WO2020027446A1 - 액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법 - Google Patents

액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법 Download PDF

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WO2020027446A1
WO2020027446A1 PCT/KR2019/007906 KR2019007906W WO2020027446A1 WO 2020027446 A1 WO2020027446 A1 WO 2020027446A1 KR 2019007906 W KR2019007906 W KR 2019007906W WO 2020027446 A1 WO2020027446 A1 WO 2020027446A1
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beta
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vdac1
ant2
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장지영
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엑소젠 피티이. 엘티디
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for early diagnosis and post-treatment of breast cancer using multiple cancer gene biomarkers, and more particularly to a non-invasive method for early diagnosis and post-treatment monitoring of breast cancer using multiple gene expression analysis in exosomes.
  • Breast cancer is the number one cancer cancer in the world and the second most common cancer in Korea after thyroid cancer.
  • X-ray-based mammography which is highly sensitive to microcalcification, is used for the screening of breast cancer. Women with known dense breasts have limitations that significantly reduce the sensitivity of X-ray mammography, which requires additional breast ultrasonography, which is relatively long and dependent on the examiner. .
  • the breast cancer diagnosis method of the invasive method (tva biopsy) through the biopsy tissue biopsy
  • tissue biopsy tissue biopsy
  • liquid biopsy is a genetic test technique that analyzes circulating tumor DNA (ctDNA) in the blood released from tumor cells as a result of tumor cell death in the blood as a result of tumor cell death.
  • This technique (ctDNA gene analysis) is mainly a method for analyzing the presence of mutations in a specific gene (BRACA1 / 2 mutation), which is more suitable for predicting future cancer incidence than early diagnosis of cancer, and predicting anticancer therapeutic effect (HER2 target).
  • therapy is a very effective technique for selecting personalized therapies.
  • recurrence after breast cancer surgery There are two types of recurrence after breast cancer surgery: (1) local recurrence and (2) systemic recurrence (remote metastasis).
  • Local recurrence refers to the recurrence of the surgical site, chest wall, axillary lymph nodes, etc.
  • Systemic recurrence refers to the recurrence of other organs in the body, such as the lungs, bones, liver, brain, and ovaries. Recurrences usually occur within five years after surgery, so regular check-ups should be taken at least once every six months for five years and once a year thereafter.
  • Regular checkups for breast cancer include (1) doctor's examination (observing whether new cancers occur in other breasts and opposite breasts), (2) mammograms, and (3) tumor markers (CA15-3). Tests, (4) liver function blood tests, (5) chest lung images (to see if there is metastasis in the lungs), (6) systemic isotope bone scans (to see if there are metastases in the bone, This is done when abnormalities are found in the tumor marker test or liver function test, or when there are symptoms such as bone pain, except for patients with mid to second stage breast cancer, which are performed regularly every six months), (7) Liver ultrasonography (examination) Only if it is suspected that it is necessary), and (8) brain computer (CT) imaging (only if it is suspected that a test is needed).
  • CT brain computer
  • the present invention has been made to solve the problems of the prior art as described above, using adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion selective channel 1 (Voltage-dependent) using mRNA in the exo anion-selective channel 1; VDAC1), Human Cervical cancer oncogene (HCCR1), caveolin-1, beta-catenin, and transforming growth factor beta 3
  • ANT2 adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • caveolin-1 caveolin-1
  • beta-catenin transforming growth factor beta 3
  • the present invention provides adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), and HCCR1 (Human Cervical) using mRNA in exosomes.
  • ANT2 adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical
  • the aim is to provide a method for monitoring recurrence after breast cancer treatment by measuring mRNA levels.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from exosomes (exosomes) isolated from biological samples of normal people and subjects; (b) Adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer) one or more mRNAs selected from the group consisting of oncogene, caveolin-1, beta-catenin, and transforming growth factor-beta 3 (TGF- ⁇ 3) genes. Measuring the level; And (c) determining breast cancer when the mRNA levels of the ANT2 and VDAC1 genes are increased compared to those of normal persons, thereby providing an information providing method for early diagnosis of breast cancer.
  • ANT2 Adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from exosomes isolated from biological samples of normal and subject; (b) Adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer) one or more mRNAs selected from the group consisting of oncogene, caveolin-1, beta-catenin, and transforming growth factor-beta 3 (TGF- ⁇ 3) genes. Measuring the level; And (c) determining breast cancer when the mRNA levels of the ANT2 and VDAC1 genes are increased compared to normal persons.
  • ANT2 Adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the breast cancer may be selected from the group of molecular subtypes consisting of Luminal A, Luminal B, HER2 type, and Triple negative / basal-like.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) adenine nucleotide transmutase 2 (ANT2), voltage-dependent anion selective channel 1 (VDAC1), human cerrvical cancer oncogene (HCCR1), caveolin-1, beta-catenin, and transfection with the extracted mRNA as a template Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) determining the molecular subtype Luminal A type breast cancer when the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, and HCCR1 genes are increased relative to the mRNA levels of the carveolin-1, beta-catenin, and TGF- ⁇ 3 genes.
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor beta 3
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) adenine nucleotide transmutase 2 (ANT2), voltage-dependent anion selective channel 1 (VDAC1), human cerrvical cancer oncogene (HCCR1), caveolin-1, beta-catenin, and transfection with the extracted mRNA as a template Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) determining the molecular subtype Luminal A type breast cancer when the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, and HCCR1 genes are increased relative to the mRNA levels of the carveolin-1, beta-catenin, and TGF- ⁇ 3 genes. It provides a method for early diagnosis of molecular subtype Luminal A type breast cancer.
  • ANT2 adenine nucleotide transmutase 2
  • VDAC1 voltage-
  • the molecular subtype Luminal A type is ER-positive (Estrogen Receptor-positive), PR-positive (Progesteron Receptor-positive), and HER2-negative (Human Epidermal growth factor Receptor 2-negative) .
  • the subject is a breast cancer patient.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) Adenine Nucleotide Translocation Enzyme 2 (ANT2), Voltage-dependent Anion Selective Channel 1 (VDAC1), Human Cervical Cancer Oncogene (HCCR1), Caberoline-1 (caveolin-1), Beta Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of catenin, and transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) determining the molecular subtype Luminal B type breast cancer when the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, and TGF- ⁇ 3 genes are increased compared to the mRNA levels of HCCR1, caveolin-1, and beta-catenin genes.
  • ANT2 Adenine Nucleotide Translocation Enzyme 2
  • VDAC1 Voltage-dependent Anion Selective Channel 1
  • HCCR1 Human Cervical Cancer Oncogene
  • Caberoline-1
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) Adenine Nucleotide Translocation Enzyme 2 (ANT2), Voltage-dependent Anion Selective Channel 1 (VDAC1), Human Cervical Cancer Oncogene (HCCR1), Caberoline-1 (caveolin-1), Beta Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of catenin, and transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) determining the molecular subtype Luminal B type breast cancer when the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, and TGF- ⁇ 3 genes are increased compared to the mRNA levels of HCCR1, caveolin-1, and beta-catenin genes. It provides a method for early diagnosis of molecular subtype Luminal B type breast cancer.
  • ANT2 Adenine Nucleotide Translocation Enzyme 2
  • VDAC1 Voltage-dependent Anion Selective Channel 1
  • the molecular subtype Luminal B type is ER-positive, PR-positive, and HER2-positive.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) adenine nucleotide transmutase 2 (ANT2), voltage-dependent anion selective channel 1 (VDAC1), human cerrvical cancer oncogene (HCCR1), caveolin-1, beta-catenin, and transfection with the extracted mRNA as a template Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) determining the molecular subtype HER2 type breast cancer when the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, and TGF- ⁇ 3 genes are increased compared to the mRNA levels of HCCR1, caveolin-1, and beta-catenin genes.
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor beta 3
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) adenine nucleotide transmutase 2 (ANT2), voltage-dependent anion selective channel 1 (VDAC1), human cerrvical cancer oncogene (HCCR1), caveolin-1, beta-catenin, and transfection with the extracted mRNA as a template Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) determining the molecular subtype HER2 type breast cancer when the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, and TGF- ⁇ 3 genes are increased compared to the mRNA levels of HCCR1, caveolin-1, and beta-catenin genes. , Early diagnosis of breast cancer of molecular subtype HER2 type.
  • the molecular subtype HER2 type is ER-negative, PR-negative, and HER2-positive.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) Adenine Nucleotide Translocation Enzyme 2 (ANT2), Voltage-dependent Anion Selective Channel 1 (VDAC1), Human Cervical Cancer Oncogene (HCCR1), Caberoline-1 (caveolin-1), Beta Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of catenin, and transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) breast cancer of molecular type triple negative / basal-like type when the mRNA level of the caveolin-1 gene is increased compared to the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, HCCR1, beta-catenin, and TGF- ⁇ 3 genes.
  • an information providing method for the early diagnosis of breast cancer of the molecular subtype Triple negative / basal-like type comprising the step of.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from the exosomes isolated from the biological sample of the subject; (b) Adenine Nucleotide Translocation Enzyme 2 (ANT2), Voltage-dependent Anion Selective Channel 1 (VDAC1), Human Cervical Cancer Oncogene (HCCR1), Caberoline-1 (caveolin-1), Beta Measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of catenin and a transforming growth factor beta 3 (TGF- ⁇ 3) gene; And (c) breast cancer of molecular type triple negative / basal-like type when the mRNA level of the caveolin-1 gene is increased compared to the mRNA levels of the ANT2, VDAC1, HCCR1, beta-catenin, and TGF- ⁇ 3 genes. It provides a method for the early diagnosis of breast cancer of the molecular subtype Triple negative / basal-like type comprising the step of.
  • the molecular subtype Triple negative / basal-like type is ER-negative, PR-negative, and HER2-negative.
  • the biological sample includes blood and urine.
  • the ANT2 and VDAC1 genes are genes involved in the generation and proliferation of cancer.
  • the HCCR1 gene is a gene involved in cancer progression.
  • the TGF- ⁇ 3 gene is a gene involved in a tumor immune response.
  • the caveolin-1 and beta-catenin genes are genes involved in cancer stem cell and anticancer drug resistance.
  • the present invention provides adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer oncogene), carveolin- 1 (caveolin-1), beta-catenin ( ⁇ -catenin), and transforming growth factor beta 3 (transforming growth factor-beta 3; TGF- ⁇ 3) a substance for measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of It provides, comprising a composition for the early diagnosis of breast cancer using exosomes (exosomes).
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • carveolin- 1 caveolin-1
  • beta-catenin beta-catenin
  • transforming growth factor beta 3 transforming growth factor-beta 3
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the present invention provides adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer oncogene), carveolin- 1 (caveolin-1), beta-catenin ( ⁇ -catenin), and transforming growth factor beta 3 (transforming growth factor-beta 3; TGF- ⁇ 3) a substance for measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of It provides, comprising a kit for early diagnosis of breast cancer using exosomes (exosomes).
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • carveolin- 1 caveolin-1
  • beta-catenin beta-catenin
  • transforming growth factor beta 3 transforming growth factor-beta 3
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the substance for measuring mRNA level may be a primer or a probe capable of amplifying mRNA.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting mRNA from exosomes (exosomes) isolated from biological samples of normal people and subjects; (b) Adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer) one or more mRNAs selected from the group consisting of oncogene, caveolin-1, beta-catenin, and transforming growth factor-beta 3 (TGF- ⁇ 3) genes. Measuring the level; And (c) determining that breast cancer has recurred when the mRNA levels of the ANT2 and VDAC1 genes are increased compared to normal persons.
  • ANT2 Adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the subject may be a person who has been treated for breast cancer.
  • the present invention provides adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer oncogene), carveolin- 1 (caveolin-1), beta-catenin ( ⁇ -catenin), and transforming growth factor beta 3 (transforming growth factor-beta 3; TGF- ⁇ 3) a substance for measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of It provides a kit for monitoring relapse after breast cancer treatment using exosomes.
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • carveolin- 1 caveolin-1
  • beta-catenin beta-catenin
  • transforming growth factor beta 3 transforming growth factor-beta 3
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the present inventors have developed a technique for analyzing mRNA inside an exosome of a lipids bilayer that can be protected from ribonuclease (RNase) in the blood and through this technique, the accuracy and reproducibility of diagnosis Since it is determined that breast cancer has a clear molecular subtype classification and effective treatment, the present invention provides a minimal multi-cancer gene biomarker technology applicable to early diagnosis of breast cancer molecular subtypes. It is possible to make early diagnosis of breast cancer of four molecular subtypes, and to determine the progression of breast cancer according to the expression level, and to detect the recurrence after breast cancer treatment using multiple gene expression analysis in exosomes as a technical feature of high detection sensitivity.
  • RNase ribonuclease
  • the regular screening test item for monitoring the recurrence of breast cancer is not only expensive, but also causes inconvenience to the inspector and requires a lot of time, but the product developed in the present invention has a low detection rate and high cost.
  • the results can be obtained in a short and short time without the pain of the examiner, it is expected to be widely used for the development of a gene in vitro diagnostic medical device for monitoring the recurrence after breast cancer treatment.
  • FIG. 1 shows the results of analyzing expression levels of six biomarker genes (ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, ⁇ -catenin, and TGF- ⁇ 3) selected from breast cancer-derived exosomes by treating them with breast cancer molecular subtypes. Is a diagram showing.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating expression levels of five biomarker genes (ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, and TGF- ⁇ 3) obtained from breast cancer-derived exosomes in healthy and breast cancer patients pooling samples.
  • biomarker genes ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, and TGF- ⁇ 3
  • Figure 3 is a diagram confirming the Ct value of real-time PCR when spike test (spike test) exosomes secreted by 5x10 5 or more breast cancer cell lines (MDA-MB-231) for 48 hours.
  • the present inventors have developed a technique for analyzing mRNA inside an exosome of a lipids bilayer that can be protected from ribonuclease (RNase) in the blood and through this technique, the accuracy and reproducibility of diagnosis
  • the present invention was completed by confirming the possibility of early diagnosis of breast cancer using a liquid biopsy multi-cancer gene biomarker and the possibility of developing an in vitro diagnostic medical device for monitoring the recurrence after breast cancer treatment.
  • breast cancer has a clear molecular subtype classification and effective target therapy
  • the present inventors have found a minimum of multiple cancer gene biomarkers applicable to the early diagnosis of the breast cancer molecular subtypes, and the four molecular subtypes.
  • Early diagnosis of breast cancer method of determining breast cancer progression according to the expression level, monitoring to confirm recurrence after breast cancer treatment with technical features of high detection sensitivity, and high-risk and low-risk cancer patients with specific gene biomarker expression level To provide a method that can be distinguished by.
  • ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, ⁇ -catenin, and TGF- ⁇ 3 selected through an experiment using a breast cancer cell line-derived exosomes, as shown in Figure 1
  • the expression levels of two or more cell lines per breast cancer molecular subtype (MCF7, T47D / BT474, ZR-75-1 / SK-BR3, MDA-MB453 / MDA-MB-231, BT20) were independently analyzed.
  • ANT2 and VDAC1 which play an important role in the generation and proliferation of cancer, showed positive correlations in ER and PR positive and HER2 positive, respectively, and in the HCCR1 gene involved in cancer progression, ER and PR There was a positive and positive correlation.
  • caveolin-1 and ⁇ -catenin which play an important role in cancer stem cell and anticancer drug resistance, were expected to have a deep correlation with triple negative molecular subtype (ER-PR-HER2-). Specific high expression was observed in the molecular subtypes, and in the case of TGF- ⁇ 3, positive correlation was confirmed with HER2 positive (see Example 1).
  • the expression levels of five biomarker genes obtained from breast cancer-derived exosomes in healthy and breast cancer patients pooling samples were confirmed, and ANT2 and VDAC1 were the largest differences regardless of breast cancer molecular subtypes. It was confirmed that was shown (see Example 2).
  • breast cancer cell lines in normal blood MDA-MB-231: ER- /.
  • PR- / HER2- the result of predicting the number of detectable cancerous cells in test spikes, when the spikes test for a bit one exo secretion for 48 hours, 5x10 5 or more breast cancer cell line (MDA-MB-231) real -time It was confirmed that the Ct value of the PCR was less than 35, and as a result, it was confirmed that the gene detection range (see Example 3).
  • the present invention comprises the steps of: (a) extracting mRNA from exosomes isolated from biological samples of normal and subject; (b) Adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer) one or more mRNAs selected from the group consisting of oncogene, caveolin-1, beta-catenin, and transforming growth factor-beta 3 (TGF- ⁇ 3) genes. Measuring the level; And (c) determining breast cancer when the mRNA levels of the ANT2 and VDAC1 genes are increased compared to those of normal persons, thereby providing an information providing method for early diagnosis of breast cancer.
  • ANT2 Adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • exosome refers to a small form of endoplasmic reticulum having a lipid bilayer secreted from a cell, wherein the exosome is secreted from various cells and is approximately 30 to It is known to have a diameter of 200 nm. In such exosomes, various kinds of proteins, DNA, mRNA, miRNA and the like derived from cells are included.
  • biological sample is a sample that can be obtained non-invasively, and means all samples containing exosomes, and preferably blood, plasma, serum, bone marrow, tissue , Cells, saliva, sputum, hair, urine and the like, more preferably blood, urine, and the like, Adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion selective channel 1 (Voltage-dependent anion) selective channel 1; VDAC1), Human Cervical cancer oncogene (HCCR1), caveolin-1, beta-catenin, and transforming growth factor beta 3; TGF- ⁇ 3) gene is not limited to any sample that can measure the mRNA amount of one or more multi-cancer biomarkers selected from the group consisting of.
  • ANT2 Adenine nucleotide translocase 2
  • VDAC1 voltage-dependent anion selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • caveolin-1 caveolin-1, beta-catenin
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor
  • molecular subtype used in the present invention refers to a classification type according to molecular diagnosis for clinical use, such as diagnosis or treatment of a disease, and recently, the body of the patient can be profiled at the molecular level, thereby targeting This leads to the development of therapies and even changes in the classification of diseases.
  • the molecular subtypes according to the above classification are closely related to the treatment of cancer and the prognosis of cancer patients, preferably breast cancer, and thus the molecular subtypes of breast cancer are Luminal A, Luminal B, HER2 type, and Triple negative / basal-like. This is not restrictive.
  • the Luminal A type of the molecular subtypes is characterized in that the ER-positive (Estrogen Receptor-positive), PR-positive (Progesterone Receptor-positive), and HER2-negative (Human Epidermal growth factor Receptor 2-negative)
  • the molecular subtype Luminal B type is characterized as being ER-positive, PR-positive, and HER2-positive
  • the molecular subtype HER2 type is characterized as being ER-negative, PR-negative, and HER2-positive, molecular subtype Triple negative
  • the / basal-like type is characterized by, but is not limited to, ER-negative, PR-negative, and HER2-negative.
  • the ANT2 and VDAC1 genes are characterized in that the genes involved in the generation and proliferation of cancer, the HCCR1 gene is characterized in that the gene involved in the progression of cancer, the TGF- ⁇ 3 gene is involved in the tumor immune response Characterized in that the gene, the kaveolin-1 and beta-catenin gene is characterized in that the gene involved in cancer stem cell and anticancer drug resistance, but is not limited thereto.
  • the present invention provides adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer oncogene), carveolin- 1 (caveolin-1), beta-catenin ( ⁇ -catenin), and transforming growth factor beta 3 (transforming growth factor-beta 3; TGF- ⁇ 3) a substance for measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of It provides, comprising a composition for the early diagnosis of breast cancer using exosomes (exosomes).
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • carveolin- 1 caveolin-1
  • beta-catenin beta-catenin
  • transforming growth factor beta 3 transforming growth factor-beta 3
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the present invention provides adenine nucleotide translocase 2 (ANT2), voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC1), HCCR1 (Human Cervical cancer oncogene), carveolin- 1 (caveolin-1), beta-catenin ( ⁇ -catenin), and transforming growth factor beta 3 (transforming growth factor-beta 3; TGF- ⁇ 3) a substance for measuring at least one mRNA level selected from the group consisting of It provides, comprising a kit for early diagnosis of breast cancer using exosomes (exosomes).
  • VDAC1 voltage-dependent anion-selective channel 1
  • HCCR1 Human Cervical cancer oncogene
  • carveolin- 1 caveolin-1
  • beta-catenin beta-catenin
  • transforming growth factor beta 3 transforming growth factor-beta 3
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor-beta 3
  • the exosomes may be separated from blood or urine, but are not limited thereto.
  • the substance for measuring mRNA level may be a primer or a probe capable of amplifying mRNA, but is not limited thereto.
  • ER + / PR + / HER2- MCF7 T47D (Luminal A) ER + / PR + / HER2 + BT474, ZR-75-1 (Luminal B) ER- / PR- / HER2 + SK-BR3, MDA-MB-453 (HER2 type) ER- / PR- / HER2- MDA-MB-231, BT20 (Triple negative / basal-like)
  • Culture conditions were cultured in a cell culture medium of 5% CO 2 , 37 °C using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% penicillin / streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • exosome-depleted FBS FBS
  • PBS Phosphate Buffered Saline, pH 7.4
  • Exosome concentration was induced by culturing in a cell incubator at 5% CO 2 , 37 ° C for 48 hours after replacing the culture medium, and the culture volume was changed to 1/10 using an amicon Ultra-15 centrifugal filter (ultracel-3K). After concentration, exosomes were obtained using SBI Exoquick TC reagent.
  • the principle of extracting RNA from the exosomes is to dissolve the exosomes in the culture medium and separate only the RNA from the protein, DNA, and RNA (mRNA, miRNA, rRNA, etc.) flowed out of the exosomes.
  • RNA concentration measurement was performed using nano-drop (absorbance at 260nm wavelength), and RNA purity and contamination were checked through 260/280 ratio and 260/230 ratio. RNA belonging to was used for the experiment.
  • qRT-PCR reagent (SensiFAST TM Probe Lo-ROX), a Bioline product that performs reverse transcription and cDNA polymerase chain reaction in one step by using 100ng of exosome RNA from breast cancer cell line as a template One-Step Kit) was used, and each gene probe was manufactured by IDT (Integrated DNA Technologies), and information is shown in Table 2 below.
  • the real-time PCR equipment used in the experiment was ABI's StepOne plus equipment and all samples were duplicated to increase the reliability of the results.
  • ANT2 and VDAC1 genes are involved in the generation and proliferation of cancer
  • HCCR1 gene is involved in cancer progression
  • TGF- ⁇ 3 is involved in tumor immune response
  • caveolin-1 and ⁇ -catenin genes are cancer Involved in stem cell and anticancer drug resistance.
  • the selected six genes were independently expressed three or more times in two breast cell molecular subtypes (MCF7, T47D / BT474, ZR-75-1 / SK-BR3, MDA-MB453 / MDA-MB-231, BT20) The levels were analyzed. In this case, two genes (b-actin and 18S rRNA) were used as internal control (housekeeping gene) genes to normalize RNAs concentration. Expression levels were compared.
  • ANT2 and VDAC1 genes which play an important role in the generation and proliferation of cancer, showed positive correlations in ER and PR positive and HER2 positive, respectively, and are involved in cancer progression.
  • the HCCR1 gene was positively correlated with ER and PR positive.
  • caveolin-1 and ⁇ -catenin which play an important role in cancer stem cell and anticancer drug resistance, were expected to have a deep correlation with triple negative molecular subtype (ER-PR-HER2-). Specific high expression was observed in molecular subtypes, and TGF- ⁇ 3 showed positive correlation with HER2 positive.
  • Luminal A type ER + / PR + / HER2-
  • ER and PR were positive, so they showed a positive correlation with the ANT2, VDAC1, and HCCR1 genes.
  • Luminal A type related gene markers were confirmed.
  • ER and PR are positive and HER2 is also positive for the molecular subtype Luminal B type (ER + / PR + / HER2 +) of breast cancer. Therefore, HCCR1 gene is excluded because HER2 is negative. Since ⁇ 3 showed positive correlation with HER2 positive, it was confirmed that ANT2, VDAC1 and TGF- ⁇ 3 genes positively correlated with ER, PR positive and HER2 positive were Luminal B type related gene markers.
  • HER2 type (ER- / PR- / HER2 +) of breast cancer
  • ANT2 VDAC1 and TGF- ⁇ 3 genes positively correlated with HER2 are also HER2 type related gene markers.
  • triple negative / basal-like type of breast cancer only olin, PR, and HER2 are negative, so only caveolin-1 gene was expressed highly, so caveolin-1 gene was triple negative / basal -like type of gene marker was confirmed.
  • the combination of the five genes not only enables early diagnosis of breast cancer by molecular subtype, but is also expected to be very useful for monitoring recurrence after breast cancer treatment due to the technical characteristics of high detection sensitivity.
  • the expression levels of gene biomarkers specifically expressed in triple negative molecular subtypes with the worst prognosis are expected to indirectly predict the prognosis of breast cancer.
  • the blood samples of healthy and cancer patients used in this study were frozen (-80 ° C) stored samples. Serum collected in SST tubes was used. Specifically, a healthy person used a sample in which the biomarker for cancer protein diagnosis was in a normal range, and a patient who received a cancer diagnosis (confirmed) at a university hospital was used for a cancer patient.
  • the minimum volume of serum required to extract RNA in exosomes is 200ul and the sample was prepared as follows.
  • Healthy Serum male 200 ml each of 5 samples are prepared in 1 ml female 200 ml each of 5 samples are prepared in 1 ml Breast cancer serum stage 1 & 2 200 ml each of 5 samples are prepared in 1 ml stage 3 & 4 200 ml each of 5 samples are prepared in 1 ml
  • Samples prepared as above were divided into 200ul each and stored at -80 ° C, and all samples were subjected to one freezing and thawing in the same manner.
  • RNA in exosomes from healthy and breast cancer serums
  • Nextractor®NX-48 an automated equipment produced and sold by Genolus Inc.
  • reagents are extracted from exosomes of the same company's products that are most suitable for the equipment. Reagents were used.
  • the principle of extracting RNA in exosomes is the same as described in Examples 1-3.
  • RNA concentration in exosomes extracted from serum by automated equipment is the same as described in Examples 1-4.
  • QRT-PCR was performed in the same manner as in Example 1-5 using 100ng of exo RNA extracted from serum as a template.
  • the expression levels of five biomarker genes obtained from breast cancer-derived exosomes in healthy people and breast cancer patients pooling samples were confirmed, and showed significant differences between normal people and breast cancer patients.
  • MDA-MB-231 ER- / PR- / HER2-
  • a 1 cm 3 sized tumor (number of cancer cells: 1x10 9 ) is assumed to contain exosomes secreted by 2.22x10 6 cancer cells in 1 ml of blood.
  • centrifugation of 1 ml of blood yields about 0.5 ml of serum, and spiked exosomes secreted by 1x10 5 to 1x10 7 breast cancer cell lines in 0.25 ml of healthy serum under artificial conditions in which 1 cm 3 tumors are present.
  • the exosome derived from the breast cancer cell line used for the spike test is secreted by MDA-MB-231 (ER- / PR- / HER2-) cells, the gene to be analyzed was performed by caveolin-1.
  • the minimal multi-cancer gene biomarker technology applicable to the early diagnosis of breast cancer molecular subtypes of the present invention it is possible to diagnose the breast cancer of the four molecular subtypes early, and to determine the progression of breast cancer according to the expression level.
  • the regular screening test item for monitoring the recurrence of breast cancer is not only expensive, but also causes inconvenience to the examiner and requires a lot of time, but the product developed in the present invention has a low detection rate and high cost.
  • it is very useful in that the results can be obtained in a simple and short time without the pain of the examiner it is expected to be widely used for the development of the in vitro diagnostic medical device for monitoring the recurrence after breast cancer treatment.

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Abstract

본 발명은 액체생검 유전자 다중 바이오마커를 이용한 유방암 분자아형 별 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법에 관한 것으로써, 엑소좀을 이용한 유방암 및 유방암의 분자아형 별 조기 진단 및 치료 후 모니터링을 위한 비침습적 방법 등에 관한 것이다. 즉, 본 발명자들은 엑소좀 내부에 있는 mRNA를 분석하는 기술을 개발하고 상기 기술을 통해 진단의 정확성 및 재현성을 높일 수 있다고 판단하였는 바, 상기 유방암 분자아형 별 조기 진단에 적용 가능한 최소한의 다중 암 유전자 바이오마커 기술을 통해, 4가지 분자아형의 유방암 조기 진단 방법, 발현 정도에 따라 유방암 진행 정도를 판단하는 방법 등을 제공할 수 있으므로, 액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단방법 및 유방암 치료 후 재발여부 모니터링을 위한 유전자 체외진단용 의료기기 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법
본 발명은 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 엑소좀 내 다중 유전자 발현 분석을 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링을 위한 비침습적 방법 등에 관한 것이다.
유방암은 세계 여성 암 발병률 1위이며 국내에서도 갑상선암 다음으로 여성에게 가장 흔한 암으로 유방암 검진을 위해서는 미세석회화 민감도가 우수한 X-선 기반의 유방촬영술(mammography)이 주로 사용되는데, 유방암 발생의 위험인자로 알려진 치밀형 유방을 가진 여성에서는 X-선 유방촬영술의 민감도가 현저하게 낮아지는 한계점을 가지고 있어 추가적인 유방 초음파검사를 수행해야 하며 초음파검사 특성상 검사 시간이 상대적으로 길고 검사자에 대한 의존도가 크다는 단점이 있다. 또한, 유방암 조직생검(tissue biopsy)을 통한 침습적 방법(invasive method)의 유방암 진단법은 검사자의 고통, 감염으로 인한 부작용 및 입원과 검사 후 회복 기간을 필요로 한다는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 액체생검(liquid biopsy)을 이용한 유방암 조기진단법 개발은 매우 시급한 실정이며 이는 조직생검 횟수를 줄이고, X-선 유방촬영술의 낮은 민감도를 극복할 수 있을 것이라 기대된다.
현재까지 개발된 액체생검을 이용한 유방암 진단법은 진단에 사용되는 바이오마커가 극소수에 불과하며 대부분의 바이오마커가 유방암 4기에서만 높은 민감도를 보이므로 암 조기 진단에 큰 어려움이 있어, 전 세계적으로 체액을 이용한 새로운 암 유전자 진단법 개발이 활발히 이루어지고 있다. 대표적인 액체생검을 이용한 유방암 유전자 진단 기술로는 혈액 내 종양세포 사멸의 결과로 종양세포로부터 방출된 혈액 내 순환하는 종양유래 순환 DNA(ctDNA: circulating tumor DNA)를 분석하는 유전자검사 기술이 있다. 이 기술(ctDNA 유전자 분석법)은 주로 특정 유전자의 돌연변이(BRACA1/2 mutation) 여부를 분석하는 방법으로, 암의 조기진단보다는 미래의 암 유발 가능성 예측에 더 적합한 기술이며, 항암제 치료 효과 예측(HER2 target therapy)으로 개인 맞춤 치료제 선택에 매우 효과적인 기술이다. 다만, 초기 단계의 작은 종양의 경우, 혈액 내 ctDNA의 half-life는 1시간 내외로 결과의 안정성과 재현성이 낮을 뿐 아니라, ctDNA의 수준이 개인마다 다르고 검출하기도 까다로우므로(낮은 검출효율, 낮은 순도, 낮은 민감도), 고감도 검출 방법 개발을 필요로 하는 실정이다.
한편, 유방암 수술을 받은 후에도 재발여부 확인을 위해 정기검진을 필요로 하는데, 유방암 수술 후의 재발에는 (1) 국소 재발과 (2) 전신 재발(원격 전이)의 두 가지로 나누어진다. 국소 재발이란 수술 부위 및 흉벽, 겨드랑이 임파선 등에 재발한 것을 말하며, 전신 재발이란 폐, 뼈, 간, 뇌, 난소 등 우리 몸의 다른 장기에 재발되는 것을 말한다. 재발은 대부분 수술 후 5년 이내에 많이 발생하게 되므로 5년 동안은 적어도 6개월에 한 번씩, 그 이후는 평생 동안 1년에 한 번씩 정기검진을 받아야 한다. 유방암 정기검진 항목으로는 대표적으로 (1) 의사의 진찰(유방 다른 부위 및 반대편 유방에 암이 새로 발생하는지 여부를 관찰), (2) 유방 사진촬영, (3) 종양표지자(CA15-3) 혈액검사, (4) 간기능 혈액검사, (5) 흉부 폐사진(폐에 전이가 있는지 여부를 관찰), (6) 전신 동위원소 뼈촬영(bone scan) (뼈에 전이가 있는지 여부를 관찰하는데, 종양표지자 검사 및 간기능 검사에서 이상이 발견되거나, 뼈의 통증 같은 증세가 있을 경우에 시행하며, 단 유방암 2기 중반 이상의 환자는 6개월 간격으로 규칙적으로 시행), (7) 간 초음파검사(검사가 필요하다고 의심되는 경우에만 시행), 및 (8) 뇌컴퓨터 (CT)촬영(검사가 필요하다고 의심되는 경우에만 시행)이 포함된다. 다만, 상기와 같이 현재 시행되는 유방암 재발 모니터링을 위한 정기검진 검사 항목은 고비용일 뿐만 아니라, 검사자의 불편함을 초래하고, 많은 시간을 필요로 하는 단점이 있다. 따라서, 높은 검출도, 저비용으로 검사자의 고통 없이 간단하고 짧은 시간에 결과를 얻을 수 있는 치료 후 모니터링 방법을 개발하는 것이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 엑소좀 내의 mRNA를 이용하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3)유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하여, 유방암 및 유방암의 분자아형 별 조기 진단하는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 엑소좀 내의 mRNA를 이용하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3)유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하여, 유방암 치료 후 재발 모니터링 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3)유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3)유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암의 조기 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유방암은 Luminal A, Luminal B, HER2 type, 및 Triple negative/basal-like으로 이루어진 분자아형(molecular subtype) 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 HCCR1 유전자의 mRNA 수준이 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal A 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal A 타입 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 HCCR1 유전자의 mRNA 수준이 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal A 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal A 타입 유방암의 조기 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 분자아형 Luminal A 타입은 ER-양성(Estrogen Receptor-positive), PR-양성(Progesteron Receptor-positive), 및 HER2-음성(Human Epidermal growth factor Receptor 2-negative)이다.
또한, 본 발명의 다른 구현예로, 상기 피검자는 유방암 환자이다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal B 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal B 타입 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal B 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal B 타입 유방암의 조기 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 분자아형 Luminal B 타입은 ER-양성, PR-양성, 및 HER2-양성이다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 HER2 type 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 HER2 type인 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 HER2 type 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 HER2 type인 유방암의 조기 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 분자아형 HER2 type은 ER-음성, PR-음성, 및 HER2-양성이다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 카베올린-1 유전자의 mRNA 수준이 ANT2, VDAC1, HCCR1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3)유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 카베올린-1 유전자의 mRNA 수준이 ANT2, VDAC1, HCCR1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암의 조기 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 분자아형 Triple negative/basal-like 타입은 ER-음성, PR-음성, 및 HER2-음성이다.
또한, 본 발명에서 상기 생물학적 시료는 혈액 및 소변을 포함한다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자는 암의 생성 및 증식에 관여하는 유전자이다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 HCCR1 유전자는 암의 진행에 관여하는 유전자이다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 TGF-β3 유전자는 종양 면역반응에 관여하는 유전자이다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 카베올린-1 및 베타-카테닌 유전자는 암 줄기세포 및 항암제 내성에 관여하는 유전자이다.
또한, 본 발명은 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암의 조기 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암의 조기 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 mRNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암이 재발된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암 치료 후 재발 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 피검자는 유방암 치료를 받은 사람일 수 있다.
또한, 본 발명은 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암 치료 후 재발 모니터링 키트를 제공한다.
본 발명자들은 혈액 내 리보뉴클레아제(RNase; ribonuclease)로부터 보호될 수 있는 이중지질막 구조(lipids bilayer)의 엑소좀 내부에 있는 mRNA를 분석하는 기술을 개발하고 상기 기술을 통해 진단의 정확성 및 재현성을 높일 수 있다고 판단하였는 바, 유방암은 분자아형(molecular subtype) 분류가 명확하고 표적치료가 효과적으로 이루어지고 있으므로, 본 발명은 유방암 분자아형 별 조기 진단에 적용 가능한 최소한의 다중 암 유전자 바이오마커 기술을 통해, 4가지 분자아형의 유방암을 조기 진단하는 것을 가능하게 하고, 발현 정도에 따라 유방암 진행 정도를 판단할 수 있으며, 높은 검출 감도의 기술적 특징으로 엑소좀 내 다중 유전자 발현 분석을 이용하여 유방암 치료 후 재발 여부를 모니터링하는 것을 가능하게 한다. 이에 더하여, 현재 시행되는 유방암 재발 모니터링을 위한 정기검진 검사 항목은 고비용일 뿐만 아니라, 검사자의 불편함을 초래하고, 많은 시간을 필요로 한다는 단점이 있지만, 본 발명에서 개발되는 제품은 높은 검출도로 저비용으로 검사자의 고통 없이 간단하고 짧은 시간에 결과를 얻을 수 있다는 면에서 매우 유용하므로, 유방암 치료 후 재발 여부 모니터링을 위한 유전자 체외진단용 의료기기 개발에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 유방암 유래 엑소좀에서 선정된 6개의 바이오마커 유전자(ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, β-catenin, 및 TGF-β3)를 유방암 분자아형 별 세포주에 처리하여 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 유방암 유래 엑소좀에서 확보한 5개의 바이오마커 유전자(ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, 및 TGF-β3)를 건강인과 유방암환자 pooling 샘플을 대상으로 발현 수준을 확인한 도이다.
도 3은 5x10 5 개 이상의 유방암 세포주(MDA-MB-231)가 48시간 동안 분비한 엑소좀을 스파이크 테스트(Spike test)한 경우에 real-time PCR의 Ct 값을 확인한 도이다.
본 발명자들은 혈액 내 리보뉴클레아제(RNase; ribonuclease)로부터 보호될 수 있는 이중지질막 구조(lipids bilayer)의 엑소좀 내부에 있는 mRNA를 분석하는 기술을 개발하고 상기 기술을 통해 진단의 정확성 및 재현성을 높일 수 있다고 판단하였는 바, 이에 기초하여 액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단방법 및 유방암 치료 후 재발여부 모니터링을 위한 유전자 체외진단용 의료기기 개발 가능성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
또한, 유방암은 분자아형(molecular subtype) 분류가 명확하고 표적치료가 효과적으로 이루어지고 있으므로, 본 발명자들은 상기 유방암 분자아형 별 조기 진단에 적용 가능한 최소한의 다중 암 유전자 바이오마커를 발견하고, 4가지 분자아형의 유방암 조기 진단 방법, 발현 정도에 따라 유방암 진행 정도를 판단하는 방법, 높은 검출 감도의 기술적 특징으로 유방암 치료 후 재발여부를 확인할 수 있는 모니터링, 및 특정 유전자 바이오마커 발현 수준으로 고위험군과 저위험군 암 환자로 구분할 수 있는 방법 등을 제공하고자 한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 유방암 세포주 유래 엑소좀을 이용한 실험을 통하여 선정된 6개의 유전자(ANT2, VDAC1, HCCR1, caveolin-1, β-catenin, 및 TGF-β3)를 도 1에 나타난 바와 같이 유방암 분자아형 별 세포주 2개씩(MCF7,T47D / BT474,ZR-75-1 / SK-BR3,MDA-MB453 / MDA-MB-231,BT20)에서 독립적으로 3회 이상 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, 암의 생성 및 증식에 있어서 중요한 역할을 하는 ANT2 및 VDAC1의 경우 ER 및 PR 양성과 HER2 양성에서 각각 양의 상관관계를 보였으며, 암의 진행에 관여하는 HCCR1 유전자의 경우, ER 및 PR 양성과 양의 상관관계를 보였다. 또한, 암 줄기세포와 항암제 내성에 중요한 기능을 하는 caveolin-1 및 β-catenin의 경우 triple negative 분자아형(ER-PR-HER2-)과 깊은 상관관계를 예상하였으나 기대와 달리 caveolin-1만 triple negative 분자아형에서 특이적으로 높은 발현이 관찰되었으며, TGF-β3의 경우는 HER2 양성과 양의 상관관계를 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 유방암 유래 엑소좀에서 확보한 5개의 바이오마커 유전자를 건강인과 유방암환자 pooling 샘플을 대상으로 발현 수준을 확인한 결과, ANT2와 VDAC1가 유방암 분자아형과 상관없이 가장 큰 차이를 보이는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명이 검출 민감도가 높다는 것을 실험을 통해 밝혀내고, 유방암 재발 모니터링에 유용하다는 점을 증명하기 위하여, 정상 혈액에 유방암 세포주(MDA-MB-231 : ER-/PR-/HER2-)를 스파이크 테스트하여 검출 가능한 암 세포 수를 예측한 결과, 5x10 5개 이상의 유방암 세포주(MDA-MB-231)가 48시간 동안 분비한 엑소좀을 스파이크 테스트한 경우에 real-time PCR의 Ct 값이 35미만인 것을 확인하였는 바, 결과적으로 유전자 검출 가능한 범위인 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
따라서, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"이란, 세포로부터 분비되는 이중 지질막(lipid bilayer)을 가지고 있는 작은 형태의 소포체를 포괄적으로 의미하며, 엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되며 대략 30 내지 200 nm의 직경을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 엑소좀 내에는 세포로부터 유래된 다양한 종류의 단백질, DNA, mRNA, 및 miRNA 등이 포함되어 있다.
본 발명에 사용되는 용어 "생물학적 시료(biological sample)"란, 비침습적으로 획득될 수 있는 시료로서, 엑소좀을 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액, 소변 등이나, 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 1; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 다중 암 유전자 바이오마커의 mRNA 양을 측정할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 "분자아형"이란, 질병의 진단이나 치료 등 임상에 이용하기 위한 분자 진단에 따른 분류 타입을 뜻하며, 최근 환자의 몸을 분자 수준에서 프로파일링할 수 있게 되면서, 그에 따른 표적치료법의 개발로 연결되고 질병의 분류 방식조차 바뀌고 있는 추세이다. 상기 분류에 의한 분자아형은 암 치료 및 암환자의 예후와 밀접한 관련이 있으며, 바람직하게는 유방암이고 그에 따른 유방암의 분자아형 타입은 Luminal A, Luminal B, HER2 type, 및 Triple negative/basal-like이나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 분자아형 타입 중 Luminal A 타입은 ER-양성(Estrogen Receptor-positive), PR-양성(Progesterone Receptor-positive), 및 HER2-음성(Human Epidermal growth factor Receptor 2-negative)인 것을 특징으로 하고, 분자아형 Luminal B 타입은 ER-양성, PR-양성, 및 HER2-양성인 것을 특징으로 하고, 분자아형 HER2 type은 ER-음성, PR-음성, 및 HER2-양성인 것을 특징으로 하며, 분자아형 Triple negative/basal-like 타입은 ER-음성, PR-음성, 및 HER2-음성인 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.
상기 ANT2 및 VDAC1 유전자는 암의 생성 및 증식에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하고, 상기 HCCR1 유전자는 암의 진행에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하며, 상기 TGF-β3 유전자는 종양 면역반응에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하며, 상기 카베올린-1 및 베타-카테닌 유전자는 암 줄기세포 및 항암제 내성에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암의 조기 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암의 조기 진단용 키트를 제공한다.
상기 엑소좀은 혈액 또는 소변으로부터 분리될 수 있으나 이에 제한되지 않고, 상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 mRNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 유방암의 조기 진단용 다중 유전자 바이오마커 선별
1-1. 분자아형 별 유방암 세포주 배양
분자아형 별 유방암 세포주를 아래 [표 1]와 같이 한국 세포주 은행에서 구매 후 배양하였다.
Molecular subtype Breast cancer cell line
ER+/PR+/HER2- MCF7, T47D (Luminal A)
ER+/PR+/HER2+ BT474, ZR-75-1 (Luminal B)
ER-/PR-/HER2+ SK-BR3, MDA-MB-453 (HER2 type)
ER-/PR-/HER2- MDA-MB-231, BT20(Triple negative/basal-like)
배양 조건은 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 1% penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)을 사용하여 5% CO 2, 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.
1-2. 유방암 세포주 유래 엑소좀 추출
유방암 세포주가 분비하는 엑소좀을 추출하기 위해서, 엑소좀이 제거된 FBS(exosome-depleted FBS)가 포함된 세포배양액을 사용하였다. 배양액을 교체하기 전에 PBS(Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)로 2번 세척(washing)하였으며, 배양액을 교체한 후 48시간 동안 5% CO 2, 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양함으로써 엑소좀 농축을 유도하였고, amicon Ultra-15 centrifugal filter(ultracel-3K)를 이용하여 배양액 부피를 1/10로 농축한 후, SBI Exoquick TC시약을 이용해서 엑소좀을 얻었다.
1-3. 엑소좀 내 RNAs 추출
㈜제놀루션에서 생산 판매하는 엑소좀 내 RNA 추출시약을 사용하여 엑소좀 내 RNA를 추출하였다. 이 때 엑소좀 내 RNA를 추출하는 원리는 배양액 내의 엑소좀을 분해(lysis)시키고, 엑소좀에서 흘러나온 단백질, DNA, 및 RNA(mRNA, miRNA, rRNA 등) 중에서 RNA만을 분리하였으며, 이 때 단백질과 DNA가 오염되지 않도록 최적화하여 순도를 높이고 RNAs 추출 농도(RNA prep yield)를 극대화할 수 있는 추출과정(protocol)을 구축하였다.
1-4. 추출한 엑소좀 내 RNA 정량
유방암 세포주 배양액에서 추출한 엑소좀 내 RNA 농도를 정량하기 위해서 nano-drop(260nm 파장에서 흡광도)을 사용하여 농도 측정을 하였으며, 260/280 ratio와 260/230ratio를 통해 RNA 순도 및 오염도를 확인하여 정상 범위 내에 속하는 RNA를 실험에 사용하였다.
1-5. qRT-PCR(quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)
유방암 세포주 유래 엑소좀 RNA 100ng을 template로 하여 역전사 반응(reverse transcription)과 cDNA 증폭과정(polymerase chain reaction)을 one-step으로 진행하는 Bioline사 제품인 One-step qRT-PCR 시약(SensiFAST TM Probe Lo-ROX One-Step Kit)을 사용하였으며, 각 유전자 probe는 IDT(Integrated DNA Technologies)사 제품으로써, 정보는 아래 [표 2]와 같다.
유전자 name IDT사 cat no.(assay name)
Target gene(IDT사 Probe cat no.)
① ANT2 Hs.PT.56a.39886014.g
② VDAC1 Hs.PT.58.2339327.g
③ HCCR-1 Hs.PT.58..1837203
④ Caveolin-1 Hs.PT.56a.40058555.g
⑤ β-catenin Hs.PT.58.3699397
⑥ TGF-β3 Hs.PT.58.27186053.g
Internal control gene(RNA 표준화)
⑦ b-actin Hs.PT.56a.40703009.g
⑧ 18S rRNA Hs.PT.39a.22214856.g
실험에 사용된 real-time PCR 장비는 ABI사 StepOne plus 장비를 사용하였으며 모든 샘플은 결과의 신뢰도를 높이기 위해 duplicate로 진행하였다.
1-6. 선별 및 분석 결과
유방암 조기진단 바이오마커 후보로 암의 생성 및 증식(tumor initiation and proliferation)에 관여하는 유전자, 암의 진행(tumor progression)에 관여하는 유전자, 종양 면역반응(tumor immune response)에 관여하는 유전자, 및 암 줄기세포(cancer stem cells)와 항암제 내성(chemoresistant)유전자 가운데 10여개의 후보 유전자를 선정하여 암 세포주 유래 엑소좀(cancer cell line-derived exosomes)을 대상으로 예비 실험을 진행하였으며, RNAs 농도 100ng 기준, real-time qRT-PCR Ct 값이 35이상인 유전자를 제외시키고, 유방암 세포주 유래 엑소좀에서 일정 수준 이상의 발현을 보이는 6개의 유전자를 선정하였다.
상기 6개의 유전자 중 ANT2 및 VDAC1 유전자는 암의 생성 및 증식에 관여하고, HCCR1 유전자는 암의 진행에 관여하고, TGF-β3는 종양 면역반응에 관여하며, caveolin-1 및 β-catenin 유전자는 암 줄기세포와 항암제 내성에 관여한다.
상기 선정된 6개의 유전자를 유방암 분자아형 별 세포주 2개씩(MCF7,T47D / BT474,ZR-75-1 / SK-BR3,MDA-MB453 / MDA-MB-231,BT20)에서 독립적으로 3회 이상 발현 수준을 분석하였다. 이 때 RNAs 농도를 정규화(normalization)하기 위한 internal control(housekeeping gene) 유전자로는 2개의 유전자(b-actin 및 18S rRNA)를 사용하였으며, 각 유전자의 발현이 가장 낮은 아형의 발현을 1로 정하여 상대적 발현 수준을 비교하였다.
분석 결과, 반복적으로 6개의 타겟 유전자 중 5개의 유전자가 특정 분자아형에서 의미 있는 차이를 보이는 결과를 얻음으로써, 유방암 분자아형 별 조기진단에 매우 유용한 바이오마커로서의 기능을 할 것이라 기대된다 .
구체적으로, 도 1에 나타난 바와 같이, 암의 생성 및 증식에 있어서 중요한 역할을 하는 ANT2 및 VDAC1 유전자의 경우, ER 및 PR 양성과 HER2 양성에서 각각 양의 상관관계를 보였으며, 암의 진행에 관여하는 HCCR1 유전자의 경우, ER 및 PR 양성과 양의 상관관계를 보였다. 또한, 암 줄기세포와 항암제 내성에 중요한 기능을 하는 caveolin-1 및 β-catenin의 경우 triple negative 분자아형(ER-PR-HER2-)과 깊은 상관관계를 예상하였으나 기대와 달리 caveolin-1만 triple negative 분자아형에서 특이적으로 높은 발현이 관찰되었으며, TGF-β3의 경우는 HER2 양성과 양의 상관관계를 보였다.
이를 종합해보면, 유방암의 분자아형 Luminal A 타입(ER+/PR+/HER2-)의 경우 ER 및 PR만 양성이므로 ANT2, VDAC1, 및 HCCR1 유전자와 양의 상관관계를 나타내었으며, 따라서, 상기 3개의 유전자가 Luminal A 타입 관련 유전자 마커임을 확인할 수 있었다. 또한, 유방암의 분자아형 Luminal B 타입(ER+/PR+/HER2+)의 경우 ER 및 PR은 양성이고, HER2 또한 양성이므로, HER2 음성인 경우 HCCR1유전자는 양의 상관관계가 보이지 않아 제외되는 대신, TGF-β3의 경우는 HER2 양성과 양의 상관관계를 보이므로, ER, PR 양성과 HER2 양성과 양의 상관관계에 있는 ANT2, VDAC1 및 TGF-β3 유전자가 Luminal B 타입 관련 유전자 마커임을 확인할 수 있었다.
또한, 유방암의 분자아형 HER2 type(ER-/PR-/HER2+)의 경우 HER2만 양성이므로, HER2와 양의 상관관계에 있는 ANT2, VDAC1 및 TGF-β3 유전자 역시 HER2 type 관련 유전자마커임을 확인할 수 있고, 마지막으로 유방암의 분자아형 Triple negative/basal-like 타입의 경우는 ER, PR, HER2 모두 음성이므로, caveolin-1 유전자만이 특이적으로 높게 발현이 되었는바, caveolin-1 유전자가 Triple negative/basal-like 타입의 유전자마커임을 확인할 수 있었다.
최종적으로 분자아형 별로 가장 뚜렷한 차이를 보이는 5개의 유전자 마커를 아래 [표 3]에 정리하였다.
Molecular subtype 유전자
ER+/PR+/HER2- ANT2, VDAC1 HCCR1
ER+/PR+/HER2+ ANT2, VDAC1 TGF-β3
ER-/PR-/HER2+ ANT2, VDAC1 TGF-β3
ER-/PR-/HER2- Cav-1
상기 5개의 유전자 조합은 분자아형 별 유방암 조기 진단을 가능하게 할 뿐만 아니라, 높은 검출 감도의 기술적 특징으로 유방암 치료 후 재발여부를 모니터링 하는데 매우 유용하게 사용될 것이라 기대된다. 이에 더하여, 치료예후가 가장 나쁜 triple negative 분자아형에서 특이적으로 발현되는 유전자 바이오마커의 발현수준은 유방암 치료 예후를 간접적으로 예측할 수 있을 것이라 기대된다.
실시예 2. 정상인과 유방암의 조기 진단용 다중 유전자 바이오마커 비교
2-1. 건강인과 암 환자 혈액 샘플 준비
본 연구에서 사용된 건강인과 암 환자 혈액 샘플은 냉동(-80℃)보관된 샘플로, SST 튜브에 채혈한 혈청(serum)을 사용하였다. 구체적으로, 건강인의 경우 암 단백 진단용 바이오마커가 정상범위인 샘플을 사용하였으며, 암 환자의 경우 대학병원에서 암 진단(확진)을 받은 샘플을 사용하였다. 엑소좀 내의 RNA를 추출하기 위해 필요로 하는 혈청의 최소 부피는 200ul이며 샘플은 유방암 환자 pooling 샘플을 아래와 같이 준비하였다.
건강인 혈청 남성 5명의 샘플을 각각 200ul씩 합쳐서 1ml로 준비
여성 5명의 샘플을 각각 200ul씩 합쳐서 1ml로 준비
유방암 혈청 stage 1 & 2 5명의 샘플을 각각 200ul씩 합쳐서 1ml로 준비
stage 3 & 4 5명의 샘플을 각각 200ul씩 합쳐서 1ml로 준비
위와 같이 준비된 샘플은 200ul씩 분주하여 -80℃에 보관하였으며, 모든 샘플이 동일하게 1번의 freezing과 thawing을 거치는 것을 원칙으로 하였다.
2-2. 엑소좀 내의 RNAs 추출
건강인과 유방암 환자 혈청을 대상으로 엑소좀 내의 RNA를 추출하기 위해서는 ㈜제놀루션에서 생산 판매하는 자동화 장비인 Nextractor®NX-48을 사용하였으며 시약은 장비에 가장 적합한 동일한 회사 제품의 엑소좀 내 RNA 추출시약을 사용하였다. 엑소좀 내 RNA를 추출하는 원리는 실시예 1-3에 기재된 바와 동일하다.
2-3. 추출한 엑소좀 내의 RNA 정량
혈청에서 자동화 장비로 추출한 엑소좀 내 RNA 농도를 정량하는 방법은 실시예 1-4에 기재된 바와 동일하다.
2-4. qRT-PCR(quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)
혈청에서 추출한 exo RNA 100ng을 template로 하여 실시예 1-5와 동일한 방법으로 qRT-PCR를 수행하였다.
2-5. 비교결과
도 2에 나타난 바와 같이, 유방암 유래 엑소좀에서 확보한 5개의 바이오마커 유전자를 건강인과 유방암환자 pooling 샘플을 대상으로 발현 수준을 확인한 결과, 정상인과 유방암 환자 사이에서 유의미한 차이를 나타내었다.
이때, 분자아형 별 pooling 샘플이 아닌 triple negative에 해당하는 caveolin-1은 정상인과 유방암 환자 사이에서 상대적으로 낮은 차이를 나타내었다. 따라서, 분자아형 별 샘플에서 다시 확인해 볼 필요가 있으며, 유방암 분자아형과 상관없이 가장 큰 차이를 보이는 ANT2 및 VDAC1이 유방암 조기진단에 유용할 것이라 판단된다.
실시예 3. 다중 유전자 바이오마커를 통한 유방암 치료 후 재발여부 모니터링 가능성 확인
이 기술이 유방암 재발 모니터링에 유용하다는 과학적 근거가 되는 검출 민감도를 실험적으로 증명하고자 정상 혈액에 유방암 세포주(MDA-MB-231: ER-/PR-/HER2-)를 스파이크 테스트하여 검출 가능한 암 세포 수를 예측해 보았다.
몸무게 60kg의 여성의 혈액이 3.6L라 가정할 때, 1cm 3 사이즈의 종양(암 세포 수: 1x10 9)이 존재하는 경우, 혈액 1ml에는 2.22x10 6개의 암세포가 분비하는 엑소좀이 존재한다고 가정하였다
Figure PCTKR2019007906-appb-img-000001
일반적으로 혈액 1ml을 원심분리하면 약 0.5ml의 혈청을 얻게 되므로 1cm 3 사이즈의 종양이 존재하는 인위적인 조건으로 건강인 혈청 0.25ml에 유방암 세포주 1x10 5~1x10 7개가 48시간 동안 분비한 엑소좀을 스파이크 테스트 했을 때 유전자 분석이 가능한 범위를 확인해 보았다.
Figure PCTKR2019007906-appb-img-000002
스파이크 테스트에 사용한 유방암 세포주 유래 엑소좀은 MDA-MB-231(ER-/PR-/HER2-)세포가 분비하는 엑소좀이므로, 분석하는 유전자는 caveolin-1로 실시하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 5x10 5개 이상의 유방암 세포주(MDA-MB-231)가 48시간 동안 분비한 엑소좀을 스파이크 테스트 한 경우에 real-time PCR의 Ct 값이 35미만으로서, 유전자 검출 가능한 범위인 것으로 판단되었다(일반적으로 real-time PCR의 Ct 값이 35이상인 경우는 유전자 발현값을 신뢰하지 않는다). 실제로 종양을 가지고 있는 경우 혈액 내 엑소좀은 48시간보다 더 오랜 시간 동안 축적이 되므로, 실제로 이 기술은 1cm 3 미만 크기의 종양을 가지고 잇는 검사자를 구별할 수 있는 높은 검출 감도의 기술로서, 단순히 유방암 조기진단에 활용될 수 있을 뿐만 아니라 유방암 치료 후 재발여부를 모니터링 하는데 매우 유용할 것으로 예측된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 유방암 분자아형 별 조기 진단에 적용 가능한 최소한의 다중 암 유전자 바이오마커 기술을 이용할 경우, 4가지 분자아형의 유방암을 조기 진단하는 것을 가능하고, 발현 정도에 따라 유방암 진행 정도를 판단할 수 있으며, 높은 검출 감도의 기술적 특징으로 엑소좀 내 다중 유전자 발현 분석을 이용하여 유방암 치료 후 재발여부를 모니터링 하는 것이 가능하다. 이에 더하여, 현재 시행되는 유방암 재발 모니터링을 위한 정기검진 검사 항목은 고비용일 뿐만 아니라, 검사자의 불편함을 초래하고, 많은 시간을 필요로 한다는 단점이 있지만, 본 발명에서 개발되는 제품은 높은 검출도로 저비용으로 검사자의 고통 없이 간단하고 짧은 시간에 결과를 얻을 수 있다는 면에서 매우 유용하므로, 유방암 치료 후 재발여부 모니터링을 위한 유전자 체외진단용 의료기기 개발에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (29)

  1. (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유방암은 Luminal A, Luminal B, HER2 type, 및 Triple negative/basal-like으로 이루어진 분자아형(molecular subtype) 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 HCCR1 유전자의 mRNA 수준이 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal A 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal A 타입 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 분자아형 Luminal A 타입은 ER-양성(Estrogen Receptor-positive), PR-양성(Progesterone Receptor-positive), 및 HER2-음성(Human Epidermal growth factor Receptor 2-negative)인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal B 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal B 타입 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분자아형 Luminal B 타입은 ER-양성, PR-양성, 및 HER2-양성인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 HER2 type 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 HER2 type인 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 분자아형 HER2 type은 ER-음성, PR-음성, 및 HER2-양성인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 카베올린-1 유전자의 mRNA 수준이 ANT2, VDAC1, HCCR1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암의 조기 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 분자아형 Triple negative/basal-like 타입은 ER-음성, PR-음성, 및 HER2-음성인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피검자는 유방암 환자인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  13. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ANT2 및 VDAC1 유전자는 암의 생성 및 증식에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  14. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HCCR1 유전자는 암의 진행에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  15. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TGF-β3 유전자는 종양 면역반응에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  16. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 카베올린-1 및 베타-카테닌 유전자는 암 줄기세포 및 항암제 내성에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  17. 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암의 조기 진단용 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 엑소좀은 혈액 또는 소변으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 mRNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  20. 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암의 조기 진단용 키트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 엑소좀은 혈액 또는 소변으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 키트.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 mRNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 키트.
  23. (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암이 재발된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암 치료 후 재발 모니터링 방법.
  24. 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 엑소좀(exosome)을 이용한 유방암 치료 후 재발 모니터링 키트.
  25. (a) 정상인 및 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome)으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(Adenine nucleotide translocase 2; ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(Voltage-dependent anion-selective channel 1; VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌(β-catenin), 및 형질전환성장인자 베타 3(transforming growth factor-beta 3; TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2 및 VDAC1 유전자의 mRNA 수준이 정상인에 비하여 증가되었을 때 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암의 조기 진단방법.
  26. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 HCCR1 유전자의 mRNA 수준이 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal A 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal A 타입 유방암의 조기 진단방법.
  27. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Luminal B 타입 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Luminal B 타입 유방암의 조기 진단방법.
  28. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1, 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 ANT2, VDAC1, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준이 HCCR1, 카베올린-1, 및 베타-카테닌 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 HER2 type 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 HER2 type인 유방암의 조기 진단방법.
  29. (a) 피검자의 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀으로부터 mRNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 mRNA를 주형으로 하여 아데닌 뉴클레오티드 전위효소 2(ANT2), 전압-의존적 음이온 선택성 채널1(VDAC1), HCCR1(Human Cervical cancer oncogene), 카베올린-1(caveolin-1), 베타-카테닌, 및 형질전환성장인자 베타 3(TGF-β3) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 카베올린-1 유전자의 mRNA 수준이 ANT2, VDAC1, HCCR1, 베타-카테닌, 및 TGF-β3 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가되었을 때 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암으로 판정하는 단계를 포함하는, 분자아형 Triple negative/basal-like 타입인 유방암의 조기 진단방법.
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