JP7168942B2 - 無血清iPS細胞培養用溶液の製造方法、無血清iPS細胞培養用溶液、無血清iPS細胞培養用液体培地、無血清iPS細胞培養用処理液、無血清培地用iPS細胞増殖活性増強剤、および無血清iPS細胞培養用代替血清剤 - Google Patents
無血清iPS細胞培養用溶液の製造方法、無血清iPS細胞培養用溶液、無血清iPS細胞培養用液体培地、無血清iPS細胞培養用処理液、無血清培地用iPS細胞増殖活性増強剤、および無血清iPS細胞培養用代替血清剤 Download PDFInfo
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Description
本発明の細胞培養用溶液は、海洋深層水を原料とする。本願において、海洋深層水とは、深度200メートル以深の深海に分布する海水を意味するものとする。採取場所に特に制限はない。搬送が利便である点で日本近海が好ましいが、これに限定されるものではない。採取した海洋深層水は、ろ過その他によって不溶物を除去することが好ましい。これにより限外ろ過の際の目詰まりを解消して製造効率を向上させることができる。例えば、孔径の大きなフィルターで5μm超の物質をろ過し、更に、孔径が0.1~0.9μmφのフィルターでろ過したろ液などを好適に使用することができる。
本発明の製造方法では、上記海洋深層水を限外ろ過膜(I)に導入し、得られたろ液を限外ろ過膜(II)に導入し、限外ろ過膜(II)に形成された孔径を通過しなかった循環液を回収して製造することができる。
本発明の細胞培養用溶液は、上記工程によって製造されたものである。
また、海洋深層水に含まれる分子量3~50kDの高分子物質(II)を濃縮成分として含み、低分子のアミノ酸等は濃縮されず、セリン/グリシンのモル比が10~100であり、セリン含有量が1,000~3,000nMである細胞培養用溶液であってもよい。本発明の細胞培養用溶液が、ヒト正常皮膚ケラチノサイトやヒト乳癌細胞などの動物細胞の増殖を増加させる理由は明確ではないが、培地には、グリシンが予め培養に至適な範囲で含まれているため、高分子物質(II)の作用によるものと推定される。
前記細胞培養用溶液を用いて培養培地基剤を溶解して液体培地を調製することができる。培養培地基剤としては、DMEM、EMEM、GMEM、IMEM、RPMI-1640などの動物細胞培養用培地がある。例えば、粉末状の細胞培養基質を溶解用溶液で溶解して液体培地を調製する場合には、溶解用溶液の一部を前記細胞培養用溶液に代えて液体培地を調製することができる。また、細胞培養基質が液体培地として予め調製されている場合には、これらに前記細胞培養用溶液を添加して、液体培地を調製することができる。本発明の細胞培養用溶液にミネラルが含まれている場合には、低張液を添加して浸透圧を調整することができる。
前記細胞培養用溶液に低張液を添加して浸透圧200~400mOsm/Lに調整し、細胞培養用処理液として使用することができる。細胞培養用処理液としては、例えば、細胞内外の浸透圧を維持しながらの細胞の洗浄や希釈を行う際に使用する平衡塩溶液や、接着細胞の剥離や各種組織の細胞分散などに使用する細胞剥離液や細胞分散用溶液として使用することができる。
本発明の細胞培養用溶液は、溶液のまま、またはこれを凍結乾燥その他により粉末その他の乾燥物として、細胞増殖活性増強剤として使用することができる。前記したように、本発明の細胞培養用溶液を使用して培養培地を調製すると、正常皮膚ケラチノサイト(HaCaT)や乳がん細胞(MCF7)の増殖率を増強させることが判明した。一方、ヒトiPS細胞を培養したところ、培地に代替血清KSR(KnockOut Serum Replacement)が含まれない場合にも、コロニーが添加量に応じて大きくなることが判明した。したがって、細胞増殖活性増強剤は、海洋深層水由来の代替血清として使用することができる。なお、後記する実施例に示すように、HaCaTやMCF7では細胞増殖増強活性が観察されたが、ヒトiPS細胞では細胞増殖率は同等であり、未分化能を均一にする特質が観察された。このように、本発明の細胞培養用溶液は、細胞増殖活性増強剤といえる。
本発明における「代替血清剤」とは、細胞培養の際に、細胞の生存に必要な栄養素として添加させる動物血清に代わる、血清代用品を意味する。本発明の細胞培養用溶液は、溶液のまま、細胞培養用代替血清剤として使用することができる。
図1に示す装置を用いて細胞培養用溶液を調製した。
富山湾で採取した海面下200メートル以深から採取した10Lの海洋深層水1をポアサイズ0.45μmのミリポアフィルターでろ過し、無菌容器、または、すぐに次工程で使用する場合には、容量10Lの容器3に貯液した。これをポンプ5で流速圧力15~30psi(1~2bar)で限外ろ過膜(I)7(スペクトラム社製、ポアサイズ50kD、材質;修飾ポリエーテルスルホン、長さ22.2cm、径7.8mm、表面積115cm2)に導入し、循環液11を容器3に戻し、ポンプ5による限外ろ過膜(I)7への導入および循環液11の循環を継続した。一方、限外ろ過膜(I)7のろ液9は、容量1Lの容器13に導入した。容器13の溶液をポンプ15で流速圧力15~30psi(1~2bar)で限外ろ過膜(II)17(スペクトラム社製、ポアサイズ3KD、材質修飾ポリエーテルスルホン、長さ22.2cm、径7.8mm、表面積115cm2)に導入し、ろ液23を容器25に回収すると共に、循環液19を容器13に循環させた。限外ろ過膜(II)17による循環ろ過を継続したところ、容器25のろ液は9.9Lとなり、容器13の循環液19は、100mlとなった。容器13の全量を細胞培養用溶液21として回収した。細胞培養用溶液21に含まれる高分子物質(II)の濃縮率は、海洋深層水1の100倍となる。
実施例1で製造した細胞培養用溶液について、トキシノメーター(富士フイルム和光純薬株式会社製、ET-6000/J)によりエンドトキシンの測定を行った。エンドトキシンは検出限界以下であった。
実施例1で製造した細胞培養用溶液を下記のFmoc-LC-MS法でアミノ酸を分析した。また、富山湾の表層水を100倍に濃縮した溶液、および富山湾で採取した海面下200メートル以深の海洋深層水を100倍に濃縮した溶液も同様に処理してアミノ酸を分析した。結果を表1に示す。
試料溶液に、0.1Mの四ホウ酸ナトリウム水溶液5mlを添加してpH10.5に調整し、100ppmFmoc-Cl((9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl Chloride)のアセトニトリル溶液2mlを添加し、室温で15分間静置し、Fmoc誘導体を含む反応液を形成した。反応液を、C18カラム(GL Sciences社製;容量1g/6ml)にアプライし、アセトニトリル5ml、1%ギ酸水溶液5mlを移動相として無機塩類を除去した。次いで、1%ギ酸含有アセトニトリル溶液5mlでFmoc誘導体を溶出し、流出液を蒸発乾固した。
蒸発乾固した試料を、LC/MS用溶媒(0.1%ギ酸水溶液:0.1%ギ酸アセトニトリル=8:2)1mlに溶解し、LC/MS用試料を調製した。LC/MS解析は以下の条件で行った。
カラム:ACQUITY UPLC BEHC18(2.1×100mm、1.7μm、Waters社製)
移動相:A:0.1% ギ酸水溶液、B:0.1%ギ酸アセトニトリル溶液
グラジエント:A/B:80/20→40/60(8分)→10/90(10分)→2/98(11分)→2/98(12分)→80/20(12.10分)
カラム温度:40℃、
流速:0.4ml/分
注入量:5μl
イオンモード:Electrospray Positive
キャピラリー電圧:2.0kV
エクストラクター電圧:3V
RFレンズ 電圧:2.5V
ソース温度:150℃
デソルベーション温度:400℃
コーン/デソルベーション ガス流量:50/800 L/Hr
MS/ドータースキャンレンジ:m/z150~1200
コーン電圧:15~20V
コリジョンエネジー:15~25eV
RPMI-1640培地(100U/mlペニシリン(シグマ)、100μg/mlストレプトマイシン(シグマ)/RPMI培地(Cell Science & Technology Inst., Inc.))を対照培地とし、対照培地を調製する際に使用した溶解液の一部を実施例1で製造した細胞培養用溶液および海洋深層水をイオン交換膜電気透析法して得られる淡水化処理水に代え、細胞培養用溶液を0.2重量%含有する細胞培養用溶液添加培地を調製した。
上記対照培地で培養したHaCaT、およびMCF7細胞を、10,000細胞/cm2濃度で24ウェルプレートに播種し、37℃、0.5%二酸化炭素の条件で一晩培養し、次いでPBSで3回洗浄した。
各ウェルに対照培地、または細胞培養用溶液添加培地を0.5ml加え、48時間培養した。培養後に、0.5mg/mlのMTT試薬(シグマ、5mg/ml/PBS)を50μl/ウェルとなるよう加え、1時間培養した。次いで、培地を除去し、DMSO(Wako)を400μl/ウェル添加し、Abs570nm、ref650nm(Infinite M200マイクロプレートリーダー、テカンジャパン)で吸光度を測定した。対照培地を使用した場合の吸光度を100%とし、細胞培養用溶液添加培地を使用した場合の割合をMTT減少率(%)として算出した。結果を図2に示す。細胞培養用溶液を0.2重量%添加したことで、HaCaTおよびMCF7の双方でMTT減少率(%)が100%を超え、統計的有意差をもって対照培地に対する細胞の増殖が観察された(n=3)。これらにより、実施例1で製造した細胞培養用溶液は、HaCaTやMCF7などの動物細胞に対して、細胞増殖活性増強剤として作用することが判明した。
実施例1で製造した細胞培養用溶液と海洋深層水をイオン交換膜電気透析で脱塩して得た淡水化処理水を使用してRPMI-1640培地(100U/mlペニシリン(シグマ)、100μg/mlストレプトマイシン(シグマ)/RPMI培地(Cell Science & Technology Inst., Inc.))を調製し、細胞培養用溶液が0.2重量%含有される細胞培養用溶液添加培地を調製した。
この培地にMCF7細胞を10,000細胞/cm2濃度で播種し、37℃、0.5%二酸化炭素の条件で48時間培養した。MCF7細胞に、ER/PgR(MONO)ユニバーサルキット(株式会社ニチレイバイオサイエンス社製)を使用し、取扱い指示書に従い、エストロゲンレセプター(Estrogen Receptor:ER)およびプロゲステロン受容体(progesterone receptor:PgR))を測定した。図3(A)にERの結果を、図3(B)にRgRの結果を示す。また、Human HER2 ELISA Kit(Proteintech社製)を使用してHER2糖タンパク質を測定した。結果を図3(C)に示す。
表2に示す組成の8種類のDMEM/F12培地を調製した。なお、表中KSRは、Knockout Serum Replacementであり、bFGFは、塩基性線維芽細胞増殖因子(Human basic Fibroblast Growth Factor)であり、NEAAは、Non-Essential Amino Acidsであり、細胞培養用溶液とは、実施例1で製造した細胞培養用溶液を意味する。
理研細胞バンクから入手したヒトiPS細胞(409B02)を10,000細胞/cm2濃度で16ウェルプレートに播種し、表2に示す各培地を2ウェルずつ添加して37℃、0.5%二酸化炭素の条件で48時間培養した。結果を図4に示す。
各ウェルの培地を除去し、PBS(-)2mlを入れて洗浄し、これを2回おこなった。4%パラホルムアルデヒド固定液(武藤化学株式会社製)500μlを入れ、室温で10分間放置した。4%パラホルムアルデヒド固定液を除去してPBS(-)2mlを入れて洗浄し、PBS(-)を除去した。ウェルに、免疫染色用発色基質BCIP/NBT Substrate System(Dako K0598)を5滴滴下し、10~30分間染色した。染色液を除去しミリQ水を入れ反応を止め、撮像した。結果を図5に示す。
Claims (6)
- 海洋深層水を限外ろ過膜(I)でろ過して分子量50kD超の高分子物質(I)を除去した限外ろ過膜(I)通過液を取得する工程と、前記工程で取得した限外ろ過膜(I)通過液を限外ろ過膜(II)でろ過して分子量3~50kDの高分子物質(II)を含む限外ろ過膜(II)循環液を取得する工程とを含むことを特徴とする、無血清iPS細胞培養用溶液の製造方法。
- 海洋深層水に含まれる分子量3~50kDの高分子物質(II)を含み、セリン/グリシンのモル比が10~100であり、セリン含有量が1,000~3,000nMである無血清iPS細胞培養用溶液。
- 培養培地基剤と、請求項2記載の無血清iPS細胞培養用溶液とを含む、無血清iPS細胞培養用液体培地。
- 前記培養培地基剤が、DMEM、EMEM、GMEM、IMEM、RPMI-1640のいずれかである、請求項3記載の無血清iPS細胞培養用液体培地。
- 請求項2記載の無血清iPS細胞培養用溶液と、低張液とを含む、浸透圧200~400mOsm/Lの、無血清iPS細胞培養用処理液。
- 請求項2記載の無血清iPS細胞培養用溶液を含む、無血清培地用iPS細胞増殖活性増強剤、または無血清iPS細胞培養用代替血清剤。
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