WO2019244836A1 - 細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤 - Google Patents

細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2019244836A1
WO2019244836A1 PCT/JP2019/023886 JP2019023886W WO2019244836A1 WO 2019244836 A1 WO2019244836 A1 WO 2019244836A1 JP 2019023886 W JP2019023886 W JP 2019023886W WO 2019244836 A1 WO2019244836 A1 WO 2019244836A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
solution
culture solution
cell
ultrafiltration membrane
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/023886
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
寛之 土合
大駿 吉田
隆一 北山
訓弘 溝口
佐伯　行紀
藤井　侃
範行 東
恵美子 松坂
Original Assignee
五洲薬品株式会社
国立研究開発法人国立成育医療研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 五洲薬品株式会社, 国立研究開発法人国立成育医療研究センター filed Critical 五洲薬品株式会社
Priority to JP2020525722A priority Critical patent/JP7168942B2/ja
Publication of WO2019244836A1 publication Critical patent/WO2019244836A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell culture solution obtained from deep sea water using two types of ultrafiltration membranes, a cell culture solution having a specific composition, a liquid medium containing the cell culture solution, and a cell culture treatment. Liquid and a cell growth activity enhancer.
  • cell culture technology One of the peripheral industries of regenerative medicine is cell culture technology.
  • nutrients necessary for cell survival are added to the cells, and animal serum is added to grow the cells in an artificial culture vessel.
  • serum and other animal-derived components become a heterogeneous component medium, and there are safety risks and differences between lots, which may affect cell culture.
  • human iPS cell culture and the like in addition to the above, expensive imported products may be used, and there is a need for the development of a cell culture solution unique to Japan.
  • the deep ocean water generally means seawater distributed in the deep sea at a depth of 200 meters or less, and has features such as rich in inorganic nutrients and high low-temperature stability like the surface seawater.
  • a powdered DMEM medium is dissolved in deep sea water, and an antibiotic, glutamic acid, sodium bicarbonate, and FBS having a final concentration of 10% are added to prepare a DMEM medium containing deep sea water. ing.
  • Example 3 When primary human fibroblasts were cultured in this deep sea water-containing DMEM medium, cell growth was observed under medium conditions in which the deep sea water concentration was adjusted to 10 to 20%.
  • a serum-free and deep seawater-containing DMEM medium was prepared using deep seawater, and human primary fibroblasts were cultured in the serum-free and deep seawater-containing DMEM medium. It is said that cell growth inhibition was observed under the medium condition in which the concentration was adjusted to 30%.
  • the inorganic salt in deep sea water is separated by 90% by weight or more and then concentrated to separate precipitates and the like by a charged mosaic membrane.
  • the total amount of the organic substance is 0.1 to 10% by weight and the content of the inorganic salt is reduced.
  • There is also a method for producing a cell active substance containing a high concentration of a cell active substance of 100 ppm or less Patent Document 2.
  • the cell active substance has a peak in any fraction having a molecular weight of 1,000,000 or more, a molecular weight of 30,000 to 1,000,000, a molecular weight of 5,000 to 30,000, or a molecular weight of 5,000 or less by ultraviolet detection by gel filtration chromatography under predetermined conditions. And activate skin cells and / or immune cells.
  • dissolved inorganic salts were precipitated by vacuum distillation of the deep sea water off Suruga Bay filtered through a membrane filter, the precipitate was filtered, and the obtained filtrate was desalted with a mosaic charged membrane, and then the pressure was reduced. Distillation and filtration of the precipitate are repeated to obtain a concentrate.
  • the deep sea water containing an electrolyte and a non-electrolyte is brought into contact with water having a lower electrolyte concentration than the deep sea water through a charged mosaic membrane, so that the electrolyte in the deep sea water is more concentrated than the deep sea water.
  • a method for producing fibroblast active deep water which is characterized by selectively transferring the electrolyte and the non-electrolyte to water having a low electrolyte concentration (Patent Document 3).
  • the charged mosaic membrane can separate the contained electrolyte without applying external energy such as heat, stress, electricity, etc. It has a high degree of activation.
  • desalination is performed between the deep sea water and the ion-exchange distilled water through a charged mosaic membrane, and concentrated to 5% of the volume of the original deep sea water to obtain a cell active substance to activate the cell.
  • the cell relative activity is about twice as high as that of a cell active substance obtained by using an electrodialysis membrane instead of a charged mosaic membrane (Comparative Example 1) or an ultrafiltration desalination apparatus (Comparative Example 3). .
  • the present invention relates to a method for improving skin water content, texture and / or corneal cell condition, comprising concentrating deep ocean water using a nanofilter membrane to obtain a deep ocean water concentrate,
  • a method applied to cells (Patent Document 4).
  • the deep sea water enriched by the above-described specific method has a problem of producing cytokines and producing fibroblasts. It has a cell activating effect accompanied by proliferation.
  • Example 2 deep sea water off the Pacific Ocean side of Yoron Island in Kagoshima Prefecture was desalted using a nanofilter membrane, and a precipitate was obtained by vacuum distillation, followed by filtration to collect a filtrate. It concentrates by repeating filtration and obtains a deep seawater concentrate.
  • Example 13 normal human neonatal fibroblasts were cultured in DMEM containing 10% fetal calf serum for 24 hours, and the deep seawater concentrate (14 to 50 times) obtained in Example 2 was added. After culturing for days, the activation activity is evaluated. As a result, in the concentration range of 14, 25 and 41 times the concentration of the deep seawater concentrate, the activation effect is improved in a concentration-dependent manner by the MTT test.
  • Example 14 a comparative test using bittern was performed. The results show that adding the above deep seawater concentrate (30 to 45 times) to the medium has a higher effect of activating fibroblasts than bittern. Has become.
  • Patent Literature 2 and Patent Literature 3 use a charged mosaic membrane to remove inorganic salts contained in seawater, and Patent Literature 4 uses demineralized water desalted using a nanofilter membrane.
  • Patent Document 5 desalination-treated water obtained by subjecting deep-sea water to desalination by electrodialysis is also known (Patent Document 5). He says that deep-sea water can be desalinated by electrodialysis using an ion-exchange membrane to remove ions.
  • Patent Document 5 epidermal keratinocytes, skin fibroblasts, vascular endothelial cells, and lymphatic endothelial cells are cultured using a solution made isotonic by adding this desalinated water to deep ocean water, and Has confirmed survival.
  • JP 2003-334066 A Japanese Patent No. 4601891 Japanese Patent No. 4679773 Japanese Patent No. 5500757 Japanese Patent No. 5207048
  • Patent Literature 1 and Patent Literature 4 the cell proliferation activity is evaluated by adding FBS.
  • serum or other animal-derived components may have a lot-to-lot difference due to a difference between collected animals. Therefore, it is necessary to ensure safety against BSE and viruses.
  • pure water human cell culture may not be obtained due to infection with a virus or the like.
  • deep sea water occupies about 90% or more of the ocean, so it can be supplied stably and its composition is stable. Therefore, development of a cell culture solution derived from deep ocean water that can be used as a substitute for animal-derived components is desired.
  • the component ratio and component amount in the concentrate differ depending on the method of concentrating deep sea water and the degree of concentration.
  • the pore size of ultrafiltration is about 0.01 to 0.001 ⁇ m, and a protein having a specific molecular weight range can be concentrated by combining ultrafiltration membranes having different pore sizes.
  • Deep seawater contains various substances, for example, lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide; hereinafter referred to as ⁇ LPS), which is called endotoxin. Therefore, development of a cell culture solution containing no LPS and containing useful components concentrated using an ultrafiltration membrane is desired.
  • ⁇ LPS lipopolysaccharide
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a cell culture solution containing a macromolecular substance having a specific molecular weight range from deep ocean water, and a cell culture solution.
  • Another object of the present invention is to provide a liquid culture medium containing the cell culture solution.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell culture treatment solution containing the above cell culture solution.
  • Another object of the present invention is to provide a cell growth activity enhancer containing the above-described cell culture solution.
  • the present inventors have studied the deep sea water in detail, and as a result, by using a combination of a plurality of ultrafiltration membranes having different pore sizes, LPS is removed, and a solution in which a protein having a specific range of molecular weight is concentrated is removed.
  • the present inventors have found that they can be prepared, that this solution can be used as a cell culture solution, and that cell culture activity is enhanced by culturing animal cells by adding the cell culture solution, thereby completing the present invention.
  • a method for producing a cell culture solution is provided.
  • the present invention also includes a polymer substance (II) having a molecular weight of 3 to 50 kD contained in deep sea water, a serine / glycine molar ratio of 10 to 100, and a serine content of 1,000 to 3,000 nM. It provides a certain cell culture solution.
  • the present invention also provides a liquid culture medium comprising a culture medium base and the cell culture solution prepared by the production method or the cell culture solution.
  • the present invention provides the above liquid medium, wherein the culture medium base is any one of DMEM, EMEM, GMEM, IMEM, and RPMI-1640.
  • the present invention also provides a cell culture solution prepared by the production method or a cell culture treatment solution having an osmotic pressure of 200 to 400 mOsm / L, comprising the cell culture solution and a hypotonic solution. .
  • the present invention provides a cell growth activity enhancer or an alternative serum agent for cell culture, comprising the cell culture solution prepared by the production method or the cell culture solution.
  • a cell culture solution can be produced from deep sea water using a plurality of ultrafiltration membranes.
  • a solution adjusted to an osmotic pressure of 200 to 400 mOsm / L by adding a hypotonic solution to the cell culture solution can be used as a cell culture treatment solution.
  • FIG. 3 is a view showing a production process of the cell culture solution of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing a result of Example 4.
  • the ratio of the absorbance of the cell culture solution-added medium when the absorbance of the control medium is 100% was calculated as the MTT reduction rate (%).
  • FIG. 14 is a view showing a result of Example 5.
  • FIG. 3 (A) shows the results of culturing MCF7 cells by adding the cell culture solution of the present invention and staining ER
  • FIG. 3 (B) shows the results of staining the same PgR.
  • FIG. 3C is a diagram showing a result in which the HER2 does not exist.
  • Example 6 It is a figure which shows the result of Example 6 and is a figure which shows the well at the time of culture
  • a first aspect of the present invention is a step of filtering a deep ocean water through an ultrafiltration membrane (I) to remove a polymer substance (I) having a molecular weight of more than 50 kD to obtain a liquid passing through the ultrafiltration membrane (I);
  • the liquid passed through the ultrafiltration membrane (I) obtained in the above step is filtered through the ultrafiltration membrane (II) to obtain a circulating liquid containing the polymer substance (II) having a molecular weight of 3 to 50 kD.
  • producing a cell culture solution is produced.
  • Deep sea water The cell culture solution of the present invention uses deep sea water as a raw material.
  • the deep sea water means seawater distributed in the deep sea at a depth of 200 meters or less. There are no particular restrictions on the sampling location.
  • the sea near Japan is preferable because the transportation is convenient, but the present invention is not limited to this. It is preferable to remove insoluble matter from the collected deep sea water by filtration or the like. Thereby, clogging at the time of ultrafiltration can be eliminated and the production efficiency can be improved.
  • a filtrate obtained by filtering a substance having a pore diameter of more than 5 ⁇ m with a filter having a large pore diameter and further filtering with a filter having a pore diameter of 0.1 to 0.9 ⁇ m can be suitably used.
  • FIG. 1 One example of the production method of the present invention is shown in FIG.
  • a filtrate obtained by filtering the collected deep sea water 1 with a membrane filter having a pore size of 0.1 to 0.9 ⁇ m is introduced into the container 3, and supplied to the ultrafiltration membrane (I) 7 via the pump 5.
  • the high-molecular substance (I) exceeding 50 kD contained in the deep seawater 1 is removed by filtration using the ultrafiltration membrane (I).
  • polymer substance (I) examples include proteins having a molecular weight of more than 50 kD, lipopolysaccharides, nucleic acids such as DNA and RNA, polyphenols such as lignin, polysaccharides such as amylopectin, amylose and fucoidan, chitin and chitosan. Mucopolysaccharides, viruses and the like.
  • the objective is to remove at least endotoxin contained in the deep sea water 1 by the ultrafiltration membrane (I) 7.
  • Endotoxin is a typical pyrogen, and is known to be composed of hydrophobic lipid A and hydrophilic sugar chains and to associate in aqueous solution to form micelles. Examination of the conditions for removing endotoxin contained in the deep ocean water 1 revealed that it could be removed by the ultrafiltration membrane (I), and its pore size was 50 kD and about 5 nm.
  • the material of the ultrafiltration membrane (I) is a material capable of removing endotoxin.
  • the ultrafiltration membrane (I) 7 may be a hollow fiber membrane, a spiral membrane, a tubular membrane, or a flat membrane. In the present invention, it is preferable to use a hollow fiber membrane and perform filtration by cross flow.
  • the circulating liquid 11 that has not been able to pass through the pore diameter formed in the ultrafiltration membrane (I) 7 is circulated to the container 3 and is again introduced into the ultrafiltration membrane (I) 7 via the pump 5. Is preferred. By circulating, the flow rate of the ultrafiltration membrane (I) 7 per unit time can be increased, and efficient filtration can be performed.
  • the filtrate 9 from the ultrafiltration membrane (I) 7 is stored in the container 13 and introduced into the ultrafiltration membrane (II) 17 via the pump 15 to remove substances having a molecular weight of less than 3 kD.
  • the pore size of such an ultrafiltration membrane (II) 17 is 3 kD, approximately 2 nm.
  • the material polyethersulfone, cellulose acetate, aromatic polyamide, polyvinyl alcohol, polysulfone, polyvinylidene fluoride, polyethylene, and polyacrylonitrile can be suitably used.
  • the structure may be any of a hollow fiber membrane, a spiral membrane, a tubular membrane, and a flat membrane. However, as in the case of the ultrafiltration membrane (I) 7, a hollow fiber membrane is used, and filtration is performed by cross flow. Is preferred.
  • the filtrate 23 of the ultrafiltration membrane (II) 17 is collected in a container 25.
  • the object of the present invention is to concentrate the high molecular substance (II) having a molecular weight of 3 to 50 kD contained in the deep ocean water 1 and to store the circulating liquid 19 which has not passed through the pore diameter of the ultrafiltration membrane (II) 17 in a container. 13 and filtered again through the ultrafiltration membrane (II) 17.
  • the circulating liquid 19 is introduced into the container 13, the solution in the container 13 becomes a mixture of the filtrate 9 and the circulating liquid 19 introduced from the ultrafiltration membrane (I) 7.
  • the solution composition of the container 13 and the composition of the circulating liquid 19 become substantially equal.
  • the filtrate 23 of the ultrafiltration membrane (II) 17 can be removed out of the system, and the polymer substance (II) in the container 13 can be concentrated.
  • the circulating fluid 19 or the solution accumulated in the container 13 is referred to as a cell culture solution 21.
  • the cell culture solution 21 can be collected from the container 13.
  • the macromolecular substance (II) contained in the cell culture solution 21 includes proteins having a molecular weight of 3 to 50 kD, nucleic acids such as DNA and RNA, polyphenols, polysaccharides, mucopolysaccharides, and other components. As shown in the above steps, the deep ocean water 1 has not been subjected to heat treatment. Therefore, the cell culture solution 21 contains components that have not been thermally denatured. When this cell culture solution 21 was added to the medium and animal cells such as human normal skin keratinocytes and human breast cancer cells were cultured, the cell growth rate could be improved with a statistically significant difference.
  • the polymer substance (II) contained in the cell culture solution 21 is 10 to 10,000 times, preferably 30 to 1,000 times, more preferably 10 to 10,000 times the polymer substance (II) contained in the deep ocean water 1. Is preferably concentrated 50 to 500 times. Within this range, when used in a culture medium, the cell does not exhibit toxicity to cultured cells and can enhance cell growth.
  • the cell culture solution 21 produced by the above production method can be used as it is as a part of the cell culture solution.
  • the cell culture solution 21 minerals contained in the deep sea water 1 are present at the same concentration as the deep sea water 1.
  • the cell culture solution 21 may be desalted by ion exchange membrane electrodialysis, a charged mosaic membrane, a nanofilter membrane, or the like, and the desalted recovered solution may be used as a cell culture solution. .
  • the cell culture solution of the present invention is produced by the above steps. Further, it contains a high molecular substance (II) having a molecular weight of 3 to 50 kD contained in deep sea water as a concentrated component, low-molecular-weight amino acids and the like are not concentrated, and the molar ratio of serine / glycine is 10 to 100; A cell culture solution having an amount of 1,000 to 3,000 nM may be used.
  • the reason that the cell culture solution of the present invention increases the proliferation of animal cells such as human normal skin keratinocytes and human breast cancer cells is not clear, but the medium contains glycine in advance in an optimal range for culture. Therefore, it is presumed to be due to the action of the polymer substance (II).
  • a liquid medium can be prepared by dissolving the culture medium base using the cell culture solution.
  • Culture medium bases include animal cell culture media such as DMEM, EMEM, GMEM, IMEM, RPMI-1640 and the like.
  • a liquid culture medium can be prepared by replacing a part of the lysis solution with the cell culture solution.
  • the cell culture substrate is prepared in advance as a liquid medium, the cell culture solution can be added thereto to prepare a liquid medium.
  • the osmotic pressure can be adjusted by adding a hypotonic solution.
  • desalinated water of seawater that is, desalinated water of seawater.
  • the seawater may be either surface seawater or deep seawater.
  • the desalination method is not limited.
  • desalinated water obtained by ion exchange membrane electrodialysis In the ion exchange membrane electrodialysis method, a direct current voltage is applied while supplying seawater to a multi-chamber electrodialysis tank in which cation exchange membranes (cation membranes) and anion exchange membranes (anion membranes) are alternately arranged.
  • the cations move to the cathode side and the anions move to the anode side, forming an ion concentration chamber and a desalination chamber.
  • Demineralized water accumulates in the desalination chamber, and concentrated salt solution accumulates in the concentration chamber.
  • This desalinated water can be recovered as desalinated water.
  • any of a reverse osmosis membrane device, a multi-stage flash method in which seawater is heated to evaporate and then cooled again to make fresh water, or any other method may be used.
  • desalinated water obtained by electrodialysis of deep ocean water with ion exchange membrane can be suitably used.
  • Treatment solution for cell culture A hypotonic solution is added to the solution for cell culture to adjust the osmotic pressure to 200 to 400 mOsm / L, and can be used as a treatment solution for cell culture.
  • a treatment solution for cell culture for example, a balanced salt solution used when washing or diluting cells while maintaining the osmotic pressure inside and outside the cells, and used for detachment of adherent cells and cell dispersion of various tissues It can be used as a cell detachment solution or a cell dispersion solution.
  • the cell culture solution of the present invention can be used as a cell growth activity enhancer, either as a solution or as a powder or other dried product by lyophilization or the like.
  • a cell growth activity enhancer As described above, it has been found that preparing a culture medium using the cell culture solution of the present invention enhances the proliferation rate of normal skin keratinocytes (HaCaT) and breast cancer cells (MCF7).
  • HaCaT normal skin keratinocytes
  • MCF7 breast cancer cells
  • the cell growth activity enhancer can be used as an alternative serum derived from deep ocean water.
  • the cell culture solution of the present invention can be said to be a cell growth activity enhancer.
  • Substitute serum agent for cell culture means a serum substitute that replaces animal serum added as a nutrient necessary for cell survival during cell culture.
  • the solution for cell culture of the present invention can be used as a solution as a substitute serum agent for cell culture as it is.
  • Example 1 Production of cell culture solution
  • a cell culture solution was prepared using the apparatus shown in FIG. 10 L of deep sea water 1 collected from a depth of 200 meters or less below the sea surface collected in Toyama Bay is filtered through a 0.45 ⁇ m pore size Millipore filter, and used in a sterile container or a 10 L capacity when used immediately in the next step.
  • the solution was stored in the container 3.
  • the solution in the container 13 is pumped by the pump 15 at a flow rate of 15 to 30 psi (1 to 2 bar) at an ultrafiltration membrane (II) 17 (manufactured by Spectrum, pore size 3KD, material-modified polyether sulfone, length 22.2 cm, diameter 7. 8 mm, a surface area of 115 cm 2 ), the filtrate 23 was collected in the container 25, and the circulating liquid 19 was circulated in the container 13.
  • the ultrafiltration membrane (II) 17 was continued, the filtrate in the container 25 became 9.9 L, and the circulating liquid 19 in the container 13 became 100 ml.
  • the entire amount of the container 13 was collected as the cell culture solution 21.
  • the concentration rate of the macromolecular substance (II) contained in the cell culture solution 21 is 100 times that of the deep ocean water 1.
  • Example 2 The endotoxin of the cell culture solution prepared in Example 1 was measured using a toxinometer (ET-6000 / J, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Endotoxin was below the detection limit.
  • Example 3 Analysis of contained amino acids
  • Amino acids in the cell culture solution prepared in Example 1 were analyzed by the following Fmoc-LC-MS method.
  • a solution obtained by concentrating the surface water of Toyama Bay 100 times and a solution obtained by concentrating the deep sea water 200 meters below the sea surface collected 100 times from the sea surface collected in Toyama Bay 100 times were also analyzed for amino acids. Table 1 shows the results.
  • Fmoc-LC-MS method To the sample solution, 5 ml of a 0.1 M sodium tetraborate aqueous solution was added to adjust the pH to 10.5, and 2 ml of an acetonitrile solution of 100 ppm Fmoc-Cl ((9H-Fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl Chloride) was added. For 15 minutes to form a reaction solution containing the Fmoc derivative.
  • the reaction solution was applied to a C18 column (manufactured by GL Sciences; capacity: 1 g / 6 ml), and inorganic salts were removed using 5 ml of acetonitrile and 5 ml of a 1% aqueous formic acid solution as a mobile phase.
  • the Fmoc derivative was eluted with 5 ml of acetonitrile solution containing 1% formic acid, and the effluent was evaporated to dryness.
  • LC / MS analysis was performed under the following conditions.
  • Example 4 Animal cells: Effects on HaCaT and MCF7
  • An RPMI-1640 medium 100 U / ml penicillin (Sigma), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Sigma) / RPMI medium (Cell Science & Technology Inst., Inc.) was used as a control medium, and the lysis used in preparing the control medium was used.
  • a cell containing 0.2% by weight of the cell culture solution is replaced with the cell culture solution prepared in Example 1 and the deep sea water replaced with desalinated water obtained by ion exchange membrane electrodialysis.
  • a culture solution-containing medium was prepared.
  • HaCaT and MCF7 cells cultured in the above control medium were seeded in a 24-well plate at a concentration of 10,000 cells / cm 2 , cultured overnight at 37 ° C. and 0.5% carbon dioxide, and then cultured in PBS for 3 hours. Washed twice. 0.5 ml of a control medium or a medium containing a cell culture solution was added to each well, and the cells were cultured for 48 hours. After the culture, 0.5 mg / ml MTT reagent (Sigma, 5 mg / ml / PBS) was added to 50 ⁇ l / well, and the cells were cultured for 1 hour.
  • Example 2 shows the results.
  • RPMI-1640 medium 100 U / ml penicillin (Sigma), 100 ⁇ g / ml
  • RPMI-1640 medium 100 U / ml penicillin (Sigma), 100 ⁇ g / ml
  • ml streptomycin (Sigma) / RPMI medium was prepared, and a cell culture solution-containing medium containing 0.2% by weight of the cell culture solution was prepared.
  • MCF7 cells were seeded on this medium at a concentration of 10,000 cells / cm 2 , and cultured at 37 ° C. and 0.5% carbon dioxide for 48 hours.
  • Estrogen receptor Estrogen Receptor: ER
  • progesterone receptor progesterone receptor: PgR
  • FIG. 3A shows the result of ER
  • FIG. 3B shows the result of RgR.
  • HER2 glycoprotein was measured using a Human HER2 ELISA Kit (manufactured by Proteintech). The results are shown in FIG.
  • ER and PgR are shown in dark colors. ER was stained as shown in FIG. 3 (A), and PgR was stained as shown in FIG. 3 (B), and it was confirmed that these were present. On the other hand, HER2 was not detected as shown in FIG. These results are consistent with the normal cellular characteristics of MCF7. From this, it was confirmed that the cell culture solution produced in Example 1 had little toxicity to MCF7 cells.
  • Example 6 Effect on iPS cells
  • Eight types of DMEM / F12 media having the compositions shown in Table 2 were prepared.
  • KSR stands for Knockout Serum Replacement
  • bFGF stands for Basic Basic Fibroblast Growth Factor
  • NEAA stands for Non-Essential Amino Acids
  • Human iPS cells (409B02) obtained from RIKEN cell bank were seeded at a concentration of 10,000 cells / cm 2 in a 16-well plate, and each medium shown in Table 2 was added to each well by 2 wells at 37 ° C. and 0.5% CO 2. The cells were cultured under carbon conditions for 48 hours.
  • FIG. 4 shows the results.
  • AP staining was performed on the cultured cells shown in FIG.
  • the medium in each well was removed, washed with 2 ml of PBS (-), and this was repeated twice.
  • 500 ⁇ l of a 4% paraformaldehyde fixative (manufactured by Mutoh Chemical Co., Ltd.) was added, and the mixture was left at room temperature for 10 minutes.
  • the 4% paraformaldehyde fixative was removed, and 2 ml of PBS (-) was added for washing, and PBS (-) was removed.
  • Five drops of a chromogenic substrate for immunostaining, BCIP / NBT Substrate System (Dako K0598) were added dropwise to the wells, and staining was performed for 10 to 30 minutes.
  • the staining solution was removed, Milli-Q water was added to stop the reaction, and imaging was performed.
  • FIG. 5 shows the results.
  • human iPS cells had higher proliferation ability in the culture medium containing KSR and bFGF.
  • the cell proliferation of the human iPS cells was suppressed in the range of 0.1 to 1.5% of the concentration of the cell culture solution prepared in Example 1. Was observed to be maintained. That is, although the colonies were small, it was confirmed that when the concentration of the cell culture solution prepared in Example 1 was increased, the colonies were stained firmly and the undifferentiated ability was increased. Particularly at 1.5%, excellent undifferentiated ability was confirmed.
  • Example 1 the undifferentiated ability was found to be reduced from the staining confirmation in FIG. found. However, when the cell culture solution prepared in Example 1 was added at 1.5%, it was confirmed that the undifferentiated ability was very strongly maintained. It has been clarified that the cell culture solution produced in Example 1 has a dose-dependent effect of maintaining undifferentiated ability on undifferentiated cells such as human iPS cells. Moreover, the cell culture solution prepared in Example 1 can maintain the undifferentiated ability of iPS cells useful in regenerative medicine without using KSR or bFGF. Since the undifferentiated cells can be proliferated by maintaining the undifferentiated ability, the activity of maintaining the undifferentiated ability is also included in the ability to enhance the cell proliferation activity. The cell culture solution prepared in Example 1 can maintain the undifferentiated ability of human iPS cells used in regenerative medicine and the like, and can be used as a cell growth activity enhancer.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

海洋深層水由来の細胞培養用溶液の調製方法、細胞培養用溶液を含む液体培地などを提供する。海洋深層水を限外ろ過膜（Ｉ）でろ過して分子量５０ｋＤ超の高分子物質（Ｉ）を除去した限外ろ過膜通過液を取得する工程と、前記工程で取得した限外ろ過膜通過液を限外ろ過膜（ＩＩ）でろ過して分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を含む限外ろ過膜循環液を取得する工程とを含むことを特徴とする。得られた細胞培養用溶液を培地溶解用液として使用すると細胞増殖活性が増強される。

Description

細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤
　本発明は、海洋深層水から２種の限外ろ過膜を使用して得る細胞培養用溶液の製造方法、特定組成の細胞培養用溶液、前記細胞培養用溶液を含む液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤に関する。
　再生医療の周辺産業の一つとして細胞培養技術がある。細胞培養では、細胞の生存に必要な栄養素を細胞に添加するが、人工的な培養容器内で細胞を増殖させるために動物血清が添加される。しかしながら、血清その他の動物由来成分は、異種成分培地となり安全上のリスク、及びロット間の差があり、細胞培養に影響を与える場合がある。また、ヒトｉＰＳ細胞培養等では、上記に加えて高価な輸入品を使用する場合があり、日本独自の細胞培養用溶液の開発が希求されている。
　一方、細胞が要求する多様な培養条件を満たす細胞培養培地として、海洋深層水を含む培地がある（特許文献１）。海洋深層水とは、一般に、深度２００メートル以深の深海に分布する海水を意味し、表層海水と同様に、無機栄養塩類が豊富であり、低温安定性が高いなどの特徴を有する。特許文献１の実施例１では、海洋深層水に粉末のＤＭＥＭ培地を溶解し、抗生物質、グルタミン酸、炭酸水素ナトリウム、終濃度１０％のＦＢＳを添加して、海洋深層水含有ＤＭＥＭ培地を作製している。この海洋深層水含有ＤＭＥＭ培地でヒト初代線維芽細胞を培養したところ、海洋深層水濃度が１０～２０％に調整された培地条件で細胞増殖が観察されたという。なお、実施例３では、海洋深層水を使用して無血清・海洋深層水含有ＤＭＥＭ培地を作製し、この無血清・海洋深層水含有ＤＭＥＭ培地でヒト初代線維芽細胞を培養し、海洋深層水濃度が３０％に調整された培地条件では細胞の増殖抑制が観察されたという。
　また、海洋深層水の無機塩を９０重量％以上分離した後に濃縮して析出物等を荷電モザイク膜により分離し、有機物質の総合量が０．１～１０重量％かつ無機塩の含有量が１００ｐｐｍ以下の、細胞活性物質を高い濃度で含有する細胞活性物質の製造方法もある（特許文献２）。前記細胞活性物質は、所定条件のゲル濾過クロマトグラフィー分析による紫外線検出によって、分子量１００万以上、分子量３万～１００万、分子量５０００～３万、または分子量５０００以下のいずれかの画分にピークを有し、皮膚細胞および／または免疫細胞を活性化するという。実施例では、メンブランフィルターでろ過した駿河湾沖の海洋深層水を減圧蒸留して溶存する無機塩を析出させ、析出物をろ過し、得られたろ液をモザイク荷電膜で脱塩し、次いで、減圧蒸留、析出物のろ過を繰り返して濃縮物を得ている。
　更に、電解質と非電解質とを含有する海洋深層水を、荷電モザイク膜を介して該海洋深層水よりも電解質濃度の低い水と接触させて、該海洋深層水中の電解質を、海洋深層水よりも電解質濃度の低い水に選択的に移動させて、電解質と非電解質とを分離することを特徴とする、繊維芽細胞活性深層水の製造方法もある（特許文献３）。海水の脱塩方法により繊維芽細胞等に対する活性が異なるが、荷電モザイク膜によれば、熱、応力、電気などの外部エネルギーを付与せず含まれる電解質を分離できるため、繊維芽細胞に対する相対的活性化度が高い、という。実施例では、海洋深層水とイオン交換蒸留水との間に荷電モザイク膜を介して脱塩し、元の海洋深層水の容積の５％まで濃縮して細胞活性物質を得て細胞活性化を評価している。荷電モザイク膜に代えて電気透析膜（比較例１）や、限外ろ過脱塩装置（比較例３）を使用して得た細胞活性物質と比較して、細胞相対活性が約２倍高いという。
　更に、皮膚の水分量やキメ及び／又は角層細胞状態を改善する方法であって、ナノフィルター膜透過を使用して海洋深層水を濃縮し、海洋深層水濃縮物を得て、これを皮膚細胞に適用する方法もある（特許文献４）。海洋深層水の濃縮方法及びその濃縮の程度によって、濃縮物中の成分比及び成分量に大きな差が生じるが、上記した特定の方法で濃縮した海洋深層水は、サイトカインの産生及び線維芽細胞の増殖を伴う細胞賦活作用を有するという。実施例２では、鹿児島県与論島太平洋側沖の海洋深層水をナノフィルター膜を使用して脱塩し、減圧蒸留により析出物を得た後これをろ過してろ液を回収し、前記減圧蒸留およびろ過を繰り返して濃縮し、海洋深層水濃縮物を得ている。実施例１３では、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭで正常ヒト新生児由来の線維芽細胞を２４時間培養し、実施例２で得た海洋深層水濃縮物（１４倍～５０倍）を添加し、２日間培養し、賦活活性を評価している。その結果、海洋深層水濃縮物が１４、２５、４１倍の濃度範囲で、ＭＴＴ試験により濃度依存的に賦活作用が向上するという。なお、実施例１４において、ニガリによる比較試験を行っているが、ニガリよりも、上記海洋深層水濃縮物（３０～４５倍）を培地に添加した方が線維芽細胞の賦活効果が高い結果となっている。
　海水の塩類濃度は約３．５質量％である。海水に含まれる無機塩を除去するために前記特許文献２、特許文献３は荷電モザイク膜を使用し、特許文献４ではナノフィルター膜を使用して脱塩した脱塩水を使用している。一方、海洋深層水を電気透析により淡水化処理した淡水化処理水も知られている（特許文献５）。海洋深層水を、イオン交換膜を用いて電気透析することでイオンを除去し、淡水化できるという。特許文献５では、海洋深層水にこの淡水化処理水を加えて等張にした溶液を使用して表皮角化細胞、皮膚繊維芽細胞、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞を培養し、細胞の生存を確認している。
特開２００３－３３４０６６号公報 特許第４６０１８９１号公報 特許第４６７９７７３号公報 特許第５５００７５７号公報 特許第５２０７０４８号公報
　上記特許文献１や特許文献４では、ＦＢＳを添加して細胞増殖活性を評価しているが、血清その他の動物由来成分は、採取動物の相違によるロット間の差が生じる場合あり、動物由来であるためにＢＳＥやウィルスに対する安全性確保の必要がある。さらに、ｉＰＳ細胞の培養においては、ウィルス等の感染などにより純水なヒト細胞培養とならない場合がある。これに対し、海洋深層水は海洋の約９０％以上を占めるため安定供給が可能で、組成も安定している。したがって動物由来成分の代替えとなりうる海洋深層水由来の細胞培養用溶液の開発が望まれる。
　更に、特許文献４が記載するように、海洋深層水の濃縮方法や濃縮の程度によって濃縮物中の成分比や成分量が異なる。限外ろ過の孔径は約０．０１～０．００１μｍであり、孔径の異なる限外ろ過膜を組み合わせることで特定の分子量範囲のタンパク質を濃縮することができる。海洋深層水には多様な物質が含有され、例えば、内毒素と称されるリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；以下　ＬＰＳと称する。）なども含まれる。したがって、限外ろ過膜を使用してＬＰＳを含まず、かつ有用成分が濃縮された、細胞培養用溶液の開発が望まれる。
　上記現状に鑑みて、本発明は、海洋深層水から特定分子量範囲の高分子物質を含有する細胞培養用溶液の製造方法、および細胞培養用溶液を提供することを目的とする。
　また、本発明は、上記細胞培養用溶液を含む液体培地を提供することを目的とする。
　更に、本発明は、上記細胞培養用溶液を含む細胞培養用処理液を提供することを目的とする。
　加えて、本発明は、上記細胞培養用溶液を含む細胞増殖活性増強剤を提供することを目的とする。
　本発明者等は、海洋深層水について詳細に検討した結果、孔径の異なる複数の限外ろ過膜を組み合わせて使用することで、ＬＰＳを除去し、特定範囲の分子量のタンパク質が濃縮された溶液を調製することができること、この溶液は細胞培養用溶液として使用できること、当該細胞培養溶液を添加して動物細胞を培養すると細胞増殖活性が増強されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、海洋深層水を限外ろ過膜（Ｉ）でろ過して分子量５０ｋＤ超の高分子物質（Ｉ）を除去した限外ろ過膜（Ｉ）通過液を取得する工程と、前記工程で取得した限外ろ過膜（Ｉ）通過液を限外ろ過膜（ＩＩ）でろ過して分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を含む限外ろ過膜（ＩＩ）循環液を取得する工程とを含むことを特徴とする、細胞培養用溶液の製造方法を提供するものである。
　また本発明は、海洋深層水に含まれる分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を含み、セリン／グリシンのモル比が１０～１００であり、セリン含有量が１，０００～３，０００ｎＭである細胞培養用溶液を提供するものである。
　また本発明は、培養培地基剤と、前記製造方法で調製した細胞培養用溶液または前記細胞培養用溶液とを含む、液体培地を提供するものである。
　更に、本発明は、前記培養培地基剤が、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０のいずれかである、前記液体培地を提供するものである。
　また本発明は、前記製造方法で調製した細胞培養用溶液または前記細胞培養用溶液と、低張液とを含む、浸透圧２００～４００ｍＯｓｍ／Ｌの、細胞培養用処理液を提供するものである。
　加えて本発明は、前記製造方法で調製した細胞培養用溶液または前記細胞培養用溶液を含む、細胞増殖活性増強剤、または細胞培養用代替血清剤を提供するものである。
　本発明によれば、海洋深層水から複数の限外ろ過膜を使用して細胞培養用溶液を製造することができる。この細胞培養用溶液に低張液を添加して浸透圧２００～４００ｍＯｓｍ／Ｌに調整した溶液は、細胞培養用処理液として使用することができる。
本発明の細胞培養用溶液の製造工程を示す図である。 実施例４の結果を示す図である。対照培地の吸光度を１００％とした場合の細胞培養用溶液添加培地による吸光度の割合をＭＴＴ減少率（％）として算出したものである。 実施例５の結果を示す図である。図３（Ａ）は、本発明の細胞培養用溶液を添加してＭＣＦ７細胞を培養し、ＥＲを染色した結果を示す図であり、図３（Ｂ）は、同ＰｇＲを染色した結果を示す図であり、図３（Ｃ）は、同ＨＥＲ２が存在しない結果を示す図である。 実施例６の結果を示す図であり、本発明の細胞培養用溶液を添加してｉＰＳ細胞を培養した際のウェルを示す図である。 実施例６の結果を示す図であり、本発明の細胞培養用溶液を添加してｉＰＳ細胞を培養し、ＡＰ染色した結果を示す図である。
　本発明の第一は、海洋深層水を限外ろ過膜（Ｉ）でろ過して分子量５０ｋＤ超の高分子物質（Ｉ）を除去した限外ろ過膜（Ｉ）通過液を取得する工程と、前記工程で取得した限外ろ過膜（Ｉ）通過液を限外ろ過膜（ＩＩ）でろ過して分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を含む限外ろ過膜（ＩＩ）循環液を取得する工程とを含むことを特徴とする、細胞培養用溶液の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
　（１）海洋深層水
　本発明の細胞培養用溶液は、海洋深層水を原料とする。本願において、海洋深層水とは、深度２００メートル以深の深海に分布する海水を意味するものとする。採取場所に特に制限はない。搬送が利便である点で日本近海が好ましいが、これに限定されるものではない。採取した海洋深層水は、ろ過その他によって不溶物を除去することが好ましい。これにより限外ろ過の際の目詰まりを解消して製造効率を向上させることができる。例えば、孔径の大きなフィルターで５μｍ超の物質をろ過し、更に、孔径が０．１～０．９μｍφのフィルターでろ過したろ液などを好適に使用することができる。
　（２）細胞培養用溶液の製造方法
　本発明の製造方法では、上記海洋深層水を限外ろ過膜（Ｉ）に導入し、得られたろ液を限外ろ過膜（ＩＩ）に導入し、限外ろ過膜（ＩＩ）に形成された孔径を通過しなかった循環液を回収して製造することができる。
　本発明の製造方法の一例を図１に示す。例えば、採取した海洋深層水１を孔径が０．１～０．９μｍのメンブランフィルターでろ過したろ液を容器３に導入し、ポンプ５を介して限外ろ過膜（Ｉ）７に供給する。本発明では限外ろ過膜（Ｉ）を使用してろ過することで、海洋深層水１に含まれる５０ｋＤ超の高分子物質（Ｉ）を除去する。このような高分子物質（Ｉ）としては、分子量５０ｋＤ超のタンパク質、リポ多糖類、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類、リグニンなどのポリフェノール、アミロペクチン、アミロース、フコイダンなどの多糖類、キチン、キトサンなどのムコ多糖類、ウィルスなどがある。
　特に、限外ろ過膜（Ｉ）７により少なくとも、海洋深層水１に含まれるエンドトキシンを除去することを目的とする。エンドトキシンは代表的な発熱物質であり、疎水性のリピドＡと親水性の糖鎖とからなり、水溶液中で会合してミセルを構成することが知られている。海洋深層水１に含まれるエンドトキシンを除去できる条件を検討したところ、限外ろ過膜（Ｉ）により除去できること、そのポアサイズは５０ｋＤ、およそ５ｎｍであることが判明した。限外ろ過膜（Ｉ）の素材は、エンドトキシンを除去できるものであり、例えば、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリルを好適に使用することができる。限外ろ過膜（Ｉ）７は、中空糸膜、スパイラル膜、チューブラー膜、平膜のいずれであってもよい。本発明では、中空糸膜を使用し、クロスフローでろ過することが好ましい。
　本発明では、限外ろ過膜（Ｉ）７に形成された孔径を通過できなかった循環液１１は、容器３に循環させ、ポンプ５を介して再度限外ろ過膜（Ｉ）７に導入することが好ましい。循環させることで、限外ろ過膜（Ｉ）７の単位時間当たりの流量を増加させ、効率的なろ過を行うことができる。
　次いで、限外ろ過膜（Ｉ）７のろ過液９を容器１３に貯留し、ポンプ１５を介して限外ろ過膜（ＩＩ）１７に導入し、分子量３ｋＤ未満の物質を除去する。このような限外ろ過膜（ＩＩ）１７のポアサイズは、３ｋＤ、およそ２ｎｍである。素材は、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリルを好適に使用することができる。また、構造は、中空糸膜、スパイラル膜、チューブラー膜、平膜のいずれであってもよいが、限外ろ過膜（Ｉ）７と同様に、中空糸膜を使用し、クロスフローでろ過することが好ましい。限外ろ過膜（ＩＩ）１７のろ液２３は、容器２５に回収する。
　本発明では、海洋深層水１に含まれる分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を濃縮することを目的とし、限外ろ過膜（ＩＩ）１７の孔径を通過できなかった循環液１９を容器１３に導入し、再度限外ろ過膜（ＩＩ）１７でろ過する。循環液１９を容器１３に導入すると、容器１３の溶液は、限外ろ過膜（Ｉ）７から導入されたろ液９と循環液１９との混合液となる。限外ろ過膜（ＩＩ）と容器１３との循環を繰り返すことで、実質的に容器１３の溶液組成と循環液１９の組成とが略等しくなる。また、循環を繰り返すことで、限外ろ過膜（ＩＩ）１７のろ液２３を系外に除去でき、容器１３内の高分子物質（ＩＩ）を濃縮することができる。本発明では、循環液１９、または容器１３に集積された溶液を細胞培養用溶液２１とする。細胞培養用溶液２１は、容器１３から回収液することができる。
　細胞培養用溶液２１に含まれる高分子物質（ＩＩ）としては、分子量３～５０ｋＤのタンパク質、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類、ポリフェノール、多糖類、ムコ多糖類、その他の成分がある。上記工程で示すように、海洋深層水１は加熱処理がなされていない。このため、細胞培養用溶液２１には、熱変性していない成分が含まれている。この細胞培養用溶液２１を培地に添加してヒト正常皮膚ケラチノサイトやヒト乳癌細胞などの動物細胞を培養すると、統計的有意差をもって細胞の増殖率を向上させることができたのである。なお、細胞培養用溶液２１に含まれる高分子物質（ＩＩ）は、海洋深層水１に含まれる高分子物質（ＩＩ）の１０～１０，０００倍、好ましくは３０～１，０００倍、より好ましくは５０～５００倍に濃縮されていることが好ましい。この範囲であれば、培養培地に使用した際に培養細胞に毒性を示さず、かつ細胞増殖を増強させることができる。
　本発明では、上記製造方法で製造した細胞培養用溶液２１をそのまま細胞培養用溶液の一部として使用することができる。一方、細胞培養用溶液２１には、海洋深層水１に含まれるミネラルが海洋深層水１と同濃度で存在する。本発明では、細胞培養用溶液２１をイオン交換膜電気透析、荷電モザイク膜、ナノフィルター膜、その他によって脱塩してもよく、この脱塩した回収液を細胞培養用溶液として使用してもよい。
　（３）細胞培養用溶液
　本発明の細胞培養用溶液は、上記工程によって製造されたものである。
　また、海洋深層水に含まれる分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を濃縮成分として含み、低分子のアミノ酸等は濃縮されず、セリン／グリシンのモル比が１０～１００であり、セリン含有量が１，０００～３，０００ｎＭである細胞培養用溶液であってもよい。本発明の細胞培養用溶液が、ヒト正常皮膚ケラチノサイトやヒト乳癌細胞などの動物細胞の増殖を増加させる理由は明確ではないが、培地には、グリシンが予め培養に至適な範囲で含まれているため、高分子物質（ＩＩ）の作用によるものと推定される。
　（４）液体培地
　前記細胞培養用溶液を用いて培養培地基剤を溶解して液体培地を調製することができる。培養培地基剤としては、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０などの動物細胞培養用培地がある。例えば、粉末状の細胞培養基質を溶解用溶液で溶解して液体培地を調製する場合には、溶解用溶液の一部を前記細胞培養用溶液に代えて液体培地を調製することができる。また、細胞培養基質が液体培地として予め調製されている場合には、これらに前記細胞培養用溶液を添加して、液体培地を調製することができる。本発明の細胞培養用溶液にミネラルが含まれている場合には、低張液を添加して浸透圧を調整することができる。
　このような低張液としては、水の他、海水の淡水化処理水、すなわち海水の脱塩水などがある。海水としては、表層海水、海洋深層水の何れでもよい。また、淡水化処理方法にも限定はなく、たとえば、イオン交換膜電気透析法によって得られる淡水化処理水がある。イオン交換膜電気透析法では、陽イオン交換膜（カチオン膜）と陰イオン交換膜（アニオン膜）とを交互に並べた多室電気透析槽に海水を供給しながら直流電圧を通じると、電位差により陽イオンは陰極側に、陰イオンは陽極側に移動し、イオンの濃縮室と脱塩室が形成される。脱塩室には脱塩水が集積し、濃縮室には濃縮塩溶液が集積する。この脱塩水を淡水化処理水として回収することができる。その他、逆浸透膜装置、海水を熱して蒸発させ、再び冷やして真水にする多段フラッシュ法、その他いずれであってもよい。本発明では、海洋深層水をイオン交換膜電気透析して得られる淡水化処理水を好適に使用することができる。
　（５）細胞培養用処理液
　前記細胞培養用溶液に低張液を添加して浸透圧２００～４００ｍＯｓｍ／Ｌに調整し、細胞培養用処理液として使用することができる。細胞培養用処理液としては、例えば、細胞内外の浸透圧を維持しながらの細胞の洗浄や希釈を行う際に使用する平衡塩溶液や、接着細胞の剥離や各種組織の細胞分散などに使用する細胞剥離液や細胞分散用溶液として使用することができる。
　（６）細胞増殖活性増強剤
　本発明の細胞培養用溶液は、溶液のまま、またはこれを凍結乾燥その他により粉末その他の乾燥物として、細胞増殖活性増強剤として使用することができる。前記したように、本発明の細胞培養用溶液を使用して培養培地を調製すると、正常皮膚ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）や乳がん細胞（ＭＣＦ７）の増殖率を増強させることが判明した。一方、ヒトｉＰＳ細胞を培養したところ、培地に代替血清ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が含まれない場合にも、コロニーが添加量に応じて大きくなることが判明した。したがって、細胞増殖活性増強剤は、海洋深層水由来の代替血清として使用することができる。なお、後記する実施例に示すように、ＨａＣａＴやＭＣＦ７では細胞増殖増強活性が観察されたが、ヒトｉＰＳ細胞では細胞増殖率は同等であり、未分化能を均一にする特質が観察された。このように、本発明の細胞培養用溶液は、細胞増殖活性増強剤といえる。
　（７）細胞培養用代替血清剤
　本発明における「代替血清剤」とは、細胞培養の際に、細胞の生存に必要な栄養素として添加させる動物血清に代わる、血清代用品を意味する。本発明の細胞培養用溶液は、溶液のまま、細胞培養用代替血清剤として使用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（実施例１：細胞培養用溶液の製造）
　図１に示す装置を用いて細胞培養用溶液を調製した。
　富山湾で採取した海面下２００メートル以深から採取した１０Ｌの海洋深層水１をポアサイズ０．４５μｍのミリポアフィルターでろ過し、無菌容器、または、すぐに次工程で使用する場合には、容量１０Ｌの容器３に貯液した。これをポンプ５で流速圧力１５～３０ｐｓｉ（１～２ｂａｒ）で限外ろ過膜（Ｉ）７（スペクトラム社製、ポアサイズ５０ｋＤ、材質；修飾ポリエーテルスルホン、長さ２２．２ｃｍ、径７．８ｍｍ、表面積１１５ｃｍ２）に導入し、循環液１１を容器３に戻し、ポンプ５による限外ろ過膜（Ｉ）７への導入および循環液１１の循環を継続した。一方、限外ろ過膜（Ｉ）７のろ液９は、容量１Ｌの容器１３に導入した。容器１３の溶液をポンプ１５で流速圧力１５～３０ｐｓｉ（１～２ｂａｒ）で限外ろ過膜（ＩＩ）１７（スペクトラム社製、ポアサイズ３ＫＤ、材質修飾ポリエーテルスルホン、長さ２２．２ｃｍ、径７．８ｍｍ、表面積１１５ｃｍ２）に導入し、ろ液２３を容器２５に回収すると共に、循環液１９を容器１３に循環させた。限外ろ過膜（ＩＩ）１７による循環ろ過を継続したところ、容器２５のろ液は９．９Ｌとなり、容器１３の循環液１９は、１００ｍｌとなった。容器１３の全量を細胞培養用溶液２１として回収した。細胞培養用溶液２１に含まれる高分子物質（ＩＩ）の濃縮率は、海洋深層水１の１００倍となる。
　（実施例２）
　実施例１で製造した細胞培養用溶液について、トキシノメーター（富士フイルム和光純薬株式会社製、ＥＴ－６０００／Ｊ）によりエンドトキシンの測定を行った。エンドトキシンは検出限界以下であった。
　（実施例３：含有アミノ酸の分析）
　実施例１で製造した細胞培養用溶液を下記のＦｍｏｃ－ＬＣ－ＭＳ法でアミノ酸を分析した。また、富山湾の表層水を１００倍に濃縮した溶液、および富山湾で採取した海面下２００メートル以深の海洋深層水を１００倍に濃縮した溶液も同様に処理してアミノ酸を分析した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（Ｆｍｏｃ－ＬＣ－ＭＳ法）
　試料溶液に、０．１Ｍの四ホウ酸ナトリウム水溶液５ｍｌを添加してｐＨ１０．５に調整し、１００ｐｐｍＦｍｏｃ－Ｃｌ（（９Ｈ－Ｆｌｕｏｒｅｎ－９－ｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）のアセトニトリル溶液２ｍｌを添加し、室温で１５分間静置し、Ｆｍｏｃ誘導体を含む反応液を形成した。反応液を、Ｃ１８カラム（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製；容量１ｇ／６ｍｌ）にアプライし、アセトニトリル５ｍｌ、１％ギ酸水溶液５ｍｌを移動相として無機塩類を除去した。次いで、１％ギ酸含有アセトニトリル溶液５ｍｌでＦｍｏｃ誘導体を溶出し、流出液を蒸発乾固した。
　蒸発乾固した試料を、ＬＣ／ＭＳ用溶媒（０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル＝８：２）１ｍｌに溶解し、ＬＣ／ＭＳ用試料を調製した。ＬＣ／ＭＳ解析は以下の条件で行った。
　ＬＣ条件
　カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨＣ１８（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）
　移動相：Ａ：０．１％　ギ酸水溶液、Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
　グラジエント：Ａ／Ｂ：８０／２０→４０／６０（８分）→１０／９０（１０分）→２／９８（１１分）→２／９８（１２分）→８０／２０（１２．１０分）
　カラム温度：４０℃、
　流速：０．４ｍｌ／分
　注入量：５μｌ
　ＭＳ条件
　イオンモード：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
　キャピラリー電圧：２．０ｋＶ
　エクストラクター電圧：３Ｖ
　ＲＦレンズ　電圧：２．５Ｖ
　ソース温度：１５０℃
　デソルベーション温度：４００℃
　コーン／デソルベーション　ガス流量：５０／８００　Ｌ／Ｈｒ
　ＭＳ／ドータースキャンレンジ：ｍ／ｚ１５０～１２００
　コーン電圧：１５～２０Ｖ
　コリジョンエネジー：１５～２５ｅＶ
　（実施例４：動物細胞：ＨａＣａＴ、およびＭＣＦ７に対する効果）
　ＲＰＭＩ－１６４０培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン（シグマ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）／ＲＰＭＩ培地（Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔ．，　Ｉｎｃ．））を対照培地とし、対照培地を調製する際に使用した溶解液の一部を実施例１で製造した細胞培養用溶液および海洋深層水をイオン交換膜電気透析法して得られる淡水化処理水に代え、細胞培養用溶液を０．２重量％含有する細胞培養用溶液添加培地を調製した。
　上記対照培地で培養したＨａＣａＴ、およびＭＣＦ７細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２濃度で２４ウェルプレートに播種し、３７℃、０．５％二酸化炭素の条件で一晩培養し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。
　各ウェルに対照培地、または細胞培養用溶液添加培地を０．５ｍｌ加え、４８時間培養した。培養後に、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（シグマ、５ｍｇ／ｍｌ／ＰＢＳ）を５０μｌ／ウェルとなるよう加え、１時間培養した。次いで、培地を除去し、ＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）を４００μｌ／ウェル添加し、Ａｂｓ５７０ｎｍ、ｒｅｆ６５０ｎｍ（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００マイクロプレートリーダー、テカンジャパン）で吸光度を測定した。対照培地を使用した場合の吸光度を１００％とし、細胞培養用溶液添加培地を使用した場合の割合をＭＴＴ減少率（％）として算出した。結果を図２に示す。細胞培養用溶液を０．２重量％添加したことで、ＨａＣａＴおよびＭＣＦ７の双方でＭＴＴ減少率（％）が１００％を超え、統計的有意差をもって対照培地に対する細胞の増殖が観察された（ｎ＝３）。これらにより、実施例１で製造した細胞培養用溶液は、ＨａＣａＴやＭＣＦ７などの動物細胞に対して、細胞増殖活性増強剤として作用することが判明した。
　（実施例５：ホルモンレセプターへの効果）
　実施例１で製造した細胞培養用溶液と海洋深層水をイオン交換膜電気透析で脱塩して得た淡水化処理水を使用してＲＰＭＩ－１６４０培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン（シグマ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）／ＲＰＭＩ培地（Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔ．，　Ｉｎｃ．））を調製し、細胞培養用溶液が０．２重量％含有される細胞培養用溶液添加培地を調製した。
　この培地にＭＣＦ７細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２濃度で播種し、３７℃、０．５％二酸化炭素の条件で４８時間培養した。ＭＣＦ７細胞に、ＥＲ／ＰｇＲ（ＭＯＮＯ）ユニバーサルキット（株式会社ニチレイバイオサイエンス社製）を使用し、取扱い指示書に従い、エストロゲンレセプター（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰｇＲ））を測定した。図３（Ａ）にＥＲの結果を、図３（Ｂ）にＲｇＲの結果を示す。また、Ｈｕｍａｎ　ＨＥＲ２　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）を使用してＨＥＲ２糖タンパク質を測定した。結果を図３（Ｃ）に示す。
　ＥＲやＰｇＲは、暗色で示される。図３（Ａ）に示すようにＥＲが染色され、図３（Ｂ）に示すようにＰｇＲが染色され、これらが存在することが確認された。一方、図３（Ｃ）に示すようにＨＥＲ２は検出されなかった。これらの結果は、ＭＣＦ７の通常の細胞の特徴と合致する。このことから、実施例１で製造した細胞培養用溶液は、ＭＣＦ７細胞に与える毒性は少ないことが確認された。
　（実施例６：ｉＰＳ細胞への効果）
　表２に示す組成の８種類のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。なお、表中ＫＳＲは、Knockout Serum Replacementであり、ｂＦＧＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（Human basic Fibroblast Growth Factor）であり、ＮＥＡＡは、Non-Essential Amino Acidsであり、細胞培養用溶液とは、実施例１で製造した細胞培養用溶液を意味する。
　理研細胞バンクから入手したヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ０２）を１０，０００細胞／ｃｍ２濃度で１６ウェルプレートに播種し、表２に示す各培地を２ウェルずつ添加して３７℃、０．５％二酸化炭素の条件で４８時間培養した。結果を図４に示す。
　また、図４に示す培養細胞について、ＡＰ染色を行った。
　各ウェルの培地を除去し、ＰＢＳ（－）２ｍｌを入れて洗浄し、これを２回おこなった。４％パラホルムアルデヒド固定液（武藤化学株式会社製）５００μｌを入れ、室温で１０分間放置した。４％パラホルムアルデヒド固定液を除去してＰＢＳ（－）２ｍｌを入れて洗浄し、ＰＢＳ（－）を除去した。ウェルに、免疫染色用発色基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ　Ｋ０５９８）を５滴滴下し、１０～３０分間染色した。染色液を除去しミリＱ水を入れ反応を止め、撮像した。結果を図５に示す。
　図４の培地番号１と培地番号５とを比較して明らかなように、ヒトｉＰＳ細胞は、ＫＳＲおよびｂＦＧＦを含む培地でより増殖能が高かったが、培地番号１～培地番号４を比較すると、実施例１で製造した細胞培養用溶液の添加濃度０．１～１．５％の範囲でヒトｉＰＳ細胞の細胞増殖は抑制されるが、図５のＡＰ染色結果からｉＰＳ細胞の未分化状態が維持されることが観察された。つまり、コロニーは小ぶりとなるが、実施例１で製造した細胞培養用溶液の添加濃度を増やすとしっかりと染色され未分化能が高まることが確認された。特に１．５％で優れた未分化能が確認された。また、ＫＳＲ、ｂＦＧＦなしの培地番号５～培地番号８で比較しても、培地番号５の細胞培養用溶液ではコロニーは存在するが、図５の染色確認から未分化能は落ちていることが判明した。しかし、実施例１で製造した細胞培養用溶液を１．５％で添加したとき、未分化能が非常に強く維持されていることが確認された。実施例１で製造した細胞培養用溶液は、ヒトｉＰＳ細胞などの未分化細胞に対し、用量依存的に未分化能の維持効果を有することが明確となった。しかも、実施例１で製造した細胞培養用溶液は、ＫＳＲやｂＦＧＦを使用することなく、再生医療で有用なｉＰＳ細胞の未分化能を維持することができる。未分化細胞は、未分化能の維持によってその後の増殖が可能となるから、未分化能の維持活性も、細胞増殖活性増強能に含まれる。実施例１で製造した細胞培養用溶液は、再生医療などで使用するヒトｉＰＳ細胞の未分化能を維持でき、細胞増殖活性増強剤として使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１８年６月１８日に出願された、日本国特許出願特願２０１８－１１５２２４号に基づく。本明細書に日本国特許出願特願２０１８－１１５２２４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

Claims (6)

  1. 　海洋深層水を限外ろ過膜（Ｉ）でろ過して分子量５０ｋＤ超の高分子物質（Ｉ）を除去した限外ろ過膜（Ｉ）通過液を取得する工程と、前記工程で取得した限外ろ過膜（Ｉ）通過液を限外ろ過膜（ＩＩ）でろ過して分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を含む限外ろ過膜（ＩＩ）循環液を取得する工程とを含むことを特徴とする、細胞培養用溶液の製造方法。
  2. 　海洋深層水に含まれる分子量３～５０ｋＤの高分子物質（ＩＩ）を含み、セリン／グリシンのモル比が１０～１００であり、セリン含有量が１，０００～３，０００ｎＭである細胞培養用溶液。
  3. 　培養培地基剤と、請求項１記載の製造方法で調製した細胞培養用溶液または請求項２記載の細胞培養用溶液とを含む、液体培地。
  4. 　前記培養培地基剤が、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０のいずれかである、請求項３記載の液体培地。
  5. 　請求項１記載の製造方法で調製した細胞培養用溶液または請求項２記載の細胞培養用溶液と、低張液とを含む、浸透圧２００～４００ｍＯｓｍ／Ｌの、細胞培養用処理液。
  6. 　請求項１記載の製造方法で調製した細胞培養用溶液または請求項２記載の細胞培養用溶液を含む、細胞増殖活性増強剤、または細胞培養用代替血清剤。
PCT/JP2019/023886 2018-06-18 2019-06-17 細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤 WO2019244836A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020525722A JP7168942B2 (ja) 2018-06-18 2019-06-17 無血清ｉＰＳ細胞培養用溶液の製造方法、無血清ｉＰＳ細胞培養用溶液、無血清ｉＰＳ細胞培養用液体培地、無血清ｉＰＳ細胞培養用処理液、無血清培地用ｉＰＳ細胞増殖活性増強剤、および無血清ｉＰＳ細胞培養用代替血清剤

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018115224 2018-06-18
JP2018-115224 2018-06-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019244836A1 true WO2019244836A1 (ja) 2019-12-26

Family

ID=68983386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/023886 WO2019244836A1 (ja) 2018-06-18 2019-06-17 細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7168942B2 (ja)
WO (1) WO2019244836A1 (ja)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003103257A (ja) * 2001-09-28 2003-04-08 Pigeon Corp 海洋水からの細胞活性化物質の分離方法
JP2003171287A (ja) * 2001-09-28 2003-06-17 Pigeon Corp 細胞活性物質、その製造方法、ならびに、当該細胞活性物質を含む医薬品、化粧料および食品
JP2008303182A (ja) * 2007-06-08 2008-12-18 Goshu Yakuhin Kk 等張液
CN101402494A (zh) * 2008-11-03 2009-04-08 赵飞虹 海洋深层水提取浓缩液的系统及其提取工艺
JP5500757B2 (ja) * 2006-02-17 2014-05-21 ワミレスコスメティックス株式会社 海洋深層水濃縮物含有組成物及びその製造方法
JP2014512194A (ja) * 2011-05-12 2014-05-22 韓国海洋科学技術院 微細藻類有用成分を含有した食塩の製造方法および製造された食塩
JP2017036259A (ja) * 2015-08-14 2017-02-16 海健生技股▲ふん▼有限公司 海洋深層水抽出物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003103257A (ja) * 2001-09-28 2003-04-08 Pigeon Corp 海洋水からの細胞活性化物質の分離方法
JP2003171287A (ja) * 2001-09-28 2003-06-17 Pigeon Corp 細胞活性物質、その製造方法、ならびに、当該細胞活性物質を含む医薬品、化粧料および食品
JP5500757B2 (ja) * 2006-02-17 2014-05-21 ワミレスコスメティックス株式会社 海洋深層水濃縮物含有組成物及びその製造方法
JP2008303182A (ja) * 2007-06-08 2008-12-18 Goshu Yakuhin Kk 等張液
CN101402494A (zh) * 2008-11-03 2009-04-08 赵飞虹 海洋深层水提取浓缩液的系统及其提取工艺
JP2014512194A (ja) * 2011-05-12 2014-05-22 韓国海洋科学技術院 微細藻類有用成分を含有した食塩の製造方法および製造された食塩
JP2017036259A (ja) * 2015-08-14 2017-02-16 海健生技股▲ふん▼有限公司 海洋深層水抽出物

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019244836A1 (ja) 2021-07-26
JP7168942B2 (ja) 2022-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2701163T3 (es) Procedimiento para la purificación eficiente de oligosacáridos de la leche humana (HMO) neutros a partir de la fermentación microbiana
Li et al. Separation of L-glutamine from fermentation broth by nanofiltration
JP2018168263A (ja) 植物性プロテオグリカン及びその用途
CN101603038A (zh) 一种溶菌酶的制备方法
Caprarescu et al. Commercial gooseberry buds extract containing membrane for removal of methylene blue dye from synthetic wastewaters
CN103194518A (zh) 一种窄分子量范围的鱼胶原蛋白肽的制备方法
CN105435658B (zh) 一种超分子复合分离膜的制备方法
JP5054784B2 (ja) 物質流を処理する方法
WO2019244836A1 (ja) 細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、細胞培養用処理液、および細胞増殖活性増強剤
AU2020286068B2 (en) Raw material solution concentration system
Cansu Comparative evaluation of different separation and concentration procedures on some quality and functional properties of fish gelatin
JP6872198B2 (ja) 細胞培養用溶液の製造方法、細胞培養用溶液、液体培地、および細胞培養用処理液
JPS59204122A (ja) 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の製造方法
CN102746174A (zh) 一种利用膜分离与电渗析组合技术从发酵液中提取分离l-缬氨酸的方法
Saiful et al. Forward osmosis membrane to produce water energy drink from seawater
CN217092934U (zh) 一种伊枯草菌素的提取浓缩装置
JPH06245784A (ja) シアル酸及びシアル酸誘導体含有組成物の製造方法
RU2521511C1 (ru) Способ очистки и концентрирования кукурузного экстракта
CN106146608A (zh) 一种蜜蜂抗菌肽的提取制备方法
PL224628B1 (pl) Sposób rozdzielania roztworu 1,3-propanodiolu otrzymywanego przez fermentację glicerolu
CN113134028B (zh) 一种伤口消毒液及其制备方法
CN102757354A (zh) 一种利用膜分离与电渗析组合技术从发酵液中提取分离l-亮氨酸的方法
CN114845798B (zh) 多孔质分离膜
CN110508027B (zh) 具膜电容电吸附过程的高纯药植提取物制备工艺
JPS60137489A (ja) 廃液の処理法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19822079

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2020525722

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19822079

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1