JP5889913B2

JP5889913B2 - 水抽出に適した液膜

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Publication number: JP5889913B2
Application number: JP2013543945A
Authority: JP
Inventors: ヴィッシング，トーマス; ハンセン，イェスパー・ソンダーガード
Original assignee: アクアポリンアー／エス
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-13
Publication date: 2016-03-22
Anticipated expiration: 2031-12-13
Also published as: WO2012080946A1; JP2014504209A; AU2011342819A1; AU2011342819B2; EP2651542B1; EP2651542A1; US9278316B2; SG191018A1; DK201001133A; US20120152841A1; IL226315A0; TW201231137A; BR112013013125A2; WO2012080946A9; TWI524921B; IL226315A; CA2818230A1; KR20130140049A; CN103402612A; CN103402612B

Description

本発明は、水および／または低分子溶質を水性媒体から抽出するための、機能性タンパク質チャネル、たとえばアクアポリン（aquaporin）もしくはアクアグリセロポリン（aquaglyceroporin）のチャネル、または他の膜貫通タンパク質ポアを取り込んだ、液膜マトリックスに関する。より詳細には、液膜マトリックスは、特にたとえば正浸透作用の適用で水性液状媒体から純水を抽出するための、組織様の粘稠な液体構造の両親媒性分子中に取り込まれたアクアポリンを含むアクアポリン液膜である。

液膜分離プロセスは、たとえばUS 4360448(A)に開示されるように、水溶液からイオンなどの溶存物質を除去するために用いられている。その発明は、水溶液をエマルジョンと接触させることを含む、水溶液から溶存種を除去するための方法に関するものであり、そのエマルジョンは、その水溶液と非混和性でありなおかつそれらの溶存種に対して透過性であることを特徴とする外相、および溶存種を非透過形に変換できるイオン交換化合物などの反応体を含有する内相を含む。溶存種は外相を透過して内相に入り、ここでそれらは非透過形に変換され、したがってエマルジョンの内相に保持される。溶存種が枯渇した水溶液をエマルジョンから分離し、エマルジョンを再利用のために循環させる。しかし、多数または不特定のイオンまたは溶質が水溶液または媒体、たとえば生物性液体中に存在する場合、除去すべきそれぞれの種に対して特異的な反応体を考案する必要があるので、この方法またはこれに類する方法により溶質を除去するのは次第に複雑になる。液膜抽出法を使用する他の例は（WO 87/002380）膜抽出による低エタノール飲料の調製に記載されている；これは、ワインその他の飲料からエタノールを選択的に除去し、一方では水および他の多数の有機成分を保持するように設計された膜抽出システムに関する。このように、液膜分離法はこれまで、たとえば水性液体中の溶質の選択的除去のために開発されてきた。水性液体供給源から水を選択的に分離または抽出する要望からみて、本発明者らは、アクアポリンタンパク質に属する既知の選択的な水チャネルを用いて水性液体から純水を分離または抽出するのに適した液膜法を考案した。

蛍光に基づく活性のアッセイは可溶性タンパク質に関しては十分に確立しているが、膜タンパク質に関しては確立していない。これについて考えられる理由は、膜タンパク質がそれらの自然環境−生体膜から取り出されると不安定になることである。さらに、市販のタンパク種の入手可能性はわずか数種類の膜タンパク質に限られている。これは、膜タンパク質を大量に（グラム規模で）発現させて精製するのが困難であることに関係する。膜タンパク質は一般に、そのタンパク質の自然環境を十分に模倣した生体模倣（biomimetic）膜内へ再構成されるとそれらの機能を保持する。現在は、脂質膜成分を、膜タンパク質要件を満たす生体模倣膜配合物（すなわち、特異的な親水性および疎水性の領域または層）の作製におけるそれらの有用性についてスクリーニングするためのアッセイを求める要望が満たされていない。同時に、そのようなアッセイは膜タンパク質のフォールディング状態について有用な情報を提供するであろう。

本発明はバイオチャネルを含有するバルク液膜（bulk liquid membrane）（ＢＬＭ）の形の液膜マトリックスに関するものであり、この液膜マトリックスは、バイオチャネルが取り込まれた層を形成する非イオン界面活性剤などの両親媒性化合物（脂質を含むかまたは含まない）から形成された生体模倣の境界層をもつセルを含む組織様構造に基づき、このマトリックスはさらに安定化用の油相を含む。本発明はまた、機能性アクアポリン水チャネルを含有する液膜マトリックスを調製する方法、および正浸透作用により液状水性媒体から純水を抽出するための、たとえば塩水の脱塩のための、アクアポリン含有−液膜マトリックスの新規使用に関する。

他の観点において、本発明の液膜マトリックスをさらに、濾過手段として有用なコンタクターモジュール内または本質的に平坦な多孔質サンドイッチ構築体内に収容または固定化することができる。

本発明の態様を、限定ではなく例として、添付の図面および実施例を参照して以下に記載する。

US 4360448(A) WO 87/002380

図１は、本発明の実験に用いる簡単な濾過デバイスの２部品の断面図および上面図を示す。図２は、図１の濾過デバイスのさらに詳細を示す図である。図３は、図１の濾過デバイスのさらに詳細を示す図である。図４は、相分離後の本発明の液膜マトリックス（エマルジョン‘クリーム’相）の、注射器による抽出の原理図を示す。図５は、先行技術の正浸透実験で達成された水フラックス（flux）および塩類フラックスを示すグラフである。図６は、本発明の液膜マトリックスを用いる正浸透実験で達成された水フラックスおよび塩類フラックスを示すグラフである。図７は、サンドイッチ型液膜（メンブレンセル）を保持するデバイスを示す、クロスフロー−正浸透セットアップの原理図である。図８は、本発明のアクアポリンＺ含有−液膜マトリックス試料の２０倍顕微鏡写真であり、標識アクアポリンＺからのｂｌｕｅｂａｄａｎ（商標）蛍光が境界層のみに限定されていることを示す。図９は、図８と同じであるが、明視野画像を示す。図１０は、図８と同じであるが、明視野画像を示す。図１１は、図９と同じであるが、タンパク質を取り込んでいない‘クリーム’相を示す。図１２は、正浸透ユニットセルの模式図である。

本明細書に記載する液膜マトリックスはアクアポリンを含有するバルク液膜（ＢＬＭ）の形であることができ、この液膜は、非イオン界面活性剤、たとえば好ましくはポロキサマータイプの両親媒性ブロックコポリマーの分散液に取り込まれた機能性アクアポリン水チャネルを含み、マトリックスはさらに安定化用の油相を含む。

本発明は、内側水相（internal water phase）、外側油相（external oil phase）、およびセル間境界層（boundary layer between cells）であって膜貫通タンパク質チャネルが取り込まれた非イオン界面活性剤を含む層を有するセル構造（cellular structure）からなる、液膜マトリックスに関する。この新規な液膜マトリックスの利点は、多種多様な形状およびサイズを可能とする三次元構造、ならびにきわめて大きな内部表面積をもつ水密材料を提供するそのコヒーレンシーであり、その際、セル間境界層はユニークな両親媒性を示し、かつ膜貫通タンパク質などの両親媒性物質を収容するのに十分な空間を示し、それらを適正に、すなわち水チャネル（アクアポリン類）、プロトンドナー（ロドプシン類）などとして機能するようにその層に挿入できる。

より具体的には、本発明の液膜マトリックスは、ステロール、スクアレン、スクアラン、アルファ−トコフェロール、ホパノイド類、イソプレン類であって、エステル化されたドリコール（dolichol）、ユビキノン（Ｑ１０）、ホホバ油、軽油、アマニ油、ダイズ油、ラッカセイ油、リン脂質安定化スクアレン、またはダイズ油、リン脂質およびグリセロールのエマルジョン、ならびにアルカン類、たとえばデカン、ウンデカン、ドデカン；ならびにその混合物を含むものからなる群から選択される少なくとも１種類の成分をもつ油相を含む。この油相は、本発明のＬＭマトリックスのマルチセル構造の作製を強く補助する；これは、本発明の顕微鏡画像にみることができるように、おそらく非イオン界面活性剤の親水性ヘッド基（またはＡ−鎖）を安定な構造内へ押し込んでこれらの構造を安定化することによるものであろう。ただし、本発明者らは油相の具体的な機能に関していずれか特定の理論または説明により拘束されることを望まない。

本発明の液膜マトリックスにおいて、界面活性剤は、好ましくは非イオン界面活性剤、たとえば親水基−疎水基−親水基（Ａ−Ｂ−Ａ）型ポロキサマーから選択され、ポロキサマーは（ＰＥＯ）_Ａ−（ＰＰＯ）_Ｂ−（ＰＥＯ）_Ａコポリマーであって、Ａの範囲６０〜８５およびＢの範囲２５〜３５をもち、好ましくはＡが約７６の平均値であり、Ｂが約３０の平均値であるものから選択できる。本発明に有用な代表的ポロキサマーはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８の商品名で販売されている。［ｐｌｕｒｏｎｉｃｇｒｉｄからの特徴を挿入］。

本発明の液膜マトリックスはさらに、両親媒性脂質成分、好ましくはＤＯＰＣ、ＤＰｈＰＣ、ＤＯＰＳ、または天然脂質抽出物、たとえば大腸菌（E. coli）総脂質抽出物、またはダイズ混合リン脂質、またはその組合わせもしくは混合物から選択されるものを含むことができる。

本発明の液膜マトリックスにおいて、タンパク質チャネルは、アクアポリンまたはアクアグリセロポリンの水チャネル、たとえば酵母アクアポリン、すなわちＡｑｙ１、植物アクアポリン、すなわちＳｏＰＩＰ２；１、アクアグリセロポリン、すなわちＡｑｐ３、または細菌性アクアポリン、すなわちＡｑｐＺであってもよい。他の膜貫通タンパク質は、ベータ−バレルポア、たとえばアルファ−ヘモリジンおよびＯｍｐＧ、ＦｏｍＡ、およびＶＤＡＣ；ロドプシン類、たとえばバクテリオロドプシン、または膜貫通ペプチドポア、たとえばアラメチシン（alamethicin）、バリノマイシン（valinomycin）、およびグラミシジンＡ（gramicidin A）、ならびにその誘導体、ならびに合成の膜貫通ペプチド；イオンチャネル、またはイオン選択的イオノホアであってもよい。

本発明の液膜マトリックスにおいて、タンパク質チャネルは、約１：５０から約１：４００までの範囲のタンパク質−対−両親媒性界面活性剤モル比で存在することができる。これは、アクアポリンＺなどの膜貫通タンパク質を両親媒性ベシクルに取り込ませることに関する研究から知られた比率と同等である；WO/2009/076174を参照。

本発明の液膜マトリックスは、一般におおよその最大直径が最高１０００μｍであるセルを有し、大部分のセルが好ましくは約２０〜約５０μｍの範囲にある、閉鎖セル構造を示すであろう。

本発明はさらに、水性液体から水を抽出する方法であって、下記の工程を含む方法に関する：
ａ）ある量の本明細書に開示するアクアポリン含有−液膜マトリックスを濾過デバイスのフィルターチャンバーに入れ、このチャンバーは液膜マトリックスのものより低いかまたは等しい浸透圧を有する供給溶液として作用する第１水性液体と制御接続し、さらにマトリックスのものより高い浸透圧を有する抜取溶液（draw solution）として作用する第２水性液体と制御接続し、これにより第１液体と第２液体の間に浸透圧ポテンシャルを形成する；
ｂ）浸透圧勾配が存在する限り、マトリックスにアクアポリン水チャネルを通して第１液体から純水を吸収させ、これにより純水フラックスを第２液体中へ仲介させる；
ｃ）場合により、抽出した純水を第２液体から分離する。

前記方法において、第１水性液体は、いずれかのタイプの天然水源、たとえば海水、河川水、湖水、汽水、雨水、またはアクアポリン水チャネルに対して有毒でない廃水、下記を含めた生物性流体：ワイン、果実および野菜のジュース、ミルク、全血、血漿、尿、唾液、汗、ホモジナイズした組織などからなる群から選択できる。

本発明の好ましい態様において、水を抽出する方法は海水の脱塩に使用され、その際、塩水が供給溶液または第１水性液体であり、ＣＯ_２／ＮＨ_３を含有する水溶液が抜取溶液または第２水性液体である。溶存ガス、たとえばＣＯ_２またはＮＨ_３は、正浸透作用−抜取溶液として用いて実質的な浸透圧勾配を形成し、したがって液膜マトリックスのアクアポリンを通る水フラックスを推進することができ、同時に、生成する希釈された抜取溶液から加熱および蒸発によって容易に駆出されるという利点をもつ。抽出した水の目的とする最終用途に応じて正浸透作用の抜取溶液中において有用な他の溶質を選択することは、もちろん当業者に明らかである。溶解した塩類、糖類、糖アルコール類などは浸透圧を形成する他の有用な抜取溶質である。

本発明はまた、水性液状媒体から純水を抽出するためのデバイスまたは装置に関するものであり、その装置は本明細書に記載する１以上のアクアポリン含有−液膜マトリックスを含むフィルターハウスを備えている。例は、２モジュール型の中空繊維液−液膜コンタクターモジュール（hollow fiber liquid-liquid membrane contactor module）（たとえば、US patent No. 5328610に開示されるもの）または液体セル−エキストラフローメンブレンコンタクター（liquid cell extra-flow membrane contactor）（たとえば、Ｌｉｑｕｉ−Ｃｅｌ（登録商標）ＭｅｍｂｒａｎｅＣｏｎｔａｃｔｏｒｓにより製造されるもの）である。

本発明はさらに、下記の工程を含む、アクアポリン含有−液膜マトリックスの調製方法に関する：
ａ）ガラスバイアルまたはガラス分液ろうと内で、油／水ｖ／ｖ比０．２５が得られるように非イオン界面活性剤の約１００ｍｇ／ｍＬの水溶液と油成分とを混合し、タンパク質−対−両親媒性界面活性剤のモル比１：５０〜１：４００が得られる量のアクアポリンタンパク質水溶液を添加し、その際、タンパク質は蛍光標識を保有することができる；
ｂ）ａ）からの組み合わせた混合物を回転装置内において室温で一夜回転させてエマルジョンを得る；
ｃ）ｂ）からのエマルジョンを、液膜マトリックスを含むクリーム相または拡張した（extended）油−水−中間相を含む個別の液相に分離するのに十分な時間放置する；
ｄ）エマルジョンのクリーム相のマトリックス試料を、濾過デバイスに注入するために、たとえば図４に示すように注射器で取り出す；そして
ｅ）場合により、アクアポリンタンパク質が液膜マトリックスに適正に挿入されたことを立証するために、形成されたマトリックスの、使用した蛍光標識と適合する吸収スペクトルを求める。

より具体的には、本発明は、正浸透作用を用いて液状媒体から純水を抽出するのに適した液膜マトリックスを調製する方法であって、非イオン界面活性剤の水溶液と水性アクアポリンタンパク質調製物および油とを混和し、続いて穏やかに混合し、生成したエマルジョンを分離させ、生成する拡張した油／水−中間相を抜き出し、これが液膜マトリックスを構成することを含む方法に関する。この方法において、界面活性剤は、好ましくはＡＢＡ型ポロキサマー、たとえば表Ｘに挙げたものから選択される両親媒性ブロックコポリマーであり、アクアポリンタンパク質は緩衝剤を含有する水溶液に可溶化したアクアポリンＺであり、油成分はスクアレンである。ＡｑｐＺ（アクアポリンＺ）を用いる場合、緩衝液は好ましくは下記の組成をもつ：２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８＋５０ｍＭのＮａＣｌ＋１００ｍＭのＯＧ（オクチルグルコシド）；あるいは、ナトリウムまたはクロリドが正浸透プロセスにとって望ましくない場合は、２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８＋１００ｍＭのＯＧ緩衝剤の組合わせを使用できる。アクアポリンとしてＳｏＰＩＰ２；１を用いる他の好ましい態様において、緩衝液はＰＢＳを基礎とするもの、たとえばＰＢＳ＋１．０％のＯＧ、またはＰＢＳ＋１．０％のＯＧであってもよい。あるいは、酵母アクアポリンＡｑｙ１を使用でき、その際、好ましい緩衝液調製物は、たとえば２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８、３００ｍＭのＮａＣｌおよび１％のベータ−ＯＧを含む。約１〜１０％のグリセロールはこれらの緩衝液調製物の任意成分である。異なるアクアポリンタンパク質には異なる最適作動条件が必要である可能性があるので、当業者には種々のアクアポリンの貯蔵および機能に適切な緩衝液調製物を選択する方法が既知であろう。本発明に有用な非イオン界面活性剤の例は、US patent No. 3,740,421に開示される化合物、およびＢＡＳＦによりＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ７７、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ８７、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１０８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７、ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８１、ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８４、およびＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８５の商品名で販売されているポロキサマーである；Monica A. James-Smith et al. J Surfact Deterg (2008) 11: 237-242の開示内容も参照されたい。

本発明の液膜マトリックスはアクアグリセロポリンを含むことができ、したがってその液膜マトリックスは水とグリセロールの両方の濾過に適したものになる。アクアポリン以外の膜貫通タンパク質を取り込ませると、バイオリアクターにおいて水抽出以外の可能な利用範囲が得られ、それぞれの具体的使用は選択する膜貫通タンパク質の生物物理学的特性に依存するであろう；たとえば、燃料電池用途に有用となる興味深い特性をもつロドプシンファミリー、たとえばバクテリオロドプシンのプロトンポンプ。

膜貫通タンパク質を取り込んだ液膜マトリックスを調製する方法はさらに、工程ａ）において、たとえばＤＯＰＣもしくはＤＰｈＰＣもしくはＤＯＰＳ、または天然脂質抽出物、たとえば大腸菌総脂質抽出物、またはダイズ混合リン脂質、またはその組合わせもしくは混合物から選択される両親媒性脂質の添加を含むことができる。最高で約２／３の非イオン界面活性剤を両親媒性脂質、たとえばＤＰｈＰＣおよびアゾレクチン（asolectin）で置き換えることができる。

標識した膜貫通タンパク質を用いる場合、標識は好ましくはナフタレン誘導体、たとえば本明細書の表１に挙げるもの、またはその蛍光機能性誘導体、たとえば６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレンである。

本発明の好ましい態様において、液膜マトリックスは取り込まれたアクアポリン水チャネル、たとえばアクアポリン２を含み、血液透析により失われた患者血漿から純水を再抽出するのに有用である。濾過される血漿から大量の水が失われることは、外部血液透析における周知の問題である。この水を補うべきであり、患者の安全を損なわないためにこれには厳密な純度要件が課される。アクアポリンが天然のヒトアクアポリン２（すなわち約１８０Ｌ／日に及ぶ腎臓の濾液から水を再吸収する作業に関与するアクアポリン）である本発明のアクアポリン液膜マトリックスを用いると、血液透析に際して外部からの大量の超純水を患者に追加する必要性が除かれるであろう。

さらに、本発明は、実質的に平坦な多孔質フィルター材料が液膜マトリックスの層の両側の支持を提供し、これにより層を固定化した、閉鎖サンドイッチ構造を有する支持体付き液膜マトリックスに関する。本発明のこの観点は、たとえばアクアポリン含有−液膜マトリックスの層を限外濾過膜および精密濾過膜から選択されるフィルター材料の間に挟むことにより作製された複合フィルター膜またはディスクの形態をとることができる。代表的な材料は、約１５０ｎｍのポアサイズをもつ有効ではあるが不活性なＰＶＤＦ層を備えた不織または網状のポリプロピレンシート、たとえばＡｌｆａ−Ｌａｖａｌ製のＦＳＭ０．１５ＰＰである。

本発明のアクアポリン含有−液膜マトリックスは、純水のみがそれのアクアポリン水チャネルを通過するのを可能にし、したがって、たとえばマトリックスの浸透圧より低いかまたはそれと等しい浸透圧をもつ供給溶液または第１水性液体と上流接触する濾過デバイスにそのマトリックスが収容され、かつそのデバイスがマトリックスの浸透圧より低い浸透圧をもつ抜取溶液または第２水性液体と下流接触する場合、そのマトリックスは浸透作用による水抽出に使用できる。そのような濾過デバイスの例を図１、２および３に示す。浸透圧勾配が存在する限り、抽出された水は供給溶液からマトリックスを通って抜取溶液中へ流れるであろう。

好ましい態様において、抜取溶液または第２水性液体は生成（精製された）水から分離でき、それは毒性が低いかまたは無毒性であり、かつ液膜に対して化学的に不活性である。第２水性液体（抜取溶液）の例は、海水の脱塩に用いられているグルコースとフルクトースの混合物であり、最近になって、加熱除去可能なアンモニウム塩の高濃度の抜取溶液中で特定比率のアンモニアガスと二酸化炭素ガスを組み合わせることに基づく抜取溶液が得られた；参照：J.O. Kessler, and C.D. Moody, Drinking water from sea water by forward osmosis, Desalination 18 (1976) 297-306; J.R. McCutcheon, R.L. McGinnis, and M. Elimelech, Desalination by a novel ammonia-carbon dioxide forward osmosis process: influence of draw and feed solution concentrations on process performance. J. Membr. Sci. 278 278 (2006) 114-123,およびKirts, Richard EugeneによるMethod and apparatus for producing potable water from seawater using forward osmosis。あるいは、希釈された抜取溶液から６０℃付近に加熱することにより水を容易に分離して、淡水、アンモニアおよび二酸化炭素を得ることができる。アンモニアおよび二酸化炭素は両方とも、次いで抜取溶液の溶質として再利用できる；Low (2009)を参照。

U.S. Pat. Appl. Publ. (2009)、US 2009308727 A1 20091217には、重炭酸アンモニウム正浸透脱塩プロセスを用いる、海水の脱塩方法および装置が開示されている。海水を膜アセンブリーの一方側にポンプで導通し、抜取溶液を膜アセンブリーの他方側にポンプで導通する。抜取溶液は水分子を海水から膜を通して抜取溶液中へ取り出し、抜取溶液分離器が加熱された抜取溶液を受容し、これは次いで分解されてアンモニア、ＣＯ_２および水になる。飲用水がアンモニアガスおよびＣＯ_２ガスから分離される。その後、アンモニアガスおよびＣＯ_２ガスを飲用水流の一部と再結合させて、抜取用の重炭酸アンモニウム溶液を再形成する。本発明の１態様は、US 2009308727 A1に開示される方法および装置における本発明の液膜マトリックスの使用である。本発明の他の態様において、アクアポリン含有−液膜マトリックスは血液透析から生じる透析液から水を再抽出する際に用いられる。血液透析法の改善において、本発明の液膜マトリックスには少なくとも２つの有用な用途がある：
ｉ）本明細書に記載する超純水の調製は、患者血漿の含水率を回復するために現在必要なきわめて複雑な水精製システムの代替となることができる；
ｉｉ）透析液を調製する際に用いる正浸透プロセスに伴って、患者の血漿に由来する大量の水が同時に取り出され、これを本明細書に記載するいずれかの方法でアクアポリン液膜を用いて抽出することができる。

本明細書に記載するアクアポリン含有−液膜マトリックスは、適宜な浸透圧勾配が存在する限り、たとえば膨潤および収縮の反復サイクルでそれのアクアポリンにより純水を吸収し、純水を放出することができる。一般に、膜マトリックスの内部より低い浸透圧をもつ第１水性液体と接触させる前に、膜マトリックスを予め収縮させておき、そしてこの第１水性液体から水を抽出することが望ましい。膨潤した膜マトリックスを第１水性液体から分離した後、吸収した水を、膨潤した膜マトリックスの内部より高い浸透圧をもつ抜取溶液中へ抽出することができる。M. Goulian et al., Biophysical Journal, Vol. 74, January 1998, pp. 328-337には、グラミシジンＡチャネルを含有するＤＯＰＣベシクルの体積は水輸送により最高で約１６％膨潤しうることが示されている。ゲル充填ＤＯＰＣベシクルについて、体積が最高で初期体積の約８０％収縮しうることも示された。A. Viallat et al. Biophysical Journal, Vol. 86, April 2004, pp. 2179-2187を参照。

第１水性液体または供給源相もしくは供給相の一般的な浸透圧は約１００ｍＯｓｍ〜約５００ｍＯｓｍまたは１０００ｍＯｓｍの範囲であり、第２水性液体または受容相もしくは抜取相の一般的な浸透圧は適切な浸透圧差を得るために約１００〜１０００ｍＯｓｍ高い。海水のモル浸透圧濃度は２０００〜２４００ｍＯｓｍであり、これは主に塩化ナトリウムの寄与による。これは、２７５〜２９９ミリオスモル／キログラムである血漿の正常なモル浸透圧濃度の８倍である。ヒトの腎臓が生成する可能性のある最も濃厚な尿は１４００ｍＯｓｍであり、海水のレベルよりはるかに低い。

天然および工学的に作製したアクアポリン水チャネルを取り込ませるほかに、本発明の液膜マトリックスは他のタイプのバイオチャネルを含むことができる；すなわち、ベータ−バレルポア、たとえばアルファ−ヘモリジンおよびＯｍｐＧ、ＦｏｍＡ、ＶＤＡＣ；膜貫通ペプチドポア（アラメチシン、バリノマイシン、グラミシジンＡ）（合成ペプチドを含む）、Boon, M. and Smith, BD; 2002 (“Synthetic membrane transporters”. Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6: 749-756)により概説されるイオンチャネル、ならびにイオン選択的イオノホア、たとえばナトリウム選択的ＥＴＨ１５７、カリウム選択的ＳＱＩ−Ｐｒおよびバリノマイシン、クロリドイオノホアである塩化トリオクチルスズ（Trioctyltin chloride）など。

本発明の液膜マトリックスは、安定化用の油相、たとえば非極性炭化水素系溶媒、たとえば炭素原子６〜１２個の非分枝または分枝炭素鎖をもつものを含む油相を含む。低毒性の油相化合物も好ましい。天然油化合物、たとえばダイズ油（ｃａｓＮｏ．８００１２２７）およびラッカセイ油（共に好ましくは分析標準品のもの）は、物理的安定性を示しかつ無毒性である比較的安定なエマルジョンを形成することが知られている。これらの油にはさらに、スクアレン、スクアラン、アルファ−トコフェロール、ホパノイド類、イソプレン類（たとえば、エステル化されたドリコール）、ユビキノン（Ｑ１０）、ホホバ油、軽油、アマニ油、リン脂質安定化スクアレン、またはダイズ油、リン脂質およびグリセロールのエマルジョン、ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）などが含まれる。さらに、高級アルカン類、たとえばデカン、ウンデカン、ドデカンなどを単独で、または上記の油相化合物と混合して、油相中に使用できる。本発明において、溶媒の少ない、またはさらに無溶媒の液膜マトリックス組成物を得るために、有機溶媒の含量を減らすことが好ましい。

定義
液−液抽出という用語は、液膜を用いる分離プロセスについて用いられる。本発明においては水が液膜内へ抽出されるので、これは液−水抽出である。

液膜の使用について、一般用語“水抽出”は本明細書中で一般用語“水分離”と共に用いられるであろう。

生体模倣（biomimetic）：本発明の膜マトリックスは、膜貫通タンパク質の挿入および統合に適した生体模倣の両親媒性膜をもつことを特徴とする。好ましくは、膜貫通タンパク質は生体模倣膜に統合された際にそれらの天然の三次元コンホメーションを保持し、したがってそのタンパク質はそれの機能性を保持している。

本明細書中で用いる用語“脂質”には、好ましくは両親媒性脂質、たとえばリン脂質、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、およびカルジオリピン、ならびにその混合物が含まれる：たとえばリン脂質、たとえば１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ＤＯＰＣ、ＤＰｈＰＣ、ＤＯＰＳ、天然脂質抽出物、たとえば大腸菌の総脂質抽出物、ダイズ混合リン脂質、またはリン脂質混合物。有用な脂質の例はWO/2006/122566の表１に挙げてあり、それを本明細書に援用する。

本明細書中で用いる用語“バイオチャネル”は、いずれかの膜貫通チャネルまたはポア、たとえば水および／または低分子溶質を液状水性媒体から抽出するために生体模倣両親媒性層に取り込ませることができるタンパク質チャネルを意味するものとする。

本明細書中で用いる用語“アクアポリン”は、いずれかの機能性水チャネル、たとえばWO/2006/122566 “Membrane for filtering of water”、およびTamir Gonen and Thomas Walz, Quarterly Reviews of Biophysics (2006), 39:4:361-396, Cambridge University Pressに記載される膜貫通タンパク質を意味するものとする。本発明に用いる好ましいアクアポリンタンパク質は、Ａｑｐ４、Ａｑｐ１、ＡｑｐＺ、ＳｏＰＩＰ２；１、ならびにそのモノマー、ダイマー、テトラマーおよびより高級なオリゴマーならびに機能性バリアントであって、一次配列の変異形、コンジュゲート形およびトランケート形、たとえば特定のアクアポリンのヘテロロガス発現に最適化した工学的に作製されたバリアントを含むものからなる群から選択される。

用語“水性液体”および“水性液状媒体”は、本明細書中で、水溶液；天然水源；生物由来の液体、たとえば果実および野菜のジュース、血液、ミルクおよび尿；廃水源；水性の懸濁液、分散液、エマルジョンなどを包含するように用いられる。

本明細書中で用いる用語“浸透圧”は、水性液体から半透膜を通ってより高濃度の水性溶質を収容した区画内へ入る水の浸透圧流によって生じる圧力を意味するものとする。潜在浸透圧は、選択透過膜により蒸留水から隔離した際に溶液中に発生する可能性のある最大浸透圧である。潜在浸透圧は、ファント-ホッフの式（van’t Hoff equation）により記述されるように、単位体積中の溶質“粒子”数によって決まる。

用語“正浸透作用（forward osmosis）”（ＦＯ）は、半透膜を隔てた浸透圧差が膜を通して水を輸送する推進力となるプロセスを意味する。ＦＯプロセスの結果、供給流の濃縮および高濃度流（抜取溶液と呼ぶ）の希釈が起きる；参照：Cath et al., Journal of Membrane Science, 281 (2006) 70-87。

用語“第１水性液体”は“供給（feed）”液または供給源相（source phase）に相当する。

用語“第２水性液体”は“抜取（draw）”液または受容相（receiving phase）に相当し、ストリッピング溶液としても知られる。

本明細書に記載する液膜について使用できる用語“標準形ファクター（standard form factor）”は、液膜抽出設備のための近代的な工業用デバイスおよび装置の基準を意味するものとする。

本明細書中で用いる用語“液膜コンタクター（liquid membrane contactor）”は、たとえばアクアポリンバルク液膜を通る相間質量移動の目的で、２以上の液相を互いに接触させることができるデバイスまたは構成物を意味するものとする。本明細書中で用いるコンタクターの例には中空繊維モジュールが含まれ、これには２モジュール型中空繊維モジュール、メンブレンバイオリアクターに有用な中空シート膜、たとえばＭＢＲ用ＨｏｌｌｏｗＳｈｅｅｔＭｅｍｂｒａｎｅ（Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ製）、マルチバンドル中空繊維コンタクター、たとえばＬｉｑｕｉ−Ｃｅｌ（商標）コンタクター、中空繊維パートラクター（Hollow fiber pertractor）および２チャンバーコンタクターシステムが含まれる；参照：http://sschi.chtf.stuba.sk/MembraneLab/Equipment.htm。

具体的な態様
本発明のアクアポリン含有−液膜マトリックスの使用は、供給塩類溶液、たとえば海水からの脱塩により純水または淡水を調製する際に特に有利であり、その際、アクアポリン水チャネルの特異的な純水輸送およびクロリド拒絶の特性がユニークなプロセス条件を提供する。本発明の興味深い態様は、淡水調製のための正浸透プロセスにおけるアクアポリン液膜マトリックスの使用であり、その際、塩水が供給溶液であり、ＣＯ_２／ＮＨ_３を含有する水溶液が約５８℃の加熱により溶存ガスを容易に除去できる利点をもつ抜取溶液である；参照：McGinnis and Elimelech, Desalination, 207 (2007) 370-382; およびQuirin Schiermeier, “Purification with a pinch of salt”, Nature, 452, 20 March 2008。

そのまま使用できる本発明の液膜マトリックスの代表的組成を表１に示す。

本発明を図１〜１２に示し、それらを以下に詳細に説明する：
図１は、本発明の実験に用いる簡単な濾過デバイスの２部品の断面図および上面図を示す。

図２および３は、図１の濾過デバイスのさらに詳細を示す図である。

図４は、相分離後の本発明の液膜マトリックス（エマルジョン‘クリーム’相）の、注射器による抽出の原理図を示す。

図５は、先行技術の正浸透実験で達成された水フラックスおよび塩類フラックスを示すグラフである。

図６は、本発明の液膜マトリックスを用いる正浸透実験で達成された水フラックスおよび塩類フラックスを示すグラフである。図５および６の背後にある実験は、図１、２および３のデバイスならびに図７に示すクロスフロー濾過セットアップを用いて実施された。

図７は、サンドイッチ型液膜（メンブレンセル）を保持するデバイスを示す、クロスフロー−正浸透セットアップの原理図である。

図８は、本発明のアクアポリンＺ含有−液膜マトリックス試料の２０倍顕微鏡写真であり、標識アクアポリンＺからのｂｌｕｅｂａｄａｎ（商標）蛍光が境界層のみに限定されていることを示す。

図９および１０は、図８と同じであるが、明視野画像を示す。液膜マトリックスの細胞様構造を明瞭に見ることができる。

図１１は、図９と同じであるが、タンパク質を取り込んでいない‘クリーム’相を示す。この場合はエマルジョンが一般にベシクルで構成されている。

図１２は、正浸透ユニットセルの模式図であり、その際、Κ_ｆｅｅｄ（ｔ）は測定した供給溶液の導電率について用いられ、Κ_ｄｒａｗ（ｔ）は測定した抜取溶液の導電率について用いられ、ΔＶ_Ｑ（Κ_{ｐｅｒｍｅａｔｅ}）は測定した供給溶液からの流れの体積について用いられる。幅広い矢印は液膜空間を通る流れの方向を示す。

本発明の他の観点は、キャリヤーシステムとしてアクアポリン液膜マトリックスを用いる正浸透作用によって純粋な飲料水を含む栄養ドリンクを提供する方法である。たとえば、アクアポリン液膜マトリックスは尿溶液からアクアポリン液膜内へ水を抽出するであろう。アクアポリン液膜マトリックスと濃縮された尿溶液を相分離させ、続いてアクアポリン液膜マトリックスを、より高い浸透圧勾配をもつ受容水溶液と接触させる。次いで、アクアポリン液膜マトリックスから受容溶液中へ水を抽出し、アクアポリン液膜マトリックスと受容溶液を相分離させると、尿溶液から他の溶液、この例ではグルコースおよびタンパク質の溶液への水の移動という最終結果が得られるであろう。

さらに他の観点において、本発明は、正浸透作用に続く均一電解質の限外濾過における、または溶存ガスの脱ガスのための、本発明の膜マトリックスの使用に関する。これは、いずれかの水溶液または水性液体からの水抽出の完全適用例である。一例として、アクアポリン含有−液膜マトリックスは、廃水溶液からアクアポリン液膜マトリックス内へ水を抽出するであろう。アクアポリン液膜と濃縮された廃水溶液を相分離させ、続いてアクアポリン液膜マトリックスを、より高い浸透圧勾配をもつ受容水溶液と接触させる。次いで、アクアポリン液膜マトリックスから受容溶液内へ水を抽出し、アクアポリン液膜マトリックスと受容溶液を相分離させると、廃水溶液から他の溶液、この例では他の電解質の溶液または溶存ガスの溶液への水の移動という最終結果が得られるであろう。

計算
正浸透圧バッチセルユニットを通るフラックスの測定および拒絶率の計算に次式を使用できる：

個別に移動する溶質分子の溶液についての浸透圧の計算：
Π＝ｃＲＴ[chapt 2.11, ‘Quantities, Units and Symbols in Physical Chemistry,’ INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY, 1993]
ｃ：個別に移動する溶質のモル濃度
Ｒ：気体定数，０．０８２０６Ｌ・ａｔｍ・ｍｏｌ^−１・Ｋ^−１
Ｔ：絶対温度
理想から逸脱した溶質については、上記の式は下記のようになる：
Π＝фｃＲＴ
ここで、фは浸透係数である。摂氏２５度の０．１５Ｍショ糖溶液について、ф＝１，０１[Sten-Knudsen, ‘Stoftransport, membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner’ Akademisk Forlag 1995]。фは特定溶液についての浸透圧測定から決定できる。

例：
周囲温度摂氏２２度摂氏の０．２Ｍソルビトール（Ｄ−ソルビトール）の浸透圧（バール）：
Π＝фｃＲＴ〜１・０，２ｍｏｌｅ・Ｌ^−１・０．０８２０６Ｌ・ａｔｍ・ｍｏｌ^−１・Ｋ^−１・２９５Ｋ・１，０１３２５ｂａｒ・ａｔｍ^−１
＝９．９ｂａｒ
ここで、фは約１と仮定される。

塩類の拒絶；図１２を参照：
完全にイオン化した強電解質を含有する抜取溶液および供給溶液の使用により、導電率κはここでは単純な濃度測定値として用いられる。抜取溶液の導電率の上昇は、抜取溶液体積中へ希釈された透過液体積Ｑ（ｔ）中の透過イオンの量を反映する（Ｖ_０は初期の抜取溶液体積である）：

図６は、本発明の液膜マトリックスを用いる正浸透実験において達成された、ＭｉｌｌｉＱ水からなる供給溶液から１ＭＮａＣｌの抜取溶液中への複合フィルター膜またはディスクを通した水フラックスおよび塩類フラックスを示すグラフである；膜またはディスクは、ＡｑｐＺを取り込んだ本発明の液膜マトリックスの層を、選択したフィルター材料、すなわちＦＳＭ０．１５ＰＰ間に挟むことにより作製された。図６は、約０．１ｇ／ｍ^２ｈのきわめて低い一貫した塩類フラックスを明瞭に示し、これは図５に示す約５．５ｇ／ｍ^２ｈから出発してポアサイズ１〜５ｎｍをもつ技術水準ＦＯ膜（ＦＯＳｅａｐａｃｋ（商標）膜；ＨｙｄｒａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＨＴＩ）から）で同じ装置を用いて得られた塩類フラックスと好対照である；実施例３を参照。図６の水フラックスは、急速に減弱するＨＴＩ膜の水フラックスと同等の期間、４〜５ｋｇ／ｍ^２ｈにおいて安定である。図５および６において、用いた正浸透デバイスは図１、２および３に示すものであり、液膜マトリックスを収容した中央部品の周囲に取り付けることができる２部品（上および下）からなる；液膜マトリックスは、ねじを締めてデバイスを密閉する直前に２つのフィルター支持シート間に注射針により注入される。膜間の体積はスペーサー／膜ホルダーにより決まる。供給溶液および抜取溶液は、図７に示す原理図に従って膜を介して向流様式で連続的にポンプ送入される；参照：Tang et al., Journal of Membrane Science, Volume 354, Issues 1-2, 15 May 2010, Pages 123-133。

本発明による支持体付き液膜は開放または閉鎖サンドイッチ構造をとることもでき、その際、実質的に平坦な多孔質フィルター材料が液膜マトリックスの片側または両側の支持を提供し、したがってその層を固定化する。フィルター材料の例を下記の表２に示す。さらに、セラミック膜、たとえばＳｐｉｎＴｅｋＴｄを支持体として使用できる。この膜タイプは厚さ１８５μｍのステンレス鋼基質から作製され、それにセラミックの薄い（１５μｍ）ナノ粉末コーティングがその基質に接着される。セラミックコーティングは汚損に耐える平滑な表面をもち、したがって重要である。Ｔｄセラミック膜は、本発明の液膜マトリックスを支持するのに適した０．０７μｍの小さいポアサイズおよび０．８μｍの大きいポアサイズのものを入手できる。Ｔｄ膜の基材セラミックは、ナノサイズのセラミック粉末から作製された二酸化チタン（ＴｉＯ_２）である。これを、意図する用途に応じてジルコニアと、またはアルミナおよび二酸化ケイ素の複合材料とブレンドすることができる。

本明細書中の図面により説明する本発明の具体的態様に加えて、本発明の液膜マトリックスはバイオリアクター［いずれかの例？？］、ならびにバイオチャネル調節作用（たとえば、阻害作用および促進作用）をもつ化合物の検出のためのバイオセンサー用途、ならびに薬物スクリーニングに有用である。一例は、固定化した液膜マトリックス調製物中への機能性カリウムチャネルの取込み、およびそのチャネルの阻害または遮断についての化合物ライブラリーのスクリーニングであろう。Judge SI及びBever CTは、多発性硬化症の処置に有用な薬物の同定に関して、この原理を示した；参考文献のセクションを参照。

実施例１．Ａｑｐ−Ｚバルク液膜マトリックスの調製および抽出
精製Ａｑｐ−Ｚを下記の方法に従って得た。あるいは、たとえばMaria Karlsson et al. (FEBS Letters 537 (2003) 68-72)に記載された方法に従って得られるＳｏＰＩＰ２；１を使用できる。

材料および化学薬品
ＢＡＳＦから入手できる非イオン界面活性剤ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８
１３ｍｇ／ｍＬのアクアポリンＺ（Ａｑｐ−Ｚ）バッチ（あるいはＳｏＰＩＰ２；１）
ＰＢＳ緩衝液（ＳｉｇｍａＰ５３６８）：０．０１Ｍリン酸緩衝化生理食塩液（ＮａＣｌ０．１３８Ｍ；ＫＣｌ−０．００２７Ｍ）；ｐＨ７．４，２５℃
Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
油相成分，スクアレン
分液ろうと／ガラスバイアル
気密ガラス注射器
抜取／供給溶液（１ＭＮａＣｌ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）
本明細書中の図１、４および５による原型クロスフローチャンバーアセンブリー
ＬａｂＲｏｌｌｅｒ（商標）回転器（ＬａｂｎｅｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）
下記の条件のｍＬサイズａｑｐ−Ｚ液膜マトリックスの調製：
非イオン界面活性剤：アクアポリンのモル比２００を使用；油−対−水体積比０．２５を使用；Ａｑｐ−Ｚバッチ１０．６ｍｇ／ｍＬを使用（合計２ｍｇ）；油（または油相成分）は純スクアレン；および下記の工程を使用：
１．４ｍＬの４ｍＬ丸底ガラスバイアルまたはガラス分液ろうと（３ｍＬ）に下記のものを添加する：
ｉ）ＰＢＳまたは他の適切な緩衝液中１００ｍｇ／ｍＬの非イオン界面活性剤溶液、室温
ｉｉ）タンパク質（１８９μＬのＡｑｐＺ）を１５２７μＬの非イオン界面活性剤に添加する、最後に
ｉｉｉ）５７２μＬのスクアレン
２．ピペットチップ（１０００μＬのピペット）で穏やかに吸引／排出することにより試料を混和する；
３．場合により：バイアルに蓋をして閉じる前に窒素流により試料を穏やかにフラッシュする；
４．試料をＬａｂＲｏｌｌｅｒ上、室温で一夜回転させる。回転させた後、試料を１時間放置した後に使用する；
５．エマルジョン−水の境界に近い３５０μＬのエマルジョン‘クリーム’層の試料を、下記の追加工程を用いるクロスフローセル（図１、２、３を参照）内への注入のために、５００μＬの気密ガラス注射器（側口付きの２６ゲージのブラントエンド注射針）で取り出す：
１．ＢＬＭキャビティ内の封入フィルターおよびガスケット（３個）を備えたクロスフローセルを組み立てる；
２．注射針を試料区画内へ挿入できるようにする；
３．試料を含む注射針を、射出口を試料区画の開放容積へ向けて挿入し、そしてセルを閉じる；
４．最高で約３５０μＬの試料を徐々に注入する；
５．注射器を抜き出し、セルのねじを完全に閉める。

この時点で、液膜マトリックスを備えたクロスフローセルは正浸透クロスフローセットアップ内に取り付けることができる状態になる。

アクアポリンＺ（ＡｑｐＺ）を下記の方法に従って得た:
細菌性アクアポリンＺ（ＡｑｐＺ）を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）培養において、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus）切断部位を含むＨｉｓタグ付きタンパク質として過剰産生させた。この融合タンパク質は２６４個のアミノ酸および２７，２３４ＤａのＭ_ｗをもつ。大腸菌ＤＨ５α由来のゲノムＤＮＡをＡｑｐＺ遺伝子増幅のための供給源として用いた。このＡｑｐＺ遺伝子を、遺伝子特異的プライマーを用い、タバコエッチウイルス切断部位（ＴＥＶ）；ＥＮＬＹＦＱＳＮをＡｑｐＺのＮ末端に付加して増幅させた。増幅したＡｑｐＺを酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで同様に消化した６−Ｈｉｓタグ付き発現ｐＥＴ２８ｂベクターＤＮＡにライゲートさせた。陽性クローンをＰＣＲスクリーニングにより検証した。次いで構築体の確実性をＤＮＡ配列決定により確認した。

大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をこのタンパク質の発現のために用いた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリアブロス（Luria Broth）培養物を３７℃で１３〜１６時間インキュベートし、新鮮なＬＢブロス中へ１００倍希釈し、約１．２〜１．５の密度（６００ｎｍにおけるＯＤ）まで増殖させた。１ｍＭＩＰＴＧの添加により３５℃で３時間、組換えタンパク質の発現を誘導した後、遠心した。

採集した細胞を、氷冷した結合用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのβ−メルカプトエタノール，１０％のグリセロール）中に、０．４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５０単位のベンゾナーゼ（Bensonase）および３％のＯＧの存在下で再懸濁した。試料を、マイクロフルイダイザーにおける１２，０００Ｐａでの５回の溶解サイクルに供した。不溶性物質を４０，０００×ｇで３０分間の遠心によりペレット化した。上清をＱ−セファロースファストフローカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）に通し、フロースルーを採集した。フロースルー画分にＮａＣｌを３００ｍＭにまで添加した後、予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムに装填した。カラムを１００カラム体積の洗浄用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，３００ｍＭのＮａＣｌ，２５ｍＭのイミダゾール，２ｍＭのβ−メルカプトエタノール，１０％のグリセロール）で洗浄して、非特異的に結合している物質を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース結合した物質を、５カラム床体積の溶離用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，３００ｍＭのＮａＣｌ，３００ｍＭのイミダゾール，２ｍＭのβ−メルカプトエタノール，１０％のグリセロール；３０ｍＭのｎ−オクチル β−Ｄ−グルコピラノシドを含有）で溶離した。ＡｑｐＺを陰イオン交換クロマトグラフィー；ｍｏｎｏＱカラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。混合試料を希釈し、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１０，０００ＤａのＡｍｉｃｏｎ濃縮装置で濃縮して塩類およびイミダゾールの濃度を約１０ｍＭにした後、ＭｏｎｏＱカラムに装填した。陰イオン交換クロマトグラフィーに際して用いた緩衝液は、（Ａ）２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、３０ｍＭのＯＧ、１０％のグリセロール、および（Ｂ）２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＯＧ、１０％のグリセロールとした。イオン交換カラムから溶出したＡｑｐＺ含有ピーク画分をプールした。この精製ＡｑｐＺを−８０℃で凍結保存した。

実施例２．実施例１に従って調製したバルク液膜マトリックスの利用
本発明のＢＬＭ調製物は、濃度推進による液−液質量移動のために設計された中空モジュール、たとえばManuel Aguilar & Jose Luis Cortina “Solvent Extraction and Liquid Membranes”, CRC Press, 2008のセクション4.21に記載され、図4.1(b)（その内容を本明細書に援用する）に示された液体セル−エキストラフロー１０×２８コンタクターに適切に組み込むことができる。本発明の液膜エマルジョンを微孔質中空繊維膜に組み込み、供給溶液としての塩水および適切な濃度の抜取溶液を用いて、純水または脱塩水を塩水供給溶液から抽出することができる。

実施例３．アクアポリン含有−液膜マトリックスを通した正浸透プロセスのための、図１、２および３に示したハウジングユニットの形のフィルターデバイスの使用
組み立てたユニットに、２枚のＡｌｆａＬａｖａｌ精密濾過膜、ＡｌｆａＬａｖａｌ−ＦＳＭ０．１５ＰＰを、濾過区画の液膜マトリックスの支持体として用いる。抜取溶液としては、０．８Ｍソルビトール（Ｄ−ソルビトール，８５５２９ＳｉｇｍａＢｉｏＵｌｔｒａ）を使用できる。試料体積は挟まれた液膜マトリックス５００μＬである。リン酸緩衝化生理食塩（ＰＢＳ）液、ＳｉｇｍａＰ−５３６８（０．１３８ＭのＮａＣｌ，０．００２７ＭのＫＣｌ，０．０１Ｍの一塩基性および二塩基性リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウム）を供給溶液として用いる。あるいは、ＭｉｌｌｉＱ水／１ＭＮａＣｌの供給溶液／抜取溶液の組合わせを使用できる。

実験開始時間は、抜取溶液を撹拌しながら供給溶液を添加した時点である。観察できるのは、測定管の水カラムの位置である。抜取溶液または供給溶液の導電率を測定する時点で測定管に探針を挿入する（ＭｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓＩｎｃ．ＭＩ−９００導電率電極，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＯｒｉｏｎ３−Ｓｔａｒ導電率計）。抜取溶液カラムの経時的な上昇を測定し、それから流速およびフラックスを、質量／面積、および質量／面積／単位時間として適宜計算することができる。水カラムの上昇と並行して、導電率を供給溶液および抜取溶液の両方において測定する。

実施例４．液膜マトリックスに取り込ませるためのアクアポリンの調製
ホウレンソウアクアポリンＳｏＰＩＰ２；１タンパク質をProfessor Per KjellbomおよびUrban Johansson（The Department of Biochemistry, Lund University, スウェーデン）から入手し、Toernroth-Horsefield et al. 2006（Susanna Toernroth-Horsefield et al. 2006. Structural mechanism of plant aquaporin gating, vol 439, Nature, pp.688-694）に従って発現させ、精製した。

大腸菌由来の細菌性アクアポリン−ＺをAssociate professor Jaume Torres (Division of Structural & Computational Biology, School of biological Sciences, Nanyang Technical University, シンガポール）から入手した。機能性アクアポリン−Ｚを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌培養において、タバコエッチウイルス切断部位を含むＨｉｓタグ付きタンパク質として過剰産生させた。この融合タンパク質は２６４個のアミノ酸および２７２３４ＤａのＭｗをもつ。大腸菌ＤＨ５α由来のゲノムＤＮＡをＡｑｐＺ遺伝子増幅のための供給源として用いた。このＡｑｐＺ遺伝子を、遺伝子特異的プライマーを用い、タバコエッチウイルス切断部位（ＴＥＶ）；ＥＮＬＹＦＱＳＮをＡｑｐＺのＮ末端に付加して増幅させた。増幅したＡｑｐＺを酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで同様に消化した６−Ｈｉｓタグ付き発現ｐＥＴ２８ｂベクターＤＮＡにライゲートさせた。陽性クローンをＰＣＲスクリーニングにより検証した。次いで構築体の確実性をＤＮＡ配列決定により確認した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をこのタンパク質の発現のために用いた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリアブロス培養物を３７℃で１３〜１６時間インキュベートし、新鮮なＬＢブロス中へ１００倍希釈し、約１．２〜１．５の密度（６００ｎｍにおけるＯＤ）まで増殖させた。１ｍＭＩＰＴＧの添加により３５℃で３時間、組換えタンパク質の発現を誘導した後、遠心した。

採集した細胞を、氷冷した結合用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのβ−メルカプトエタノール，１０％のグリセロール）中に、０．４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５０単位のベンゾナーゼおよび３％のｎ−オクチル β−Ｄ−グルコピラノシドの存在下で再懸濁した。試料を、マイクロフルイダイザーにおける１２，０００Ｐａでの５回の溶解サイクルに供した。不溶性物質を４０，０００×ｇで３０分間の遠心によりペレット化した。上清をＱ−セファロースファストフローカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）に通し、フロースルーを採集した。フロースルー画分にＮａＣｌを３００ｍＭにまで添加した後、予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムに装填した。カラムを１００カラム体積の洗浄用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，３００ｍＭのＮａＣｌ，２５ｍＭのイミダゾール，２ｍＭのβ−メルカプトエタノール，１０％のグリセロール）で洗浄して、非特異的に結合している物質を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース結合した物質を、５カラム床体積の溶離用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０，３００ｍＭのＮａＣｌ，３００ｍＭのイミダゾール，２ｍＭのβ−メルカプトエタノール，１０％のグリセロール；３０ｍＭのｎ−オクチル β−Ｄ−グルコピラノシドを含有）で溶離した。ＡｑｐＺを陰イオン交換クロマトグラフィー；ｍｏｎｏＱカラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。混合物試料を希釈し、膜カットオフ１０，０００ＤａのＡｍｉｃｏｎ濃縮装置で濃縮して塩類およびイミダゾールの濃度を約１０ｍＭにした後、ＭｏｎｏＱカラムに装填した。陰イオン交換クロマトグラフィーに際して用いた緩衝液は、（Ａ）２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、３０ｍＭのＯＧ、１０％のグリセロール、および（Ｂ）２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＯＧ、１０％のグリセロールとした。イオン交換カラムから溶出したＡｑｐＺ含有ピーク画分をプールした。この精製ＡｑｐＺを−８０℃で凍結保存した。

実施例５．ホウレンソウＳｏＰＩＰ２；１アクアポリンおよび大腸菌Ａｑｐ−Ｚアクアポリンの蛍光標識
アクアポリン膜貫通タンパク質であるホウレンソウアクアポリンＳｏＰＩＰ２；１または大腸菌ＡｑｐＺを、ｂａｄａｎ（商標）で標識した。ｂａｄａｎ（商標）誘導体化タンパク質の合成および取扱いは薄暗い光の下で実施された。この反応を実施するために、ＳｏＰＩＰ２；１に対して１０倍モル過剰のｂａｄａｎ（商標）をｂａｄａｎ（商標）の２０ｍＭ原液（ジメチルホルムアミドに溶解）から１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液に。４℃で２０時間、回転させながら反応を行なわせた。反応混合物を、ＳｏＰＩＰ２；１についてはＰＢＳ、１％のＯＧ、１％のグリセロール、ｐＨ７．４中へ、Ａｑｐ−Ｚについては２０ｍＭのＴｒｉｓ、３０ｍＭのＯＧ、ｐＨ８中へ、ポリアクリルアミドゲルＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ１０ＤＧ脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で脱塩した。得られた蛍光標識アクアポリン類を使用するまで４℃に保存した。ｂａｄａｎ（商標）標識したＳｏＰＩＰ２；１またはＡｑｐＺを、実施例１に従って調製した液膜マトリックス中へ、非イオン界面活性剤−対−タンパク質モル比１：２００で再構成した。

実施例６．ｂａｄａｎ（商標）−アクアポリンの蛍光分光測定および顕微鏡検査
ＶａｒｉａｎＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅ蛍光分光計（ＶａｒｉａｎＩｎｃ．，米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてλ_ｅｘ（励起波長）３８０ｎｍで蛍光分光測定を実施し、４００〜７００ｎｍで発光を記録した。ｂａｄａｎ（商標）標識したアクアポリンＳｏＰＩＰ２；１およびＡｑｐＺの蛍光発光特性は、蛍光プローブｂａｄａｎ（商標）の局所環境の極性に対して感受性である。プローブ周囲の局所環境がより疎水性または親水性になれば、それぞれｂａｄａｎ（商標）の蛍光最大発光収率はブルーシフトまたはレッドシフトする。飽和量のＳＤＳは、最大発光収率のレッドシフトを引き起こす。ｂａｄａｎ（商標）標識アクアポリンのシフトおよび非シフト蛍光強度ピークについての一般偏光（generalized polarization）（ＧＰ）値と比較して、発光スペクトル変化を定量することができる。ＧＰ値を下記により計算した：ＧＰ＝Ｉ_ｂ−Ｉ_ｇ／Ｉ_ｂ＋Ｉ_ｇ；ここで、Ｉ_ｂおよびＩ_ｇは、それぞれ発光スペクトルのブルー辺縁およびグリーン辺縁における強度に相当する。ＶａｒｉａｎＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅ蛍光分光計（ＶａｒｉａｎＩｎｃ．，米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてλ_ｅｘ（励起波長）４００ｎｍで蛍光分光測定を実施し、４２５〜７００ｎｍで発光を記録した。Ｉ_ｂおよびＩ_ｇは、蛍光共焦点顕微鏡画像作成のために適用したバンドパスフィルター範囲に相当する発光スペクトルから計算された。

図８は、蛍光体６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレンで製造業者のプロトコルに従って標識し（ｂａｄａｎ（商標）；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．が製造，29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402-9132, USA）、本発明の液膜マトリックスに取り込ませることにより再構成した、アクアポリンＺの蛍光画像を示す。この画像は、ＲｏｐｅｒＣａｓｃａｄｅ冷却式フレームトランスファー型（frame-transfer）ＣＣＤモノクロカメラを備えたＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｌａｎ２アップライト蛍光顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ，ドイツ、イエナ）を用いて取得された。画像取得に用いたフィルター設定は、３９０ｎｍの励起フィルターおよび４３５〜４６５ｎｍの発光フィルター（ブルーチャンネル）とした。このモノクロ画像は生体模倣両親媒性膜の個々のセルを取り巻く境界層またはシェル内に標識ＡｑｐＺタンパク質が存在することを明瞭に示す。さらに、図９および１０の明視野顕微鏡画像は、アクアポリンを取り込んだマトリックスのユニークなハニカム様構造を示す。これに対し、図１１は、タンパク質なしで調製したクリーム相の明視野顕微鏡画像を示す。この場合、材料が個別のベシクルからなることが明瞭に分かる。他の有用なナフタレンプローブを次表に挙げる。

実施例６．免疫アッセイに使用するための、および感染性疾患における薬物探査のための、バイオセンサーとしての本発明の液膜マトリックスの使用
フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）の主要な外膜タンパク質ＦｏｍＡはトリマー型タンパク質であり、他の腸内細菌の拡散（チャネル）ポリン類のものと類似する透過性を示す。各ＦｏｍＡモノマーは、拡散（チャネル）ポリン類に典型的な、１６の逆平行ベータ鎖からなるベータ−バレルモチーフを示す。ＦｏｍＡポリン類は電圧依存性チャネルタンパク質として機能する。機能性脂質膜に取り込まれたＦｏｍＡチャネルを含む液膜マトリックスは、前記の実施例１に従って調製できる。

ＦｏｍＡセンサーアッセイは液膜マトリックスアッセイとして構築され、今後、センシングをモニターするためのパッチクランプデバイスとして用いられるであろう。そのようなパッチクランプデバイスは、たとえばポート−ア−パッチ（port-a-patch）パッチクランプデバイスとして開発された自動パッチクランプデバイスであってもよい（ＮａｎｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ，ドイツ、ミューニッヒ）。ＦｏｍＡポリンは有望な薬物標的であり、グラム陰性細菌感染性疾患における薬物探査、または免疫アッセイに有用な可能性がある。本発明者らの予備試験により、ＦｏｍＡをシクロデキストリン類で遮断できることが示された。このことは、これまでＦｏｍＡについて記載されたことはない。シクロデキストリンによるＦｏｍＡ遮断というこのユニークな特徴は、ＦｏｍＡに基づく推計学的センシングアッセイを構築するのに適用できる。抗うつ薬など特定の薬物をシクロデキストリン類に結合させ（Li-Qun Gu et al 2000）、これを次いでタンパク質（この場合はＦｏｍＡ）により検知することができる。

実施例７．血液透析のためのシステムにおける本発明の液膜マトリックスの使用
腎臓は、脊椎動物および若干の無脊椎動物をも含めた多くの動物において重要な機能をもつ臓器である。それらの機能は血液から老廃物を除去することであり、したがって天然の血液フィルターである。尿を生成する際、腎臓は尿素およびアンモニアなどの老廃物を排出する；腎臓は水、グルコースおよびアミノ酸の再吸収にも関与する。毎日１８０Ｌの水が腎臓に入り、その水の体積のほとんど全部が再利用される（約０．５Ｌが排出される）。尿の塩類濃度は血液の４倍も高くなる可能性がある。水の再利用および尿中の塩類濃度上昇の理由は、腎臓の構造およびアクアポリンの機能に関係する。腎臓は高性能の正浸透システムとして機能する。腎臓において、細い上行脚、太い上行脚および遠位尿細管は高度に水不透過性であり、一方、他のセグメントは水透過性である。これは腎臓における塩類勾配を形成し、これが正常な腎機能に必要な浸透プロセスの推進力となる。

これに関して、アクアポリンは近位尿細管および集合管に多量に存在する。後者は水の再吸収、および血液と比較した尿中の塩類濃度上昇に関与する。腎不全の場合、腎臓は適正に機能できず、多くの医療問題の原因となる可能性がある。血液透析は、腎不全を伴う患者の血液からイオン（たとえば、Ｋ^＋およびＰＯ_４ ^３−）および尿素などの老廃物ならびに遊離水を分離するための医療方法である。

血液透析に際して、殺菌した無機質イオンの透析溶液を正浸透プロセスに用い、半透膜を通して前記の老廃物を除去する。しかし、過剰の水が同時に血液から分離され、これを補充しなければならない。したがって、血液透析には精製水が必要である。さらに、透析患者は透析液を形成するために透析液濃縮物と混合される大量の水にさらされ、その際、痕跡量の無機質夾雑物または細菌内毒素が患者の血液中へ濾過される可能性すらある。ガラス器具に由来するアルミニウムイオンなどごく低い濃度の金属イオン、および低レベルの内毒素ですら、すべてがこれに関する問題の原因となっている。この理由で、血液透析に用いる水は使用前に慎重に精製しなければならない。１精製工程は、微孔質逆浸透膜を通して水を押し出すことを伴う。この方法で、電解質などの低分子溶質が濾去される。残存電解質の最終除去は、イオン交換樹脂を入れたタンクに水を通すことにより行なうことができ、これによりいずれかの残存する陰イオンまたは陽イオンが除去され、それらがそれぞれヒドロキシル分子および水素分子で置き換えられて超純水が残る。

この水精製度ですら不十分な場合がある。最近の傾向は、この最終精製水を（透析液濃縮物と混合した後）透析膜に通すものである。これは、水を当初の水精製システムに通した後に水中に蓄積した可能性がある不純物、特に細菌起源のものを除去することによってもうひとつの防御層を提供する。

血液透析法の改善において、本発明の液膜マトリックスの少なくとも２つの有用な用途がある：
１．本明細書に記載する超純水の調製は、血液透析に現在用いられているきわめて複雑な水精製システムの代替となることができる；
２．患者の血漿に由来する多量の水が同時に除去される前記の正浸透プロセスに続いて、これを本明細書に記載するいずれかの方法でアクアポリン液膜を用いて抽出することができる。この目的のために、本発明の液膜を介して正常な腎機能を模倣した塩類勾配および向流を形成し、次いでこれが正浸透プロセスに必要な推進力を構成するであろう。これによって患者自身の血漿水の再利用が確保され、いかに精製されたとしても外部からの水中に存在する夾雑物によるリスクが除かれる。

明瞭さおよび理解を目的として、以上に本発明をある程度詳細に記載したが、形態および詳細事項の多様な変更をなしうることは、この開示内容を読むことによって当業者に明らかになるであろう。たとえば、前記の技術および装置はすべて多様な組合わせで使用できる。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書を、個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書それぞれをあらゆる目的で援用すると個々に指示したと同様に、あらゆる目的で全体として本明細書に援用する。

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Claims

（ｉ）内側水相、
（ｉｉ）外側油相、および
（ｉｉｉ）非イオン界面活性剤を含むセル間境界層、
を有するセル構造からなる、液膜マトリックスであって、
アクアポリンまたはアクアグリセロポリンの水チャネルタンパク質が液膜マトリックスのセル間境界層に取り込まれており、境界層におけるアクアポリンまたはアクアグリセロポリンの水チャネルタンパク質の非イオン界面活性剤に対するモル比が１：５０〜１：４００である、前記液膜マトリックス。
非イオン界面活性剤が両親媒性ブロックコポリマーである、請求項１に記載の液膜マトリックス。
両親媒性ブロックコポリマーがポロキサマーである、請求項２に記載の液膜マトリックス。
ポロキサマーが親水基−疎水基−親水基（Ａ−Ｂ−Ａ）型ポロキサマーである、請求項３に記載の液膜マトリックス。
油相が、ステロール、スクアレン、スクアラン、アルファ−トコフェロール、ホパノイド類、イソプレン類であって、エステル化されたドリコール、グリセロール、ユビキノン、ホホバ油、軽油、アマニ油、ダイズ油、ラッカセイ油、リン脂質安定化スクアレン、またはダイズ油、リン脂質およびグリセロールのエマルジョン、ならびにアルカン類、たとえばデカン、ウンデカン、ドデカン；ならびにその混合物を含むものからなる群から選択される成分を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の液膜マトリックス。
油相が、非極性炭化水素系溶媒を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の液膜マトリックス。
セル間境界層が一以上の両親媒性脂質成分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の液膜マトリックス。
一以上の両親媒性脂質成分が、リン脂質、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、カルジオリピン、天然脂質抽出物、大腸菌の総脂質抽出物、ダイズ混合リン脂質及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の液膜マトリックス。
リン脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ＤＯＰＣ、ＤＰｈＰＣ、ＤＯＰＳ又はダイズ混合リン脂質である、請求項８に記載の液膜マトリックス。
アクアポリンまたはアクアグリセロポリンの水チャネルが、ＡＱＰ４、ＡＱＰ１、ＡＱＰＺ、ＳｏＰＩＰ２；１、ならびにそのモノマー、ダイマー、テトラマーおよびより高級オリゴマーならびに機能性バリアントであって、一次配列の変異形、コンジュゲート形およびトランケート形を含むものからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の液膜マトリックス。
最大直径が最高１０００μｍであるセルを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の液膜マトリックス。
大部分のセルが２０〜５０μｍの直径を有する、請求項１１に記載の液膜マトリックス。
実質的に平坦な多孔質フィルター材料が請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスの層の両側の支持を提供し、これにより層を固定化した、閉鎖サンドイッチ構造を有する支持体付き液膜マトリックス。
実質的に平坦な多孔質フィルター材料が請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスの層の片側の支持を提供し、これにより層を固定化した、開放サンドイッチ構造を有する支持体付き液膜マトリックス。
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスを１以上含む、水性液状媒体から純水を抽出するための装置。
水性液状媒体から純水を抽出するための装置であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアクアポリン含有−液膜マトリックスを１以上含むフィルターハウスを有する装置。
装置が中空繊維モジュールである、請求項１６に記載の装置。
装置が、２モジュール型の中空繊維液−液膜コンタクターモジュールまたは液体セル−エキストラフローメンブレンコンタクターである、請求項１６に記載の装置。
正浸透作用を用いて液状媒体から水を抽出するのに適した、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスを調製する方法であって、非イオン界面活性剤の水溶液と緩衝化した水性アクアポリン又は水性アクアグリセロポリンのタンパク質調製物および油とを混和し、続いて回転混合し、生成したエマルジョンを分離させ、生成する拡張した油／水−中間相を抜き出し、これが液膜マトリックスを構成することを含む、前記方法。
一以上の両親媒性脂質成分が、緩衝化した水性アクアポリン又は水性アクアグリセロポリンのタンパク質調製物および油にさらに混和される、請求項１９に記載の方法。
正浸透作用により純水を抽出するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスの使用。
血液透析により失われた患者血漿から純水を再抽出するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスの使用。
下記の工程：
ａ）ある量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の液膜マトリックスをフィルターチャンバーに入れ、これは液膜マトリックスのものより低いかまたは等しい浸透圧を有する第１水性液体（供給溶液）と制御接続し、さらにマトリックスのものより高い浸透圧を有する第２水性液体（抜取溶液）と制御接続して、第１液体と第２液体の間に浸透圧ポテンシャルを形成する、
ｂ）浸透圧勾配が存在する限り、マトリックスに第１液体から純水を吸収させ、純水フラックスを第２液体中へ仲介させる、
ｃ）場合により、抽出した純水を第２液体から分離する、
を含む、水性液体から水を抽出する方法。
第１水性液体が、いずれかのタイプの天然水源、たとえば海水、河川水、湖水、汽水、雨水、アクアポリン水チャネルに対して有毒でない廃水、下記を含めた生物性流体：ワイン、果実および野菜のジュース、ミルク、全血、血漿、尿、唾液、汗、ホモジナイズした組織からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。