TWI570073B - 海洋深層水萃取物及其用途 - Google Patents

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Description

海洋深層水萃取物及其用途
本發明提供一種海洋深層水萃取物，特別係一種具有有機成分的海洋深層水萃取物及其用途。
最近10年，含有質子幫浦抑制劑(PPI)及抗生素的三合一療法被視為清除幽門螺旋桿菌感染首選。然而，服藥順從性不足和抗藥性菌株的增加常導致除菌的失敗。初步治療失敗後，被推薦的二線療法包括抗生素的三合一療法及四合一療法，但是這些療法仍然無法克服因抗藥性菌株增加而造成的困擾。因此找出能有效預防和治療幽門螺旋桿菌感染的新成分或混合物，就有迫切的需要。
目前已知飲水中鎂不足會增加心血管病變之機會，而飲水中含高鈣與鎂離子則可提升對心肌梗塞之保護效應。高鎂攝取會改善高血脂、降低代謝症候群與氧化壓力之發生率。海洋深層水(Deep-sea water，DSW)得自低於海平面200公尺以下是富含高鎂、高鈣與高鉀離子與高營養成分或高有機成分之低溫、乾淨衛生之無污染水。近年，DSW已被廣泛應用於食品加工業、農業、藥用與化妝品業。研究文獻也指出DSW具有降低血脂肪與脂質氧化、血管硬化、高血壓與減少血管管壁增生。在異位性皮膚炎也發現飲用或浸泡DSW也會改善皮膚發炎與過敏症狀，同時DSW飲用也改善白內障。
氧化壓力(oxidative stress)與發炎對幽門螺旋桿菌感染和腸胃潰瘍有關，飲用高鎂離子可改善幽門螺旋桿菌感染、胃潰瘍與胃食道逆流等症狀。而飲用海洋深層水對幽門螺旋桿菌感染患者的抗菌效用幽門螺 旋桿菌與胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃腺癌，以及其他胃部癌症如胃的「粘膜相關淋巴組織淋巴瘤」(MALToma)有強烈相關性。有限的資料或文獻顯示在體外試驗時DSW可能藉由內含高濃度的一些離子以抑制幽門螺旋桿菌的作用。有報告指出在人體血清中的鎂濃度和胃幽門螺旋桿菌聚集於胃部有關聯。
基於上述，本發明進行抗胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的臨床試驗中發現飲用海洋深層水二週對幽門螺旋桿菌感染患者的抗菌有效成分，非經由本發明技術領域中習知認為高鈣、高鎂離子及硬水所引起，而是海洋深層水中的有機成分。
有鑑於此，本發明之一目的在於提供一種海洋深層水萃取物，其係將海洋深層水由一方法而製得，該方法係為逆滲透(reverse osmosis，RO)與電透析(Electrodialysis，ED)之方法或是奈米過濾(nanofilter)之方法；其中該海洋深層水萃取物具有一有機成分，該有機成分選自於由685至690、733至738、以及1070至1075之分子量所組成之群組。
在本發明一實施例中，其中該方法進一步選自於由凝膠層析(gel filtration)方法、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取方法、丙酮萃取方法、以及三氯甲烷萃取方法所組成之群組。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水萃取物之分子量較佳為1070至1075。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水係為低於海平面200公尺以下之海水。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水萃取物進一步包含一抗氧化物以延緩該有機成分之降解，且該抗氧化物係為檞皮素(quercetin)、綠茶素(EGCG)或是氫氣。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水萃取物係經由巴氏 殺菌或濾菌方式而獲得。
本發明之另一目的在於提供一種上述海洋深層水萃取物用於製備抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之藥物的用途。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。
在本發明一實施例中，其中該海洋深層水萃取物進一步包含一抗氧化物以延緩該有機成分之降解；且該抗氧化物係為氫氣、檞皮素(quercetin)或綠茶素(EGCG)。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖係為本發明之2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析的質譜圖；(A)以竹籤電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析RO逆滲透水做為比較例；(B)以竹籤質譜儀分析本發明DSW2400；(C)以濾紙電噴灑/質譜法分析本發明DSW2400；(D)以竹籤質譜儀分析本發明DSW2400。
第二圖係為電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析以DCM、丙酮、三氯甲烷三種有機溶液萃取本發明DSW2400之質譜圖。
第三圖係為電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析不同海水區域與不同處理之海洋深層水或海洋表面水之質譜圖；CS1-HB係為商品台肥海礦1400深層海水、CS2-DM係為Deep Mine深層海水、DSW2400係為本發明DSW2400、SSW-50係為海洋表面水、CS3-TY係為商品台鹽海洋鹼性離子水、CS4-T1係為商品統一PH 9.0鹼性離子水、CS5-LB係為商品Light鹼性水以及會出現338.5之波形的背景值。
第四圖係為拉曼光譜儀測量電透析之本發明之海洋深層水 萃取物2400ppm(DSW2400)；上圖為未加熱，下圖為經滅菌鍋加熱。
第五圖係為電噴灑質譜法(ESI/MS)分析不同處理之本發明之海洋深層水萃取物2400ppm(DSW2400)；(A)50ml以RO逆滲透處理後淡化之RO逆滲透水；(B)未經任何處理50ml本發明DSW2400；(C)50ml本發明DSW2400連同離心管在滅菌鍋內經121℃ 15分鐘之加熱滅菌處理；(D)50ml本發明DSW2400加入HCl至pH值為5，進行電透析之樣品；(E)50ml本發明DSW2400加入HCl至pH值為4，進行電透析之樣品；(F)50ml本發明DSW2400加入HCl至pH值為3，進行電透析之樣品；(G)剛接觸空氣之50ml本發明DSW2400；(H)接觸空氣三天之50ml本發明DSW2400，進行電透析之樣品；(I)通入氫氣之50ml本發明DSW2400，進行電透析之樣品；(G)經過0.22μm濾紙過濾之50ml本發明DSW2400，進行電透析之樣品。
第六圖係為電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析量測第一天(Day 1)不同處理之本發明之海洋深層水萃取物1070波形組之強度。
第七圖係為電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析量測第一天(Day 1)不同處理之本發明之海洋深層水萃取物1070波形組之強度。
第八圖係為電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析量測第一天(Day 1)不同處理之本發明之海洋深層水萃取物1070波形組之強度。
第九圖係為電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析量測第一天(Day 1)、第二天(Day 2)及第九天(Day 9)不同處理之本發明之海洋深層水萃取物1070波形組之強度是樹狀圖。此數值為三重覆數據。* P<0.05與第一天之個別控制組比較；# P<0.05與第九天之本發明之海洋深層水萃取物無處理組(Air 2)比較。
第十圖係為以維他命C作為抗氧化劑會破壞本發明之海洋深層水萃取物之成分。
第十一圖A及B係為本發明之海洋深層水萃取物具有抑制 胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之數據圖。
第十二圖係為含有不同成分1070波形組含量之海洋深層水萃取物對抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果之關係圖。1070波形組含量越高之海洋深層水萃取物與抑制胃幽門螺旋桿菌能力成正相關。A為RO逆滲透樣品；B為表面海水SSW(50公尺海平面下之海水)樣品；C為經過滅菌鍋處理後之DSW2400樣品；D為在pH 3.93之條件下之DSW2400樣品；E為經過0.22μm過濾之DSW2400樣品；F為經過ED處理之DSW2400樣品；G係為樣品A至F對抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果之關係圖；H係為樣品A至F之1070波形組含量之平均強度量化數值。
第十三圖係為本發明之海洋深層水萃取物可明顯降低胃幽門螺旋桿菌感染所放出之碳十三尿素呼吸數值之曲線圖；DSW係為本發明之海洋深層水萃取物，CMW係為一般礦泉水。
本發明提供一種主要目的係確認海洋深層水萃取物的抑菌或其他功效之活性成分，以及該海洋深層水萃取物用於製備抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之藥物的用途，經由取得低於海平面200公尺以下之本發明之海洋深層水進行有機成分分析確定可能分子並鑑定其特性，並藉由拉曼光譜確認該有機成分之活性。本發明海洋深層水萃取物證實具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之活性成分並非是與其高鈣、高鎂濃度或高硬度有關。
實施例1 本發明之海洋深層水(Deep sea water，DSW)萃取物的製造方法
本發明之海洋深層水水源取自臺灣花蓮縣七星潭(Chisingtan)灣200米以下深度之水源，海洋深層水由石頭和資源行業研究與發展中心(Guanghuajian，花蓮，臺灣)獲准後取得。海洋深層水之改良與製備是由石材和資源行業研究與發展中心(Guanghuajian，花蓮，臺灣)所提供。海洋深層水水源會先經逆滲透(reverse osmosis，RO)的處理和電透析(Electrodialysis，ED)為了減少海洋深層水之硬度，以每ppm的硬度表[CaCO3]ppm=([Ca2+]×2.5+[Mg2+]×4.1)ppm。 經逆滲透(RO)和電透析(ED)後得到了不同硬度之海洋深層水。如1200至4800ppm的硬度。海洋深層水以巴氏殺菌在60秒80℃或以濾菌方式後立即存儲在室溫(25℃)，即為本發明之海洋深層水萃取物。
本發明利用電感耦合的等離子體發射光譜儀(JY ULTIMA 2000，堀場，法國)，分析本發明1200ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW1200)、本發明2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)以及2.1ppm RO水的礦物質含量，並另分析該些樣品的pH值，如表一所示。另外，本發明亦取得海洋深層水200公尺以下所製備之RO逆滲透水、海洋深層水、海平面下50公尺之海洋表面水(surface water，SSW)，以及從市面上所購買之其他海洋深層水或是表面水之相關產品做為比較。所用之化學藥品如綠茶素(EGCG)和檞皮素(quercetin)等均採購自Sigma-Aldrich公司。
實施例2 電噴灑質譜法(ESI/MS)
本發明係利用改良式竹籤當作電噴灑游離法(ESI)，將3μl樣品滴加竹籤尖端同時利用甲醇當作揮發性溶劑(Harvard Apparatus Model 22)，流速6μl/min，並施加+3000v高電壓(Gamma,FL,USA Model RR30-2R)，使樣品離子化進到質譜儀(Thermo Finnigan LCQ LC/MS)進行分析，偵測範圍是150-2000m/z，並使用抽氣迴轉泵(EDWARDS EM30)來維持質譜儀內的真空狀態，每次樣品測試完畢後把竹籤使用超音波洗淨器(BRANSON 3510)震盪30分鐘。利用電噴灑離子化/質譜法主要用來測量主成分物質的分子量。
電噴灑游離法中主要包含霧化(nebulization)、去溶劑(desovation)以及游離(ionization)三部分。
2.1 霧化(nebulization)：形成帶電液滴
當樣品通過未施加高電壓的金屬毛細管出口端時，由於缺乏電場的作用，只會形成正負離子分佈均勻的液滴。但當樣品流經外加高電壓的金屬毛細管時，毛細管出口端會產生強大的電場作用，使得溶液中的正負離子受到電場作用而產生電荷分離的現象。若施加的為正電壓，則正離子會因為電場排斥的作用力往毛細管出口端移動，負離子會受正電場吸引而聚集在金屬毛細管壁，當溶液大量聚集出口端時，會在液滴表面累積大量正電荷。當正電荷累積到一定的數量，此時所產生的排斥力與電場作用力會將正電荷的液體表面往低電場方向拉長，在毛細管出口端形成一錐狀液滴，稱之為泰勒錐(Taylor cone)。此時向外的庫倫排斥力和向內的表面張力呈現平衡狀態，稱為雷利極限(Rayleigh limit)。當外加電場逐漸增強時，累積在溶液表面的正電荷排斥力大於表面張力，液滴的作用力就會突破雷利極限，由泰勒錐前端噴灑出表面帶有電荷的微小液滴，此即為電噴灑游離法中帶電液滴形成的過程。
2.1 去溶劑(desovation)：電噴灑液滴的揮發與分裂
從金屬毛細管出口端噴灑出來的帶正電荷液滴，因會受到質 譜入口較低電場的吸引而進入質譜儀。在飛行過程中，帶電液滴不斷接觸大量的空氣，使得液滴中的溶劑分子快速揮發，造成液滴體積持續縮小，但液滴內電荷是固定的，因此液滴內電荷密度會逐漸增加，當體積縮小到一定程度時，電荷間的排斥力會大於液滴的表面張力，為了平衡內部的作用力，此時液滴會產生分裂現象，而分裂的程度會因液滴的半徑大小、溶劑的表面張力和液滴內所帶的電荷數而有所不同。相同的過程會在電噴灑端與質譜儀間不斷重複，帶電液滴經過多次分裂，體積不斷減少，最終便能去除溶劑。為了提高去除溶劑的效率，通常會在分析物溶液中添加揮發性較高的有機溶劑，降低溶液的表面張力以利電噴灑時的溶劑的揮發。也會利用霧化氣流來增加電噴灑的效率，或是在質譜儀入口端往電噴灑端施予一輔助氣流來幫助溶劑揮發。
2.3 游離(ionization)：形成氣相離子
目前為止並無法定論將帶電液滴形成氣相離子的機制，但是目前較為被科學家接受的理論主要有兩個，一個是在1968年由M.Dole所提出電荷殘留理論；另一個是在1976年由B.A.Thomson所提出的離子揮發理論。電荷殘留理論討論到當帶電液滴的溶劑經過不斷的揮發和多次分裂後，溶劑會完全揮發，使液滴無法再一次分裂，而原本液滴上的電荷會殘留在分析物分子上，使分析物形成帶多電荷的氣相離子。離子揮發理論則認為氣相離子不一定是溶劑揮發後才能形成，而是當帶電液滴的溶劑揮發到最後，液滴直徑縮小至10至20nm，造成液滴內部電荷不穩定，為了降低內部過大的向外排斥力，帶電的液滴就會突破液滴表面形成帶多電荷的氣態離子。1993年Fenn將離子揮發理論改良並發表，用來解釋大分子會帶多電荷的現象，他認為液滴一開始就帶有多電荷，而這些液滴中同時包含異性電荷的離子。由於大分子在液滴中行布朗運動而移動到液滴的表面取代部分液滴表面的電荷，再藉由熱能驅動使大分子的部分帶電區域突破液滴表面，使分子與液滴脫離而形成多價電荷的氣相離子。
實施例3 拉曼散射光譜
本發明利用拉曼光譜法主要用來測量主成分物質的分子振 動譜峰，作為分析物的光譜指紋辨識之用。
拉曼光譜的產生機制為牽涉入射光和樣品分子交互作用後，當分子上的原子受到入射光的擾動時，其入射光的電場會和分子的電子雲產生交互作用，因而產生輻射散射(electromagnetic radiation)，而此交互作用所引起電子的週期性振動，會伴隨產生震盪電極矩(electric moment)，其振盪的電子即為散射光的來源。散射過程中，入射光和樣品分子牽扯到能量轉移，所產生的散射光頻率和光源入射光頻率不相等，故拉曼散射(Raman scattering)即是非彈性碰撞，其中拉曼散射又可分為兩種，當散射光頻率相對於入射光增加時，稱為反史托克散射(anti-Stokes Raman scattering)；而當散射光頻率相對於入射光減少時，稱為史托克散射(Stokes Raman scattering)。而生活中常看到的散射是雷利散射，因為不牽涉光波長的改變，所以屬於彈性散射。相對於雷利散射，拉曼強度通常僅是其百萬分一左右，因此在日常生活中要觀察到拉曼散射現象並不容易。從量子力學角度來看，拉曼散射光頻率之所以和入射光不同，主要是因為電子所佔據的能階改變所致，及散射光頻率改變可對應分子振動能階。
實施例4 本發明之海洋深層水萃取物活性成分分析
本發明之2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)以電噴灑質譜法(ESI/MS)包括竹籤電噴灑離子化、濾紙電噴灑離子化方法和拉曼光譜分析海洋深層水萃取物可能有某些特殊成分之分析。
電噴灑/質譜法(ESI/MS)的結果如第一圖所示，以竹籤質譜儀發現在本發明DSW2400有三種主要687(685-690)、733(733-738)、1070(1070-1075)波形組分子量之強度(B)；687、733、1070波形組分子量在快速圖之表現(D)。或是利用濾紙電噴灑/質譜法(ESI/MS)亦可發現733和1070波形組分子量(C)；而RO水樣品在竹籤電噴灑/質譜法(ESI/MS)無法發現有此波形(A)。
為確定本發明之海洋深層水萃取物成分之溶解性有機質(DOM)為有機成分，本發明分別以二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)、丙酮、 三氯甲烷三種有機溶液萃取之海洋深層水萃取物與本發明2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)原液作電噴灑/質譜法(ESI/MS)質譜圖之比較。結果如第二圖所示，竹籤電噴灑/質譜法(ESI/MS)發現在本發明DSW2400以DCM、丙酮、三氯甲烷三種有機溶液萃取可得到主要687、733、1070波形之分子量。和利用本發明DSW2400進行之濾紙電噴灑/質譜法(ESI/MS)亦可發現733和1070波形之分子量。因此，證明本發明之海洋深層水萃取物的687、733、1070分子量為有機成分。
本發明取不同海水區域與不同處理之海洋深層水或海洋表面水(surface water，SSW)之以電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析，結果如第三圖所示，分子量在2000以下之有機成分之分子量表現不同，發現本發明之海洋深層水(DSW2400)比海洋表面水(SSW-50)、台肥海礦1400深層海水(CS1-HB)樣品更能表現1070波形組之強度；且其他Deep Mine深層海水(CS2-DM係)、台鹽海洋鹼性離子水(CS3-TY)、統一PH 9.0鹼性離子水(CS4-T1)以及Light鹼性水(CS5-LB)皆不具有1070波形，表示該些商品未含有該有機成分。
以市售RENISHAW拉曼光譜儀測量電透析(ED)之DSW2400之樣品，如第四圖所示，在波數(wavenumber)為1000的分子振動譜峰的強度，會受到滅菌鍋加熱後和未處理之本發明海洋深層水萃取物相比有顯著降低之情形，證實加熱會破壞有機成分。
實施例5 本發明之海洋深層水萃取物活性成分對酸之表現
將400ml的本發明之2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)開封後立即使用。取10個離心管分別加入：(A)50ml以RO逆滲透處理後淡化之RO逆滲透水；(B)未經任何處理50ml本發明DSW2400；(C)50ml本發明DSW2400連同離心管在滅菌鍋內經121℃ 15分鐘之加熱滅菌處理；(D)50ml本發明DSW2400加入HCl至pH值為5，進行電透析之樣品；(E)50ml本發明DSW2400加入HCl至pH值為4，進行電透析之樣品；(F)50ml本發明DSW2400加入HCl至pH值為3，進行電透析之樣品；(G)剛接觸空氣之50ml本發明DSW2400；(H)接觸空氣 三天之50ml本發明DSW2400，進行電透析之樣品；(I)通入氫氣之50ml本發明DSW2400，進行電透析之樣品；(G)經過0.22μm濾紙過濾之50ml本發明DSW2400，進行電透析之樣品。10個樣品進行電噴灑/質譜法(ESI/MS)，如第五圖所示，發明1070波形組之強度在各樣品中表現不同，以剛接觸空氣之50ml本發明DSW2400，及以經過0.22μm濾紙過濾之50ml本發明DSW2400的波鋒最高，而用酸(pH 3至4)、接觸空氣越久氧化以及高溫滅菌的樣品1070波形之有機成分會被破壞。
實施例6 添加抗氧化物對保存本發明之海深層水萃取物活性成分之效果
將400ml的本發明之海洋深層水開封後(第一天)立即以電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析，用量筒取出200ml，然後分裝至4瓶50ml離心管內，每瓶50ml處理後封瓶鎖緊，第一瓶不做任何處理(減少接觸空氣面積)，第二瓶則通氫氣30秒(可能會導至DSW溢出)，第三瓶加入抗氧化物檞皮素(quercetin)(1mg/200ml)及第四瓶加抗氧化物綠茶素(EGCG)(12mg/50ml)，另外殘餘之200ml則仍舊留在原容器中並暴露於空氣中作為無處理對照組。所有液體都會在第二、九天分別開封測試不同處理方式後的以電噴灑質譜法(ESI/MS)評估1070等波形強度。
結果如第六至八圖所示，以電噴灑/質譜法(ESI/MS)發現以1070波形組之強度在第一天之各種情形之表現量，在第一天剛開瓶時五種處理有相近之1070波形組之強度(第六圖)。以電噴灑/質譜法(ESI/MS)發現以1070波形組之強度在第二天之各種情形之表現量，在第二天減少空氣接觸、通入氫氣30秒或加入抗氧化物如檞皮素或綠茶素處理都有保留1070波形組之強度表現量，相對於大瓶未處理與大量接觸空氣之1070波形組之強度表現量明顯消失(第七圖)。以電噴灑質譜法(ESI/MS)發現以1070波形組之強度在第九天之各種情形之表現量，各組1070波形組之強度表現量皆明顯降低，但加入抗氧化物如檞皮素或綠茶素之1070波形組之強度表現量比其它組別仍有較高的趨勢(第八圖)。
以電噴灑/質譜法(ESI/MS)量測以1070波形組之強度為指標統計五組處理本發明之海洋深層水萃取物在第一天(Day 1)、第二天(Day 2) 和第九天(Day 9)之各種情形之1070波形表現強度。如第九圖所示，除了暴露在大量空氣中之第一組(Air 1)外，四組1070波形組之強度在第二天尚可保持。各組1070波形組之強度在第九天表現量皆明顯降低，但加入抗氧化物如氫氣、檞皮素(quercetin)或綠茶素(EGCG)之1070波形組之強度表現量比其它組別仍有較高的趨勢。在無處理的對照組中(以Air 1表示)，將200ml本發明之海洋深層水萃取物暴露在大量空氣中；在無處理組中(以Air 2表示)，將50ml本發明之海洋深層水萃取物緊密封住在50ml離心管中；通入氫氣(以H2表示)組中，將50ml本發明之海洋深層水萃取物緊密封住在通入氫氣30秒之50ml離心管中；加入檞皮素組中(以quercetin表示)，將50ml本發明之海洋深層水萃取物緊密封住在已添加1mg/200ml檞皮素之50ml離心管中；加入綠茶素(以EGCG表示)，將50ml本發明之海洋深層水萃取物緊密封住在已添加12mg/50ml綠茶素之50ml離心管中。其結果顯示與空氣或氫氣接觸，皆會使本發明之海洋深層水萃取物之有機成分氧化，而加入具安全、常用之可食性物質之抗氧化物能減少本發明之海洋深層水萃取物的1070波形組之有機成分氧化。
本發明利用海洋深層水萃取物經過reverse osmosis(RO逆滲透)和電透析(electrodialysis)或是經由小分子膜奈米過濾(nanofilter)等其它方式可以取得或保留具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長之活性成分。這些活性成分可進一步經由凝膠層析(gel filtration)、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取、丙酮萃取、以及三氯甲烷萃取後取得分子量在2000以下具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長之性質。以電噴灑/質譜法(ESI/MS)分析可發現三種主要分子量在687(685-690)、733(733-738)、1070(1070-1075)波形組之強度。並以電噴灑/質譜法(ESI/MS)發現在以DCM、丙酮、三氯甲烷三種有機溶液萃取2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)之樣品可得到主要687、733以及1070波形，證實687、733以及1070分子量為有機成分。
本發明之海洋深層水萃取物接觸空氣氧化、以121℃或加熱100℃處理或是用酸(pH 3至4)會破壞687、733以及1070等波形之有機成分。以市售RENISHAW拉曼光譜儀測量電透析之DSW2400之樣品，在波 數(wavenumber)為1000的分子振動譜峰的強度，會受到滅菌鍋加熱後和未處理之本發明海洋深層水萃取物有顯著降低之情形。以電噴灑/質譜法(ESI/MS)發現以1070波形組之強度在第二天接觸空氣後之表現量明顯降低。在第二天減少空氣接觸、通入氫氣30秒或加入抗氧化物如檞皮素或綠茶素處理都有保留1070波形組之強度表現量。以電噴灑/質譜法(ESI/MS)發現以1070波形組之強度在第九天之強度表現量皆明顯降低，但加入抗氧化物如檞皮素或綠茶素之1070波形組之強度表現量比其它組別仍有較高的趨勢。
此外，本發明亦採用其他抗氧化劑進行比較，如第十圖所示，以維他命C作為抗氧化劑會破壞本發明之海洋深層水萃取物的有效成分，非所有的抗氧化劑皆具有減緩本發明之海洋深層水萃取物氧化之效果。
實施例7 本發明之海深層水萃取物具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之效果
本發明證實海洋深層水萃取物具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之活性成分並非是與其高鈣、高鎂濃度及高硬度有關。如第十一圖A所示，本發明1200、2400、3600、4800以及6000ppm硬度之海洋深層水萃取物分別以滅菌鍋、0.22μm過濾膜進行濾菌以及滅菌鍋與0.22μm過濾膜進行濾菌處理後，發現本發明硬度2400ppm以上具有抑制胃幽門螺旋桿菌之效果，同時以濾菌處理後之抑制較果較佳(第十一圖A)。本發明利用EDTA二價金屬螯合劑將鈣和鎂移除，證實本發明之海洋深層水萃取物不含鈣及鎂離子，仍具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長之效應；而以含相同之鎂離子濃度之蒸餾水則無法產生抑制胃幽門螺旋桿菌生長之效應(第十一圖B)。
另外，本發明利用質譜儀量化海洋深層水萃取物1070成分強度數值與抑制胃幽門螺旋桿菌生長百分比之關係圖，本實施方式為製備不同硬度之海洋深層水萃取物、加入不同濃度之EDTA於海洋深層水萃取物或不同濃度MgCl2的洋菜膠(agar)，接著以0.22μm過濾膜滅菌或是鍋 (autoclave)滅菌進行濾菌。混合羊血之後，倒入9cm的培養基，等待凝固成為洋菜膠固體培養基(agar plate)。取2.85毫克MgCl2，加入其他培養基成分與水，最後泡成體積為10ml的agar plate，則代表agar plate所含有MgCl2濃度為285mg/L。依據上述方法，分別製備含有MgCl2濃度為285mg/L與570mg/L的agar plate；並且分別製備不同硬度1200至6000ppm海洋深層水萃取物或加入不同濃度之EDTA於硬度2400之ppm海洋深層水萃取物製備成不同成分含量之洋菜膠固體培養基。本案為確定海洋深層水具抑制胃幽門螺旋桿菌生長之主要成份為何者，選取來自10個不同病人檢體的胃幽門螺旋桿菌，使用無菌棉棒，沾取適量的胃幽門螺旋桿菌，塗抹於洋菜膠固體培養基上，放入厭養培養箱進行培養，培養3至4天之後，觀察是否有胃幽門螺旋桿菌細菌生長，如果沒有生長以-標示，如果有微量生長以+/-標示，如果會有正常生長以+標示。其結果如第十二圖所示，發現該海洋深層水萃取物濃度愈高其抑菌效果越好。滅菌鍋(autoclave)滅菌降低1070波形組含量，但以0.22μm過濾膜進行濾菌不會影響1070波形組含量，證實1070波形組含量為海洋深層水具抑制胃幽門螺旋桿菌生長之主要成份。第十二圖係為含有不同成分1070波形組含量之海洋深層水萃取物對抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果之關係圖。1070波形組含量越高之海洋深層水萃取物與抑制胃幽門螺旋桿菌能力成正相關。A為RO逆滲透水樣品；B為表面海水SSW(50公尺海平面下之海水)樣品；C為經過滅菌鍋處理後之DSW2400樣品；D為在pH 3.93之條件下之DSW2400樣品；E為經過0.22μm過濾之DSW2400樣品；F為經過ED處理之DSW2400樣品；G係為樣品A至F對抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果之關係圖；H係為樣品A至F之1070波形組含量之平均強度量化數值。
更進一步地，本發明之實施例另採前瞻、雙盲的方式進行臨床試驗檢測本發明之海洋深層水萃取物是否可明顯降低胃幽門螺旋桿菌感染所放出之碳十三尿素呼吸數值。
首先，針對年齡20歲以上之成年男性或女性，因有上腹痛等消化不良症狀而來接受胃鏡檢查，經檢查發現有慢性胃炎或輕微胃靡爛況之一，就被排除：1)懷孕或哺乳婦女；2)嚴重並存疾病如腎衰竭、肝硬化等；3)無法治癒的惡性腫瘤；4)嚴重的潰瘍出血；5)以前接受胃切除手術；6)在胃鏡檢查前一個月之內曾服用鉍鹽、PPIs、抗生素，或非類固醇消炎止痛劑。治療前都接受胃鏡和其附屬檢查同時做碳13尿素呼氣試驗(13C-UBT)判定幽門螺旋桿菌存在的狀態。病患先經過負責計畫的人員解說試驗內容及流程且簽署受試者同意書後，依照試驗流程接受試驗前後抽血篩檢身體基本功能(血液常規檢驗(CBC)、肝功能檢驗(LFT)、腎功能檢驗(RFT)、血糖、血脂及、電解質)，碳13尿素呼氣試驗(分別在本發明之海洋深層水萃取物(DSW)飲用前、2週DSW剛飲用完畢後、DSW飲用完畢4週後)。受試者分別為每次飲用200mL本發明之海洋深層水萃取物(DSW)或飲用相同包裝非本發明之海洋深層水萃取物之一般礦泉水(CMW)，一天4次(三餐飯前一小時及睡前)，為期四週。同時在三餐飯後服用促進腸胃蠕動藥物(prokinetics)(甲氧氯普胺(metoclopramide)5mg/tab)一天三次和抗酸劑(antacid)(息痛佳音錠(Strocain)(含有歐西拉因(oxethazaine)5mg以及polymigel 244mg/tab)，一天三次，以幫助消化不良症狀之緩解。所有病患被要求填寫一份問卷，同時在治療期間每天記錄臨床症狀和DSW飲用量。DSW飲用期間，病人將維持其平時規則性飲食方式，但被要求禁止同時使用下列食物或藥物：乳製品、漢方草藥、蜂蜜、蔓越莓、含乳酸菌之保健食品、過度酸辣之食物等。本發明之海洋深層水萃取物(DSW)飲用結束後，病患被安排至門診以便評估DSW飲用順從度和不良反應發生的內容、程度和頻率。同時安排評估DSW飲用後改變幽門螺旋桿菌菌量效果的追蹤檢查。治療前，當(1)組織學檢查及13C-UBT均為陽性時；或(2)細菌培養陽性，則判定為有帶菌之狀態。治療後的效果則以系列性的13C-UBT數值的變化做為判斷之依據。
如第十三圖所示在臨床研究數值發現具有陽性幽門螺旋桿菌感染之病患在飲用本發明之含有1070成分之海洋深層水萃取物可以明顯降低胃幽門螺旋桿菌感染所放出之碳十三尿素呼吸數值，而以不含1070成分之RO逆滲透水則不能改善碳十三尿素呼吸數值(無法改善胃幽門螺旋桿菌感染程度)。
因此，本發明提供一種具有分子量為2000以下的有機成分的海洋深層水萃取物，能有效抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長，其為治療胃幽門螺旋桿菌感染的新策略。

Claims (9)

  1. 一種海洋深層水萃取物，其係將海洋深層水由一方法而製得，該方法係為逆滲透(reverse osmosis，RO)與電透析(Electrodialysis，ED)之方法或是奈米過濾(nanofilter)之方法；其中該海洋深層水萃取物具有一有機成分，該有機成分係為1070至1075之分子量以及選自於由685至690、733至738之分子量及其任意組合所組成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之海洋深層水萃取物，其中該方法進一步包含選自於由凝膠層析(gel filtration)方法、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取方法、丙酮萃取方法、以及三氯甲烷萃取方法所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之海洋深層水萃取物，其中該海洋深層水係為低於海平面200公尺以下之海水。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之海洋深層水萃取物，其中該海洋深層水萃取物進一步包含一抗氧化物以延緩該有機成分之降解，且該抗氧化物係為檞皮素(quercetin)、綠茶素(EGCG)或是氫氣。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之海洋深層水萃取物，其具有2400ppm至4800ppm的硬度。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之海洋深層水萃取物，其中該海洋深層水萃取物係經由巴氏殺菌或濾菌方式而獲得。
  7. 一種海洋深層水萃取物用於製備抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長之藥物的用途；其中該海洋深層水萃取物具有1070至1075分子量的有機成分。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該海洋深層水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該海洋深層水萃取物進一步包含一抗氧化物以延緩該有機成分之降解，且該抗氧化物係為氫氣、檞皮素(quercetin)或綠茶素(EGCG)。
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