shorter the detection time.
  • photobleaching of the acceptor is a concern in conventional cell imaging but photobleaching is unlikely in biomarker detection, so it is desirable to increase a by increasing the acceptor strand length or by attaching the acceptor phosphor directly to the docking strand. Do. It is possible to reduce b by increasing the acceptor strand concentration, but it is not preferable in terms of signal to noise ratio.
  • the DNA since the DNA has a negative charge, the DNA tends to push each other, so it is preferable to put a positive charge in the buffer to offset the DNA.
  • Complementary binding between DNAs results in two or three hydrogen bonds (pulling force) per base, so the longer the base sequence, the more stable the bond.
  • concentration of Na + is 500 mM and the acceptor strand length is 10 nt, the binding is maintained for an average of 40 seconds. The longer the length, the longer the bond can be maintained.
  • PNA has no negative charge unlike DNA, so the binding of PNA-PNA and PNA-DNA is much more stable than the DNA-DNA binding. Therefore, only acceptor strands use PNA or LNA, and docking and donor strands use DNA. You can also use
  • the concentration may vary by 10 to 12 times from 10 ⁇ 15 g / ml to 10 ⁇ 3 g / ml depending on the type of target substance.
  • the solution of the blood diluted to the standard concentration is injected into well 1, the further diluted solution into well 2, and the further diluted solution into well 3 to fix the target material to the substrate.
  • the target material expected to be low is detected in well 1, if the appropriate number of target substances is found, the measurement is finished. If too few target substances are found, the various areas of well 1 are measured and synthesized. For example, if too many target substances are present and cannot be analyzed, try detection in well 2.
  • the measurement is completed when an appropriate number of target substances are found. For example, if too many target substances are present and cannot be analyzed, detection may be attempted in well 3. Or if too many target substances are present and intermolecular overlap is a problem, lower the donor strand concentration, lower the salt concentration in the buffer, or have a mismatch or shorter length than the original donor strand to complement the docking strand. Alternative donor strands with fewer bonds can be added to solve the intermolecular overlap problem.
  • biomarkers can be detected from very small amounts of biological fluids with a sensitivity 1000 times higher than conventional methods, which is useful for early diagnosis of various diseases including cancer. Available.
  • a method of multiple detection of multiple target materials may be provided by measuring fret efficiency using strands having various fret pairs introduced for each target material.
  • a kit for detecting a target substance using a detection probe having a tagged strand labeled with a fluorescent substance specifically binds to the target material and includes at least one detection probe having a tag strand.
  • the tag strand is at least one donor fluorescent material; And at least one acceptor fluorescent material, wherein excitation of the donor fluorescent material indicates light emission by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the tag strand may include two or more fret pairs formed adjacent to the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the kit for detecting a target substance comprises a substrate; Two or more tag strands labeled with a fluorescent substance; And two or more detection antibodies having the tag strand bound thereto, and may be a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers simultaneously determining two or more types of biomarkers using FRET efficiency by the fluorescent material.
  • the fluorescent material may act as a donor or acceptor on a specific base, 3'- or 5'-end, or backbone of the tag strand. Two or more biomarkers can be detected simultaneously by using the measured value of the FRET efficiency measured differently according to the distance between the donor and the acceptor labeled on the tag strand.
  • the detection antibody is a detection probe for detecting a biomarker using an antigen-antibody reaction, and it is preferable to use heterogeneous ones as many kinds of biomarkers to be detected.
  • each detection antibody uses a tag strand labeled with a fluorescent substance.
  • DNA is mainly used as a tag strand, but is not necessarily limited thereto, and preferably, nucleic acid such as DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA, or an analog thereof, It may be a biopolymer such as a polypeptide or a carbohydrate.
  • the "FRET efficiency” is a phenomenon in which energy of a fluorescent material excited by light is transferred to another adjacent fluorescent material, and represents a different energy transfer efficiency according to a distance between the fluorescent materials. It means the value.
  • FRET efficiency (the intensity of light emitted by the acceptor) / (the sum of the intensity of light emitted by the donor and the acceptor)
  • the light intensity of the donor or acceptor may be affected by the distance between the donor and the acceptor, but the donor and acceptor may be labeled on a specific base, 3'- or 5'-terminal, or base skeleton of interest.
  • the FRET efficiency can be controlled.
  • the FRET efficiency is that the acceptor is excited by the light for exciting the donor and the donor is not completely separated by the optical component (ex: dichroic mirror) used to separate the light emitted by the donor and the acceptor.
  • the difference between the detection efficiency of the image sensor according to the wavelength difference between the light emitted by the donor and the acceptor or the donor and the acceptor may be corrected.
  • Detection of the target material using the FRET efficiency can be made, for example, in the following manner. If the interval is 1 when the number of bases present between the donor and the acceptor is 1, the interval between the donor and the acceptor is 1, 2, 3,... Two or more types of tag strands of n are produced. The FRET efficiency for each interval is measured to database the FRET efficiency for the interval. The same kind of tag strand is attached to the same kind of detection antibody, and the different kind of tag strand is attached to the other kind of detection antibody. Then, when the reaction with the sample containing the biomarker, the specific biomarker is combined with a specific detection antibody, at this time, the FRET efficiency is calculated by measuring the intensity of light emitted from the donor and acceptor of each molecule. By comparing the calculated value with the database, the type of detection antibody used for detection can be confirmed, and thus the type of biomarker can be finally confirmed.
  • the interval for distinguishing the FRET efficiency is an integer of 4 or more and 20 or less as described above, there are 17 kinds of tag strands that can be produced by one donor and one acceptor. If there are two pairs of donors and acceptors under the same conditions, there are 289 types, and if there are three pairs, there are 4,913 kinds, and thus, a plurality of biomarkers can be detected using a minimum number of fluorescent materials.
  • the tag strand may be labeled with two or more different fluorescent materials.
  • 9 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers according to one embodiment of the technology disclosed herein. 9, a biomarker is fixed to a substrate, and a detection antibody having a tag strand (detection antibody tag) attached thereto is attached to the biomarker. 9 shows a configuration of a kit including N detection antibodies that specifically bind to N biomarkers and N tag strands attached thereto.
  • kit is configured in this way is that it is not possible to specify the type of biomarker detected if the same FRET efficiency is measured from the tag strand of the detection antibody bound to each biomarker. Therefore, in order to obtain a measure of FRET efficiency that can be distinguished, it is preferable to use different tag strands by the number of biomarkers to be detected.
  • the two or more tag strands may be of different numbers of bases present between the labeled donor and the acceptor. More specifically, the tag strands may be ones having different FRET efficiencies both depending on where the donor and acceptor are labeled. In this case, the tag strand may be labeled with a plurality of donors or acceptors. In this case, the two or more donors may be different kinds of fluorescent materials than the acceptor, and the two or more donors may be different kinds of fluorescent materials. In another case, the two or more acceptors may be a different kind of fluorescent material than the donor, and the two or more acceptors may be a different kind of fluorescent material. For example, as shown in FIG.
  • the tag strand may be labeled with one acceptor and a plurality of donors.
  • the donor and the acceptor are heterogeneous fluorescent materials, and the plurality of donors are preferably different kinds of fluorescent materials.
  • the interval for distinguishing the FRET efficiency is an integer of 4 or more and 20 or less, theoretically, there are 17 tag strands that can be produced with one FRET efficiency.
  • a tag strand consisting of four donors and one acceptor is manufactured, a total of four FRET efficiencies between donor 1-donor 2, donor 2-donor 3, donor 3-donor 4, and donor 4-acceptor
  • FIG. 11 illustrates a process of measuring FRET efficiency from a fluorescent material labeled on a tag strand configured as shown in FIG. 10, and schematically illustrates a principle of imaging a fluorescent material using a single molecule microscope.
  • the brightness of the light is observed using a single molecule fluorescent microscope as shown in FIG.
  • molecules located within about 300 nm by diffraction of light may be observed as one point without being distinguished from each other. Therefore, even if several fluorescent materials are labeled on one tag strand, the fluorescent materials arranged so that the total distance is 300 nm or less appear as one point.
  • an optical component ex: dichroic mirror reflecting or passing only light of a specific wavelength range separates the emitted light according to the wavelength to change the brightness of the specific fluorescent material. It can be measured.
  • the left image of FIG. 11 schematically illustrates a method of outputting and checking four kinds of fluorescent materials (Cy2, Cy3, Cy5, and Cy7) on one screen in one camera, and the right image of FIG. This is a schematic of how to image with different cameras.
  • the method described above may be used as a method of imaging the FRET efficiency generated by the donor and the acceptor, and there is no particular limitation, but specifically, the donor and acceptor Imaging light intensity is desirable in terms of analysis time.
  • FIG. 12 shows the results of imaging by the above-described method using tag strands labeled with Cy3, Cy5 donors and Cy7 acceptors.
  • the brightness was measured in the same manner as the left image of FIG. 11.
  • imaging results in the order of Cy3, Cy5, Cy7 from the left most were confirmed through one monitor.
  • Cy5 is excited first, energy is transferred to Cy7 by FRET, and Cy7 can also emit light, so that nothing appears in the region of Cy3. And bright spots are observed only in the region of Cy7.
  • the distance can be confirmed by measuring the FRET efficiency between Cy5 and Cy7 from the brightness ratio of each point.
  • Cy3 when irradiating a green laser, Cy3 is excited, and energy is transferred to Cy5 and Cy7 by FRET and both light is emitted. In this case, the distance between Cy3 and Cy5 can be checked using the FRET efficiency between Cy5 and Cy7 identified through the previous case.
  • the multiple biomarker simultaneous detection kit may have a configuration in which two or more pairs of FRET pairs composed of donor-acceptors are labeled as shown in FIGS. 13 and 14.
  • each FRET pair is more preferably labeled 5 nm or more apart.
  • the tag strand may include two or more FRET pairs composed of a donor and an acceptor.
  • the two or more FRET pairs may have different intervals between the donor and the acceptor, and preferably, in consideration of the error range and noise that may occur in the measurement, the gaps may be measured to sufficiently distinguish the FRET efficiency. This may be different.
  • each of the labeled acceptors may use the same or different kinds of donors, but it is preferable that the donors are different from each other.
  • the labeled donors may be the same or different types from each other, but preferably different types from the acceptors.
  • the donors and acceptors of the FRET pair may be combined in the following four cases.
  • the donors of the FRET pair may be the same fluorescent material and the acceptor may be the same fluorescent material.
  • the donors of the FRET pair may be different fluorescent materials from each other, and the acceptors may be the same fluorescent materials from each other.
  • the donors of the FRET pair may be the same fluorescent material and the acceptors may be different fluorescent materials from each other.
  • the donors of the FRET pair may be different fluorescent materials from each other, and the acceptors may be different fluorescent materials from each other.
  • Fig. 13 shows the case of i) as an example.
  • donor 1 and donor 2 are labeled with a fluorescent substance A
  • acceptor 1 and acceptor 2 are labeled with a fluorescent substance B.
  • each donor and acceptor are labeled with the same fluorescent material, in this case all four donors and acceptors are adjacent to affect the FRET efficiency of the FRET pair consisting of each donor-acceptor. Accordingly, as shown in FIG. 13, when labeling two or more of the same donor and acceptor on one tag strand, each FRET pair is preferably labeled at least 5 nm apart.
  • FIG. 14A shows the case of ii), wherein donor 1 of FIG. 14A is labeled with a fluorescent material A, and donor 2 is labeled with a fluorescent material B.
  • FIG. 14A both acceptor 1 and acceptor 2 are labeled with the same fluorescent substance C, and the figure illustrates a case where the same species of acceptor is labeled on two pairs of FRET pairs labeled on one tag strand.
  • Fig. 14B shows the case of iii), in which both donor 1 and donor 2 of Fig. 14B are labeled with the same fluorescent substance A, acceptor 1 is fluorescent substance B, and acceptor 2 is fluorescent substance C. It is labeled.
  • FIG. 14C shows the case of iv), wherein donor 1 is labeled with fluorescent material A, donor 2 is labeled with fluorescent material B, acceptor 1 is labeled with fluorescent material C, and acceptor 2 is labeled with fluorescent material D.
  • tag strands labeled with a fluorescent substance is described.
  • the first FRET pair of donor 1 -acceptor 1 and the second FRET pair of donor 2 -acceptor 2 are both labeled at a predetermined distance from each other. This is to minimize the influence of adjacent FRET pairs, as described above with reference to FIG. 13.
  • the spacing between donors and acceptors of the first FRET pair and the second FRET pair may be the same or different.
  • the FRET efficiency of the first FRET pair and the second FRET pair is i) a, b and the tag strands ii) b, respectively. If there is a tag strand of a, since the tag strands of i) and ii) cannot be distinguished from each other, only one of the tag strands of i) or ii) may be used.
  • Tag strand may include two or more FRET pairs, the configuration may be as described above. That is, the tag strand may be implemented similar to that shown in FIG. 13 and may be the same as the configuration of FIG. 14A, 14B, or 14C.
  • the fluorescent material is in a photobleached state in which light can no longer emit light. Once light bleached, the light intensity changes. In this case as well, by measuring and comparing the brightness of light before and after photobleaching, FRET efficiency on each donor-acceptor can be measured.
  • the basic principle of measuring FRET efficiency by comparing the brightness before and after photobleaching is as follows.
  • the donor becomes photobleached, the donor no longer emits light or transmits energy to the acceptor by the photobleaching, and the acceptor cannot receive energy from the donor, so that the light intensity of both the donor and the acceptor Will decrease.
  • the donor does not transfer energy to the acceptor, so all energy is used to emit light, which increases the donor's brightness and decreases the acceptor's brightness.
  • the multi-biomarker simultaneous detection kit may further comprise a capture antibody.
  • FIG. 16 schematically shows a kit according to an embodiment of the technology disclosed herein including a capture antibody, in which case the capture antibody may be previously attached to the substrate, or may be attached during detection. .
  • the capture antibody may be a tag strand is coupled.
  • the tag strand coupled to the capture antibody may be made of the same or similar basic skeleton as the tag strand (named “detection antibody tag”) coupled to the above-described detection antibody,
  • the tag strand may preferably be a nucleic acid such as DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA, or an analog thereof, a biopolymer such as a polypeptide or a carbohydrate.
  • it may be configured as shown in Figure 17, but is not particularly limited.
  • the multi-biomarker simultaneous detection kit may further comprise a bridge strand.
  • the bridge strand preferably uses the same or similar basic skeleton as the above-described detection antibody tag and capture antibody tag, and more preferably, it uses a single strand of nucleic acid having a nucleotide sequence.
  • the bridge strand may be complementary to the capture antibody tag bound to the detection antibody tag and the capture antibody.
  • some nucleotide sequences of the bridge strand are complementary to some nucleotide sequences of the capture antibody tag, and others are complementary to some nucleotide sequences of the detection antibody tag, A portion of the bridge strand complementarily binds to the detection and capture antibody tags, respectively, to form two different double-stranded nucleic acids. This structure can be represented as shown in FIG.
  • the bridge strand may be labeled with a donor or acceptor on a specific base, 3'- or 5'-end, or backbone.
  • the fluorescent material serving as a donor or acceptor may be labeled on a specific base of the bridge strand to measure FRET efficiency.
  • the donor or acceptor can be labeled as follows in order to combine the capture antibody tag, detection antibody tag and bridge strand to measure FRET efficiency.
  • the donor and the acceptor are preferably labeled with different fluorescent materials.
  • the types of donors labeled on the capture antibody tag, the detection antibody tag, or the bridge strand may be the same or different from each other, and are labeled on the capture antibody tag, the detection antibody tag, or the bridge strand.
  • the types of acceptors can also be the same or different.
  • the capture antibody 1, the detection antibody 1 and the bridge strand 1 are used to detect the biomarker 1, and the tag binding to the bridge strand 1 is the capture antibody tag 1 and Assume that it is detection antibody tag 1.
  • donor 1 is labeled on any base of capture antibody tag 1
  • acceptor 1 is labeled on any base of the binding site of the bridge strand 1 to capture antibody tag 1 to achieve a desired FRET efficiency.
  • donor 1 and acceptor 1 are labeled, or donor 2 and acceptor 2, which are labeled differently, in such a manner that the binding site of detection antibody tag 1 and bridge strand 1 with detection antibody tag 1 becomes the desired FRET efficiency. May be a mark.
  • donor 1 and acceptor 2 may be labeled, or donor 2 and acceptor 1 may be labeled, but donor 1 and acceptor 1 are different fluorescent materials, and donor 2 and acceptor 2 should be different fluorescent materials. do.
  • a method of detecting a target substance using a detection probe having a tagged strand labeled with a fluorescent substance comprises the steps of: a) introducing a sample containing a target biomaterial to a substrate; b) specifically binding a detection probe having a tag strand to the target biomaterial; c) the tag strand comprises at least one donor fluorescent material; And at least one acceptor fluorescent material; And d) reading the target material by measuring a fluorescence signal by a fret between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the tag strand may include two or more fret pairs formed adjacent to the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material.
  • the measurement of the fluorescence signal by the frets may be a method of measuring the FRET efficiency.
  • the measurement of the FRET efficiency may include measuring brightness of light before and after photobleaching of the donor or acceptor.
  • the spacing between the fret pairs may be adjusted so as not to affect the FRET efficiency of each fret pair.
  • the spacing between the pairs of frets is preferably at least 5nm.
  • a method of simultaneously detecting multiple biomarkers includes attaching two or more biomarkers to a substrate; Binding each of the two or more biomarkers to at least two detection antibodies to which a tag strand (detection antibody tag) labeled with a fluorescent substance is bound; And measuring the FRET efficiency from the fluorescence signal generated by the coupling.
  • the biomarker concentration in the sample may be measured from the number of biomarkers per unit area after simultaneously determining the types of the biomarkers by using the FRET efficiency by the fluorescent material.
  • the fluorescent material may act as a donor or acceptor on a specific base, 3'- or 5'-end, or backbone of the tag strand.
  • the fluorescent material serving as a donor or acceptor may be labeled on a specific base of the tag strand to measure FRET efficiency.
  • the multi-biomarker simultaneous detection method may be a detection method using the aforementioned multi-biomarker simultaneous detection kit, and may include a method described below.
  • a step of preparing a FRET efficiency database to be described later may be preceded.
  • the types of biomarkers can be confirmed by measuring the database of distinguishable FRET efficiency in advance and comparing the measured FRET efficiency measured values after the reaction.
  • the FRET efficiency database can be produced by the following process.
  • different fluorescent materials A and B are used as donors and acceptors, respectively, and A and B are labeled on specific bases on a DNA base skeleton, and heterogeneous DNA is produced as necessary.
  • 50 types are required on the database, 50 types of DNA are prepared in which the distances between labeled A and B are all different.
  • one end of each DNA is attached to a substrate and a binding affinity material to the substrate, it can be fixed to the substrate.
  • the donor and acceptor used are commercially available fluorescent materials, such a production process may be omitted, and commercially available DNA may be used with the donor and acceptor attached thereto.
  • the wavelength of the maximum value of the emission spectrum of the fluorescent material used as the donor is shorter than the wavelength of the maximum value of the absorption spectrum of the fluorescent material used as the acceptor.
  • the DNA having a distance of 1 is fixed to the substrate and the FRET efficiency of the distance is measured. Subsequently, the same procedure as described above is repeated from the DNA having a distance of 2 to obtain a FRET efficiency reference value, which is then databased by distance.
  • the distance between the donor and acceptor of the tag strand used for detection can be known, and the type of the biomarker detected therefrom You can see right away.
  • the FRET efficiency of all distances may not be distinguishable. For example, if the FRET efficiency at distance 1 is 0.95 (average) ⁇ 0.05 (error) and the FRET efficiency at distance 2 is 0.94 ⁇ 0.05, distance 1 and 2 cannot be distinguished by FRET efficiency. . Therefore, when detecting the actual biomarker, it is preferable to use only the distance in which the FRET efficiency is clearly distinguished among the values of the database.
  • a step of injecting a sample including the biomarker to detect the biomarker and attaching the biomarker to the substrate may be performed.
  • the multiple biomarker simultaneous detection method may further comprise attaching the capture antibody to the substrate.
  • the capture antibody may be a tag strand (capture antibody tag) is combined.
  • a method of adsorbing a capture antibody to a substrate is, for example, by adsorbing the capture antibody by diluting the capture antibody with a 0.06 M carbonate buffer solution or a bicarbonate buffer solution having a pH of 9.5, and contacting the diluted solution with the substrate for a predetermined time. It may be to. Alternatively, the surface of the substrate is coated with biotin-bound polyethylene glycol (PEG) or bovine serum albumin (BSA), streptavidin is bound, and then the biotin-bound capture antibody is bound thereto for adsorption. It may be.
  • PEG polyethylene glycol
  • BSA bovine serum albumin
  • the capture antibody adsorbed on the substrate processes the sample or the processed sample on the substrate
  • the capture antibody forms a conjugate with the biomarker included in the sample.
  • the detection method comprises the steps of combining the capture antibody tag and the bridge strand; And it may further comprise the step of coupling the detection antibody tag and the bridge strand.
  • the bridge strand may include a base sequence complementary to the base sequence of the tag strand and the capture antibody tag.
  • some nucleotide sequences may include nucleotide sequences complementary to the nucleotide sequences of the tag strands, and others may include nucleotide sequences complementary to the capture antibody tags.
  • the scope of the bond is not particularly limited.
  • detection antibody tag may be equally applied to the capture antibody tag, and may be similarly or similarly applied to the kit and the detection method including the capture antibody.
  • biomarker detection method according to an embodiment of the technology according to the present specification has the effect of simultaneously detecting up to 1000 biomarkers, including biomarkers present in extremely small amounts of 1fg / ml, and detecting And the time required for analysis is very short.
  • kits and detection method for the simultaneous detection of multiple biomarkers to simultaneously determine the N biomarkers by using the fret efficiency by the fluorescent material.
  • the kit comprises a donor strand; And an acceptor strand having two or more acceptor fluorescent materials forming a fret pair with each other, wherein the two acceptor fluorescent materials serve as donors and acceptors in the acceptor strand.
  • the acceptor strand in this case will be referred to as 'fret strand'.
  • a kit capable of simultaneously detecting N biomarkers by using a measurement of fret efficiency measured by two or more fluorescent materials labeled on a docking strand or a fret strand and a donor labeled on a donor strand. And a detection method is provided.
  • the multi-biomarker simultaneous detection kit is a substrate; N docking strands attached to N detection antibodies; And a donor strand that complementarily couples with the N kinds of docking strands.
  • the docking strand or donor strand comprises a fluorescent material. By measuring the fret efficiency by the fluorescent material it is possible to determine the N biomarkers at the same time.
  • the kit may further comprise a fret strand labeled with a fluorescent material.
  • the fret strand may be complementary to the N type of docking strand.
  • the fluorescent material will act as a donor or acceptor on a particular base, 3'- or 5'-end, or backbone of the docking strand, donor strand or fret strand. Can be.
  • the kit may further comprise a capture antibody.
  • Simultaneous detection of multiple biomarkers includes attaching N biomarkers to a substrate; Binding each of the N detection antibodies to which the N docking strands are attached, respectively, to the N biomarkers; Coupling donor strands to the N kinds of docking strands, respectively; And measuring fret efficiency generated by the fluorescent material included in the docking strand or the donor strand. After determining the type of the N biomarkers using the fret efficiency, the biomarker concentration is measured from the number of biomarkers per unit area.
  • the detection method may further comprise the step of binding a fret strand (FRET strand) labeled with a fluorescent material to the N kinds of docking strand.
  • the fret strand may be complementary to the N kinds of docking strands.
  • the detection method may further comprise attaching a capture antibody to the substrate.
  • Detection of the target material using the FRET efficiency can be made, for example, in the following manner. If the interval is 1 when the number of bases present between the donor and the acceptor is 1, the interval between the donor and the acceptor is 1, 2, 3,... Two or more kinds of FRET pairs made into n are produced. The fret efficiency for the n-type fret pairs is measured and the fret efficiency for the interval is databased. The same kind of detection strand is attached to the same kind of detection antibody, and the other kind of detection antibody is attached to the other kind of docking strand. N species of fret pairs may be labeled directly on the docking strand.
  • the fret efficiency is calculated by measuring the intensity of light emitted from the donor and acceptor of each molecule. For example, when a donor strand labeled with a fluorescent substance acting as donor 1 binds to the docking strand, fret efficiency may be measured by a pair of frets composed of donor 2 and an acceptor that absorbs light from the excited donor 1. .
  • the fret pair is labeled on the fret strand and not on the docking strand.
  • fret efficiency can be measured at the moment when both the donor strand and the fret strand are coupled to the docking strand.
  • the type of detection antibody used for detection can be confirmed, and thus the type of biomarker can be finally confirmed.
  • kits for simultaneous detection of multiple biomarkers in accordance with various embodiments of the technology disclosed herein.
  • a configuration of a kit including a detection antibody, a docking strand attached to the detection antibody, and a donor strand complementary to N kinds of docking strands is exemplarily illustrated.
  • the donor strand is labeled with a donor 1 fluorescent substance
  • the docking strand is labeled with a pair of frets composed of donor 2 and acceptor fluorescent substance.
  • the fret efficiency can be measured at the moment when the donor strand is coupled to the docking strand.
  • the kit may further comprise a fret strand.
  • the fret strand is used, even if some of the fluorescent material is photobleached, the donor strand and the fret strand labeled with the unbleached fluorescent material have the advantage of measuring the fret efficiency through the process of repeating the binding and separation to the docking strand.
  • a configuration of a kit including a detection antibody, a docking strand attached to the detection antibody, a donor strand complementary to N kinds of docking strands, and a fret strand complementary to a specific docking strand are exemplary. Is shown.
  • the donor strands are labeled with a donor 1 fluorescent material
  • the fret strands are labeled with a pair of frets composed of donor 2 and acceptor fluorescent material. In this case, fret efficiency can be measured at the moment when both the donor strand and the fret strand are coupled to the docking strand.
  • an exemplary kit includes a detection antibody, a docking strand attached to a detection antibody, a donor strand complementary to N kinds of docking strands, and a fret strand complementarily binding to a specific docking strand.
  • the donor strand is labeled with a donor 1 fluorescent substance
  • the fret strand is labeled with a pair of frets composed of donor 2, donor 3 and acceptor fluorescent substance.
  • FIG. 22 there is shown a configuration of a kit including a detection antibody, a docking strand attached to the detection antibody, and a donor strand complementary to the N kinds of docking strands.
  • a donor strand is labeled with a donor 1 fluorescent material
  • the docking strand is labeled with a pair of frets composed of donor 2 and acceptor fluorescent material.
  • the docking strand attached to the detection antibody 1 is labeled far away from the donor 2 and the acceptor so as to have a low fret efficiency
  • the docking strand attached to the detection antibody N is labeled close to the donor 2 and the acceptor to have a high fret efficiency.
  • N kinds of docking strands and N kinds of fret pairs that differ by the number of biomarkers to be detected.
  • the N kinds of docking strands may be different in the number of bases present between the two or more fluorescent substances to be labeled. More specifically, the N type of docking strand may be one in which a pair of frets having different fret efficiencies are labeled. When two or more fluorescent materials are labeled on the fret strand, the N fret strands may be different in the number of bases present between the two or more fluorescent materials to be labeled. More specifically, the N kinds of fret strands may be labeled with fret pairs having different fret efficiencies. In this case, at least two fluorescent materials labeled on the docking strand or the fret strand may act as donors or acceptors.
  • FIG. 23 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of N biomarkers according to another embodiment of the technology disclosed in this specification.
  • a kit including a detection antibody, a docking strand attached to a detection antibody, a donor strand complementary to N kinds of docking strands, and a fret strand complementary to a specific docking strand are exemplary.
  • the donor strand is labeled with a donor 2 and an acceptor at a distance between the donor 1 and the acceptor N so as to have a low fret efficiency in the fret strand 1, in which the donor 1 fluorescent material complementarily binds to the docking strand attached to the detection antibody 1.
  • the fret strand N which is complementary to the strand, is labeled closely with donor 2 and the acceptor to have a high fret efficiency.
  • the configuration and principle are the same as in FIG. 2 except that the fret pair is labeled on the fret strand rather than the docking strand.
  • a kit includes a detection antibody, a docking strand attached to the detection antibody, a donor strand complementarily binding to N kinds of docking strands, and two fret strands complementarily binding to a specific docking strand. Illustrated illustratively.
  • the donor strand is labeled with a donor 1 fluorescent substance
  • the fret strands 1-1 and 1-2 which are complementarily bound to the docking strand attached to the detection antibody 1
  • Each fret pair is preferably labeled so that the fret efficiency is different.
  • frit strands having the same fret efficiency may have the same base sequence.
  • one fret strand can complementarily bind to several kinds of docking strands.
  • three fret strands with fret efficiencies 0.25, 0.5, and 0.75 are designed, biomarker 1 has fret efficiencies 0.25 and 0.5, biomarker 2 has fret efficiencies 0.25 and 0.75, and biomarker 3 has frets Designed with efficiency 0.5 and 0.75, fret strands with a fret efficiency of 0.25 can complementarily bind to docking strands of biomarker 1 and biomarker 2, and fret strands with a fret efficiency of 0.5 are biomarker 1 and biomarker 3
  • the frit strands having a fret efficiency of 0.75 can complementarily bind to the docking strands of biomarker 2 and biomarker 3.
  • the fret strands complementarily bonded to the N kinds of docking strands may be N or less.
  • FIG. 25 schematically illustrates a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers, according to another embodiment of the technology disclosed herein.
  • a configuration of a kit including a detection antibody, a docking strand attached to the detection antibody, a donor strand complementary to N kinds of docking strands, and a fret strand complementary to a specific docking strand are exemplary. Is shown.
  • the donor strand is labeled with a donor 1 fluorescent substance
  • the fret strand 1 which complementarily binds to the docking strand attached to the detection antibody 1, is labeled with a donor 2 and an acceptor fret pair.
  • the docking strand is configured such that the same donor strand and the fret strand can be complementarily coupled to two or more, so that the donor strand and fret strand at the same time the at least one or more coupling sites, frit efficiency Since can be measured, it is possible to analyze more than two times faster than the configuration as shown in FIG.
  • the docking strand or fret strand may be labeled with a plurality of donors or acceptors.
  • the two or more donors may be different kinds of fluorescent materials than the acceptor, and the two or more donors may be different kinds of fluorescent materials.
  • the two or more acceptors may be a different kind of fluorescent material than the donor, and the two or more acceptors may be a different kind of fluorescent material.
  • a plurality of docking strands may be attached to one detection antibody.
  • the docking strands to be attached are the same species, and the donor strands and fret strands that are bonded to each docking strand are also the same. This configuration is as shown schematically in FIG.
  • FIG. 26 there is shown a configuration of a kit including a detection antibody, a docking strand attached to the detection antibody, a donor strand complementary to N kinds of docking strands, and a fret strand complementary to a specific docking strand.
  • two or more docking strands may be attached to one detection antibody.
  • a donor strand is labeled with a donor 1 fluorescent substance
  • a fret strand 1 which complementarily binds to a docking strand attached to the detection antibody 1 is labeled with a donor 2 and an acceptor fret pair.
  • the fret efficiency can be observed, so that the analysis can be performed more than twice as fast as the configuration shown in FIG. That is, when using the kit configured as shown in FIG. 26, an effect similar to that of FIG. 25 can be obtained. The same effect can also be obtained when the fret pair is labeled on the docking strand rather than the fret strand.
  • the kit may be a kit for detecting multiple biomarkers simultaneously by combining two or more of the components shown in FIGS. 25 to 26, and may be used for simultaneous detection of multiple biomarkers.
  • a kit for simultaneous detection of multiple biomarkers may be used for detecting micro RNA, as shown in FIG. 27.
  • FIG. 27 a configuration of a kit for detecting nucleic acids such as DNA, RNA, and the like including microRNA is illustrated.
  • the N-type nucleic acid to be detected is fixed to the substrate by attaching a binding-friendly material to the coating material on the substrate at one end of the N-type nucleic acid to be detected or by coating a substrate complementary to a portion of each nucleic acid on the substrate. Since the nucleotide sequence of the N kinds of nucleic acids to be detected is determined, each of the nucleic acids can be determined using the N kinds of donor strands and fret strands complementary thereto.
  • FIG. 28 illustrates data obtained by measuring absorption spectra and emission spectra of donors 1 (Alexa Fluor 488), donors 2 (Cy5), and acceptors (Cy7) according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 28A shows absorbance spectra of fluorescent materials.
  • the vertical black dashed line in (a) represents the 488 nm wavelength used to excite donor 1, where donor 1 is excited, but donor 2 and acceptor are not excited.
  • donor 2 and acceptor can receive light only when energy is received from donor 1 by the fret, so donor strand labeled donor 1 must be coupled to the docking strand to measure fret efficiency of the fret pair.
  • fret strands When fret strands are used, donor strands and fret strands must be coupled to the docking strands simultaneously to measure the fret efficiency of the fret pair.
  • Figure 28 (b) shows the emission spectrum of the fluorescent material.
  • the brightness of donor 2 is measured by adding the intensity of light in the wavelength band between the left dotted line and the right dotted line using a dichroic mirror based on the wavelength indicated by the black vertical dotted line in (b).
  • the fret efficiency of a pair of frets can be calculated by adding the intensity of light in the wavelength band and measuring the brightness of the acceptor. In this case, it is preferable to make the fret efficiency between donor 1 and donor 2 close to 1, remove the signal of donor 1 with an optical filter, and measure only the light intensity of donor 2 and acceptor.
  • the fret efficiency between donor 1 and donor 2 is adjusted, and the light intensity of donor 1 and donor 2 is measured. Multiple biomarkers can be detected by calculating the fret efficiency.
  • 29 schematically illustrates the principle of multiple biomarker simultaneous detection according to one embodiment of the technology disclosed herein.
  • a buffer including a donor strand is included. Filling the well with) binds the donor strands complementarily to the docking strands.
  • fret efficiency can be measured and multiple biomarkers can be determined.
  • the fret efficiency can be calculated by measuring the intensity of light for each wavelength band using a dichroic mirror or by measuring the relative spectral size of the fluorescent materials using a prism or a grating.
  • FIG. 29 illustrates a method of measuring the intensity of light emitted by donor 2 and acceptor using a dichroic mirror.
  • (a) shows a state in which two biomarkers 1 and 2 are fixed to a substrate.
  • Biomarker 1 binds to detection antibody 1 with docking strand 1 attached thereto, and biomarker 2 detects antibody 2 with docking strand 2 attached thereto.
  • (b) shows a state in which donor strands are bonded to docking strand 2 so that a pair of frets shines. At this time, the frit efficiency of the biomarker 2 is calculated by measuring the brightness of the donor 2 and the acceptor.
  • (c) shows a state in which the donor strands are separated from the docking strand 2 so that the fret pair does not emit light
  • (d) shows a state in which the donor strands bind to the docking strand 1 and the fret pair emits light.
  • the frit efficiency of the biomarker 1 is calculated by measuring the brightness of the donor 2 and the acceptor.
  • (e) represents a state in which the donor strands are separated from the docking strand 1 so that the fret pair does not emit light
  • (f) represents a state in which the donor strands recombine to the docking strand 1 and the fret pair emits light.
  • the fret efficiency of the biomarker 1 is calculated by measuring the brightness of the donor 2 and the acceptor. After the fret efficiency of all the biomarkers in the observation area is maintained at least once, the biomarker concentration is determined from the number of biomarkers per unit area by determining the type of biomarker using the fret efficiency.
  • the time taken for the donor strand to detach after binding to the docking strand can be controlled.
  • measurement time can be shortened by making donor strands couple to most docking strands.
  • shortening this time it is possible to prevent the donor strands from being bonded to most of the docking strands. If a donor strand is temporarily coupled to one docking strand to emit light, most of the docking strands present in the vicinity do not emit light so that the fret efficiency can be measured without interference from other fret pairs.
  • the position of the fret pair can be measured with high precision of less than 10 nm.
  • this allows a large number of biomarkers to be measured simultaneously on one screen, resulting in a high dynamic range.
  • This may be equally applied to fret strands. At this time, it is preferable that the time for separating the donor strand is short within several seconds, and the time for separating the fret strand is longer than several seconds.
  • the rate at which the donor strand or the fret strand binds to the docking strand is proportional to the concentration of the donor strand or the fret strand, the higher the concentration, the faster the analysis speed.
  • 30 is a fluorescence image measured by varying the concentration of the donor strand in accordance with one embodiment of the technology disclosed herein. As shown in FIG. 28B, some of the donor 1 spectrums have a section overlapping with a part of the donor 2 spectrum, and these overlapping sections affect the brightness measurement of the donor 2. 30 is a screen measuring the brightness of the donor 2 through the imaging camera, the concentration of the donor strand present in the buffer (a) is 100 nM, (b) is 500 nM, (c) is 1000 nM Image of when As shown in FIG. 30, as the concentration of donor strands increases, the background noise of the donor 2 image increases, which degrades the accuracy of donor 2 brightness measurement. In other words, the higher the donor strand concentration, the higher the analysis speed, but the lower the accuracy of fret efficiency measurement, the concentration of the donor strand included in the buffer is preferably 1 nM to 1 uM to satisfy both speed and accuracy.
  • the donor strands may be coupled as many as the number of fret strands.
  • the labeled donors may be the same or different from each other, but it is preferable that the labeled donors are different from the acceptors.
  • the donors and acceptors labeled on the fret strands may be combined in the following four cases.
  • the donors labeled on the plurality of fret strands may be the same fluorescent material and the acceptors may be the same fluorescent material.
  • the donors labeled on the plurality of fret strands may be different fluorescent materials from each other, and the acceptors may be the same fluorescent materials from each other.
  • the donors labeled on the plurality of fret strands may be the same fluorescent material and the acceptors may be different fluorescent materials from each other.
  • the donors labeled on the plurality of fret strands may be different fluorescent materials from each other, and the acceptors may be different fluorescent materials from each other.
  • the fluorescent material may be one that acts as a donor or acceptor on a specific base, 3'- or 5'-end, or backbone of the strand.
  • the fluorescent material acting as a donor or acceptor may be labeled on a specific base of the docking strand, the donor strand or the fret strand to measure fret efficiency.
  • sample used in the technology disclosed herein may be selected from the group consisting of blood, plasma, serum, saliva, tissue fluid and urine, but may include a biomarker requiring detection according to the type or characteristics of the diagnosis. However, it is not specifically limited.
  • the donor strands are added one by one, the complementary docking strands are found, and the washing process is repeated N times.
  • the measurement time may be longer than N minutes (one minute per species, N is hundreds to thousands).
  • donor strands of several hundred nM concentration are used N times, economic efficiency may be reduced.
  • the same donor strand can be used when the target material is distinguished using the fret efficiency of the acceptor strand rather than the base sequence as described above.
  • the time can be reduced to about 1 minute, and donor strands with concentrations of several hundred nM can be consumed only once.
  • the fret efficiency that can be divided into one acceptor strand is about 10
  • the number of acceptor strands can be increased according to the number of targets to be distinguished. However, if the number of targets that can be distinguished by one acceptor strand is 10, the number that can be distinguished by two acceptor strands is 55 instead of 100. In this way, the number of acceptor strands is 220 instead of 1,000 and four is 715 instead of 10,000.
  • the target 1 composed of fret efficiency 0.1 and 0.2 and the target 2 composed of fret efficiency 0.1 and 0.3 can be distinguished from each other, but the target 1 composed of fret efficiency 0.1 and 0.2 and the target 2 composed of fret efficiency 0.2 and 0.1 This is because they cannot be distinguished from each other.
  • the fret efficiency can be used to detect two or more kinds of biomarkers at the same time, and can distinguish the kind of low concentration biomarkers included in a small amount of sample.
  • the technology disclosed herein is characterized by the ability to temporarily bind strands labeled with fluorescent material. Therefore, even when the fluorescent material acting as a donor or acceptor is photo-bleached, the donor strand or fret strand labeled with the unbleached fluorescent substance is bound to the docking strand and the fret efficiency can be measured in the process of binding and separating repeatedly. Regardless of the photobleaching phenomenon, N biomarkers can be detected simultaneously.
  • the fluorescent material on the fret strand shines only at the moment when the donor strand and the fret strand are simultaneously bonded to the docking strand, and only when the donor strand is bonded to the docking strand when the fret strand is not used. Fluorescent material on the docking strand glows. Therefore, it is possible to measure a fluorescent material that emits light temporarily without interference from surrounding fluorescent materials, so that the position of the fluorescent material can be measured with a high precision of less than 10 nm, thereby simultaneously measuring a large number of biomarkers on one screen. It has a high dynamic range that can be done.
  • different acceptor strands are composed of different combinations of acceptor phosphors, and targets can be determined by identifying the type of each acceptor. For example, if target 1 is composed of acceptor 1 and acceptor 2, and target 2 is composed of acceptor 1 and acceptor 5, the spectra of target 1 and target 2 are observed separately. Therefore, different acceptors can emit light at the same time, so that all donors and acceptors can be labeled on the docking strand, and all the acceptors emit fluorescent signals at the moment of excitation, so the total measurement time is only a few seconds. It can be very shortened and economical since donor strands are not used.
  • the multi-biomarker simultaneous detection kit comprises a substrate; N kinds of docking strands labeled with two or more fluorescent substances; And N detection antibodies to which the docking strands are bound, respectively.
  • the multi-biomarker simultaneous detection kit comprises a substrate; N docking strands labeled with one or more fluorescent materials; N detection antibodies to which the docking strands are respectively bound; And donor strands labeled with one or more fluorescent materials.
  • the multi-biomarker simultaneous detection kit is a substrate; N kinds of docking strands; N detection antibodies to which the docking strands are respectively bound; Donor strands labeled with one or more fluorescent materials; And an acceptor strand labeled with at least one fluorescent substance.
  • the fluorescent material is a donor on a specific base, 3'- or 5'-end, or backbone of the docking strand, the donor strand or the acceptor strand. ) Or as an acceptor.
  • the docking strand may be complementary to the donor strand or the acceptor strand.
  • the kit may further comprise a capture antibody.
  • Simultaneous detection of multiple biomarkers includes attaching N biomarkers to a substrate; Binding each of the N detection antibodies to which the N docking strands are attached, respectively, to the N biomarkers; And measuring the emission spectrum of the docking strand. At this time, by measuring the emission spectrum by using a fret (FRET) generated between different kinds of fluorescent materials to determine the N species of biomarkers at the same time, the concentration of biomarkers in the sample from the number of biomarkers per unit area is measured.
  • FRET fret
  • Simultaneous detection of multiple biomarkers includes attaching N biomarkers to a substrate; Binding each of the N detection antibodies to which the N docking strands are attached, respectively, to the N biomarkers; And a donor strand complementarily coupling to the N kinds of docking strands. And measuring the emission spectrum. At this time, by measuring the emission spectrum by using a fret (FRET) generated between different kinds of fluorescent materials to determine the N species of biomarkers at the same time, the concentration of biomarkers in the sample from the number of biomarkers per unit area is measured.
  • FRET fret
  • the detection method may further comprise the step of complementarily binding the acceptor strand labeled with a fluorescent material to the docking strand.
  • the detection method may further comprise attaching a capture antibody to the substrate.
  • multiple biomarkers can be detected simultaneously by measuring emission spectra using a fret of resonance of two or more fluorescent substances labeled on a docking strand or on a donor strand or an acceptor strand.
  • the detection antibody is for detecting a biomarker using an antigen-antibody reaction, and it is preferable to use heterologous ones as many as the types of biomarkers to be detected.
  • any of the N kinds of docking strands use the same donor or acceptor.
  • the type of N biomarker may be determined by measuring the emission spectrum of each docking strand without using an additional light source and an optical filter using only one light source. Can be.
  • the absorbance spectrum and the predetermined wavelength range of the fluorescent material acting as an acceptor so that the conditions for the fret can overlap between the emission spectrum of the donor and the absorption spectrum of the acceptor. It is preferable to use as a donor a fluorescent substance having an overlapping emission spectrum.
  • the detection antibodies 1 to N are respectively coupled to docking strands labeled with the same donor, and each of the docking strands is labeled with acceptors 1 to N, the donor for exciting the light source. Since all are the same, only one kind of light source is irradiated at first, and the spectrum of emitted light is measured differently according to the kind of fluorescent material acting as an acceptor. You can check.
  • the docking strand N bound to the detection antibody N can identify the detection antibody labeled with the acceptor identified by labeling the acceptor N and the type of biomarker that binds to it.
  • the same donor and the same acceptor may be labeled on the docking strand that binds to the detection antibodies 1 to N, respectively.
  • the distance between each donor and the acceptor is different as shown in Figs. 32 (a), (b), and (c), and the multiple biomarkers are used by using the spectrum difference according to the fret efficiency as shown in the graph on the right. It can also detect simultaneously.
  • the same acceptor and two or more donors may be labeled on docking strands that bind to the detection antibodies, respectively.
  • the absorption spectra (dotted lines) of the two fluorescent materials acting as donors overlap, so that both the fluorescent materials are excited with one light source and the emission spectrum (solid line) Since it can be clearly distinguished, there is an advantage that there are more types of biomarkers detectable, as compared with the case of Fig. 31 or 32 using all the same donor.
  • the same donor may be labeled on a docking strand that binds to each of the detection antibodies, and two or more acceptors may be labeled.
  • the two or more acceptors to be labeled may form an acceptor-acceptor fret pair adjacent to each other as shown in FIG. 34A, or as shown in FIG. 34B, each of the donor-acceptor frets adjacent to the donor. It may also form a pair.
  • the type of biomarker may be determined by adjusting the distance between labeled acceptors.
  • FIG. 34C shows the results of multiple detections by labeling an acceptor-acceptor fret pair on a docking strand as shown in FIG. 34A using one donor and five acceptors.
  • 35A and 35B exemplarily illustrate a method for simultaneously detecting multiple biomarkers according to one embodiment disclosed herein, and different from each of the N detection antibodies specifically binding to the N biomarkers to be detected.
  • the kind of biomarker can be determined by combining N kinds of docking strands having an emission spectrum and measuring the emission spectrum.
  • the biomarkers are fixed to the substrate, and then the biomarkers and the detection antibody are combined.
  • the step of attaching the capture antibody to the substrate may be performed first, in which case, it is preferable that each of the N capture antibodies is used to specifically bind to the N biomarkers.
  • the biomarker may be attached directly to the substrate. This is for speed, economics and convenience of the measurement process, and if necessary, biomarkers may be detected through antigen-antibody reactions with capture antibodies attached to the substrate to increase the accuracy of the measurement results.
  • the substrate included in the kit may be treated with a surface such that the biomarker may directly attach to the surface of the substrate or attach a capture antibody capable of capturing the biomarker upon detection of the biomarker.
  • a coating coated with a specific material binding to the capture antibody it is preferable to use a coating coated with a specific material binding to the capture antibody as a substrate.
  • a method of adsorbing a capture antibody to a substrate is, for example, by adsorbing the capture antibody by diluting the capture antibody with a 0.06 M carbonate buffer solution or a bicarbonate buffer solution having a pH of 9.5, and contacting the diluted solution with the substrate for a predetermined time. It may be to. Alternatively, the surface of the substrate is coated with biotin-bound polyethylene glycol (PEG) or bovine serum albumin (BSA), streptavidin is bound, and then the biotin-bound capture antibody is bound thereto for adsorption. It may be.
  • PEG polyethylene glycol
  • BSA bovine serum albumin
  • the capture antibody adsorbed on the substrate processes the sample or the processed sample on the substrate
  • the capture antibody forms a conjugate with the biomarker included in the sample.
  • the detection antibody is bound to the biomarker.
  • the emission spectrum of the docking strand is measured and the biomarkers are determined by comparing the emission spectrum databases previously measured, and then the number of biomarkers per unit area displayed on the screen is compared with the number per unit area for each concentration measured.
  • the concentration of can be measured. For example, when the donor is excited by irradiating a light source, the emission spectrum of each molecule appears on the screen as shown in FIG.
  • the biomarker can be identified (ex: biomarker A side, biomarker B side 2, biomarker 3 side C). Thereafter, the concentration of each biomarker included in the sample may be measured by measuring the number per unit area for each biomarker and comparing the number per unit area for each concentration. For example, in the case of biomarker 1, if the number of units per unit area by concentration is 10 ng / ml and the number of units per unit area is 5, the concentration of biomarker 1 included in the sample may be 0.5 ng / ml. .
  • 35B exemplarily illustrates one of various methods of measuring emission spectra.
  • PSF point spread function
  • the point diffusion function of each fluorescent material can be changed from a circle to an ellipse.
  • the emission spectrum can be measured by comparing the center of the ellipse with the center of the ellipse, and analyzing the profile of the long axis of the ellipse, and comparing it with the measured emission spectrum database to find out which fluorescent substance the molecule is composed of.
  • the docking strand attached to the detection antibody may bind complementarily with the donor strand or acceptor strand.
  • the donor strand is labeled with a donor
  • the acceptor strand is labeled with at least one acceptor or acceptor-acceptor fret pair.
  • donor strands may complementarily bind to a portion adjacent to the labeled portion, and at the moment, the frets are generated.
  • the acceptor can emit light. If the fluorescent material is not labeled on the docking strand as shown in FIG.
  • the donor strand and the acceptor strand are repeatedly bonded and separated from the docking strand, so that the donor strand and the acceptor strand are simultaneously
  • the emission spectrum can be measured by allowing the acceptor to emit light only at the moment of binding. For this reason, even when a photobleached fluorescent material is generated, if a predetermined reaction time is given, there is an advantage that the emission spectrum can be measured at the same time when the donor strand labeled with the unbleached fluorescent material and the acceptor strand combine simultaneously.
  • it is possible to measure and record at the same time to combine as the number of biomarkers to be detected increases, it is possible to solve the problem that it becomes difficult to discriminate as several kinds of images are simultaneously output on one screen.
  • FIG. 37 exemplarily illustrates a method of determining the type of biomarker using a detection kit including a donor strand and an acceptor strand as shown in FIG. 36B.
  • N kinds of biomarkers to be detected N kinds of docking strands and donor strands and acceptor strands complementarily coupled thereto are designed, and respective emission spectra are measured in advance to prepare a database.
  • detection antibodies 1 to N are respectively bound to the biomarkers 1 to N, and docking strands 1 to N are attached to the detection antibodies 1 to N, respectively.
  • the biomarker After the recording of the database, the biomarker is fixed to the substrate, and then the biomarker is discriminated as follows using a docking strand suitable for the type of biomarker to be detected. After binding the detection antibody to each biomarker, the donor strand and acceptor strand prepared in advance are added and the binding and separation are repeated for a predetermined time. In this case, when a donor strand and an acceptor strand are simultaneously coupled to one docking strand, a signal is displayed on the screen as shown in FIG. 37, and the biomarker type is determined by analyzing the spectrum of the signal and comparing it with a previously recorded database. can do.
  • Each screen accumulates and displays the position where the signal is detected, and the signals generated by overlapping one biomarker molecule form a cluster of Gaussian function centered on a specific position and one cluster.
  • the number of biomarkers per unit area is calculated by considering the biomarker molecules, and the concentration of the biomarkers included in the sample can be measured by comparing the number of biomarkers per unit area.
  • the donor is labeled on the donor strand and the acceptor is labeled on the docking strand or the acceptor strand for any one of the configurations shown in FIGS. 31 to 34 or a combination of at least two or more. More than about 1,000 biomarker types can be determined.
  • a plurality of donor strands and a plurality of acceptor strands may be complementarily coupled to one docking strand.
  • Such a combination has the same kind of biomarker detected in the configuration as shown in FIG. 36B, but two or more sites complementarily bind to the donor strand and the acceptor strand, and any one site may be the donor strand and the acceptor.
  • the emission spectrum can be measured. Therefore, it is possible to increase the probability of bonding while the donor strand and the acceptor strand are repeatedly combined and separated, thereby increasing the detection speed by more than two times.
  • the plurality of donor strands may be labeled with different donors.
  • each of the plurality of donor strands may be labeled with a donor such that a distance from an adjacent acceptor or acceptor-acceptor fret pair is different in order to have a different fret efficiency from each other, and the acceptor or acceptor- The acceptor fret pair may be composed of different fluorescent materials from each other.
  • the plurality of acceptors or acceptor-acceptor fret pairs may be labeled such that the distance from the donor is different so as to have a different fret efficiency from the donor, and the acceptor-acceptor fret pairs are different from each other. It may be labeled so that the distance between the acceptors to be different.
  • a docking strand having the same configuration may be attached to one detection antibody as in FIG. 38B to increase the detection speed of the biomarker.
  • 38A and 38B may be combined to attach two or more docking strands to which a plurality of donor strands and acceptor strands may complementarily attach to one detection antibody to further increase the detection speed of the biomarker. have.
  • Kit for simultaneous detection of multiple biomarkers may be used for the purpose of detecting micro RNA, as shown in FIG.
  • a configuration of a kit for detecting nucleic acids such as DNA, RNA, and the like including microRNA is illustrated.
  • the N-type nucleic acid to be detected is fixed to the substrate by attaching a binding-friendly material to the coating material on the substrate at one end of the N-type nucleic acid to be detected or by coating a substrate complementary to a portion of each nucleic acid on the substrate. Since the nucleotide sequence of N kinds of nucleic acids to be detected is determined, each nucleic acid can be determined using N kinds of donor strands and acceptor strands complementary thereto.
  • the docking strand may be a polypeptide or a carbohydrate.
  • the light intensity of the donor or acceptor may be influenced according to the distance between the donor and the acceptor, but the donor and acceptor are labeled on a specific base, 3'- or 5'-terminal, or base skeleton of interest.
  • the distance between the donor and the acceptor or the acceptor and the acceptor By adjusting the distance between the donor and the acceptor or the acceptor and the acceptor, docking strands having different fret efficiencies can be manufactured.
  • N kinds of docking strands are labeled with fluorescent materials having different fret efficiencies, the emission spectra of each of the docking strands are measured in advance, and a database is measured, and then the emission spectra generated during the reaction for biomarker detection. By comparing with, the kind of biomarker reacted can be detected.
  • the fluorescent materials having different fret efficiencies are (donor 1, acceptor 1), (donor 1, acceptor 2),... , (Donor 1, acceptor N), (donor 1, acceptor 1), (donor 2, acceptor 1),... , (Donor N, acceptor 1).
  • the fluorescent materials having different fret efficiencies are (donor 1, acceptor 1), (donor 1, acceptor 2),... , (Donor 1, acceptor N), (donor 1, acceptor 1), (donor 2, acceptor 1),... , (Donor N, acceptor 1).
  • the fluorescent materials having different fret efficiencies are (donor 1, acceptor 1), (donor 1, acceptor 2),... , (Donor 1, acceptor N), (don
  • the configuration of the fluorescent materials having different fret efficiencies described above is exemplarily a part, and is not particularly limited as long as there is a difference in fret efficiencies to a degree that can be discriminated upon detection.
  • the target material detection method may further include preparing a database by measuring emission spectra of N kinds of docking strands. Before proceeding with the reaction for detection, a docking strand comprising any one or more of the above-described configurations is designed, the emission spectrum of each docking strand is measured and recorded in a database, and compared with the values measured during the reaction. Since the type of detection antibody used can be confirmed, the type of biomarker can be finally confirmed.
  • the emission spectra can be measured simultaneously or sequentially. For example, when detecting three biomarkers, donor strands that complementarily bind to docking strands 1, 2, and 3 attached to detection antibodies 1, 2, and 3 may bind to docking strands 1, 2, and 3 simultaneously. It may be combined sequentially. If the acceptor is labeled directly on the docking strand, the emission spectrum can be measured only at the moment when the donor strand is temporarily coupled.
  • the donor strands 1, 2, and 3 are additionally used, the donor strands 1, 2, and 3 to the docking strands 1, 2, and 3 while the acceptor strands 1, 2, and 3 are simultaneously or sequentially repeated, the donor The emission spectrum is measurable only at the moment the strands simultaneously bind to either docking strand. In other words, when the donor strand and the acceptor strand 1 are simultaneously coupled to the docking strand 1, the emission spectrum of the docking strand 1 can be measured, but the moment the donor strand 1 is coupled to the docking strand 1, the donor strand is the docking strand. If only 2 or 3 are bound, the emission spectrum of docking strand 1 cannot be measured. That is, measurement of the emission spectrum for detecting the N biomarkers can be performed simultaneously or sequentially, and finally, the N biomarkers can be discriminated simultaneously by comparing the measured values with a previously measured database.
  • the N-type biomarkers can be detected simultaneously using the frets, and the types of biomarkers of low concentration included in the small amount of samples can be distinguished.
  • the technology disclosed herein may determine the type of biomarker by measuring the emission spectrum of a strand labeled with a fluorescent material using energy resonance occurring between two or more adjacent fluorescent materials.
  • all the biomarkers can be discriminated by one light source by labeling all of the fluorescent substances acting as donors, and thus a simple structure is not required because an additional light source and an optical filter are required. There is an advantage that the loss of the emission spectrum is prevented.
  • the donor and acceptor-labeled strands are temporarily bonded, even if the fluorescent material acting as the donor or acceptor becomes photobleached, the unbleached fluorescent substance is labeled in the process of binding and separation.
  • N biomarkers can be detected simultaneously regardless of the photobleaching phenomenon.
  • the temporarily emitting fluorescent material can be measured without interference of the surrounding fluorescent material, and the position of the fluorescent material can be measured with a high precision of less than 10 nm, and thus has a high dynamic range.
  • Modified DNA oligonucleotides were purchased from Integrated DNA Technologies and Alexa 488 (Alexa Fluor 488 NHS Ester, catalog number: A20000) was purchased from Thermo Fisher Scientific. Cy3 (Cy3 NHS Ester, catalog number: PA13101) and Cy5 (Cy5 NHS Ester, catalog number: PA15101) were purchased from GE Healthcare Life Sciences, and COS-7 cells were purchased from the Korean Cell Line Bank.
  • Anti-tubulin antibody catalog number: ab6160 was purchased from Abcam, anti-Tom20 antibody (sc-11415) was purchased from Santa Cruz Biotechnology, and donkey anti-rabbit IgG antibody.
  • DNA oligonucleotides modified with amines were labeled with fluorescent materials with NHS ester chemical groups.
  • First 5 ⁇ l of 1 mM DNA was mixed with 25 ⁇ l of 100 mM sodium tetra borate buffer (pH 8.5), 5 ⁇ l of 20 mM fluorescent substance dissolved in DMSO was added, and then incubated overnight at 4 ° C. 265 ⁇ l of distilled water, 900 ⁇ l of ethanol and 30 ⁇ l of 3M sodium acetate pH 5.2) were then added and mixed. The mixture was incubated at ⁇ 20 ° C. for 1 hour and then centrifuged for 2 hours. The supernatant was then discarded and the DNA pellet was washed with cold ethanol. After ethanol was completely dried, the DNA pellet was resuspended in 50 ⁇ l of distilled water and the fluorescent labeling efficiency was measured.
  • the cover slip was diluted with distilled water with bead solution 1:10, heated in a hot plate at 100 ° C. for 10 minutes, washed with distilled water, and dried using N 2 gas.
  • COS-7 cells were grown on cover slips coated with beads and then fixed for 10 minutes. Then, microtubules were observed using 2% glutaraldehyde, and microtubules and mitochondria were prepared using a mixture of 3% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde dissolved in PBS buffer. Was observed. Fixed samples were then stored at 4 ° C. in PBS buffer until use.
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • HILO highly sloped and stacked optical sheet
  • the docking strand was fixed to the polymer-coated quartz slide surface using streptavidin-biotin interaction and donor and acceptor strands were added to the imaging channel.
  • Alexa488, Cy3 and Cy5 are blue laser (473nm, 100mW, MBL-III-473-100 mW, CNI), green laser (532nm, 50mW, Compass 215M-50, Coherent) and red laser (642nm, 60mW, Excelsior- 642-60, Spectra-Physics). Cy3 signals were filtered using a 640dcxr dichroic mirror (Chroma) and Cy5 signals were filtered using a 740dcxr dichroic mirror (Chroma). Monomolecular images were recorded at a frame rate of 10 Hz using an electron multiplying charge coupled device (EMCDCD) camera (iXon Ultra DU-897U-CS0- # BV, Andor).
  • ECDCD electron multiplying charge coupled device
  • 1A to 1K illustrate the principle and characteristics of FRET-PAINT.
  • FIG. 1A shows the docking strand (black), donor strand (dark grey) and acceptor strand (light grey) used for the characterization of FRET-PAINT
  • FIG. 1B shows a schematic of FRET-PAINT
  • 1C shows representative Cy5 fluorescence signal intensities over time (1000 nM Donor_P1_Alexa488 and 100 nM Acceptor_P11_Cy5)
  • FIG. 1D shows the brightness of an acceptor according to donor-acceptor distance for Cy3-Cy5 and Alexa488-Cy5 pairs.
  • FIG. 1E shows a DNA-PAINT image of the docking strand (Docking_P0) with the surface immobilized at the indicated concentration of acceptor_P11_Cy3.
  • FIG. 1F shows a FRET-PAINT image of Docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentrations of Acceptor_P6_Cy5 and Donor_P1_Cy3 fixed at 10 nM.
  • FIG. 1G shows a FRET-PAINT image of Docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentration of Acceptor_P6_Cy5 with Donor_P1_Cy3 fixed at 10 nM.
  • 1H shows a FRET-PAINT image of docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentration of Donor_P1_Alexa488 with fixed Acceptor_P2_Cy5 at 10 nM.
  • 1I shows a FRET-PAINT image of docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentration of Acceptor_P2_Cy5 with Donor_P1_Alexa488 fixed at 10 nM (Scale bar: 1 ⁇ m).
  • FIG. 1J shows the SNR values of each strand concentration of DNA-PAINT using Cy3 imager strand, FRET-PAINT using Cy3 donor strand, and FRET-PAINT using Cy3 acceptor strand. Is a comparison.
  • FIG. 1K compares SNR values for each strand concentration of DNA-PAINT using Cy3 imager strands, FRET-PAINT using Alexa488 donor strands, and FRET-PAINT using Cy5 acceptor strands. It is.
  • FRET-PAINT used three DNA strands (docking strand, donor strand and acceptor strand).
  • the docking strand (Docking_P0) has biotin attached to the 5 'end, and there are two docking sites, donor strands or acceptor strands, respectively.
  • the acceptor strand is already bonded to the docking strand, so that a relatively long acceptor strand is used to increase the probability of FRET from the donor to the acceptor, while Donor strands were selected.
  • donor strands labeled Alexa488 Donor_P1_Alexa488) at the 3 'end
  • acceptor strands were labeled with Cy5 (Acceptor_P11_Cy5) at the 3' end.
  • the base sequence of each strand is as follows.
  • Donor_P1_Cy3 5'-TAATGAAGA-Cy3-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Donor_P1_Alexa488 5'-TAATGAAGA-Alexa488-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Acceptor_P2_Cy5 5'-Cy5-TATGTAGATC-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Acceptor_P6_Cy5 5'-TATG-Cy5-TAGATC-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Acceptor_P11_Cy5 5'-TATGTAGATC-Cy5-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • the docking strand was then fixed to the polymer-coated quartz surface using streptavidin-biotin interaction. Then, donor strands (1000 nM) and acceptor strands (100 nM) were injected and then single molecule images of Cy5 were taken by Alexa488 reacted using a blue laser (FIG. 1B).
  • the acceptor strand, Alex488 is labeled with Cy3 (Donor_P1_Cy3) at the 3 'end.
  • Cy5 acceptor_P2_Cy5, P4_Cy5, P6_Cy5 and P11_Cy5.
  • microtubules of COS-7 cells were immunostained using an anti-tubulin antibody to which Docking_P1 is bound.
  • the microtubules were imaged after injection of 1 nM Cy5-labeled imager strand (Acceptor_P2'_Cy5). Also, for FRET-PAINT, 30 nM donor strand (Donor_P1_Alexa488) and After injecting 20 nM acceptor strand (Acceptor_P2_Cy5), microtubules of the same site were imaged Single-molecular images were recorded at 10 Hz frame rate, a speed at which binding of donor and acceptor strands could be detected.
  • FIG. 2A shows DNA-PAINT images reconstructed at the indicated acquisition time.
  • FIG. 2B shows a FRET-PAINT image of the same area as FIG. 2A reconstructed at the indicated acquisition time.
  • FIG. 2C shows the cumulative number of localized spots as a function of time for the DNA-PAINT image of FIG. 2A and as a function of time for the FRET-PAINT image of FIG. 2B.
  • Figure 2d shows the result of comparing the number of local single molecule spots per second of FRET-PAINT and DNA-PAINT.
  • Figure 2e graphically shows the results of comparing the spatial resolution of DNA-PAINT and FRET-PAINT against imaging time. Error bars represent standard deviations.
  • DNA-PAINT recorded a total of 18,000 frames at a rate of 10 Hz for 30 minutes ( Figure 2a), whereas FRET-PAINT recorded a total of 600 frames at a rate of 10 Hz for 60 seconds.
  • FIG. 2B the imaging speed of FRET-PAINT was increased by 29 times compared to DNA-PAINT (FIG. 2C), and the imaging speed was increased by 32 times even with the average value measured for different sites (FIG. 2D).
  • FIG. 2E the imaging speed of FRET-PAINT was increased 36 times
  • Microtubules and mitochondria of COS-7 cells were immunostained using anti-tubulin antibodies with Docking_P1 and anti-Tom20 antibodies with Docking_P2, respectively.
  • two approaches were used to obtain multiplexed images.
  • 3A to 3H show the multiplexing performance of FRET-PAINT.
  • 3A shows a schematic of multiplexed images of FRET-PAINT using donor and acceptor strand exchange schemes.
  • 3B to 3D show FRET-PAINT images of microtubules (b) and mitochondria (c) obtained using the method of FIG. 3A, and images d overlapping them.
  • 3E schematically illustrates a multiplexed image without buffer exchange.
  • 3F to 3H show FRET-PAINT images of microtubules (f) and mitochondria (g) obtained by using the method of FIG. 3e and images (h) superimposing them (MT: microtubules, MC: mitochondria, DS: donor strand, AS: acceptor strand, Scale bars: 5 ⁇ m).
  • Micron tubes were observed by injecting 20nM Donor_P1_Alexa488 and 10nM Acceptor_P2_Cy5 according to the approach according to FIG. 3A (method of sequentially processing donor and acceptor strands) (FIG. 3B), and 10nM Donor_P2_Alexa499 and 10nM Acceptor_P2_Cy5 were injected and mitochondria were injected. 3c).
  • FIG. 3E a method of simultaneously processing donor and acceptor strands injects 10nM Donor_P1_Cy3 into the microtubule, injects 20nM Donor_P2_Alexa488 into the mitochondria, and injects 10nM Acceptor_P2'_Cy5 into all DNA probes. The rolls were injected at the same time, and then microtubules were observed for the first time with Cy3 excitation (FIG. 3F), and then mitochondria were observed with Alexa488 excitation (FIG. 3G).
  • the two approaches showed no difference in imaging time, but when the donor strand and the acceptor strand were simultaneously processed, it was confirmed that crosstalk occurred between the microtubule and the mitochondrial image, and thus, the donor strand and the acceptor strand. It was found that the case of sequentially processing is more effective for multiplexed imaging.
  • Example 1-4 Measurement of Biomarkers over a Wide Concentration Range
  • FIGS. 4A and 4B show the results of measuring biomarkers using donor strands and acceptor strands by fixing biomarkers at concentrations of 10, 40, 100, 400, 1000, and 10000 pg / ml in different wells, respectively.
  • Figure 4b shows the results of measuring the biomarker when the biomarkers of 1000 pg / ml and 10000 pg / ml concentration diluted to 1/10 and 1/100, respectively.
  • 4C graphically illustrates the number of points measured at each concentration of FIGS. 4A and 4B. 1000 pg / ml was diluted to 1/10 and multiplied by 10 to the number of points, and 10000 pg / ml was diluted to 1/100 and multiplied by 100 to the number of points.
  • 4A shows the number of dots (individual biomarker molecules) displayed on the screen using donor strands and acceptor strands by fixing biomarkers at concentrations of 10, 40, 100, 400, 1000, and 10000 pg / ml, respectively, in different wells. It is a result of a measurement. It can be seen that the number of dots appearing on the screen increases in proportion to the concentration, and at a concentration of 1000 pg / ml or more, the dots start to overlap and cannot count the correct number.
  • 4B is a result of measuring the number of dots on the screen using donor strands and acceptor strands by diluting 1000 and 10000 pg / ml biomarkers at 1/10 and 1/100, respectively, and diluting them in different wells. .
  • FIG. 4C is a graph showing the number of points at each concentration of FIGS. 4A and 4B.
  • biomarkers at 1000 pg / ml dilute to 1/10 and multiply the number of points by 10, and for 10000 pg / ml for biomarkers, dilute to 1/100 and count Multiplied by 100.
  • a tag strand was prepared by labeling DNA strands with Cy3 as a donor and Cy5 as an acceptor. One end of the DNA is attached to biotin, a donor and an acceptor are attached to a specific base, and a distance of 1 to 50 between the donor and the acceptor is labeled to prepare a total of 50 tag strands.
  • the reason for attaching the biotin is to fix the DNA on the substrate by using the binding between streptavidin and biotin, in order to play a similar role, digoxigenin and its antibody or SNAP-tag, CLIP It is also possible to use a method of fixing to a substrate by using a bond between a tag such as -tag, FLAG-tag, His-tag and the like.
  • the substrate was coated with streptavidin, a DNA having a distance of 1 between the donor and the acceptor was fixed, and a FRET efficiency at a distance of 1 was measured to obtain a reference value.
  • the FRET efficiency is not completely separated by 1) the acceptor is excited by the light to excite the donor and 2) the dichroic mirror used to separate the light emitted by the donor and the acceptor. 3) the difference in the detection efficiency of the image sensor according to the wavelength difference of the light emitted by the donor and the acceptor.
  • each reference value was secured by the same method, and the error due to the noise generated during the measurement was calculated to use only the distance of FRET efficiency, which is actually clearly distinguished.
  • Example 2-2 Tag Strand Fabrication
  • Tag strands were fabricated as many as the number of biomarkers to be detected.
  • the same DNA as that used in Example 2-1 can be used, but instead of biotin attached to one end of the DNA used in Example 2-1, a functional group attached to a detection antibody was used.
  • the method of attaching may be the same as attaching a fluorescent substance to DNA.
  • Example 2-1 it was assumed that the FRET efficiencies that can be clearly distinguished into one donor-acceptor pair are ten. Therefore, if the number of biomarkers to be detected is ten, only one pair of donor-acceptor is sufficient for detection. It is possible.
  • two or more donor-acceptor pairs may be used. If more than 10 kinds of biomarkers to be detected, two or more donor-acceptor pairs may be used. If two donor-acceptor pairs are used, up to 55 distinctly identifiable FRET efficiencies will be at most 205. Theoretically, if there is a maximum of 10 FRET efficiencies that can be distinguished by a pair of donor-acceptors, 100 FRET efficiencies that can be distinguished by two pairs can be calculated. However, if the FRET efficiency of FRET pair 1 and FRET pair 2 is i) a, b and ii) b, a, respectively, the cases of i) and ii) cannot be distinguished from each other.
  • any one of ii) is used as a tag strand, there may be a total of 55 cases where the FRET efficiency can be substantially classified. If the donors or acceptors of FRET pair 1 and FRET pair 2 are different in type, the FRET efficiency of the two pairs is 100, and the three pairs are 1000.
  • FRET efficiency of FRET pair 1 is 0.5 and the FRET efficiency of FRET pair 2 is 0.7, but the FRET efficiency observed in this state is 0.6, which is the average of the two FRET pairs. FRET efficiency is unknown.
  • the FRET efficiency measured from the brightness difference before and after the photobleaching is 0.5
  • the FRET efficiency measured from the brightness observed after the photobleaching is 0.7. Therefore, it can be seen that the FRET efficiency of the tag strand is composed of 0.5 and 0.7.
  • the FRET efficiency measured from the brightness difference before and after the photobleaching was 0.7
  • the FRET efficiency measured from the brightness observed after the photobleaching was 0.5. Therefore, it can be seen that the FRET efficiency of the tag strand is composed of 0.5 and 0.7.
  • the FRET efficiency of the tag strand is composed of 0.5 and 0.7.
  • the FRET efficiency of the tag strand is composed of 0.5 and 0.7.
  • the FRET efficiency of the tag strand is composed of 0.5 and 0.7.
  • Kits were prepared as follows to detect biomarker 1 or 2.
  • Tag strand 1 is attached to detection antibody 1 that binds to biomarker 1
  • tag strand 2 is attached to detection antibody 2 that binds to biomarker 2.
  • the tag strands 1 and 2 were labeled with two donor-acceptor FRET pairs, respectively.
  • FRET pair 2 0.5
  • FRET pair 2 0.4.
  • FRET efficiency was analyzed by measuring the difference in brightness before and after photobleaching as in Example 2-3. Molecules A and B appeared in the imaging camera to observe the brightness, the FRET efficiency of the molecule A was measured to 0.1, 0.5, it was found that the molecule A is biomarker 1. In the same principle, the FRET efficiency of molecule B was measured to be 0.2 and 0.4, indicating that molecule B is biomarker 2 (FIG. 15).
  • Biomarkers included in the sample have a very wide concentration range from fg / ml to mg / ml depending on the type. If an excessively high concentration of biomarker is immobilized on a substrate, the number of points on one screen may be too large, resulting in overlap between the dots, which makes it impossible to measure the FRET efficiency of individual molecules. Samples can be diluted in various ratios so that molecules can be detected.
  • the assay may be performed after diluting the biomarkers in the same ratio. For example, if dilution of biomarkers with a concentration of about 1 ng / ml is 1: 100, if a suitable number of biomarker molecules is detected on one screen, biomarkers with a concentration of about 100 ng / ml are usually 1: The assay can be performed after dilution to 10000.
  • Different donor materials A, B, and C were used as donor 1, donor 2, and acceptor, respectively, and donor 1 was labeled on donor strand, and donor 2 and acceptor were labeled on fret strand.
  • the distance between two fluorescent materials A and B was determined so that the fret efficiency between donor 1 and donor 2 was maximum.
  • a fret pair was formed by using donors 2 and acceptors in B and C, respectively, to label the fret strands, and to prepare fret strands labeled with different types of fret pairs as necessary.
  • the wavelength of the maximum value of the emission spectrum of each fluorescent material is the shortest in the donor 1 and the longest in the acceptor.
  • the fret efficiency measurement value measured in the biomarker detection process with the fret efficiency reference value, the distance between donor 2-acceptors of the fret pair used for detection can be known, and the type of the biomarker detected therefrom is determined. You can check it.
  • the fret efficiency of all distances may not be distinguishable.
  • the fret efficiency when the distance is 1 is 0.95 (average) ⁇ 0.05 (error) and the fret efficiency when the distance is 2 is 0.94 ⁇ 0.05, the distance 1 and 2 cannot be distinguished by the fret efficiency. . Therefore, when detecting the actual biomarker, it is preferable to use only the distance in which the fret efficiency is clearly distinguished among the values of the database. In the following embodiment, it is assumed that 10 values that can be clearly distinguished among the fret efficiency reference values having a distance of 1 to 50 will be described.
  • Example 3-1 it is assumed that the fret efficiencies that can be clearly distinguished into one pair of donor 2-acceptor fret pairs are 10. If the types of biomarkers to be detected are 10, the donor 2-acceptor fret pairs are used. Only one pair can detect enough. Therefore, one fret strand was manufactured to be bonded to the docking strand.
  • two or more fret pairs composed of donor 2-acceptors may be used. Therefore, two or more fret strands were manufactured to be bonded to the docking strand. If two fret pairs are used, the maximum distinguishable fret efficiencies will be up to 55, and if three fret pairs are used, the clearly distinguishable fret efficiencies will be up to 205.
  • the fret efficiency that can be divided into two fret pairs can be calculated as 100, but fret pair 1 and fret pair If the frit efficiency of 2 is i) a, b, and ii) b, a, respectively, the cases of i) and ii) cannot be distinguished from each other, so only one of the i) or ii) docking strands In practice, there are a total of 55 cases where the fret efficiency can be distinguished. However, if the kind of the fluorescent material of donor 2 or acceptor or both of fret pair 1 and fret pair 2 is different, the fret efficiency which can be divided into two pairs may be 100 types, and three pairs may be 1000 types.
  • Kits were prepared as follows to detect two biomarkers, Biomarker 1 or 2.
  • Docking strand 1 is attached to detection antibody 1 that binds to biomarker 1
  • docking strand 2 is attached to detection antibody 2 that binds to biomarker 2.
  • the docking strands 1 and 2 are each manufactured so that two kinds of fret strands can be combined.
  • the docking strand 1 can be bonded to fret strands having a fret efficiency of 0.2 and 0.4, respectively, and the docking strand 2 is designed to couple fret strands having a fret efficiency of 0.6 and 0.8, respectively.
  • Biomarkers 1 and 2 were fixed to the substrate, and detection antibodies 1 and 2 were bound to each.
  • the positions of molecules 1 and 2 are observed as intermittent fluorescence signals in an imaging camera that observes the brightness of donor 2 and acceptor, and the brightness of the donor 2 and acceptor is measured and the frets are measured. The efficiency was analyzed. As a result, since the fret efficiency 0.2 and 0.4 were measured in the position of the molecule 1, it was confirmed that the molecule 1 is a biomarker 1. In the same principle, fret efficiency 0.6 and 0.8 were measured at the position of molecule 2, confirming that molecule 2 is biomarker 2.
  • Biomarkers included in the sample have a very wide concentration range from fg / ml to mg / ml depending on the type. When an excessively high concentration of biomarker is immobilized on a substrate, the number of points on one screen is too large to cause overlap between the points, which makes it impossible to measure the fret efficiency of individual molecules. Samples can be diluted in various ratios so that molecules can be detected.
  • the assay may be performed after diluting the biomarkers in the same ratio. For example, if dilution of biomarkers with a concentration of about 1 ng / ml is 1: 100, if a suitable number of biomarker molecules is detected on one screen, biomarkers with a concentration of about 100 ng / ml are usually 1: The assay can be performed after dilution to 10000.
  • a kind of donor strands each labeled with an A kind of donor capable of being excited by one light source were produced.
  • B type acceptor strands respectively labeled with B type acceptors in which the A type donors and frets were produced were prepared.
  • a total of A ⁇ B docking strands were complementarily bonded with the A donor strands and the B acceptor strands, provided that each of A and B is an integer of 1 or more.
  • the emission spectra of the donor and acceptor were measured using donor strand 1 and acceptor strand 1 and docking strand 1 complementary thereto. The emission spectrum was measured in the same manner for the remaining donor strands and acceptor strands.
  • the method of the embodiment has been described as shown in FIG. 36B by combining the methods of FIGS. 31 and 33.
  • the donor and the access as shown in FIG.
  • the frit efficiency between the acceptors may be configured to be differently applied, or two or more acceptors may be labeled on one acceptor strand as shown in FIG. 36B, or two or more different acceptor strands may be labeled on one docking strand.
  • a larger number of emission spectra databases than the number of biomarkers to be detected can be created.
  • N types of docking strands were made to detect N types of biomarkers.
  • N kinds of docking strands having complementary nucleotide sequences were prepared to allow donor strands and acceptor strands to provide the databased emission spectra.
  • a kit was prepared as follows.
  • Docking strand 1 is attached to detection antibody 1 which binds to biomarker 1
  • docking strand 2 is attached to detection antibody 2 which binds to biomarker 2.
  • the donor strand 1 and the acceptor strand 1 are coupled to the docking strand 1, and the donor strand 2 and the acceptor strand 2 are manufactured to be coupled to the docking strand 2.
  • Biomarkers 1 and 2 were fixed to the substrate, and detection antibodies 1 and 2 were bound to each. After injecting a buffer containing donor strand 1, acceptor strand 1, donor strand 2, and acceptor strand 2 into the wells, the spectrum of light emitted when the donor strand and acceptor strand were simultaneously coupled to the docking strand was observed. . As shown in FIG. 37, an intermittent fluorescence signal was observed at the positions of molecules 1 and 2 on the imaging camera screen, and the biomarker type could be determined by comparing the emission spectrum at the position with a database.
  • Biomarkers included in the sample have a very wide concentration range from fg / ml to mg / ml depending on the type. However, if an excessively high concentration of biomarker is immobilized on a substrate, the number of dots appearing on one screen is too large, causing overlap between the dots, which makes it impossible to measure the fret efficiency of individual molecules. Samples can be diluted and used for detection in various ratios so that marker molecules can be detected.
  • the assay may be performed after diluting the biomarkers in the same ratio. For example, when dilution of biomarkers with a concentration of about 1 ng / ml at 1: 100, if a suitable number of biomarker molecules are detected on one screen, biomarkers with a concentration of about 100 ng / ml are usually 1: 10000. After dilution, the analysis can be performed.

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Abstract

a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.

Description

타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트
본 명세서에 개시된 기술은 일반적으로 타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 매우 높은 감도로 타겟 물질을 다중 검출할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것이다.
바이오마커는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용하여 몸속의 변화를 알아낼 수 있는 생물학적인 지표를 말한다. 생명체로부터 유래된 특정 시료에 포함되어 있는 바이오마커를 검출하는 방법으로 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인 할 수 있고, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정 가능하다. 최근에는 암을 비롯해 심장질환, 뇌졸중, 치매 등 각종 난치병을 진단하기 위한 효과적인 방법이라는 점에서 의료계의 각광을 받고 있다.
통상적으로 사용되는 바이오마커 검출 기술은 주로 ELISA 기반의 기술로서, 최대 수~수십 pg/ml 수준의 민감도를 가지므로 바이오마커를 검출하기 위해서는 민감도에 비례하는 일정량 이상의 생체시료를 필요로 한다.
바이오마커를 이용하여 종양의 발생 유무를 판별하는 경우, 한 번의 검사에서 한 가지의 바이오마커를 판별하여 여러 번 검사를 반복하는 경우가 대부분이다. 그러나, 종양이 발생하게 되면, 하나의 바이오마커의 수치만 변하는 것이 아니라 2 이상의 바이오마커의 수치가 변하게 된다. 따라서, 종양의 발생 여부를 확인하기 위해서는 여러 종의 바이오마커를 동시에 검출하는 것이 발병 여부 판별의 정확도를 높일 수 있다.
현재의 기술로 다수의 바이오마커를 검출하기 위해서는 검출하고자 하는 바이오마커의 수에 비례하는 혈액의 양과 키트가 요구된다. 이는 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담 및 다수의 검출용 키트 사용에 따른 경제적 부담을 유발할 뿐만 아니라, 질병의 조기 진단에도 어려움을 가져올 수 있어 2종 이상의 바이오마커를 동시에 진단할 필요가 있다.
따라서 미량의 생체 시료를 이용하여 2종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있도록, 높은 민감도와 다중 진단이 가능한 기술이 요구되는 실정이다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 0001) 한국등록특허 제1431062호, "유방암 진단용 다중 바이오마커 세트, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트" (공개일: 2013.09.23)
(특허문헌 0002) 한국공개특허 제20170096619호, "3차원 단백질 나노입자 프로브 기반 복수 질환의 동시검출 방법 및 키트" (공개일: 2017.08.24.)
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, a) 기판에 핵산 또는 핵산 유사체를 타겟 물질로서 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 기판에 도입된 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 c) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 상기 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 상기 억셉터 형광 물질을 포함하는 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법이 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장보다 짧고, 상기 도너 형광 물질의 발광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 발광도가 최대인 파장보다 짧을 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질을 여기시키기 위한 여기광의 파장에서 상기 도너 형광 물질의 흡광계수(extinction coefficient)가 상기 억셉터 형광 물질의 흡광계수보다 3배 이상 큰 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질의 포스터(Forster) 반경은 0.208 nm 이상일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도너 형광 물질 및 상기 억셉터 형광 물질은 링커에 의해 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 별도 스트랜드와 결합된 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 링커의 길이는 10nm 이하인 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상술한 타겟 물질 검출방법은 상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상이 되도록 광학필터의 파장을 제어하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 별도 스트랜드는 상기 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드; 및 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질이 2종 이상이고, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나는 검출하고자 하는 상기 타겟 물질들의 종류에 따라 서로 다른 염기서열을 갖거나, 종류 또는 부착 위치가 서로 다른 형광 물질을 갖는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 타겟 물질의 판독 후 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나 이상을 제거한 다음 제거한 것과 상이한 도너 스트랜드 또는 상이한 억셉터 스트랜드를 적용하여 상기 d) 단계를 수행함으로써 타겟 물질들을 종류별로 판독하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도킹 스트랜드에 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 사이의 갭의 간격은 상기 도킹 스트랜드의 지속길이(persistence length)보다 짧은 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상을 유지하면서, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 상기 도킹 스트랜드에 결합하는 데 필요한 시간이 10분 이내가 되도록 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 경우 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도가 10nM 내지 10uM일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 8 이상일 수 있다. 이때 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 6 내지 12일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산 유사체일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 5 이상일 수 있다. 이때 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 3 내지 9일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 억셉터 스트랜드 또는 상기 도킹 스트랜드는 각 스트랜드 내에서 서로 프렛쌍을 형성하는 형광 물질들을 2종 이상 구비할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 별도 스트랜드는 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 별도 스트랜드는 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프렛에 의한 형광 신호의 측정은 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것일 수 있다.
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
일 구현예에 있어서, 상기 FRET 효율의 측정은 상기 도너 또는 상기 억셉터의 광표백 전후의 빛의 밝기를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프렛쌍들 사이의 간격은 각 프렛쌍의 FRET 효율에 영향을 미치지 않도록 조절된 것일 수 있다. 이때 상기 프렛쌍들 사이의 간격은 적어도 5nm인 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 판독 단계는 형광 물질들 간 거리에 따라 서로 구분되는 프렛(FRET) 효율의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 판독 단계는 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 형광 신호를 이미징하는 영역의 단위 면적당 상기 타겟 물질들의 개수로부터 상기 시료 중의 상기 타겟 물질의 농도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함하되,
상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, a) 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브; 및 b) 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비되며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질인 핵산 또는 핵산 유사체의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되, 상기 별도 스트랜드는 적어도 하나의 도너 형광 물질을 구비한 도너 스트랜드; 및 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비한 억셉터 스트랜드를 포함하며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 태그 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함하되, 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질을 부착하기 위한 기판을 더 포함할 수 있다. 상기 기판에는 상기 타겟 물질을 포획하기 위한 1종 이상의 포획 프로브가 고정될 수 있다. 상기 포획 프로브는 태그 스트랜드를 구비할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 상기 검출 프로브의 태그 스트랜드 및 상기 포획 프로브의 태그 스트랜드와 상보적으로 결합함으로써 프렛쌍을 형성할 수 있는 브릿지 스트랜드를 더 포함할 수 있다.
도 1a 내지 도 1k는 FRET-PAINT의 원리와 특성을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2e는 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3h는 FRET-PAINT의 다중화 성능을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 다양한 농도 범위의 바이오마커를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도너와 억셉터의 각 스펙트럼 간의 겹침을 나타낸다.
도 6은 도킹 스트랜드와 결합된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 나타낸다.
도 7은 도너 형광물질(실선)과 억셉터 형광물질(점선)의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8a는 카메라로 측정한 억셉터 형광 신호를 나타낸다.
도 8b는 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교한 그래프이다.
도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 태그 스트랜드에 표지된 도너 및 억셉터를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 단일분자 현미경을 이용하여 이미징하는 과정을 나타낸 것이다.
도 12는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 도너 및 억셉터의 FRET 효율 측정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 2 이상의 도너-억셉터 FRET쌍이 표지된 태그 스트랜드를 나타낸 것이다.
도 14는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 2 이상의 도너-억셉터 FRET쌍의 도너 및 억셉터의 조합의 경우를 나타낸 것이다.
도 15는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커의 종류 검출을 개략적으로 도시한 것이다.
도 16은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 17은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 18은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 19 내지 도 21는 본 명세서에 개시된 기술의 다양한 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 23은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 26은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 27은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 28은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 흡광 스펙트럼 및 발광 스펙트럼 데이터를 나타낸 것이다.
도 29는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 30은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 도너 스트랜드의 농도를 달리하여 형광 이미지를 측정한 것이다.
도 31은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 32는 도너와 억셉터 간의 거리에 따른 발광스펙트럼의 차이를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 33은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 34a 내지 도 34c는 2종 이상의 억셉터가 표지되는 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 35a 및 도 35b는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 36a 및 도 36b는 본 명세서에 개시된 기술의 몇몇 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트들을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 37은 상기 도 36b와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 포함되는 검출용 키트를 이용하여 바이오마커의 종류를 판별하는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 38a 및 38b는 본 명세서에 개시된 기술의 몇몇 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트들을를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 39는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 마이크로 RNA 검출용 키트를 예시적으로 도시한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대하여 간단히 설명한다.
본 명세서에서 "바이오마커"는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인할 수 있는 생체물질을 모두 포함한다.
본 명세서에서 "프렛"은 인접한 2개의 형광 물질의 공명에 의해 에너지가 전달되는 메커니즘을 의미한다. 구체적으로는, 빛에 의해 여기(excited)된 형광 물질의 에너지가 인접한 다른 형광 물질에 전달되는 현상을 일컫는 용어로, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "프렛 효율"은 빛에 의해 여기(excited)된 형광 물질의 에너지가 인접한 다른 형광 물질에 전달되는 현상을 이용하여, 형광 물질 사이의 거리에 따라 상이한 에너지 전달 효율을 값으로 나타낸 것을 의미하고, 당업자가 인식하는 통상적인 프렛 효율의 의미를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "도너"는 빛을 받아 여기되면 에너지를 전달하는 형광 물질을 의미하고, 2 이상의 형광 물질이 인접하는 경우, 상대적으로 짧은 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광 물질을 의미한다.
본 명세서에서 "억셉터"는 여기상태의 도너로부터 에너지를 전달받는 형광 물질을 의미하고, 2 이상의 형광 물질이 인접하는 경우, 상대적으로 긴 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 형광 물질을 의미한다.
본 명세서에서 "스트랜드"는 생체고분자의 사슬 또는 생체고분자를 모사하여 합성한 고분자의 사슬로서, 상기 생체고분자는 단일가닥 또는 이중가닥 구조를 가질 수 있으며, 핵산, 핵산 유사체, 폴리펩타이드 또는 탄수화물을 포함한다. 상기 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함하고, 상기 핵산 유사체는 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모폴리노 핵산(MNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA)을 포함한다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 다양한 구현예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 구현예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 구현예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 구현예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 다양한 구현예들을 설명함에 있어, 동일한 구성 요소는 달리 설명되지 않는 한 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
최근 단분자 형광현미경 기술의 개발로 분자를 하나씩 관찰할 수 있게 되었고 이를 바이오마커 검출에 적용함으로써 민감도는 fg/ml 수준으로 1000배 가량 증가하게 되었다(Nature 473, 484-488, 2011). 통상적으로 사용하는 형광 이미징에서는 관찰하려는 분자에 형광 물질을 고정하여, 서로 다른 종류의 바이오마커를 형광신호를 이용해 구분하는 방법을 사용한다. 이때 각각 서로 다른 색의 형광 물질을 고정하고 색깔 차이를 이용해 바이오마커의 종류를 구분하는 방법을 사용하나, 통상의 이미지 센서로 구분하여 관찰할 수 있는 형광 물질의 종류는 3~4가지 정도이다. 따라서, 단분자 형광현미경 기술을 사용할 경우, 민감도는 fg/ml로 기존 방법에 비해 1000배 가량 증가하나 검출할 수 있는 바이오마커의 종류는 여전히 3~4 가지 정도로 제한된다.
한편, 단분자 형광현미경 기술에 DNA-PAINT 기술(Nature Methods 11, 313-318, 2014)을 적용함으로써 높은 민감도를 유지하는 동시에 다양한 바이오마커를 동시에 분석할 수 있다. 관찰하고자 하는 바이오마커에 형광 물질 대신 도킹 스트랜드가 결합되어 있는 검출항체를 붙이고, 도킹 스트랜드에 잠시 (수 초 이내) 붙었다가 떨어지는 이미저 스트랜드에 형광 물질을 붙인 후 도킹 스트랜드에 결합된 이미저 스트랜드의 형광 신호를 검출함으로써 높은 민감도를 유지한 채 한 가지 색의 형광 물질로 많은 종류의 바이오마커를 검출할 수 있다.
그러나, DNA-PAINT 기술을 이용할 경우 이미저 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합했는지 여부와 무관하게 모든 이미저 스트랜드가 형광 신호를 방출하므로 높은 노이즈가 생성되며, 이로 인해 이미저 스트랜드의 농도는 수 nM ~ 수십 nM로 제한되어 검출 속도가 느려지는 단점이 발생한다.
이에, 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따르면, 단분자 형광현미경의 높은 민감도를 유지하면서 다양한 타겟 물질을 동시에 검출하는 방법으로서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)에 기초한 DNA-PAINT 기술인 FRET-PAINT 기술이 제공된다. FRET이란 최초에 여기된 도너(donor)의 여기된 상태의 에너지가 억셉터(acceptor)로 전달되는 현상을 의미한다. 도너 물질은 일반적으로 억셉터 물질에 비해 더 짧은 파장의 빛을 방출하게 되는데, 이때의 방출 파장은 억셉터의 흡수 파장과 중첩(spectral overlap)된다. 에너지 전달 속도와 효율은 도너의 방출 파장과 억셉터의 흡수 파장의 중첩의 정도, 도너의 양자 효율, 도너와 억셉터의 전이 쌍극자의 상대적인 배열 정도, 그리고 도너와 억셉터 사이의 거리 등에 의존하게 된다.
예를 들어 FRET-PAINT 기술에 따르면, 도킹 스트랜드에 두 가지 DNA 결합 자리들을 가질 수 있으며, 각각 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 위한 자리가 될 수 있다. 단일 분자 국지화(single-molecule localization)를 위해서 억셉터의 FRET 신호가 사용된다. FRET-PAINT 기술을 사용하면 억셉터가 직접 여기되지 않고 FRET에 의해 여기되어 이미저(도너 및 억셉터) 농도를 수십~수백배 높일 수 있으므로 DNA-PAINT에 비해 이미징 스피드가 수십~수백 배 향상될 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 타겟 물질 검출방법이 제공된다. 상기 타겟 물질 검출방법은 a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 전부 또는 일부를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함한다.
각 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저 상기 a) 단계에서 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입한다.
상기 기판은 타겟 물질을 포획하고 관찰하기 위한 영역으로 그 형태는 특별히 제한되지 않으나, 평판, 구형 입자, 막대형 구조, 및 기타 비정형 구조의 형태를 가질 수 있으며 그 재질도 유리, 석영, 플라스틱 등으로 이루어질 수 있다. 상기 기판은 통상 유리 재질로 된 평판 형태의 슬라이드 글라스나 커버슬립일 수 있다. 바람직하게는 상기 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다.
상기 시료는 검출 대상이 되는 타겟 물질을 함유한 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점막액, 뇨 등일 수 있으며, 예를 들어 질환이 의심되는 동물 또는 인간 개체로부터 분리 수득된 것일 수 있다.
상기 타겟 물질은 관심있는 검출 대상이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 금속(Ca, Mg, Pb 등), 금속 이온 또는 생체물질일 수 있다. 상기 생체물질은 바이오마커, 혈액, 혈장, 혈청, 체액, 단백질, 펩타이드, 핵산, 박테리아, 바이러스, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 타겟 물질은 바이오마커일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 세포, 조직 및 기관 등을 관찰하는 데 사용될 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술이 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하고, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 구체적으로는 AFP(alpha fetoprotein), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼시토닌(calcitonin), 칼레티닌(calretinin), CEA(carcinoembryonic antigen), CD34, CD99, MIC-2, CD117, 크라모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴(cytokeratin, various types: TPA, TPS, Cyfra21-1), 데스민(desmin), EMA(epithelial membrane antigen), Factor VIII, CD31, FL1, GFAP(glial fibrillary acidic protein), GCDFP-15(gross cystic disease fluid protein), HMB-45, hCG(human chorionic gonadotropin), 면역글로불린(immunoglobulin), 인히빈(inhibin), 케라틴(keratin, various types of keratin), 백혈구 마커(lymphocyte marker), MART-1(Melan-A), Myo D1, MSA (muscle-specific actin), 뉴로필라멘트(neurofilament), NSE(neuron-specific enolase), PLAP(placental alkaline phosphatase), PSA(prostate-specific antigen), PTPRC(CD45), S100 protein, SMA(smooth muscle actin), 시냅토파이신(synaptophysin), TK(thymidine kinase), Tg(thyroglobulin), TTF-1(thyroid transcription factor-1), M2-PK, 바이멘틴(vimentin), 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(integrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR, FGF, BRAF, GFEB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(mucin), 렉틴(lectin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
또한 상기 시료는 상기 바이오마커가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 상기 시료에 포함된 상기 바이오마커의 농도는 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 크게 차이가 날 수 있다. 바람직하게는 이미지 센서에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다. 바람직하게는 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1000의 중량비로 수 차례 희석하여 사용할 수 있다.
상기 타겟 물질은 상기 기판에 직접 부착될 수도 있고, 상기 기판에 부착된 포획 프로브를 통해 상기 기판에 도입될 수도 있다. 한편, 상기 기판은 표면에 원치 않는 항원, 항체, 형광 물질 등이 붙지 않도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 아크릴아마이드를 포함한 적절한 중합체로 코팅될 수 있다.
상기 포획 프로브는 타겟 물질과 특이적으로 결합하여 기판에 고정시키는 역할을 수행하는 물질로서, 항체 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 포획항체일 수 있다. 상기 포획항체의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 상기 기판에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 상기 포획항체를 상기 기판에 부착시킬 수 있다.
예를 들어 검출 대상인 바이오마커는 측정 과정의 속도 및 편의성을 위해 포획항체에 의하지 않고 기판의 표면에 직접 부착될 수 있으며, 측정 결과의 정확성을 높이기 위해 바이오마커 분자는 기판의 표면에 고정되어 있는 포획항체에 항원-항체 반응을 통해 부착될 수 있다.
상기 바이오마커를 기판의 표면에 직접 부착하는 경우, 예를 들어 커버 슬립을 비드 용액으로 코팅한 다음 시료에 해당하는 세포를 배양하여 고정시켜 사용할 수 있다. 또한 상기 포획 항체를 기판에 흡착시켜 사용할 경우, 이러한 부착은 예컨대 pH 9.5인 0.06M 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획 항체를 희석시키고 하고 그 희석액을 기판에 일정 온도에서 일정 시간 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 그 다음 기판에 흡착된 포획 항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리할 경우 그 시료 중의 바이오마커와 결합체를 형성하게 되며, 결합체가 형성된 후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 Tween 20과 같은 세척 완충액이나 증류수 등의 세척제로 세척하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 b) 단계에서, 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시킨다. 상기 검출 프로브는 항체 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 검출 대상인 바이오마커와 특이적으로 결합할 수 있는 검출항체에 도킹 스트랜드를 태깅할 수 있다.
본 명세서에서 상기 포획항체와 검출항체로서 사용되는 '항체'는 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어, 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다.
검출 프로브인 항체 또는 압타머에 도킹 스트랜드를 부착하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 단백질 분자와 핵산 분자를 결합시키는 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 서로 다른 반응기를 동시에 가지고 있는 화합물을 사용하여 핵산 분자와 단백질 분자 간의 결합 반응을 수행하여 부착할 수 있다. 일례로 SMCC (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)는 아민(amine)에 반응하는 NHS-ester와 싸이올(thiol)에 반응하는 말레이미드(maleimide) 그룹을 가지고 있는데, 싸이올기가 부착되어 있는 도킹 스트랜드를 SMCC와 반응시킨 후 그 결과물을 검출항체와 반응시키면 검출항체의 N-말단 또는 라이신에 있는 아민기와 반응하여 검출항체에 도킹 스트랜드를 붙일 수 있다.
측정의 정확성 면에서, 상기 검출항체는 1차 항체일 수 있으며, 도킹 스트랜드가 1차 항체에 부착될 수 있다. 한편 측정 속도의 신속성 면에서, 상기 검출항체는 1차 항체 및 2차 항체의 조합으로 사용될 수 있으며, 도킹 스트랜드가 2차 항체에 부착될 수 있다.
상기 1차 항체는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 면역글로불린일 수 있으며 항체의 종류는 제한되지 않는다. 후술할 실시예에서는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체, 항-Tom20(anti-Tom20) 또는 항-Th20(anti-Th20) 항체가 사용되었다.
상기 2차 항체는 바이오마커에 결합한 1차 항체에 결합하는 항체를 의미하고 사용하는 항체의 종류는 제한되지 않는다. 후술할 실시예에서는 당나귀 항-래빗 IgG(Donkey anti-rabbit IgG) 항체 또는 당나귀 항-랫 IgG(donkey anti-rat IgG) 항체가 사용되었다.
다음 c) 단계에서, 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시킨다.
이때 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것일 수 있다.
상기 별도 스트랜드는 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있는 스트랜드로서 스트랜드에 부착된 형광 물질에 따라 도너 스트랜드(donor strand), 억셉터 스트랜드(acceptor strand), 프렛 스트랜드(fret strand) 등으로 구분될 수 있다. 상기 도너 스트랜드는 도너 역할을 하는 형광 물질을 구비한 스트랜드이고 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도너 형광 물질의 에너지를 전달받아 여기될 수 있도록 억셉터 역할을 하는 형광 물질을 구비한 스트랜드이다. 상기 프렛 스트랜드에는 하나의 스트랜드 내에 서로 프렛쌍을 형성하는 도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질이 동시에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 별도 스트랜드는 상기 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드; 및 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있다.
서로 다른 두 종류의 형광 물질이 매우 가까이 위치할 때 한 형광물질(도너)의 에너지가 다른 형광 물질(억셉터)로 전달되는 현상을 FRET이라 하는데, 이러한 현상을 이용하여 타겟 물질을 효과적으로 검출할 수 있다. 억셉터가 빛을 내기 위해서는 도너로부터 에너지를 전달받아야만 하고, 이는 오로지 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합할 때만 일어나므로 억셉터의 형광 신호가 나타나는 곳에 타겟 물질이 위치함을 알 수 있다.
도 1b는 도 1a의 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용한 FRET-PAINT 기술을 사용하여 타겟 물질을 검출하는 원리를 나타낸다. 프렛(FRET)이 일어나면 도너의 에너지가 억셉터로 전달되어 도너는 어두워지고 억셉터가 밝게 빛을 내는 것을 알 수 있다.
상기 방식은 DNA-PAINT의 이미저 스트랜드를 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드로 나눈 것으로, 이때 도너 스트랜드에 표지된 형광 물질을 λex 파장의 빛으로 여기(excitation)하여 나타나는 도너의 형광 신호를 광학 필터로 제거하여 억셉터의 형광 신호를 관찰할 수 있다. 즉 모든 도너 형광 물질은 빛을 내지만 광학필터에 의해 모두 제거되고, 관찰하고자 하는 억셉터 형광 물질은 도너를 여기하는 λex 파장의 빛에 직접 여기되지 않아 배경잡음이 매우 낮아질 수 있다. DNA-PAINT와 달리 도너에 의한 배경잡음은 무시할 정도로 작으므로 도너 스트랜드의 농도를 예를 들어 수백 nM 정도로 매우 높일 수 있어 측정 속도가 수백 배 빨라지는 장점이 있다.
일 구현예에서, 상기 별도 스트랜드는 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 도킹 스트랜드에 상기 형광 물질로서 양자점을 도입할 경우 형광 단백질(fluorescent protein), 유기 형광분자(organic fluorophore) 등에서 발생하는 광표백(photobleaching) 현상이 일어나지 않는다. 따라서 도너 형광물질의 광표백 문제를 해결하기 위해 도입했던 도너 스트랜드가 불필요해지고, 도너 스트랜드를 사용하지 않음으로써 배경잡음이 낮아져 신호대잡음비가 높아지고, 구성이 간단해져 경제성이 높아지며, 분석 과정이 간단해질 수 있다.
상기 도킹 스트랜드(docking strand)나 상기 별도 스트랜드를 포함한 스트랜드는 핵산, 폴리펩타이드, 또는 탄수화물일 수 있다. 바람직하게는 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드가 상보적 결합이 가능하고, 합성이 용이하고 저렴한 동시에, 원하는 부위에 형광 물질을 부착하기 용이하다는 측면에서, 상기 스트랜드는 핵산일 수 있다.상기 핵산은 상보적 결합이 가능한 DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA 및 TNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 단일 가닥(single strand) 또는 이중 가닥(double strand)을 가질 수 있다.
상기 도킹 스트랜드는 상기 검출 프로브에 결합되어 있는 가닥이며, 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 등이 상기 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 이미저 스트랜드(imager strand)는 DNA-PAINT 기술을 이용할 경우에 사용될 수 있으며, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 FRET-PAINT 기술을 이용할 경우 사용될 수 있다.
상기 이미저 스트랜드의 염기서열은 검출하는 바이오마커의 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있으며, 예를 들어, 두 가지의 서로 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 경우에는, 두 개의 이미저 스트랜드가 최소 하나 이상의 염기가 다를 수 있다. 즉 바이오마커의 종류 수에 상관없이 바이오마커의 종류에 따라 결합하는 각각의 이미저 스트랜드의 염기서열이 모두 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드는 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, N가지의 서로 상이한 바이오마커를 검출하는 경우 N개의 도너 스트랜드와 N개의 억셉터 스트랜드가 이용될 수 있으며, 이들의 염기서열이 상이할 수 있다. 즉, 도너 스트랜드에 대해서 각각의 도너 스트랜드가 최소 하나 이상의 염기가 다르고, 상이한 바이오마커에 결합하는 각각의 억셉터 스트랜드도 최소 하나 이상의 염기가 다르며, 각각의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 염기서열이 모두 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 억셉터 스트랜드는 전체 검출대상 바이오마커에 대해서 동일하거나, 일부 바이오마커에 대해서 동일한 염기서열을 가지고, 상기 도너 스트랜드는 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 두 가지 상이한 바이오마커를 검출하는 경우, 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 도너 스트랜드의 염기서열은 최소 하나 이상의 염기가 다르나, 동일한 염기서열을 가진 한 가지 억셉터 스트랜드를 검출에 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 도너 스트랜드는 전체 검출대상 바이오마커에 대해서 동일하거나, 일부 바이오마커에 대해서 동일한 염기서열을 가지고, 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도너 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 두 가지 서로 상이한 바이오마커를 검출하는 경우, 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 억셉터 스트랜드는 최소 하나 이상의 염기가 다르나, 한 가지 도너 스트랜드를 검출하는 데 사용할 수 있다.
또한, 상기 도킹 스트랜드는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드에 대해 상보적인 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "스트랜드"는 일반적인 형태, 형광 물질 부착이 가능하도록 기능기가 도입된 형태, 또는 형광 물질이 이미 부착된 형태 등 다양한 형태를 가질 수 있다. 상기 스트랜드에 기능기를 도입하면 원하는 위치에 원하는 형광 물질을 부착할 수 있으며 하나의 스트랜드에 동일 또는 상이한 기능기를 여러 개 부착시킬 수도 있다. 스트랜드의 어느 위치에 도너와 억셉터를 부착하느냐에 따라 도너와 억셉터 사이의 거리가 달라지고 FRET 효율 또한 달라질 수 있다. 이러한 성질을 이용하면 타겟 물질의 다중 검출이 가능하다.
상기 형광 물질은 자외선, 전기에너지, 열에너지 등의 외부 에너지에 의해 여기되어 그 에너지를 빛으로 바꾸는 물질로서, 유기 형광체 또는 무기 형광체를 포함할 수 있다. 상기 유기 형광체의 예는 로다민(Rhodamine), 알렉사(Alexa) Fluor dye, 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), FAM(5-carboxy fluorescein), ATTO dye, BODIPY, CF dye, Cyanine(Cy) dye, DyLight Fluor 및 텍사스 레드(Texas Red)일 수 있고, 상기 무기 형광체의 예는 양자점을 들 수 있다.
이때 상기 도너 스트랜드(donor strand)에 결합되어 있는 형광 물질의 발광스펙트럼 최대값의 파장은 상기 억셉터 스트랜드(acceptor strand)에 결합되어 있는 형광 물질의 흡광스펙트럼 최대값의 파장보다 짧다.
한편 도너와 억셉터 관계인 두 형광 물질 사이의 FRET 신호 강도는 프렛쌍을 이루는 두 형광 물질 사이의 거리와 관계가 있다. 예를 들어 DNA 스트랜드의 경우 A, T, G, C 네 종류의 염기, 5탄당 및 인산을 포함하는 뉴클레오타이드가 선형으로 길게 이어져 있고 두 개의 가닥이 염기-염기 간에 상보적으로 결합한다. 각 뉴클레오타이드의 염기, 5탄당 또는 인산 중 어디든 원하는 작용기나 형광 물질을 부착할 수 있으며 DNA 이중 나선에서 인접한 두 염기 사이의 거리가 0.34nm이므로 매우 정밀하게 프렛쌍의 거리를 조절할 수 있다. 만약 서로 다른 두 개의 형광 물질을 M개의 염기를 사이에 두고 한 가닥의 DNA에 표지하고 싶다면 특정 염기에 아민을 달고 M개 떨어진 염기에 thiol(sulfhydryl; SH)기를 단다. 그 다음 아민과 반응하는 NHS-ester가 달린 형광물질 A와 thiol과 반응하는 maleimide가 달린 형광 물질 B를 DNA와 반응시킴으로써 프렛쌍을 표지할 수 있다. 여러 서로 다른 반응기를 사용함으로써 3개 이상의 형광 물질 표지도 가능하다. (ex: DNA 특정 위치에 알데하이드기를 부착하고 알데하이드기와 반응하는 하이드라자이드가 달린 형광 물질 C 부착)
상기 타겟 물질과 상기 검출 프로브 또는 상기 포획 프로브 사이의 특이적 결합 반응은 샌드위치 ELISA와 같은 면역반응에 의한 결합 방식 또는 특이적 압타머(aptamer) 결합 방식에 의해 진행될 수 있다.
다음 d) 단계에서, 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독함으로써 타겟 물질을 검출할 수 있다. 상기 형광 신호의 측정은 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 전부 또는 일부를 측정하는 방식일 수 있다. 예를 들어 타겟 물질들을 프렛 효율로 구분할 때는 각 형광물질 스펙트럼의 일부(주로 피크)만을 측정하고, 스펙트럼 모양으로 구분할 때는 스펙트럼의 전부를 측정할 수 있다.
상기 d) 단계는 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 형광신호는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하거나 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생할 수 있으며, 구체적으로는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하여 일정시간 머무르거나, 도너 스트랜드에 결합된 형광 물질(도너)과 억셉터 스트랜드에 결합된 형광 물질(억셉터)이 도킹 스트랜드에 의해 일정시간 매우 가까이 위치하였을 때 형광신호가 발생할 수 있다. 상기와 같이 발생한 형광신호는 고감도 이미지 센서(EMCCD, sCMOS, iCMOS 등)를 이용하여 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출방법은 상기 타겟 물질의 판독 후 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나 이상을 제거한 다음 제거한 것과 상이한 도너 스트랜드 또는 상이한 억셉터 스트랜드를 적용하여 상기 d) 단계를 수행함으로써 타겟 물질들을 종류별로 판독하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에는 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 모두를 제거한 후에 상이한 스트랜드들을 조합하여 적용할 수도 있고, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 중 하나를 도킹 스트랜드에 안정적으로 결합시켜 제거하지 않고 공통 스트랜드로 사용하고 안정적으로 결합되지 않은 나머지 스트랜드를 제거하는 경우를 포함한다.
상기 방법에 따르면, 각 스트랜드의 염기서열을 차이를 이용해 다중 검출을 하므로 N종의 타겟을 검출하기 위해서 관찰하고자 하는 타겟의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드 (또는 억셉터 스트랜드 또는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 모두)를 N회 넣어주고 씻어내는 과정을 반복할 수 있다. 예를 들어, 다중 검출을 위해서 하기의 과정으로 상기 c) 및 상기 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 수행함으로써 다중 바이오마커를 검출할 수 있다. 상기 도너 스트랜드에 형광 물질이 결합되어 있는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 결합시킨 다음, 발생하는 형광 신호를 검출한다. 그 다음 기 결합된 스트랜드(들)을 제거하고, 상이한 스트랜드(들)을 이용하여 동일한 방법을 반복하여 형광 신호를 검출할 수 있다. 이러한 과정을 여러 번 반복하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 바이오마커를 검출할 수 있다. 예를 들어, 9개의 염기로 이루어진 도너 스트랜드는 4의 9제곱에 해당하는 262,144개의 염기서열을 가질 수 있고 이는 인체 내 모든 단백질의 수보다 크므로 모든 바이오마커에 서로 다른 염기서열의 도킹 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 배정함으로써 모든 바이오마커를 순차적으로 측정할 수 있다.
도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질 사이의 FRET 반응은 다양한 방식으로 측정될 수 있다.
형광 신호가 발생할 때 통상 회절 현상에 의해 실제 타겟 물질이 차지한 영역보다 더 큰 영역에서 빛이 발생하므로 기판 상에 두 종류의 타겟 물질이 매우 가까이 위치하고 동시에 형광 신호를 낼 경우에 점 형태의 발광 영역이 겹쳐 정확한 측정이 어려울 수 있다.
일 구현예에서, 도킹 스트랜드 자체에 억셉터 형광 물질이 표지되어 있거나 억셉터 스트랜드가 결합되어 있는 상태에 있는 경우, 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하는 순간 나타나는 형광 신호의 FRET 효율 또는 발광 스펙트럼을 측정하여 바이오마커를 검출할 수 있다. 이때에는 모든 도킹 스트랜드에 최소 한 번 이상 도너 스트랜드가 결합하여 FRET 효율 또는 발광 스펙트럼을 측정해야 하므로 모든 바이오마커를 검출하는 데 다소 시간이 걸릴 수 있으나(수십 초~수 분), 매우 근접한 두 개의 바이오마커를 구분할 수 있다. 매우 가까운 두 개의 형광 물질이 동시에 빛을 낸다면 카메라에는 두 배 밝은 하나의 점으로 보이고 각 형광 물질의 FRET 효율을 구분할 수 없지만, 두 개의 형광 물질이 시간을 두고 하나씩 빛을 낸다면 각 점의 정확한 위치와 FRET 효율을 측정할 수 있으므로 두 바이오마커가 무엇인지 알 수 있다. 또한 다중 검출을 위해 한 도킹 스트랜드에서 여러 FRET 효율을 검출할 수 있다는 장점도 있다. 만약 여러 개의 FRET 효율을 갖는 형광 물질들이 동시에 빛을 방출한다면 각각의 FRET 효율을 알 수 없다.
일 구현예에서, 도킹 스트랜드에 도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질이 모두 표지되어 있거나 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 모두 결합되어 있는 상태에서 도너를 여기시키고 형광신호를 측정할 수도 있다. 이때 도너를 여기하자마자 모든 형광분자가 빛을 내므로 짧은 시간에 측정할 수 있으나 바이오마커의 농도가 높아 형광분자 사이의 거리가 가까워 점 형태의 발광 영역이 겹치면 정확한 측정이 어려울 수 있고, 한 바이오마커에서 여러 FRET 효율을 측정할 수 없어 다중검출할 수 있는 수가 줄어들 수 있다. 하지만 발광 스펙트럼을 측정하는 경우에는 스펙트럼의 모양으로 판단하므로 다중검출에 문제가 없을 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다. 상기 타겟 물질 검출용 키트는 a) 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브; 및 b) 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함한다. 이때 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비되며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질을 부착하기 위한 기판이 더 포함될 수 있다. 상기 타겟 물질을 제외한 다른 물질의 비특이적 결합을 제외하거나 상기 타겟 물질의 부착을 용이하게 하기 위해 기판 위에 적절한 코팅층이 도입되거나 표면개질이 행해질 수 있다. 상기 타겟 물질은 상기 기판 위에 직접 부착되거나 상기 기판에 미리 부착된 포획 프로브를 통해 포획되는 방식으로 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 a) 도킹 스트랜드가 결합된 1종 이상의 검출항체; 및 b) 형광 물질이 결합된 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있으며, 바이오마커에 상기 도킹 스트랜드가 부착된 검출항체를 결합시키고, 상기 도킹 스트랜드를 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트일 수 있다.
상기 키트는 i) 기판, ii) 포획항체, iii) 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체; 또는 도킹 스트랜드가 결합되지 않은 1차 검출항체 및 도킹 스트랜드가 결합된 2차 검출항체, 및 iv) 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 기판, 포획항체, 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드로 구성될 수 있다.
상기 키트는 바이오마커를 검출하기 위한 체외진단 제품일 수 있으며, 예를 들어 RUO(research use only) 또는 IUO(investigational use only) IVD(in vitro diagnostic) 제품일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 시료 중의 타겟 물질이 핵산 또는 핵산 유사체인 타겟 물질 검출방법이 제공된다. 상기 방법은 a) 기판에 핵산 또는 핵산 유사체를 타겟 물질로서 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 기판에 도입된 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및 c) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서는 상술한 일 측면에 따른 기술과 달리 타겟 물질이 핵산 또는 핵산 유사체이므로 도킹 스트랜드를 이미 구비한 것과 같다는 것이다. 바람직하게는 생명체의 정상 또는 병리적인 상태를 확인 할 수 있다는 면에서 상기 타겟 물질은 RNA, miRNA(microRNA), cfDNA(cell-free 또는 circulating free DNA), ctDNA(circulating tumor DNA)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 타겟 물질 검출방법은 a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 핵산을 기판의 표면에 부착하는 단계; b) 상기 a) 단계의 핵산에 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 형광 신호 검출 후 기 결합된 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 RNA 종류 개수만큼 반복하여 바이오마커를 다중 검출할 수 있다.
상기 각 단계를 구체적으로 설명하자면, i) 먼저 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 핵산을 기판의 표면에 부착한다. 상기 핵산은 바이오마커로 기능할 수 있어 검출대상이 될 수 있는 핵산을 나타내며, 바람직하게는 비-코딩 RNA(Non-coding RNA)일 수 있다. 상기 비-코딩 RNA는 특정 단백질에 대한 아미노산 코드가 없는 RNA의 유형으로, 유전자 서열을 번역하는 mRNA와 달리 다양한 형태로 존재하며, mRNA 부산물, 분해물 또는 별도의 전사과정을 통해 생성될 수 있으며, 염색체 활동이나 단백질 발현을 조절하는 역할 등을 하는 것으로 알려져 있다. 검출 대상이 되는 RNA는 miRNA, snRNA, snoRNA, aRNA, siRNA, piRNA, exRNA, scaRNA와 같은 작은 RNA를 포함하며, 바람직하게는 마이크로 RNA일 수 있다.
상기 마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)는 약 22개의 염기로 구성된 작은 비발현 RNA 분자로, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현 조절 등의 기능을 하는데 혈액, 소변 등 다양한 생체액에서 발견되고 다양한 질병에 의해 그 수치가 변화하여 바이오마커로서 각광받고 있다.
타겟 물질이 핵산인 경우 항원-항체 반응으로 포획할 수 없으므로, 검출하고자 하는 핵산의 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 포획프로브를 기판에 고정한 후, 이 포획프로브와 상보적으로 결합하도록 하여 핵산를 기판의 표면에 부착한다. 상기 시료는 핵산가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 시료에 포함된 핵산 농도는 그 종류에 따라 매우 크게 차이 나므로 이미지 센서에 적당한 수의 핵산 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다.
다음 ii)단계로서, 상기 i)단계의 핵산에 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시킨다. 이때 상기 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 핵산 단일 가닥 부위와 상보적으로 결합할 수 있도록 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 염기서열을 정할 수 있다. 한편 상기 포획프로브, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드는 DNA, RNA, PNA, LNA 등에서 선택될 수 있다.
다음 iii)단계에서, 상기 ii)단계에서 발생하는 형광 신호를 검출한다. 상기 형광신호는 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 핵산 단일 가닥 부위에 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생할 수 있다. 보다 구체적으로는 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 핵산 단일 가닥 부위에 이미저 스트랜드가 결합하여 일정시간 머무르거나, 도너 스트랜드에 결합된 형광 물질(도너)와 억셉터 스트랜드에 결합된 형광 물질(억셉터)가 핵산에 의해 일정시간 매우 가까이 위치하였을 때 형광 신호가 발생할 수 있다. 상기와 같이 발생한 형광신호는 초감도 이미지 센서(EMCCD, sCMOS, iCMOS 등)를 이용하여 검출할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 시료 중의 타겟 물질로서 핵산 또는 핵산 유사체를 검출하기 위한 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다. 상기 타겟 물질 검출용 키트는 타겟 물질인 핵산 또는 핵산 유사체의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함한다. 이때 상기 별도 스트랜드는 적어도 하나의 도너 형광 물질을 구비한 도너 스트랜드; 및 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비한 억셉터 스트랜드를 포함하며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 a) 형광 물질이 결합된 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함하며, 핵산에 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트일 수 있다.
상기 키트는 상기 핵산을 부착하기 위한 기판을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 기판에는 검출대상 핵산의 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 포획프로브가 고정된 것일 수 있다. 또는 상기 기판은 포획프로브를 부착할 수 있도록 표면처리된 것일 수 있다.
후술할 실시예들을 통해 하기와 같이 FRET-PAINT가 종래의 DNA-PAINT보다 우수한 장점을 확인하였다.
FRET-PAINT가 현미경으로 검사가 가능한지 확인하기 위하여, 석영 표면에 도킹 스트랜드를 고정시킨 다음 형광 물질이 결합된 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 주입한 후, 단일분자 이미지를 촬영한 결과 형광 강도가 명확하게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 1-1, 도 1c 참조).
또한 2개의 FRET 페어(Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5)를 이용하여 동일한 실험을 실행한 결과, Alexa488-Cy5 FRET 페어(FRET pair)는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 2nt 일 때, Cy3-Cy5 FRET 페어는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 6 nt 일 때 형광신호가 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 1-1, 도 1d 참조).
초고해상도 형광 이미징을 측정하여 다양한 DNA 농도에서 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 신호에 대한 노이즈 비율(signal-to-noise ratio, SNR)을 비교한 결과, DNA-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 5nM 이상일 때 단일-분자 이미지에 노이즈가 발생하였고, FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 100nM 이상인 경우에 노이즈가 발생하였다. 이로부터 DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 경우 더 높은 이미저 농도에서 동일한 SNR을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 1-1, 도 1e 내지 1k 참조).
세포에 도킹 스트랜드가 결합된 튜블린 항체를 사용하여 면역 염색을 한 다음 DNA-PAINT 방식을 이용하여 미세소관을 관찰하였고, FRET-PAINT 방식을 이용하여 동일한 부위의 미세소관을 관찰하였다. 또한 DNA-PAINT 이미징 속도와 FRET-PAINT 이미징 속도를 정량화하여 비교하였으며, DNA-PAINT는 10Hz 속도로 총 30분 동안 촬영하였고, FRET-PAINT는 10Hz 속도로 총 60초 동안 촬영하여 관찰한 결과, DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 이미징 속도가 더 빠른 것을 확인하였다(실시예 1-2, 도 2a 내지 도 2e 참조).
한편 세포에 도킹 스트랜드가 결합된 튜블린 항체와 Tom20 항체를 처리한 다음, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 방법과, 동시에 처리하는 방법으로 처리한 다음 이미지를 관찰한 결과, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 경우가 다중화 이미징에 더 효과적이라는 것을 확인하였다(실시예 1-3, 도 3a 내지 도 3h 참조).
바이오마커 농도에 따라 관찰 화면에 나타난 분자의 개수를 측정한 결과 10 pg/mg~400 pg/ml 범위에서는 개별 분자가 잘 구분되어 바이오마커 농도를 측정할 수 있으나 1000 pg/ml 이상 농도에서는 분자들이 겹치기 시작해 정확한 농도를 측정할 수 없음을 확인하였다. 대략 100 pg/ml의 농도가 되도록 적당한 비율로 희석한 후 분자의 개수를 측정하고 희석한 비율로 나눠 바이오마커 농도를 구할 경우 본래 바이오마커 농도를 정확하게 측정할 수 있음을 확인하였다. 현재 널리 쓰이는 바이오마커 농도(수 pg/ml~수십 ng/ml) 범위에서 정확한 측정이 가능함을 확인하였다(실시예 1-4, 도 4a 내지 도 4c 참조).
상술한 바에 따르면, 단분자 형광현미경과 FRET-PAINT 시스템을 이용하면 기존의 방식에 비해 1000배 더 높은 민감도로 다양한 바이오마커를 극소량의 생체액으로부터 검출할 수 있기 때문에, 기존 바이오마커 진단의 문제점을 해결하여 암을 포함한 다양한 질병의 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
한편, 본 명세서를 통틀어 타겟 물질 검출을 효율적으로 하려면 도너와 억셉터 간의 FRET 효과를 최대화할 필요가 있다. 이를 위해서 적절한 도너와 억셉터를 선택함으로써, 도너와 억셉터의 효과적인 스펙트럼 겹침이 되도록 하여 최적의 에너지 이동을 유도하는 것이 바람직하다.
도 5는 도너와 억셉터의 각 스펙트럼 간의 겹침을 나타낸다.
일 구현예에서, 도너의 흡광도가 최대인 파장이 억셉터의 흡광도가 최대인 파장보다 짧고, 도너의 발광도가 최대인 파장이 억셉터의 발광도가 최대인 파장보다 짧도록 도너와 억셉터를 정할 수 있다. 그 결과 도너에서 억셉터로 에너지가 전달될 수 있으며, 도너의 흡광도가 최대인 파장이 억셉터의 흡광도가 최대인 파장보다 짧으므로 특정 파장의 여기광(excitation light)을 이용해 선택적으로 도너만 여기하는 것이 가능하다. 또한 도너의 발광도가 최대인 파장이 억셉터의 발광도가 최대인 파장보다 짧으므로 광학필터, 프리즘, 회절격자 등을 이용해 도너의 형광신호를 제거하고, 억셉터의 형광신호를 선택적으로 검출할 수 있다.
한편, 도너와 억셉터 사이의 FRET 효율 EFRET은 아래 식 1과 같다.
(식 1)
Figure PCTKR2019011003-appb-I000001
이때 R은 도너와 억셉터 사이의 거리이고, R0(Forster radius)는 FRET 효율이 0.5가 되는 도너와 억셉터 사이의 거리로 아래 식 2와 같이 정의될 수 있다.
(식 2)
Figure PCTKR2019011003-appb-I000002
상기 식 2에서, κ는 쌍극자 방향(dipole orientation)의 영향을 나타내는 상수이고, n은 매질의 굴절 계수(refractive index)를 나타내는 상수이다. ΦD는 도너 형광물질의 양자 수율(quantum yield)로서 도너 형광물질의 종류에 따라 달라진다. JDA는 스펙트럼 겹침 적분(spectral overlap integral)으로 아래 식 3과 같이 정의될 수 있다.
(식 3)
Figure PCTKR2019011003-appb-I000003
상기 식 3에서, εA는 억셉터 형광물질의 흡광계수, FD는 도너 형광분자의 발광 강도(fluorescence emission intensity)이다. 도너 형광물질의 발광 스펙트럼과 억셉터 형광물질의 흡광 스펙트럼 사이의 겹침 정도에 따라 달라 달라지므로 ΦD와 함께 R0를 결정하는 중요한 요소이다.
예를 들어, 도너를 여기시키는 데 사용되는 여기광의 파장에서 도너의 흡광계수(extinction coefficient)가 억셉터의 흡광계수(extinction coefficient)보다 3배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상 크도록 도너와 억셉터를 정할 수 있다. 이 경우 대다수의 억셉터는 여기광(excitation light)이 아닌 프렛에 의해 도너로부터 에너지를 전달받아 여기될 수 있다. 도너의 흡광계수 대 억셉터의 흡광계수 비가 크면 클수록 억셉터는 여기광이 아닌 프렛에 의해서 여기되므로 신호대잡음비가 더욱 커지는 장점이 있다. 따라서 도너의 흡광계수 대 억셉터의 흡광계수 비는 크면 클수록 바람직하다.
타겟 물질을 용이하게 검출하기 위해서는 형광 신호를 배경 잡음으로부터 식별가능하도록 도너와 억셉터 간의 FRET 효율이 0.05 이상인 것이 바람직하다.
이를 위해서 상술한 타겟 물질 검출방법과 같이 억셉터 신호를 관찰할 경우, 도너와 억셉터의 Forster 반경 (또는 Forster distance)가 예를 들어 0.208 nm 이상이 되도록 도너와 억셉터 형광물질을 정하는 것이 바람직하다. 다른 예로서, 후술하겠지만 FRET 효율을 측정하여 타겟 물질을 다중 검출을 하는 경우에는 도너와 억셉터 간의 도너와 억셉터의 Forster 반경 (또는 Forster distance)가 예를 들어 0.83 nm 이상이 되도록 도너와 억셉터 형광물질을 정하는 것이 바람직하다. 핵산을 이용해 도너와 억셉터 사이의 거리를 조절할 경우 두 형광물질 사이의 최단 거리는 1 bp (base pair), 즉 0.34 nm이므로 Forster 반경( Forster radius)이 0.208 nm 이상이면 0.34 nm 거리에서 FRET 효율이 0.05 이상이 될 수 있다. Forster radius가 이보다 작을 경우 1 bp 거리에서 FRET 효율이 0에 수렴해 억셉터 신호를 관찰하기 어려울 수 있다. Forster radius가 클수록 동일한 거리에서 FRET 효율이 높고, 따라서 억셉터가 더욱 밝게 관측되므로 Forster radius는 클수록 바람직하다.
다른 예로, FRET 효율을 측정하여 다중 검출을 하는 경우에는 Forster radius가 0.83 nm 미만일 경우 거리에 따른 FRET 효율의 감소가 커 도너와 억셉터 사이의 거리가 3 bp만 되어도 FRET 효율이 0.05 미만으로 감소하여 억셉터 신호를 관찰하기 어렵고, FRET 효율도 측정하기 어려울 수 있다. 따라서 타겟 물질을 3종 이상 검출하기 위해서는 Forster radius가 0.83 nm 이상인 것이 바람직하며, Forster radius가 클수록 더 넓은 거리 범위에서 FRET 효율을 구분하여 검출할 수 있으므로 Forster radius는 클수록 바람직하다.
한편, 최적의 에너지 이동을 유도하기 위해 도너와 억셉터 간의 상호작용을 고려하여 적절한 도너와 억셉터 간의 간격을 정할 필요가 있다.
도 6은 도킹 스트랜드와 결합된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 나타낸다. 도 6을 참조하면, 도너 및 억셉터 형광 물질의 실제 간격은 예를 들어 형광 물질이 부착된 스트랜드의 염기 사이의 거리가 기준이 될 수 있다. 도너 형광 물질과 억셉터 형광 물질을 각각 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드에 부착함에 있어서 스트랜드의 어느 위치에 도너와 억셉터를 부착하는가에 따라서도 달라질 수 있고, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 얼마만큼의 간격(갭)을 두고 결합하는가에 따라서도 달라질 수 있다.
일 구현예에서, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 사이의 갭(단일 가닥 부분)의 간격은 단일가닥 도킹 스트랜드의 지속길이(persistence length)보다 짧은 것이 바람직하다.
예를 들어 DNA 이중가닥(double strand)의 염기-염기 사이의 거리는 0.34 nm이고, 지속길이가 50 nm인 것에 비해 단일가닥(single strand)의 염기-염기 사이의 거리는 0.5 nm 이상이고, 지속길이는 수 nm 내외에 불과하다. 여기서 지속길이(persistence length)는 DNA와 같은 고분자 사슬(polymer chain)이 직선 상태를 유지하는 거리로서 고분자 사슬의 구조, 전하, 버퍼 내 염의 농도 등에 따라 달라질 수 있다. 단일가닥 도킹 스트랜드의 지속길이보다 갭(gap)의 길이가 더 긴 경우 갭 어딘가에서 도킹 스트랜드가 꺾일 수 있으며, 이 경우 도너-억셉터 사이의 거리는 의도한 거리보다 훨씬 가까워질 수 있어 의도한 형광 신호를 얻을 수 없으므로 문제를 야기할 수 있다. 따라서 도킹 스트랜드가 직선 상태를 유지할 수 있도록 갭의 길이가 도킹 스트랜드의 지속길이보다 짧은 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 스트랜드 상에 형광 물질을 부착할 때 스트랜드와 형광물질 사이에 유연한 링커(linker)를 둘 수 있다. 상기 링커에 의해 형광 분자가 자유롭게 회전할 수 있으므로 관찰자가 관찰하는 방향에 무관하게 일정한 밝기가 유지될 수 있다. 상기 링커는 -CH2-나 -CH2CH2O-와 같은 유연하거나 회전 가능한 반복단위를 1개 이상 포함할 수 있다. 상기 링커의 길이는 0.1nm 이상, 최대 10nm 이하일 수 있다. 상기 링커의 길이가 길수록 형광분자가 관찰되는 위치가 크게 변화하므로 링커가 지나치게 길 경우 근처 타겟 물질과 구분이 어려울 수 있다. 따라서 링커의 길이는 10 nm 이하로 제한을 두는 것이 바람직하다.
도너 및 억셉터 형광 물질로서, Alexa, CF와 같은 친수성 형광물질, Cy, 양자점과 같은 소수성 형광물질 모두 사용 가능하나 형광 물질 간에 상호작용이 일어날 만큼 거리가 가까운 경우에는 친수성 형광물질만을 사용하거나 친수성 형광물질과 소수성 형광물질을 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 소수성 형광물질 사이의 거리가 매우 가까울 경우 둘 사이의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)으로 인해 형광 신호가 불안정해질 수 있다(도 1d의 Cy3-Cy5).
일 구현예에서, 형광 신호를 안정화하기 위해 형광 물질 자체 또는 형광 물질 근처에 Cyclooctatetraene (COT), nitrobenzyl alcohol (NBA), trolox 등의 안정화 물질을 부착하거나 이를 버퍼에 포함시킬 수 있다.
일 구현예에서, 산소에 의한 형광물질의 광표백(photobleaching)을 방지하기 위해 산소를 제거하기 위한 물질(Glucose + glucose oxidase + catalase, PCA + PCD 등)을 버퍼에 포함시킬 수 있다.
한편 타겟 물질 검출시 검출 정확도를 향상시키기 위해 형광 신호의 노이즈(잡음)를 최소화할 필요가 있다. 이를 위해 광학필터로 도너의 발광 파장을 적절히 제거하여 도너로부터 나오는 형광 신호를 최소화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형광 신호의 신호대잡음비(SNR)가 2 이상이 되도록 광학필터의 파장을 제어할 수 있다. 예를 들어, long-pass 필터의 컷온 파장, short-pass 필터의 컷오프 파장, band-pass 또는 band-rejection 필터의 시작 파장은 억셉터 발광 스펙트럼이 0.01인 파장보다 길거나 같고, 도너 발광 스펙트럼이 0.01인 파장보다 짧거나 같을 수 있다.
도 7은 도너 형광물질(실선)과 억셉터 형광물질(점선)의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다. λmin은 억셉터의 발광 스펙트럼이 0.01인 파장, λmax는 도너의 발광스펙트럼이 0.01인 파장을 나타낼 수 있다.
도너 신호를 제거하고, 억셉터 신호를 검출하기 위해서 특정 파장보다 긴 파장을 통과시키는 long-pass dichroic mirror 또는 dichroic filter를 사용하거나, 특정 파장보다 짧은 파장을 통과시키는 short-pass dichroic mirror 또는 dichroic filter를 사용하거나, 특정 파장대를 통과 또는 반사시키는 band-pass dichroic mirror 또는 dichroic filter를 사용할 수 있다.
컷온(cut on) 파장보다 긴 파장을 통과시키는 long-pass dichroic filter(이하 필터)를 예로 들어 설명하면, 필터의 컷온(cut on) 파장이 λmin보다 짧을 경우 광학필터를 통과하는 억셉터 신호는 동일한 반면 도너 신호는 증가하므로 신호대잡음비는 낮아질 수 있다. 따라서 컷온 파장은 λmin보다 길거나 같은 것이 바람직하다. 필터의 컷온 파장이 λmax보다 클 경우 광학필터를 통과하는 도너 신호는 동일한 반면 억셉터 신호는 감소하므로 신호대잡음비는 낮아질 수 있다. 따라서 컷온 파장은 λmax보다 짧거나 같은 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 신호대잡음비는 하기와 같이 정의될 수 있다. 도 8a는 카메라로 측정한 억셉터 형광 신호를 나타낸다. 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교하기 위해 흰색 점선을 따라 단면을 그리면 도 8b와 같다. 도 8b는 신호의 크기와 잡음의 크기를 비교한 그래프이다. 이 그래프를 가우스 함수로 피팅하여 얻은 가우스 함수의 높이(amplitude)를 '신호'로 정의할 수 있다. 억셉터 형광 신호가 없는 나머지 모든 픽셀들의 값을 히스토그램으로 그리면 정규분포를 따른다. 이 정규분포의 반치전폭(full width at half maximum; FWHM)을 '잡음'으로 정의한다. 따라서 상기 신호와 상기 잡음의 비율을 신호대잡음비(signal to noise ratio, SNR)로 정의할 수 있다.
한편 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 농도 증가에 따라 노이즈가 발생할 수 있다. 따라서 노이즈는 줄이고 정확한 억셉터 신호를 판별하도록 하는 것이 바람직하다. SNR을 고려하면, 타겟 신호의 검출이 가장 잘되는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 농도 조건을 선택할 수 있다.
일 구현예에서, 정해진 도너-억셉터 형광 물질의 조합 및 광학필터 하에서 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 데 필요한 평균 시간이 50-100초가 되도록 하는 도너 스트랜드의 농도는 10 nM 이상이며, 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상이 되도록 하는 도너 스트랜드의 농도는 10 uM 이하일 수 있다.
억셉터가 신호를 내기 위해서는 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합해야 한다. 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 데 필요한 평균 시간은 하기 식 4와 같이 도킹 스트랜드 주변 도너 스트랜드의 농도에 반비례한다.
(식 4)
도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 데 필요한 평균 시간 = (500~1000 s x nM)/[도너 스트랜드 농도(nM)]
따라서 1 nM일 때 500~1000초, 10 nM일 때 50~100초, 100 nM일 때 5~10초가 소요될 수 있다. 타겟 물질을 정확히 검출하기 위해서는 해당 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 적어도 5 회 이상 결합해야 하며, 경제성을 고려하여 전체 측정을 10분 이내에 완료하기 위해서는 도너 스트랜드의 농도가 10 nM 이상인 것이 바람직하다.
도너 스트랜드의 농도가 증가하면 억셉터 신호의 크기는 동일한 반면 잡음의 크기는 증가하므로 신호대잡음비가 감소할 수 있다. 따라서 신호대잡음비가 2 이상이 되기 위해서는 도너 스트랜드의 농도가 10 uM 이하, 바람직하게는 5uM이하이다. 한편 도너 스트랜드와 달리 억셉터 스트랜드는 도킹 스트랜드에 결합한 후 오랜 시간 유지되므로 억셉터 스트랜드의 농도는 1 uM 이하로도 충분하다.
한편 도너 스트랜드나 억셉터 스트랜드의 길이에 따라 각각 도킹 스트랜드에 결합한 후 유지되는 시간을 조절할 수 있다. 도킹 스트랜드에 억셉터 스트랜드의 결합이 안정적으로 오래 유지되면, 도너 스트랜드를 넣었을 때에 빠른 시간 내에 이미징할 수 있어 검출 시간을 단축할 수 있다. 이미징 시간이 동일한 경우에는 낮은 농도의 도너 스트랜드를 적용하여도 바이오마커 검출에 용이할 수 있다.
일 구현예에서, 스트랜드가 DNA 또는 RNA일 경우, 도킹 스트랜드와 상보적인 염기서열 개수는 도너 스트랜드의 경우 6 이상 12 이하, 억셉터 스트랜드의 경우 8 이상이 바람직하다. 본 실시예에서는 통상 7 내지 9 nt 길이의 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하도록 사용했으나 버퍼 내 양이온의 농도가 높으면 더 짧은 길이도 가능하고, 양이온 농도가 낮으면 더 긴 길이도 가능하다. 또한 실제 상보적인 결합을 하는 길이는 7인데 중간에 상보적 결합을 하지 않는 미스매치(mismatch) 서열을 넣을 경우 전체 길이를 얼마든지 길게 할 수 있으므로 전체 길이가 아닌 상보적 결합의 개수로 표현하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 스트랜드가 DNA, RNA가 아닌 PNA, LNA, GNA 등일 경우, 도킹 스트랜드와 상보적인 염기서열 개수는 도너 스트랜드 경우 3 이상 9 이하, 억셉터 스트랜드의 경우 5 이상이 바람직하다. 상기 XNA 들은 DNA, RNA보다 결합력이 더 강하므로 더 적은 상보적 결합으로도 활용이 가능하여 상보적인 염기서열 개수가 적어질 수 있다.
도킹 스트랜드의 길이는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 의도한 상보적 결합을 할 수 있는 최소 길이 이상이 바람직하다. 상술한 바와 마찬가지로 미스매치 서열 또는 gap(single-stranded DNA 부분)을 넣을 경우 얼마든지 길이를 늘일 수 있으므로 최소 길이 이상으로 표현하였다.
억셉터 스트랜드는 도킹 스트랜드에 결합한 후 오래 유지되거나 분리되지 않도록 길게 제작될 수 있으며, 억셉터 형광물질 자체를 도킹 스트랜드에 직접 부착하는 것도 가능하다. 항상 여기광에 의해 여기되고 빛을 내는 도너와 달리 억셉터는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 도킹 스트랜드에 동시에 결합했을 경우에만 빛을 내므로 광표백의 우려가 낮다.
도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합 시 억셉터 스트랜드가 이미 도킹 스트랜드에 결합하고 있어 FRET에 의해 억셉터가 빛을 낼 확률을 높이기 위해 상대적으로 긴 억셉터 스트랜드를 사용하고 억셉터 스트랜드보다 짧은 길이의 도너 스트랜드를 선택할 수 있다.
억셉터 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합한 후 결합이 유지되는 시간을 a, 억셉터 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하는 데 걸리는 시간을 b라고 하면 도킹 스트랜드에 억셉터 스트랜드가 결합해있을 확률은 a/(a+b)가 된다. a는 억셉터 스트랜드의 길이가 길어질수록, 염의 농도가 높아질수록 커지고, b는 억셉터 스트랜드의 농도가 높을수록 작아질 수 있다. 만약 위의 확률이 1이라면 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합할 때마다 억셉터가 신호를 내는 것이다. 반면 확률이 0.5라면 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합했을 때 억셉터가 신호를 낼 확률은 0.5에 불과하므로 도너 스트랜드가 두 배 더 많이 결합해야 동일한 억셉터 신호를 얻을 수 있다는 것이다. 결국 확률이 높을수록, 즉 a가 크거나 b가 작을수록 검출시간은 짧아질 수 있다.
일 구현예에서, 기존 세포 이미징에서는 억셉터의 광표백이 우려되었으나 바이오마커 검출에서는 광표백될 가능성이 낮으므로 억셉터 스트랜드의 길이를 늘이거나 억셉터 형광물질을 도킹 스트랜드에 직접 부착함으로써 a를 늘이는 게 바람직하다. 억셉터 스트랜드의 농도를 높임으로써 b를 줄일 수도 있으나 신호대잡음비 측면에서 바람직하지 않다.
한편, DNA는 음의 전하를 띄고 있으므로 DNA끼리 서로 밀어내는 경향이 있어 이를 상쇄하기 위해 양전하를 버퍼에 넣는 것이 바람직하다. DNA끼리 상보적으로 결합할 경우 한 염기 당 2개 또는 3개의 수소결합(당기는 힘)이 생기므로 염기서열이 길어질수록 결합이 더 안정적일 수 있다. Na+의 농도가 500mM이고, 억셉터 스트랜드 길이가 10 nt일 때 평균 40초 동안 결합이 유지되는데 길이가 더 길어질수록 결합이 유지되는 시간은 더 길어질 수 있다.
또한 예를 들어, PNA는 DNA와 달리 음의 전하를 띄지 않으므로 PNA-PNA, PNA-DNA의 결합은 DNA-DNA 결합보다 훨씬 안정적이므로 억셉터 스트랜드만 PNA나 LNA를 사용하고 도킹과 도너 스트랜드는 DNA를 사용할 수도 있다.
한편, 타겟 물질이 검출 과정에서 시료 중 타겟 물질의 농도가 지나치게 높을 경우 신호 겹침에 의해서 정확한 정량이 어려울 수 있다.
대다수 타겟 물질의 혈중 농도는 알려져 있지만 피검자의 상태에 따라 그 수치는 매우 크게 달라질 수 있다. 또한 타겟 물질의 종류에 따라 농도는 10-15 g/ml에서 10-3 g/ml까지 1012배 가량 차이날 수 있다.
따라서 검출화면 상에 적당한 수의 타겟 물질의 수가 나타나도록 예를 들어 하기와 같은 방법으로 희석할 필요가 있다. 먼저 well 1, well 2, well 3 등이 구비된 웰 플레이트(well plate) 또는 랩텍(Lab-Tek)를 준비한다. 농도가 낮을 것으로 예상되는 타겟 물질의 포획 항체와 검출 항체는 well 1과 well 2에, 농도가 높을 것으로 예상되는 타겟 물질의 포획 항체와 검출 항체는 well 2와 well 3에 적용한다.
혈액을 표준 농도로 희석한 용액은 well 1에, 이를 추가로 희석한 용액은 well 2에, 이를 더욱 희석한 용액은 well 3에 주입하여 타겟 물질을 기판에 고정시킨다. 농도가 낮을 것으로 예상되는 타겟 물질을 well 1에서 검출을 시도했을 때 적당한 수의 타겟 물질이 나타날 경우 측정을 마무리하고, 너무 적은 수의 타겟 물질이 나타날 경우 well 1의 여러 영역을 측정해 이를 종합하며, 너무 많은 수의 타겟 물질이 나타나 분석이 불가능할 경우 well 2에서 검출을 시도한다.
농도가 높을 것으로 예상되는 타겟 물질을 well 2에서 검출을 시도했을 때 적당한 수의 타겟 물질이 나타날 경우 측정을 마무리하고, 너무 적은 수의 타겟 물질이 나타날 경우 well 2의 여러 영역을 측정해 이를 종합하며, 너무 많은 수의 타겟 물질이 나타나 분석이 불가능할 경우 well 3에서 검출을 시도할 수 있다. 또는 너무 많은 수의 타겟 물질이 나타나 분자 간 겹침이 문제가 되는 경우 도너 스트랜드의 농도를 낮추거나, 버퍼 내 염의 농도를 낮추거나, 본래 도너 스트랜드 대비 미스매치가 있거나 길이가 짧아 도킹 스트랜드와의 상보적 결합 수가 적은 대체 도너 스트랜드를 넣어 분자간 겹침 문제를 해결할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이 상술한 타겟 물질 검출방법 및 키트를 사용할 경우 기존의 방식에 비해 1000배 이상 더 높은 민감도로 다양한 바이오마커를 극소량의 생체액으로부터 검출할 수 있어 암을 포함한 다양한 질병의 조기진단에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 전술한 바와 같이 억셉터 형광 신호를 관찰하는 방법 외에 타겟 물질별로 다양한 프렛쌍이 도입된 스트랜드를 이용하여 프렛 효율을 측정함으로써 여러 타겟 물질을 다중 검출하는 방법이 제공될 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 측면에 의하면, 형광 물질로 표지된 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 이용한 타겟 물질 검출용 키트가 제공된다. 상기 타겟 물질 검출용 키트는 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 태그 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함한다. 이때 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타낸다.
일 구현예에서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 물질 검출용 키트는 기판; 형광 물질이 표지된 2종 이상의 태그 스트랜드; 및 상기 태그 스트랜드가 결합된 2종 이상의 검출항체를 포함하고, 상기 형광 물질에 의한 FRET 효율을 이용하여 2종 이상의 바이오마커 종류를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트일 수 있다. 상기 형광 물질은 상기 태그 스트랜드의 특정염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너 또는 억셉터로 작용하는 것일 수 있다. 상기 태그 스트랜드에 표지된 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 상이하게 측정되는 FRET 효율의 측정값을 이용함으로써 2종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.
상기 검출항체는 바이오마커를 항원-항체반응을 이용하여 검출하기 위한 검출 프로브로서, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류만큼 이종의 것을 사용함이 바람직하다. 또, 검출 시 FRET 효율을 측정하기 위해서는 각각의 검출항체는 형광 물질이 표지된 태그 스트랜드가 결합된 것을 사용함이 바람직하다. 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에서는 태그 스트랜드로 DNA를 주로 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체, 폴리펩타이드나 탄수화물과 같은 생체 고분자일 수 있다.
상기 "FRET 효율"은 빛에 의해 여기된 형광 물질의 에너지가 인접한 다른 형광 물질에 전달되는 현상에서, 형광 물질 사이의 거리에 따라 상이한 에너지 전달 효율을 값으로 나타낸 것으로, 구체적으로는 아래와 같이 계산되는 값을 의미한다.
(식 5)
FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
이때, 도너 또는 억셉터의 빛의 세기는 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 영향을 받을 수 있으나, 도너와 억셉터를 원하는 특정 염기, 3'- 또는 5'-말단, 또는 기본골격 상에 표지하여 도너와 억셉터 사이의 거리를 조절함으로써, FRET 효율을 제어할 수 있다.
이때, FRET 효율은 도너를 여기하기 위한 빛에 의해 억셉터가 여기되며 내는 빛, 도너와 억셉터가 내는 빛을 분리하기 위해 사용하는 광학부품(ex: dichroic mirror)에 의해 완벽하게 분리되지 않은 도너와 억셉터가 내는 빛의 일부, 또는 도너와 억셉터가 내는 빛의 파장 차이에 따른 이미지 센서의 검출 효율 차를 보정한 값일 수 있다.
FRET 효율을 이용한 타겟 물질의 검출은 예를 들어 하기와 같은 방식으로 이루어질 수 있다. 도너와 억셉터 사이에 존재하는 염기의 수가 1개라고 할 때 간격을 1이라고 한다면, 도너와 억셉터 사이 간격을 1, 2, 3, … n으로 하는 2종 이상의 태그 스트랜드를 제작한다. 각각의 간격에 대한 FRET 효율을 측정하여 간격에 대한 FRET 효율을 데이터베이스화한다. 같은 종류의 검출항체에는 같은 종류의 태그 스트랜드를 부착하고, 다른 종류의 검출항체에는 다른 종류의 태그 스트랜드를 부착한다. 이후, 바이오마커가 포함된 시료와 반응을 진행하면, 특정 바이오마커는 특정 검출항체와 결합하게 되는데, 이때, 각 분자의 도너와 억셉터가 내는 빛의 세기를 측정하여 FRET 효율을 계산한다. 데이터베이스화된 값과 계산한 값을 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
예를 들어, 전술한 내용으로 FRET 효율을 구분할 수 있는 간격을 4 이상 20 이하의 정수라고 가정한다면, 1종의 도너와 1종의 억셉터로 제작할 수 있는 태그 스트랜드는 17가지가 된다. 만일, 동일한 조건으로 도너와 억셉터가 2쌍 존재한다면, 289가지가 되고, 3쌍이 존재하면 4,913가지가 되므로, 최소한의 형광 물질 종류를 이용하여 다종의 바이오마커를 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 태그 스트랜드는 2 이상의 서로 상이한 형광 물질이 표지된 것일 수 있다. 도 9는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 도시한 것이다. 도 9을 보면, 기판에는 바이오마커가 고정되어 있고, 바이오마커에는 태그 스트랜드(검출항체태그)가 부착된 검출항체가 결합되어 있다. 도 9에는 N종의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 N종의 검출항체와 이에 부착된 N종의 태그 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 도시되어 있다.
상기 키트가 이와 같이 구성되는 이유는 각각의 바이오마커와 결합한 검출항체의 태그 스트랜드로부터 동일한 FRET 효율이 측정된다면 검출된 바이오마커의 종류를 특정할 수 없기 때문이다. 따라서, 구분이 가능할 정도의 FRET 효율의 측정값을 획득하기 위해서는 검출하고자 하는 바이오마커의 수만큼 상이한 태그 스트랜드를 이용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 2종 이상의 태그 스트랜드는 표지된 도너와 억셉터 사이에 존재하는 염기의 수가 상이한 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 태그 스트랜드는 도너 및 억셉터 각각이 표지된 위치에 따라 모두 상이한 FRET 효율을 가지는 것일 수 있다. 이때, 상기 태그 스트랜드는 복수의 도너 또는 억셉터가 표지되는 것일 수 있다. 이 경우, 2 이상의 도너는 억셉터와 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 도너는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다. 또 다른 경우, 2 이상의 억셉터는 도너와는 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 억셉터는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다. 일례로, 상기 태그 스트랜드는 도 10에 도시된 바와 같이, 태그 스트랜드에 1개의 억셉터와 복수의 도너가 표지된 것일 수 있다. 이때, 도너와 억셉터는 서로 이종의 형광 물질이고, 복수 개의 도너는 모두 상이한 종류의 형광 물질인 것이 바람직하다. 가령, 전술한 내용으로 FRET 효율을 구분할 수 있는 간격을 4 이상 20 이하의 정수라고 가정한다면, 이론적으로는, 하나의 FRET 효율로 제작할 수 있는 태그 스트랜드는 17가지가 된다. 즉, 4개의 도너와 1개의 억셉터로 구성된 태그 스트랜드를 제작하는 경우라면, 도너1-도너2, 도너2-도너3, 도너3-도너4, 도너4-억셉터 사이의 총 4개의 FRET 효율로 제작할 수 있는 태그 스트랜드의 종류는 이론상 17x17x17x17=83,521 가지가 된다.
도 11은 도 10과 같이 구성된 태그 스트랜드에 표지되는 형광 물질로부터 FRET 효율을 측정하는 과정을 나타낸 것으로, 단일분자 현미경을 이용하여 형광 물질을 이미징하는 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
먼저, 기판에 형광 물질이 표지된 태그 스트랜드를 고정한 뒤, 도 11과 같은 단일분자 형광현미경을 이용하여 빛의 밝기를 관찰한다. 이때, 빛의 회절현상(diffraction)에 의해 약 300nm 이내에 위치한 분자들은 서로 구분되지 않고 하나의 점으로 관찰될 수 있다. 따라서, 한 태그 스트랜드에 여러 형광 물질이 표지되어 있어도, 전체 거리가 300nm 이하가 되도록 배치된 형광 물질은 하나의 점으로 보이게 된다. 반면에, 서로 다른 형광 물질은 서로 다른 파장의 빛을 발산하므로, 특정 파장대의 빛만 반사 또는 통과시키는 광학부품(ex: dichroic mirror)을 이용해 방출되는 빛을 파장에 따라 분리하면 특정 형광 물질의 밝기를 측정할 수 있다.
도 11의 왼쪽 이미지는 하나의 카메라에 4종의 형광 물질(Cy2, Cy3, Cy5, Cy7)을 한 화면으로 출력하여 확인하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 11의 오른쪽 이미지는, 형광 물질의 종류에 따라 각기 다른 카메라를 통해 이미징 하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 도너와 억셉터에 의해 생성된 FRET 효율을 이미징하는 방법으로서 전술한 내용의 방법을 이용할 수 있고, 특별히 제한을 두지는 않으나, 구체적으로는, 도너카메라와 억셉터카메라 각각을 통해 도너와 억셉터의 빛의 세기를 이미징함이 분석시간 측면에서 바람직하다.
도 12는 Cy3, Cy5의 도너 및 Cy7의 억셉터가 표지된 태그 스트랜드를 이용하여 전술한 방법으로 이미징한 결과를 함께 나타낸 것이다. 도 12를 보면, 도 11의 왼쪽 이미지와 같은 방법으로 밝기를 측정한 결과, 가장 왼쪽부터 Cy3, Cy5, Cy7 순으로 이미징된 결과가 하나의 모니터를 통해 확인되었다. 도 12와 같이 제작된 태그 스트랜드에 빨간색의 레이저를 조사하는 경우, 먼저 Cy5가 여기되고, FRET에 의해 Cy7으로 에너지가 전달되어 Cy7도 빛을 낼 수 있게 되므로, Cy3의 영역에서는 아무것도 나타나지 않고, Cy5 및 Cy7의 영역에서만 밝은 점이 관찰된다. 이때, 각 점의 밝기 비율로부터 Cy5와 Cy7 사이의 FRET 효율을 측정하여 거리를 확인할 수 있다. 추가적으로, 녹색의 레이저를 조사하는 경우, Cy3가 여기되고, FRET에 의해 Cy5 및 Cy7으로 에너지가 전달되어 모두 빛을 내게 된다. 이 경우, 앞선 경우를 통해 확인된 Cy5 와 Cy7 사이의 FRET 효율을 이용하여 Cy3와 Cy5 사이의 거리를 확인 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 13 및 도 14과 같이 도너-억셉터로 구성되는 FRET쌍이 2쌍 이상 표지되는 구성일 수 있다.
1개의 태그 스트랜드에 도너 및 억셉터로 구성되는 FRET쌍이 2 이상 표지되는 경우에는, 각각의 FRET쌍이 서로의 FRET 효율에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 일정 거리 이상 이격하여 표지함이 바람직하다. 구체적으로는, 각 FRET쌍은 5nm 이상 이격하여 표지됨이 더욱 바람직하다.
상기 태그 스트랜드는 도너 및 억셉터로 구성되는 2 이상의 FRET쌍을 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 2 이상의 FRET쌍은 도너 및 억셉터 사이의 간격이 상이한 것일 수 있으며, 바람직하게는, 측정시 발생할 수 있는 오차범위와 노이즈를 감안하여, 충분히 구별이 가능한 FRET 효율이 측정될 정도로 간격이 상이한 것일 수 있다.
다른 일례로, 상기 2 이상의 FRET쌍에 동일종의 도너를 이용하는 경우, 표지되는 억셉터 각각은 서로 동일 또는 상이한 종류를 사용할 수 있으나, 상기 도너와는 상이한 종류임이 바람직하다.
또 다른 일례로, 상기 2 이상의 FRET쌍에 동일종의 억셉터를 이용하는 경우, 표지되는 도너 각각은 서로 동일 또는 상이한 종류를 사용할 수 있으나, 상기 억셉터와는 상이한 종류임이 바람직하다.
구체적으로, 1개의 태그 스트랜드에 2쌍의 FRET쌍이 표지되는 경우, 상기 FRET쌍의 도너 및 억셉터는 아래의 4가지 경우로 조합되는 것일 수 있다.
i) 상기 FRET쌍의 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 동일한 형광 물질일 수 있다
ii) 상기 FRET쌍의 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 동일한 형광 물질일 수 있다.
iii) 상기 FRET쌍의 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
iv) 상기 FRET 쌍의 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
도 13은 상기 i)의 경우를 일례로 나타낸 것이다. 도 13을 보면, 도너1 및 도너2가 A라는 형광 물질로 표지되어 있고, 억셉터1 및 억셉터2가 B라는 형광 물질로 표지되어 있다. 각각의 도너와 억셉터가 동일한 형광 물질로 표지되기 때문에 이 경우, 4개의 도너 및 억셉터가 모두 인접해 있으면 각각의 도너-억셉터로 구성되는 FRET쌍의 FRET 효율에 영향을 미치게 된다. 따라서, 도 13과 같이, 하나의 태그 스트랜드에 동일한 도너 및 억셉터를 2 이상 표지하는 경우에는 각각의 FRET쌍은 최소 5nm 이상 이격하여 표지하는 것이 바람직하다.
도 14a 내지 도 14c는 전술한 ii) 내지 iv)의 FRET쌍 조합을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 14a는 상기 ii)의 경우를 나타낸 것으로, 도 14a의 도너 1은 A라는 형광 물질로, 도너2는 B라는 형광 물질로 표지된 것이다. 이때, 억셉터 1 및 억셉터2는 모두 C라는 동일한 형광 물질로 표지된 것으로, 1개의 태그 스트랜드에 표지된 2쌍의 FRET 쌍에 동일종의 억셉터가 표지된 경우를 설명하는 그림이다.
또, 도 14b는 상기 iii)의 경우를 나타낸 것으로, 도 14b의 도너 1 및 도너2는 모두 A라는 동일한 형광 물질로 표지되고, 억셉터 1 은 형광 물질 B로, 억셉터2는 형광 물질 C로 표지된 것이다. 또한, 도 14c는 상기 iv)의 경우를 나타낸 것으로, 도너 1은 형광 물질 A, 도너 2는 형광 물질B, 억셉터 1은 형광 물질 C, 억셉터2는 형광 물질 D로 표지되어, 모두 다른 종류의 형광 물질로 표지된 태그 스트랜드의 경우를 설명하고 있다.
도 14a 내지 도 14c에 나타낸 그림을 보면, 모두 도너1-억셉터1의 제1 FRET쌍과 도너2-억셉터2의 제2 FRET쌍은 소정거리 이격된 상태로 표지된 것을 확인할 수 있다. 이는, 앞서 도 13에서 설명한 바와 같이, 인접한 FRET 쌍이 주는 영향을 최소화하기 위한 것이다. 또, 제1 FRET쌍과 제2 FRET쌍의 도너 및 억셉터 간의 간격은 동일 또는 상이할 수 있다. 다만, 제1 FRET 쌍과 제2 FRET쌍에 사용되는 도너 및 억셉터의 종류가 서로 동일한 경우 제1 FRET쌍과 제2 FRET쌍의 FRET 효율이 각각 i) a, b인 태그 스트랜드와 ii) b, a인 태그 스트랜드가 존재한다면, 상기 i) 및 ii)의 태그 스트랜드를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나의 태그 스트랜드만 이용할 수 있다.
일 구현예에 따른 태그 스트랜드는, 2이상의 FRET쌍을 포함할 수 있으며, 그 구성은 전술한 내용과 같을 수도 있다. 즉, 상기 태그 스트랜드는 도 13에 도시한 것과 유사하게 구현될 수 있고, 도 14a, 도 14b 또는 도 14c의 구성과 같을 수도 있다.
전술한 바와 같은 구성의 키트를 이용하여 FRET 효율을 측정함에 있어, 도너를 여기시킨 뒤, 일정 시간이 지나면 형광 물질이 더 이상 빛을 방출하지 못하는 광표백(photobleached)된 상태가 된다. 일단 광표백이 되면 빛의 세기가 변하게 된다. 이 경우에도 광표백 전과 후의 빛의 밝기를 측정하여 비교함으로써 각 도너-억셉터 상의 FRET 효율을 측정할 수 있다.
광표백 전후의 밝기를 비교하여 FRET 효율을 측정하는 기본적인 원리는 다음과 같다. 도너가 광표백이 될 경우, 도너는 광표백에 의해 더 이상 빛을 방출하거나 억셉터에 에너지를 전달하지 못하게 되고, 억셉터는 도너로부터 에너지를 받을 수 없게 되므로, 도너와 억셉터 모두의 빛의 세기가 감소하게 된다. 반면, 억셉터가 광표백될 경우, 도너는 억셉터로 에너지를 전달하지 못하므로 모든 에너지를 빛을 방출하는 데 사용하므로 도너의 밝기는 더 증가하고 억셉터의 밝기는 감소하게 된다. 보다 구체적인 원리는 후술할 실시예 2-3을 통해 설명하도록 한다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 포획항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
도 16은 포획항체를 포함하는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 키트를 개략적으로 나타낸 것으로 이 경우, 포획항체는 기판에 미리 부착된 상태일 수 있고, 혹은 검출과정에서 부착되는 것일 수 있다. 상기 포획항체는 태그 스트랜드가 결합된 것일 수 있다.
이때, 상기 포획항체에 결합된 태그 스트랜드("포획항체태그"로 명명)는 전술한 검출항체에 결합된 태그 스트랜드("검출항체태그"로 명명)와 동일 또는 유사한 기본골격으로 이루어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 상기 태그 스트랜드는 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체, 폴리펩타이드나 탄수화물과 같은 생체 고분자일 수 있다. 가령, 도 17에 도시한 바와 같이 구성되는 것일 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 브릿지 스트랜드를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 브릿지 스트랜드는 전술한 검출항체태그 및 포획항체태그와 동일 또는 유사한 기본골격을 사용함이 바람직하며, 구체적으로는 염기서열이 존재하는 단일가닥의 핵산을 이용함이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 브릿지 스트랜드는 검출항체태그 및 포획항체에 결합된 포획항체태그와 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 브릿지 스트랜드로 단일가닥의 핵산을 이용하는 경우, 브릿지 스트랜드의 일부 염기서열은 포획항체태그의 일부 염기서열과 상보적으로 구성되고, 다른 일부는 검출항체태그의 일부 염기서열과 상보적으로 구성됨으로써, 브릿지 스트랜드의 일부가 검출항체태그 및 포획항체태그와 각각 상보적으로 결합하여 서로 다른 두 개의 이중가닥 핵산을 형성하게 된다. 이러한 구조는 도 18과 같이 나타낼 수 있다.
바이오마커를 구분하는 데 필요한 전체 FRET 쌍 중 일부는 검출항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합해야 형성되며, 나머지 FRET 쌍은 포획항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합해야 형성된다. 따라서 바이오마커 검출 과정에서 전체 FRET 쌍이 관측되었다는 것은 브릿지 스트랜드가 검출항체태그 및 포획항체태그 모두와 상보적 결합을 하고 있음을 의미하고, 이는 바이오마커가 포획항체 및 검출항체와 결합하고 있음을 의미한다. 반면, 복수의 FRET 쌍 중 어느 일부만 관측되는 경우, 검출항체가 바이오마커가 아닌 기판 등에 비특이적(non-specific)으로 결합하고 있음을 의미하고, 이는 위양성(false positive) 신호이며 측정 오차임을 확인할 수 있다. 즉, 검출항체태그 및 포획항체태그와 상보적으로 결합하는 브릿지 스트랜드를 사용함으로써 위양성 신호를 제거하여 분석 결과의 정확도를 향상시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 브릿지 스트랜드는 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에 도너 또는 억셉터가 표지되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질을 브릿지 스트랜드의 특정 염기 상에 표지하여 FRET 효율을 측정하는 것일 수 있다.
포획항체태그, 검출항체태그 및 브릿지 스트랜드가 결합하여 FRET 효율을 측정하기 위해 도너 또는 억셉터는 아래의 경우와 같이 표지될 수 있다.
1) 검출항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합하여 하나 이상의 FRET 쌍을 형성하도록 제작되는 경우
a) 검출항체태그에 도너만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 억셉터가 표지되는 경우
b) 검출항체태그에 억셉터만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너가 표지되는 경우
c) 검출항체태그에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되는 경우
2) 포획항체태그와 브릿지 스트랜드가 상보적으로 결합하여 하나 이상의 FRET 쌍을 형성하도록 제작되는 경우
a) 포획항체태그에 도너만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 억셉터가 표지되는 경우
b) 포획항체태그에 억셉터만 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너가 표지되는 경우
c) 포획항체태그에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되고, 브릿지 스트랜드에 도너 및 억셉터 중 하나 이상 표지되는 경우
상기 1) 및 2)의 경우에도, 전술한 원리가 적용될 수 있다. 이때, 동일 종으로 표지되는 FRET쌍의 경우에는, 제 1FRET쌍과 제 2FRET쌍의 FRET 효율이 각각 i) a, b인 경우와 ii) b, a인 경우를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나만 사용할 수 있도록 포획항체태그, 검출항체태그, 브릿지 스트랜드를 제작함이 바람직하고, 구체적으로는 FRET 효율의 측정값이 구분 가능한 정도의 간격으로 각각의 포획항체태그, 검출항체태그 및 브릿지 스트랜드에 표지함이 바람직하다.
또, 상기 1) 및 2)의 경우, 도너와 억셉터는 서로 상이한 형광 물질로 표지됨이 바람직하다. 이때, 복수의 도너 또는 억셉터가 표지되는 경우, 포획항체태그, 검출항체태그 또는 브릿지 스트랜드에 표지되는 도너의 종류는 서로 같거나 다를 수 있고, 포획항체태그, 검출항체태그 또는 브릿지 스트랜드에 표지되는 억셉터의 종류 역시 서로 같거나 다를 수 있다.
예를 들어, 바이오마커1을 검출하기 위한 키트인 경우, 바이오마커1을 검출하기 위해 포획항체1, 검출항체1및 브릿지 스트랜드1을 사용하고, 브릿지 스트랜드1과 결합하는 태그는 포획항체태그1 및 검출항체태그1이라고 가정한다. 이 경우, 포획항체태그1의 어느 하나의 염기에 도너1이 표지가 되면, 원하는 FRET 효율이 되도록 브릿지 스트랜드1의 포획항체태그1과 결합하는 부위 중 어느 하나의 염기에는 억셉터1이 표지가 된다. 동시에, 검출항체태그1 및 브릿지 스트랜드1의 검출항체태그1과 결합하는 부위도 동일한 방식으로 원하는 FRET 효율이 되도록 도너1 및 억셉터1이 표지가 되거나, 전혀 다른 형광 물질인 도너2 및 억셉터2가 표지가 될 수도 있다. 또는, 도너1 및 억셉터2가 표지되거나, 도너2 및 억셉터1이 표지가 될 수도 있으나, 도너1 및 억셉터1은 서로 다른 형광 물질이며, 도너2 및 억셉터2 역시 서로 다른 형광 물질이어야 한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 측면에 의하면, 형광 물질로 표지된 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 이용한 타겟 물질 검출방법이 제공된다. 상기 타겟 물질 검출방법은 a) 기판에 타겟 생체물질을 함유한 시료를 도입하는 단계; b) 상기 타겟 생체물질에 태그 스트랜드가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계; c) 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 상기 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 상기 억셉터 형광 물질을 포함하는 단계; 및 d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비할 수 있다.
상기 프렛에 의한 형광 신호의 측정은 FRET 효율을 측정하는 방식일 수 있다. 이때 상기 FRET 효율의 측정은 상기 도너 또는 상기 억셉터의 광표백 전후의 빛의 밝기를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 프렛쌍들 사이의 간격은 각 프렛쌍의 FRET 효율에 영향을 미치지 않도록 조절된 것일 수 있다. 이때 상기 프렛쌍들 사이의 간격은 적어도 5nm인 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 다중 바이오마커를 동시에 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 기판에 2종 이상의 바이오마커가 부착되는 단계; 형광 물질이 표지된 태그 스트랜드(검출항체태그)가 결합된 2종 이상의 검출항체가 상기 2종 이상의 바이오마커에 각각 결합하는 단계; 및 상기 결합에 의해 생성되는 형광신호로부터 FRET 효율을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 형광 물질에 의한 FRET 효율을 이용하여 상기 바이오마커의 종류를 동시에 판별한 후 단위 면적 당 바이오마커 개수로부터 시료 중의 바이오마커 농도를 측정할 수 있다.
상기 형광 물질은 상기 태그 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너 또는 억셉터로 작용하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질을 태그 스트랜드의 특정 염기 상에 표지하여 FRET 효율을 측정하는 것일 수 있다.
상기 다중 바이오마커 동시 검출 방법은 전술한 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 이용하는 검출 방법일 수 있으며, 후술하는 내용을 포함하는 방법일 수 있다.
상기 검출 방법을 이용함에 있어서, 후술하는 FRET 효율 데이터베이스를 제작하는 단계가 선행될 수 있다. 예를 들어 구별 가능한 FRET 효율 기준값을 미리 측정하여 데이터베이스화하고, 이를 기준으로 반응 후 측정되는 FRET 효율 측정값을 비교함으로써 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
FRET 효율 데이터베이스는 다음과 같은 과정을 통해 제작될 수 있다.
먼저 각기 다른 형광 물질 A, B를 각각 도너, 억셉터로 이용하여, DNA 기본골격에 A와 B를 특정 염기 상에 표지하고, 필요한 종류만큼 이종의 DNA를 제작한다. 가령, 데이터베이스 상에 필요한 종류가 50종이면, 표지된 A, B 사이의 거리가 모두 상이하게 표지된 50 종의 DNA를 준비한다. 이때, 각각의 DNA 한 쪽 끝에는 기판에 도포된 물질과 결합친화적인 물질을 부착함으로써, 기판에 고정할 수 있도록 한다. 필요에 따라서, 사용하는 도너 및 억셉터가 시판되는 형광 물질인 경우, 이러한 제작과정을 생략하고 도너 및 억셉터가 부착된 상태로 시판되는 DNA를 사용할 수도 있다. 다만, 도너 및 억셉터로 사용되는 형광 물질을 결정함에 있어서, 도너로 사용하는 형광 물질의 발광스펙트럼의 최대값의 파장이 억셉터로 사용되는 형광 물질의 흡광스펙트럼의 최대값의 파장보다 짧은 것이 바람직하다.
2 종 이상의 DNA가 준비되면, 거리가 1인 DNA를 기판에 고정하고 해당 거리의 FRET 효율을 측정한다. 이후, 거리가 2인 DNA부터 차례로 전술한 내용과 동일한 과정을 반복하여 FRET 효율 기준값을 획득하고, 이를 거리별로 데이터베이스화 한다.
이후, 바이오마커 검출과정에서 측정되는 FRET 효율 측정값과 상기 FRET 효율 기준값을 비교하면, 검출에 사용된 태그 스트랜드의 도너와 억셉터 사이의 거리를 알 수 있으며, 이로부터 검출한 바이오마커의 종류를 바로 알 수 있다.
그러나, FRET 효율 측정에는 노이즈에 의한 오차가 있을 수 있어 모든 거리의 FRET 효율이 구분가능한 것이 아닐 수 있다. 예를 들면, 거리가 1일 때의 FRET 효율이 0.95(평균) ± 0.05(오차)이고, 거리가 2일 때의 FRET 효율이 0.94 ± 0.05이라면, FRET 효율로는 거리 1과 2를 구분할 수 없다. 따라서, 실제 바이오마커를 검출시에는 데이터베이스의 값 중 FRET 효율이 명확히 구분되는 거리만 이용함이 바람직하다.
FRET 효율 기준값이 확보되면 바이오마커를 검출하기 위해 바이오마커가 포함된 시료를 주입하고, 바이오마커를 기판에 부착하는 단계가 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출방법은 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 포획항체는 태그 스트랜드(포획항체태그)가 결합된 것일 수 있다.
포획항체를 기판에 흡착시키는 방법은, 예를 들면, pH 9.5인 0.06M의 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획항체를 희석시키고, 그 희석액을 일정 온도에서 기판에 소정의 시간동안 접촉시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 또는 기판 표면을 바이오틴(biotin)이 결합된 PEG(polyethylene glycol) 또는 BSA(bovine serum albumin)로 코팅하고, 스트렙타비딘(streptavidin)을 결합시킨 후 여기에 바이오틴이 결합된 포획항체를 결합시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 이후, 기판에 흡착된 포획항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리하게 되면, 시료에 포함된 바이오마커와 결합체를 형성하게 된다. 추가적으로, 결합체의 형성 이후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 TWEEN 20, TritonX-100 등이 포함된 세척 완충액으로 세척함이 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 검출 방법은 상기 포획항체태그와 브릿지 스트랜드가 결합하는 단계; 및 검출항체태그와 상기 브릿지 스트랜드가 결합하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
이때, 브릿지 스트랜드는 태그 스트랜드 및 포획항체태그의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 브릿지 스트랜드가 단일가닥 핵산인 경우, 일부 염기서열은 태그 스트랜드의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하고, 다른 일부는 포획항체태그와 상보적인 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이때, 상보적 결합의 범위가 특별히 한정되는 것은 아니다.
전술한 검출항체태그와 관련한 모든 설명은 포획항체태그에도 동일하게 적용될 수 있는 것이며, 포획항체를 포함하는 키트 및 검출 방법에도 동일 또는 유사하게 적용될 수 있다.
상술한 방법과 키트를 이용하면 FRET 효율을 이용하여 2 종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고, 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 따른 기술의 일 구현예에 따른 바이오마커 검출 방법을 이용하면 1fg/ml 수준의 극히 미량 존재하는 바이오마커를 포함하여 최대 1000여 개의 바이오마커를 동시에 검출하는 효과가 있으며, 검출 및 분석에 소요되는 시간이 매우 짧다는 장점이 있다.
이 후, 본 개시된 기술의 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법을 이용한 2 종 이상의 바이오마커의 검출은 후술할 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
한편 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 형광 물질에 의한 프렛효율을 이용하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별하는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출방법이 제공된다.
상기 키트는 도너 스트랜드; 및 서로 프렛쌍을 형성하는 상기 억셉터 형광 물질들을 2종 이상 구비한 억셉터 스트랜드를 포함할 수 있으며, 이때 상기 억셉터 스트랜드 내에서 두 억셉터 형광 물질은 서로 간에 도너와 억셉터 역할을 한다. 그리하여 이 경우의 상기 억셉터 스트랜드를 '프렛 스트랜드'라고 명명하기로 한다.
구체적으로, 도킹 스트랜드 또는 프렛 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광 물질과 도너 스트랜드에 표지되는 도너(Donor)에 의해 측정되는 프렛효율의 측정값을 이용함으로써 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있는 키트 및 검출방법이 제공된다.
상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; N종의 검출항체에 부착되는 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및 상기 N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함한다. 상기 도킹 스트랜드 또는 도너 스트랜드는 형광 물질을 포함한다. 상기 형광 물질에 의한 프렛효율을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 형광 물질이 표지된 프렛 스트랜드(FRET strand)를 더 포함할 수 있다. 상기 프렛 스트랜드는 N종의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 형광 물질은 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(Donor) 또는 억셉터(Acceptor)로 작용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 포획항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출방법은 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 도너 스트랜드(Donor strand)가 상기 N종의 도킹 스트랜드에 각각 결합하는 단계; 및 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드에 포함되는 형광 물질에 의해 생성되는 프렛효율을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 프렛효율을 이용하여 상기 N종의 바이오마커의 종류를 판별한 후 단위 면적 당 바이오마커 개수로부터 바이오마커 농도를 측정한다.
일 구현예에서, 상기 검출방법은 형광 물질이 표지된 프렛 스트랜드(FRET strand)가 상기 N종의 도킹 스트랜드에 결합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 상기 프렛 스트랜드는 상기 N종의 도킹 스트랜드에 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 검출방법은 상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
FRET 효율을 이용한 타겟 물질의 검출은 예를 들어 하기와 같은 방식으로 이루어질 수 있다. 도너와 억셉터 사이에 존재하는 염기의 수가 1개라고 할 때 간격을 1이라고 한다면, 도너와 억셉터 사이 간격을 1, 2, 3, … n으로 하는 2종 이상의 프렛쌍(FRET pair)을 제작한다. 상기 제작된 n종의 프렛쌍에 대한 프렛효율을 측정하여 간격에 대한 프렛효율을 데이터베이스화한다. 같은 종류의 검출항체에는 같은 종류의 도킹 스트랜드를 부착하고, 다른 종류의 검출항체에는 다른 종류의 도킹 스트랜드를 부착한다. N종의 프렛쌍은 도킹스트랜드에 직접 표지될 수도 있다. 이후, 바이오마커가 포함된 시료와 반응을 진행하면, 특정 바이오마커는 특정 검출항체와 결합하게 되는데, 이때, 각 분자의 도너와 억셉터가 내는 빛의 세기를 측정하여 프렛효율을 계산한다. 일례로, 도너 1로 작용하는 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드가 상기 도킹 스트랜드에 결합하면, 여기된 도너 1로부터 빛을 흡수한 도너 2와 억셉터로 구성된 프렛쌍에 의해 프렛효율을 측정할 수 있다.
추가적으로, 프렛 스트랜드를 더 포함하는 경우, 프렛쌍은 프렛 스트랜드에 표지되고 도킹 스트랜드에는 표지되지 않는다. 이 경우, 상기 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 모두 결합하는 순간에 프렛효율의 측정이 가능하다. 데이터베이스화된 값과 측정한 값을 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
도 19 내지 도 21는 본 명세서에 개시된 기술의 다양한 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
먼저, 도 19를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드 및 N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이 표지되어 있고, 도킹 스트랜드에는 도너 2 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 이 경우, 상기 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 순간에 프렛효율의 측정이 가능하다.
일 구현예에서, 상기 키트는 프렛 스트랜드(FRET strand)를 더 포함할 수 있다. 프렛 스트랜드를 사용하는 경우, 일부 형광 물질이 광표백되더라도 광표백되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합과 분리를 반복하는 과정을 통해 프렛효율을 측정할 수 있는 장점이 있다.
도 20을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질로, 프렛 스트랜드에는 도너 2 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 이 경우, 상기 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 모두 결합하는 순간에 프렛효율의 측정이 가능하다.
도 21을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이, 프렛 스트랜드에는 도너 2, 도너 3 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 프렛 스트랜드에 2개 이상의 형광 물질을 표지함으로써 최소한의 형광 물질 종류를 이용하여 다종의 바이오마커를 검출할 수 있다.
도 22는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드 및 N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질로, 도킹 스트랜드에는 도너 2 및 억셉터 형광 물질로 구성된 프렛쌍이 표지되어 있다. 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드에는 낮은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터가 멀게 표지되어 있고, 검출항체 N에 부착된 도킹 스트랜드에는 높은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터 가깝게 표지되어 있다.
상기 키트가 이와 같이 구성되는 이유는, N종의 바이오마커와 결합한 N종의 검출항체의 도킹 스트랜드로부터 동일한 프렛효율이 측정된다면, 검출된 바이오마커의 종류를 특정할 수 없기 때문이다.
따라서, 구분이 가능할 정도의 프렛효율의 측정값을 획득하기 위해서는, 검출하고자 하는 바이오마커의 수만큼 상이한 N종의 도킹 스트랜드 및 N종의 프렛쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 N종의 도킹 스트랜드에 결합하는 도너 스트랜드는 모두 동일한 종을 이용함이 바람직하다.
구체적으로, 도킹 스트랜드 각각에 직접 2종 이상의 형광 물질이 표지되는 경우, N종의 도킹 스트랜드는, 표지되는 2종 이상의 형광 물질 사이에 존재하는 염기의 수가 상이한 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, N종의 도킹 스트랜드는, 서로 상이한 프렛효율을 가지는 프렛쌍이 표지되는 것일 수 있다. 프렛 스트랜드에 2종 이상의 형광 물질이 표지되는 경우, N종의 프렛 스트랜드는 표지되는 2종 이상의 형광 물질 사이에 존재하는 염기의 수가 상이한 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, N종의 프렛 스트랜드는, 서로 상이한 프렛효율을 가지는 프렛쌍이 표지되는 것일 수 있다. 이때, 상기 도킹 스트랜드 또는 프렛 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광 물질은 도너 또는 억셉터로 작용할 수 있다.
도 23은 본 명세서에 개시된 기술의 다른 일 구현예에 따른 N종의 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 23을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1에는 낮은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터가 멀게 표지되어 있고, 검출항체 N에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 N에는 높은 프렛효율을 갖도록 도너 2와 억셉터가 가깝게 표지되어 있다. 프렛쌍이 도킹 스트랜드가 아닌 프렛 스트랜드에 표지되어 있는 점을 제외하면 도 2와 구성 및 원리는 동일유사하다.
도 24는 본 명세서에 개시된 기술의 다른 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 24를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 2개의 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 상기 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이 표지되어 있고, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1-1및 1-2에는 각각 도너 2와 억셉터 프렛쌍이 표지되어 있으나, 이때, 각각의 프렛쌍은 프렛효율이 상이하도록 표지함이 바람직하다.
또한, 동일한 프렛효율을 갖는 프렛 스트랜드는 동일한 염기서열을 가질 수 있다. 따라서 하나의 프렛 스트랜드는 여러 종의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있다. 일례로, 프렛효율 0.25, 0.5, 0.75를 갖는 3종의 프렛 스트랜드를 디자인하고, 바이오마커 1은 프렛효율 0.25와 0.5를 갖고, 바이오마커 2는 프렛효율 0.25와 0.75를 갖고, 바이오마커 3은 프렛효율 0.5와 0.75를 갖도록 디자인할 경우, 프렛효율 0.25의 프렛 스트랜드는 바이오마커 1과 바이오마커 2의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있으며, 프렛효율 0.5의 프렛 스트랜드는 바이오마커 1과 바이오마커 3의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있고, 프렛효율 0.75의 프렛 스트랜드는 바이오마커 2와 바이오마커 3의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합할 수 있다. 이 경우, N종의 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드는 N종 이하일 수 있다.
도 25는 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 25를 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이 표지되어 있고, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1에는 도너 2와 억셉터 프렛쌍이 표지되어 있다. 이때, 상기 도킹 스트랜드에는 동일한 도너 스트랜드와 프렛 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있는 결합부위가 2 이상 존재하도록 구성함으로써, 최소 1 이상의 결합부위에 상기 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 동시에 결합하는 경우, 프렛효율을 측정할 수 있으므로, 전술한 도 23과 같은 구성에 비해 2배 이상 빠른 분석이 가능하다.
한편, 프렛쌍이 프렛 스트랜드가 아닌 도킹 스트랜드에 표지되는 경우에도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
또, 상기 도킹 스트랜드 또는 프렛 스트랜드는 복수의 도너 또는 억셉터가 표지되는 것일 수 있다. 이 경우, 2 이상의 도너는 억셉터와 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 도너는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다. 또 다른 경우, 2 이상의 억셉터는 도너와는 상이한 종류의 형광 물질이고, 2 이상의 억셉터는 서로 다른 종류의 형광 물질일 수 있다.
일례로, 하나의 검출항체에 복수의 도킹 스트랜드가 부착될 수 있다. 이때, 부착되는 도킹 스트랜드는 동일종으로서, 각 도킹 스트랜드에 결합하는 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드도 동일하다. 이러한 구성은 도 26에 개략적으로 도시한 바와 같다.
도 26을 보면, 검출항체, 검출항체에 부착되는 도킹 스트랜드, N종의 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드, 특정 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드를 포함하는 키트의 구성이 도시되어 있다. 구체적으로는, 하나의 검출항체에는 2 이상의 도킹 스트랜드가 부착될 수 있다. 도너 스트랜드에는 도너 1 형광 물질이, 검출항체 1에 부착된 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 프렛 스트랜드 1에는 도너 2와 억셉터 프렛쌍이 표지되어 있고, 2 이상의 도킹 스트랜드 중 어느 하나에 도너 스트랜드와 프렛 스트랜드가 동시에 결합하는 경우, 프렛효율을 관측할 수 있어, 전술한 도 23과 같은 구성에 비해 2배 이상 빠른 분석이 가능하다. 즉, 도 26과 같이 구성되는 키트를 이용하는 경우, 도 25와 유사한 효과를 얻을 수 있다. 또한 프렛쌍이 프렛 스트랜드가 아닌 도킹 스트랜드에 표지되는 경우에도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
다른 일례로, 도 25 내지 도 26에 나타낸 구성 중 둘 이상을 조합하여 이루어지는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트일 수 있으며, 이를 다중 바이오마커 동시 검출에 이용할 수 있다.
또 다른 일례로, 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 27에 도시된 바와 같이, 마이크로 RNA를 검출하는 용도로 이용될 수도 있다. 도 27을 보면, 마이크로 RNA를 포함한 DNA, RNA 등의 핵산을 검출하기 위한 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 한쪽 끝에 기판의 코팅물질과 결합친화적인 물질을 부착하거나 각 핵산의 일부분과 상보적인 핵산을 미리 기판에 코팅하여 검출하고자 하는 N종의 핵산을 기판에 고정한다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 염기서열은 정해져 있으므로 이에 상보적인 N종의 도너 스트랜드와 프렛 스트랜드를 이용하여 각 핵산을 판별할 수 있다.
도 28은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 도너 1(Alexa Fluor 488), 도너 2(Cy5) 및 억셉터 (Cy7)의 흡광 스펙트럼 및 발광 스펙트럼을 측정한 데이터를 나타낸 것이다. 도 28의 (a)는 형광 물질들의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다. 일례로, (a)의 검은색 세로 점선은 도너 1을 여기하는 데 사용되는 488 nm 파장을 나타낸 것으로서, 이때, 도너 1은 여기되지만, 도너 2와 억셉터는 여기되지 않는다. 이 경우, 도너 2 및 억셉터는 프렛에 의해 도너 1로부터 에너지를 전달받아야만 빛을 낼 수 있으므로, 도너 1이 표지된 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합해야만 프렛쌍의 프렛효율을 측정할 수 있다. 프렛 스트랜드가 이용되는 경우에는 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 동시에 도킹 스트랜드에 결합해야 프렛쌍의 프렛효율을 측정할 수 있다.
도 28의 (b)는 형광 물질들의 발광 스펙트럼을 나타낸 것이다. 일례로, (b)의 검은색 세로 점선으로 표시된 파장을 기준으로 광학필터(dichroic mirror)를 이용해 왼쪽 점선과 오른쪽 점선 사이 파장대의 빛의 세기를 합해 도너 2의 밝기를 측정하고, 오른쪽 점선보다 긴 파장대의 빛의 세기를 합해 억셉터의 밝기를 측정함으로써 프렛쌍의 프렛효율을 계산할 수 있다. 이 경우, 도너 1과 도너 2 사이의 프렛효율을 1에 가깝도록 하고 광학필터로 도너 1의 신호를 제거한 후 도너 2와 억셉터의 빛을 세기만을 측정함이 바람직하다.
또한, 추가로 도너 스트랜드에 표지되는 도너 1과 프렛 스트랜드에 표지되는 도너 2 사이의 거리를 조절함으로써, 도너 1과 도너 2 사이의 프렛효율을 조절하고, 도너 1과 도너 2의 빛을 세기를 측정하여 프렛효율을 계산함으로써 다중 바이오마커를 검출할 수 있다.
도 29는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 원리를 개략적으로 나타낸 것이다.
기판을 바닥으로 하는 웰에 N종의 바이오마커를 부착하고, N종의 도킹 스트랜드가 각각 부착된 N종의 검출항체를 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합시킨 후 도너 스트랜드가 포함된 버퍼(buffer)로 웰을 채우면 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합한다. 이때 발생하는 프렛쌍의 빛의 세기를 측정함으로써 프렛효율을 측정하고, 다중 바이오마커를 판별할 수 있다. 이때, 프렛효율은 광학필터(dichroic mirror)를 이용해 파장대별 빛의 세기를 측정하거나 프리즘(prism)이나 격자(grating)를 이용해 형광 물질들의 상대적인 스펙트럼 크기를 측정함으로써 계산할 수 있다.
도 29는 광학필터(dichroic mirror)를 이용해 도너 2와 억셉터가 방출하는 빛의 세기를 측정하는 방법을 나타낸다.
도 29를 보면, (a)는 기판에 2종의 바이오마커 1과 2가 고정된 상태를 나타낸다. 바이오마커 1에는 도킹 스트랜드 1이 부착된 검출항체 1이 결합해 있으며, 바이오마커 2에는 도킹 스트랜드 2가 부착된 검출항체 2가 결합해 있다. (b)는 도킹 스트랜드 2에 도너 스트랜드가 결합하여 프렛쌍이 빛을 내는 상태를 나타낸다. 이때, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정함으로써 바이오마커 2의 프렛효율을 계산한다. 또, (c)는 도킹 스트랜드 2에서 도너 스트랜드가 분리되어 프렛쌍이 빛을 내지 않는 상태를 나타내며, (d)는 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드가 결합하여 프렛쌍이 빛을 내는 상태를 나타낸다. 이때, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정함으로써 바이오마커 1의 프렛효율을 계산한다. 이후, (e)는 도킹 스트랜드 1에서 도너 스트랜드가 분리되어 프렛쌍이 빛을 내지 않는 상태를 나타내며, (f)는 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드가 다시 결합하여 프렛쌍이 빛을 내는 상태를 나타낸다. 이 경우 역시, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정함으로써 바이오마커 1의 프렛효율을 계산한다. 관측영역 내의 모든 바이오마커의 프렛효율을 1회 이상 측정할 때까지 지속한 후 상기 프렛효율을 이용하여 바이오마커의 종류를 판별한 후 단위 면적 당 바이오마커 개수로부터 바이오마커 농도를 측정한다.
도너 스트랜드의 종류(DNA, RNA, PNA 등) 또는 도킹 스트랜드와 결합하는 도너 스트랜드의 길이, 버퍼의 이온 농도 등을 조절함으로써 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합한 후 분리되는 데 걸리는 시간을 제어할 수 있다. 이 시간을 길게함으로써 대부분의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합되어 있도록 함으로써 측정 시간을 줄일 수 있다. 또는 이 시간을 짧게 함으로써 대부분의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합되어 있지 않도록 할 수 있다. 만일, 어느 하나의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 일시적으로 결합해 프렛쌍이 빛을 낼 경우, 그 주변에 존재하는 대부분의 도킹 스트랜드는 빛을 내지 않는 상태이므로 다른 프렛쌍의 간섭없이 프렛효율을 측정할 수 있으므로, 프렛쌍의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도 측정할 수 있다. 또, 이로 인해 한 화면에 많은 수의 바이오마커를 동시에 측정할 수 있어 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다. 이는, 프렛 스트랜드에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다. 이때, 도너 스트랜드가 분리되는 시간은 수 초 이내로 짧게, 프렛 스트랜드가 분리되는 시간은 수 초 이상으로 길게 함이 바람직하다.
아울러, 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하는 속도는 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드의 농도에 비례하므로 농도를 높일수록 분석 속도를 높일 수 있다.
도 30은 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따라 도너 스트랜드의 농도를 달리하여 형광 이미지를 측정한 것이다. 전술한 도 28의 (b)와 같이, 도너 1 스펙트럼의 일부는 도너 2 스펙트럼의 일부와 겹치는 구간이 있으며, 이러한 겹치는 구간이 도너 2의 밝기 측정에 영향을 미친다. 도 30은 도너 2의 밝기를 이미징 카메라를 통해 측정한 화면을 도시한 것으로, 버퍼에 존재하는 도너 스트랜드의 농도가 각각 (a)는 100 nM, (b)는 500 nM, (c)는 1000 nM일 때의 이미지이다. 도 30에 도시된 바와 같이, 도너 스트랜드의 농도가 증가할수록 도너 2 이미지의 배경잡음이 증가하며, 이는 도너 2 밝기 측정의 정확도를 떨어뜨린다. 즉, 도너 스트랜드의 농도가 높아질수록 분석 속도는 증가하나 프렛효율 측정의 정확도 낮아지므로 속도와 정확도 모두를 만족시키기 위해서 버퍼에 포함되는 도너 스트랜드의 농도는 1 nM 내지 1 uM 임이 바람직하다.
또 다른 일례로, 1개의 도킹 스트랜드에 복수의 프렛 스트랜드가 결합하는 경우, 도너 스트랜드는 상기 프렛 스트랜드의 수와 동일한 만큼 결합하는 것일 수 있다. 상기 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 억셉터가 동일한 경우, 표지되는 도너는 서로 동일 또는 상이한 종류를 사용할 수 있으나, 상기 억셉터와는 상이한 종류임이 바람직하다.
구체적으로, 1개의 도킹 스트랜드에 복수의 프렛 스트랜드가 결합하는 경우, 상기 프렛 스트랜드에 표지되는 도너 및 억셉터는 아래의 4가지 경우로 조합되는 것일 수 있다.
i) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 동일한 형광 물질일 수 있다
ii) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 동일한 형광 물질일 수 있다.
iii) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 동일한 형광 물질이고, 억셉터는 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
iv) 복수의 프렛 스트랜드에 표지되는 도너는 서로 상이한 형광 물질이고, 억셉터도 서로 상이한 형광 물질일 수 있다.
상기 형광 물질은 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너 또는 억셉터로 작용하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질을 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드의 특정 염기 상에 표지하여 프렛효율을 측정하는 것일 수 있다.
또, 본 명세서에 개시된 기술에서 이용되는 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 침, 조직액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 진단의 종류 또는 특성에 따라서 검출이 필요한 바이오마커가 포함되는 것이면 될 뿐, 특별히 한정되는 것은 아니다.
2종 이상의 바이오마커를 검출하는 경우에 있어서, 앞서와 같이 억셉터 신호만 관찰하는 FRET-PAINT 방식에서는 도너 스트랜드를 1종씩 넣어주고 이에 상보적인 도킹 스트랜드를 찾은 후 씻어내는 과정을 N회 반복하므로 전체 측정 시간이 N분 내외로 장시간(1종당 1분 내외, N은 수백~수천) 소요될 수 있다. 또한 수백 nM 농도의 도너 스트랜드를 N회 사용하므로 경제성이 떨어질 수 있다.
하지만 상술한 방법과 같이 염기서열이 아닌 억셉터 스트랜드의 프렛 효율을 이용하여 타겟 물질을 구분하는 방식을 이용할 경우에 동일한 도너 스트랜드를 사용할 수 있어서, 새로운 도너 스트랜드를 넣고 씻어내는 과정이 불필요하여 전체 측정시간이 1분 내외로 감소할 수 있으며, 수백 nM 농도의 도너 스트랜드도 단 1회만 소모하는 장점이 있다.
하나의 억셉터 스트랜드로 구분 가능한 프렛 효율은 10개 내외이므로 구분하고자 하는 타겟의 수에 맞춰 억셉터 스트랜드의 개수를 늘릴 수 있다. 하지만 하나의 억셉터 스트랜드로 구분 가능한 타겟 수가 10개라면, 두 개의 억셉터 스트랜드로 구분 가능한 수는 100개가 아닌 55개가 된다. 이런 식으로 억셉터 스트랜드의 개수가 세 개면 1,000이 아닌 220개, 네 개면 10,000이 아닌 715개가 된다. 그 이유는, 가령 프렛효율 0.1과 0.2로 구성된 타겟1과 프렛효율 0.1과 0.3으로 구성된 타겟2는 서로 구분할 수 있으나, 프렛효율 0.1과 0.2로 구성된 타겟1과 프렛효율 0.2와 0.1으로 구성된 타겟2는 서로 구분할 수 없기 때문이다.
하지만 이 경우에는 공통 도너 스트랜드를 N종 사용함으로써 위의 문제를 해결할 수 있다. 예를 들어 공통 도너 스트랜드를 사용할 경우 프렛 효율 0.1과 0.2로 구성된 타겟1과 프렛 효율 0.2와 0.1로 구성된 타겟2를 구분할 수 없으나, 1차 도너 스트랜드를 넣을 경우 타겟1은 0.1, 타겟2는 0.2가 측정되고, 2차 도너 스트랜드를 넣을 경우 타겟1은 0.2, 타겟2는 0.1이 측정되어 구분 가능할 수 있다. 즉, N종의 공통 도너 스트랜드를 사용하고 단 N회 도너 스트랜드를 넣고 측정 후 세척하는 과정을 반복함으로써 10N개의 타겟 물질을 구분할 수 있다. 예를 들어 N=2일 경우 100, N=3일 경우 1,000, N=4일 경우 10,000 가지 타겟 물질을 구분할 수 있다.
상술한 바에 따르면, 프렛효율을 이용하여 2 종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 개시된 기술은 형광 물질이 표지된 스트랜드가 일시적으로 결합되는 특징이 있다. 그러므로 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질이 광표백이 되는 경우에도 결합과 분리를 반복하는 과정에서 광표백 되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드 또는 프렛 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합하여 프렛효율을 측정할 수 있어 광표백 현상과 관계없이 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.
또, 프렛 스트랜드를 이용하는 경우, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드 및 프렛 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에만 프렛 스트랜드 상의 형광 물질이 빛을 내고, 프렛 스트랜드를 이용하지 않는 경우, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합하는 순간에만 도킹 스트랜드 상의 형광 물질이 빛을 낸다. 그러므로 일시적으로 빛을 내는 형광 물질을 주변 형광 물질의 간섭없이 측정할 수 있어, 해당 형광 물질의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도로 측정할 수 있으며, 이로 인해 한 화면에 많은 수의 바이오마커를 동시에 측정할 수 있는 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다.
이 후, 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법을 이용한 N종의 바이오마커의 검출은 후술할 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
한편 본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있는 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출방법이 제공된다.
앞의 기술에 따르면, 서로 다른 억셉터 스트랜드는 동일한 조합의 억셉터 형광물질로 구성되나 억셉터 사이의 거리가 다르므로 각 억셉터 스트랜드의 프렛 효율을 파악함으로써 타겟을 구별한다.
반면 본 측면에 따른 기술에서는 서로 다른 억셉터 스트랜드는 서로 다른 조합의 억셉터 형광물질로 구성되며, 각 억셉터의 종류를 파악함으로써 타겟을 판별할 수 있다. 가령 타겟1이 억셉터1과 억셉터2로 구성되어 있고, 타겟2가 억셉터1과 억셉터5로 구성되어 있으면 타겟1과 타겟2의 각 스펙트럼은 구별되어 관찰된다. 따라서 서로 다른 억셉터들이 동시에 빛을 내도 무방하므로 모든 도너와 억셉터를 도킹 스트랜드상에 표지할 수 있고, 도너를 여기하는 순간 모든 억셉터가 형광신호를 내므로 전체 측정 시간은 수 초에 불과할 정도로 매우 단축될 수 있으며, 도너 스트랜드를 사용하지 않으므로 경제성도 높다.
일 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; 2종 이상의 형광 물질이 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 및 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; 1종 이상의 형광 물질이 표지된 N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 및 1종 이상의 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드(Donor strand)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 기판; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand); 상기 도킹 스트랜드가 각각 결합된 N종의 검출항체; 1종 이상의 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드(Donor strand); 및 1종 이상의 형광 물질이 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor strand)를 포함한다.
상기 각 구현예에서 상기 형광 물질은 상기 도킹 스트랜드, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 특정 염기(base), 3'- 또는 5'-말단(end), 또는 기본골격(backbone) 상에서 도너(donor) 또는 억셉터(acceptor)로 작용할 수 있다.
상기 다양한 구현예에 따른 키트를 이용하면 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
상기 도킹 스트랜드는 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 포획항체를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출방법은 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다. 이때 서로 다른 종류의 형광 물질간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 시료 중의 바이오마커의 농도를 측정한다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 방법은 기판에 N종의 바이오마커가 부착되는 단계; N종의 도킹 스트랜드(Docking strand)가 각각 부착된 N종의 검출항체가 상기 N종의 바이오마커와 각각 결합하는 단계; 및 상기 N종의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계; 및 발광 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다. 이때 서로 다른 종류의 형광 물질간 발생하는 프렛(FRET)으로 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커를 동시에 판별한 후 단위 면적당 바이오마커의 개수로부터 시료 중의 바이오마커의 농도를 측정한다.
일 구현예에서, 상기 검출 방법은 도킹 스트랜드에 형광 물질이 표지된 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 검출 방법은 상기 기판에 포획항체를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상술한 키트 및 검출 방법에 따르면, 도킹 스트랜드에 표지되거나, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드에 표지되는 2종 이상의 형광 물질의 공명에 의한 프렛을 이용하여 발광 스펙트럼을 측정함으로써 다종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.
상기 검출항체는 바이오마커를 항원-항체반응을 이용하여 검출하기 위한 것으로서, 검출대상인 바이오마커의 종류만큼 이종의 것을 사용함이 바람직하다. 또, 검출용 키트의 구성의 간단함을 위해서는 N종의 도킹 스트랜드는 표지되는 도너 또는 억셉터 중 어느 하나는 모두 동일한 것을 이용함이 바람직하다. 구체적으로는, 상기 N종의 도킹 스트랜드에 표지되는 도너가 모두 동일한 경우, 하나의 광원만을 이용하여 추가적인 광원과 광학필터 없이도 각각의 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 N종의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프렛이 발생하기 위한 조건으로, 도너의 발광 스펙트럼과 억셉터의 흡광 스펙트럼 사이에 겹침(Overlap)현상이 일어날 수 있도록, 억셉터로 작용하는 형광 물질의 흡광 스펙트럼과 소정의 파장범위가 겹치는 발광 스펙트럼을 가지는 형광 물질을 도너로 이용함이 바람직하다.
일례로, 도 31에 도시된 바와 같이, 검출항체1 내지 N에는 각각 동일한 도너가 표지된 도킹 스트랜드가 결합되고, 각각의 도킹 스트랜드에는 각각 억셉터1 내지 N이 표지되는 경우, 광원을 여기시키는 도너는 모두 동일하므로 최초에 조사되는 광원은 1종류만 필요하고, 억셉터로 작용하는 형광 물질의 종류에 따라 방출하는 빛의 스펙트럼이 각기 다르게 측정되므로, 측정된 빛의 스펙트럼을 확인함으로써 억셉터의 종류를 확인할 수 있다. 검출항체N에 결합된 도킹 스트랜드N에는 억셉터N을 표지함으로써 확인된 억셉터가 표지된 검출항체 및 이와 친화적으로 결합하는 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
또, 도 32에 도시된 바와 같이, 검출항체 1 내지 N 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 도너 및 동일한 억셉터가 표지될 수 있다. 이때, 각각의 도너와 억셉터 사이의 거리는 도 32의 (a), (b), (c)와 같이 상이한 것을 이용함으로써, 오른쪽 그래프와 같이 프렛효율에 따른 스펙트럼의 차이를 이용하여 다중 바이오마커를 동시에 검출할 수도 있다.
또는, 도 33에 도시된 바와 같이, 검출항체 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 억셉터와 2종 이상의 도너가 각각 표지될 수도 있다. 이 경우, 도 33의 오른쪽 그래프와 같이, 도너로 작용하는 2종의 형광 물질의 흡광 스펙트럼(점선)이 겹치고 있으므로, 하나의 광원으로 2종의 형광 물질을 모두 여기시키는 동시에 발광 스펙트럼(실선)이 명확하게 구분될 수 있으므로, 모두 동일한 도너를 이용한 도 31 또는 도 32의 경우에 비해, 검출 가능한 바이오마커의 종류가 더 많아지는 장점이 있다.
다른 일례로, 도 34a 내지 도 34c에 도시된 바와 같이, 검출항체 각각에 결합하는 도킹 스트랜드에 동일한 도너가 표지되고, 2종 이상의 억셉터가 표지될 수도 있다.
이때, 표지되는 2종 이상의 억셉터는 도 34a와 같이, 억셉터끼리 인접하여 억셉터-억셉터 프렛쌍을 형성할 수 있으며, 혹은, 도 34b와 같이, 각각 도너와 인접하여 도너-억셉터 프렛쌍을 형성할 수도 있다. 억셉터-억셉터 프렛쌍을 형성하는 경우, 표지되는 억셉터 사이의 거리를 조절하여 바이오마커의 종류를 판별할 수도 있다. 도 34c는 1종의 도너와 5종의 억셉터를 이용하여, 도 34a와 같이 도킹 스트랜드 상에 억셉터-억셉터 프렛쌍을 표지하여 다중 검출을 실시한 결과를 나타낸 것으로 아래쪽부터 (억셉터1, 억셉터2), (억셉터1, 억셉터3), (억셉터1, 억셉터4), (억셉터1, 억셉터5), (억셉터2, 억셉터3), (억셉터2, 억셉터4), (억셉터2, 억셉터5), (억셉터3, 억셉터4), (억셉터3, 억셉터5), (억셉터4, 억셉터5)로 프렛쌍이 구성된 도킹 스트랜드로부터 방출된 빛의 스펙트럼을 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 즉, 측정된 스펙트럼을 이용하여 도킹 스트랜드의 종류를 명확히 구분할 수 있으므로, 각각의 도킹 스트랜드에 이용된 억셉터-억셉터 프렛쌍의 종류를 확인함으로써 검출된 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이 구성되는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트의 구성 중 어느 하나 또는 적어도 2 이상을 조합한 구성을 이용하여 다중 검출함으로써 약 1,000여종 이상의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다.
또한, 하나의 도킹 스트랜드 상에 구성이 동일한 형광 물질 조합을 2 이상 반복함으로써 검출되는 신호의 강도를 증가시킬 수 있다.
도 35a 및 도 35b는 본 명세서에 개시된 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출 방법을 예시적으로 나타낸 것으로, 검출하고자 하는 N종의 바이오마커와 특이적으로 결합하는 N종의 검출항체 각각에 상이한 발광 스펙트럼을 갖는 N종의 도킹 스트랜드를 결합시켜, 상기 발광 스펙트럼을 측정함으로써 바이오마커의 종류를 판별할 수 있다.
먼저, 기판에 바이오마커를 고정한 뒤, 각 바이오마커와 검출항체를 결합시킨다. 이때, 기판에는 포획항체가 부착되는 단계가 먼저 수행될 수 있으며, 이 경우, N종의 포획항체 각각은 N종의 바이오마커와 특이적으로 결합하는 것을 이용함이 바람직하다. 그러나, 이는 하나의 예일 뿐, 상황에 따라서 바이오마커는 기판에 직접 부착될 수도 있다. 이는 측정 과정의 속도, 경제성 및 편의성을 위한 것이며, 필요에 따라, 측정 결과의 정확성을 높이기 위해 기판에 부착된 포획항체와의 항원-항체 반응을 통해 바이오마커를 검출할 수도 있다.
따라서, 상기 키트에 포함된 기판은, 바이오마커 검출시에, 바이오마커가 직접 기판의 표면에 부착되거나 바이오마커를 포획할 수 있는 포획항체를 부착할 수 있도록 표면이 처리가 된 것일 수 있다. 검출과정에 부착되는 경우, 기판으로서 포획항체와 결합특이적인 물질이 코팅된 것을 이용함이 바람직하다. 구체적으로는, 포획항체에는 특이적이면서, 검출항체 또는 스트랜드와는 비특이적인 물질을 도포하여 기판에 코팅함이 바람직하다.
포획항체를 기판에 흡착시키는 방법은, 예를 들면, pH 9.5인 0.06M의 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획항체를 희석시키고, 그 희석액을 일정 온도에서 기판에 소정의 시간동안 접촉시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 또는 기판 표면을 바이오틴(biotin)이 결합된 PEG(polyethylene glycol) 또는 BSA(bovine serum albumin)로 코팅하고, 스트렙타비딘(streptavidin)을 결합시킨 후 여기에 바이오틴이 결합된 포획항체를 결합시킴으로써 흡착시키는 것일 수 있다. 이후, 기판에 흡착된 포획항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리하게 되면, 시료에 포함된 바이오마커와 결합체를 형성하게 된다. 추가적으로, 결합체의 형성 이후에는, 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 TWEEN 20, Triton X-100 등이 포함된 세척 완충액으로 세척함이 바람직할 수 있다.
전술한 바와 같이, 포획항체 또는 기판에 도포된 물질에 의해 N종의 바이오마커를 기판에 고정시킨 뒤, 상기 바이오마커에 검출항체를 결합시킨다. 이후, 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하고 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스를 비교하여 해당 바이오마커를 판별한 뒤, 화면에 나타난 단위 면적당 바이오마커의 개수를 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다. 가령, 광원을 조사하여 도너를 여기시키면, 도 35a와 같이 화면에 각 분자의 발광 스펙트럼이 나타나게 되는데, 이를 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스(A, B, C 등)와 비교하여 화면에 나타난 각 분자가 어떤 바이오마커인지 판별할 수 있다(ex: 스펙트럼의 형태가 A면 바이오마커 1, B면 바이오마커 2, C면 바이오마커 3). 이후, 각 바이오마커별 단위 면적당 개수를 측정하고 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 시료에 포함된 각 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다. 일례로 바이오마커 1의 경우 기 측정한 농도별 단위 면적당 개수가 1 ng/ml당 10이고, 측정 결과 단위 면적당 개수가 5라면 시료에 포함된 바이오마커 1의 농도는 0.5 ng/ml임을 알 수 있다.
도 35b는 발광 스펙트럼을 측정하는 다양한 방법 중 하나를 예시적으로 나타낸 것이다. 일례로, 통상의 현미경을 이용해 다양한 종류의 형광 물질을 관측하는 경우, 발광 스펙트럼과 무관하게 왼쪽 그림과 같이 원형의 점 확산 함수(point spread function; PSF)을 갖는다. 하지만 광로(optical path) 상에 프리즘(prism)이나 격자(grating) 등 파장에 따른 광로 차를 유발하는 광학부품을 사용함으로써 각 형광 물질의 점 확산 함수를 원에서 타원 형태로 바꿀 수 있으며, 본래 원의 중심과 타원의 중심을 비교하고, 타원의 장축 방향의 프로파일을 분석함으로써 발광 스펙트럼을 측정할 수 있고, 이를 기 측정한 발광 스펙트럼 데이터베이스와 비교함으로써 해당 분자가 어떤 형광 물질로 구성되어 있는지 알아낼 수 있다("Ultrahigh-throughput single-molecule spectroscopy and spectrally resolved super-resolution microscopy", Zhengyang Zhang, Samuel J Kenny, Margaret Hauser, Wan Li & Ke Xu, Nature Methods volume 12(2015), pages 935-938 참조).
일 구현예에서, 검출항체에 부착된 도킹 스트랜드는 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합할 수도 있다.
이 경우, 상기 도너 스트랜드에는 도너가 표지되며, 억셉터 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍이 표지된다. 이때, 도 36a에 도시된 바와 같이 상기 도킹 스트랜드에 직접 2종 이상의 억셉터가 표지되는 경우, 표지된 부분에 인접한 부위에 도너 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있으며, 결합하는 순간, 프렛이 발생하여 억셉터가 발광할 수 있다. 만일, 도 36b와 같이 도킹 스트랜드에 별도의 형광 물질이 표지되지 않는 경우라면, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도킹 스트랜드에 결합과 분리를 반복하므로, 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에만 억셉터가 발광함으로써 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 이러한 이유로, 광표백되는 형광 물질이 발생하는 경우라도 소정의 반응시간이 주어진다면 광표백되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하는 순간에 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다는 장점이 있다. 또, 동시에 결합하는 순간에 측정하여 기록할 수 있으므로, 검출대상인 바이오마커의 종류가 많아질수록 하나의 화면에 여러 종류의 이미지가 동시에 출력되어 분별이 어려워지는 문제점을 해결할 수 있다.
도 37은 상기 도 36b와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 포함되는 검출용 키트를 이용하여 바이오마커의 종류를 판별하는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
먼저, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 N종이라면, N종의 도킹 스트랜드와 이에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 디자인하고 각각의 발광 스펙트럼을 미리 측정하여 데이터베이스를 제작한다. 이때, 바이오마커 1 내지 N에는 검출항체1 내지 N이 각각 결합하고, 검출항체 1 내지 N 각각에는 도킹 스트랜드 1내지 N이 부착된다.
데이터베이스의 기록이 끝나면, 기판에 바이오마커를 고정시킨 뒤, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류에 적합한 도킹스트랜드를 이용하여 다음과 같이 바이오마커의 판별을 수행한다. 각각의 바이오마커에 검출항체를 결합시킨 뒤, 미리 제작된 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 넣고 소정 시간동안 결합과 분리가 반복되도록 한다. 이때, 1개의 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합할 경우, 도 37과 같이 화면상에 신호가 나타되고, 해당 신호의 스펙트럼을 분석하여 앞서 기록된 데이터베이스와 비교함으로써 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 매 화면마다 신호가 검출된 위치를 누적하여 표시하고, 하나의 바이오마커 분자에 의해 중복하여 발생하는 신호는 특정 위치를 중심으로 가우스 함수(Gaussian function) 형태의 군집을 이루게 되고, 하나의 군집을 하나의 바이오마커 분자로 간주하여 단위 면적당 바이오마커의 개수를 산출하고, 기 측정된 농도별 단위 면적당 개수와 비교함으로써 시료에 포함된 바이오마커의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 도 31 내지 도 34에 도시된 구성 중 어느 하나 또는 적어도 2 이상을 조합한 구성에 대하여, 도너를 도너 스트랜드에 표지하고, 억셉터를 도킹 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드에 표지함으로써 상기와 같은 방법으로 약 1,000여종 이상의 바이오마커 종류를 판별할 수 있다. 가령, 도 38a와 같이 하나의 도킹 스트랜드에 복수의 도너 스트랜드 및 복수의 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합할 수도 있다. 이러한 조합은, 도 36b와 같은 구성으로 검출하는 바이오마커의 종류는 동일하나, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 부위가 2 이상 존재하고 있어, 어느 하나의 부위라도 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합하면 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 따라서, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 결합과 분리가 반복되는 동안 결합이 되는 확률을 높일 수 있어, 검출속도가 2배 이상 빨라진다는 장점이 있다.
이 경우, 상기 복수의 도너 스트랜드는 서로 상이한 도너가 표지되어 있을 수 있다. 이때, 상기 복수의 도너 스트랜드 각각은 서로 상이한 프렛효율을 갖기위해, 인접하는 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍과의 거리가 상이하도록 도너가 표지된 것일 수 있으며, 상기 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍은 서로 상이한 형광 물질로 구성될 수 있다. 또, 상기 복수의 억셉터 또는 억셉터-억셉터 프렛쌍은 도너와 서로 상이한 프렛효율을 갖도록 상기 도너와의 거리가 상이하도록 표지될 수 있으며, 상기 억셉터-억셉터 프렛쌍은 서로 상이한 프렛효율을 갖도록 억셉터간 거리가 상이하도록 표지되어 있을 수 있다.
도 38a와 유사한 효과를 야기시키는 방안으로, 도 38b 와 같이 하나의 검출항체에 동일한 구성을 가지는 도킹 스트랜드를 부착시켜 바이오마커의 검출속도를 높일 수도 있다.
또, 도 38a와 도 38b의 구성을 조합하여, 복수의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 상보적으로 결합할 수 있는 도킹 스트랜드를 하나의 검출항체에 2이상 부착시켜 바이오마커의 검출속도를 더 높일 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 다중 바이오마커 동시 검출용 키트는 도 39에 도시된 바와 같이, 마이크로 RNA를 검출하는 용도로 이용될 수도 있다.
도 39를 보면, 마이크로 RNA를 포함한 DNA, RNA 등의 핵산을 검출하기 위한 키트의 구성이 예시적으로 도시되어 있다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 한쪽 끝에 기판의 코팅물질과 결합친화적인 물질을 부착하거나 각 핵산의 일부분과 상보적인 핵산을 미리 기판에 코팅하여 검출하고자 하는 N종의 핵산을 기판에 고정한다. 검출하고자 하는 N종의 핵산의 염기서열은 정해져 있으므로 이에 상보적인 N종의 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용하여 각 핵산을 판별할 수 있다.
앞서 언급한, 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드로서, 바람직하게는, DNA, RNA, PNA, LNA, MNA, GNA, TNA와 같은 핵산 또는 이의 유사체를 이용할 수 있다. 추가적으로, 도 31 내지 도 34와 같이 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 별도로 사용하지 않는 경우, 상기 도킹 스트랜드는 폴리펩티드 또는 탄수화물일 수도 있다.
이때, 도너 또는 억셉터의 빛의 세기는 도너와 억셉터 간의 거리에 따라 영향을 받을 수도 있으나, 도너와 억셉터를 원하는 특정 염기, 3'- 또는 5'-말단, 또는 기본골격 상에 표지하여 도너와 억셉터 혹은 억셉터와 억셉터 사이의 거리를 조절함으로써, 다른 프렛효율을 가지는 도킹 스트랜드를 제작할 수 있다.
예를 들어, N종의 도킹 스트랜드에 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광 물질을 표지하고, 각 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 미리 측정하여 데이터베이스를 측정한 뒤, 바이오마커 검출을 위한 반응 시에 생성되는 발광 스펙트럼과 비교함으로써, 반응한 바이오마커의 종류를 검출할 수 있다. 이때, 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광 물질은 (도너1, 억셉터1), (도너1, 억셉터2), …, (도너1, 억셉터N)과 같이 구성될 수 있고, (도너1, 억셉터1), (도너2, 억셉터1), …, (도너 N, 억셉터1)과 같이 구성될 수 있다. 혹은, 동일한 도너가 표지된 도킹 스트랜드에 (억셉터1, 억셉터2), (억셉터1, 억셉터3), (억셉터2, 억셉터3), … 등과 같이 2종 이상의 상이한 억셉터로 구성될 수도 있다.
상술한 서로 다른 프렛효율을 가지는 형광 물질의 구성은 일부를 예시적으로 나타낸 것으로, 검출시 판별이 가능한 정도의 프렛효율의 차이가 있는 구성이면 특별히 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법은, N종의 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 데이터베이스를 제작하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 검출을 위한 반응을 진행하기 전 단계로, 전술한 구성 중 어느 하나 이상을 포함하는 도킹 스트랜드를 디자인하여 각 도킹 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정하여 데이터베이스로 기록함으로써 반응시 측정되는 값과 비교하여, 검출에 사용된 검출항체의 종류를 확인할 수 있으므로, 최종적으로 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
N종의 바이오마커를 검출함에 있어서, 발광 스펙트럼은 동시 또는 순차적으로 측정할 수 있다. 가령, 3종의 바이오마커를 검출하는 경우, 검출항체 1, 2, 3에 부착되는 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 상보적으로 결합하는 도너 스트랜드는 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 동시에 결합할 수도 있고, 순차적으로 결합할 수도 있다. 도킹 스트랜드에 직접 억셉터가 표지되는 경우라면, 도너 스트랜드가 일시적으로 결합하는 순간에만 발광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 만일, 억셉터 스트랜드 1, 2, 3을 추가로 이용하는 경우라면, 상기 도킹 스트랜드 1, 2, 3에 억셉터 스트랜드 1, 2, 3이 각기 동시 또는 순차적으로 결합과 분리를 반복하는 동안, 상기 도너 스트랜드가 어느 하나의 도킹 스트랜드에 동시에 결합하는 순간에만 발광 스펙트럼이 측정 가능하다. 다시 말하면, 도킹 스트랜드 1에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 1이 동시에 결합하는 순간에는 도킹 스트랜드 1의 발광 스펙트럼을 측정할 수 있으나, 도킹 스트랜드 1에 억셉터 스트랜드1이 결합하는 순간, 도너 스트랜드가 도킹 스트랜드 2 또는 3에만 결합하는 경우라면 도킹 스트랜드 1의 발광 스펙트럼은 측정할 수 없다. 즉, N종의 바이오마커를 검출하기 위한 발광 스펙트럼의 측정은 동시 또는 순차적으로 가능하며, 측정된 값들을 기측정된 데이터베이스와 비교함으로써, 최종적으로는 N종의 바이오마커를 동시에 판별할 수 있다.
상술한 바에 따르면, 프렛을 이용하여 N 종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있고, 적은 양의 시료에 포함된 낮은 농도의 바이오마커 종류를 구별할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 개시된 기술은 인접한 2종 이상의 형광 물질 간에 발생하는 에너지 공명현상을 이용하여 형광 물질이 표지된 스트랜드의 발광 스펙트럼을 측정함으로써 바이오마커의 종류를 판별할 수 있다. 또, 도너로 작용하는 형광 물질을 모두 동일하게 표지하여 하나의 광원으로 다수 개의 바이오마커 종류를 판별할 수 있어, 추가적인 광원과 광학필터를 요하지 않아 간단한 구성을 가지며, 추가적인 광학필터에 의한 측정에 필요한 발광 스펙트럼의 손실이 방지되는 장점이 있다.
더욱이, 도너 및 억셉터가 표지된 스트랜드가 일시적으로 결합되는 특징이 있으므로, 도너 또는 억셉터로 작용하는 형광 물질이 광표백이 되는 경우에도, 결합과 분리를 반복하는 과정에서 광표백되지 않은 형광 물질이 표지된 도너 스트랜드(Donor strand) 또는 억셉터 스트랜드(Acceptor strand)가 도킹 스트랜드(Docking strand)에 결합하는 순간에 발광 스펙트럼을 측정함으로써 광표백 현상과 관계없이 N종의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다. 또한, 일시적으로 빛을 내는 형광 물질을 주변 형광 물질의 간섭 없이 측정할 수 있어, 해당 형광 물질의 위치를 10nm 미만의 높은 정밀도 측정할 수 있어 높은 다이나믹 레인지(dynamic range)를 가진다.
이 후, 일 구현예에 따른 타겟 물질 검출 방법을 이용한 N종의 바이오마커의 검출은 후술할 실시예를 통해 과정을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
[실시예]
1. 서로 다른 염기서열을 갖는 도너 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실험방법
1) 시약 및 재료의 준비
변형된 DNA 올리고뉴클레오티드(Modified DNA oligonucleotides)는 Integrated DNA Technologies에서 구입하였고, Alexa 488(Alexa Fluor 488 NHS Ester, catalog number: A20000)은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. Cy3(Cy3 NHS Ester, catalog number: PA13101) 및 Cy5(Cy5 NHS Ester, catalog number: PA15101)는 GE Healthcare Life Sciences에서 구입하였고, COS-7 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. 항-튜블린 항체(Anti-tubulin antibody; catalog number: ab6160)는 Abcam에서 구입하였고, 항-Tom20 항체(Anti-Tom20 antibody; sc-11415)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였으며, 당나귀 항-토끼 IgG 항체(Donkey anti-rabbit IgG antibody; catalog number: 711-005-152) 및 당나귀 항-랫 IgG 항체(donkey anti-rat IgG antibody; catalog number: 712-005-153)는 Jackson ImmunoResearch Laboratories에서 구입하였다. 카르복실 라텍스 비드(Carboxyl latex beads; catalog number: C37281)는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였고, 파라포름알데히드(Paraformaldehyde; catalog number: 1.04005.1000)는 Merck에서 구입하였고, 글루타알데히드(Glutaraldehyde; catalog number: G5882), 트리톤 X-100(Triton X-100; catalog number: T9284) 및 BSA(Bovine Serum Albumin; catalog number: A4919)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 여기서 사용한 도킹 스트랜드는 항체-올리고뉴클레오티드 올인원 접합 키트(Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit; catalog number: A-9202-001)를 사용하여 2차 항체에 접합하였으며, 상기 키트는 Solulink에서 구입하였다.
2) DNA 형광표지
아민으로 변형된 DNA 올리고뉴클레오티드는 NHS 에스테르 화학 그룹을 갖는 형광 물질로 표지하였다. 먼저 1 mM DNA 5 ㎕를 100 mM 소듐 테트라 보레이트 완충액(pH 8.5) 25 ㎕와 혼합하였고, DMSO에 용해된 20 mM 형광 물질 5 ㎕를 첨가한 뒤, 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 그 다음 265 ㎕의 증류수, 900㎕의 에탄올 및 30㎕의 3M 아세트산나트륨 pH 5.2)을 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 1 시간 동안 배양한 뒤, 2시간 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 버리고 DNA 펠릿을 차가운 에탄올로 세척하였다. 에탄올이 완전히 건조시킨 후, DNA 펠릿을 50 ㎕의 증류수에 재현탁 시키고 형광 표지 효율을 측정하였다.
3) 세포배양 및 고정
DNA-PAINT 이미징의 표류 보정을 위해 유리 커버 슬립을 카복시 라텍스 비즈로 코팅하였다.
커버 슬립을 비드 용액 1:10으로 증류수로 희석하고, 100℃의 핫 플레이트에서 10 분동안 가열한 후 증류수로 씻어준 다음, N2 가스를 이용하여 건조시켰다. COS-7 세포를 비드로 코팅된 커버 슬립에서 성장시킨 다음 10분 동안 고정시켰다. 그 다음 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 이용하여 미세소관(microtubule)을 관찰하였고, 3% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 0.1% 글루타르알데히드를 PBS 버퍼에 용해시킨 혼합물을 사용하여 미세소관과 미토콘드리아를 관찰하였다. 그 다음 고정 샘플은 사용전까지 PBS 버퍼에 4℃에서 보관하였다.
4) 면역염색법
커버 슬립에서 세포를 배양하여 고정한 뒤, 미세소관을 차단 용액(PBS 버퍼에 5% BSA 및 0.25 % Triton X-100 함유)에 1:100으로 희석시킨 항-미세소관 항체(anti-tubulin antibody)를 처리한 뒤. 4℃에서 밤새 배양한 다음. 면역염색을 실시하였다. PBS 버퍼로 자유 항-미세소관 항체(free anti-tubulin antibody)을 완전히 세척하였고, 세포에 도킹 스트랜드(Docking_P1)가 접합된 100 nM 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 항온 배양하였다. 미토콘드리아는 1:100으로 희석된 항-Tom20 항체를 처리한 뒤, 4℃에서 밤새 배양한 다음 면역 염색을 실시하였다, 그 다음 PBS 버퍼로 자유 항-Tom20 항체(free anti-Tom20 antibody)를 세척하였고, 세포를 도킹 스트랜드(Docking_P2)가 접합된 100 nM 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 항온 배양하였다.
5) 단일-분자 이미징
단일-분자 이미징의 경우, 프리즘-형 TIRF(total internal reflection fluorescence) 현미경 검사법과 고도로 경사지고 적층 된 광학 시트 (HILO) 현미경 검사법을 사용하였다. 상기 현미경은 상업용의 거꾸로 된 현미경(IX71, Olympus)을 수정하고 100X 1.4 NA 유면 대물 렌즈(UPlanSApo, Olympus)를 장착하여 제작하였다.
스트렙타비딘(streptavidin)-비오틴(biotin) 상호작용을 이용하여 중합체-코팅된 석영 슬라이드(polymer-coated quartz slide) 표면에 도킹 스트랜드를 고정시키고, 도너 및 억셉터 스트랜드를 이미징 채널에 첨가하였다. Alexa488, Cy3 및 Cy5는 각각 청색 레이저(473nm, 100mW, MBL-III-473-100 mW, CNI), 녹색 레이저(532nm, 50mW, Compass 215M-50, Coherent) 및 적색 레이저 (642nm, 60mW, Excelsior-642-60, Spectra-Physics)를 사용하여 확인하였다. Cy3 신호는 640dcxr 다이크로익 미러(dichroic mirror; Chroma)를 사용하여 필터링하였고, Cy5 신호는 740dcxr 다이크로익 미러(Chroma)를 사용하여 필터링하였다. 단일분자 이미지는 EMCCD(electron multiplying charge coupled device) 카메라 (iXon Ultra DU-897U-CS0-#BV, Andor)를 사용하여 10Hz의 프레임 속도로 기록하였다.
6) FRET 쌍 특성
도 1d에서 프레임 당 검출된 광자(photon)를 평가하기 위하여, 2nt, 4nt, 6nt 및 11nt Cy3-Cy5(Alexa488-Cy5) FRET 쌍(FRET pair)에 대하여 각각 13997(8096), 11021(5100), 11208(3451), 및 17051(3980) 단일분자 스팟(single-molecule spot)을 수득하였다. 도 1j-1k에서 SNR을 특징짓기 위하여, Cy3, Cy3-Cy5 쌍 및 Alexa 488-Cy5 쌍은 각각 795, 2322 및 742 단일분자 스팟(single-molecule spot)을 수득하였다
7) 드리프트 보정(Drift correction)
DNA-PAINT를 이용한 초 고해상도 이미징을 위해 이미지 상관법을 기반으로 하는 자동 집계 및 드리프트 보정 시스템을 사용하였다. 촬영 전, 하나의 in-focus 밝은 필드 이미지 및 두 개의 out-of-focus 이미지를 촬영하였다. 이 세 개의 참조 이미지는 x, y 및 z 축 드리프트를 추적하는 데 사용되었다. 피에조 스테이지(piezo stage; PZ-2000, Applied Scientific Instrumentation)를 사용하여 z 방향의 드리프트를 실시간으로 보정한 반면, xy 평면의 드리프트는 이미지 분석하는 동안에 보정하였다.
실시예 1-1: FRET-PAINT 특성 확인
표면에 고정된 DNA 스트랜드 및 TIRF 현미경을 사용하여 FRET-PAINT가 현미경으로 검사가 가능한지 여부를 확인하였다.
도 1a 내지 도 1k는 FRET-PAINT의 원리와 특성을 나타낸 것이다.
도 1a는 FRET-PAINT의 특성화에 사용된 도킹 스트랜드(검정), 도너 스트랜드(어두운 회색) 및 억셉터 스트랜드(밝은 회색)를 나타낸 것이고, 도 1b는 FRET-PAINT의 모식도를 나타낸 것이다. 도 1c는 대표적인 Cy5 형광 신호 강도를 시간에 따라 나타낸 것이다(1000 nM Donor_P1_Alexa488 및 100 nM Acceptor_P11_Cy5). 도 1d는 Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5 쌍에 대한 도너(donor)-억셉터(acceptor) 거리에 따른 억셉터의 밝기를 나타낸 것이다.
도 1e는 억셉터_P11_Cy3의 표시된 농도에서 표면을 고정시킨 도킹 스트랜드(Docking_P0)의 DNA-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1f는 10nM에서 고정된 Acceptor_P6_Cy5와 Donor_P1_Cy3의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1g는 10nM에서 고정된 Donor_P1_Cy3와 함께 Acceptor_P6_Cy5의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1h는 10nM에서 고정된 Acceptor_P2_Cy5와 함께 Donor_P1_Alexa488의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1i는 10nM에서 고정된 Donor_P1_Alexa488과 함께 Acceptor_P2_Cy5의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다(Scale bar: 1㎛).
도 1j는 Cy3 이미저(Cy3 imager) 스트랜드를 사용한 DNA-PAINT, Cy3 도너(Cy3 donor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT 및 Cy3 억셉터(Cy3 acceptor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT의 각 스트랜드 농도별 SNR 값을 비교한 것이다. 도 1k는 Cy3 이미저(Cy3 imager) 스트랜드를 사용한 DNA-PAINT, Alexa488 도너(donor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT 및 Cy5 억셉터(acceptor) 스트랜드를 사용한 FRET-PAINT의 각 스트랜드 농도별 SNR 값을 비교한 것이다.
도 1a에 나타난 바와 같이, FRET-PAINT는 3개의 DNA 스트랜드(도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드)를 사용하였다. 도킹 스트랜드(Docking_P0)에는 5'말단에 바이오틴(biotin)이 붙어있고, 각각 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드인 두 개의 도킹 사이트가 있다. 여기서는 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드가 결합시 도킹 스트랜드에 억셉터 스트랜드가 이미 결합해 있어 도너에서 억셉터로 FRET이 일어날 확률을 증가시키기 위해 상대적으로 긴 억셉터 스트랜드를 사용한 반면, 억셉터 스트랜드보다 짧은 길이의 도너 스트랜드를 선택하였다. 또한, 도너 스트랜드는 3' 말단에 Alexa488(Donor_P1_Alexa488)을 표지한 반면, 억셉터 스트랜드는 3' 말단에 Cy5(Acceptor_P11_Cy5)로 표지하였다.
각 스트랜드의 염기서열은 다음과 같다.
Docking_P0 = 5'-Biotin-TTGATCTACATATTCTTCATTA-3'(서열번호 1)
Donor_P1_Cy3 = 5'-TAATGAAGA-Cy3-3'(서열번호 2)
Donor_P1_Alexa488 = 5'-TAATGAAGA-Alexa488-3'(서열번호 2)
Acceptor_P2_Cy5 = 5'-Cy5-TATGTAGATC-3'(서열번호 3)
Acceptor_P6_Cy5 = 5'-TATG-Cy5-TAGATC-3' (서열번호 3)
Acceptor_P11_Cy5 = 5'-TATGTAGATC-Cy5-3'(서열번호 3)
그 다음, 스트렙타비딘-바이오틴(streptavidin - biotin) 상호작용을 이용하여 중합체-코팅된 석영(quartz) 표면에 도킹 스트랜드를 고정시켰다. 그 다음 도너 스트랜드(1000 nM) 및 억셉터 스트랜드(100 nM)를 주입 한 후, 블루 레이저를 사용하여 반응시킨 Alexa488에 의해 Cy5의 단일 분자 이미지를 촬영하였다(도 1b).
그 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 높은 도너 및 억셉터 농도에서 시간에 따른 Cy5 형광 강도가 명확하게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 2개의 FRET 쌍(Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5)에 대하여 최대의 FRET 신호를 주는 FRET 프로브의 위치를 찾기 위하여 Cy3 (Donor_P1_Cy3)가 3'말단에 표지된 억셉터 스트랜드, Alex488 (Donor_P1_Alexa488)이 3'말단에 표지된 억셉터 스트랜드 및 다양한 위치에 Cy5가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor_P2_Cy5, P4_Cy5, P6_Cy5 및 P11_Cy5)로 상기와 동일한 방법의 실험을 실시하였다.
그 결과 도 1d에 나타난 바와 같이, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 2nt일 때, Alexa488-Cy5 FRET 쌍(FRET pair)이 가장 높은 Cy5 신호를 나타내는 반면, Cy3-Cy5 FRET 쌍은 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 6 nt일 때 가장 높은 Cy5 신호를 나타내는 것을 확인하였다.
그 다음, HILO(Highly Inclined and Laminated Optical sheet) 현미경을 사용하여 초고해상도 형광 이미징을 측정하였고, 다양한 DNA 농도에서 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 신호에 대한 노이즈 비율(signal-to-noise ratio, SNR)을 비교하였다.
그 결과 도 1e 내지 도 1i에 나타난 바와 같이, DNA-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 5nM 이상일 때 단일-분자 이미지에 노이즈가 생기는 것을 확인하였다(도 1e). 반면, Cy3-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 100nM 이상인 경우에 노이즈가 생기는 것을 확인하였고(도 1f, 도 1g), Alexa488-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 150nM 이상인 경우에 노이즈가 생기는 것을 확인하였다(도 1h, 도 1i).
이에 DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 경우 더 높은 이미저 농도에서 동일한 SNR을 얻을 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 예를 들어, 도 1j 및 도 1k에 나타난 바와 같이, 3.3 SNR을 얻기 위해, DNA-PAINT의 경우는 5nM 이미저 농도를 사용하였으며, 동일한 SNR을 얻기 위해, Cy3-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우는 180nM 도너 및 120nM 억셉터 농도를 사용하였고, Alexa488-Cy5 쌍 FRET-PAINT의 경우에는 250nM 도너 및 90nM 억셉터 농도를 사용하였다.
실시예 1-2: DNA-PAINT 및 FRET-PAINT 초고해상도 이미지 확인
기존의 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 초고해상도 이미징 속도를 비교하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다
먼저 상기 기재된 실험방법에 따라, COS-7 세포의 미세소관을 Docking_P1이 결합되어 있는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체를 사용하여 면역 염색하였다.
그 다음 DNA-PAINT의 경우, 1nM Cy5-표지된 이미저 스트랜드(imager strand; (Acceptor_P2'_Cy5)를 주입한 후 미세소관을 이미지화하였다. 또한, FRET-PAINT의 경우, 30nM 도너 스트랜드(Donor_P1_Alexa488) 및 20nM 억셉터 스트랜드(Acceptor_P2_Cy5)를 주입한 후, 동일한 부위의 미세소관을 이미지화하였다. 단일-분자 이미지는 도너 및 억셉터 스트랜드의 결합을 감지할 수 있는 속도인 10Hz 프레임 속도로 기록하였다.
또한 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 정량적으로 비교하기 위하여, 도 2a 및 도 2b에 나타난 스폿 수를 측정하였고, 9개의 부위에서 동일하게 측정하여 평균적인 속도를 비교하였다. 또한 다음의 식 6을 이용하여, 컨볼루션된 해상도(convolved resolutions)를 정량화하여 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교하였다. DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 국소화 정밀도는 각각 6.9 nm와 11.1 nm이다.
(식 6)
[(국소화 정확도(localization precision))2 + (나이퀴스트 해상도(Nyquist resolution))2]1/2
그 결과를 도 2a 내지 도 2e에 나타내었다. 도 2a 내지 도 2e는 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 표시된 획득 시간에 재구성된 DNA-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 2b는 표시된 획득 시간에 재구성된 도 2a와 동일한 영역의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 2c는 도 2a의 DNA-PAINT 이미지에 대한 시간의 함수 및 도 2b의 FRET-PAINT 이미지에 대한 시간의 함수로서 국소성 스팟(localized spot)의 누적 개수를 나타낸 것이다. 도 2d는 FRET-PAINT와 DNA-PAINT의 초당 국소 단일 분자 스팟 개수를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 2e는 이미징 시간에 대하여 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 공간 해상도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 오차막대는 표준편차를 나타낸 것이다.
DNA-PAINT는 10Hz의 속도로 총 18,000개의 프레임이 기록되어 총 30분 동안 촬영한 반면(도 2a), FRET-PAINT는 10Hz의 속도로 총 600개의 프레임이 기록되어 총 60초 동안 촬영한 것으로 나타났다(도 2b). 또한 DNA-PAINT에 비하여 FRET-PAINT의 이미징 속도가 29배 증가하는 것으로 나타났고(도 2c), 각기 다른 부위에 대하여 측정한 평균 값으로도 이미징 속도가 32배 증가하는 것으로 나타났다(도 2d). 또한 상기 컨볼루션 해상도로 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과, FRET-PAINT의 이미징 속도가 36배 증가하는 것을 확인하였다(도 2e).
실시예 1-3: FRET-PAINT 다중화된 이미지(Multiplexed imaging)
FRET-PAINT 현미경의 다중화 능력을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
COS-7 세포의 미세소관과 미토콘드리아를 각각 Docking_P1이 결합되어 있는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체 및 Docking_P2가 결합되어 있는 항-Tom20(anti-Tom20) 항체를 사용하여 면역 염색하였다. 여기서는 두 가지 접근법을 사용하여 다중화된 이미지를 획득하였다.
그 결과를 도 3a 내지 도 3h에 나타내었다.
도 3a 내지 도 3h는 FRET-PAINT의 다중화 성능을 나타낸 것이다. 도 3a는 도너 및 억셉터 스트랜드 교환 체계를 사용하는 FRET-PAINT의 다중화된 이미지를 모식도로 나타낸 것이다. 도 3b 내지 도 3d는 도 3a의 방법을 사용하여 획득한 미세소관(microtubule, b) 및 미토콘드리아(mitochondria, c)의 FRET-PAINT 이미지 및 이들을 중첩한 이미지(d)를 나타낸 것이다. 도 3e는 버퍼 교환 없이 다중화된 이미지를 모식도로 나타낸 것이다. 도 3f 내지 도 3h는 도 3e의 방법을 사용하여 획득한 미세소관(f) 및 미토콘드리아(g)의 FRET-PAINT 이미지 및 이들을 중첩한 이미지(h)를 나타낸 것이다(MT: 미세소관(microtubule), MC: 미토콘드리아(mitochondria), DS: 도너 스트랜드(donor strand), AS: 억셉터 스트랜드(acceptor strand), Scale bars: 5㎛).
도 3a에 따른 접근법(도너 및 억셉터 스트랜드 순차적으로 처리하는 방법)에 따라 20nM Donor_P1_Alexa488과 10nM Acceptor_P2_Cy5를 주입하여 미세소관을 관찰하였고(도 3b), 10nM Donor_P2_Alexa499과 10nM Acceptor_P2_Cy5를 주입하여 미토콘드리아를 관찰하였다(도 3c). 또한, 도 3e에 따른 또 다른 접근법(도너 및 억셉터 스트랜드 동시에 처리하는 방법)은 미세소관에 10nM Donor_P1_Cy3를 주입하고, 미토콘드리아에 20nM Donor_P2_Alexa488을 주입하였고, 10nM Acceptor_P2'_Cy5를 주입하는 방법으로 모든 DNA 프로브롤 동시에 주입한 다음, Cy3 여기(excitation)와 함께 처음으로 미세소관을 관찰(도 3f)한 다음, Alexa488 여기로 미토콘드리아를 관찰(도 3g)하였다.
이를 통해, 두 가지 접근법은 이미징 시간에서 차이가 없었으나, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 동시에 처리하는 경우에는 미세소관과 미토콘드리아 이미지 사이에 혼선이 발생하는 것을 확인하였고, 이에, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 경우가 다중화 이미징에 더 효과적이라는 것을 확인하였다.
실시예 1-4: 넓은 농도 범위의 바이오마커 측정
넓은 농도 범위의 바이오마커 측정능력을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
도 4a 내지 도 4c는 다양한 농도 범위의 바이오마커를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 10, 40, 100, 400, 1000, 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 서로 다른 웰에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 바이오마커를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 1000 pg/ml과 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 1/10과 1/100으로 희석하여 사용한 경우 바이오마커를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4c는 도 4a 및 4b의 각각의 농도에서 측정한 점의 개수를 그래프로 나타낸 것이다. 1000 pg/ml는 1/10로 희석해 센 점의 수에 10을 곱했고, 10000 pg/ml는 1/100로 희석해 센 점의 수에 100을 곱하여 측정하였다.
도 4a는 10, 40, 100, 400, 1000, 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 서로 다른 웰에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 화면에 나타난 점(개별 바이오마커 분자)의 수를 측정한 결과이다. 농도에 비례하여 화면에 나타나는 점의 수가 늘어남을 확인할 수 있고, 1000 pg/ml 이상의 농도에서는 점이 겹치기 시작해 정확한 수를 셀 수 없음을 확인하였다.
도 4b는 1000과 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 1/10과 1/100로 희석하여 서로 다른 웰에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 화면에 나타난 점의 수를 측정한 결과이다.
도 4c는 도 4a 및 도 4b의 각각의 농도에서 점의 개수를 세어 그래프로 나타낸 것이다. 1000 pg/ml의 농도의 바이오마커인 경우에는 1/10로 희석해 센 점의 수에 10을 곱했고, 10000 pg/ml의 농도의 바이오마커인 경우에는 1/100로 희석해 센 점의 개수에 100을 곱하였다.
측정 결과를 선형으로 피팅하였을 때 상관 계수가 0.99997로 계산되었고 이로부터 고농도의 바이오마커를 희석 후 측정해도 정확한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
2. 2종 이상의 도너 형광물질 또는 억셉터 형광물질로 표지된 태그 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실시예 2-1: FRET 효율 데이터베이스 제작
앞서, 설명한 방법으로 FRET 효율 데이터베이스를 구축하기 위해, 도너로는 Cy3를, 억셉터로는 Cy5 를 DNA가닥에 표지하여 태그 스트랜드를 제작하였다. 상기 DNA의 한쪽 끝에는 바이오틴이 부착되어 있고, 특정 염기 상에는 도너 및 억셉터가 부착되어 있으며, 도너와 억셉터 사이의 거리가 1 내지 50이 되도록 표지하여, 총 50종의 태그 스트랜드를 준비하였다.
이때, 바이오틴을 부착하는 이유는 스트렙타비딘과 바이오틴 사이의 결합을 이용하여 기판에 DNA를 고정하기 위함이며, 유사한 역할을 수행하기 위해, 디곡시게닌(digoxigenin) 및 이의 항체 또는 SNAP-tag, CLIP-tag, FLAG-tag, His-tag 등의 태그와 각각의 리간드(ligand) 사이의 결합을 이용하여 기판에 고정하는 방법을 이용할 수도 있다.
기판을 스트렙타비딘으로 코팅한 후, 도너와 억셉터 사이의 거리가 1인 DNA를 고정하고, 거리가 1일 때의 FRET 효율을 측정하여 기준값을 확보하였다. 이때, FRET 효율은 1) 도너를 여기하기 위한 빛에 의해 억셉터가 여기되며 내는 빛, 2) 도너와 억셉터가 내는 빛을 분리하기 위해 사용하는 광학부품(dichroic mirror)에 의해 완벽하게 분리되지 않은 도너와 억셉터가 내는 빛의 일부 및 3) 도너와 억셉터가 내는 빛의 파장 차이에 따른 이미지 센서의 검출 효율 차를 보정한 값일 수 있다.
나머지 거리 2 내지 50의 경우도, 동일한 방법으로 측정하여 각각의 기준값을 확보하였으며, 측정시 발생하는 노이즈에 의한 오차를 계산하여 실제 명확히 구분이 되는 FRET 효율의 거리만을 이용하기로 하였다. 이후, 후술하는 실시예에서는 거리 1 내지 50의 FRET 효율 기준값 중 명확히 구분이 가능한 값은 10개라고 가정하고, 검출예를 설명하도록 한다.
실시예 2-2: 태그 스트랜드 제작
태그 스트랜드는 실제 검출하고자 하는 바이오마커 종류의 수만큼 제작하였다. 실시예 2-1에서 사용되는 DNA와 동일한 것을 이용할 수 있으나, 실시예 2-1에서 사용된 DNA의 한쪽 끝에 부착되었던 바이오틴 대신 검출항체에 붙일 수 있는 작용기를 부착한 것을 사용하였다. 이때, 부착하는 방법은 DNA에 형광 물질을 부착하는 것과 동일한 방법을 사용할 수 있다.
실시예 2-1을 통해 도너-억셉터 1쌍으로 명확히 구분 가능한 FRET 효율은 10개라고 가정한 바 있으므로, 만일 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개라면 도너-억셉터 1쌍만으로도 충분히 검출이 가능한 것이다.
만일, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개를 초과한다면, 도너-억셉터 2쌍 이상이 사용될 수 있다. 만일, 도너-억셉터 2쌍을 이용한다면, 명확하게 구분이 가능한 FRET 효율은 최대 55개가 될 것이고, 3 쌍을 이용한다면, 최대 205개가 될 것이다. 이론적으로 계산한다면, 도너-억셉터 1쌍으로 구분이 가능한 FRET 효율이 최대 10개라면, 2쌍으로 구분이 가능한 FRET 효율은 100개일 것으로 계산될 수 있다. 그러나, FRET쌍 1과 FRET쌍 2의 FRET 효율이 각각 i) a, b 인 경우와 ii) b, a 인 경우가 존재한다면, 상기 i) 및 ii)의 경우를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나만 태그 스트랜드로 사용한다면 실질적으로는 FRET 효율을 구분할 수 있는 경우는 총 55가지 존재할 수 있다. FRET쌍 1과 FRET 쌍 2의 도너 또는 억셉터 또는 모두의 형광 물질의 종류가 다르다면 두 쌍으로 구분 가능한 FRET 효율은 100가지, 세 쌍은 1000가지가 된다.
실시예 2-3: 광표백 전후 FRET 효율 변화
도너1-억셉터1 및 도너2-억셉터2를 일정거리 이격하여 표지한 DNA를 이용하여 광표백 전의 도너 및 억셉터 각각의 밝기와 도너-억셉터 쌍의 FRET 효율을 측정하였다(표 1). 이때, FRET 효율은 1) 도너를 여기하기 위한 빛에 의해 억셉터가 여기되며 내는 빛, 2) 도너와 억셉터가 내는 빛을 분리하기 위해 사용하는 광학부품(dichroic mirror)에 의해 완벽하게 분리되지 않은 도너와 억셉터가 내는 빛의 일부 및 3) 도너와 억셉터가 내는 빛의 파장 차이에 따른 이미지 센서의 검출 효율 차를 보정한 값일 수 있다.
가령, FRET쌍 1의 FRET 효율은 0.5이고 FRET쌍 2의 FRET 효율은 0.7이지만, 이 상태에서 관측되는 FRET 효율은 두 FRET쌍의 평균인 0.6이며 이러한 상태에서의 관측 결과로는 두 FRET쌍 각각의 FRET 효율은 알 수 없다.
도너1-억셉터1 도너2-억셉터2
도너1 억셉터1 도너2 억셉터2
50 50 30 70
FRET 효율 0.5 FRET 효율 0.7
표 1과 같은 구성으로부터 4가지의 광표백 경우가 발생할 수 있으며, 상기와 같이 보정한 FRET 효율의 경우 광표백 전과 후 FRET 쌍을 이루는 도너와 억셉터 밝기의 합은 일정하며, 본 실시예의 경우 합은 100이다. 각각의 경우의 FRET 효율은 다음과 같이 측정될 수 있었다.
1) 도너1이 광표백되는 경우
도너1과 억셉터1이 모두 빛을 방출하지 않으므로, 도너의 밝기 합이 80에서 30이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 70이되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 50, 억셉터가 50이 된다. 즉, 광표백 전후의 밝기 차이로부터 측정되는 FRET 효율은 0.5이고, 광표백 이후 관측되는 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.7임을 확인할 수 있다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있다.
2) 도너2가 광표백되는 경우
도너2와 억셉터2가 모두 빛을 방출하지 않으므로, 도너의 밝기 합이 80에서 50이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 50이 되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 30, 억셉터가 70이 된다. 즉, 광표백 전후의 밝기 차이로부터 측정되는 FRET 효율은 0.7이고, 광표백 이후 관측되는 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.5임을 확인할 수 있었다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있었다.
3) 억셉터1이 광표백되는 경우
억셉터1이 내던 빛을 도너1이 방출하게 되므로, 도너의 밝기 합이 80에서 130이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 70이 되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 50, 억셉터가 50이 된다. 광표백 전과 후 FRET 쌍을 이루는 도너와 억셉터 밝기의 합은 100으로 일정하므로 억셉터의 변화량 50으로부터 FRET 효율은 0.5임을 알 수 있다. 광표백 후 도너의 밝기 합 130 중 도너1이 방출하는 100을 제외한 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.7임을 확인할 수 있었다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있었다.
4) 억셉터2가 광표백되는 경우
억셉터2가 내던 빛을 도너2가 방출하게 되므로, 도너의 밝기 합이 80에서 150이 되고, 억셉터의 밝기 합이 120에서 50이되므로, 광표백 전후의 밝기의 변화량은 도너가 70, 억셉터가 70이 된다. 광표백 전과 후 FRET 쌍을 이루는 도너와 억셉터 밝기의 합은 100으로 일정하므로 억셉터의 변화량 70으로부터 FRET 효율은 0.7임을 알 수 있다. 광표백 후 도너의 밝기 합 150 중 도너2가 방출하는 100을 제외한 밝기로부터 측정되는 FRET 효율은 0.5임을 확인할 수 있다. 따라서 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 알 수 있다.
위와 같이, 하나의 형광 물질이 광표백되기까지 밝기를 측정하고, 각 형광 물질 별로 동일한 방법으로 반복하여 측정함으로써, 해당 태그 스트랜드의 FRET 효율이 0.5와 0.7로 구성됨을 확인할 수 있다.
실시예 2-4: FRET 효율의 측정 및 바이오마커 종류 판별
바이오마커 1 또는 2를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작하였다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 태그 스트랜드1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 태그 스트랜드2를 부착하였다. 상기 태그 스트랜드1 및 2는 도너-억셉터 FRET쌍이 각각 2쌍이 표지되었다. 검출항체 1의 FRET 효율 기준값은 FRET쌍1= 0.1, FRET쌍2= 0.5였고, 검출항체 2의 FRET 효율 기준값은 FRET쌍1= 0.2, FRET쌍2= 0.4였다.
이후, 실시예 2-3과 같이 광표백 전후의 밝기 차이를 측정함으로써 FRET 효율을 분석하였다. 밝기를 관찰하는 이미징 카메라에 분자 A 및 B가 나타나고, 분자 A의 FRET 효율이 0.1, 0.5로 측정되어, 분자 A는 바이오마커 1임을 알 수 있었다. 동일한 원리로, 분자 B의 FRET 효율이 0.2, 0.4로 측정되어, 분자 B는 바이오마커 2임을 알 수 있었다(도 15).
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 FRET 효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면, 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면, 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
3. N종의 도킹 스트랜드 및 N종의 프렛 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실시예 3-1: 프렛효율 데이터베이스 제작
각기 다른 형광 물질 A, B, C를 각각 도너 1, 도너 2, 억셉터로 하여, 도너 1은 도너 스트랜드에, 도너 2와 억셉터는 프렛 스트랜드에 표지하였다. 도너 1과 도너 2 사이의 프렛효율이 최대가 되도록 두 형광 물질 A, B 사이의 거리를 정하였다. B와 C를 각각 도너 2, 억셉터로 프렛쌍을 구성하여, 프렛 스트랜드에 표지하고, 필요한 종류만큼 이종의 프렛쌍이 표지된 프렛 스트랜드를 제작하였다.
가령, 데이터베이스 상에 필요한 종류가 50종이면, 표지된 B, C 사이의 거리가 모두 상이하게 표지된 50 종의 프렛 스트랜드를 준비하였다. 필요에 따라서, 사용하는 도너 1, 도너 2 및 억셉터가 시판되는 형광 물질인 경우, 이러한 제작과정을 생략하고 도너 1, 도너 2 및 억셉터가 부착된 상태로 시판되는 프렛 스트랜드를 사용할 수도 있다.
다만, 도너1, 도너 2 및 억셉터로 사용되는 형광 물질을 결정함에 있어서, 각 형광 물질의 발광스펙트럼의 최대값의 파장이 도너 1이 가장 짧고, 억셉터가 가장 긴 것이 바람직하다.
2 종 이상의 프렛 스트랜드가 준비되면, 도너 2-억셉터 사이의 거리가 1인 프렛 스트랜드 및 도너 스트랜드를 도킹 스트랜드에 결합시킨 후 해당 거리의 프렛효율을 측정하였다. 이후, 도너 2-억셉터 프렛쌍 사이의 거리가 2인 프렛 스트랜드부터 차례로 전술한 내용과 동일한 과정을 반복하여 프렛효율 기준값을 획득하고, 이를 거리별로 데이터베이스화하였다.
이후, 바이오마커 검출과정에서 측정되는 프렛효율 측정값과 상기 프렛효율 기준값을 비교하면 검출에 사용된 프렛쌍의 도너 2-억셉터 사이의 거리를 알 수 있으며, 이로부터 검출한 바이오마커의 종류를 확인할 수 있다.
그러나, 프렛효율 측정에는 노이즈에 의한 오차가 있을 수 있어, 모든 거리의 프렛효율이 구분가능한 것이 아닐 수 있다. 예를 들면, 거리가 1일 때의 프렛효율이 0.95(평균) ± 0.05(오차)이고, 거리가 2일 때의 프렛효율이 0.94 ± 0.05이라면, 프렛효율로는 거리 1과 2를 구분할 수 없다. 따라서, 실제 바이오마커를 검출시에는 데이터베이스의 값 중 프렛효율이 명확히 구분되는 거리만 이용함이 바람직하다. 이후, 후술하는 실시예에서는 거리 1 내지 50의 프렛효율 기준값 중 명확히 구분이 가능한 값은 10개라고 가정하고, 검출예를 설명하도록 한다.
실시예 3-2: N종의 도킹 스트랜드 및 N종의 프렛 스트랜드 제작
도킹 스트랜드는 실제 검출하고자 하는 바이오마커 종류의 수만큼 제작하였다.
실시예 3-1을 통해 도너 2-억셉터 프렛쌍 1쌍으로 명확히 구분 가능한 프렛효율은 10개라고 가정한 바 있으므로, 만일 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개라면 도너 2-억셉터 프렛쌍 1쌍만으로도 충분히 검출이 가능하다. 따라서 도킹 스트랜드에 1개의 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작하였다.
만일, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류가 10개를 초과하는 경우, 도너 2-억셉터로 구성되는 프렛쌍이 2 이상 사용될 수 있다. 따라서, 도킹 스트랜드에 2 이상의 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작하였다. 만일, 2개의 프렛쌍을 사용한다면, 명확하게 구분이 가능한 프렛효율은 최대 55개가 될 것이고, 3개의 프렛쌍을 이용한다면, 명확하게 구분이 가능한 프렛효율은 최대 205개가 될 것이다. 이론적으로 계산한다면, 1개의 프렛쌍으로 구분이 가능한 프렛효율이 최대 10개라면, 2개의 프렛쌍으로 구분이 가능한 프렛효율은 100개일 것으로 계산될 수 있다고 판단할 수도 있으나, 프렛쌍 1과 프렛쌍 2의 프렛효율이 각각 i) a, b 인 경우와 ii) b, a 인 경우가 존재한다면, 상기 i) 및 ii) 의 경우를 서로 구분할 수 없으므로, 상기 i) 또는 ii) 중 어느 하나만 도킹 스트랜드로 사용한다면 실질적으로는 프렛효율을 구분할 수 있는 경우는 총 55가지 존재할 수 있다. 단, 프렛쌍 1과 프렛쌍 2의 도너 2 또는 억셉터 또는 모두의 형광 물질의 종류가 다르다면 두 쌍으로 구분 가능한 프렛효율은 100가지, 세 쌍은 1000가지가 될 수도 있다.
실시예 3-3: 프렛효율의 측정 및 바이오마커 판별
2종의 바이오마커인 바이오마커 1 또는 2를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작하였다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 도킹 스트랜드 1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 도킹 스트랜드 2를 부착하였다. 상기 도킹 스트랜드 1 및 2는 각각 2종의 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작되었다. 도킹 스트랜드 1에는 프렛효율이 각각 0.2, 0.4인 프렛 스트랜드가 결합할 수 있고, 도킹 스트랜드 2에는 프렛효율이 각각 0.6, 0.8인 프렛 스트랜드가 결합할 수 있도록 제작하였다.
기판에 바이오마커 1과 2를 고정하고, 각각에 검출항체 1과 2를 결합시켰다. 도너 스트랜드, 프렛효율이 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8인 프렛 스트랜드 4종이 포함된 버퍼를 웰에 주입한 후, 도킹 스트랜드에 결합한 프렛 스트랜드의 프렛효율을 측정하였다. 전술한 도 29에 대한 설명과 같이, 도너 2와 억셉터의 밝기를 관찰하는 이미징 카메라에 분자 1 및 분자 2의 위치가 간헐적인 형광신호로 관측되고, 도너 2와 억셉터의 밝기를 측정하여 프렛효율을 분석하였다. 측정한 결과, 분자 1의 위치에서는 프렛효율 0.2와 0.4가 측정되었으므로, 분자 1은 바이오마커 1임을 확인할 수 있었다. 이와 동일한 원리로, 분자 2의 위치에서는 프렛효율 0.6과 0.8이 측정되어, 분자 2는 바이오마커 2임을 확인할 수 있었다.
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 프렛효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면, 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면, 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
4. N종의 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 이용한 바이오마커 다중검출
실시예 4-1: 발광 스펙트럼 데이터베이스 제작
하나의 광원으로 여기 가능한 A 종의 도너로 각각 표지된 A 종의 도너 스트랜드를 제작하였다. 상기 A 종의 도너와 프렛이 일어나는 B종의 억셉터로 각각 표지된 B종의 억셉터 스트랜드를 제작하였다. 상기 A종의 도너 스트랜드 및 B종의 억셉터 스트랜드와 상보적으로 결합하는 총 A x B종의 도킹 스트랜드를 제작하였다(단, A, B 각각은 1 이상의 정수임).
도너 스트랜드 1과 억셉터 스트랜드 1 및 이에 상보적인 도킹 스트랜드1을 이용하여 도너 및 억셉터의 발광 스펙트럼을 측정하였다. 나머지 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드에 대해서도 동일한 방식으로 발광 스펙트럼을 측정하였다.
측정된 총 A x B 개의 발광 스펙트럼 중, 측정 노이즈에 의한 오차를 감안하는 경우에도 명확히 구분 가능한 발광 스펙트럼만을 데이터베이스로 제작하고, 해당 발광 스펙트럼을 제공하는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 조합만을 바이오마커를 검출에 이용하였다.
상기 실시예의 방법은 도 31 및 도 33의 방법을 조합하여 도 36b와 같이 구성한 과정을 설명한 것으로, 데이터베이스화된 발광 스펙트럼의 개수가 검출할 바이오마커의 개수보다 작을 경우, 도 32와 같이 도너와 억셉터 사이의 프렛효율이 상이하도록 구성하여 추가적으로 적용하거나, 도 36b와 같이 하나의 억셉터 스트랜드에 두 종류 이상의 억셉터를 표지할 수도 있고, 또는 하나의 도킹 스트랜드에 두 개 이상의 서로 상이한 억셉터 스트랜드가 결합하도록 함으로써 검출할 바이오마커 개수보다 많은 수의 발광 스펙트럼 데이터베이스를 만들 수 있다.
실시예 4-2: N종의 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드 제작
N 종 바이오마커를 검출하기 위해 N 종의 도킹 스트랜드를 제작하였다. 상기 데이터베이스화 된 발광 스펙트럼을 제공하는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 결합할 수 있도록 이에 상보적인 염기서열을 갖는 N종의 도킹 스트랜드를 제작하였다.
실시예 4-3: 발광 스펙트럼의 측정 및 바이오마커 판별
2 종의 바이오마커를 검출하기 위해 다음과 같이 키트를 제작했다.
바이오마커1에 결합하는 검출항체1에는 도킹 스트랜드 1을 부착하고, 바이오마커 2에 결합하는 검출항체 2에는 도킹 스트랜드 2를 부착했다. 상기 도킹 스트랜드 1에는 도너 스트랜드 1 및 억셉터 스트랜드 1이 결합하고, 상기 도킹 스트랜드 2에는 도너 스트랜드 2 및 억셉터 스트랜드 2가 결합할 수 있도록 제작했다.
기판에 바이오마커 1과 2를 고정하고, 각각에 검출항체 1과 2를 결합시켰다. 도너 스트랜드 1, 억셉터 스트랜드 1, 도너 스트랜드 2 및 억셉터 스트랜드 2가 포함된 버퍼를 웰에 주입한 후, 도킹 스트랜드에 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 방출하는 빛의 스펙트럼을 관찰했다. 도 37과 같이, 이미징 카메라 화면의 분자 1 및 분자 2의 위치에서 간헐적인 형광신호가 관측되고, 해당 위치에서의 방출 스펙트럼을 데이터베이스와 비교함으로써 바이오마커 종류를 판별할 수 있었다.
시료에 포함된 바이오마커들은 그 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 넓은 농도 범위를 갖는다. 그러나 지나치게 높은 농도의 바이오마커를 기판에 고정할 경우 한 화면에 나타나는 점의 수가 너무 많아 점들 사이에 겹침이 발생하고 이로 인해 개별 분자의 프렛효율을 측정할 수 없게 되므로, 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 시료를 희석하여 검출에 이용할 수 있다.
만일, 비슷한 농도 범위를 갖는 바이오마커들을 검출하는 경우라면 바이오마커들을 동일한 비율로 희석한 후 상기 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상 1ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들을 1:100으로 희석할 경우 한 화면에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출된다면 통상 100ng/ml 정도의 농도를 갖는 바이오마커들은 1:10000으로 희석한 후 분석을 수행할 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (38)

  1. a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계;
    b) 상기 타겟 물질에 도킹 스트랜드(docking strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계;
    c) 상기 도킹 스트랜드에 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및
    d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 도너 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 흡광도가 최대인 파장보다 짧고, 상기 도너 형광 물질의 발광도가 최대인 파장이 상기 억셉터 형광 물질의 발광도가 최대인 파장보다 짧은 것인 타겟 물질 검출방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 도너 형광 물질을 여기시키기 위한 여기광의 파장에서 상기 도너 형광 물질의 흡광계수(extinction coefficient)가 상기 억셉터 형광 물질의 흡광계수보다 3배 이상 큰 것인 타겟 물질 검출방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질의 포스터(Forster) 반경은 0.208 nm 이상인 것인 타겟 물질 검출방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 도너 형광 물질 및 상기 억셉터 형광 물질은 링커에 의해 상기 도킹 스트랜드 또는 상기 별도 스트랜드와 결합된 것인 타겟 물질 검출방법.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 링커의 길이는 10nm 이하인 것인 타겟 물질 검출방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상이 되도록 광학필터의 파장을 제어하는 단계를 더 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 별도 스트랜드는 상기 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드; 및 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 2종 이상이고, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나는 검출하고자 하는 상기 타겟 물질들의 종류에 따라 서로 다른 염기서열을 갖거나, 종류 또는 부착 위치가 서로 다른 형광 물질을 갖는 것인 타겟 물질 검출방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 타겟 물질의 판독 후 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 중 적어도 하나 이상을 제거한 다음 제거한 것과 상이한 도너 스트랜드 또는 상이한 억셉터 스트랜드를 적용하여 상기 d) 단계를 수행함으로써 타겟 물질들을 종류별로 판독하는 단계를 더 포함하는 타겟 물질 검출방법.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드에 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드가 동시에 결합했을 때 상기 도너 스트랜드와 상기 억셉터 스트랜드 사이의 갭의 간격은 상기 도킹 스트랜드의 지속길이(persistence length)보다 짧은 것인 타겟 물질 검출방법.
  12. 제8 항에 있어서,
    상기 형광 신호의 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 2 이상을 유지하면서, 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 상기 도킹 스트랜드에 결합하는 데 필요한 시간이 10분 이내가 되도록 상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 타겟 물질 검출방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 도너 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드의 농도가 10nM 내지 10uM인 것인 타겟 물질 검출방법.
  14. 제8 항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 8 이상인 것인 타겟 물질 검출방법.
  15. 제14 항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 6 내지 12인 것인 타겟 물질 검출방법.
  16. 제8 항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드 또는 상기 억셉터 스트랜드가 핵산 유사체일 경우, 상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열 개수는 5 이상인 것인 타겟 물질 검출방법.
  17. 제16 항에 있어서,
    상기 도킹 스트랜드와 상보적인 상기 도너 스트랜드의 염기서열 개수는 3 내지 9인 것인 타겟 물질 검출방법.
  18. a) 기판에 핵산 또는 핵산 유사체를 타겟 물질로서 함유한 시료를 도입하는 단계;
    b) 상기 기판에 도입된 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 도입시키되, 상기 타겟 물질의 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비된 것인 단계; 및
    c) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법.
  19. 제8 항에 있어서,
    상기 억셉터 스트랜드 또는 상기 도킹 스트랜드는 서로 프렛쌍을 형성하는 형광 물질들을 2종 이상 구비하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  20. 제19 항에 있어서,
    상기 프렛쌍으로부터 발생하는 형광 신호로부터 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것인 타겟 물질 검출방법.
    FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
  21. 제1 항에 있어서,
    상기 별도 스트랜드는 도너 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 도너 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  22. 제1 항에 있어서,
    상기 별도 스트랜드는 상기 억셉터 형광 물질을 1종 이상 구비한 1종 이상의 억셉터 스트랜드를 포함하고, 상기 도킹 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질을 포함하는 것인 타겟 검출방법.
  23. a) 기판에 타겟 물질을 함유한 시료를 도입하는 단계;
    b) 상기 타겟 물질에 태그 스트랜드(tagged strand)가 구비된 검출 프로브를 특이적으로 결합시키는 단계;
    c) 상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 상기 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 상기 억셉터 형광 물질을 포함하는 단계; 및
    d) 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 형광 신호를 측정하여 상기 타겟 물질을 판독하는 단계를 포함하는 타겟 물질 검출방법.
  24. 제23 항에 있어서,
    상기 태그 스트랜드는 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 간에 인접하여 형성된 프렛쌍들을 2종 이상 구비한 것인 타겟 물질 검출방법.
  25. 제23 항에 있어서,
    상기 프렛에 의한 형광 신호의 측정은 하기 식으로 정의되는 FRET 효율을 측정하는 것인 타겟 물질 검출방법.
    FRET 효율 = (억셉터가 내는 빛의 세기)/(도너와 억셉터가 내는 빛의 세기 합)
  26. 제25 항에 있어서,
    상기 FRET 효율의 측정은 상기 도너 또는 상기 억셉터의 광표백 전후의 빛의 밝기를 측정하는 단계를 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  27. 제24 항에 있어서,
    상기 프렛쌍들 사이의 간격은 각 프렛쌍의 FRET 효율에 영향을 미치지 않도록 간격이 조절된 것인 타겟 물질 검출방법.
  28. 제27 항에 있어서,
    상기 프렛쌍들 사이의 간격은 적어도 5nm인 것인 타겟 물질 검출방법.
  29. 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 판독 단계는 형광 물질들 간 거리에 따라 서로 구분되는 프렛(FRET) 효율의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  30. 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 판독 단계는 서로 다른 종류의 형광 물질 간 발생하는 프렛(FRET)에 의한 발광 스펙트럼의 차이를 측정하여 2종 이상의 타겟 물질들을 동시에 판독하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  31. 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광 신호를 이미징하는 영역의 단위 면적당 상기 타겟 물질들의 개수로부터 상기 시료 중의 상기 타겟 물질의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 타겟 물질 검출방법.
  32. a) 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 도킹 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브; 및
    b) 상기 도킹 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되,
    상기 도킹 스트랜드와 상기 별도 스트랜드 중 어느 하나 또는 각각에 적어도 하나의 도너 형광 물질과 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비되며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트.
  33. 타겟 물질인 핵산 또는 핵산 유사체의 스트랜드와 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 별도 스트랜드를 포함하되, 상기 별도 스트랜드는 적어도 하나의 도너 형광 물질을 구비한 도너 스트랜드; 및 적어도 하나의 억셉터 형광 물질이 구비한 억셉터 스트랜드를 포함하며, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트.
  34. 타겟 물질과 특이적으로 결합하며, 태그 스트랜드를 구비한 1종 이상의 검출 프로브를 포함하되,
    상기 태그 스트랜드는 1종 이상의 도너 형광 물질; 및 1종 이상의 억셉터 형광 물질을 포함하고, 상기 도너 형광 물질의 여기에 의해 상기 도너 형광 물질과 상기 억셉터 형광 물질 사이의 프렛(FRET)에 의한 발광을 나타내는 타겟 물질 검출용 키트.
  35. 제32 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 물질을 부착하기 위한 기판을 더 포함하는 것인 타겟 물질 검출용 키트.
  36. 제35 항에 있어서,
    상기 기판에 상기 타겟 물질을 포획하기 위한 1종 이상의 포획 프로브가 고정된 것인 타겟 물질 검출용 키트.
  37. 제36 항에 있어서,
    상기 포획 프로브는 태그 스트랜드를 구비한 것인 타겟 물질 검출용 키트.
  38. 제37 항에 있어서,
    상기 검출 프로브의 태그 스트랜드 및 상기 포획 프로브의 태그 스트랜드와 상보적으로 결합함으로써 프렛쌍을 형성할 수 있는 브릿지 스트랜드를 더 포함하는 타겟 물질 검출용 키트.
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