TWI718831B

TWI718831B - 包含有三種萃取物的組成物及其用途

Info

Publication number: TWI718831B
Application number: TW108148358A
Authority: TW
Inventors: 黃信綸; 古秀玲; 許紘瑜
Original assignee: 財團法人石材暨資源產業研究發展中心
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-02-11
Also published as: TW202123952A

Abstract

本發明揭示一包含有深層海水的固相萃取產物、洛神葵花萼的萃取產物以及乳酸乳球菌的萃取產物的組成物可被用來防止和/或抑制變種鏈球菌的生長，以及治療和/或預防變種鏈球菌的感染。

Description

包含有三種萃取物的組成物及其用途

本發明是有關於一種用於抗變種鏈球菌( Streptococcus mutans)的組成物，其包含有深層海水的固相萃取產物(solid phase extraction product)、洛神葵花萼( Hibiscus sabdariffacalyx)的萃取產物以及乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)的萃取產物。本發明亦有關於該組成物可被用來防止和/或抑制變種鏈球菌的生長，以及治療和/或預防變種鏈球菌的感染。

變種鏈球菌( Streptococcus mutans)是一種兼性厭氣的(facultatively anaerobic)革蘭氏陽性球菌(gram-positive cocci)，它普遍存在於人類的口腔中，屬於一種常見的致齲細菌(cariogenic bacteria)。當變種鏈球菌開始定殖(colonize)於牙齒表面時，會因其在代謝醣類的過程中所產生的酸性物質腐蝕牙齒表面的琺瑯質(enamel)，而導致口腔異味、齲齒(dental caries)、牙齦炎(gingivitis)以及齒結石(dental calculus)等口腔疾病的發生。此外，變種鏈球菌亦是感染性心內膜炎(infective endocarditis)的伺機性病原菌(opportunistic pathogen)，它主要會經由口腔內的傷口進入血液中造成暫時性的菌血症(bacteremia)，並且黏附於受損的心臟瓣膜上以形成贅疣(vegetation)而引發感染性心內膜炎。

目前臨床上用於對抗變種鏈球菌的抗生素包括安比西林(ampicillin)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢若林(cefazolin)、二甲氧基苯青黴素(methicillin)以及氯林絲菌素(clindamycin)。然而，這些抗生素在對抗變種鏈球菌上所達成的效果仍不盡理想，主要的原因包括：變種鏈球菌所展現出的抗生素耐性(antibiotic resistance)，以及抗生素對患者所產生的嚴重副作用(side effect) 與不良反應(adverse effect)。因此，本領域的相關研究人員嘗試從天然來源(natural source)中來尋找可供用於對抗變種鏈球菌的活性組分(active component)。

目前已有許多研究是有關於得自於植物或微生物的萃取物在抗菌上的應用。例如，在Alaga T.O. et al. (2014), J. Med. Plants Res., 8:339-344中，Alaga T.O.等人將洛神葵( Hibiscus sabdariffa)的花萼(calyces)分別浸泡於去離子水以及乙醇中歷時12小時，繼而予以過濾並收集濾液，而分別得到洛神葵花萼之經水萃取的產物以及經乙醇萃取的產物。接著，Alaga T.O.等人將該等產物拿來進行植物性化合物分析(phytochemical analysis)而鑑定出它們含有皂苷(saponins)、生物鹼(alkaloids)、鞣質(tannins)、總酚(total phenols)、類黃酮(flavonoids)以及醣苷(glycosides)。該等產物經由紙錠與瓊脂擴散法(disc and agar well diffusion methods)而被證實對於病原菌(pathogenic bacteria)(包括變種鏈球菌)具有抗菌活性(antibacterial activity)。

在Fatemeh Babadi et al. (2018), J. Res. Med. Dent. Sci., 6:198-202中，Fatemeh Babadi等人將嗜酸乳桿菌( Lactobacillus acidophilus)接種至MRS肉湯培養基(MRS broth)中進行培養，接而將所得到的培養物與乙酸乙酯(ehtyl acetate)予以混合並進行沉降(settle)，然後收集有機層並移除乙酸乙酯，而得到嗜酸乳桿菌代謝產物( Lactobacillus acidophilusmetabolites)。之後，Fatemeh Babadi等人將該嗜酸乳桿菌代謝產物拿來進行抗口腔鏈球菌(oral streptococci)的試驗，而結果發現，該嗜酸乳桿菌代謝產物對於口腔鏈球菌具有抗菌活性。

此外，TW 201924697 A揭示一種深層海水有機萃取物，其包含有固體有機物質。該固體有機物質是藉由使用C18濾膜來對深層海水進行萃取而被製得。該深層海水有機萃取物經由實驗而被證實具有抑制幽門螺旋桿菌( Helicobacter pylori)生長的效用。

經研究，申請人意外地發現：一包含有深層海水的固相萃取產物、洛神葵花萼的萃取產物以及乳酸乳球菌的萃取產物的組成物能夠有效地防止和/或抑制變種鏈球菌的生長，因而被預期可供用於治療和/或預防變種鏈球菌的感染。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於抗變種鏈球菌的組成物，其包含有深層海水的固相萃取產物、洛神葵花萼的萃取產物以及乳酸乳球菌的萃取產物。

在第二個方面，本發明提供一種如上所述的組成物供應用於製備一用來防止和/或抑制變種鏈球菌的生長之醫藥品的用途。

在第三個方面，本發明提供一種用於防止和/或抑制在一個體中之變種鏈球菌的生長的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述的組成物。

在第四個方面，本發明提供一種如上所述的組成物供應用於製備一用來治療和/或預防變種鏈球菌的感染之醫藥品的用途。

在第五個方面，本發明提供一種用於治療和/或預防在一個體中之變種鏈球菌感染的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述的組成物。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在開發可用於對抗變種鏈球菌( Streptococcus mutans)的藥物上，申請人經由實驗而發現到：一包含有深層海水的固相萃取產物(solid phase extraction product)、洛神葵花萼( Hibiscus sabdariffacalyx)的萃取產物以及乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)的萃取產物的混合物能夠有效地抑制變種鏈球菌的生長，且此抑制效用是顯著優於上述3種萃取產物中之任一者或任兩者的組合所具者，因而被預期具有治療和/或預防變種鏈球菌的感染之高潛力。

因此，本發明提供一種用於抗變種鏈球菌的組成物，其包含有深層海水的固相萃取產物、洛神葵花萼的萃取產物以及乳酸乳球菌的萃取產物。

較佳地，該乳酸乳球菌的萃取產物、該洛神葵花萼的萃取產物以及該深層海水的固相萃取產物是呈一範圍落在1：1：4 (w/w/w)至3：4：7 (w/w/w)內的比例。在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸乳球菌的萃取產物、該洛神葵花萼的萃取產物以及該深層海水的固相萃取產物是呈一為1：1：3 (w/w/w)的比例。

依據本發明，該深層海水的固相萃取產物具有一範圍落在5至100 mg/mL內的含量。較佳地，該深層海水的固相萃取產物具有一範圍落在5至20 mg/mL內的含量。在本發明的一個較佳具體例中，該組成物含有16 mg/mL的深層海水的固相萃取產物。

依據本發明，該洛神葵花萼的萃取產物具有一範圍落在1至80 mg/mL內的含量。較佳地，該洛神葵花萼的萃取產物具有一範圍落在2至30 mg/mL內的含量。在本發明的一個較佳具體例中，該組成物含有3 mg/mL的洛神葵花萼的萃取產物。

依據本發明，該乳酸乳球菌的萃取產物具有一範圍落在1至50 mg/mL內的含量。較佳地，該乳酸乳球菌的萃取產物具有一範圍落在1至20 mg/mL內的含量。在本發明的一個較佳具體例中，該組成物含有1 mg/mL的乳酸乳球菌的萃取產物。

依據本發明，該深層海水的固相萃取產物是藉由對深層海水進行一C18固相萃取以移除離子化合物而被製得。

如本文中所使用的，術語“深層海水(deep sea water)”以及“海洋深層水(marine deep water)”可被交換地使用，並且意指一從海平面以下的一特定深度所收集到的海水，它具有低溫、乾淨且富含營養鹽(nutrient salt-rich)的特性。較佳地，該深層海水是取自於海平面以下一範圍落在300至600公尺的深度內的海水。在本發明的一個較佳具體例中，該深層海水是取自於海平面以下一為200公尺的深度的海水。

如本文中所使用的，術語“固相萃取(solid phase extraction)”意指一種化學分離技術(chemical separation technique)，其是使一樣品溶解或懸浮於一液體[被稱為移動相(mobile phase)]中並流經一固體[被稱為固定相(stationary phase)或吸附劑(sorbent)]，接而利用該樣品中的各個組分對於該固體的親和力(affinity)之差異來予以分離成所欲的以及非所欲的組分。在某些具體例中，所欲的組分被保留在吸附劑上。在某些具體例中，非所欲的組分被保留在吸附劑上。在本發明的一個較佳具體例中，所欲的組分被保留在吸附劑上。

如本文中所使用的，術語“C18固相萃取(C18 solid phase extraction)”意指使用C18材料(C18 material)作為吸附劑來進行的固相萃取。較佳地，C18固相萃取是使用含有C18-鍵結的二氧化矽顆粒(C18-bonded silica particles)的管柱(columns)、管(tubes)、注射器(syringes)、筒(cartridges)以及盤(discs)而被進行。

依據本發明，該C18固相萃取可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參考，例如，TW 201924697 A、US 2016/0282371 A1以及US 2013/0261315 A1。

可瞭解到的是，有關固相萃取的操作條件會進一步隨著所使用的樣品來源以及總量等因素而被變動，以便達致最佳的萃取效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

依據本發明，該深層海水的固相萃取產物含有9,000-13,000 ppm的鈉、150-600 ppm的鉀、210-700 ppm的鈣、640-1,800 ppm的鎂。在本發明的一個較佳具體例中，該深層海水的固相萃取產物含有12,100 ppm的鈉、443 ppm的鉀、427 ppm的鈣以及1,430 ppm的鎂。

依據本發明，該深層海水的固相萃取產物含有5-70%之具有一範圍落在50至700 Da內之分子量的有機物質。在本發明的一個較佳具體例中，該深層海水的固相萃取產物含有50%之具有一範圍落在200至700 Da內之分子量的有機物質。

依據本發明，該洛神葵花萼的萃取產物以及該乳酸乳球菌的萃取產物可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的萃取技術來進行。在此方面，可以參照，例如，Fatemeh Babadi et al. (2018)(同上述)。

可瞭解到的是，萃取的操作條件會進一步隨著所使用萃取溶劑的種類與用量等因素而被變動，以便達致最佳的萃取效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

較佳地，該洛神葵花萼的萃取產物是藉由使用一選自於由下列所構成之群組中的溶劑來對洛神葵的花萼進行萃取而被製得：乙酸乙酯(ethyl acetate)、甲醇、乙醇、水，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該洛神葵花萼的萃取產物是一經乙酸乙酯萃取的產物。

較佳地，該乳酸乳球菌的萃取產物是藉由使用一選自於由下列所構成之群組中的溶劑來對乳酸乳球菌的培養物進行萃取而被製得：乙酸乙酯、正己烷(n-hexane)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸乳球菌的萃取產物是一經乙酸乙酯萃取的產物。

更佳地，該洛神葵花萼的萃取產物是藉由以下條件而被製備：令呈一範圍落在1：10 (w/v, g/mL)至1：20 (w/v, g/mL)內之用量比例的洛神葵花萼以及乙酸乙酯於一範圍落在-50至0 kpa的壓力下以及一範圍落在15至40℃的溫度下混合歷時5至12小時。

更佳地，該乳酸乳球菌的萃取產物是藉由以下條件而被製備：令呈一範圍落在1：5 (v/v)至1：20 (v/v)內之用量比例的乳酸乳球菌的培養物以及乙酸乙酯於一範圍落在15至40℃的溫度下混合歷時5至12小時。

依據本發明，該洛神葵花萼之經乙酸乙酯萃取的產物包含有1-30%的花青素(anthocyanin)、10-70%的多酚(polyphenol)、5-10%的有機酸(organic acid)以及5-10%的胺基酸(amino acid)。較佳地，該花青素包括，但不限於：矢車菊色素配質(cyanidin)、翠省花素(delphinidin)、錦葵色素(malvidin)、天竺葵苷素(pelargonidin)、芍藥色素(peonidin)以及牽牛花素(petunidin)。

依據本發明，該乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物包含有抗菌胜肽(antimicrobial peptides, AMPs)。較佳地，該抗菌胜肽包括，但不限於：乳酸鏈球菌素(nisin)、乳鏈球菌素(lacticin)、肉食桿菌素(carnobacteriocin)、腸球菌素(enterocin)以及片球菌素(pediocin)。在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物包含有乳酸鏈球菌素。

依據本發明之含有3種萃取物的混合物經由最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration)的測定而被證實能夠有效地抑制變種鏈球菌的生長。據此，依據本發明之含有3種萃取物的混合物被預期具有抗菌活性，因而可供應用於製備一用來防止和/或抑制變種鏈球菌的生長之醫藥品的用途。此外，本發明亦提供一種用於防止和/或抑制在一個體中之變種鏈球菌的生長的方法，其包括對該個體投藥以上述醫藥品。

基於上述的抗菌活性，依據本發明之含有3種萃取物的混合物被預期可供應用於製備一用來治療和/或預防變種鏈球菌的感染之醫藥品的用途。本發明亦提供一種用於治療和/或預防在一個體中之變種鏈球菌感染的方法，其包括對該個體投藥以上述醫藥品。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”變種鏈球菌的感染意指該感染的嚴重性(severity)或該感染的症狀(symptom)被減少(reduced)，或是該感染被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。

如本文中所使用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”變種鏈球菌的感染意指一個體在還沒有被診斷具有該感染時，消除(eliminate)或減少(reduce)該感染的發生率(incidence)，以及減緩(slow)、延遲(delay)、控制(control)或減少(decrease)該感染的可能性(likelihood)或機率(probability)。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)、口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。

依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：表皮內注射(intraepidermal injection)、病灶內注射(intralesional injection)以及舌下投藥(sublingual administration)。較佳地，該醫藥品被製造成適於以舌下投藥的劑型。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。較佳地，該醫藥品被製造成一口腔衛生產品(oral hygiene products)，這包括，但不限於：口香糖(chewing gums)、潔牙劑(dentifrices)、漱口水(mouthwash)、口腔噴霧(mouth sprays)、口頰錠(buccal tablet)、持續性膜衣錠(sustained film coated table)以及口內膏(oral ointment)。

依據本發明，該醫藥品亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明之含有3種萃取物的混合物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性、投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的醫藥品可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被非經腸道地、口服地或局部地投藥。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 實施例 1. 製備本發明之含有 3 種萃取物的混合物 實驗材料： 1. 製備深層海水的固相萃取產物(solid phase extraction product)：

首先，將取自於花蓮縣七星潭且位於海平面以下200公尺的深層海水依序以四個0.22 μm的濾膜(廠牌：KHAN，型號：PUP-001-DOE-20-V)予以過濾，以去除該深層海水中的砂粒與微生物。所得到的濾液經由使用一感應耦合電漿儀(inductively coupled plasma, ICP)的微量元素分析而被測得含有12,100 ppm的鈉、443 ppm的鉀、427 ppm的鈣以及1,430 ppm的鎂。

接著，收取1.5公噸的濾液並使用一C18固相萃取膜(3M™ Empore™ C18 Extraction Disks)(貨號為2215或2315，廠牌為3M)來進行固相萃取(solid phase extraction)。之後，加入200 mL的100%乙醇來將吸附於該C18固相萃取膜上的物質洗提出，接而以減壓濃縮的方式來移除乙醇，繼而予以乾燥處理，藉此而得到一呈粉末狀的深層海水之經固相萃取的產物(以下簡稱為DSW萃取物)。

之後，將該DSW萃取物溶於去離子水中以配製成一具有一濃度為10 mg/mL的待測溶液樣品，並將之拿來進行液相層析-串聯式質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)。所使用的LC-MS/MS分析儀器如下：超效能液相層析(ultra performance liquid chromatography, UPLC)(型號為LC-30AD，廠牌為Shimadzu)以及四極桿質譜儀(quadrupole mass spectrometer)(型號為API 4500，廠牌為AB SCIEX)。而有關LC-MS/MS的各項操作參數與條件被顯示於下面的表1中。表1. LC-MS/MS的操作參數與條件

操作參數	條件
分離管柱	C18管柱(貨號為00A-4461-AN，廠牌為Kinetex)
管柱規格	30 mm × 2.1 mm
偵測範圍	50-700 m/z
移動相	甲醇/水，100：0 (v/v)
移動相的梯度洗提(gradient elution)	在第0至3分鐘時，甲醇由100%變至70%；在第4至6分鐘時，甲醇由70%變至20%；在第6至8分鐘時，甲醇由20%變至0%；在第8至10分鐘時，甲醇由0%變至100%。
流速(mL/分鐘)	0.4

圖1顯示將DSW萃取物拿來進行LC-MS/MS所得到的質譜圖。從圖1可見，該深層海水之經固相萃取的產物含有至少12種不同的有機物質，且其中有50%的有機物質具有一範圍落在200至700 Da的分子量。 2. 製備洛神葵花萼之經乙酸乙酯萃取的產物(ethyl acetate -extracted product of Hibiscus sabdariffacalyx)：

首先，將購自於臺東縣金峰鄉的新鮮洛神葵( Hibiscus sabdariffa)的花萼(calyx)以去離子水洗淨並以一均質破碎機(型號為B96W-7010S，廠牌為WARING)予以粉碎，然後進行冷凍乾燥歷時72小時。接著，將所得到之含水量低於3%的洛神葵花萼置於一粉末均質機(型號為D9KC-CK100，廠牌為CHEMIST)中進行研磨處理(grinding)，而得到洛神葵花萼粉末。

之後，將100 g的洛神葵花萼粉末添加至1,000 mL的乙酸乙酯中並於一為-20 kpa的壓力下以及一為27℃的溫度下使用一超音波處理器(型號為O-LEO-803，廠牌為LEO ULTRASONIC)來進行震盪歷時8小時，然後以一孔徑為11 µm的1號濾紙(貨號為AW1001-00090，廠牌為Whatman)來進行過濾，收集濾液並以10,000 rpm來進行離心歷時20分鐘。接著，收取上澄液並以該1號濾紙來進行過濾，然後將所收集的濾液置於-80℃下進行冷凍乾燥，藉此而得到一呈粉末狀的洛神葵花萼之經乙酸乙酯萃取的產物(以下簡稱為HS萃取物)。

之後，將該HS萃取物溶於乙酸乙酯中以配製成一具有一濃度為10 mg/mL的待測溶液樣品，並大體上依照上面第1項當中所述的操作參數與條件來進行LC-MS/MS，不同之處在於：移動相是以乙腈(acetonitrile)來代替甲醇、偵測範圍是被調整為50-400 m/z，以及流速是被調整為0.3 mL/分鐘。

依據LC-MS/MS的結果顯示，該洛神葵花萼之經乙酸乙酯萃取的產物含有30%的花青素(anthocyanin)、60%的多酚(polyphenol)、5%的有機酸(organic acid)以及5%的胺基酸(amino acid)。 3. 製備乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物(ethyl acetate-extracted product of Lactococcus lactis)：

首先，將購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)的乳酸乳球菌BCRC 10791接種至葡萄糖肉湯培養基(glucose broth medium)(購自於Difco)[含有酪蛋白酵素水解產物(casein enzymic hydrolysate)、葡萄糖(glucose)以及氯化鈉(sodium chloride)]中，並於一溫度被設定為30℃的培養箱內進行培養歷時48小時，繼而依序於-80℃下進行冷凍處理以及於室溫下進行解凍處理，然後以12,000 rpm來進行離心歷時20分鐘。接著，收取上澄液並以一孔徑為0.22 µm的濾紙(貨號為10116620，廠牌為Merck)來進行過濾，繼而收集100 mL的濾液並將之添加至1,000 mL的乙酸乙酯中，然後在30℃的溫度下進行震盪歷時8小時之後，置於-80℃下進行冷凍乾燥。之後，將所得到之經凍乾的乳酸乳球菌(其含水量低於3%)置於一高效奈米研磨機(型號為3070506，廠牌為PMC)中進行研磨處理，藉此而得到一呈粉末狀的乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物(以下簡稱為LL萃取物)。

之後，將該LL萃取物溶於乙酸乙酯中以配製成一具有一濃度為10 mg/mL的待測溶液樣品，並大體上依照上面第1項當中所述的操作參數與條件來進行LC-MS/MS，不同之處在於：移動相是以乙腈來代替甲醇、偵測範圍是被調整為1111-1119 m/z，以及流速是被調整為0.3 mL/分鐘。此外，為供比對，使用乳酸鏈球菌素(nisin)(貨號為N5764，廠牌為Sigma-Aldrich)來作為對照標準品(control standard)並進行相同的LC-MS/MS分析。

依據LC-MS/MS的結果顯示，該乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物含有乳酸鏈球菌素[包括乳酸鏈球菌素複合物(nisin complex)]，其屬於一種抗菌胜肽(antimicrobial peptides, AMPs)。 實驗方法：

將依據上面“實驗材料”的第1至3項當中所得到之呈粉末狀的DSW萃取物、HS萃取物以及LL萃取物以一為3：1：1 (w/w/w)的比例予以混合均勻，藉此而得到本發明之含有3種萃取物的混合物(以下簡稱為DSW-HS-LL混合物)來供隨後的實驗之用。 實施例 2. 本發明之含有 3 種萃取物的混合物在抗變種鏈球菌 ( Streptococcus mutans) 上的效用評估：

於本實施例中，申請人將在上面實施例1中所得到的DSW-HS-LL混合物拿來進行抑制50%變種鏈球菌生長的最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration reached by 50%, MIC ₅₀)的測定，藉此評估其對於變種鏈球菌的抗菌活性(antibacterial activity)。此外，為供比較，依據上面實施例1的“實驗材料”中所得到的3種萃取物(亦即DSW萃取物、HS萃取物以及LL萃取物)被拿來進行相同的實驗。 實驗材料： 1. 變種鏈球菌的測試菌液之製備：

首先，將購自於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心的變種鏈球菌BCRC 10793接種至腦心浸液培養基[brain heart infusion (BHI) medium](購自於Difco)[含有牛心(beef heart)、牛腦(calf brains)、磷酸氫二鈉(disodium hydrogen phosphate)、蛋白腖(peptone)以及葡萄糖]中，並於一溫度被設定為30℃的培養箱內進行培養歷時24小時。之後，將所形成的培養物以5,000 rpm來進行離心歷時10分鐘。在倒除上澄液之後，以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)來清洗沉澱物(pellets)，繼而以BHI培養基來充份懸浮菌體並將OD ₆₀₀值調整至1，藉此而得到變種鏈球菌的測試菌液(細菌濃度約為1×10 ⁷CFU/mL)。 實驗方法：

首先，將依據上面實施例1中所得到的DSW-HS-LL混合物、DSW萃取物、HS萃取物以及LL萃取物分別溶於去離子水中而各自配製成一濃度為50 mg/mL的儲備溶液(stock solution)。接著，以去離子水來對該等儲備溶液進行稀釋，藉此而得到具有不同萃取物濃度(0.5、1、2、5、10、20以及50 mg/mL)的測試溶液。

之後，將各個測試溶液(2 mL)分別添加至含有10 mL之依據上面“實驗材料”的第1項所製得的測試菌液之96-井培養盤(96-well plate)的各井中，繼而於30℃下靜置培養歷時24小時。另外，未被處理以測試溶液的測試菌液被用來作為對照。

之後，於600 nm的波長下以一ELISA讀取儀(型號為UVM340，廠牌為Biochrom Asys)來讀取各井中所形成之細菌培養物的吸光值(OD ₆₀₀)，而MIC ₅₀即為該萃取物可以降低該細菌培養物的OD ₆₀₀值達50%以上(與對照菌液相較之下)的最低濃度。 結果：

有關DSW-HS-LL混合物、DSW萃取物、HS萃取物以及LL萃取物對於變種鏈球菌所測得的MIC ₅₀分別為5、10、20以及20 mg/mL。這個實驗結果顯示：相較於深層海水之經固相萃取的產物、洛神葵花萼之經乙酸乙酯萃取的產物以及乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物之任一者，組合這3種萃取物所得到的萃取混合物對於變種鏈球菌具有明顯優異的抗菌活性，因而被預期在抗變種鏈球菌上具有最高的開發潛力。 實施例 3. 不同萃取物的組合在抗變種鏈球菌上的效用比較：

於本實施例中，申請人選用本發明之含有3種萃取物的混合物所測得的MIC ₅₀(亦即5 mg/mL)來進行不同萃取物的組合在抗變種鏈球菌上的效用比較。 實驗材料： 1. 製備含有2種萃取物的萃取混合物：

將依據上面實施例1的“實驗材料”當中所得到的DSW萃取物、HS萃取物以及LL萃取物中之任兩者以一為1：1 (w/w)的比例來進行混合，以得到3種不同的混合物(以下簡稱為DSW-HS混合物、DSW-LL混合物以及HS-LL混合物)。 實驗方法：

首先，將DSW萃取物、HS萃取物、LL萃取物、DSW-HS混合物、DSW-LL混合物、HS-LL混合物以及DSW-HS-LL混合物分別溶於去離子水中而各自配製成一濃度為5 mg/mL的測試溶液。

之後，將各個測試溶液(2 mL)分別添加至含有10 mL之依據上面實施例2的“實驗材料”的第1項所製得的測試菌液之96-井培養盤的各井中，繼而於30℃下靜置培養歷時24小時。另外，未被處理以測試溶液的測試菌液被用來作為對照。之後，於600 nm的波長下以一ELISA讀取儀來讀取各井的吸光值(OD ₆₀₀)。

細菌生長抑制率(bacterial growth inhibition rate)(%)是藉由將所測得的吸光值(OD ₆₀₀)代入下列公式(1)而被計算出：公式 (1) ： A=(C- B)/C ×100其中：A=細菌生長抑制率(%) B=在以各個測試溶液處理之後所測得的OD ₆₀₀吸光值 C=對照菌液所測得的OD ₆₀₀吸光值若所測得的細菌生長抑制率越高，代表萃取物對於變種鏈球菌的抗性越高。 結果：

圖2顯示不同萃取物的組合對於變種鏈球菌所測得的細菌生長抑制率(%)。從圖2可見，DSW-HS-LL混合物所測得的細菌生長抑制率是顯著地高於DSW萃取物、HS萃取物、LL萃取物、DSW-HS混合物、DSW-LL混合物以及HS-LL混合物所具者。這個實驗結果顯示：深層海水之經固相萃取的產物、洛神葵花萼之經乙酸乙酯萃取的產物以及乳酸乳球菌之經乙酸乙酯萃取的產物這三者的組合的變種鏈球菌生長抑制效用是顯著優於其中任一者或任兩者的組合所具者。因此，依據本發明之含有3種萃取物的混合物被預期可供用於治療和/或預防變種鏈球菌的感染。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示將DSW萃取物拿來進行LC-MS/MS所得到的質譜圖；以及圖2顯示不同萃取物的組合對於變種鏈球菌所測得的細菌生長抑制率(%)。

Claims

一種用於抗變種鏈球菌的組成物，其包含有深層海水的固相萃取產物、洛神葵花萼的萃取產物以及乳酸乳球菌的萃取產物，其中該深層海水的固相萃取產物是藉由對深層海水進行一C18固相萃取以移除離子化合物而被製得，該洛神葵花萼的萃取產物是藉由使用乙酸乙酯來對洛神葵的花萼進行萃取而被製得，以及該乳酸乳球菌的萃取產物是藉由使用乙酸乙酯來對乳酸乳球菌的培養物進行萃取而被製得。
如請求項1的組成物，其中該深層海水的固相萃取產物具有一範圍落在5至100mg/mL內的含量。
如請求項1的組成物，其中該洛神葵花萼的萃取產物具有一範圍落在1至80mg/mL內的含量。
如請求項1的組成物，其中該乳酸乳球菌的萃取產物具有一範圍落在1至50mg/mL內的含量。
一種如請求項1至4中任一項的組成物供應用於製備一用來防止和/或抑制變種鏈球菌的生長之醫藥品的用途。
一種如請求項1至4中任一項的組成物供應用於製備一用來治療和/或預防變種鏈球菌的感染之醫藥品的用途。