KR20130140049A - 물 추출에 적합한 액체 막 - Google Patents

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KR20130140049A
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토마스 비싱
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아쿠아포린 에이에스
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Abstract

아쿠아포린 함유 벌크의 액체 막 매트릭스(BLM) 형태의 액체 막 매트릭스가 기술되며, 여기서 상기 액체 막 매트릭스가 양친매성 공중합체 세제로부터 형성되며, 막관통 단백질이 기능적으로 도입되며 또한 상기 매트릭스가 안정화 유상을 추가로 포함한다. 막 매트릭스의 사용은 예를 들어 염수의 탈염을 위해, 정삼투에 의해 액체 수성 매질로부터 물 추출을 포함한다. .

Description

물 추출에 적합한 액체 막{A LIQUID MEMBRANE SUITABLE FOR WATER EXTRACTION}
본 발명은 수성 매질로부터 물 및/또는 작은 용질을 추출하기 위한, 아쿠아포린(aquaporin) 또는 아쿠아글리세로포린 채널 또는 다른 막 관통 단백질 기공과 같은 기능성 단백질 채널이 도입된(incorporated) 액체 막 매트릭스에 관한 것이다. 더욱 특히 액체 막 매트릭스는, 예컨대 정삼투 적용(forward osmosis application)에서, 특히 수성 액체 매질로부터 순수한 물 추출을 위한, 양친매성 분자의 티슈(tissue) 같은 점성 액체 조직에 도입된 아쿠아포린을 포함하는 아쿠아포린 액체 막이다.
액체 막 분리 공정은, 예컨대 미국특허 4360448(A)호에 기술된 바와 같이, 수용액으로부터 이온과 같은 용해 물질을 제거하기 위해 사용되어 왔다. 상기 발명은 수용액을 에멀전과 접촉시킴을 포함하는 수용액으로부터 용해 종(dissolved species)을 제거하는 방법으로, 상기 에멀전은 상기 수용액과 비혼합성이고 상기 용해 종에 투과성인 것을 특징으로 하는 외부 상(exterior phase), 및 상기 용해 종을 비투과성 형태로 전환할 수 있는 이온교환 화합물과 같은 반응물을 함유하는 내부 상(interior phase)을 포함하는 방법에 관한 것이다. 용해 종은 외부 상을 내부 상에 투과하며, 여기서 이들 종은 비투과성 형태로 전환되어 상기 에멀전의 내부 상에 보유된다. 상기 용해 종에서 대폭 감소된 수용액은 상기 에멀전으로부터 분리되며 상기 에멀전은 재사용을 위해 순환된다. 그러나 복수 또는 불특정 이온 또는 용질이 생물학적 액체와 같은 수용액 또는 매질 중에 존재하는 경우에는, 각각의 종을 제거하기 위하여 특정의 반응물을 고안할 필요가 있기 때문에 이런 또는 유사한 방법에 의해 용질을 제거하는 것이 점점더 복잡하게 된다. 액체 막 추출공정의 사용에 관한 다른 예는 "막 추출에 의한 저-에탄올 음료의 생산"이란 명칭의 국제공개 WO 87/002380호에 기술되어 있으며, 이것은 물 및 다수의 다른 유기 구성분을 보유하면서 와인 및 다른 음료로부터 에탄올을 선택적으로 제거하도록 고안된 막 추출 시스템에 관한 것이다. 따라서 지금까지 액체 막 분리방법은 예컨대 수성 액체 중에서 용질의 선택적 제거를 위해 개발되었다. 수성액체 원료 근원으로부터 물을 선택적으로 제거 또는 추출할 필요성을 감안하여, 본 발명자들은 아쿠아포린 단백질로부터 알려진 선택적 물 채널을 사용하여 수성 액체로부터 순수한 물을 제거 또는 추출하는데 적합한 액체 막 공정을 고안하였다.
형광성 기본 활성 분석은 가용성 단백질에 대하여 잘 확립되었지만, 막 단백질에 대해서는 그렇지 않았다. 이에 대한 그럴듯한 이유는 막 단백질이 그의 자연 환경 - 생물학적 막에서 꺼낼 때 부서지기 쉽다. 더욱이, 상업적으로 입수가능한 단백질 종에 대한 접근 가능성은 단지 몇 가지 막 단백질로 제한되어 있었다. 이것은 다량 (그램 단위)으로 막 단백질을 발현 및 정제하는 어려움과 관련되어 있다. 막 단백질은 전형적으로 단백질의 자연 환경을 충분히 모방하는 바이오미메틱 막 (biomimetic membrane)으로 재구성시 그의 작용을 보유한다. 오늘날 특정의 친수성 및 소수성 영역 또는 층과 같은, 막 단백질 요구조건에 부합하는 바이오미메틱 막 제형의 생산에서 그의 유용성을 위한 지질 막 성분들을 스크리닝하는 분석에 대한 필요성이 충족되지 못하고 있다. 동시에, 이러한 분석은 막 단백질의 접힘 상태에 대한 유용한 정보를 제공한다.
본 발명은 벌크 액체 막(BLM)을 포함하는 바이오채널 형태의 액체 막 매트릭스에 관한 것이며, 여기서 상기 액체 막 매트릭스는 바이오채널이 도입되고 상기 매트릭스가 안정화 유상을 추가로 포함하는 층을 형성하는 지질 함유 또는 불함유 비이온성 세제와 같은 양친매성 화합물로부터 형성된 바이오미메틱 경계층을 갖는 세포를 포함하는 티슈 같은 구조를 기본으로 한다. 본 발명은 또한 기능성 아쿠아포린 물 채널을 함유하는 상기 액체 막 매트릭스를 제조하는 방법, 및 예컨대 염수의 탈염을 위해 정삼투에 의해 액체 수성 매질로부터 순수한 물 추출용 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스의 신규한 사용에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명의 액체 막 매트릭스는 여과수단으로서 유용한 실질적으로 평면 다공질 샌드위치 구조에서 또는 콘텍터 모듈에서 추가로 포함되거나 또는 고정될 수 있다.
본 명세서에 기술된 액체 막 매트릭스는 아쿠아포린 함유 벌크 액체 막(BLM)형태일 수 있으며, 여기서 상기 액체 막은 바람직하게는 폴록사머 형태의 양친매성 블록 공중합체와 같은 비이온성 세제의 분산액에 도입된 기능성 아쿠아포린 물 채널을 포함하며, 상기 매트릭스는 안정화 유상을 추가로 포함한다.
본 발명은 내부 수상, 외부 유상, 및 막 관통 단백질 채널이 도입된 비이온 세제를 포함하는 셀들(cells) 사이의 경계층을 포함하는 셀형 구조로 이루어진 액체 막 매트릭스에 관한 것이다. 이러한 신규 액체 막 매트릭스의 이점은 많은 상이한 형상 및 크기를 허용하는 그의 3차원 구조, 및 매우 큰 내부 표면적을 갖는 물 불침투성 물질을 제공하는 그의 밀착성이며, 여기서 상기 셀들 사이의 경계층은 막 관통 단백질과 같은 양친매성 물질을 보유하기 위한 유일한 양친매성 및 충분한 공간을 나타내며, 이들은 물 채널 (아쿠아포린), 양자 공여체 (로돕신) 등으로서 적절히 작용하도록 층 내에 삽입될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 액체 막 매트릭스는 스테롤, 스쿠알렌, 스쿠알란, 알파-토코페롤, 호파노이드, 에스테르화 돌리콜을 포함하는 이소프렌, 유비퀴논(Q10), 호호바유, 경광물유, 아마씨유, 대두유, 땅콩유, 인지질 안정화 스쿠알렌 또는 대두유, 인지질 및 글리세롤의 에멀전 및 데칸, 운데칸, 도데칸과 같은 알칸 및 그의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 갖는 유상을 포함한다. 상기 유상은 추측건대 비이온성 세제의 친수성 헤드 그룹 (또는 A-체인)을 안정한 구조 내로 강제로 들어가게 하여 본 발명의 LM 매트릭스의 멀티셀룰라 구조를 생성하는데 크게 보조하고, 본 명세서에서 현미경 이미지로 도시된 바와 같이 이들 구조를 안정화시킨다. 그러나 본 발명자들은 유상의 자세한 작용에 관하여 임의의 구체적 이론 또는 설명으로 구속받고 싶지 않다.
본 발명의 액체 막 매트릭스에서, 상기 세제는 바람직하게는 친수성-소수성-친수성(A-B-A) 타입 폴록사머와 같은 비이온성 세제로부터 선택되며, 여기서 상기 폴록사머는 60-85의 A 범위 및 25-35의 B 범위를 갖는 (PEO)A-(PPO)B-(PEO)A　공중합체로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게 A는 약 76의 평균값이며 B는 약 30의 평균값이다. 본 발명에서 사용되는 대표적인 폴록사머는 플루로닉 F68이란 상품명으로 판매되고 있다 [플루로닉 그리드(pluronic grid)로부터 특징들을 삽입].
본 발명의 액체 막 매트릭스는 바람직하게는 DOPC, DPhPC, DOPS, 또는 대장균(E. coli) 총지질 추출물과 같은 천연 지질 추출물, 또는 대두 혼합 인지질, 또는 그의 배합물 또는 혼합물로부터 선택된 양친매성 지질 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 액체 막 매트릭스에서, 상기 단백질 채널은 아쿠아포린 또는 아쿠아글리세로포린 물 채널 예컨대 효모 아쿠아포린, 즉 Aqy1, 식물 아쿠아포린, 즉 SoPIP2;1, 아쿠아글리세로포린, 즉 Aqp3, 또는 박테리아 아쿠아포린, 즉 AqpZ일 수 있다. 다른 막 관통 단백질은 베타-배럴 기공, 예컨대 알파-헤모리신 및 OmpG, FomA, 및 VDAC; 로돕신, 예를 들어 박테리오로돕신, 또는 막 관통 펩티드 기공, 예를 들어 알마메티신, 발리노마이신, 및 그의 유도체를 포함하는 그라미시딘 A 및 합성 막 관통 펩티드; 이온 채널, 또는 이온-선택성 이온운반체(iorsophore)일 수 있다.
본 발명의 액체 막 매트릭스에서, 상기 단백질 채널은 약 1 :50 내지 약 1 :400 범위의 단백질 대 양친매성 세제로 존재할 수 있다. 이것은 양친매성 베시클(amphiphilic vesicle)에서 아쿠아포린 Z와 같은 막 관통 단백질의 도입과 관련하여 알려진 비율과 비교할만하다. 국제공개 WO/2009/076174호 참조.
본 발명의 액체 막 매트릭스는 전형적으로 1000㎛까지의 근사 최대 직경의 셀들을 갖는 밀폐 셀 구조를 나타내며 셀들의 대부분은 바람직하게는 약 20 내지 약 50㎛ 범위이다.
본 발명은 추가로 하기 단계들을 포함하는 수성 액체로부터 물을 추출하는 방법에 관한 것이다:
a) 본 명세서에서 기술된 바와 같은 상당량의 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스를 여과 장치의 필터 챔버 내에 넣는 단계로, 여기서 상기 챔버는 상기 액체 막 매트릭스의 삼투압보다 더 낮거나 동일한 삼투압을 갖는 피드 용액으로 작용하는 제1 수성 액체와 제어 연동되고, 추가로 상기 매트릭스의 삼투압보다 더 높은 삼투압을 갖는 드로우 용액(draw solution)으로 작용하는 제2 수성 액체와 제어 연동되어, 상기 제1 및 제2 액체 사이에 삼투압 전위를 생성하는 것인 단계,
b) 상기 매트릭스가 그의 아쿠아포린 물 채널을 통하여 상기 제1 액체로부터 순수한 물을 흡수하게 하여, 삼투압 구배가 존재하는 한 상기 제2 액체 내에 순수한 물 플럭스를 매개하는 단계,
c) 선택적으로, 상기 제2 액체로부터 추출된 순수한 물을 분리하는 단계.
상기 기술된 방법에서, 상기 제1 수성 액체는 임의의 유형의 자연 수원, 예컨대 해수, 강물, 호숫물, 기수(brackish water), 빗물, 또는 아쿠아포린 물 채널에 독성이 없는 폐수, 와인, 과실 및 식물성 쥬스, 우유, 전혈, 혈장, 뇨, 침, 땀, 균질화 조직 등을 포함한 생물학적 유체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 물을 추출하는 방법은 해수의 탈염에 사용되며, 여기서 염수는 피드 또는 제1 수성 액체이며 또한 C02/NH3　함유 수용액은 드로우 용액 또는 제2 수성 액체이다. C02 또는 NH3와 같은 용해 가스는 정삼투 드로우 용액 중에 사용하여 실질적인 삼투압 구배를 생성할 수 있으며, 따라서 액체 막 매트릭스의 아쿠아포린를 통하여 물 플럭스(water flux)를 구동함과 동시에 가열 및 증발을 통하여 얻어진 희석 드로우 용액으로부터 용이하게 추출된다는 이점을 가진다. 물론 추출된 물의 원하는 최종 용도에 따라 정삼투 드로우 용액에서 유용한 다른 용액을 선택하는 것이 당업자에게 자명하다. 용해 염, 당, 당 알코올 등은 다른 유용한 삼투압 생성 드로우 용질이다.
본 발명은 또한 수성 액체 매질로부터 순수한 물 추출을 위한 장치 또는 기구에 관한 것이며, 여기서 상기 장치는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 하나 이상의 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스를 포함하는 필터 하우스(filter house)를 갖는다. 그의 예는 두개의 모듈 중공 섬유 액체-액체 막 콘텍터 모듈 (예, 미국특허 제5328610호에 기술됨) 또는 액체 셀 여분 흐름 막 콘텍터 (예, Liquid-Cel®Membrane Contactors에서 제조됨)이다.
본 발명은 추가로 하기 단계들을 포함하는 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이다:
a) 유리 바이알 또는 유리 분별 깔대기 내에서 비이온성 세제의 수용액 약 100 mg/mL 및 유성분을 혼합하여 0.25의 유/수 v/v 비를 얻고, 단백질이 형광 표지를 가질 수 있는 상당량의 수성 아쿠아포린 단백질 용액을 첨가하여, 1 : 50 내지 1 : 400의 세제 대 단백질 몰비를 얻는 단계,
b) a)에서 얻은 배합 혼합물을 실온에서 회전 장치 중에 하룻밤 회전시켜 에멀전을 얻는 단계,
c) b)에서 얻은 에멀전을 상기 액체 막 매트릭스를 포함하는 크림상 또는 확장된 유-수 계면을 포함하는 뚜렷한 액체상으로 분리시키는데 충분한 시간 동안 정치시키는 단계,
d) 예컨대 도 4에 도시된 바와 같이, 여과 장치 내에 주입하기 위해 주사기를 이용하여 에멀전 크림상의 매트릭스 시료를 채취하는 단계, 및
e) 선택적으로, 상기 액체 막 매트릭스 내에 아쿠아포린 단백질의 정확한 삽입을 검증하기 위하여 사용된 형광 표지에 적합성이 있는 형성된 매트릭스의 흡수 스펙트럼을 얻는 단계.
더욱 구체적으로 본 발명은 정삼투를 사용하여 액체 매질로부터 물을 추출하는데 적합한 액체 막 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 비이온성 세제의 수용액을 수성 아쿠아포린 단백질 제제 및 오일과 배합시킨 다음 온화하게 혼합하고, 얻어진 에멀전을 분리시키고 상기 액체 막 매트릭스를 구성하는 생성된 확장된 유/수 계면을 추출한다. 상기 방법에서 세제는 바람직하게는 표 X에 나열된 폴록사머와 같은 ABA 타입 폴록사머로부터 선택된 양친매성 블록 공중합체이며, 상기 아쿠아포린 단백질은 완충제 함유 수용액 중에 가용화된 아쿠아포린 Z이며, 상기 유상 성분은 스쿠알렌이다. AqpZ (아쿠아포린 Z)를 사용하는 경우, 상기 완충제는 바람직하게는 다음의 조성 즉 20mM 트리스 pH 8 + 50 mM NaCl + 100mM OG (옥틸 글루코시드)를 가지거나 또는 대안적으로, 나트륨 또는 염화물이 정삼투 공정에 원하지 않는 경우, 20mM 트리스 pH 8 + 100mM OG 완충제 조합이 사용될 수 있다. 아쿠아포린으로서 SoPIP2;1를 사용하는 다른 바람직한 실시형태에서, 완충제는 PBS계, 예컨대 PBS + 1.0% OG, 또는 PBS + 1.0% OG일 수 있다. 대안적으로, 효모 아쿠아포린 Aqy1은 바람직한 완충제 제제가 예를 들면 20 mM 트리스 pH 8, 300 mM NaCl 및 1% 베타-OG인 경우에 사용될 수 있다. 약 1 내지 10%의 글리세롤은 이들 완충제 제제의 임의의 성분이다. 상이한 아쿠아포린 단백질은 상이한 최적 작업조건을 요구할 수 있기 때문에, 당업자는 다양한 아쿠아포린의 저장 및 작용에 적합한 완충제 제제를 선택하는 방법을 알 것이다. 본 발명에서 유용한 비이온성 세제의 예는 미국특허 제3,740,421호에 기술된 화합물이며, 플루로닉 F68, 플루로닉 F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F108, 플루로닉 F127, 플루로닉 P81, 플루로닉 P84, 및 플루로닉 P85이란 상품명으로 BASF에서 시판하는 폴록사머도 또한 Monica A. James-Smith et al. J Surfact Deterg (2008) 1 1 :237-242에 기술되어 있다.
본 발명의 액체 막 매트릭스는 아쿠아글리세로포린을 포함하여 물 및 글리세론 여과에 둘 다 적합한 액체 막 매트릭스를 제조할 수 있다. 아쿠아포린 이외의 다른 막 관통 단백질의 도입은 바이오리액터에서 물 추출 외에 광범위한 가능한 용도를 제공할 것이며, 각각의 구체적 용도는 선택된 막 관통 단백질의 생물리학 특성들, 예컨대 로돕신 패밀리의 프로톤 펌프, 예컨대 연료 셀 적용에 유용하게 하는 흥리로운 특성을 갖는 박테리오로돕신에 따라 달라진다.
막관통 단백질이 도입된 액체 막 매트릭스를 제조하는 방법은 단계 a)에서 예컨대 DOPC 또는 DPhPC 또는 DOPS 또는 천연지질 추출물, 예컨대 대장균 총지질 추출물, 또는 대두 혼합 인지질, 또는 이의 배합물 또는 혼합물의 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 비이온성 세제의 약 3분의 2 이하는 DPhPC 및 아소렉틴과 같은 양친매성 지질로 대체될 수 있다.
표지 막관통 단백질을 사용하는 경우, 상기 표지는 바람직하게는 본 명세서의 표 1에 나열된 것과 같은 나프탈렌 유도체 또는 그의 형광 작용성 유도체, 예컨대 6-브로모아세틸-2-디메틸아미노나프탈렌이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 액체 막 매트릭스는 아쿠아포린 2와 같은 도입된 아쿠아포린 물 채널을 포함하며, 혈액투석을 통해 손실된 환자의 혈장으로부터 순수한 물을 재추출하는데 유용하다. 다량의 물이 여과되는 혈장으로부터 없어지는 것은 외부 혈액투석에서 잘 알려진 문제점이다. 이러한 물은 교체되어야 하며, 이것은 환자의 안전성을 나쁘게 하지 않도록 엄격한 순도 요건을 부여한다. 아쿠아포린이 하루에 대략 180L에 해당하는 신장의 여과물로부터 물을 재흡수시키는 작업을 담당하는 순수 인간 아쿠아포린 2인 본 발명의 아쿠아포린 액체 막 매트릭스를 사용하면, 혈액투석 중에 환자에게 다량의 외부 초 순수 물(extra pure water)의 첨가 필요성을 없앨 것이다.
추가로, 본 발명은 밀폐 샌드위치 구조를 갖는 지지성 액체 막 매트릭스에 관한 것이며, 여기서 실질적으로 편평한 다공질 필터 물질은 상기 매트릭스 층의 양측에 지지체(support)를 제공하여 층을 고정한다. 본 발명의 이러한 측면은 예를 들면 한외여과 막 및 미세여과 막으로부터 선택된 여과물질들 사이에 아쿠아포린 함유 액체 매트릭스의 층을 샌드위치 시켜 생성된 복합 여과막 또는 디스크의 형태를 가질 수 있다. 대표적인 물질은 Alfa-Laval에서 제조한 FSM 0.15 PP와 같은 약 150nm의 기공 크기를 갖는 활성이지만 불활성인 PVDF 여과층을 갖는 부직포 또는 메시 폴리프로필렌 시트이다.
본 발명의 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스는 그의 아쿠아포린 물 채널을 통하여 순수한 물만 통과시키며, 따라서 예컨대 상기 매트릭스가 여과 장치에 함유되고 이는 매트릭스의 삼투압보다 더 적거나 동일한 삼투압을 갖는 피드 용액 또는 제1 수성 액체와 상류 접촉하며 또한 상기 장치가 매트릭스의 삼투압보다 더 적은 삼투압을 갖는 드로우 용액 또는 제2 수성 액체와 하류 접촉하는 경우, 삼투압 물 추출에 사용될 수 있다. 이러한 여과 장치의 일 예는 도 1, 2 및 3에 도시되어 있다. 추출된 물은 삽투압 구배가 존재하는 한 매트릭스를 통하여 피드 용액으로부터 및 드로우 용액 내로 유동할 것이다.
바람직한 실시형태에서 드로우 또는 제2 수성 액체는 생산(정제)수로부터 분리 가능하며, 저독성 또는 비독성을 가지며, 액체 막에 화학적으로 비활성이다. 제2 수성 액체 (드로우 용액)의 예는 해수 탈염에 사용되는 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물이며, 또한 최근에는 열적으로 제거 가능한 암모늄 염의 고농축 드로우 용액중에 암모니아와 이산화탄소를 특정한 비율로 배합하는 것을 기본으로 하는 드로우 용액이 얻어졌다. 참조 J.O. Kessler, 및 CD. Moody, 정삼투에 의해 해수로부터 식수, Desalination 18 (1976) 297-306; J.R. McCutcheon, R.L. McGinnis, and M. Elimelech, 신규의 암모니아-이산화탄소 정삼투 공정에 의한 탈염: 프로세스 성능에 대한 드로우 및 피드 용액 농도의 영향. J. Membr. Sci. 278 278 (2006) 1 14-123), 및 Kirts, Richard Eugene에 의한 정삼투를 사용하여 해수로부터 상수(portable water)를 생산하는 방법 및 장치. 대안적으로, 물은 담수(fresh water), 암모니아 및 이산화탄소를 얻기 위하여 60℃ 부근으로 가열시킴으로써 희석된 드로우 용액으로부터 용이하게 분리할 수 있다. 다음에 암모니아 및 이산화탄소는 드로우 유체에 대한 용질로서 재사용할 수 있다. Low (2009) 참조.
미국특허 출원공개 (2009), US 2009308727 A1 (2009.12.17)은 암모니아-중탄산염 정삼투 탈염 공정을 사용하는 해수의 탈염 방법 및 장치를 기술하고 있다. 해수는 막 조립체의 한측을 통하여 펌프되며 또한 드로우 용액은 막 조립체의 다른 측을 통하여 펌프된다. 드로우 용액은 드로우 용액 중에서 막을 통하여 해수로부터 물 분자를 제거하며, 드로운 용액 분리기는 가열된 드로우 용액을 수용한 다음 암모니아, C02 및 물로 분해한다. 휴대용 물은 암모니아 및 C02　가스로부터 분리된다. 다음에, 암모니아 가스 및 C02　가스는 휴대용 물 흐름의 일부와 재결합되어 중탄산암모늄 드로우 용액을 재형성한다. 본 발명의 한 실시형태는 미국출원 공개 2009308727 A1호에 기술된 바와 같은 방법 및 장치에서 본 발명의 액체 막 매트릭스의 사용이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스는 혈액투석으로부터 기인하는 투석액으로부터 물 재추출에 사용된다. 여기에는 혈액투석 방법의 개량에서 본 발명의 액체 막 매트릭스의 적어도 두 가지의 유용한 적용이 있다:
i) 본 명세서에서 기술된 바와 같은 초 순수 물(ultra pure water)의 생산은 환자 혈장의 물 함량을 회복시키기 위하여 현재 필요한 물 정제를 위해 매우 정교한 시스템을 대체할 수 있다. ii) 투석액을 생산할 때 사용되는 정삼투 공정을 사용하면, 환자의 혈액 혈장으로부터 기인하는 상당량의 물이 동시에 제거되며, 이것은 임의의 본 명세서에서 기술된 바와 같은 방법으로 아쿠아포린 액체 막을 사용하여 추출할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스는, 예컨대 적절한 삼투압 구배가 존재하면 반복적인 팽창 및 수축 사이클에서, 순수한 물을 흡수할 수 있고 그의 아쿠아포린을 통하여 순순한 물을 방출할 수 있다. 전형적으로 막 매트릭스는 막 매트릭스의 내부보다 더 낮은 삼투압을 갖는 제1 수성 액체와 접촉되지 전에 미리 수축될 수 있으며, 이런 제1 수성 액체로부터 물을 추출하는 것이 바람직하다. 상기 제1 수성 액체로부터 팽창된 막 매트릭스를 분리한 이후에, 팽창된 막 매트릭스의 내부보다 더 높은 삼투압을 갖는 드로우 용액 내로 흡수된 물을 추출할 수 있다. M. Goulian et al., Biophysical Journal, Vol. 74, January 1998, pp. 328-337는 DOPC 베시클 함유 그라미시딘 A 채널의 부피가 물 수송에 의해 약 16%까지 팽창할 수 있다는 것을 보여주었다. 또한 이것은 상기 부피가 초기 부피의 약 80%까지 수축할 수 있는 겔 충전 DOPC 베시클을 보여주었다. 참조 A. Viallat et al. Biophysical Journal, Vol. 86, April 2004, pp. 2179-2187.
제1 수성 액체 또는 근원 또는 피드 상의 대표적인 삼투압은 약 100 mOsm 내지 약 500 mOsm 또는 1000 mOsm 범위이며, 제2 수성 액체 또는 수용 또는 드로우 상의 대표적인 삼투압은 적절한 삼투압 차이를 얻기 위하여 약 100 내지 1000 mOsm 이상이다. 해수의 삼투압은 2000-2400 mOsm 범위이고, 이는 주로 염화 나트륨에 기여된다. 이것은 킬로그램 당 약 275-299 밀리오스몰에 해당하는 혈액 혈장의 정상 삼투압의 8배이다. 우리의 신장에서 가장 농축된 뇨는 해양수의 수준보다 훨씬 낮은 1400 mOsm 정도를 생산한다.
자연 및 강화(engineered) 아쿠아포린 물 채널의 도입 외에도, 본 발명의 액체 막 매트릭스는 다른 타입의 바이오채널, 즉 베타-배럴 기공(beta-barrel channel) 예컨대 알파-헤모리신 및 OmpG, FomA, VDAC; 합성 펩티드를 포함하는 막관통 펩타이드 기공(알라메티신, 발리노마이신, 그라미시딘 A), Boon, M. 및 Smith, BD; 2002 ("합성막 수송체". Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6:749-756)에서 검토된 바와 같은, 이온 채널, 및 이온 선택적 이온운반체(ionophore) 예컨대 나트륨 선택적 ETH 157, 칼륨 선택적 SQI-Pr 및 발리노마이신, 클로라이드 이온운반체 트리옥틸틴 클로라이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 액체 막 매트릭스는 예컨대 탄소원자 6 내지 12개의 비분지 또는 분지 탄소 쇄를 갖는 비극성 탄화수소 용매를 포함하는 유상과 같은 안정화 유상을 포함한다. 저독성의 유상 화합물이 또한 바람직한다. 천연유 화합물, 예컨대 대두유 (cas No. 8001227) 및 땅콩유는 둘 다 바람직하게는 분석 표준에서 물리적 안정성을 나타내고 비독성인 비교적 안정한 에멀전을 형성하는 것으로 알려져 있다. 이들 오일은 수쿠알렌, 수쿠알란, 알파-토코페롤, 호파노이드, 이소프렌 (예, 에스테르화 돌리콜), 유비퀴논 (Q10), 호호바유, 경유, 아마씨유, 인지질 안정화 스쿠알렌, 또는 대두유, 인지질 및 글리세롤의 에멀전, 인트라리피드TM 등을 추가로 포함한다. 그 외에, 고급 알칸, 예를 들어 데칸, 운데칸, 도데칸 등이 유상 단독으로 또는 앞서 언급된 유상 화합물과 혼합되게 사용될 수 있다. 본 발명에서는 유기용매의 함량을 감소시켜 적거나 동일한 용매 불함유 액체 막 매트릭스 조성물을 얻는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 실시형태는 첨부한 도면 및 실시예를 참조하여 예시적으로 제한 없이 설명할 것이다.
도 1은 본 명세서에서 실험에 사용된 간단한 여과 장치의 두개 부분의 단면 및 상면을 도시한다.
도 2 및 3은 도 1의 여과 장치의 더욱 상세한 도면을 도시한다.
도 4는 상 분리 후에 본 발명의 액체 막 매트릭스(에멀전 크림상)의 주사기를 이용한 추출의 주요한 스케치를 도시한다.
도 5는 선행기술 정삼투 실험에서 얻어진 물 플럭스(flux) 및 염 플럭스를 도시하는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 액체 막 매트릭스를 사용하는 정삼투 실험에서 얻어진 물 플럭스 및 염 플럭스를 도시하는 그래프이다.
도 7은 샌드위치된 액체 막(막 셀)을 유지하는 장치를 도시하는 크로스 흐름 정삼투 셋업의 주요한 스케치이다.
도 8은 단지 경계층으로 한정된 표지 아쿠아포린 Z로부터 블루 바덴TM 형광을 나타내는 본 발명의 아쿠아포린Z 함유 액체 막 매트릭스 시료의 현미경 20 배 확대 사진이다.
도 9 및 10은 밝은 부분 영상을 도시하는 것을 제외하고는 도 8과 동일한다.
도 11은 단백질이 도입되지 않은 '크림' 상을 도시하는 것을 제외하고는 도 9와 동일하다.
도 12는 정삼투 단위셀의 대략적 예시도이다.
정의
액체-액체 추출이란 용어는 액체 막을 사용하는 분리 공정에서 사용된다. 본 발명에서 이것은 물이 액체 막 내로 추출되기 때문에 액체-물 추출이다.
액체 막을 사용하면, 일반적인 용어 "물 추출"(water extraction)은 본 명세서에서 일반적인 용어 "물 분리"와 함께 사용될 것이다.
바이오미메틱(biomimetic): 본 발명의 막 매트릭스는 막관통 단백질의 삽입 및 통합에 적합한 바이오미메틱 양친매성 막을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 막관통 단백질은 바이오미메틱 막에 도입되는 경우 그의 순수한 3차원 형상을 유지하며, 따라서 단백질은 그의 작용성을 유지한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지질"은 바람직하게는 양친매성 지질, 예컨대 인지질, 포스포글리세라이드, 스핑고지질, 및 카디오지질 뿐만 아니라 그의 혼합물, 예컨대 1,2-디팔미토일-sn-포스파티딜콜린 (DPPC), DOPC, DPhPC, DOPS과 같은 인지질, 예컨대 대장균 총지질 추출물, 천연 지질 추출물, 대두 혼합 인지질, 또는 인지질의 혼합물을 포함한다. 유용한 지질의 예는 본 명세서에서 참고로 인용되는 국제공개 WO/2006/122566의 표 1에 나열되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오채널"(biochannel)은 액체 수성 매질로부터 물 및/또는 소 용질을 추출하기 위해 바이오미메틱 양친매성 층 내로 도입될 수 있는 임의의 막 스패닝 채널(membrane spanning channel) 또는 기공을 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아쿠아포린"(aquaporin)은 국제공개 WO/2006/122566 "Membrane for filtering of water" and by Tamir Gonen and Thomas Walz, Quarterly Reviews of Biophysics (2006), 39:4:361-396, Cambridge University Press에 기술된 막관통 단백질과 같은 임의의 작용성 물 채널을 의미할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 바람직한 아쿠아포린 단백질은 Aqp 4, Aqp 1 , Aqp Z, SoPIP2; 1 및 단량체, 이량체, 사량체 및 그 이상의 올리고머는 물론 변이, 컨주게이트 및 사절두(truncated) 유형의 1차 배열을 포함하는 그의 기능성 변이체, 예컨대 이종 발현에 최적화된 특이적 아쿠아포린의 강화 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수성 액체" 및 "수성 액체 매질"은 수용액; 자연수원; 과실 및 식물성 쥬스, 혈액, 우유 및 뇨와 같은 생물학적 기원의 지질; 폐수원; 수성 현탁액, 분산액, 에멀전 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "삼투압"은 고농도로 수성 용질을 함유하는 분획 내로 반투과 막을 통하여 수성 액체로부터 물의 삼투 흐름에 의해 발생된 압력을 의미할 것이다. 잠재적 삼투압은 선택적 투과성 막에 의해 증류수로부터 분리되었을 때 용액 중에서 발전할 수 있는 최대 삼투압이다. 잠재적 삼투압은 반트 호프 식(van't Hoff equation)으로 기술된 바와 같이 용액의 단위 부피에서 용질 "입자"의 수에 의해 결정된다.
용어 "정상투" (FO)는 반투과성 막에 걸친 삼투압 차이가 막을 통한 물의 수송을 위한 구동력인 공정을 의미한다. FO 공정은 피드 흐름의 농축 및 (드로우 용액으로 언급되는) 고농축 흐름의 희석을 생기게 한다. 참조 Cath et al., Journal of Membrane Science, 281 (2006) 70-87.
용어 "제1 수성 액체"는 "피드(feed) " 액체 또는 근원 상에 상응한다.
용어 "제2 수성 액체"는 박리 용액(stripping solution)으로 또한 알려진 "드로우" 액체 또는 수용 상(receiving phase)에 상응한다.
본 명세서에서 기술된 바와 같은 액체 막으로 사용가능한 "표준 형태 인자"란 용어는 액체 막 추출장치를 위한 현대 공업 장치 및 기구 기준을 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "액체 막 콘텍터" (liquid membrane contactor)는 두 개 이상의 액체 상을 예컨대 아쿠아포린 벌크 액체 막을 통하여 상들 사이에 물질 수송을 목적으로 서로 접촉시키는 장치 또는 조성을 의미할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 콘텍터의 예는 두 개의 모듈 중공 섬유 모듈을 포함하는 중공섬유 모듈, 막 바이오리액터에 유용한 중공 시트 막, 예컨대 Alfa-Laval에서 제조된 NBR용 중공 시트 막, 멀티번들 중공섬유 콘텍터(multibundle hollow fiber contactors), 예컨대 Liqui-CelTM 콘텍터, 중공섬유 분도기(pertractor) 및 두 개의 챔버 콘텍터 시스템을 포함한다. 참조 http://sschi.chtf.stuba.sk/MembraneLab/Equipment.htm
구체적 실시형태
본 발명의 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스의 사용은 아쿠아포린 물 채널의 특이적 물 이동 및 염화물 거부 특성들이 독특한 공정 조건을 제공하는 경우에 해수와 같은 식염 피드 용액의 탈염으로부터 순수한 또는 신선한 물의 생산에 특히 유리하다. 본 발명의 흥미있는 실시형태는 염수가 피드물이고 C02/NH3　함유 수용액이 약 58℃로 가열을 통하여 용해 가스의 용이한 제거의 이점을 갖는 드로우 용액인 경우에 신선한 물의 생산을 위한 정삼투 공정에서 아쿠아포린 액체 막 매트릭스의 사용이다. 참조 McGinnis and Elimelech, Desalination, 207 (2007) 370-382; 및 Quirin Schiermeier, "Purification with a pinch of salt", Nature, 452, 20 March 2008.
사용할 준비가 되어있는 본 발명의 액체 막 매트릭스의 대표적인 조성은 표 1에 나타나 있다.
표 1. 아쿠아포린 액체 막 리터당 성분들
Figure pct00001

본 발명은 이하에 상세하게 설명되는 도 1 내지 12에서 예시된다.
도 1은 본 명세서에서 실험에 사용된 간단한 여과 장치의 두개 부분의 단면 및 상면도를 도시한다.
도 2 및 3은 도 1의 여과 장치의 더욱 상세한 도면을 도시한다.
도 4는 상 분리 후에 본 발명의 액체 막 매트릭스(에멀전 '크림'상)의 주사기를 이용한 추출의 주요한 스케치를 도시한다.
도 5는 선행기술 정삼투 실험에서 얻어진 물 플럭스 및 염 플럭스를 도시하는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 액체 막 매트릭스를 사용하는 정삼투 실험에서 얻어진 물 플럭스 및 염 플럭스를 도시하는 그래프이다. 도 5 및 6 이후의 실험은 도 1, 2 및 3의 장치 및 도 7에 도시된 크로스 흐름 여과 정삼투 셋업을 사용하여 수행하였다.
도 7은 샌드위치된 액체 막 (막 셀)을 유지하는 장치를 도시하는 크로스 흐름 정삼투 셋업의 주요한 스케치이다.
도 8은 단지 경계층으로 한정된 표지 아쿠아포린 Z로부터 블루 바단TM 형광을 나타내는 본 발명의 아쿠아포린 Z 함유 액체 막 매트릭스 시료의 현미경 20 배 확대 사진이다.
도 9 및 10은 밝은 부분 영상을 도시하는 것을 제외하고는 도 8과 동일한다. 막 매트릭스의 셀 유사 구조가 분명하게 나타날 수 있다.
도 11은 단백질이 도입되지 않은 '크림'상을 도시하는 것을 제외하고는 도 9와 동일하다. 본 명세서에서 에멀전은 전형적으로 베시클로 만들어진다.
도 12는 정삼투 단위셀의 대략적 예시도이며, 여기에서 K피드 (t)는 피드 용액의 측정된 전도도에 사용되며, K드로우　(t)는 드로우 용액의 측정된 전도도에 사용되며, 또한 AVQ(K투과)는 피드물로부터 측정된 흐름의 부피에 사용된다. 넓은 화살표는 액체 막 공간을 통하여 흐름 방향을 나타낸다.
본 발명의 추가적인 양상은 캐리어 시스템으로서 아쿠아포린 액체 막 매트릭스를 사용하여 정삼투를 통하여 순수한 음용수를 포함하는 영양음료를 제조하는 방법이다. 일 예로서, 아쿠아포린 액체 막 매트릭스는 아쿠아포린 액체 막 내로 뇨 용액으로부터 물을 추출할 것이다. 아쿠아포린 액체 막 매트릭스 및 농축된 뇨 용액은 상 분리되고, 그 후에 아쿠아포린 액체 막 매트릭스는 높은 삼투압 구배를 갖는 수용 수용액과 접촉될 것이다. 이어서 물은 수용 용액내로 아쿠아포린 액체 막 매트릭스로부터 추출될 것이며, 또한 아쿠아포린 액체 막 매트릭스 및 수용 용액은 상 분리되어 다른 용액에 뇨 용액으로부터 물 이동의 최종 결과를 제공하며, 이 실시예에서는 글루코오스 및 단백질의 용액이다.
또 다른 추가의 양상에서 본 발명은 균일한 전해질의 한외여과 후에 정삼투에서 또는 용해 가스의 탈기를 위해 본 발명의 막 매트릭스의 사용에 관한 것이다. 이것은 임의의 수용액 또는 액체로부터 물 추출의 완전한 적용의 예이다. 일 예로서, 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스는 아쿠아포린 액체 막 매트릭스 내로 폐수 용액으로부터 물을 추출할 것이다. 아쿠아포린 액체 막 및 농축된 폐수 용액은 상 분리되고, 그 후에 아쿠아포린 액체 막 매트릭스는 높은 삼투압 구배를 갖는 수용 수용액과 접촉될 것이다. 이어서 물은 아쿠아포린 액체 막으로부터 수용 용액으로 추출될 것이고, 아쿠아포린 액체 막 매트릭스 및 수용 용액은 상 분리되어, 다른 용액에 폐수 용액으로부터 물의 수송의 최종 결과를 제공하며, 이 실시예에서는 또 하나의 전해질의 용액 또는 용해가스의 용액이다.
계산
다음 식은 정삼투 배치 셀 단위(batach cell unit)에 걸쳐 플럭스의 측정 및 제거율의 계산에 사용될 수 있다.
흐름(flow):
Figure pct00002
(식중
Figure pct00003
는 측정 피펫으로 해독함).
플럭스(flux)는
Figure pct00004
(식중 A는 액체 막 접촉 면적임)로서 계산한다.
삼투압의 함수로서 플럭스:
Figure pct00005

개개 이동 용질 분자의 용액에 대한 삼투압 계산:
Figure pct00006
[chapt 2.11 In 'Quantities, Units and Symbols In Physical Chemistry,' INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY, 1993]
c : 개개 이동 용질의 몰농도
R: 가스 상수, 0.08206 L ·atm　·mol-1 ·k-1
T: 절대온도
이론상 용액 편차에서, 상기 식은 다음과 같이 된다:
Figure pct00007
식중
Figure pct00008
는 삼투압 계수이다. 섭씨 25도에서 0.15 수크로오스 용액에 있어서
Figure pct00009
= 1.01. [Sten-Knudsen, 'Stoflransport, membranpotentialer og elektriske impulaer over biologiske membraner' Akademisk Forlag 1995].
Figure pct00010
는 특정 용액에 대한 삼투로부터 측정될 수 있다.
실시예
섭씨 22도의 주위 온도에서 0.2M 소르비톨 (D-소르비톨)의 삽투압 (기압):
Figure pct00011
Figure pct00012
는 여기서 ＞1로 가정한다.
염 제거율, 도 12 참조
완전히 이온화된 강한 전해질을 함유하는 드로우 및 피드 용액을 사용하여, 전도도는 여기에서 κ는 순 농도 측정단위로서 사용된다. 드로우 용액 전도도의 증가는 투과물 부피 Q(t)에서 투과된 이온의 량을 반영하며, 드로우 부피 (V0는 초기 드로우 부피임)으로 희석된다:
Figure pct00013
벌크 R ('염 제거율')은
Figure pct00014
로 정의될 수 있다.
도 6은 선택된 필터 물질 즉, FSM 0.15PP 사이에 AqpZ가 도입된 본 발명의 액체 막 매트릭스 층을 샌드위치 시켜 생성된 복합 여과막 또는 디스크를 통하여 1M NaCl의 드로우 용액에 MilliQ 물로 이루어진 피드액으로부터 정삼투 실험에서 얻어진 물 플럭스 및 염 플럭스를 도시하는 그래프이다. 도 6은 동일 장치를 사용하는 1 내지 5 nm의 기공 크기를 갖는 선행기술 FO 막 (Hydration Technologies(HT)로부터 FO SeapackTM 막)으로 얻어지고 또한 약 5.5 g/m2h로 시작하는 도 5에 도시된 염 플럭스와 유리하게 비교하는 0.1g/m2h 부근의 매우 낮고 일정한 염 플럭스를 명확하게 나타낸다. 실시예 3 참조. 도 6에서 물 플럭스는 HTI 막의 빠르게 감소하는 물 플럭스에 비하여 일정 기간 동안 4 내지 5 kg/m2h 사이에서 안정하다. 도 5 및 6에서 사용된 정삼투압 장치는 도 1, 2 및 3에 도시된 바와 같으며 또한 스크류의 밀폐(tightening) 및 장치의 밀봉(sealing) 직전에 두 개의 여과 지지체 시트들 사이에 바늘을 통하여 주입되는 액체 막 매트릭스 함유 중심부 부근에 적합할 수 있는 두 개의 부분 (상부 및 하부)으로 구성된다. 막들 사이의 부피는 스페이서/막 홀더에 의해 한정된다. 피드 용액 및 드로우 용액은 도 7에 도시된 주요한 스케치에 따라 역류 모드에서 막에 걸쳐 펌프된다. 참조 Tang et al., Journal of Membrane science, Volume 354, Issues 1 -2, 15 May 2010, Pages 123-133.
본 발명에 따른 지지성 액체 막은 또한 개방 또는 밀폐된 샌드위치 구조의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 실질적으로 편평한 다공질 필터 물질은 액체 막 매트릭스 층의 한쪽 또는 양쪽에 대한 지지체를 제공하며, 따라서 상기 층을 고정한다. 필터 물질의 예는 하기 도 2에 나열된다. 그 외에, SpinTek Td와 같은 세라믹 막이 지지체로서 사용될 수 있다. 이러한 막 유형은 185 ㎛ 두께의 스테인레스 강 기질로 제조되며, 여기서 세라믹의 얇은 (15 ㎛) 나노분말 코팅이 기질에 결합된다. 세라믹 코팅은 파울링(fouling)을 억제하는 부드러운 표면을 가지므로 흥미롭다. Td 세라믹 막은 본 발명의 액체 막 매트릭스의 지지체로 적합한 0.07㎛ 정도로 작고 0.8 ㎛ 정도로 큰 기공 크기로 이용할 수 있다. Td 의 기본 세라믹은 나노 크기 세라믹 분말로 제조된 이산화 티타늄(Ti02)이다. 이것은 원하는 용도에 따라 지르코니아와 혼합하거나 또는 알루미나와 이산화 실리카의 복합물과 혼합할 수 있다.
표 2. 타입, 생산자 및 기공 선택성이 표시된 대체 필터의 목록.
약자의 목록: MF: 미세여과, NF: 나노여과, -as: 비대칭, -s: 대칭
Figure pct00015
본 명세서에서 도면으로 예시된 바와 같은 본 발명의 구체적 실시형태 외에도, 본 발명의 액체 막 매트릭스는 억제 및 활성화와 같은 바이오채널 조절 효과를 갖는 화합물의 검출을 위한 및 약물 스크리닝을 위한 바이오센서 적용에서 및 바이오리액터(특정의의 실시예??)에서 유용하다. 일 예는 고정 액체 막 매트릭스 제제, 및 채널의 억제 또는 차단을 위한 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 있어서 기능성 칼륨 채널의 도입일 것이다. Judge SI and Bever CT는 다발성 경화증의 치료에 유용한 약물의 확인을 위한 이런 원칙을 보여주었다. 문헌 섹션 참조.
실험 섹션
실시예 1. Aqp -Z 벌크 액체 막 매트릭스의 제조 및 추출
정제된 Aqp-Z는 하기에 기술된 방법에 따라 얻었다. 대안적으로, SoPIP2;1은 예를 들어 Maria Karlsson et al. (FEBS Letters 537 (2003) 68-72)에 기술된 방법에 따라 얻어진 바와 같이 사용할 수 있다.
물질 및 화학물질
BASF에서 입수 가능한 비이온성 세제 플루로닉 F68
13 mg/mL의 아쿠아포린 Z (Aqp-Z) 배치 (또는 대안적으로 SoPIP 2;1 )
PBS 완충액 (Sigma P5368) : 0.01 M 인산염 완충 식염수 (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, 25℃
Milli-Q 물
유상 성분, 스쿠알렌
분리 깔대기/유리 바이알
가스 밀폐 유리 주사기
드로우/피드 용액(1M NaCl/ Milli-Q 물)
본 명세서에서 도 1, 4 및 5에 따른 프로토타입 크로스-플로우 챔버 조립체
LabRollerTM 회전자(Labnet International, Inc.)
다음의 조건으로 mL 크기 aqp-Z 액체 막 매트릭스의 제조:
비이온성 세제 : 아쿠아포린의 몰비 200을 사용함; 유-대-수 부피비 0.25를 사용함; 10.6 mg/mL (총 2 mg)으로 Aqp-Z 배치를 사용함; 여기서 오일 (또는 유상 성분)은 순수한 스쿠알렌임; 및 다음 단계들을 사용함:
1. 4 mL 둥근바닥 유리 바이알 또는 4 mL의 유리 분별 깔대기 (3 mL)에 하기를 첨가:
i) 실온에서 100 mg/mL으로 PBS 또는 다른 적합한 완충제에서 비이온성 세제의 용액
ii) 1527 μL의 비이온성 세제에 단백질 (189 μL AqpZ)을 첨가 및 최종적으로
iii) 572 μL의 스쿠알렌.
2. 피펫 선단 (1000 μL 피펫) 내/외에서 온화하게 피펫팅하여 시료를 혼합
3. 선택적으로: 바이알 상의 뚜껑을 밀폐하기 전에 질소 흐름으로 시료를 가볍게 씻어냄(flush)
4. 실온에서 LabRoller 상에 시료를 하룻밤 회전시킴. 회전 후, 시료를 사용 전 1 시간 동안 정치시킴.
5. 하기의 추가 단계를 사용하여 크로스-플로우 셀 (도 1, 2, 3 참조) 내로 주입하기 위하여 500μL 가스 밀폐 유리 주사기 (사이드 포트를 갖는 26 게이지 블런트-말단 바늘(blunt-end needle))로, 에멀전-물 계면에 근사한 시료, 350 μL의 에멀전 '크림' 상을 취함.
1. BLM 캐비티 및 가스켓 (3 조각)에서 캡슐화 필터로 크로스-플로우 셀을 조립한다.
2. 바늘을 시료 구획 내에 삽입시킨다.
3. 시료 구획의 개방 부피에 향하는 사출구로 시료를 포함하는 주사기를 삽입하고 셀을 밀폐한다.
4. 시료의 ~350μL까지 서서히 주입한다.
5. 주사기를 꺼내고 셀 스크류를 완전하게 밀폐한다.
여기서 액체 막 매트릭스를 갖는 크로스-플로우 셀은 정삼투 크로스-플로우 셋업에 설치할 준비가 되어 있다.
아쿠아포린 Z (AqpZ)는 하기에 기술된 방법에 따라 얻었다.
박테리아 아쿠아포린-Z (AqpZ)는 타바코 에치병 바이러스 절단 부위를 갖는 His-표지 단백질로서 대장균 균주 BL21 (DE3) 배양에서 과잉으로 생산하였다. 융합 단백질은 264개의 아미노산 및 27,234 Da의 Mw를 갖는다. 대장균 DH5α로부터 게놈 DNA는 AqpZ 유전자를 증식하는 근원으로 사용되었다. AqpZ 유전자는 AqpZ의 N-말단에서 ENLYFQSN; 타바코 에치병 바이러스 절단 부위 (TEV)를 첨가하여 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증식하였다. 증식된 AqpZ는 효소 NdeI 및 BamHI로 소화한 다음 유사하게 소화된 6-His 표지 발현 pET28b 벡터 DNA에 결찰하였다. 양성 클론은 PCR-스크리닝으로 검증하였다. 다음에 구조물의 신뢰성은 DNA 서열결정에 의해 확인되었다.
대장균 균주 BL21 (DE3)은 단백질의 발현을 위해 사용하였다. 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 루리아 액체 배지 배양물은 37℃에서 13-16시간 동안 보온하고, 신선한 LB 액체 배지에 100배 희석하고, 약 1.2-1.5 (600nm에서 OD)의 밀도로 증식시켰다. 재조합 단백질의 발현은 원심분리 전에 35℃에서 3 시간 동안 1 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다.
수집된 세포는 0.4 mg/ml 리소자임, 50 단위 벤소나제(Bensonase) 및 3% OG의 존재 하에 빙냉 결합 완충액 (20 mM 트리스s pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mM β-머르캅토에탄올, 10% 글리세롤)중에서 재현탁시켰다. 시료는 12,000Pa에서 마이크로플루이다이저 중에 5회 용해 사이클로 처리하였다. 불용성 물질은 40,000 x g에서 30분 원심분리로 펠렛화하였다. 상등액은 Q-세파로오스 고속류 칼럼(Amersham Pharmacia)에 통과시키고, 관류(flow through)를 수집하였다. 관류 분획은 미리 평행화된 Ni-NTA 칼럼 상에 부하되기 전에 NaCl로 300 mM까지 토핑하였다. 칼럼은 100 칼럼 부피의 세척 완충액 (20 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 25 mM 이미다졸, 2 mM β-머르캅토에탄올, 10% 글리세롤)로 세척하여 비특이적 결합 물질을 제거하였다. Ni-NTA 아가로스 배합 물질은 5 상(bed) 부피의 용출 완충액 (20 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, 2 mM β-머르캅토에탄올, 30 mM n-옥틸 β-D-글루코피라노사이드를 함유하는 10% 글리세롤)으로 용출시켰다. AqpZ는 음이온 교환 크로마토그래피; 모노Q 칼럼 (GE 헬스케어)로 추가로 정제하였다. 혼합물 시료는 희석하고 농축시켜 염 및 이미다졸 농도를, 모노Q 칼럼에 부하하기 전에 10,000 Da의 분자량 컷오프(MWCO), 아미콘 농축기로 대략 10mM으로 하였다. 음이온 교환 크로마토그래피 중에 사용된 완충액는 (A) 20 mM 트리스 pH 8.0, 30 mM OG, 10% 글리세롤 및 (B) 20 mM 트리스 pH 8.0, 1 M NaCl, 30 mM OG, 10% 글리세롤이다. 이온교환 칼럼으로부터 AqpZ를 함유하는 용출된 피크 분획을 모았다. 정제된 AqpZ는 -80℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 2. 실시예 1에서 제조된 벌크 액체 막 매트릭스의 적용
본 발명의 BLM 제제는 본 명세서에서 참고로 인용되는 문헌[Manuel Aguilar & Jose Luis Cortina "Solvent Extraction and Liquid Membranes", CRC Press, 2008]의 도 4.1(b)에 도시되고 섹션 4.21에 기술된 바와 같은 농축 구동 액체-액체 집단 이동, 예컨대 액체-셀 엑스트라-플로우 10x28 콘텍터에 적절히 도입될 수 있다. 본 발명의 액체 막 에멀전은 피드 유체로서 염수를 사용하여 미세 다공질 중공섬유 막에 도입할 수 있으며 또한 적절히 농축된 드로우 유체 순수 또는 탈염수는 염수 피드물로부터 추출할 수 있다.
실시예 3. 아쿠로포린 함유 액체 막 매트릭스에 걸쳐 정삼투 공정을 위해 도 1, 2 및 3에 도시된 하우징 ( housing ) 단위 형태로 여과 장치의 사용
조립체 단위에서, 두 개의 알파 라발 미세여과 막, Alfa Laval-FSM 0.15 PP는 여과 구획에서 액체 막 매트릭스의 지지체로서 사용된다. 드로우 용액의 경우, 0.8M 소르비톨 (D-소르비톨, 85529 Sigma BioUltra)가 사용될 수 있다. 시료 부피는 샌드위치 액체 막 매트릭스의 500μL이다. 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, Sigma P-5368 (0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M의 일- 및 이-염기성 인산칼륨 및 인산 나트륨)이 피드물로서 사용된다. 다른 방법에서는, 밀리Q 수/ 1M NaCl 용액의 피드/드로우 배합물이 사용될 수 있다.
실험 시작 시간은 드로우 시 교반하면서 피드 용액을 첨가한다. 주목할 점은 측정 튜브에서 물 칼럼(water column)의 위치이다. 측정 튜브를 통하여, 탐침자(probe)는 드로우 또는 피드 용액(Microelectrodes Inc. MI-900 전도도 전극, Thermo Scientific Orion 3-스타 전도도계)의 전도도(conductivity)를 측정하기 위하여 특정 시점에서 삽입한다. 시간에 따른 드로우 칼럼(draw column)의 상승을 측정하고, 그로부터 유량 및 플럭스는 면적당 질량 및 시간 단위당 면적당 질량으로 적절하게 계산할 수 있다. 전도도는 물 칼럼 상승에 평행하게 피드 및 드로우 둘 다에서 측정한다.
실시예 4. 액체 막 매트릭스에 도입하기 위한 아쿠아포린의 제조
시금치(spinach) 아쿠아포린 SoPIP2; 1 단백질은 스웨덴 Lund 대학교 생화학과 교수 Per Kjellbom 및 Urban Johansson로부터 입수하였고, Tornroth-Horsefield et al. 2006 (Susanna Tornroth-Horsefield et al. 2006. 식물 아쿠아포린 게이팅의 구조 메카니즘, vol 439, Nature, pp.688-694)에 따라 발현 및 정제하였다.
대장균으로부터 박테리아 아쿠아포린-Z는 싱가폴 Nanyang 기술 대학교 생물과학 대학 구조 및 계산 생물학과 부교수 Jaume Torres로부터 입수하였다. 기능성 아쿠아포린-Z는 타바코 에치병 바이러스 절단 부위를 갖는 His-표지 단백질로서 대장균 균주 BL21 (DE3) 박테리아 배양에서 과잉 생산되었다. 융합 단백질은 264개의 아미노산 및 27234 Da의 Mw를 갖는다. 대장균 DH5α로부터 게놈 DNA는 AqpZ 유전자를 증식하는 근원으로서 사용되었다. AqpZ 유전자는 AqpZ의 N-말단에서 타바코 에치병 바이러스 절단 부위 (TEV); ENLYFQSN을 첨가하여 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증식하였다. 증식된 AqpZ는 효소 Ndel 및 BamHl으로 소화시킨 다음 유사하게 소화된 6-His 표지 발현 pET28b 벡터 DNA에 결찰하였다. 양성 클론은 PCR-스크리닝으로 검사하였다. 다음에 구조체의 신뢰성은 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다. 대장균 균주 BL21 (DE3)은 단백질의 발현을 위해 사용하였다. 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 루리아 액체 배지 배양물은 37℃에서 12-16시간 보온하고, 신선한 LB 액체 배지에 100번 희석하고, 약 1.2-1.5의 밀도 (600nm에서 OD)로 증식하였다. 재조합 단백질의 발현은 원심분리 전에 35℃에서 3시간 동안 1 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다.
수거된 세포는 0.4 mg/ml 리소자임, 50 단위 벤소나제 및 3% n-옥틸 β-D-글루코피라노사이드의 존재하에 빙냉 결합 완충액 (20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mM β-머르캅토에탄올, 10% 글리세롤) 중에 재현탁시켰다. 시료는 12,000Pa에서 마이크로플루다이저 중에 5회 용해 사이클로 처리하였다. 불용성 물질은 40,000 x g에서 30분 원심분리로 펠렛화 하였다. 상등액은 Q-세파로오스 고속 흐름 칼럼(Amersham Pharmacia)에 통과시키고, 관류(flow through)를 수집하였다. 관류 분획은 미리 평행화된 Ni-NTA 칼럼 상에 부하되기 전에 NaCl로 300 mM까지 토핑하였다. 칼럼은 100 칼럼 부피의 세척 완충액 (20 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 25 mM 이미다졸, 2 mM β-머르캅토에탄올, 10% 글리세롤)로 세척하여 비특이적으로 배합된 물질을 제거하였다. Ni-NTA 아가로스 배합물질은 5 베드 용적의 용출 완충액 (20 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, 2 mM β-머르캅토에탄올, 30 mM n-옥틸 β-D-글루코피라노사이드를 함유하는 10% 글리세롤)로 용출시켰다. AqpZ는 음이온 교환 크로마토그래피; 모노Q 칼럼 (GE 헬스케어)으로 추가로 정제하였다. 혼합물 시료는 희석하고 농축시켜 염 및 이미다졸 농도를, 모노Q 칼럼에 부하하기 전에 10,000 Da의 분자량 컷오프(MWCO), 아미콘 농축기로 대략 10mM으로 하였다. 음이온 교환 크로마토그래피 중에 사용된 완충액는 (A) 20 mM 트리스 pH 8.0, 30 mM OG, 10% 글리세롤 및 (B) 20 mM 트리스 pH 8.0, 1 M NaCl, 30 mM OG, 10% 글리세롤이다. 이온교환 칼럼으로부터 AqpZ를 함유하는 용출된 피크 분획을 모았다. 정제된 AqpZ는 -80℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 5. 시금치 SoPIP2 ;1 및 대장균 Aqp -Z 아쿠아포린의 형광 표지
아쿠아포린 막관통 단백질, 시금치 아쿠아포린 SoPIP2;1 또는 대장균 AqpZ은 바단(badan)TM으로 표지하였다. 바단TM 유도체화 단백질의 합성 및 취급은 어둑한 빛 하에 수행하였다. 반응을 수행하기 위하여, 바단TM의 20mM 저장 용액으로부터 내지 SoPIP2;1 대비 10-배 몰 과량의 바단TM을 10 mg/ml 단백질 용액에 첨가하였다. 반응은 빙글빙글 회전시켜(end-over-end rotation) 4℃에서 20시간 동안 발생시켰다. 반응 혼합물은 폴리아크릴아미드 겔 Econo-Pac 10DG 탈염 칼럼(Bio-Rad) 상에서 에코노 Aqp-Z에서는 20 mM 트리스, 30 mM OG, pH 8로 탈염하고, SoPIP2;1에서는 PBS, 1% OG, 1% 글리세롤, pH 7.4로 탈염하였다. 얻어진 형광 표지 아쿠아포린은 사용할 때까지 4℃로 저장하였다. 바단TM 표지 SoPIP2;1 또는 AqpZ는 비이온성 세제 대 단백질 몰비 1:200에서 실시예 1에 따라 제조된 액체 막 매트릭스로 재구성하였다.
실시예 6. 바단 TM - 아쿠아포린의 형광 분광 및 현미경 검사
형광 분광은 400 내지 700nm로 기록된 방출 및 380nm의 λex (여기 파장)을 갖는 바리안 카리 에크립스(Varian Cary Eclipse) 형광분광계(Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 바단TM 표지 아쿠아포린 SoPIP2; 1 및 AqpZ의 형광 방출 특성은 형광 탐지자 바단TM의 국부 환경의 극성에 민감하다. 바단TM 의 형광 최대 방출 수율은 탐침자 부근의 국소 환경이 각각 더욱 소수성 또는 친수성이 되면 청색 이동 또는 적색 이동된다. 포화량의 SDS는 최대 방출 수율에서 적색 이동의 원인이 된다. 방출 스펙트럼 변화는 바단TM 표지 아쿠아포린의 이동된 및 이동되지 않은 형광 강도 피크에 대한 일반화 분극(GP) 값을 비교하여 정량할 수 있다. GP 값은 GP= l b　-l g/l b　+ l g로 계산되며, 여기서 l b　및 l g　는 각각 방출 스펙트럼의 청색 및 녹색 단부에서의 강도에 상응한다. 형광 분광은 425 내지 700nm로 기록된 방출 및 400nm의 λex (여기 파장)을 갖는 바리안 카리 에크립스(Varian Cary Eclipse) 형광분광계(Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. l b　및 l g　는 형광 조형 현미경 검사 이미지에 적용되는 밴드 통과 필터 범위에 상응하는 방출 스펙트럼으로부터 계산하였다.
도 8은 제조자의 프로토콜 (바단TM, Molecular Probes, Inc.제조, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402-9132, 미국)에 따라 형광단 6-브로모아세틸-2-디메틸아미노나프탈렌으로 표지되고 본 발명의 막 매트릭스 내에 도입된 아쿠아포린 Z의 형광이미지를 도시한다. 이 이미지는 Roper Cascade 냉각 프레임-트랜스퍼 CCD 모노크롬 카메라가 장착된 Zeiss Axioplan2 직립형 형광 현미경(Carl Zeiss, Jena, 독일)을 사용하여 획득하였다. 이미지 획득에 사용되는 필터 셋팅은 390nm 여기 및 435-465nm 방출 필터 (블루 채널)이었다. 이러한 단색 이미지는 바이오미메틱 양친매성 막의 개개 셀을 둘러싸는 경계층 또는 쉘에서 표지 Aqp Z 단백질의 존재를 명확하게 보여준다. 그 외에, 도 9 및 10의 밝은 영역 현미경 이미지는 아쿠아포린이 도입된 매트릭스의 독특한 벌집 모양 구조를 나타낸다. 반면, 도 11은 임의의 단백질 없이 제조된 크림상의 밝은 영역 현미경 이미지를 나타낸다. 여기서는 물질이 별도의 베시클로 구성되어 있음을 명확하게 보여준다. 다른 유용한 나프탈렌 탐침자는 하기 표에 열거되어 있다.
표 3. 형광 환경 민감성 티올 반응성 나프탈렌 유도체
Figure pct00016
실시예 6. 감염성 질환에서 약물 발견 및 면역 분석에 사용하기 위한 바이오센서로서 본 발명의 액체 막 매트릭스의 사용.
푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), FomA의 주요한 외부 막 단백질은 다른 장내세균 확산 포린(diffusion porin)과 유사한 투과성을 나타내는 삼량체 단백질이다. 각각의 FomA 단량체는 16개의 역평행 베타-스트랜드로 이루어진 확산 포린의 대표적인 베타-베럴 모티프를 나타낸다. FomA 포린은 전압-의존성 채널 단백질로서 작용한다. FomA 채널이 도입된 기능성 지질 막을 갖는 액체 막 매트릭스는 상기 실시예 1에 따라 제조할 수 있다.
FomA 센서 분석은 액체 막 매트릭스 분석으로서 구성될 것이며, 이후에는 센서링을 탐지하기 위한 패치 클램프 장치로서 사용된다. 이러한 패치 클램프 장치는 예를 들면 포트-패치(port-a-patch) 패치 클램프 장치(Nanion Technologies GmbH , Munich, 독일)로서 개발된 자동화 패치 클램프 장치일 수 있다. FomA 포린은 그램 음성 박테리아 감염성 질환에서 또는 면역학적 분석에서 약물 개발에 유용할 수 있는 강력한 약물 표적이다. 우리의 예비적인 연구들은 FomA가 사이클로덱스트린에 의해 차단될 수 있다는 것을 보여주었다. 이것은 예전에는 FomA에 대해 결코 기술되지 않았다. FomA의 사이클로덱스트린 차단의 독특한 특징은 FomA-기본 확률적 센서 분석을 하기 위해 적용될 수 있다. 항우울제와 같은 특정의 약물은 사이클로덱스트린(Li-Qun Gu et al 2000)에 배합된 다음, 단백질 이 경우에는 FomA로 등록될 수 있다.
실시예 7. 혈액투석용 시스템에서 본 발명의 액체 막 매트릭스의 사용
신장은 척추동물 및 일부 무척추 동물을 포함한 많은 동물에서 중요한 기능을 갖는 기관이다. 이들의 기능은 혈액으로부터 찌꺼기 생성물을 제거하는 것이고 그리하여 혈액의 자연 필터를 나타낸다. 뇨를 생성함에 있어서, 신장은 뇨 및 암모니아와 같은 찌꺼기를 배설한다. 신장은 또한 물, 글루코오스 및 아미노산의 재흡수를 담당한다. 매일 180L의 물은 신장에 들어가며 거의 모든 물 부피가 재생된다 (약 0.5L 배출). 뇨의 염 농도는 혈액의 4배 정도 더 높을 수 있다. 뇨에서 물 재생 및 염 상향 농도 이유는 신장의 구조 및 아쿠아포린의 기능과 관련되어 있다. 신장은 고도의 정삼투압 시스템으로 작용한다. 신장에서, 짧은 상승 돌출부, 얇은 상승 돌출부 및 원위 세뇨관은 고도로 수 불투과성이며. 반면 다른 분절은 수 투과성이다. 이것은 정상 신기능에 필요한 삼투 공정에 대한 구동력인 신장에 대한 염농도 구배를 생기게 한다.
이 문맥에서, 아쿠아포린은 원위 세뇨관 및 집합 세뇨관에서 풍부하다. 후자는 혈액에 비하여 물 흡수 및 염의 과잉 농축을 담당한다. 신부전에서 신장은 적절하게 기능하지 못하며, 상당수의 의학적 문제의 원인이 될 수 있다. 혈액투석은 심부전을 갖는 환자의 혈액으로부터 자유수는 물론 이온 (예, K+　및 P04 3 ") 등의 찌꺼기 생성물을 제거하는 의학적 방법이다.
혈액투석에서, 광물 이온의 멸균 투석 용액은 반투과성 막을 통하여 상기 찌꺼기 생성물을 제거하기 위하여 정삼투 공정에서 사용된다. 그러나 과량의 물은 동시에 혈액으로부터 제거되며 이것은 보충되어야 한다. 따라서 정제수는 혈액투석에서 필요하다. 그 외에, 투석 환자는 투석 농축물과 혼합하여 투석물을 형성하는 막대한 양의 물에 노출되며, 여기서 미량의 광물 오염물 또는 박테리아 엔도톡신이라도 환자의 혈액내로 여과할 수 있다. 매우 낮은 농도의 금속 이온, 예컨대 글래스 기구로부터 나오는 알루미늄 이온은 물론, 낮은 수준의 엔도톡신도 이와 관련하여 모든 원인이 되는 문제를 가진다. 이러한 이유 때문에, 혈액투석에서 사용된 물은 사용전에 조심스럽게 정제한다. 하나의 정제단계는 미세 다공질 역삼투막에 물을 통과시킴을 포함한다. 이러한 방식으로 작은 용질 예를 들어 전해질을 여과한다. 최종적으로 남은 전해질의 제거는 이온교환수지로 탱크에 물을 통과시키고, 임의의 남은 음이온 또는 양이온을 제거하고 이들을 하이드록실 및 수소 분자로 각각 대체하여, 초 순수 물을 남긴다.
이러한 정도의 물 정제다로 불충분할 수 있다. 최근에 이러한 추세는 투석기 막을 통해 최종 정제수 (투석 농축물과 혼합 후)를 통과시키는 것이다. 이것은 불순물, 특히 원래의 물 정제시스템을 통과한 후에 물에 축적될 수 있는 박테리아 기원의 불순물을 제거하는 또 하나의 보호층을 제공한다.
여기에는 혈액투석 방법의 개량에서 본 발명의 액체 막 매트릭스의 적어도 두 개의 유용한 적용이 있다.
1. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 초 순수 물의 생산은 혈액투석에서 사용되는 물 정제를 위한 매우 정교한 시스템을 대체할 수 있다.
2. 환자의 혈액 혈장으로부터 유래하는 다량의 물이 제거되는 상술한 정삼투 공정 다음에, 본 명세서에서 기술된 방법 중 임의의 하나에서 아쿠아포린를 사용하여 추출할 수 있다. 이러한 이유 때문에, 염농도 구배 및 대향류(counter current)는 본 발명의 액체 막에 걸쳐 정상 신장 기능을 모방하는 것을 생기게 할 것이며, 다음에 정삼투 공정에 필요한 구동력을 구성할 것이다. 이것은 환자 자신의 혈장수(plasma water)의 재사용을 보장하며 외부 물에 존재하는 오염물로부터 위험을 제거하지만, 정제될 것이다.
전술한 발명은 명확성 및 이해를 위하여 어느 정도 상세하게 설명되었지만, 당업자는 본 기술내용을 읽어보면 형식 및 상세한 내용에서 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 예를 들면, 상술된 모든 기술 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 본 출원에서 인용되는 모든 공보, 특허, 특허출원 및/또는 다른 서류는 각각의 개별적인 공개 공보, 특허, 특허출원 및/또는 다른 서류가 모든 목적에 대해 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 모든 목적에 대해 그 전체가 참고로 포함된다.
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Claims (26)

  1. 내부 수상, 외부 유상, 및 막관통 단백질 채널이 도입된 비이온성 세제를 포함하는 셀들 사이의 경계층을 포함하는 셀형 구조로 이루어진 액체 막 매트릭스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유상이 스테롤, 수쿠알렌, 수쿠알란, 알파-토코페롤, 호파노이드, 에스테르화 돌리콜을 포함하는 이소프렌, 글리세롤, 유비퀴논, 호호바유, 경광물유, 아마씨유, 대두유, 땅콩유, 인지질 안정화 스쿠알렌, 또는 대두유, 인지질 및 글리세롤의 에멀전 및 데칸, 운데칸, 도데칸과 같은 알칸; 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 성분들을 포함하는 액체 막 매트릭스.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세제가 친수성-소수성-친수성 (A-B-A) 타입 폴록사머와 같은 비이온성 세제로부터 선택되는 액체 막 매트릭스.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴록사머가 60 - 85의 A 범위 및 25 - 35의 B 범위를 갖는 (PEO)A-(PPO)B-(PEO)A 공중합체로부터 선택되며, 바람직하게는 A는 약 76의 평균값이며, B는 약 30의 평균값인 액체 막 매트릭스.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 양친매성 지질 성분을 추가로 포함하는 액체 막 매트릭스.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 지질 성분이 DOPC, DPhPC, DOPS, 또는 천연 지질 추출물, 예컨대 대장균 총지질 추출물, 또는 대두 혼합 인지질, 또는 이의 배합물 또는 혼합물로부터 선택되는 액체 막 매트릭스.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 채널이 아쿠아포린 또는 아쿠아글리세로포린 물 채널인 액체 막 매트릭스.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 채널이 약 1:50 내지 약 1:400 범위의 단백질 대 양친매성 세제 몰비로 존재하는 액체 막 매트릭스.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 관통 단백질이 베타-배럴 기공(beta-barrel pores), 예컨대 알파-헤모리신 및 OmpG, FomA, 및 VDAC; 로돕신, 예컨대 박테리오로돕신, 또는 막관통 펩타이드 기공, 예컨대 알라메티신, 발리노마이신, 및 그의 유도체를 포함한 그라미시딘 A 및 합성 막관통 펩타이드; 이온 채널, 또는 이온 선택적 이온운반체(ionophore)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 액체 막 매트릭스.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 1000㎛ 까지의 근사 최대 직경의 셀을 포함하고 셀의 대부분이 바람직하게는 약 20 내지 약 50㎛ 범위에 있는 액체 막 매트릭스.
  11. 하기 단계들을 포함하는 수성 액체로부터 물을 추출하는 방법:
    a) 제 7항, 제 8항 또는 제 10항에 따른 상당량의 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스를 여과 장치의 필터 챔버 내에 넣는 단계로, 여기서 상기 챔버가 상기 액체 막 매트릭스의 삼투압보다 더 낮거나 동일한 삼투압을 갖는 피드 용액으로 작용하는 제1 수성 액체와 제어 연동되고, 추가로 상기 매트릭스의 삼투압보다 더 높은 삼투압을 갖는 드로우 용액(draw solution)으로 작용하는 제2 수성 액체와 제어 연동되므로, 상기 제1 및 제2 액체 사이에 삼투압 전위를 생성하는 것인 단계,
    b) 상기 매트릭스가 그의 아쿠아포린 물 채널을 통하여 상기 제1 액체로부터 순수한 물을 흡수하게 하여, 삼투압 구배가 존재하는 한 상기 제2 액체 내에 순수한 물 플럭스를 매개하는 단계,
    c) 선택적으로, 상기 제2 액체로부터 추출된 순수한 물을 분리하는 단계.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 제1 수성 액체는 임의의 유형의 자연 수원, 예컨대 해수, 강물, 호숫물, 기수(brackish water), 빗물, 또는 아쿠아포린 물 채널에 독성이 없는 폐수, 와인, 과실 및 식물성 쥬스, 우유, 전혈, 혈장, 뇨, 침, 땀, 균질화 조직 등을 포함한 생물학적 유체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 방법이 해수의 탈염에 사용되며, 여기서 염수가 피드 또는 제1 수성 액체이며 C02/NH3　함유 수용액이 드로우 용액 또는 제2 수성 액체인 방법.
  14. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 액체 막 매트릭스를 포함하는 수성 액체 매질로부터 순수한 물 추출을 위한 장치.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 장치가 두 개의 모듈 중공섬유 지지성 액체 막 콘텍터 모듈 또는 액체-액체 셀 막 콘텍터인 장치.
  16. 비이온성 세제의 수용액을 완충된 수성 아쿠아포린 단백질 제제 및 오일과 배합한 다음 빙글빙글 회전시켜(end-over-end) 혼합하고, 얻어진 에멀전을 분리시키고 상기 액체 막 매트릭스를 구성하는 생성된 확장된 유/수 계면을 추출하는 단계를 포함하는, 정삼투를 사용하여 액체 매질로부터 물을 추출하는데 적합한 액체 막 매트릭스를 제조하는 방법.
  17. 하기 단계들을 포함하는 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 액체 막 매트릭스를 제조하는 방법:
    a) 유리 바이알 또는 유리 분별 깔대기 내에서 비이온성 세제의 수용액 약 100 mg/mL 및 유성 성분을 혼합하여 0.25의 유/수 v/v 비를 얻고, 단백질이 형광 표지를 가질 수 있는 상당량의 수성 막관통 단백질 용액을 첨가하여, 1 : 50 내지 1 : 400의 세제 대 단백질 몰비를 얻는 단계,
    b) a)에서 얻은 배합 혼합물을 실온에서 회전 장치 중에 하룻밤 회전시켜 에멀전을 얻는 단계,
    c) b)에서 얻은 에멀전을 상기 액체 막 매트릭스를 포함하는 크림상 또는 확장된 유-수 계면을 포함하는 뚜렷한 액체상으로 분리시키는데 충분한 시간 동안정치시키는 단계,
    d) 여과 장치 내에 주입하기 위해 주사시를 이용하여 에멀전 크림상의 매트릭스 시료를 채취하는 단계, 및
    e) 선택적으로, 상기 액체 막 매트릭스 내에 막관통 단백질의 정확한 삽입을 검증하기 위하여 사용된 형광 표지에 적합성이 있는 형성된 매트릭스의 흡수 스펙트럼을 얻는 단계.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 세제가 ABA 타입 폴록사머 및 그의 양친매성 유도체로부터 선택된 블록 공중합체인 방법.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 막 관통 단백질이 아쿠아포린, 예컨ㄷ대 Aqy1, SoPIP2;1 및 AqpZ; 및 막 관통 단백질, 예컨대 FomA로부터 선택되는 방법.
  20. 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지가 본 명세서에서 표 3에 나열된 것과 같은 나프탈렌 유도체 또는 그의 형광 작용성 유도체인 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 나프탈렌 유도체가 6-브로모아세틸-2-디메틸아미노나프탈렌인 방법.
  22. 제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 DOPC 또는 DPhPC 또는 DOPS 또는 천연 지질 추출물, 예컨대 대장균 총 지질 추출물, 또는 대두 혼합 인지질, 또는 그의 배합물 또는 혼합물의 첨가를 추가로 포함하는 방법.
  23. 정삼투를 통해 순수한 물을 추출하기 위한 제 17항 및 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 액체 막 매트릭스의 용도.
  24. 혈액투석을 통해 손실된 환자의 혈장으로부터 순수한 물을 재추출하기 위한 제 17항 및 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 액체 막 매트릭스의 용도.
  25. 실질적으로 편평한 다공질 필터 물질이 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 액체 막 매트릭스의 층의 양측에 지지체를 제공하는 밀폐 샌드위치 구조를 갖는 지지성 액체 막 매트릭스.
  26. 한외여과 막 및 미세여과 막으로부터 선택된 필터 물질들 사이에 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 아쿠아포린 함유 액체 막 매트릭스의 층을 샌드위치시켜 만들어진 복합 필터 막 또는 디스크.

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