WO2020022847A1 - 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

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문혜연
장희정
정선아
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Definitions

  • the invention cholesterol by introducing the codon optimized recombinant yeast strain, its preparation method and relates to the use, and more particularly, to a defect the ERG5 and ERG6 gene and DHCR24 and DHCR7 gene multiple or codon context system having a sterol-producing ability And a recombinant yeast strain capable of producing a high yield of cholesterol precursors, and a method and use of the same. Furthermore, the present invention includes a method and a method for producing a recombinant yeast strain in which the yield of cholesterol and cholesterol precursors is increased by further introducing tHMG1 , ERG2 , ERG3 , ERG27 , or UPC2-1 gene into the recombinant yeast strain.
  • Yeast is of interest as a host that can be expressed by introducing a variety of secondary metabolite biosynthetic pathways.
  • Secondary metabolites produced by various living organisms, are a major source of high value-added chemicals and in many cases have important medicinal properties.
  • plant metabolites prevent the infection of bacteria, viruses and fungi through the function of antioxidants or antibiotics, and also have high demands for mass production technology utilizing microorganisms because they are useful as therapeutics for human health.
  • Yeast which has its own secondary metabolic biosynthetic pathways, does not interfere or compete with foreign metabolic pathways introduced through genetic engineering. There is an advantage in that it is possible to obtain comprehensive information about the physiological state.
  • yeast is a suitable host for the expression of foreign enzymes, such as cytochrome P450, which must be expressed in organelles such as endoplasmic reticulum and mitochondria, and is capable of post-translational modifications essential for enzymatic activity from plants and animals. It is also an advantage over prokaryotic microbial hosts. Cholesterol is a very important bioconstituent in mammals.
  • the present invention is to provide a recombinant yeast strain capable of producing cholesterol and its precursors in high yield.
  • the present invention provides a recombinant yeast strain having a sterol (cholesterol and cholesterol precursor) production capacity.
  • the present invention provides a method for producing a recombinant yeast strain having the sterol (cholesterol and cholesterol precursor) production capacity and its use.
  • the present invention provides a recombinant yeast strain having a sterol producing ability in which the ERG5 and ERG6 genes are deleted and the DHCR24 and DHCR7 genes are introduced.
  • a copy number of one or more genes of the DHCR24 and DHCR7 genes may be introduced in multiple or codon optimized DHCR24 and DHCR7 synthetic genes may be introduced in one or more copies.
  • the copy number of one or more genes of the DHCR24 and DHCR7 genes may be 2 to 10. More preferably, it may be 4-7. If the gene copy number is less than 2, it is difficult to achieve the expected effect. If the gene copy number is greater than 10, the effect is not changed.
  • One or more genes selected from the group consisting of tHMG1, ERG3, ERG2, ERG27, and UPC2-1 genes may be further introduced into the recombinant yeast strain.
  • the recombinant yeast strain was synthesized encoding the ERG27-ERG2 fusion protein. Genes may be further introduced.
  • the genes are introduced into the ERG6 gene spot, the DHCR7 gene can be introduced into the ERG5 locus.
  • the gene introduction site as described above can produce cholesterol and cholesterol precursors in a higher yield, there is an effect that the by-products such as ethanol and acetate (acetate) does not accumulate.
  • the sterol may comprise one or more of both cholesterol precursors or cholesterol.
  • the cholesterol precursor may include one or more selected from the group consisting of geosterol, dihydrocholesterol, lasosterol, dihydrodesosterol and desostosterol.
  • the recombinant strain is a nutritional selection marker that includes the N-terminal fragment gene, insertion target gene, and promoter region of Sacchoromyces cerevisiae ribosomal DNA nontranscribed spacer (rDNA NTS).
  • the gene and the C-terminal fragment gene of Sacchoromyces cerevisiae rDNA NTS can be prepared in sequence using a multi-insertion cassette.
  • the N terminal fragment gene of the rDNA NTS of the gene multiple insertion cassette is represented by SEQ ID NO: 1 (cacaagaggt aggtcgaaac agaacatgaa agttggtcgg taggtgc), and the C terminal fragment gene of the rDNA NTS is represented by SEQ ID NO: 2 (ggttttgcac catatcttca taacctgtca ccttgaaact acctctggc) Can be.
  • the auxotrophic selection marker the marker gene is SEQ ID NO: 3 LEU2 gene, SEQ ID NO: including the URA3 gene, SEQ ID NO: promoter region represented by 4 (ttacctttta catttcagca a) comprises a promoter, which is expressed as (gaaacgaaga taaatc) 5 ( cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag) it may be a TRP1 gene that contains the promoter region represented by the HIS3 gene or SEQ ID NO: 6 (tattgagcac gtgagtatac gtgattaagc acacaaaggc agcttggagt) containing a promoter region represented by.
  • the DHCR24 gene and the DHCR7 gene may be codon optimized in a Codon Adaptation Index method or a codon context method.
  • the DHCR7 gene optimized by the Codon Adaptation Index method may be configured as SEQ ID NO: 9, and the DHCR24 gene may be configured as SEQ ID NO: 10.
  • the codon optimized DHCR24 gene in a codon context manner may consist of SEQ ID NO: 17 and the DHCR7 gene may consist of SEQ ID NO: 18.
  • the recombinant yeast strain may be one to which tHMG1 gene is additionally introduced.
  • the present invention includes the step of introducing the DHCR24 and DHCR7 gene after the deletion of the ERG5 and ERG6 gene of the yeast strain, the multiple copy number of one or more of the DHCR24 and DHCR7 gene Characterized in that, there is provided a method for producing a recombinant yeast strain having sterol production capacity.
  • the yeast strain may be Sacchoromyces cerevisiae .
  • the DHCR24 and DHCR7 gene introduction is a nutritional selection marker that includes the N-terminal fragment gene, insertion target gene, and promoter region of Saccharomyces cerevisiae ribosomal DNA nontranscribed spacer (rDNA NTS).
  • the gene and the C-terminal fragment gene of Saccharomyces cerevisiae rDNA NTS can be performed in sequence using a gene multiple insertion cassette. Details are as described above.
  • the present invention provides a method for producing a sterol by culturing the recombinant yeast strain in a medium.
  • the culture may be performed for 2 to 10 days at 25 ⁇ 35 °C.
  • ERG5 and ERG6 gene is deficient, DHCR24 and DHCR7 gene recombinant strain introduced into the multiple, or ERG5 and ERG6 gene is deficient, and the codon optimized DHCR24 and DHCR7 gene by codon context scheme introduced recombinant strain It is possible to produce cholesterol and its precursors in high yield.
  • the present invention relates to a method and a method for producing a recombinant yeast strain having increased yields of cholesterol and cholesterol precursors by additionally introducing a tHMG1 , ERG2 , ERG3 , ERG27 , or UPC2-1 gene into the recombinant yeast strain.
  • Figure 1 shows the cholesterol biosynthetic pathway of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the manufacturing process of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention.
  • (a) A schematic diagram of the production of recombinant yeast strains # 19 (erg5 :: D24 / erg6 :: D7) and # S1 (erg6 :: D24 / erg5 :: D7) and a recombinant yeast strain in which DHCR24 was multi-inserted.
  • Figure 3 shows the manufacturing process of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the vector used in the production of recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention.
  • NTS D24 / # 19 NTS D24 / erg5 :: D24 / erg6 :: D7
  • NTS D24 / # S1 NTS D24 / erg6 :: D24 / erg5
  • the production of cholesterol of D7) and its precursors was analyzed by HPLC-UV / Vis analytical chromatogram (DD: dihydrodesosterol, D: desmosterol, Z: geosterol, C: cholesterol).
  • FIG. 9 is a result of newly constructed HPLC-CAD based LC chromatogram analysis, which analyzes the production of cholesterol and precursors of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention.
  • A LC chromatograms for three standards (1: zymosterol, 2: ergosterol, 3: cholesterol),
  • B four standards (4: 7-dihydrodesosterol, 5: desmosterol, 6: LC chromatogram for 7-dihydrocholesterol, 7: lasosterol
  • C wild-type strain (CEN.PK)
  • D recombinant strain # 19 (erg5 :: D24 / erg6 :: D7)
  • FIG. 10 is a result of analyzing the sterol profile of the ARE2 deficient strain prepared according to an embodiment of the present invention.
  • DD dihydrodesosterol
  • D desmosterol
  • Z geosterol
  • C cholesterol
  • 11a to 11c analyze the relationship between the copy number and the sterol yield of recombinant yeast strains prepared according to one embodiment of the present invention.
  • 11D shows the sterol profile of the erg6 :: D7 / UPC2-1 / NTS D24D7 strain by HPLC-UV / Vis. *: Unknown peak, DD: dihydrodesosterol, D: desostrolol, Z: geosterol, C: cholesterol
  • Figure 12 is a comparative analysis of the characteristics of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention: (a) a vector comprising a cassette used for the production of recombinant strain NTS D7 / NTS D24 / # S1. (b) Analysis of results according to the number of insert cassettes of recombinant strain NTS D7 / NTS D24 / # S1 (qPCR analysis). (c) Results of analysis of cholesterol and precursor production thereof of recombinant strain NTS D7 / NTS D24 / # S1 (HPLC-UV / Vis assay chromatogram).
  • Figure 13 is a comparative analysis of the characteristics of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention: (a) ⁇ (d) a vector containing a cassette used for the production of recombinant strains # cc19, # ccS1. (e) Results of analysis of cholesterol and precursor production of recombinant strains # cc19 and # ccS1 (HPLC-UV / Vis analysis chromatogram).
  • Figure 14 is a comparative analysis of the characteristics of the recombinant yeast strain according to an embodiment of the present invention: (a) a vector containing a tHMG1 multi-insertion cassette used for the production of recombinant strains tHMG1 / # cc19, tHMG1 / # ccS1. (b) Result analysis according to the number of multiple inserted tHMG1 cassettes of recombinant strains tHMG1 / # cc19, tHMG1 / # ccS1 (qPCR analysis). (C) Results of analysis of cholesterol and precursor production of recombinant strains tHMG1 / # cc19 and tHMG1 / # ccS1 (HPLC-UV / Vis analysis chromatogram).
  • This example was performed to manufacture recombinant yeast strains that produce cholesterol of animal cells and precursors of cholesterol instead of ergosterol, a yeast specific sterol.
  • a recombinant yeast strain having a cholesterol biosynthesis pathway was produced by blocking the final biosynthesis step of ergosterol and introducing a cholesterol biosynthesis-exogenous gene for Saccharomyces cerevisiae in traditional baker's yeast Saccharomyces cerevisiae (FIG. 1).
  • Specific strategies of this example include the C-22 sterol desaturase genes ERG5 and 24-carbon methyl, which are involved in the formation of ergosterol specific structures 22-carbon double bonds.
  • ERG3 (Delta (7) -sterol 5 (6) -desaturase )
  • ERG2 (C-8 sterol isomerase)
  • ERG27 (3-keto) can be used to more efficiently convert the ergosterol biosynthetic pathway to the cholesterol precursor biosynthetic pathway.
  • -steroid reductase and ergosterol biosynthetic pathway regulatory transcription factor UPC2-1 (Uptake Control Protein 2-1) was further introduced to prepare a recombinant strain (Fig. 2b).
  • Another method is to insert the DHCR7 and DHCR24 genes into the wild-type strain background first , and then add ERG3, ERG2, ERG27 and ergosterol biosynthetic pathway control transcription factors UPC2-1 , and then disrupt ERG6 to disrupt the cholesterol producing strain.
  • ERG3, ERG2, ERG27 and ergosterol biosynthetic pathway control transcription factors UPC2-1 was prepared (FIG. 3A).
  • the tHMG1 gene was further introduced multiplexed into the host chromosome to amplify the Mevalonate pathway, the precursor biosynthetic pathway of the ergosterol biosynthetic pathway (FIG. 3b).
  • ERG5, ERG6 , DHCR7, DHCR24, ERG3, ERG2, ERG27 , ARE2, ERG27-ERG2 , UPC2-1 , tHMG1 are SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 may be composed of the sequence shown.
  • ERG27-ERG2 fusion gene sequence (SEQ ID NO: 15, Underlined: ERG2 part )
  • SC medium Synthetic Complete medium; 0.67% yeast nitrogen base without amino acids (BD, 291940), 2% glucose (JUNSEI, 64220S0650), 0.77 g / L all required Drop-out amino acid mixture supplemented with all required amino acids (CLONTECH, 630425)
  • TITEC Water bath
  • HPLC-CAD system Thermo scientific, Dionex Ultimate 3000- Corona Veo RS
  • Primer used in this experiment Primer Sequence (5 '-> 3') erg5 dN fw ACATGCATGCCGCTATTGAAGAGAGCTCATG (SEQ ID NO: 20) erg5 dN rv GCGGCCGCGGGTCTAGAGGGGGATCCCCAGGATACTGAAGGCAGTAG (SEQ ID NO: 21) erg5 dC fw GGATCCCCCTCTAGACCCGCGGCCGC CATGATTACCTTCGCCGCTTTG (SEQ ID NO: 22) erg5 dC rv CGACGCGT GCTGGCAGGGTGAGTATTTG (SEQ ID NO: 23) erg6 dN fw ACGTGCATGCGCTGTTGCCGATAACTTCTTC (SEQ ID NO: 24) erg6 dN rv GCGGCCGCGGGTCTAGAGGGCTCGAGGGGATCCCTCAATTCTGTTTCACTCATC (SEQ ID NO: 25) erg6 dC f
  • Plasmid used in this experiment Plasmid Description Reference pT-ERG5dNC pGEM-Teasy vector containing ERG5 N and C partial fragments this study pT-ERG6dNC pGEM-Teasy vector containing ERG6 N and C partial fragments this study pMKRQ-DrDHCR24 pMKRQ containing S. cerevisiae -codon optimized zebrafish DHCR7 Daewoong pMKRQ-DrDHCR7 pMKRQ containing S.
  • YPD Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), D-glucose (Glucose) 2% (w / v)
  • Glucose 2% (w / v)
  • Strains precultured in liquid medium were incubated at 180 rpm in a 30 mL shake incubator at 50 ° C with an initial OD 600 of 0.2 in a 500 mL baffled flask. After culturing until 600 value is 1.0, it was centrifuged for 10 minutes at 4,000 rpm at 4 ° C.
  • LiAc / TE buffer solution (0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5). 1 mL was added and suspended by pipetting and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to obtain a precipitate, which was then suspended in 500 ⁇ L of LiAc / TE buffer solution to prepare competent cells. Divide into 5 aliquots, and add 2 ⁇ L of recombinant vector or cassette, 10 ⁇ L of salmon sperm DNA, PEG / LiAc buffer into each tube.
  • Example 1 ERG5 , ERG6 Deficit DHCR24 , DHCR7 Production of Sterol Production Strains by Simultaneous Insertion
  • N fragments and C fragments for which homologous recombination will occur for ERG5 and ERG6 deficiency are identified as erg5 dN fw, erg5 dN rv, erg5 dC fw, erg5 dC rv, erg6 dN fw, erg6 dN rv, erg6 N, C 2 PCR fragments were obtained using the dC fw and erg6 dC rv primers, and the fragments were subjected to fusion polymerase chain reaction (Fusion-PCR) to obtain pT-ERG5dNC and pT-ERG6dNC.
  • Fusion-PCR fusion polymerase chain reaction
  • DHCR24 and DHCR7 genes of zebrafish it derived codon optimized for yeast codon adaptation index (Codon Adaptation Index) method is cloning from pMKRQ-DrDHCR24, pMKRQ-DrDHCR7 by PCR recovering DHCR7, DHCR24 DNA fragments, and also by PCR The resulting 411 bp TEF1 promoter and 314 bp GAL7 terminator were ligation to construct pT-DHCR24, pT-DHCR7 vectors, and then the TEF1p-DHCR7-GAL7t and TEF1p-DHCR24-GAL7t fragments were obtained from the vector.
  • Codon Adaptation Index Codon Adaptation Index
  • the final vector pT-erg5 : DHCR24-LEU2, by inserting the Kl URA3 , Kl LEU2 from the pUG73, pUG72 vector into the NotI position by inserting it into the BamHI / XbaI position among the N and C fragments of the pT-ERG5dNC and pT-ERG6dNC vectors.
  • pT-erg6 :: DHCR7-URA3
  • pT-erg6 :: DHCR24-LEU2
  • pT-erg5 :: DHCR7-URA3 were obtained (FIG. 4A, B, C, D).
  • the final vector was subjected to SphI / MluI treatment to recover the erg5 :: DHCR24-LEU2, erg6 :: DHCR7-URA3, erg6 :: DHCR24-LEU2, erg5 :: DHCR7-URA3 cassettes, and transformed the CENPK strain into the LiAc / PEG method.
  • NTS-DHCR24-86TRP1 cassette was constructed using rDNA-NTS based multiinsertion cassette system (Moon et al., 2016) developed by our team.
  • the pT-NTS-DHCR24-86TRP1 (FIG. 4E) prepared by inserting the TEF1p-DHCR24-GALt7 fragment obtained from pT-erg6 :: DHCR24-LEU2 into the BamHI position in the pT-NTS-86TRP1 vector was subjected to SphI / NsiI treatment.
  • KCTC 13889BP and erg6 :: D24 / erg5 :: D7 (# S1, accession no. KCTC 13888BP) recombinant strains were recovered after the DHCR24-86TRP1 cassette was recovered. It was then screened in SC-LEU-URA-TRP medium to prepare NTS D24 / # 19 and NTS D24 / # S1 recombinant strains (Fig. 2, step 2).
  • Example 3 DHCR24 Of DHCR7 Multiple Insert Fabrication and Recombinant Yeast Screening
  • PT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 vector containing DCHR24 and DHCR7 expression cassettes (FIG. 4F) was constructed using the ACT1p fw and ACT1p rv primers with a ScACT1 promoter of 837 bp and 1458 bp with DHCR7 fw2 and DHCR7 rv2 primers.
  • the DHCR7 gene, CYC1t fw and CYC1t rv primers amplified each of the 252 bp CYC1 terminator sites into a single fragment by fusion PCR, and then replaced the KpnI site with the existing pT-NTS-DHCR24-86TRP1 vector. Insert was made.
  • PT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 was recovered by treatment with SphI / NsiI to recover NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 cassette, and then transformed into erg5 :: D24 / erg6 :: D7 (# 19) recombinant strain.
  • NTS D24D7 / # 19 recombinant strain accesion No. KCTC 13884BP
  • NTS-101HIS3-DHCR7 cassette Treated with SpeI / XbaI to obtain NTS-101HIS3-DHCR7 cassette, and then transformed NTS D24 / # S1 strain by LiAc / PEG method, screened in SC-HIS medium and NTS D7 / NTS D24 / # S1 strain (Accession No. KCTC 13885 BP).
  • NTS D7 / NTS D24 / # S1 dielectric in the introduction cassette the resulting gene of DHCR7 of analyzing the introduced copies of the strain over the qPCR gene of about four DHCR24 is about two cassette It was confirmed that it was introduced (FIG. 12B).
  • Example 4 Episomal plasmid based DHCR24 Of DHCR7 Expression vector production
  • Y2pH-DHCR7-DHCR24 vector (Fig. 4g) is DHCR24 taken from the pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 Y2pH the vector-insert the DHCR7 the BamHI / XhoI position
  • the erg6 :: D24 / erg5 :: D7 (# S1) recombinant strain was then transformed in a LiAc / PEG method, and then screened in SC-LEU-URA-HIS medium to obtain a 2u D24D7 / # S1 recombinant strain ( 2, step 3, left panel).
  • ERG2, Y2pH-ERG3-ERG2 vector for ERG3 expression (Fig. 4f) produced is TDH3p fw and TDH3p rv primer 714 bp size ScTDH3 promoter and ERG3 fw and ERG3 rv primer ScERG3 gene of 1098 bp in size, TEF1t fw and TEF1t Amplify the 367 bp ScTEF1 terminator site with rv primers and make one fragment by fusion PCR, and use the TEF2p fw and TEF2p rv primers with a 836 bp ScTEF2 promoter and ERG2 fw and REF2 rv primers.
  • Preparation of Y2pH-ERG3-ERG27-2 fusion vector (Fig.
  • the produced Y2pH-ERG3-ERG2, Y2pH-ERG3-ERG27-2 fusion vectors were transformed into NTS D24D7 / # 19 strains, and then screened in SC-LEU-URA-TRP-HIS medium to select E3E2 / NTS D24D7 / # 19, E3E27-2 / NTS D24D7 / # 19 recombinant strain was constructed.
  • Example 7 erg6 :: D7 / UPC2-1 / NTS D24D7 strain production
  • the NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 cassette prepared above was transformed into CEN.PK wild type strain, and then screened in SC-TRP medium to obtain NTS D24D7 / WT recombinant strain. Thereafter, the prepared Y2pH-ERG3-ERG2, Y2pH-ERG3-ERG27-2 and YCpH-np-UPC2 were introduced to E3E2 / NTS D24D7 / WT, E3E27-2 / NTS D24D7 / WT, UPC2-1 / NTS D24D7 / WT strain was produced.
  • the UPC2-1 / NTS D24D7 / WT strain was selected to delete the ERG6 gene using the erg6 :: DHCR7-URA3 cassette to prepare the erg6 :: D7 / UPC2-1 / NTS D24D7 strain (FIG. 3).
  • Example 8 Sterol esterification major genes ARE2 Deletion strain production
  • N and C fragments were obtained by PCR using ARE2 dN fw, ARE2 dN fw, ARE2 dC fw, and ARE2 dC fw primers for ARE2 deletion using homologous recombination, followed by fusion PCR with the fragments.
  • PT-ARE2dNC Got was obtained by inserting ScHIS3 at the XhoI / EcoRV site between the two fragments, and the ARE2dNC-HIS cassette was obtained through SphI / MluI treatment, and then transformed into NTS D24D7 / # 19 strain by LiAc / PEG method.
  • SC-LEU-URA-TRP-HIS medium was selected to prepare the are2 ⁇ / NTS D24D7 / # 19 recombinant strain.
  • Example 9 cc Codon-Optimized by Codon Context DHCR24 , cc DHCR7 Using ERG5 , ERG6 Deletion and Simultaneous Insertion of DHCR24 / DHCR7 and Recombinant Yeast Screening
  • the final vector pT-erg5 :: ccDHCR24-LEU2, pT-erg6 :: ccDHCR7-URA3, pT-erg6 :: ccDHCR24-LEU2, pT-erg5 by taking Kl URA3 and Kl LEU2 from the pUG73 and pUG72 vectors :: ccDHCR7-URA3 was obtained (FIGS. 13A-D).
  • the final vector was treated with SphI / MluI to recover the erg5 :: ccDHCR24-LEU2, erg6 :: ccDHCR7-URA3, erg6 :: ccDHCR24-LEU2, erg5 :: ccDHCR7-URA3 cassettes, and then subjected to LiAc / PEG in the CEN.PK strain.
  • chromosome DNA was recovered and qPCR was performed using this chromosome DNA as a template.
  • Metabolism byproducts eg, ethanol, acetate
  • the sample used for analysis was the final culture solution, and the supernatant was analyzed by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes).
  • the analysis was performed using a bio process analyzer and analyzed using a ethanol, acetate, and glucose measurement kit (Roche / COWIE).
  • the mixed samples were collected by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes, 25 ° C.), and then dried, dried, and dissolved by adding 250 ⁇ L hexane to a dry pellet. After complete drying, HPLC analysis was performed on samples dissolved by adding 200 ⁇ L of acetone.
  • HPLC analysis the column used Cosmosil C18-PAQ (4.6 mm * 250 mm), the flow rate was 1 mL / min, the analysis solvent was 90% Acetonitrile, and the analysis time was 50 minutes (min). Peaks corresponding to cholesterol and precursors were analyzed at wavelength 203 nm using a UV / Vis detector.
  • the mixed samples were centrifuged (3,000 g , 5 minutes) and the supernatant was recovered. Extraction process by adding petroleum ether was repeated twice, and then proceeded to 3 mL to recover all the supernatant.
  • the collected supernatant was dried using a rotary vacuum concentrator, and HPLC-CAD analysis was performed on the sample dissolved by adding 1 mL of methanol (methanol) to the dried sample.
  • methanol methanol
  • a capsule was used as a Capsulepack (C18, 4.6 mm x 250 mm, 5 ⁇ m), methanol was used as the mobile phase, and flow rates and conditions are shown in the table below. Analysis time was 45 minutes (min).
  • Table 4 summarizes the production of cholesterol (cholesterol) and cholesterol precursors of the recombinant strain prepared by the above method.
  • Yeast plays a key role in aerobic growth of the ARE1 and ARE2 genes (Hohmann HP et. Al. 2017) that are involved in esterification and lipid droplet storage for the storage of excess intracellular sterols in yeast. Deletion of responsible ARE2 was attempted in NTS D24D7 / # 19 strain by gene disruption by homologous recombination (FIG. 10A). For the samples prepared by the extraction method in which the free cholesterol form was maintained, it was observed that the amount of cholesterol in the wild-type strain background was not significantly changed while the amount of dihydrodes-mosterol in the precursor was greatly reduced (FIG. 10B).
  • the first method for multi-NTS-DHCR24 DHCR7-86TRP1 cassette inserted in the wild type strain for insertion can increase the NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 cassette inserted in a multi-chromosome (chromosome) using the cassette out of the system before attempting strategy ERG6
  • chromosome multi-chromosome
  • HPLC-UV / Vis Analysis showed a significant decrease in the ergosterol peak in the seven inserted candidate groups ( NTS D24D7 / WT # 8), while showing the highest value of the peak estimated to be campesterol (FIG. 11b). Therefore, in the subsequent experiment, E3E2 / NTS D24D7 / WT, E3E27-2 / NTS D24D7 / WT strains were prepared using 7 inserted candidate groups ( NTS D24D7 / WT # 8), but HPLC-UV / Vis As a result of the analysis, the NTS D24D7 / WT strain did not show a significant difference.
  • the UPC2-1 / NTS D24D7 / WT recombinant strain increased ergosterol production rather than due to the activation of the overall ergosterol pathway (FIG. 11C).
  • HPLC-UV / Vis against the erg6 :: D7 / UPC2-1 / NTS D24D7 strain As a result, the cholesterol production was not superior to the NTS D24D7 / erg5 :: D24 / erg6 :: D7 ( NTS D24D7 / # 19) recombinant strain showing the highest production of cholesterol (Fig. 11d).

Abstract

본 발명은 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시키고 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 다중으로 또는 코돈 콘텍스트 방식으로 코돈 최적화하여 도입함으로써 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체를 높은 수율로 생산할 수 재조합 효모 균주와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 또한 상기 제작된 재조합 효모균주에 tHMG1, ERG2, ERG3, ERG27, 또는 UPC2-1 유전자를 추가로 도입시킴으로 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산 수율이 증가된 재조합 효모 균주 제조 방법 및 용도에 관한 것을 포함한다.

Description

스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도
본 출원은 2018년 7월 26일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0087372 호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시키고 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 다중으로 또는 코돈 콘텍스트 방식으로 코돈 최적화하여 도입함으로써 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체를 높은 수율로 생산할 수 있는 재조합 효모 균주와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 더 나아가 상기 제작된 재조합 효모균주에 tHMG1, ERG2, ERG3, ERG27, 또는 UPC2-1 유전자 등을 추가로 도입시킴으로 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산 수율이 증가된 재조합 효모 균주 제조 방법 및 용도에 관한 것을 포함한다.
효모는 다양한 이차대사산물 생합성 경로를 도입하여 발현시킬 수 있는 숙주로 관심을 받고 있다. 다양한 생명체들이 생산하는 이차대사산물은 고부가가치 화학화합물의 주요 공급처로서 많은 경우 중요한 의약적인 성질을 지니고 있다. 특히 식물의 대사산물들은 항산화제 또는 항생제 기능을 통해 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등의 감염을 막아주며, 또한 인체 건강에 유익한 기능성 물질로 치료제로서의 활용도가 높아 미생물을 활용한 대량생산 기술에 대한 수요가 높다. 이차대사 생합성 경로가 자체적으로 제한적인 효모는 유전공학을 통해 도입된 외래 대사 경로를 방해하거나 경쟁하지 않으며, 무엇보다 다양한 오믹스 분석 시스템이 잘 구축되어 있어 전사체와 대사체 분석을 통해 효모 숙주의 생리 상태에 대한 총체적인 정보를 확보할 수 있는 장점이 있다. 또한 대사과정에 대한 상세한 모델이 개발되어 변형된 대사 네트워크의 행동을 예측할 수 있는 인 실리코(in silico) 효모가 구축되어 있어 이를 활용한 인공 세포 디자인 및 제작이 더욱 용이한 점이 큰 장점이다. 더 나아가 단세포 진핵 미생물로서 효모는 소포체 및 미토콘드리아 같은 소기관에서 발현되어야만 활성을 갖게 되는 시트크롬(cytochrome) P450 같은 외래 효소 발현에 적합한 숙주이며, 식물 및 동물 유래의 효소 활성에 필수적인 단백질 번역 후 변형능이 있는 점도 원핵 미생물 숙주에 비해 갖는 장점이다. 한편 콜레스테롤은 포유동물에서 매우 중요한 생체구성 물질로서, 세포의 분열, 성장, 발육 및 분화의 조절에 관여하고, 각종 필수적인 대사 물질(예, 호르몬, 담즙산 등)의 전구체로 알려져 있으며 그 전구체가 발생 초기 및 노화과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 콜레스테롤 및 그 전구체를 높은 수율로 생산할 수 있는 재조합 효모 균주를 제공하고자 한다.
선행기술문헌
특허문헌
대한민국 등록특허 제10-0418187호
본 발명은, 스테롤 (콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체) 생산능을 갖는 재조합 효모 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스테롤 (콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체) 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법과 이의 용도를 제공한다.
본 발명은, ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고, DHCR24 및 DHCR7 유전자가 도입된 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주를 제공한다.
상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)가 다중으로 도입되거나 또는 코돈 최적화된 DHCR24와 DHCR7 합성 유전자가 한 카피 이상으로 도입될 수 있다. 여기서 상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)가 다중으로 도입되는 경우, DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자 카피수(copy number)는 2 ~ 10일 수 있다. 더욱 바람직하게는 4 ~ 7일 수 있다. 유전자 카피수가 2 미만인 경우에는 기대하는 효과를 구현하기 어렵고 10 초과 시에는 효과의 변화가 미미하다.
상기 재조합 효모 균주에는 tHMG1, ERG3, ERG2, ERG27 및 UPC2-1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 도입될 수 있다.
상기 재조합 효모 균주에는 ERG27-ERG2 융합 단백질을 코딩하는 합성 유전자가 추가로 도입될 수 있다.
상기 DHCR24 유전자는 ERG6 유전자 자리에 도입되고, 상기 DHCR7 유전자는 ERG5 유전자 자리에 도입될 수 있다. 상기와 같이 유전자 도입 위치를 구성하는 경우 콜레스테롤과 콜레스테롤 전구체를 보다 높은 수율로 생산할 수 있으며, 에탄올(ethanol)과 아세테이트(acetate)와 같은 부산물이 축적되지 않는 효과가 있다.
상기 스테롤은 콜레스테롤 전구체 또는 콜레스테롤 둘 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 콜레스테롤 전구체는 지모스테롤, 디하이드로콜레스테롤, 라쏘스테롤,디하이드로데스모스테롤 및 데스모스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 재조합 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 제조될 수 있다.
상기 유전자 다중 삽입 카세트의 rDNA NTS의 N 말단 단편 유전자는 서열번호 1(cacaagaggt aggtcgaaac agaacatgaa agttggtcgg taggtgc)로 표시되고, 상기 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자는 서열번호 2(ggttttgcac catatcttca taacctgtca ccttgaaact acctctggc)로 표시될 수 있다.
상기 영양요구성 선택 표지 마커 유전자는 서열번호 3(gaaacgaaga taaatc)으로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 URA3 유전자, 서열번호 4(ttacctttta catttcagca a)로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 LEU2 유전자, 서열번호 5(cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag)로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 HIS3 유전자 또는 서열번호 6(tattgagcac gtgagtatac gtgattaagc acacaaaggc agcttggagt)으로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 TRP1 유전자일 수 있다.
상기 DHCR24 유전자 및 DHCR7 유전자는 코돈 어댑테이션 인덱스 (Codon Adaptation Index) 방식 또는 코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화될 수 있다.
상기 코돈 코돈 어댑테이션 인덱스 (Codon Adaptation Index) 방식으로 최적화된 DHCR7 유전자는 서열번호 9로 구성되고, DHCR24 유전자는 서열번호 10으로 구성될 수 있다.
코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화된 DHCR24 유전자는 서열번호 17로 구성되고, DHCR7 유전자는 서열번호 18로 구성될 수 있다.
상기 재조합 효모 균주는 tHMG1 유전자가 추가로 도입된 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 효모 균주의 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시킨 후 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)를 다중으로 도입하는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae)일 수 있다.
상기 DHCR24 및 DHCR7 유전자 도입은, 사카로마이세스 세레비시애 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 수행할 수 있다. 구체적인 내용은 상기에서 설명한 바와 같다.
또한 본 발명은, 상기 재조합 효모 균주를 배지에 배양하여 스테롤을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 25 ~35℃에서 2 ~ 10일 동안 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고, DHCR24 및 DHCR7 유전자가 다중으로 도입된 재조합 균주, 또는 ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고 코돈 콘텍스트 방식에 의해 코돈 최적화된 DHCR24 및 DHCR7 유전자가 도입된 재조합 균주 에 의해 높은 수율로 콜레스테롤과 그 전구체들을 생산할 수 있다. 더 나아가 상기 제작된 재조합 효모 균주에 tHMG1, ERG2, ERG3, ERG27, 또는 UPC2-1 유전자를 추가로 도입시킴으로 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산 수율이 증가된 재조합 효모 균주 제조 방법 및 용도에 관한 것을 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 콜레스테롤 생합성 경로를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예예 따른 재조합 효모 균주의 제조 과정을 나타내는 것이다. (a)재조합 효모 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 제작 및 추가적으로 DHCR24가 다중삽입된 재조합 효모 균주 제작 모식도이다. (b) 재조합 효모 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7)에 추가적으로 DHCR24, DHCR7의 다중삽입 혹은 과발현 및 ERG3, ERG2, ERG27-2 fusion, UPC2-1 의 추가도입 재조합 효모 균주 제작 모식도 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 제조 과정을 나타내는 것이다. (a) 사카로마이세스 세레비시애 야생형 균주에 DHCR24, DHCR7 다중삽입 도입한 재조합 효모 균주 제작 및 추가적인 ERG3, ERG2, ERG27-2 fusion, UPC2-1 도입한 재조합 효모 균주 제작 및 erg6 결손과 동시에 DHCR24, 다중삽입 도입한 재조합 효모 균주 제작 모식도이다. (b) 코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화된 DHCR24(cc), DHCR7(cc)를 이용한 재조합 효모 균주 #cc19(erg5::ccD24/erg6::ccD7)와 #ccS1(erg6::ccD24/erg5::ccD7) 제작 및 추가적으로 N-말단이 일부 제거된 tHMG1가 다중삽입된 재조합 효모 균주 제작 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 제작 시 사용된 벡터를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주#19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7)의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다.(*:알 수 없는 피크(unknown peak), DD:디하이드로데스모스테롤(dehydrodesmosterol), D:데스모스테롤(desmosterol), Z:지모스테롤(zymosterol), C:콜레스테롤(cholesterol))
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 NTSD24/#19 (NTSD24/erg5::D24/erg6::D7) 및 NTSD24/#S1 (NTSD24/erg6::D24/erg5::D7)의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다(DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 NTSD24D7/#19 (NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7)의 삽입 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (b) 재조합 균주 #19와 NTSD24D7/#19 의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램). (c) 재조합 균주 2uD24D7/#S1 균주의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램). (DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤)
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19, UPC2-1/NTSD24D7/#19의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다(DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤).
도 9은 신규 구축한 HPLC-CAD 기반 LC 크로마토그램 분석 결과로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 분석한 것이다. (A) 표준품 3종(1: 지모스테롤, 2: 에르고스테롤, 3: 콜레스테롤)에 대한 LC 크로마토그램, (B) 표준품 4종(4: 7-디하이드로데스모스테롤, 5: 데스모스테롤, 6: 7-디하이드로콜레스테롤, 7: 라쏘스테롤)에 대한 LC 크로마토그램 (C) 야생형 균주(CEN.PK), (D) 재조합 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ARE2 결손 균주의 스테롤 프로파일을 분석한 결과이다. (a) 상동재조합 기법 기반의 ARE2 결손 균주 제작 모식도 (b) HPLC-UV/Vis 분석 기반 다른 스테롤 추출 방법으로 확보된 총 스테롤(total sterol)(KOH/EtOH)과 유리 스테롤(free sterol) (Chloroform/MeOH) 크로마토그램, (c) HPLC-UV/Vis 분석 기반 are2/NTSD24D7/#19 재조합 균주의 총 스테롤(total sterol) 크로마토그램. (DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤)
도 11a 내지 11c는 본 발명의 일 실시예 따라 제조된 재조합 효모 균주들의 카피수와 스테롤 생산량의 관계를 분석한 것이다. 도 11d는 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주의 스테롤 프로파일을 HPLC-UV/Vis로 분석 결과이다. *:알려지지 않은 피크(unknown peak), DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 제작에 사용된 카세트를 포함한 벡터. (b) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 삽입 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (c) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a)~(d) 재조합 균주 #cc19, #ccS1의 제작에 사용된 카세트를 포함한 벡터. (e)재조합 균주 #cc19, #ccS1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 제작에 사용된 tHMG1 다중삽입 카세트를 포함한 벡터. (b) 재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 다중 삽입된 tHMG1 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (C)재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 실시예는 효모 특이적 스테롤(sterol)인 에르고스테롤(ergosterol) 대신 동물 세포의 콜레스테롤(cholesterol)과, 콜레스테롤의 전구체를 생산하는 재조합 효모 균주 제작을 목적으로 수행되었다. 이를 위해 전통 제빵 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 에르고스테롤 최종 생합성 단계를 차단하고 콜레스테롤 생합성 관련 외래유전자를 도입하여 콜레스테롤 생합성 경로를 지닌 재조합 효모 균주를 제작하였다(도 1). 본 실시예의 구체적인 전략으로는, 에르고스테롤 특이적 구조 22-카본 더블 본드 (22-carbone double bond) 형성에 관여하는 C-22 스테롤 디새츄라아제(C-22 sterol desaturase) 유전자 ERG5와 24-카본 메틸레이션(24-carbone methylation)에 관여하는 델타(24)-스테롤 C-메틸 트렌스퍼라아제(Delta(24)-sterol C-methyl transferase) 유전자 ERG6를 파쇄시키고 콜레스테롤(cholesterol) 생성에 필요한 동물세포 유래의 7-디하이드로콜레스테롤 리덕타아제(7-dehydrocholesterol reductase) 유전자 DHCR7와 24-디하이드로콜레스테롤 리덕타아제(24-dehydrocholesterol reductase) 유전자 DHCR24를 효모 숙주에 도입하여 다양한 형태로 도입된 재조합 사카로마이세스 세레비시애 (S. cerevisiae)균주를 제작하였다(도 2a). 또한 더 나아가 에르고스테롤 생합성 경로가 콜레스테롤 전구체 생합성 경로로 더 효율적으로 전환될 수 있도록 ERG3 (Delta(7)-sterol 5(6)-desaturase), ERG2 (C-8 sterol isomerase), ERG27 (3-keto-steroid reductase)와 에르고스테롤 생합성 경로 조절 전사인자인 UPC2-1 (Uptake Control Protein 2-1)를 추가로 도입된 재조합 균주를 제작하고자 하였다(도 2b). 또 다른 방법으로는 야생형 균주 배경에 DHCR7와 DHCR24 유전자를 다중으로 먼저 삽입시킨 후 ERG3, ERG2, ERG27 와 에르고스테롤 생합성 경로 조절 전사인자인 UPC2-1를 추가로 도입시킨 후 ERG6를 파쇄시켜 콜레스테롤 생산 균주를 제작하였다(도 3a). 더 나아가, 에르고스테롤 생합성 경로의 전구체 생합성 경로인 메발로네이트 생합성 경로(Mevalonate pathway)를 증폭시키기 위해 tHMG1 유전자를 숙주 염색체로 다중으로 추가 도입하였다(도 3b).
상기 ERG5, ERG6, DHCR7, DHCR24, ERG3, ERG2, ERG27, ARE2, ERG27-ERG2, UPC2-1, tHMG1는 각각 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19로 표시되는 서열로 구성될 수 있다.
ERG27-ERG2 융합 유전자 서열(서열번호 15, 밑줄: ERG2 부분 )
ttgaaactagaacccccatt ccaaccaattacatgttcgatccaaaaactttgaacgaaatatgtaactcggtgattagcaaacacaacgcagcagaaggtttatccactgaagacctgttacaggatgtcagagacgcacttgcctctcattacggggacgaatacatcaacaggtacgtcaaagaagaatgggtcttcaacaatgctggtggtgcgatgggccaaatgatcatcctacacgcttccgtatccgagtacttaattctattcggaaccgctgttggtactgaagggcacacaggtgttcactttgctgacgactattttaccatcttacatggtacgcaaatcgcagcattgccatatgccactgaagccgaagtttacactcctggtatgactcatcacttgaagaagggatacgccaagcaatacagcatgccaggtggttcctttgcccttgaattggctcaaggctggattccatgtatgttgccattcgggtttttggacactttctccagtactcttgatttatacactctatatagaactgtctacctgactgccagggacatgggtaagaacttgttgcaaaacaaaaagttctaa
UPC2-1 서열(서열번호 16, 대문자 밑줄: G888D point mutation site (GGT to GAT)
attattaagagaagctgttttagaaatatctgagaataacaccgatgcgctagttgccagcgccctgatactaatcatggactcgttagcaaatgctagtggtaacggcactgtaggaaaccaaagtttgaatagcatgtcaccaagcgcttggatctttcatgtcaaaggtgctgcaacaattttaaccgctgtgtggcctttgagtgaaagatctaaatttcataacattatatctgttgatcttagcgatttaggcgatgtcattaaccctgatgttggaacaattactgaattggtatgttttgatgaaagtattgccgatttgtatcctgtcggcttagattcgccatatttgataacactagcttatttagataaattgcaccgtgaaaaaaaccagggtgattttattctgcgggtatttacatttccagcattgctagacaagacattcctggcattactgatgacaggtgatttaggtgcaatgagaattatgagatcatattataaactacttcgaggatttgccacagaggtcaaggataaagtctggtttctcgaaggagtcacgcaggtgctgcctcaagatgttgacgaatacagtggaggtggtGATatgcatatgatgctagatttcctcggtggcggattaccatcgatgacaacaacaaatttctctgatttttcgtta
이하 더욱 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
<실시예>
재료
본 실시예에 사용된 프라이머, 발현 벡터, 효모 균주들은 표 1, 표 2, 표 3로 정리되어 있다. 본 실시예에서 제작된 발현 벡터들은 도 4에 도식으로 정리되어 있으며, 사용한 배지 및 시약은 하기와 같다.
- SC 배지 (Synthetic Complete medium;): 0.67% 아미노산이 없는 효모 질소 염기(yeast nitrogen base without amino acids) (BD, 291940), 2% 글루코오스(glucose) (JUNSEI, 64220S0650), 0.77 g/L 모든 필수 아미노산이 보충된 드롭-아웃 아미노산 혼합물(drop-out amino acid mixture supplemented with all required amino acids) (CLONTECH, 630425)
- 인 퓨전 클로닝 키트(In fusion cloning kit) (TAKARA 121416)
- KOH (JUNSEI, 39040-0350 / Sigma, P1767)
- 에탄올(Ethanol) (MERCK, 1.00983.1011)
- 메탄올(Methanol) (B&J, AH230-4)
- 헵탄(Heptane) (SIGMA, 246654)
- 석유 에탄올(Petroleum ether) (B&J, 317-4)
- 피로갈롤(Pyrogallol) (TCI, P0570)
- 아세톤(Acetone) (SIGMA, 650501)
- Cosmosil C18-PAQ (4.6 mm*250 mm) column
- HPLC 아세토니트릴(acetonitrile) (FISHER, A998-4)
- HPLC 워터(water) (FISHER, W5-4)
- HPLC 분석용 표준 콜레스테롤 전구체
: 라노스테롤(Lanosterol) (SIGMA, L5768)
: 에르고스테롤(Ergosterol) (SIGMA, 45480-10g-f)
: 지모스테롤(Zymosterol) (AVANTI, 700068P)
: 데스모스테롤(Desmosterol) (SIGMA, D6513)
: 콜레스테롤(Cholesterol) (SIGMA, C8667)
: 라쏘스테롤(Lathosterol) (SIGMA, C3652)
: 7-디하이드로데스모스테롤(7-Dehydrodesmosterol)(AVANTI, 700138P)
: 7-디하이드로콜레스테롤(7-Dehydrocholesterol) (SIGMA, 30800)
: 글루코오스 바이오(Glucose Bio) (Roche, 06343732001)
: 아세테이트 V2 바이오(Acetate V2 Bio) (COWIE, 7395442001)
: 에탄올 바이오(Ethanol bio) (Roche, 8055645001)
기기
- HPLC (Waters Separations Module 2695, Waters Dual λ Absorbance Detector 2487)
- PCR cycler (Eppendorf, AG 22331)
- 비드비터(Beadbeator) (BERTIN TECHNOLOGY, PrecellysR24)
- 워터 배스(Water bath) (TAITEC, SDN-B)
- 원심분리기(Centrifuge) (Eppendorf, 5424R)
- 회전진공농축기(Rotational vacuum concentrator) (CHRIST, RVC 2-25 CD plus)
- HPLC-CAD 시스템 (Thermo scientific, Dionex Ultimate 3000- Corona Veo RS)
- 바이오프로세스 애널라이저(Bioprocess analyzer) (Roche, Cedex Bio)
본 실험에 사용한 프라이머
Primer Sequence (5'->3')
erg5 dN fw ACATGCATGCCGCTATTGAAGAGAGCTCATG (서열번호 20)
erg5 dN rv GCGGCCGCGGGTCTAGAGGGGGATCCCCAGGATACTGAAGGCAGTAG (서열번호 21)
erg5 dC fw GGATCCCCCTCTAGACCCGCGGCCGC CATGATTACCTTCGCCGCTTTG (서열번호 22)
erg5 dC rv CGACGCGT GCTGGCAGGGTGAGTATTTG (서열번호 23)
erg6 dN fw ACGTGCATGCGCTGTTGCCGATAACTTCTTC (서열번호 24)
erg6 dN rv GCGGCCGCGGGTCTAGAGGGCTCGAGGGGGGATCCCTCAATTCTGTTTCACTCATC (서열번호 25)
erg6 dC fw GGATCCCCCCTCGAGCCCTCTAGACCCGCGGCCGCCCTCCCAAACTTCCCAAG (서열번호 26)
erg6 dC rv CGACGCGTCTTGCCGCTGTAGACAATAG (서열번호 27)
DHCR7 fw AACTGCAGATGATGGCCTCCGATAGAGTTAG (서열번호 28)
DHCR7 rv GCGTCGACTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAAAGATGTTTGGCAATAATCTATAGG (서열번호 29)
DHCR24 fw AACTGCAGATGGACCCTTTGTTGTATTTGGG (서열번호 30)
DHCR24 rv GCGTCGACTTACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGTGTCTGGCGGATTTACAG (서열번호 31)
TEF1p fw CCG CTCGAG AGCTCATAGCTTCAAAATGTTTC (서열번호 32)
TEF1p rv GC TCTAGA GGGGAAACTTAAAGAAATTC (서열번호 33)
GAL7t fw ACGC GTCGAC TTGAACGAAACTTGAACGGAG (서열번호 34)
GAL7t rv GC TCTAGA GGGGAAACTTAAAGAAATTC (서열번호 35)
ACT1p fw CGAAGTTATTAGGGCGGCCGCTTTGGACTCCACCAACGTC (서열번호 36)
ACT1p rv ATCGGAGGCCATCATTGTTAATTCAGTAAATTTTCGATCTTGGG (서열번호 37)
DHCR7 fw2 TGAATTAACAATGATGGCCTCCGATAGAGTTAG (서열번호 38)
DHCR7 rv2 CTTTAATTTGCGGCCTTACTTGTCGTCATCGTCTTTG (서열번호 39)
CYC1t fw GATGACGACAAGTAAGGCCGCAAATTAAAGCCTTC (서열번호 40)
CYC1t rv ACCTCTGGCGCGGCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGC (서열번호 41)
TDH3p fw CGCGGATCCGTAGAATCATTTTGAATAAAAAACACGC (서열번호 42)
TDH3p rv ACTTCTAAGACCAAATCCATGAATTCTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC (서열번호 43)
ERG3 fw ACTTCTAAGACCAAATCCATGAATTCTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC (서열번호 44)
ERG3 rv AGAAAAGTCTTATCAATCTCCGTCGACTCAGTTGTTCTTCTTGGTATTTG (서열번호 45)
TEF1t fw CAAATACCAAGAAGAACAACTGAGTCGACGGAGATTGATAAGACTTTTCT (서열번호 46)
TEF1t rv CCGCTCGAGGTAAAAAATACGCCCGTAACGATG (서열번호 47)
TEF2p fw CCGCTCGAGTGCCATTAAAGGCGAATTTTTG (서열번호 48)
TEF2p rv AAGGAGTGGGAAAAACTTCATGCATGCGTTTAGTTAATTATAGTTCGTTG (서열번호 49)
ERG2 fw CAACGAACTATAATTAACTAAACGCATGCATGAAGTTTTTCCCACTCCTT (서열번호 50)
ERG2 rv AGATTTAAAGTAAATTCACGCATGCTTAGAACTTTTTGTTTTGCAACAAG (서열번호 51)
TDH3t fw CTTGTTGCAAAACAAAAAGTTCTAAGCATGCGTGAATTTACTTTAAATCT (서열번호 52)
TDH3t rv CCGCTCGAGTCTAGATATATGTTATCTTATCTTGG (서열번호 53)
ERG27-2 fw1 CGAACATGTAATTGGTTGGAATGGGGGTTCTAGTTTCAACAATTTG (서열번호 54)
ERG27-2 rv1 CTATAATTAACTAAACGCATGCATGAACAGGAAAGTAGCTATCGTAAC (서열번호 55)
ERG27-2 fw2 AAGATTTAAAGTAAATTCACGCATGCTTAGAACTTTTTGTTTTGCAACAAGTTC (서열번호 56)
ERG27-2 rv2 GTTGAAACTAGAACCCCCATTCCAACCAATTACATGTTCGATCC (서열번호 57)
ARE2 dN fw1 ACAT GCATGCCAAGTCGTAAACCTCGTCGG (서열번호 58)
ARE2 dN rv1 GATATCGCGCTCGAGGTTCTCCAGTAGATCCTTCTTC (서열번호 59)
ARE2 dN fw2 CTCGAGCGCGATATCGGACCAAGTGTCATGTGTACG (서열번호 60)
ARE2 dN rv2 CCG ACGCGTGGCAAATAGATTGGTTAAATCTGAAG (서열번호 61)
101HIS fw GCTATACGAAGTTATTAGGCCCGGGGATTGGCATTATCACATAATGAATTATAC (서열번호 62)
101HIS rv CACCTTGAAACTACCTCTGGCGCGGCCGCTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAGAAAAAGCAAAAAG (서열번호 63)
ccD7 fw CTAATCTAAGTTTTCTAGCTGCAGATGATGGCCTCTGACAGAGTC (서열번호 64)
ccD7 rv GTCACTCCGTTCAAGTCGACTTAGAAAATGTTTGGTAGCAATCTGTAAG (서열번호 65)
ccD24 fw CTAAGTTTTCTAACTGCAGATGGACCCATTGCTATACTTAGGTG (서열번호 66)
ccD24 rv CAAGTTTCGTTCAAGTCGACCTAATGTCTGGCAGATTTGCAAATCTTG (서열번호 67)
tHMG1-fw GGAATTCATGCCAGTTTTAACCAATAA (서열번호 68)
tHMG1-rv GCGTCGACTTACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGGATTTAATGCAGGTGACGG (서열번호 69)
본 실험에 사용된 플라스미드
Plasmid Description Reference
pT-ERG5dNC pGEM-Teasy vector containing ERG5 N and C partial fragments this study
pT-ERG6dNC pGEM-Teasy vector containing ERG6 N and C partial fragments this study
pMKRQ-DrDHCR24 pMKRQ containing S. cerevisiae-codon optimized zebrafish DHCR7 대웅
pMKRQ-DrDHCR7 pMKRQ containing S. cerevisiae-codon optimized zebrafish DHCR24 대웅
pUG72 loxP-pKlURA3-KlURA3-tKlURA3-loxP Euroscarf
pUG73 loxP-pKlLEU2-KlLEU2-tKlLEU2-loxP Euroscarf
pT-DHCR24 pGEM-Teasy-pTEF1-DHCR24-GAL7t this study
pT-DHCR7 pGEM-Teasy-pACT1-DHCR7-CYC1t this study
pT-erg5::DHCR24-LEU2 pGEM-Teasy-ERG5(N)-pTEF1-DHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG5(C) this study
pT-erg6::DHCR7-URA3 pGEM-Teasy-ERG6(N)-pACT1-DHCR7-CYC1t-KlURA3-ERG6(C) this study
pT-erg6::DHCR24-LEU2 pGEM-Teasy-ERG6(N)-pTEF1-DHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG6(C) this study
pT-erg5::DHCR7-URA3 pGEM-Teasy-ERG5(N)-pACT1-DHCR7-CYC1t-KlURA3-ERG5(C) this study
pT-NTS-86TRP1 pGEM-Teasy-5NTS2-TRP1 with 86bp promoter-3NTS2 Moon et. al., 2016
pT-NTS-DHCR24-86TRP1 pT-NTS-86TRP1 containing the DHCR24 expression cassette pTEF1-DHCR24-GAL7t this study
pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 pT-NTS-DHCR24-86TRP1 containing the DHCR7 expression cassette pACT1-DHCR7-CYC1t this study
Y2pH 2μ-based YEp351 derivative, containing the GAL10 promoter and GAL7 terminator and the HIS3 marker this study
Y2pH-DHCR7-DHCR24 Y2pH containing pTEF1-DHCR24-GAL7t and pACT1-DHCR7-CYC1t this study
Y2pH-ERG3-ERG2 Y2pH containing TDH3p-ERG3-TEF1t and TEF2p-ERG2-TDH3t this study
Y2pH-ERG3-ERG27-2 Y2pH containing TDH3p-ERG3-TEF1t and TEF2p-ERG27-ERG2 fusion-TDH3t this study
YCpH-Tp CEN-based pRE316 derivative containing the TEF1 promoter, the GAL7 terminater and the HIS3 marker 출원번호 :10-2017-0182422
YCpH-np-UPC2 YCpH derivative expressing UPC2-1 under the control of its own promoter 출원번호 :10-2017-0182422
pT-ARE2dNC-HIS pGEM-Teasy vector containing the ARE2 deletion cassette ARE2::HIS3 this study
pT-NTS-101HIS3-DHCR7 pT-NTS-101HIS3 containing the DHCR7 expression cassette pACT1-DHCR7-CYC1t this study
pMKRQ-sDrDHCRc7(cc) pMKRQ containing S. cerevisiae-codon context optimized DHCR7 gene from Danio rerio this study
pMKRQ-sDrDHCRc24(cc) pMKRQ containing S. cerevisiae-codon context optimized DHCR24 gene from Danio rerio this study
pT-ERG5dNC-ccDHCR7 pGEM-Teasy-ERG5(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t-ERG5(C) this study
pT-ERG5dNC-ccDHCR24 pGEM-Teasy-ERG5(N)-pTEF1-ccDHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG5(C) this study
pT-ERG6dNC-ccDHCR7 pGEM-Teasy-ERG6(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t-ERG6(C) this study
pT-ERG6dNC-ccDHCR24 pGEM-Teasy-ERG6(N)-pTEF1-ccDHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG6(C) this study
pT-erg6::ccDHCR7-URA3 pGEM-Teasy-ERG6(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t-KlURA3-ERG6(C) this study
pT-erg6::ccDHCR24-LEU2 pGEM-Teasy-ERG6(N)-pTEF1-ccDHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG6(C) this study
pT-erg5::ccDHCR7-URA3 pGEM-Teasy-ERG5(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t-KlURA3-ERG5(C) this study
pT-NTS-86TRP1-tHMG1 pT-NTS-86TRP1 containing the N-truncated HMG1 expression cassette pTEF1-tHMG1-GAL7t this study
본 실험에 사용된 효모 균주
Strain Genotype Reference
1 CEN.PK (WT) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 Entian and Kotter (2007)
2 erg5::D24 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24 this study
3 erg6::D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 this study
4 erg6::D24 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24 this study
5 erg5::D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 this study
6 erg5::D24/erg6::D7 (#19) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 this study
7 erg6::D24/erg5::D7(#S1) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24 this study
8 NTSD24/erg5::D24/erg6::D7(NTSD24/#19) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-TRP1 this study
9 NTSD24/erg6::D24/erg5::D7(NTSD24/#S1) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24, NTS-DHCR24-TRP1 this study
10 NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7(NTSD24D7/#19) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1 this study
11 2uD24D7/erg6::D24/erg5::D7(2uD24D7/#S1) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, ergΔ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24/Y2pH-DHCR24-DHCR7 this study
12 E3E2/NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 ergΔ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG2 this study
13 E3E27-2/NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG27-2 this study
14 UPC2-1/NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG2 this study
15 NTSD24D7/WT MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1 this study
16 E3E2/NTSD24D7/WT MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG2 this study
17 E3E27-2/NTSD24D7/WT MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG27ERG2 fusion this study
18 UPC2-1/NTSD24D7/WT MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG27ERG2 fusion this study
19 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG27ERG2 fusion/erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 this study
20 are2Δ MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 are2Δ::HIS3 this study
21 are2Δ/NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24 erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1 are2Δ::HIS3 this study
22 NTSD7/NTSD24/#S1 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, ergΔ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24,NTS-DHCR24-TRP1/NTS-DHCR7-HIS3 this study
23 erg5::ccD24 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc) this study
24 erg6::ccD7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) this study
25 erg6::ccD24 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc) this study
26 erg5::ccD7 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) this study
27 erg5::ccD24/erg6::ccD7 (#cc19) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) this study
28 erg6::ccD24/erg5::ccD7 (#ccS1) MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24(cc) this study
29 tHMG1/#cc19 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc)/NTS-tHMG1-TRP1 this study
30 tHMG1/#ccS1 MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24(cc)/NTS-tHMG1-TRP1 this study
효모 형질 전환 (LiAc/PEG 방식)
상기 제조된 벡터 혹은 카세트 들을 이용하여 형질전환을 수행하기 위하여, YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-글루코오즈(Glucose) 2%(w/v) 액체배지에서 전배양한 균주를 500 mL 배플 플라스크(baffled flask)에 초기 OD 600 값을 0.2로 맞추어 50 mL을 30 ℃ 진탕 배양기에서 180 rpm으로 배양하였다. 6~7 시간 후 OD 600 값이 1.0이 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 4,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 상층액은 제거하고 LiAc/TE 완충용액 (0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5) 1 mL을 넣고 피펫팅(pipetting)으로 현탁한 다음 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 다시 LiAc/TE 완충 용액 500 μL에 현탁하여 컴피턴트 세포(competent cell)을 제조하였다. 100 μL씩 5개로 나누어 분주하고 각 튜브(tube)에 재조합 벡터 혹은 카세트 2 μL, 연어 정자(salmon sperm) DNA 10 μL, PEG/LiAc 완충용액 (50% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5) 600 μL를 혼합한 후, 3~4번 정도 조심스럽게 피펫팅(pipetting)해 주었다. 30℃에서 30분간 방치시킨 후 DMSO 70 μL를 첨가하여 피펫팅(pipetting) 해준 후, 42℃에서 15 분간 열처리를 하였다. 얼음에서 3분간 방치한 후 13,000 rpm으로 1분간 원심 분리하여 얻은 침전물을 멸균된 증류수로 현탁하고 특정 아미노산(LEU or TRP or HIS) 또는 염기(URA)가 결손된 SC 합성 기반의 선택 배지 SC-LEU, SC-URA, SC-LUE-URA-TRP, SC-LUE-URA-TRP-HIS(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose, 0.77 g/L drop-out amino acid mixture supplemented without leucine, tryptophan, histidine, or uracil in combination)에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후 형질전환체를 얻었다(Hill J et. al. 1991).
실시예 1: ERG5 , ERG6 결손과 DHCR24 , DHCR7 동시 삽입을 통한 스테롤 생산 균주 제작
우선 ERG5, ERG6 결손을 위해 상동재조합(homologous recombination)이 일어날 N 단편과 C 단편을 표 1에 표시된 erg5 dN fw, erg5 dN rv, erg5 dC fw, erg5 dC rv, erg6 dN fw, erg6 dN rv, erg6 dC fw, erg6 dC rv 프라이머를 이용하여 각각 N, C 2개의 PCR 단편을 얻은 후 그 단편들을 가지고 융합 중합효소연쇄반응(Fusion-PCR)을 수행하여 pT-ERG5dNC, pT-ERG6dNC를 얻었다. 효모용 코돈 어댑테이션 인덱스 (Codon Adaptation Index) 방식으로 코돈 최적화된 제브라피쉬 유래의 DHCR24와 DHCR7 유전자가 클로닝되어 있는 pMKRQ-DrDHCR24, pMKRQ-DrDHCR7에서 PCR을 통해 DHCR7, DHCR24 DNA 절편을 회수하고 또한 PCR을 통해 얻은 411 bp TEF1 프로모터(promoter)와 314 bp GAL7 터미네이터(terminator)와 같이 연결(ligation)하여 pT-DHCR24, pT-DHCR7 벡터를 제작 후 이 벡터에서 TEF1p-DHCR7-GAL7t, TEF1p-DHCR24-GAL7t 단편을 가져와 pT-ERG5dNC, pT-ERG6dNC 벡터의 N, C 단편 가운데 BamHI/XbaI 위치로 삽입하고 KlURA3, KlLEU2를 pUG73, pUG72 벡터에서 가져와 NotI 위치로 삽입함으로써 최종 벡터 pT-erg5::DHCR24-LEU2, pT-erg6::DHCR7-URA3, pT-erg6::DHCR24-LEU2, pT-erg5::DHCR7-URA3를 얻었다(도 4A, B, C, D). 최종 벡터를 SphI/MluI 처리하여 erg5::DHCR24-LEU2, erg6::DHCR7-URA3, erg6::DHCR24-LEU2, erg5::DHCR7-URA3 카세트를 회수한 후 CENPK 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-LEU, SC-URA, SC-LEU-URA 배지에서 선별하여 erg5::D24, erg6::D7, erg6::D24, erg5::D7, erg5::24/erg6::D7, erg6::D24/erg5::D7 재조합 균주를 제작하였다(도 2, 1단계, 표 3).
실시예 2: DHCR24 다중 삽입 카세트 제작 및 재조합 효모 선별
콜레스테롤 생합성 유전자 다중삽입을 위해서 본 연구팀에서 개발된 rDNA-NTS 기반 다중삽입 카세트 시스템(Moon et al., 2016)을 이용하여 NTS-DHCR24-86TRP1 카세트를 제작하였다. pT-NTS-86TRP1 벡터에 pT-erg6::DHCR24-LEU2에서 가져온 TEF1p-DHCR24-GALt7 단편을 BamHI 위치에 삽입하여 제작된 pT-NTS-DHCR24-86TRP1(도 4E)를 SphI/NsiI 처리하여 NTS-DHCR24-86TRP1 카세트를 회수한 후 erg5::D24/erg6::D7 (#19, 기탁번호 KCTC 13889BP), erg6::D24/erg5::D7 (#S1, 기탁번호 KCTC 13888BP) 재조합 균주에 도입시킨 후 SC-LEU-URA-TRP 배지에서 선별하여 NTSD24/#19 및 NTSD24/#S1 재조합 균주를 제작하였다(도 2, 2단계).
실시예 3: DHCR24 / DHCR7 다중 삽입 제작 및 재조합 효모 선별
DCHR24와 DHCR7 발현 카세트가 함께 들어있는 pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 벡터(도 4f) 제작은 ACT1p fw 와 ACT1p rv 프리이머로 837 bp 크기의 ScACT1 프로모터와 DHCR7 fw2와 DHCR7 rv2 프라이머로 1458 bp 크기의 DHCR7 유전자, CYC1t fw 와 CYC1t rv 프리이머로 252 bp 크기의 CYC1 터미네이터 부위를 각각 증폭하고 이를 융합(fusion) PCR을 통해 하나의 단편으로 만든 후 기존 pT-NTS-DHCR24-86TRP1 벡터에 KpnI 자리로 삽입하여 제작하였다. 이렇게 제작된 pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1를 SphI/NsiI 처리하여 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 회수한 후 erg5::D24/erg6::D7 (#19) 재조합 균주에 형질전환 수행 후 SC-LEU-URA-TRP 배지에서 선별하여 NTSD24D7/#19 재조합 균주 (기탁번호 KCTC 13884BP)를 제작하였다(도 2, 3단계, 오른쪽 패널).
또한, pT-NTS-86TRP1-DHCR24-DHCR7 벡터를 BamHI 처리하여 DHCR24을 제거함으로써 pT-NTS-86TRP1-DHCR7 벡터를 제작하였다. 이후 pT-NTS-86TRP1-DHCR7 벡터에 SmaI/NotI을 처리하여 86TRP1을 제거한 후 프라이머 101HIS3 fw, 101HIS3 rv를 이용하여 PCR로 얻은 101 bp 크기의 프로모터를 가진 HIS3 단편를 삽입하여 pT-NTS-101HIS3-DHCR7를 제작하였다 (도 12a). SpeI/XbaI을 처리하여 NTS-101HIS3-DHCR7 카세트를 얻은 후 NTSD24/#S1 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-HIS 배지에서 선별하여 NTSD7/NTSD24/#S1 균주 (기탁번호 KCTC 13885BP)를 얻었다. 제작된 균주 NTSD7/NTSD24/#S1 유전체 내 도입된 카세트 수를 확인하고자, 해당 균주를 qPCR을 통해 도입 카피 수를 분석한 결과 DHCR7의 유전자는 약 4개 DHCR24의 유전자는 약 2개의 카세트가 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 12b).
실시예 4: 에피좀 플라스미드(Episomal plasmid) 기반 DHCR24 / DHCR7 발현 벡터 제작
2 마이크로 이스트 에피좀 플라스미드(micro yeast episomal plasmids)를 이용한 Y2pH-DHCR7-DHCR24 벡터(도 4g)는 Y2pH 벡터에 pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1에서 가져온 DHCR24-DHCR7를 BamHI/XhoI 위치에 삽입하여 제작하였고, erg6::D24/erg5::D7 (#S1) 재조합 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환을 수행 후 SC-LEU-URA-HIS 배지에서 선별하여 2uD24D7/#S1 재조합 균주를 얻었다(도 2, 3단계, 왼쪽 패널).
실시예 5: ERG27 - ERG2 융합 유전자(fusion gene), ERG3 과발현 균주 제작
ERG2, ERG3 발현을 위하여 Y2pH-ERG3-ERG2 벡터(도 4f) 제작은 TDH3p fw와 TDH3p rv 프라이머로 714 bp 크기의 ScTDH3 프로모터와 ERG3 fw와 ERG3 rv 프라이머로 1098 bp 크기의 ScERG3 유전자, TEF1t fw와 TEF1t rv 프라이머로 367 bp 크기의 ScTEF1 터미네이터 부위를 각각 증폭하고 이를 융합(fusion) PCR을 통해 하나의 단편으로 만들고, TEF2p fw와 TEF2p rv 프라이머로 836 bp 크기의 ScTEF2 프로모터와 ERG2 fw 와 REF2 rv 프라이머로 666 bp 크기의 ScERG2 유전자, TDH3t fw와 TDH3t rv 프라이머로 484 bp 크기의 ScTDH3 터미네이터 부위를 각각 증폭하고 이를 융합 PCR을 통해 하나의 단편으로 만든 후 기존 Y2pH 벡터에 BamHI/XhoI 자리로 삽입하여 제작하였다. Y2pH-ERG3-ERG27-2 융합 벡터(도 4g) 제작은 ERG27과 ERG2를 ERG27-2 fw1와 ERG27-2 rv1를 이용하여 PCR 생성물(product) 1과 ERG27-2 fw2와 ERG27-2 rv2를 이용하여 얻은 PCR 생성물(product) 2를 융합 PCR을 통해 얻은 후 Y2pH-ERG3-ERG2 벡터에 SphI 사이트를 이용하여 ERG2 대신 삽입시켜 제작하였다. 제작된 Y2pH-ERG3-ERG2, Y2pH-ERG3-ERG27-2 융합 벡터를 NTSD24D7/#19 균주에 형질전환시킨 후 SC-LEU-URA-TRP-HIS 배지에서 선별하여 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19 재조합 균주를 제작하였다.
실시예 6: UPC2-1 도입 균주 제작
본 연구팀에서 480 bp 크기의 UPC2 프로모터(promoter)와 YCp(yeast centromere plasmids)를 이용하여 제작한 YCpH-np-UPC2를 2uD24D7/#19 균주에 형질전환시킨 후 SC-LEU-URA-TRP-HIS 배지에서 선별하여 UPC2-1/NTSD24D7/#19 재조합 균주를 제작하였다(도 2, 4단계 왼쪽 패널).
실시예 7: erg6::D7/UPC2-1/ NTS D24D7 균주 제작
앞서 제작된 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 CEN.PK 야생형 균주에 형질전환 시킨 후 SC-TRP 배지에서 선별하여 NTSD24D7/WT 재조합 균주를 얻었다. 그 후 상기 제작한 Y2pH-ERG3-ERG2, Y2pH-ERG3-ERG27-2, YCpH-np-UPC2를 도입하여 E3E2/NTSD24D7/WT, E3E27-2/NTSD24D7/WT, UPC2-1/NTSD24D7/WT 균주를 제작하였다. 이들 중 UPC2-1/NTSD24D7/WT 균주를 선택하여 erg6::DHCR7-URA3 카세트를 활용하여 ERG6 유전자를 결손시켜 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주를 제작하였다(도 3).
실시예 8: 스테롤 에스터(Sterol ester)화 주요 유전자 ARE2 결손 균주 제작
상동재조합을 이용한 ARE2 결손을 위해 N 단편과 C 단편을 ARE2 dN fw, ARE2 dN fw, ARE2 dC fw, ARE2 dC fw 프라이머를 이용하여 각각 PCR로 얻은 후 그 단편들을 가지고 융합 PCR을 수행하여 pT-ARE2dNC를 얻었다. 이후 두 단편 사이의 XhoI/EcoRV 사이트에 ScHIS3를 삽입하여 최종벡터 pT-ARE2dNC-HIS를 얻었고 SphI/MluI 처리를 통해 ARE2dNC-HIS 카세트를 얻은 후 NTSD24D7/#19 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환을 수행한 후 SC-LEU-URA-TRP-HIS 배지에서 선별하여 are2Δ/NTSD24D7/#19 재조합 균주를 제작하였다.
실시예 9: 코돈 컨텍스트(Codon context) 방식으로 코돈 최적화한 cc DHCR24 , cc DHCR7 을 이용한 ERG5 , ERG6 결손과 DHCR24/DHCR7 동시 삽입 제작 및 재조합 효모 선별
기존에 제작된 pT-ERG5dNC-DrDHCR7, pT-ERG5dNC-DrDHCR24, pT-ERG6dNC-DrDHCR7, pT-ERG6dNC-DrDHCR7 벡터를 PstI/SalI 처리하여 백본(backbone)으로 준비하고 코돈 컨텍스트(Codon context) 방식으로 ccDHCR24, ccDHCR7를 유전자 합성한 pMKRQ-sDrDHCR7(cc), pMKRQ-sDrDHCR24(cc)벡터에서 프라이머 ccD7 fw, ccD7 rv, ccD24 fw, ccD24 rv 를 이용하여 PCR로 얻은 ccDHCR24, ccDHCR7 단편을 KpnI/SalI 처리하여 얻은 인서트(insert)를 리게이션(ligation)하여 벡터 pT-ERG5dNC-ccDHCR7, pT-ERG5dNC-ccDHCR24, pT-ERG6dNC-ccDHCR7, pT-ERG6dNC-ccDHCR24를 얻었다. 이후 KlURA3, KlLEU2를 pUG73, pUG72 벡터에서 가져와 NotI 위치로 삽입함으로써 최종 벡터 pT-erg5::ccDHCR24-LEU2, pT-erg6::ccDHCR7-URA3, pT-erg6::ccDHCR24-LEU2, pT-erg5::ccDHCR7-URA3를 얻었다(도 13a~d). 최종 벡터를 SphI/MluI 처리하여 erg5::ccDHCR24-LEU2, erg6::ccDHCR7-URA3, erg6::ccDHCR24-LEU2, erg5::ccDHCR7-URA3 카세트를 회수한 후 CEN.PK 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-LEU, SC-URA, SC-LEU-URA 배지에서 선별하여 erg5::ccD24, erg6::ccD7, erg6::ccD24, erg5::ccD7, erg5::ccD24/erg6::ccD7(=#cc19, 기탁번호 KCTC 13886BP), erg6::ccD24/erg5::ccD7(=#ccS1, 기탁번호 KCTC 13882BP) 재조합 균주를 제작하였다(표 3).
실시예 10: tHMG1 다중 삽입에 의한 재조합 #cc19, #ccS1 균주의 콜레스테롤 생산량 증대
다중 삽입이 가능한 pT-NTS-86TRP1-tHMG1 벡터는 표 1에 기술된 프라이머 tHMG1-fw와 tHMG1-rv를 이용하여 증폭한 N-말단 552 amino acid가 제거된 HMG1 유전자를 pT-NTS-86TRP1의 EcoRI/SalI에 삽입하여 pT-NTS-86TRP1-tHMG1 벡터를 제작하였다(도 14a). 제작된 pT-NTS-86TRP1-tHMG1 벡터를 SpeI/NsiI 처리하여 NTS-86TRP1-tHMG1 카세트를 얻은 후 erg5::ccD24/erg6::ccD7(=#cc19), erg6::ccD24/erg5::ccD7(=#ccS1) 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-TRP 배지에서 선별하여 tHMG1/erg5::ccD24/erg6::ccD7(=tHMG1/#cc19, 기탁번호 KCTC 13887BP), tHMG1/erg6::ccD24/erg5::ccD7(=tHMG1/#ccS1, 기탁번호 KCTC 13883BP) 재조합 균주를 제작하였다(표 3). 제작된 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1 유전체 내 도입된 카세트 수를 확인하고자, 해당 균주를 qPCR을 통해 도입 카피 수를 분석한 결과 약 3~4개의 카세트가 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 14b).
<실험예>
qPCR을 이용한 삽입 카피 수 분석
제작된 재조합 균주의 삽입된 타겟 유전자 발현 카세트 카피 수를 확인하기 위해 염색체(chromosome) DNA를 회수한 후 이 염색체 DNA를 템플릿(template)로 하여 qPCR을 수행하였다.
대사 부산물 및 잔존 탄소원 분석
최종 배양 후 상층액 내에 축적된 대사 부산물(예: Ethanol, acetate)과 배양 시 첨가한 탄소원인 글루코오스(glucose) 잔존량을 측정하였다. 분석에 사용한 시료는 본 배양 최종 배양액을 이용하였으며, 이를 원심분리(12,000 rpm, 10 분)하여 상층액을 분석하였다. 분석은 바이오 프로세스 애널라이저(Bio process analyzer)를 이용하였으며, 해당 장비의 에탄올(ethanol), 아세테이트(acetate), 글루코오스(glucose) 측정 전용 키트(Roche/COWIE)를 이용하여 분석하였다.
HPLC-UV/VIs 기반 콜레스테롤 및 전구체 분석
HPLC 분석은 SC 배지 [Synthetic Complete medium (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose, 0.77 g/L drop-out amino acid mixture supplemented with all required amino acids)]에 균주 1~2 콜로니(colony) 접종하여 종배양 수행한 후 OD600=0.3~0.5 되게 초기 접종 후 SC 배지 또는 YPD 배지에서 배양하였다. 총 스테롤(Total sterol) 추출을 위해서는 3일 내지 6일 배양 (28℃, 220 rpm) 샘플 10 mL 회수 후, 0.05 g/wet weight pellet에 1 mL KOH/EtOH (3:2) (KOH final concentration 4.5 M) 혼합액에 현탁 후 85 ℃에서 1시간 배양 후 0.5 mL 헵탄(heptane)(sigma)을 첨가한 후 비드비터(beadbeator) (6,000 rpm, 15 초, 3번 반복)을 이용하여 혼합하였다. 혼합된 샘플을 원심분리(12,000 rpm, 10 분, 25℃)로 상등액 0.5 mL 헵탄(heptane) 층을 회수한 (12,000 rpm, 10 분, 25℃) 후 건조하고 아세톤(acetone) 200 μL 첨가하여 녹여낸 샘플에 대해 HPLC 분석을 수행하였다. 유리 스테롤(Free sterol) 추출을 위해서는 0.5 mL 클로로포름(chloroform):MeOH(2:1) 혼합물(mixture)을 펠렛(pellet)과 첨가 후 비드비터 (6,000 rpm, 15 초, 3번 반복)을 이용하여 혼합하였다. 혼합된 샘플을 원심분리(12,000 rpm, 10 분, 25℃)로 유기용매 층을 회수한 후 건조하고 건조 펠릿(pellet)에 250 μL 헥산(hexane)을 첨가 하여 녹여낸 후 다시 건조하였다. 완벽히 건조 후 아세톤(acetone) 200 μL 첨가하여 녹여낸 샘플에 대해 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석 시 컬럼은 Cosmosil C18-PAQ (4.6 mm*250 mm)을 사용하였고 유량(flow rate)은 1 mL/min, 분석 용매는 90% 아세토니트릴(Acetonitrile), 분석 시간 50 분(min) 이었다. 콜레스테롤 및 전구체에 해당되는 피크(peak)는 UV/Vis 감지기를 사용하여 파장 203 nm에서 분석하였다.
HPLC-CAD 기반 콜레스테롤 및 전구체 생산성 분석
제작한 균주에서 콜레스테롤 및 전구체 생산성 확인을 위한 HPLC-CAD 분석을 위한 세포 배양은 상기 HPLC 기반 분석 내용과 동일하다. 콜레스테롤 및 전구체 추출을 위해서는 3일 내지 6일 배양(28℃, 220 rpm)한 샘플 50 mL을 회수한 후, 20 mL의 재현탁(resuspension) 용액(15% KOH (w/v), 0.125% 피롤갈롤(pyrogallol, w/v), 71% MeOH (v/v))에 재현탁하였다. 이를 85℃에서 2시간 반응한 후 상온에서 식히고, 석유 에테르(petroleum ether) 5 mL을 첨가한 후 5분간 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하였다. 혼합된 샘플을 원심분리(3,000 g, 5 분)하고, 상층액을 회수하였다. 석유 에테르를 첨가하여 추출하는 과정은 이후 2회 반복하며, 3 mL로 진행하여 상층액은 모두 회수하였다. 회수한 상층액은 회전진공농축기(rotational vacuum concentrator)를 이용하여 건조하고, 건조한 시료에 1 mL의 메탄올(methanol)을 첨가하여 녹여낸 샘플에 대해 HPLC-CAD 분석을 수행하였다. HPLC-CAD 분석 시 컬럼은 캅셀팩(Capcellpak) (C18, 4.6 mm x 250 mm, 5μm)을 사용하였고, 이동상으로는 메탄올을 사용하였으며 유량 및 조건은 아래 표와 같다. 분석시간은 45 분(min)이었다.
Figure PCTKR2019009360-appb-I000001
상기 분석법을 통해 표준품 7종(Zymosterol, Ergosterol, Lathosterol, 7-dehydrocholesterol, 7-dehydrodesmosterol, Desmosterol, Cholesterol)을 분석한 결과(도 9 참조), 에르고스테롤과 데스모스테롤의 HPLC peak 머무름 시간이 각각 30.7분과 30.4분으로 겹치나, 야생형 효모 균주에서는 에르고스테롤만 생산되며, 콜레스테롤 및 전구체를 생산할 수 있도록 제작한 재조합 효모 균주의 경우에는 데스모스테롤만 생산되므로 해당 분석법을 통해 최종 생산성 분석을 수행하였다.
실험예 1: erg5 , erg6 결손 및 DHCR24 , DHCR7 발현을 통해 제작한 스테롤 생산 균주에 대한 HPLC 분석
HPLC-UV/Vis 분석 결과 erg5::D24/erg6::D7, erg6::D24/erg5::D7 균주에서 콜레스테롤 피크(cholesterol peak)를 확인할 수 있었으며 erg5::D24/erg6::D7 (#19) 균주가 3.1 ppm, erg6::D24/erg5::D7 (#S1) 균주가 7.5 ppm 콜레스테롤 생산량을 보였다(표 4). 그러나 콜레스테롤 전구체인 지모스테롤(zymosterol), 디하이드로데스모스테롤(dehydrodesmosterol), 데스모스테롤(desmosterol)의 함량이 매우 높았다(도 5).
실험예 2: DHCR24 다중 삽입을 통해 제조한 스테롤 생산 균주에 대한 HLPC 분석
생산된 콜레스테롤 생산량 증가를 위해 본 연구팀에서 개발된 rDNA-NTS 기반 다중삽입 카세트 시스템을 이용하여 NTS-DHCR24-86TRP1 카세트를 추가 도입시킨 균주의 HPLC 분석 결과 #19 균주에 비해 NTSD24/#19 재조합 균주에서 약 2.4배 높은 7.4 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 6, 표 4). 또한 #S1 균주에 비해 NTSD24/#S1 재조합 균주에서 약 1.5배 높은 11.5 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 6, 표 4).
실험예 3: DHCR24 , DHCR7 다중 삽입을 통한 제조한 재조합 균주에 대한 qPCR 및 HPLC 분석
DHCR24, DHCR7 두 유전자 발현 카세트가 함께 들어가 있는 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 다중삽입하여 얻은 NTSD24D7/#19 재조합 균주의 삽입된 카세트 수를 qPCR로 분석한 결과 3~4개 까지 삽입된 균주를 얻을 수 있었다(도 7a). HPLC 분석 결과 erg5::D24/erg6::D7(#19) 균주에 비해 NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 (NTSD24D7/#19)재조합 균주에서 약 2.9배 높은 9.0 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 7b). 또한 HPLC 분석 결과 2uD24D7/#S1 재조합 균주도 #S1 균주에 비해 약 1.5배 높은 11.1 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 7c, 표 4).
실험예 4: ERG27-ERG2 융합 유전자(fusion gene), ERG3 및 UPC2-1 과발현을 통해 제조한 재조합 균주에 대한 HPLC 분석
제작된 NTSD24D7/#19 재조합 균주의 더 나은 콜레스테롤 생산 효율 증가를 위해 지모스테롤에서 콜레스테롤 생산에 관여하는 ERG27, ERG2, ERG3 유전자의 추가 발현한 균주의 HPLC 분석 결과 NTSD24D7/#19와 비교하여 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19, UPC2-1/NTSD24D7/#19 재조합 균주들에서 콜레스테롤 생산량 차이가 크지 않았다(표 4. 도 8). 그러나 ERG3,ERG27-2 또는 UPC2-1이 도입된 재조합 균주들의 경우 콜레스테롤 전구체 생산량은 현저히 증가된 추세를 보였다.
실험예 5: HPLC-CAD 기반 재조합 균주의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 분석
HPLC-CAD 기반 분석법을 통해 콜레스테롤 및 전구체 생산성 분석하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 야생형 균주에 대비 재조합 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)는 7-디하이드로데스모스테롤, 지모스테롤, 데스모스테롤, 7-디하이드로콜레스테롤 및 콜레스테롤을 높은 수율로 생산하는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 방법으로 제조한 재조합 균주의 콜레스테롤(cholesterol) 및 콜레스테롤 전구체의 생산량을 표 4에 정리하였다.
[표 4]
HPLC-CAD 기반 재조합 균주의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 비교 분석
Figure PCTKR2019009360-appb-I000002
(E: Ergosterol, Z: Zymosteorl, 7-dc: 7-dehydrocholesterol, 7-dm: 7-dehydrodesmosterol, D: Desmosterol, C: Cholesterol)
(Strains: CEN.PK (WT), #19, #S1, NTSD7/#19, NTSD7/#S1, NTSD24/#19, NTSD24/#S1, NTSD24D7/#19, 2μD24D7/#S1, E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19, UPC2-1/NTSD24D7/#19)
실험예 6: 스테롤 에스터(Sterol ester)화 주요 유전자 ARE2 결손 재조합 균주에 대한 HPLC-UV/Vis 분석
효모에서 세포내 과잉된 스테롤(sterol)의 저장을 위해 에스터(ester)화 및 지질액적(lipid droplet) 보관에 관여하는 ARE1, ARE2 유전자(Hohmann H-P et. al. 2017) 중 호기성 성장에서 주요 기능을 담당하는 ARE2의 결손을 상동재조합에 의한 유전자 파쇄기법으로 NTSD24D7/#19 균주에 시도하였다(도 10a). 유리 콜레스테롤(Free cholesterol) 형태가 유지되는 추출법으로 준비한 샘플의 경우 야생형 균주 배경에서 콜레스테롤의 양은 큰 변화가 없는 반면 전구체 중 디하이드로데스모스테롤의 양이 크게 감소됨이 관찰되었다(도 10b). 이는 디하이드로데스모스테롤의 경우 대부분 에스터(ester)화된 상태로 존재하지만, 콜레스테롤은 대부분 유리된(free) 형태로 존재함을 시사한다. 제작된 are2Δ/NTSD24D7/#19 균주의 HPLC 분석 결과, 콜레스테롤 양은 큰 차이가 없었고 다량 축적되고 있던 디하이드로데스모스테롤의 양이 다소 감소하였다. 이러한 결과는 NTSD24D7/#19 균주에서 생산되는 콜레스테롤은 대부분 유리 스테롤(free sterol) 상태로 추정된다.
실험예 7: 야생형 균주 대상 스테롤 생산 재조합 효모 S. cerevisiae 분석
앞서 시도된 전략 중에서 다중삽입 카세트 시스템을 이용한 염색체(chromosome) 내의 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트의 삽입 수 증가를 위한 방법으로 야생형 균주에 먼저 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 다중 삽입 시킨 후 ERG6 결손을 시도하는 전략을 가지고 첫 단계로 제작된 NTSD24D7/WT 재조합 균주의 삽입된 카세트 수를 qPCR로 분석한 결과 4~10개 까지 삽입된 여러 후보 균주를 얻을 수 있었다(도 11a). 이후 HPLC-UV/Vis 분석에서 7개 삽입된 후보군(NTSD24D7/WT #8)에서 에르고스테롤(ergosterol) 피크(peak)가 크게 감소한 반면 캄페스테롤(campesterol)로 추정되는 피크(peak)의 가장 증가된 값을 보였다(도 11b). 따라서 이후 실험에서는 7개 삽입된 후보군(NTSD24D7/WT #8)을 사용하여 E3E2/NTSD24D7/WT, E3E27-2/NTSD24D7/WT 균주를 제작하였으나, HPLC-UV/Vis 분석결과 NTSD24D7/WT 균주와 큰 차이를 볼 수 없었다. 한편, UPC2-1/NTSD24D7/WT 재조합 균주의 경우 전체적인 에르고스테롤 생합성 경로(ergosterol pathway) 활성화 때문인지 오히려 에르고스테롤 생산이 증가 되었다(도 11c). 다음으로 제작된 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주에 대해 HPLC-UV/Vis 분석 결과, 콜레스테롤 생산량이 기존 제작한 가장 높은 콜레스테롤 생산량을 보이는 NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 (NTSD24D7/#19) 재조합 균주에 비해 더 우수하지는 않았다(도 11d).
실험예 8: 스테롤 생산 재조합 균주 #S1 및 #19의 생장량 및 부산물 축적량 분석
제작한 균주의 대사 부산물 축적량 확인 결과, #19(erg5::D24/erg6::D7) 균주에서는 최종 배양 후 에탄올과 아세테이트와 같은 부산물이 축적되는 반면, #S1(erg6::D24/erg5::D7) 균주의 경우는 아세테이트의 축적은 소량 있지만 주요 대사 부산물인 에탄올의 축적은 확인되지 않았으므로 야생형과 동일한 양상을 확인할 수 있었다. 또한 세포 생장량 분석 결과, #19(erg5::D24/erg6::D7) 균주의 OD600 값의 경우 약 14.8로 확인되었는 바, 야생형 균주(WT) 및 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 균주 각각의 OD600 값인 약 46.5, 약 57.3 대비 생장이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(표 5).
[표 5]
재조합 균주 #S1 및 #19의 생장량 및 부산물 축적량 비교분석
Figure PCTKR2019009360-appb-I000003
실험예 9: SC 또는 YPD 배지에서 #S1 유래 균주와 DHCR 유전자 코돈 최적화 균주들의 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산량 분석
세포 생장량 및 부산물 축적량 분석 결과는 #19(erg5::D24/erg6::D7) 균주에 비해 성장이 좋고 부산물 축적이 거의 없는 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 균주가 산업적 균주로 더 적합함을 제시하고 있다. 이에 따라서 #S1 유래의 재조합 균주들의 콜레스테롤 및 전구체 생산량을 SC 배지와 YPD 배지에서 배양하여 HPLC-CAD 기반 LC 크로마토그램을 이용하여 상세 비교 분석을 수행하였다(표 6). YPD 배지에서 배양 시에는 SC 배지를 이용할 때보다 세포 성장이 높아 총 콜레스테롤 생산량은 높은 반면, SC 배지에서 배양된 경우가 균체 당 생산된 콜레스테롤 양은 높은 것을 확인할 수 있었다.
[표 6]
HPLC-CAD 기반 HPLC 크로마토그램을 이용한 SC 또는 YPD 배지에서 배양한 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 유래 재조합 균주들의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 분석
Figure PCTKR2019009360-appb-I000004
(E: Ergosterol, Z: Zymosteorl, 7-dc: 7-dehydrocholesterol, 7-dm: 7-dehydrodesmosterol, D: Desmosterol, C: Cholesterol)
(Strains: CEN.PK (WT), #S1, NTSD7/#S1, NTSD24/#S1, 2μD24D7/#S1)
또한 NTSD7/NTSD24/#S1 재조합 균주에 대한 HPLC 분석 결과 #S1 균주에 비해 약 1.7배 높은 9.3 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 12c, 표 7). 또한 erg5::ccD24/erg6::ccD7(=#cc19), erg6::ccD24/erg5::ccD7(=#ccS1)에 대해 HPLC분석 결과, 30.1, 29.4 ppm의 콜레스테롤과 6.1, 6.0 ppm의 지모스테롤을 생산하는 것으로 확인되었고, 이는 #S1 균주 대비 콜레스테롤 생산량이 약 5배 이상 증대된 결과이다 (도 13e, 표7).
[표 7]
HPLC-CAD 기반 HPLC 크로마토그램을 이용한 재조합 균주들의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 분석
Figure PCTKR2019009360-appb-I000005
(7-dm: 7-dehydrodesmosterol, 7-dc: 7-dehydrocholesterol, Z: Zymosteorl, D: Desmosterol, E: Ergosterol, L: Lathosterol, C: Cholesterol, D7/D24/S1: NTSD7/NTSD24/#S1)
또한 HPLC 분석 결과 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1 균주가 #cc19, #ccS1 균주에 비해 스쿠알렌 (squalene), 옥시도스쿠알렌 (oxidosqualene), 라노스테롤 (lanosterol), 지모스테롤 (zymosterol) 모두 축적되는 패턴을 보였으며, 콜레스테롤의 경우 #cc19, #ccS1 균주에 비해 HPLC 크로마토그램 피크 면적 (peak area) 비교 시 약 1.3~1.5배 정도 생산량이 증가하는 경향을 보였다(도 14c).
[수탁번호]
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Claims (16)

  1. ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고, DHCR24 및 DHCR7 유전자가 도입된 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주로서,
    상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)가 다중으로 도입되거나, 또는 코돈 최적화된 DHCR24와 DHCR7 합성 유전자가 한 카피 이상으로 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자 카피수(copy number)는 2 ~ 10인 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 효모 균주에는 ERG3, ERG2, ERG27 및 UPC2-1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 효모 균주에는 ERG27-ERG2 융합 단백질을 코딩하는 합성 유전자가 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 DHCR24 유전자는 ERG6 유전자 자리에 도입되고,
    상기 DHCR7 유전자는 ERG5 유전자 자리에 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 스테롤은 콜레스테롤 전구체 또는 콜레스테롤 둘 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 콜레스테롤 전구체는 지모스테롤, 디하이드로콜레스테롤, 라쏘스테롤, 디하이드로데스모스테롤 및 데스모스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 유전자 다중 삽입 카세트의 rDNA NTS의 N 말단 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 코돈 최적화된 DHCR24 합성 유전자는 서열번호 17로 구성되고, 상기 DHCR7 합성 유전자는 서열번호 18로 구성되는 것을 특징으로 하는 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 효모 균주는 tHMG1 유전자가 숙주의 염색체 상으로 추가 도입된 것을 특징으로 하는 재조합 효모 균주.
  12. 효모 균주의 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시킨 후 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)를 다중으로 도입하는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법.
  13. 청구항 12에서,
    상기 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법.
  14. 청구항 12에서,
    상기 DHCR24 및 DHCR7 유전자 도입은, 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 재조합 효모 균주를 배지에 배양하여 스테롤을 생산하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 배양은 25 ~35℃에서 2 ~ 10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 스테롤을 생산하는 방법.
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