JP7326303B2 - 膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞 - Google Patents
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Description
技術分野
本開示は、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を含む分離膜、および、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を多孔質基質膜上に固定化した薄膜複合層を調製する方法に関する。
本開示は、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を含む分離膜、および、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を多孔質基質膜上に固定化した薄膜複合層を調製する方法に関する。
背景
ポリマーソームまたはポリマー小胞は、適切な溶媒（水など）で両親媒性ブロックコポリマーによって形成される自己組織化構造であり、膜貫通タンパク質などのさまざまな構造を組み込むことができる二重層壁に囲まれた内部の空の空洞を提供する。ポリマー小胞の安定性は、形成するポリマーの分子量および親水性対疎水性比の増加に伴うそれらの透過性とともに増加している。疎水性に対する低い親水性比の値を持つポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレン（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）のブロックコポリマー（一般にＰｌｕｒｏｎｉｃ（プルロニック）として知られている）は、小胞を形成できるため、透過膜を得るのに適している。残念ながら、それらは直接溶解によって自己組織化するのは容易ではない。マイクロ流体デバイスでの組み立てがより適している(Debora F. do Nascimento et al, Microfluidic Fabrication of Pluronic Vesicles with Controlled Permeability Langmuir 2016, 32, 5350-5355)。さらに、ＰＰＯ／ＰＥＯ比が非常に高い（例えば６８／１０）プルロニックは、１００ｎｍ前後の小胞構造に自己組織化することが知られており、それはあまり安定していない。重合したペンタエリスリトールテトラアクリレート（ＰＥＴＡ）の永続的な相互侵入ネットワーク（ＩＰＮ）を介して安定化した場合でも、保存期間は１か月以下である。(Feng Li, Pluronic polymersomes stabilized by core cross-linked polymer micelles, Soft Matter, 2009, 5, 4042-4046.)
ポリマーソームまたはポリマー小胞は、適切な溶媒（水など）で両親媒性ブロックコポリマーによって形成される自己組織化構造であり、膜貫通タンパク質などのさまざまな構造を組み込むことができる二重層壁に囲まれた内部の空の空洞を提供する。ポリマー小胞の安定性は、形成するポリマーの分子量および親水性対疎水性比の増加に伴うそれらの透過性とともに増加している。疎水性に対する低い親水性比の値を持つポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレン（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）のブロックコポリマー（一般にＰｌｕｒｏｎｉｃ（プルロニック）として知られている）は、小胞を形成できるため、透過膜を得るのに適している。残念ながら、それらは直接溶解によって自己組織化するのは容易ではない。マイクロ流体デバイスでの組み立てがより適している(Debora F. do Nascimento et al, Microfluidic Fabrication of Pluronic Vesicles with Controlled Permeability Langmuir 2016, 32, 5350-5355)。さらに、ＰＰＯ／ＰＥＯ比が非常に高い（例えば６８／１０）プルロニックは、１００ｎｍ前後の小胞構造に自己組織化することが知られており、それはあまり安定していない。重合したペンタエリスリトールテトラアクリレート（ＰＥＴＡ）の永続的な相互侵入ネットワーク（ＩＰＮ）を介して安定化した場合でも、保存期間は１か月以下である。(Feng Li, Pluronic polymersomes stabilized by core cross-linked polymer micelles, Soft Matter, 2009, 5, 4042-4046.)
ＰＰＯ／ＰＥＯ比が小さいプルロニックは、陰イオン洗浄剤または無機塩（ドデシル硫酸ナトリウムまたはＮａＦとして）の存在下で自己組織化して、約８００ｎｍから最大３０００ｎｍの構造を形成できる。(Li, F.; Ketelaar, T.; Marcelis, A. T. M.; Leermakers, F. A. M.; Stuart, M. A. C.; Sudholter, E. J. R., Stabilization of polymersome vesicles by an interpenetrating polymer network. Macromolecules 2007, 40 (2), 329-333.; Chen, S.; Yang, B.; Guo, C.; Ma, J. H.; Yang, L. R.; Liang, X. F.; Hua, C.; Liu, H. Z., Spontaneous Vesicle Formation of Poly(ethylene oxide)-Poly(propylene oxide)-Poly(ethylene oxide) Triblock Copolymer. Journal of Physical Chemistry B 2008, 112 (49), 15659-15665.)
プルロニックは非毒性と見なされ、ドラッグデリバリーシステムで広く使用されており、遺伝子治療に刺激的な機会を提供する。(Feng Li, Pluronic polymersomes stabilized by core cross-linked polymer micelles, Soft Matter, 2009, 5, 4042-4046)．多くの研究により、広範囲の抗原とともに使用した場合、細胞性および抗体性の両方の免疫応答を増加させるアジュバントとしてプルロニックの潜在的な使用が示されている(Jain-Gupta N, et al, Pluronic P85 enhances the efficacy of outer membrane vesicles as a subunit vaccine against Brucella melitensis challenge in mice, FEMS Immunol Med Microbiol 66 (2012) 436-444)。
より多くの研究は、様々なより疎水性の薬物を含むことができるミセル中で自己集合し、それらを人体に輸送するポロキサマーの能力を説明している(Yapar AE, Inal O, Poly(ethylene oxide) -Poly(propylene oxide)-Based Copolymers for Transdermal Drug Delivery: An Overview, Trop J Pharm Res, October2012;11 (5):855; Kamboj VK, Verma PK, Poloxamers based nanocarriers for drug delivery system, Der Pharmacia Lettre, 2015, 7 (2):264-269, Batrakova EV et al, Polymer Micelles as Drug Carriers). Block copolymers including pluronics as pluronic-polylactic copolymer self-assembles in vesicles that can load and transport various cargo (eg. insulin) (Xiong XY Vesicles from Pluronic/poly(lactic acid) block copolymers as new carriers for oral insulin delivery, Journal of Controlled Release 120 (2007) 11-17)．
Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（プルロニック）は、ＤＮＡ細胞の取り込み、核移行、および遺伝子発現の増強への影響を含む生物活性を示すことができる。親水性と親油性のバランス値が高いＰｌｕｒｏｎｉｃｓは、細胞質に均一な分布をもたらす。親水性と親油性のバランス値が低いものは、核に局在することを好む(Fan W et al. Degradable gene delivery systems based on Pluronics-modified low-molecular-weight polyethyleneimine: preparation, characterization, intracellular trafficking, and cellular distribution, International Journal of Nanomedicine 2012:7 1127-1138)。
アクアポリンなどの膜貫通タンパク質を含む小胞は、水の浄化（ＷＯ２００６／１２２５６６）や塩分の生成（ＷＯ２００７／０３３６７５）などの用途向けの固定化されたアクアポリンを有する膜を作るために使用することができる。小胞は一般に層としてまたはフィルムとして支持基質上に堆積され、ナノ濾過、逆浸透、正浸透または圧力遅延浸透によって膜を通る水分子の選択的通過を可能にする。
ＷＯ２０１３／０４３１１８は、アクアポリン水チャネル（ＡＱＰ）を組み込んだ小胞が固定化されている薄膜複合（ＴＦＣ）膜を開示している。さらに、それは、薄膜複合膜を製造する方法、ならびにナノ濾過および浸透濾過プロセスなどの濾過プロセスにおけるそれらの使用を開示する。ＷＯ２０１０／１４６３６５は、固定化ＡＱＰを組み込むための小胞形成物質として両親媒性トリブロックコポリマーを使用するＴＦＣ－アクアポリン－Ｚ（ＡｑｐＺ）濾過膜の調製について記載している。ＷＯ２０１４／１０８８２７は、アクアポリン水チャネルが脂質またはブロック共重合体小胞に組み込まれてからＴＦＣ層に組み込まれる、アクアポリン水チャネルを含む薄膜複合（ＴＦＣ）層で修飾された繊維を有する中空繊維（ＨＦ）モジュールを開示している。
しかしながら、典型的には先行技術において、小胞の製造に使用される両親媒性脂質およびブロックコポリマーは、それらの主に疎水性の部分を可溶化するために、テトラクロロメタン（ＣＣｌ４）またはクロロホルム（ＣＨＣｌ３）などの過酷な溶媒に溶解する必要がある固体である。膜合成では、この溶媒を蒸発させて膜を形成し、これを再水和して両親媒性物質を小胞などのさまざまなエマルション形態にし、同時にＡＱＰ膜タンパク質を組み込む。より環境への影響が少ない溶媒を使用するプロセスを開発することが望ましい。
工業用膜は、分離プロセスまたは洗浄プロセス中に高温で処理される場合がある。膜が乳製品などの食品の処理に使用される場合、微生物の発生を回避するために膜を消毒することが一般に望ましい。小胞を組み込んだ先行技術の膜は、高温に曝されると急速に劣化する傾向がある。本発明の一態様では、高温での処理後に適切な水透過性を維持しながら、より高い温度安定性を示す膜に組み込むための小胞を開発することが目的である。
発明の概要
本発明は、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞に関し、小胞膜形成材料は、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を含む。
本発明は、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞に関し、小胞膜形成材料は、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を含む。
本発明による小胞は、一般に、直径の実質的な収縮なしに高温に耐える。小胞径の収縮が少ないため、膜の機械的寸法安定性が高くなり、生産寿命が長くなる。さらに、収縮率が低いため、水の透過性はほとんど影響を受けない。
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）は、通常、約１，０００Ｄａ～約１５，０００Ｄａの重量平均分子量、例えば、約２，５００Ｄａ～約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである。特定の態様では、重量平均分子量は、３，０００Ｄａを超え、例えば４，０００Ｄａを超え、好ましくは５，０００Ｄａを超える。しかしながら、通常、この態様の重量平均分子量は、８，０００Ｄａ以下、例えば７，０００Ｄａ以下、好ましくは６，０００Ｄａ以下である。好ましい態様では、重量平均分子量は約５，８００Ｄａである。
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）は、ブロックの組成と比率が異なる場合があるが、一般に、化合物は次の化学式で表すことができる。
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す
ｘは１０～３０の整数を示す、
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ｚは１０～３０の整数を示す
本発明の特定の実施形態では、ｘは１５～２５の整数を示し、ｙは６０～８０の整数を示し、ｚは１５～２５の整数を示す。本発明の特定の実施において、ｘおよびｙは同じ意味を有する。さらに、ｘおよびｚは好ましくは約２０であり、ｙは約７０である。この化合物はプルロニックＰ－１２３として入手可能である。別の実施形態では、ｘおよびｚは３０～２００の範囲であり、ｙは４０～６０の範囲である。この代替実施形態による特定の例は、ポロキサマー４０７（ＢＡＳＦの商品名：プルロニックＦ１２７）であり、ここで、ｘ＝ｚ＝１０１およびｙ＝５６である。
ポリエーテルアミンは通常、ポリエーテル骨格に結合した１つ以上の一級アミノ基を含んでいる。ポリエーテル骨格は、通常、プロピレンオキシド（ＰＯ）またはプロピレンオキシド（ＰＯ）とエチレンオキシド（ＥＯ）の混合物をベースとしている。プロピレンオキシド（ＰＯ）とエチレンオキシド（ＥＯ）の混合物を使用する場合、ＰＯ／ＥＯのモル比は通常１より高くなる。つまり、ポリエーテルアミンは主にポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ベースである。好ましい態様では、モル比ＰＯ／ＥＯは通常２より高く、例えば３より高い。
ポリエーテル主鎖は、１～３個のアミン基を含むことができ、すなわち、ポリエーテルは、モノアミン、ジアミン、またはトリアミンである。本発明の好ましい態様では、ポリエーテルアミンはモノアミンである。プロピレンオキシド（ＰＯ）とエチレンオキシド（ＥＯ）の混合物が適用される場合、アミン基は主に分子のプロピレンオキシド（ＰＯ）部分の末端に配置される。
ポリエーテルアミンの分子量は一般に５００～５０００Ｄａの範囲である。本発明の特定の態様では、分子量は、１０００～４０００Ｄａ、例えば１５００～３０００Ｄａである。本発明の好ましい態様では、ポリエーテルアミンの分子量は約２０００Ｄａである。
本発明の特定の実施形態では、ポリエーテルアミンは、下記の一般構造のものである。
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～５０の整数である、
ＲはＣＨ３である。
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～５０の整数である、
ＲはＣＨ３である。
本発明の特定の態様では、比ｎ／ｍは、１以上、例えば２または３以上である。より適切には、ｍは２～１０の整数、例えば４～８を表す。最も好ましいのは約６である。ｎは適切には１０～４０の範囲、例えば２５～３５の範囲である。
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の比率は、広い範囲で選択することができる。しかしながら、通常、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比は５：１である。
現在、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）は小胞の主鎖を形成していると考えられており、そこでは、プロピレングリコールユニットが疎水性ドメイン中に集合して、エチレングリコールが小胞外空間に突き出ている。ポリエーテルアミンの疎水性部分が小胞内に分子を固定し、アミン基が小胞外空間に突き出るようになるであろう。したがって、ポリエーテルアミンは、小胞の表面をアミン基で装飾すると言えるかもしれない。
膜貫通タンパク質は、それらの自然環境において、全脂質膜、すなわち細胞の内部から細胞外空間に及ぶ。膜貫通タンパク質の多くは特定の物質のゲートウェイとして機能し、それによって細胞内部と細胞外液の間でこれらの物質の交換を可能にする。膜貫通タンパク質の特徴は、膜中への膜貫通タンパク質の組み込みを確実にする疎水性領域の存在である。膜貫通タンパク質はさらに、中空繊維領域の両側に親水性セグメントを有し、前記親水性セグメントは、それぞれ細胞の内部および細胞外液に向けられている。本発明において、膜貫通タンパク質は、小胞の疎水性部分に組み込まれる。
本発明に開示される膜材料に任意の膜貫通タンパク質を組み込むことができるが、イオン（イオンチャネル）および水（アクアポリン水チャネル）を輸送する膜貫通タンパク質を使用することが一般に望ましい。イオンチャネルには、塩化物チャネルと金属イオントランスポーター（輸送体）が含まれる。いくつかの膜貫通タンパク質では、塩化物チャネルは、塩化物イオンに加えてＨＣＯ３
－、Ｉ－、ＳＣＮ－、およびＮＯ３
－をも伝導する。金属イオン輸送体には、マグネシウム輸送体、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネル、カルシウムチャネル、プロトンチャネルなどが含まれる。
本発明の好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、アクアポリン水チャネルである。アクアポリン水チャネルは、細胞内外への水の輸送を促進する。工業用膜では、アクアポリン水チャネルが浸透により水の流れを確保するが、溶液中のその他の溶質は拒否される。
膜貫通タンパク質は水溶液中で凝集および沈殿する傾向があるため、膜貫通タンパク質が洗浄剤に可溶化されていることが適切な場合がある。多くの洗浄剤を使用することができるが、一般に、洗浄剤は、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明はまた、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法に関するものでもあり、当該方法は、下記の工程を含む：
ａ．膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
ｂ．水溶液として、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）を、工程ａで調製された混合物に添加すること、
ｃ．工程ｂで得られた溶液を攪拌すること。
ａ．膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
ｂ．水溶液として、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）を、工程ａで調製された混合物に添加すること、
ｃ．工程ｂで得られた溶液を攪拌すること。
調製された小胞はまた、ポリマーソームまたはポリマー小胞と呼ばれることもある。小胞は、撹拌工程中に適切な溶媒（例えば、水）中で両親媒性ブロックコポリマーによって形成される自己組織化構造である。小胞は、膜貫通タンパク質のような様々な構造を組み込むことができる二層壁によって囲まれた内部の空の空洞を提示する。
ポリマー小胞の安定性は、形成するポリマーの分子量とともに増加している。従って、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）の平均分子量は、少なくとも１０００ダルトンである。しかしながら、高すぎる分子量は、小胞へと組み立てることが困難になる傾向がある。したがって、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）の平均分子量は、好ましくは１５，０００ダルトンを超えない。本発明の好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）は、約２，５００Ｄａ～約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである。本発明の代替実施形態では、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）は、１０，０００～１５，０００Ｄａの分子量を有する。
小胞の透過性は、一般に、親水性対疎水性比の増加に伴って増加する。したがって、プロピレングリコール単位の量は、一般にエチレングリコール単位の量よりも多い。一般にプルロニックとして知られているポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレン（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）のブロックコポリマーは、親水性対疎水性の比の値が低く、透過膜を得るのに適している。本発明の一実施形態では、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）は、下記の化学式を有する：
ｘは１０～３０、好ましくは１５～２５の整数を表す。
ｙは、５０～１００、好ましくは６０～８０の整数を表す。そして
ｚは、１０～３０、好ましくは１５～２５の間の整数を表す。
ｘは１０～３０、好ましくは１５～２５の整数を表す。
ｙは、５０～１００、好ましくは６０～８０の整数を表す。そして
ｚは、１０～３０、好ましくは１５～２５の間の整数を表す。
ポリエーテルアミンは適切には下記の一般構造のものである：
ｍは１～１５の整数であり、
ｎは５～５０の整数であり、
Ｒ＝ＣＨ３である。
ｍは１～１５の整数であり、
ｎは５～５０の整数であり、
Ｒ＝ＣＨ３である。
本発明の一実施形態では、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比は５～１である。
アクアポリンなどの水性膜貫通タンパク質が工程ａでポリエーテルアミンと混合される前に、適切には、膜貫通タンパク質が洗浄剤に可溶化される。洗浄剤中の膜貫通タンパク質の可溶化は、膜貫通が水溶液中に沈殿する傾向を防止または改善する。適切には、洗浄剤は、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の一実施形態では、上記で開示されたように生成された小胞は、分離膜中に含まれる。一実施形態では、分離膜は、小胞および多孔質支持膜を組み込んだ活性層を含む。多孔性支持膜は、膜貫通タンパク質によって輸送されるイオンおよび／または水の流束を実質的に妨げるべきではない。多孔性支持膜の主な目的は、小胞を組み込んだ活性層の足場として機能することであり、それによって膜貫通タンパク質が主要な識別要素になることを可能にする。
本発明の好ましい態様では、活性層は、多孔質基質膜上に形成された薄膜複合層に組み込まれた小胞を含む。特定の理論に縛られることを望まないが、表面にアミン基を含む小胞は、物理的に組み込まれるか、または固定化（吸着）されるだけでなく、さらに、ＴＦＣ層に化学的に結合されると考えられている。なぜなら、アミン基は、塩化トリメソイル（ＴＭＣ）などの塩化アシルとの界面重合反応に参加するであろうからである。このようにして、小胞はＴＦＣ層中で共有結合され、比較的高い小胞ローディングをもたらし、したがって膜を通るより高い水流束をもたらすであろうと考えられている。さらに、ＴＦＣ層中における小胞の共有結合は、選択的膜層中に組み込まれた場合、アクアポリンおよびアクアポリンが組み込まれた小胞のより高い安定性および／または寿命をもたらすと考えられている。
さらに、前記膜貫通タンパク質が、イオンチャネルまたはアクアポリンなどを含み、前記膜貫通タンパク質を含む前記小胞が、前記活性層または選択層に固定化または組み込まれる場合、多様な選択性および輸送特性を有する分離膜または濾過膜を製造することが可能になる。例えば、前記膜貫通タンパク質がイオンチャネルである場合はイオン交換膜を、または、前記膜貫通タンパク質がアクアポリンである場合は水濾過膜を、製造することが可能になる。膜貫通タンパク質は、自己組織化小胞に複合化されたときにその生物学的に活性な折り畳み構造を維持するため、分解から保護されている可能性がある。敏感な両親媒性タンパク質でさえ、十分に安定になり、したがって、実験室および工業規模で分離膜に加工されたときに、それらの望ましい機能を維持することができる。
本発明はさらに、膜貫通タンパク質を多孔質基質膜上に組み込んだ小胞を固定化した薄膜複合層を調製する方法に関し、当該方法は、下記の工程を含む：
ａ．上記のように調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
ｂ．工程ａの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
ｃ．ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
ｄ．当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること。
ａ．上記のように調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
ｂ．工程ａの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
ｃ．ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
ｄ．当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること。
ジアミン化合物は、例えば、下記のものを含む化合物の範囲から選択できる：フェニレンジアミン、例えば、ｍ－フェニレンジアミン、ｐ－フェニレンジアミン、２，５－ジクロロ－ｐ－フェニレンジアミン、２，５－ジブロモ－ｐ－フェニレンジアミン、２，４，６－トリクロロ－ｍ－フェニレンジアミン、２，４，６－トリブロモ－ｍ－フェニレンジアミンなど；ジアミノビフェニル、例えば、２，２’－ジアミノビフェニル、４，４’－ジアミノビフェニル、３，３’－ジクロロ－４，４’－ジアミノ－ビフェニル、３，５，３’，５’－テトラブロモ－４，４’－ジアミノビフェニルなど；ジアミノジフェニルメタン、例えば、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジアミノジフェニルメタン、２，２’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジクロロ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、２，２’－ジクロロ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，５，３’，５’－テトラクロロ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，５，３’，５’－テトラブロモ－４，４’－ジアミノジフェニルメタンなど；ジアミノビベンジル、例えば、４，４’－ジアミノビベンジル、３，５，３’，５’－テトラブロモ－４，４’－ジアミノ－ビベンジルなど；２，２－ビスアミノフェニルプロパン、例えば、２，２－ビス（４’－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（３’，５’－ジクロロ－４’－アミノ－フェニル）プロパン、２，２－ビス（３’，５’－ジブロモ－４’－アミノフェニル）－プロパンなど；ジアミノジフェニルスルホン、例えば、４，４’－ジアミノ－－ジフェニルスルホン、３，５，３’，５’－テトラクロロ－４，４’－ジアミノ－ジフェニルスルホン、３，５，３’，５’－テトラブロモ－４，４’－ジアミノジフェニル－スルホンなど；ジアミノベンゾフェノン、例えば、４，４’－ジアミノ－ベンゾフェノン、２，２’－ジアミノベンゾフェノン、３，３’－ジクロロ－４，４’－ジアミノベンゾフェノン、３，５，３’，５’－テトラブロモ－４，４’－ジアミノベンゾフェノン、３，５，３’，５’－テトラクロロ－４，４’－ジアミノベンゾフェノンなど；ジアミノジフェニルエーテル、例えば、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，３’－ジブロモ－４，４’－ジアミノジフェニルエーテルなど、ピペラジン、Ｎ－フェニル－ベンゼン－１，３ジアミン、メラニン、およびそのような化合物の混合物。好ましい態様では、ジアミンは、１，３－ジアミノベンゼンとしても知られるｍ－フェニレンジアミン（ＭＰＤ）として選択される。
トリアミン化合物は、例えば、ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン、フェニレントリアミン、ビス（ヘキサメチレン）－トリアミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、ビス（３－アミノプロピル）－アミン、ヘキサメチレンジアミン、Ｎ－獣脂アルキルジプロピレン、１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリアミン、およびこれらの化合物の混合物を含む化合物の範囲から選択することができる。
ハロゲン化アシル化合物は、通常、ジアミン化合物またはトリアミン化合物との反応に利用可能な２つまたは３つのハロゲン化アシル基を有する。ハロゲン化ジアシルまたはハロゲン化トリアシル化合物の適切な例には、塩化トリメソイル（ＴＭＣ）、臭化トリメソイル、塩化イソフタロイル（ＩＰＣ）、臭化イソフタロイル、塩化テレフタロイル（ＴＰＣ）、臭化テレフタロイル、塩化アジポイル、塩化シアヌルおよびこれらの化合物の混合物が含まれる。
ジアミンまたはトリアミン化合物のアミン基は、ハロゲン化アシル化合物の酸塩化物基と反応で競合する。一般に、ジアミンまたはトリアミン化合物のハロゲン化アシル化合物に対する重量比は、０：１～３０：１である。表面に高密度の小胞が要求される場合、ジアミンまたはトリアミン基の量は通常、範囲の下部内、つまり０：１から１：１、たとえば０：１から０．５：１の間である。本発明の他の実施形態では、より剛性の高いＴＦＣ層が望ましく、反応物の選択は、範囲の上限内、例えば１：１から３０：１、好ましくは１：１から５：１である。
アミン水溶液は、多孔質支持膜に均一な層で添加され、その後、ハロゲン化アシル溶液の塗布前に乾燥されてもよい。本発明の特定の実施形態では、アミン水溶液を多孔性支持膜に適用し、続いて、多孔性支持膜の反対側に真空を提供して、水性アミン溶液の多孔性構造中への浸透を刺激する。真空を解除した後、アミンと塩化アシルとの反応による薄膜複合層の形成のために、塩化アシル溶液が適用される。真空の使用は、多孔質支持膜における薄膜複合層のより良い統合を提供すると考えられている。
多孔性支持膜は、多くの材料によって形成され得る。材料の特定の選択は、サポート膜がＴＦＣ層を十分にサポートし、動作条件での分解に耐えることができる、つまり膜の両側の圧力および／または化学環境に耐えることができる限り、必須ではない。多孔性支持膜の材料の具体例としては、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンポリマーが挙げられる。支持は対称的であっても非対称的であってもよい。多孔性支持膜が非対称である場合、ＴＦＣ層は、スキン層面上に適切に形成される。
多孔質支持膜は、いくつかの実施形態では、織物または不織の機械的支持体によってさらに支持されて、機械的構造を増加させ、動作中の破損のリスクを低減し得る。
多孔質支持膜は、フラットシート膜、管状膜、または中空繊維膜などの、当技術分野で既知の任意の物理的外観であってよい。本発明の特定の態様において、より高い充填密度を提供するので、すなわち、活性膜面積が特定の容量に対してより高いので、中空繊維膜が好ましい。膜は、当技術分野で知られているように、一緒にグループ化するか、モジュールに組み立てることができる。したがって、複数のフラットシート膜をプレートおよびフレーム膜（プレートアンドフレーム膜）構成に組み立てることができる。プレートアンドフレーム膜システムは、プレート状の構造の上に置かれた膜を利用し、それは、順に、フレーム状のサポートによって一緒に保持される。
フラットシート膜は、らせん状に巻かれたフィルターモジュールに組み込むこともできる。フラットシート膜に加えて、らせん状に巻かれた膜モジュールには、フィードスペーサーと、透過液チューブと呼ばれる中空のチューブに巻き付けられた透過液スペーサーが含まれている。らせん状の巻き要素はクロスフローテクノロジーを利用しており、その構造により、さまざまな長さ、直径、および膜材料でさまざまな構成で簡単に作成できる。らせん状に巻かれたフィルターモジュールは、最初に膜を配置し、次に膜を内側に向けて半分に折り畳むことによって製造されてもよい。次に、供給スペーサーが折り畳まれた膜の間に置かれ、膜サンドイッチを形成する。供給スペーサーの目的は、膜表面間で水が流れるためのスペースを提供して、膜リーフ間の均一な流れを可能にすることである。次に、透過液スペーサーを透過液チューブに取り付け、先に調製した膜サンドイッチを接着剤を使用して透過液スペーサーに取り付ける。次の透過液層を置き、接着剤で密封し、必要な透過液スペーサーがすべて膜に取り付けられるまで、プロセス全体を繰り返す。完成した膜レイヤーは、チューブの周りに巻き付けられ、らせん形状を作る。
管状膜モジュールは、多孔性の壁を持つチューブのような構造である。管状モジュールは接線方向のクロスフローで機能し、一般に、高溶解固形分、高浮遊固形分、油、グリース、脂肪を含むものなどの困難な供給ストリームの処理に使用される。管状モジュールは最低２つのチューブ（；膜チューブと呼ばれるインナーチューブと、シェルであるアウターチューブ）で構成される。供給ストリームは膜チューブの長さを横切り、ろ過されて外殻に移されるが、濃縮液は膜チューブの反対側の端に集まる。
中空糸膜はモジュールに組み立てられてもよい。したがって、本発明は、ハウジング中に中空繊維の束を組み立てることによって中空繊維モジュールを製造する工程を提供し、そこでは、第１の溶液を通すための入口が、一端で中空繊維の管腔に接続され、出口が、他端で当該管腔に接続されており、ハウジングに接続された出口に第２の溶液を通過させるために、入口がハウジングに設けられている。
本発明に従って製造された膜モジュールは、正浸透構成および逆浸透構成を含む様々な構成で使用することができる。
本発明は、内部カーゴを含む小胞にも関し、帯電した小胞は、環境のｐＨ変化時に内部カーゴを放出することができる。ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンの混合物を含む小胞は、アルカリ性ｐＨ値で、例えばｐＨ８又はｐＨ７以下又はそれ以上の値で、安定している。しかしながら、小胞の外部の環境が酸価、例えばｐＨ７以下またはｐＨ６以下のｐＨ値に変化すると、小胞形成は解離する。小胞のｐＨ選択的挙動は、アルカリｐＨ値で小胞にカーゴを組み込み、小胞をカーゴとともに所望の場所に輸送し、そして、小胞を酸性条件にさらすことによりカーゴを解放する、という機会を提供し、それは、小胞を解離させる。
カーゴデリバリー用の小胞は、小胞取り込み膜貫通タンパク質について上で説明したのと同じ構成と調製方法を持っている。調製方法に起因して、小胞は非常にアルカリ性のｐＨ値、すなわちｐＨ７からｐＨ１４までのｐＨで、３０から９０℃の温度である。最初のテストでは、小胞が室温で少なくとも１年間、何の変化もなく安定していることが示されている。
さらに、小胞は中性または塩基性のｐＨで再集合し、追加の精製工程を必要とせずに、必要なときに内部カーゴを簡単に組み込むことができる。
カーゴ物質を含む小胞は、生物活性部分を含む様々なカーゴ物質のインサイチュまたはインビボ送達のためのキャリアシステムとして使用され得る。カーゴ物質は、例えば、低分子薬物、生体分子、生体高分子および細胞からなる群から選択される生物活性物質などの生物活性物質であり得る。生物活性物質は、非生物活性担体上に支持されていてもよい。カーゴ物質は、ポリマーまたは無機粒子であり得る。本発明に従ってカーゴ物質として利用され得る物質の例示的な例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：小分子薬物、生体分子、生体高分子（多糖類、グリコサミノグリカン、およびタンパク質を含むが、これらに限定されない）、細胞（生細胞を含む）、治療薬（すなわち、ヒトなどの動物に測定可能な生理学的応答を引き起こす薬剤）、発蛍光団、発色剤、酵素、タンパク質（免疫調節タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼを含む）、抗生物質、麻酔薬、抗体、成長因子、ホルモン、抗炎症薬、鎮痛剤、心臓薬、向精神薬、充填剤（例、無機および／またはポリマー粒子）、免疫療法、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、標識（例、フルオロフォア、放射性ヌクレオチド、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子、染料）などおよびそれらの組み合わせ。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞であって、小胞形成材料が、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を含む、前記の小胞。
［２］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、約１，０００Ｄａから約１５，０００Ｄａの間の平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１］に記載の小胞。
［３］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）が、約２，５００Ｄａから約１０，０００Ｄａの間の重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１］または［２］に記載の小胞。
［４］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、下記の化学式を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の小胞：
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す。
［５］
ｘは１５～２５の整数を示す、
ｙは６０～８０の整数を示す、
ｚは１５～２５の整数を示す、
［４］に記載の小胞。
［６］
ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、［１］から［５］のいずれかに記載の小胞：
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～ら５０の整数である、
Ｒ＝ＣＨ ３ である
［７］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比が、５対１である、［１］～［６］のいずれかに記載の小胞。
［８］
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、［１］から［７］のいずれかに記載の小胞。
［９］
膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、［１］～［８］のいずれかに記載の小胞。
［１０］
洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［９］のいずれかに記載の小胞。
［１１］
膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法であって、下記の工程：
ａ．膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
ｂ．水溶液として、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）を、工程ａで調製された混合物に添加すること、
ｃ．工程ｂで得られた溶液を攪拌すること、
を含む、前記の方法。
［１２］
７～９の範囲のｐＨを有する緩衝液の添加をさらに含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
工程ｃにおける撹拌が１２～１６時間継続される、［１１］または［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、約１，０００Ｄａから約１５，０００Ｄａの平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、約２，５００Ｄａから約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、下記の化学式を有する、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法：
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す。
［１７］
ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、［１１］～［１６］のいずれかに記載の方法：
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～５０の整数である、
Ｒ＝ＣＨ ３ である。
［１８］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比率が、５対１である、［１１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、［１１］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、［１１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］
前記洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１１］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
［１］～［１０］のいずれかに記載の小胞を含む分離膜。
［２３］
分離膜が、小胞を組み込んだ活性層および多孔質支持膜を含む、［２２］に記載の分離膜。
［２４］
活性層が、多孔質基質膜上に形成された薄膜複合層に組み込まれた小胞を含む、［２２］または［２３］のいずれかに記載の分離膜。
［２５］
小胞を組み込んだ活性層が、交互積層法により形成される、［２２］に記載の分離膜。
［２６］
多孔質基質膜上に膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を固定化した薄膜複合層を調製する方法であって、下記の工程：
ａ．［１１］～［２１］のいずれかに従って調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
ｂ．工程ａの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
ｃ．ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
ｄ．当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること、
を含む、前記の方法。
［２７］
ジアミン化合物が１，３－ジアミノベンゼンである、［２６］に記載の方法。
［２８］
ジアミンまたはトリアミン化合物とハロゲン化アシル化合物との重量比が、重量で０：１～３０：１である、［２６］または［２７］に記載の方法。
［２９］
前記多孔性支持膜が、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンポリマーによって形成される、［２６］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］
多孔性支持膜が中空繊維である、［２６］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］
ハウジング内に中空繊維の束を組み立てることにより中空繊維モジュールを製造する更なる工程を含み、第１の溶液を通すための入口が、一端で中空繊維の内腔に接続され、出口が、他端で当該内腔に接続され、そして、入口は、ハウジングに接続された出口に第２の溶液を通過させるためにハウジング内に設けられる、［３０］に記載の方法。
［３２］
多孔質支持膜が平坦なシートである、［２６］から［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］
平シート膜を巻き付けることによって、らせん巻き膜モジュールを製造する更なる工程を含む、［２６］から［３２］のいずれかに記載の方法。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞であって、小胞形成材料が、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を含む、前記の小胞。
［２］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、約１，０００Ｄａから約１５，０００Ｄａの間の平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１］に記載の小胞。
［３］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）が、約２，５００Ｄａから約１０，０００Ｄａの間の重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１］または［２］に記載の小胞。
［４］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、下記の化学式を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の小胞：
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す。
［５］
ｘは１５～２５の整数を示す、
ｙは６０～８０の整数を示す、
ｚは１５～２５の整数を示す、
［４］に記載の小胞。
［６］
ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、［１］から［５］のいずれかに記載の小胞：
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～ら５０の整数である、
Ｒ＝ＣＨ ３ である
［７］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比が、５対１である、［１］～［６］のいずれかに記載の小胞。
［８］
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、［１］から［７］のいずれかに記載の小胞。
［９］
膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、［１］～［８］のいずれかに記載の小胞。
［１０］
洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［９］のいずれかに記載の小胞。
［１１］
膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法であって、下記の工程：
ａ．膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
ｂ．水溶液として、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ－（エチレングリコール）を、工程ａで調製された混合物に添加すること、
ｃ．工程ｂで得られた溶液を攪拌すること、
を含む、前記の方法。
［１２］
７～９の範囲のｐＨを有する緩衝液の添加をさらに含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
工程ｃにおける撹拌が１２～１６時間継続される、［１１］または［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、約１，０００Ｄａから約１５，０００Ｄａの平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、約２，５００Ｄａから約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、［１１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、下記の化学式を有する、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法：
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す。
［１７］
ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、［１１］～［１６］のいずれかに記載の方法：
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～５０の整数である、
Ｒ＝ＣＨ ３ である。
［１８］
ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比率が、５対１である、［１１］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、［１１］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、［１１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］
前記洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１１］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
［１］～［１０］のいずれかに記載の小胞を含む分離膜。
［２３］
分離膜が、小胞を組み込んだ活性層および多孔質支持膜を含む、［２２］に記載の分離膜。
［２４］
活性層が、多孔質基質膜上に形成された薄膜複合層に組み込まれた小胞を含む、［２２］または［２３］のいずれかに記載の分離膜。
［２５］
小胞を組み込んだ活性層が、交互積層法により形成される、［２２］に記載の分離膜。
［２６］
多孔質基質膜上に膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を固定化した薄膜複合層を調製する方法であって、下記の工程：
ａ．［１１］～［２１］のいずれかに従って調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
ｂ．工程ａの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
ｃ．ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
ｄ．当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること、
を含む、前記の方法。
［２７］
ジアミン化合物が１，３－ジアミノベンゼンである、［２６］に記載の方法。
［２８］
ジアミンまたはトリアミン化合物とハロゲン化アシル化合物との重量比が、重量で０：１～３０：１である、［２６］または［２７］に記載の方法。
［２９］
前記多孔性支持膜が、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンポリマーによって形成される、［２６］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］
多孔性支持膜が中空繊維である、［２６］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］
ハウジング内に中空繊維の束を組み立てることにより中空繊維モジュールを製造する更なる工程を含み、第１の溶液を通すための入口が、一端で中空繊維の内腔に接続され、出口が、他端で当該内腔に接続され、そして、入口は、ハウジングに接続された出口に第２の溶液を通過させるためにハウジング内に設けられる、［３０］に記載の方法。
［３２］
多孔質支持膜が平坦なシートである、［２６］から［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］
平シート膜を巻き付けることによって、らせん巻き膜モジュールを製造する更なる工程を含む、［２６］から［３２］のいずれかに記載の方法。
発明の詳細な説明
概して、本発明は、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を使用して、アクアポリン水チャネルなどの膜貫通タンパク質を持つ自己組織化小胞を形成することに関する。次いで、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞は、例えば、水分子が膜を通過することを可能にするために、膜貫通タンパク質が組み込まれているかまたは固定化されている分離膜の製造に使用され得る。例えば、膜貫通タンパク質を含む分離膜の製造のために、小胞は、ジアミンまたはトリアミンなどの芳香族アミンを含む水性液体組成物に添加されてもよい。例えば、多孔性支持構造の表面に１，３－ジアミノベンゼン（ＭＰＤ）を適用し、有機溶媒中の酸塩化物の溶液と接触させると、界面重合反応に参加して、アクティブまたは選択的な薄膜複合体を前記支持体上に形成し、このようにして分離膜を形成し、そこでは前記小胞は固定化または組み込まれている。
概して、本発明は、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を使用して、アクアポリン水チャネルなどの膜貫通タンパク質を持つ自己組織化小胞を形成することに関する。次いで、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞は、例えば、水分子が膜を通過することを可能にするために、膜貫通タンパク質が組み込まれているかまたは固定化されている分離膜の製造に使用され得る。例えば、膜貫通タンパク質を含む分離膜の製造のために、小胞は、ジアミンまたはトリアミンなどの芳香族アミンを含む水性液体組成物に添加されてもよい。例えば、多孔性支持構造の表面に１，３－ジアミノベンゼン（ＭＰＤ）を適用し、有機溶媒中の酸塩化物の溶液と接触させると、界面重合反応に参加して、アクティブまたは選択的な薄膜複合体を前記支持体上に形成し、このようにして分離膜を形成し、そこでは前記小胞は固定化または組み込まれている。
特定の理論に拘束されるつもりはないが、表面に自由に利用可能なＮＨ２反応性基を含む小胞は、物理的に組み込まれるか（吸着）固定されるだけでなく、ＴＦＣ層に化学的に結合されると考えられている。なぜなら、ＮＨ２反応性基は、塩化トリメソイル（ＴＭＣ）などの塩化アシルとの界面重合反応に参加するためである。このようにして、小胞はＴＦＣ層で共有結合されると考えられている。さらに、反応性成分の適切な調整により、高い小胞負荷を得ることができ、したがって膜の特定の領域を通るより高い流束が得られると考えられている。さらに、ＴＦＣ層における小胞の共有結合は、選択的膜層に組み込まれた場合、膜貫通タンパク質を含む小胞のより高い安定性および／または寿命をもたらすと考えられている。
さらに、前記膜貫通タンパク質がイオンチャネルまたはアクアポリンなどを含み、前記膜貫通タンパク質を含む前記小胞が前記活性層または選択層に固定化または組み込まれている場合、多様な選択性及び輸送特性を有する新規な分離膜または濾過膜を製造することが可能になる。例えば前記膜貫通タンパク質がイオンチャネルである場合はイオン交換膜を、または前記膜貫通タンパク質がアクアポリンである場合は水濾過膜を、製造することが可能になる。膜貫通タンパク質は、分解から保護されていることができる自己組織化ナノ構造に複合化された場合、その生物学的に活性な折りたたみ構造を維持するために、敏感な両親媒性タンパク質でも十分に安定し、したがって、実験室および工業規模で分離膜に加工されたときに、それらの望ましい機能を維持する。
本発明の分離膜は、ナノ濾過プロセスまたは逆浸透プロセスで分離膜を通して水溶液を濾過するなど、純水濾液を調製するための工業的または家庭用の設定で有用である。本明細書における目的のために、用語「分離膜」は、薄い架橋芳香族ポリアミド層またはフィルムまたは交互に帯電した高分子電解質（ＬＢＬ）の層などの片側に選択層が形成された多孔性支持膜を含む非対称膜などの、水濾過および水分離用の選択的透過膜および半透膜を含む。反対側は、典型的にはポリエステル繊維で作られた織物層または不織層またはメッシュによって補強することができる。
さらに、本発明の分離膜は、生成物溶液の濃縮方法において有用であり、前記方法は、フィルターハウジングまたはモジュールに取り付けられた本発明の分離膜を利用して、例えば正浸透によって生成物溶液から水を抽出することを含む。
本発明の一態様では、本発明の小胞製剤を含む選択層で修飾された中空繊維膜（中空糸膜）の束を有する中空繊維（ＨＦ）モジュールを含む。好ましくは、選択層は、界面重合反応により繊維の内面に形成された薄膜複合（ＴＦＣ）層を含み、ここで、前記ＴＦＣ層は、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物から構成される小胞に組み込まれたアクアポリン水チャネルを含む。
本発明の分離膜は、圧力遅延浸透を使用して塩分力を生成する方法においてさらに有用であり得、前記方法は、静水圧を増加させるために前記分離膜を利用すること、及び、塩分力の源として静水圧の増加を使用すること、を含む。ＷＯ２００７／０３３６７５およびＷＯ２０１４１２８２９３（Ａ１）を参照。
本明細書で使用される「アクアポリン水チャネル」という用語は、アクアポリンＺ（ＡｑｐＺ）、ＧｌＰｆ、ＳｏＰＩＰ２；１、アクアポリン１および／またはアクアポリン２などの機能的な天然または合成のアクアポリンまたはアクアグリセロポリン水チャネルを含む。アクアポリン水チャネルは、細菌アクアポリン及び真核生物アクアポリン、例えば、酵母アクアポリン、植物アクアポリン、哺乳類アクアポリン、およびアクアグリセロポリンなどの関連チャネルタンパク質を含む。アクアポリンおよびアクアグリセロポリンの例には、以下が含まれる：ＡｑｐＺなどの原核生物のアクアポリン；Ａｑｐ１やＡｑｐ２などの哺乳類のアクアポリン；植物のアクアポリン、例えば、血漿内在性タンパク質（ＰＩＰ）、液胞膜内因性タンパク質（ＴＩＰ）、ノジュリン内因性タンパク質（ＮＩＰ）、小さな内因性タンパク質（ＳＩＰ）、例えば、ＳｏＰＩＰ２；１、ＰｔｔＰＩＰ２；５およびＰｔＰＩＰ２；２；ＡＱＹ１やＡＱＹ２などの酵母アクアポリン；ＧｌｐＦやＹｆｌ０５４などのアクアグリセロポリン。アクアポリン水チャネルタンパク質は、本明細書に記載されている方法に従って、または、Karlsson et al. (FEBS Letters 537: 68-72, 2003)またはJensen et al. US 2012/0080377 A1（例６を参照）に記載されているように調製することができる。
本明細書で使用される「分離膜」という用語は、水および場合によりアニオンおよびカチオンを含む特定の小さなサイズの溶質を、他の溶質、粒子、コロイドおよび高分子から、分離するのに有用な膜を含む。分離膜の例は、ナノろ過（ＮＦ）膜、正浸透（ＦＯ）膜、逆浸透（ＲＯ）膜などの「ろ過膜」である。ろ過膜の１つのタイプは、「薄膜複合」（またはＴＦＣ）膜で、ナノろ過および逆浸透膜に分類されることがよくある。フラットシートＴＦＣ膜は、通常、不織布または織布の支持体の上にポリエーテルスルホンまたはポリスルホン多孔質層の上にポリアミド層を堆積させることによって作成される。ポリアミド拒絶層は、アミンの水溶液と有機溶媒中の酸塩化物の溶液との界面重合によって形成される。ＴＦＣ膜は、ＷＯ２０１３／０４３１１８(Nanyang Technological University & Aquaporin A/S)に記載されているように製造できる。他のタイプの濾過膜は、Gribova et al. (Chem. Mater., 24: 854-869, 2012) and Wang et al. (Membranes, 5(3): 369-384, 2015)に記載されているような、レイヤーバイレイヤー（ＬｂＬ）堆積法によって形成されるものである。例えば、本発明の小胞は、Gribova et al.の図４に概説されているように、高分子電解質多層（ＰＥＭ）フィルム中に埋め込まれるかまたは組み込まれてもよい。
本明細書で使用される「薄膜複合」または（ＴＦＣ）膜は、下記のものを使用して調製することができる：アミン反応物、好ましくはジアミンまたはトリアミンなどの芳香族アミン、例えば、水溶液中の１，３－ジアミノベンゼン（ｍ－フェニレンジアミン、＞９９％、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入したもの）、および二酸または三酸塩化物などのハロゲン化アシル反応物、好ましくは芳香族ハロゲン化アシル、例えば、有機溶媒に溶解したベンゼン－１，３，５－トリカルボニルクロリド（ＣＡＳ Ｎｏ． ８４２７０－８４－８、トリメソイルクロリド（ＴＭＣ）、９８％、例えばＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した場合）。そこでは、前記反応物は界面縮合重合反応で結合する。cf. Khorshidi et al. (2016) Scientific Reports 6, Article number: 22069、および米国特許番号：４，２７７，３４４を参照。これは、ポリエーテルスルホン膜などの支持膜の表面で、多孔性膜サポート（支持）にラミネートされたポリアミドを含む複合膜の形成を詳細に説明している。ベンゼン－１，３，５－トリカルボニルクロリド（トリメソイルクロリド）は、ヘキサン（＞９９．９％、Fisher Chemicals）、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなどを含むＣ６－Ｃ１２炭化水素（直鎖または分岐炭化水素）などの溶媒または他の低芳香族炭化水素溶媒（例えばイソアルカンを主成分とする低臭気流体を生成するために、触媒の存在下で水素で処理された石油ベースの原料から生成されるＩｓｏｐａｒＴＭＧ流体）に溶解する。ＩｓｏｐａｒＴＭＧ液体：化学名：炭化水素、Ｃ１０－Ｃ１２、イソアルカン、＜２％芳香族；ＣＡＳ番号：６４７４２－４８－９、化学名：ナフサ（石油）、水素化処理重質（ExxonMobil Chemical製）。反応物１，３－ジアミノベンゼンの代替物にはヘキサメチレンジアミンなどのジアミンが含まれ、反応物ベンゼン－１，３，５－トリカルボノイルクロリドの代替物には、当技術分野で知られているアジポイルクロリド、シアヌル酸などが含まれる。
本発明の小胞は、両親媒性物質、すなわちポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテル－アミンの混合物の親水性および疎水性相互作用によって小胞が形成されるプロセスを説明するために、「自己集合」と呼ばれることがある。
本明細書で使用される「流体力学的直径」は、測定される粒子と同じ方法で拡散する仮想の剛体球のサイズとして定義される動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される水性媒体中のナノ粒子の流体力学的サイズを表す。
正浸透（ＦＯ）または直接浸透は、選択的で透過性の膜を使用して、溶解した溶質から水を分離する浸透プロセスである。この分離の推進力は、本明細書ではドロー（吸引）と呼ばれる高濃度の溶液と、供給（フィード）と呼ばれる低濃度の溶液と、の間の浸透圧勾配である。浸透圧勾配により、膜を通過してドロー中に正味の水の流れが生じ、効果的に供給が濃縮される。ドロー溶液は、単一または複数の単純な塩で構成されることができるか、又は、正浸透アプリケーション用に特別に調整された物質であることができる。供給溶液は、飲料、廃棄物流れ、または海水などの希薄な生成物流れであり得る。IFOA, http://forwardosmosis.biz/education/what-is-forward-osmosis/を参照。
したがって、ＦＯの用途のほとんどは、次の３つの広範なカテゴリに分類される：製品の濃縮、廃棄物の濃縮、または濃縮プロセスの副産物としてのきれいな水の生産である。本明細書で使用される「ＰＡＦＯ」という用語は、圧力支援正浸透プロセスを表す。本明細書で使用される場合の「ＰＲＯ」という用語は、浸透力の発生に有用な圧力遅延浸透を表す。本発明の膜は、すべてのタイプの正浸透プロセスにおいて有用であり、各正浸透タイプに特に適合させることができる。
本明細書で使用される「逆浸透」（ＲＯ）という用語は、選択的透過性膜に加えられた給水圧力が浸透圧を克服するために使用される場合を指す。逆浸透は、通常、バクテリアを含む給水から多くのタイプの溶解および懸濁物質を除去し、工業プロセスと飲料水の生産の両方で使用される。ＲＯプロセス中、溶質は膜の加圧側に保持され、純粋な溶媒である透過液は反対側に移動する。選択性は、大きな分子やイオンを膜がその細孔（穴）を通過させず、溶液の小さな成分（溶媒分子など）が自由に通過できることを、特定する。低圧逆浸透（ＬＰＲＯ）膜は、通常、約５ｂａｒ未満から最大約２５ｂａｒまでの供給水圧で、１５特定フラックスＬＭＨ／ｂａｒで動作する。ＬＰＲＯは、より低い供給圧力範囲で実行される。例えば、２～５ｂａｒは、超低圧逆浸透と呼ばれることもある。当技術分野で知られているＬＰＲＯ膜は、約４５℃の給水温度、２～１１の範囲の給水ｐＨ、およびｐＨ１～１２の範囲の化学洗浄の典型的な動作限界を持っている。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明される。
例
例１
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３トリブロックコポリマー（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）Ｍｎ５８００Ｄａ）および公称２０００分子量のＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５（ポリエーテルアミン）からの小胞の調製、および前記小胞を用いた水膜の調製。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３トリブロックコポリマー（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）Ｍｎ５８００Ｄａ）および公称２０００分子量のＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５（ポリエーテルアミン）からの小胞の調製、および前記小胞を用いた水膜の調製。
材料：
分子量５８００ＤａのＰＥＧ２０－ＰＰＯ７０－ＰＥＧ２０の組成を持つＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３トリブロックコポリマー（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール））は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用された。
分子量５８００ＤａのＰＥＧ２０－ＰＰＯ７０－ＰＥＧ２０の組成を持つＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３トリブロックコポリマー（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール））は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用された。
Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５は、ポリエチレンオキシドポリプロピレンオキシドの比率が２９から６、分子量が２０００Ｄａのポリエーテルアミンであり、Ｈｕｎｔｓｍａｎから購入し、受け取ったままの状態で使用した。
リン酸緩衝液１０ｍＭ（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＫＣｌ）は、８００ｍＬのＭｉｌｉＱ精製Ｈ２Ｏに８ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４４ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．２４ｇ ＫＨ２ＰＯ４を溶解し、ＨＣＬを使用してｐＨを７．２に調整し、容積を１Ｌに完成することによって、調製された。
アクアポリンＺ ５ｍｇ／ｍＬストック溶液は、以下に開示されているように調製した。機能的アクアポリンＺは、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌培養において、タバコエッチウイルス切断部位を持つＨｉｓタグ付きタンパク質として過剰生産された。融合タンパク質は２６４アミノ酸と２７２３４Ｄａの分子量を持っている。大腸菌ＤＨ５からのゲノムＤＮＡは、ＡｑｐＺ遺伝子を増幅するためのソースとして使用された。ＡｑｐＺ遺伝子は、タバコエッチウイルス切断部位（ＴＥＶ）；ＡｑｐＺのＮ末端にあるＥＮＬＹＦＱＳＮを追加した遺伝子特異的プライマーを使用して増幅された。増幅されたＡｑｐＺを酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、その後、同様に消化した６－Ｈｉｓタグ付き発現ｐＥＴ２８ｂベクターＤＮＡにライゲーションした。陽性クローンはＰＣＲスクリーニングにより確認された。次に、構築物の真正性をＤＮＡ配列決定により確認した。
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をタンパク質の発現に使用した。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むルリア培養液培養物を３７℃で１３～１６時間インキュベートし、新鮮なＬＢ培養液に１００倍に希釈し、約１．２～１．５（ＯＤは６００ｎｍ）の密度まで増殖させた。組換えタンパク質の発現は、遠心分離前に１ｍＭ ＩＰＴＧを３５℃で３時間添加することにより誘導された。採取した細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌリゾチーム、５０単位のベンソナーゼおよび３％ｎ－オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシドの存在下で、氷冷結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ β－メルカプトエタノール、１０％グリセロール）中に再懸濁した。試料を１２，０００Ｐａのマイクロフルイダイザーで５回の溶解サイクルに供した。４０，０００×ｇで３０分の遠心分離により不溶性物質をペレット化した。上清をＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速フローカラム（Amersham Pharmacia）に通し、フロースルーを１０収集した。フロースルーフラクションにＮａＣｌを３００ｍＭまで追加してから、事前に平衡化したＮｉ－ＮＴＡカラム上にロードした。カラムを１００カラム容量の洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ β－メルカプトエタノール、１０％グリセロール）で洗浄して、非特異的に結合した物質を除去した。Ｎｉ－ＮＴＡアガロース結合材料は、５ベッド容量の溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ β－メルカプトエタノール、１０％１５グリセロール、３０ｍＭ ｎ－オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシドを含む）で溶出された。ＡｑｐＺを陰イオン交換クロマトグラフィー；ｍｏｎｏＱカラム（GE healthcare）でさらに精製した。サンプル混合物を希釈および濃縮して、アミコン濃縮器で塩とイミダゾールの濃度を約１０ｍＭにし、ＭｏｎｏＱカラムにロードする前に膜を１０，０００Ｄａカットオフした。陰イオン交換クロマトグラフィー中に使用したバッファーは、（Ａ）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＯＧ、１０％グリセロール、および（Ｂ）２０ｍＭ ２０Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＯＧ、１０％グリセロールであった。イオン交換カラムからのＡｑｐＺを含む溶出ピーク画分をプールした。精製したＡｑｐＺ抽出物は－８０℃で凍結保存した。
精製の前日、ＡＱＰ抽出物（－８０℃の冷凍庫で保存）を氷上または４℃の冷蔵庫で解凍した。バッファーとｄｄＨ２Ｏの一部は４℃で準備した。ＡＱＰ抽出物を氷浴上の適切な冷却ビーカー内で磁気スティックで攪拌して、沈殿物を溶解した。１．５容量の事前に冷却したＬＤＡＯフリーのＡＱＰ結合バッファーを１容量の可溶化抽出物中に徐々に加え（抽出チューブとろ過カップを洗浄するためにさらに０．５容量のバッファーを使用）、よく混合し、滅菌０．４５μＭ真空フィルターカップでろ過した。過剰な発泡を避けるために真空をフィルターカップに適用し、濾液を氷上に置いて２時間以内に使用した。
Ｈｉｓｔｒａｐカラムを滅菌水で平衡化した後、ＲＴでＡＱＰ結合バッファーを平衡化した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎ（１ｍＬプレパックカラムの場合）または２．５ｍｌ／ｍｉｎ（５ｍｌプレパックカラムとセルフパックカラムの場合）に設定した。ＡＫＴＡプログラムを使用して、３倍に希釈した抽出物（氷水浴上）をＨｉｓｔｒａｐカラム上にロードした。流速は１ｍｌ／ｍｉｎ（１ｍＬプレパックドカラムの場合）または２．５ｍｌ／ｍｉｎ（５ｍＬプレパックドカラムとセルフパックドカラムの場合）に設定した。ローディングボリュームは、３０ｍｌ／ｍｌレジン未満であった。氷水浴での抽出液フロースルーを収集し、さらに使用するために４℃で保存した。カラムを１０ＣＶ（カラム容量）の氷冷ＡＱＰ結合バッファーで洗浄した。流速は、２．５ｍｌ／ｍｉｎ（５ｍｌプレパックドカラムおよびセルフパックドカラムの場合）、または１ｍｌプレパックドカラムの場合は１ｍｌ／ｍｉｎに設定した。ＡＱＰタンパク質を、ＡＫＴＡプログラムを使用して、２．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で氷冷ＡＱＰ溶出バッファー（１０カラム容量）で溶出した。分画容量を１０ｍｌに設定し、０．５～１ＣＶ後に１５ｍｌ ＰＰチューブで収集を開始した。
溶出したフラクションに蓋をして、氷または４℃で保存した。ＡＱＰの純度とコンフォメーションは、それぞれ変性とネイティブＰＡＧＥ分析によって調べた。タンパク質濃度はナノドロップで測定した。抽出物フロースルーは、適切な品質のＡＱＰ組成物を生成するために、必要に応じて２回および３回処理されてもよい。
ＡＱＰ品質分析に合格したら、２％ＬＤＡＯを含む氷冷イミダゾールを含まないＡＱＰ結合バッファーを添加して、タンパク質濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整した。最後に、ＡＱＰを０．４５μＭの滅菌済みカップでろ過して滅菌し、１か月以内に使用するために冷蔵庫で４℃で保管するか、フリーザーで－８０℃で保管した。
調製方法：
１．ポリマーをＰＢＳに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにすることによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３の新鮮な溶液を調製する。
２．フラスコ中に１５ｍｇ／ｍｌのＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５の重量を量る。
３．アクアポリンＺストック溶液を、最終濃度が１／２００のＡＱＰＺ／ポリマーモルタンパク質比になるように追加する。ここで、ポリマーはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３とＪｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ－２００５の合計量である。
４．工程１で調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５とＡｑｕａｐｏｒｉｎ Ｚの混合物に追加して、９．９ｍｇにする。
５．室温で、毎分１７０回転で混合物を一晩攪拌する（２０時間以下）。
６．翌朝、手順１～５の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
１．ポリマーをＰＢＳに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにすることによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３の新鮮な溶液を調製する。
２．フラスコ中に１５ｍｇ／ｍｌのＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５の重量を量る。
３．アクアポリンＺストック溶液を、最終濃度が１／２００のＡＱＰＺ／ポリマーモルタンパク質比になるように追加する。ここで、ポリマーはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３とＪｅｆｆａｍｉｎｅ Ｍ－２００５の合計量である。
４．工程１で調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５とＡｑｕａｐｏｒｉｎ Ｚの混合物に追加して、９．９ｍｇにする。
５．室温で、毎分１７０回転で混合物を一晩攪拌する（２０時間以下）。
６．翌朝、手順１～５の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
小胞製剤は、ＤＬＳ、ゼータ電位、および０．５Ｍ ＮａＣｌでのストップトフロー測定により、サイズ、透水性、ゼータ電位の観点からテストされた。結果は、５つの異なるバッチに対して５回測定される。
５ｍｌの小胞製剤を３０℃～１００℃の範囲のさまざまな温度で１０分間ウォームアップすることにより、温度安定性と熱挙動をテストし、それらのサイズと透水性をＤＬＳおよびストップトフロー測定によってさらに決定した。
熱処理は配合の安定性に大きな影響を与えず、室温での約２００ｎｍから約１８００ｎｍまでの大きなサイズの構造の直径収縮をもたらす。透水性の観点から、１００℃まで変化は観察されない。１７００から１６８７ｓ－１のＫｉ値が記録された。
ｐＨの挙動は、１から７まで変化するｐＨでの小胞製剤の分解を示し、直径が最大２０ｎｍのミセルになり、基本的なｐＨ値で再構築する（９から１３までは同じサイズの１８０ｎｍを示し、Ｋｉ値は約１７００ｓ－１を示す）。
例２
ＢＷＲＯ（汽水逆浸透）膜の調製
ＢＷＲＯ（汽水逆浸透）膜の調製
これらの膜は、以下に概説する手順に従って作成された。
ａ）ＭＰＤをＭｉｌｌｉＱ水中に溶解して、２．５％（Ｗ／Ｗ）濃度にする。以下を参照。
ｂ）ＴＭＣをアイソパー中に溶解し、最終濃度を０．１５％Ｗ／Ｖにする。
ｃ）長方形の膜（例えば、ＭＰＤ溶液の約２０ｍｌ／ｍ２の膜を備えた５．５ｃｍ×１１ｃｍのメンブラナ１ＦＰＨ ＰＥＳ膜）をカバーして、穏やかに攪拌しながら３０秒間放置する。
ｄ）ラボの乾燥紙（キムワイプなど）で非アクティブな面（裏面）を５～１０秒間乾燥させる。
ｅ）膜をガラスプレート上に置き、表面が光沢から薄暗くなるまでＮ２で穏やかに乾燥させる。
ｆ）膜の端の周りにテープを貼る（≒１ｍｍ）。
ｇ）テープが貼られた膜の付いたガラスプレートをガラスまたは金属製の容器中に入れ、約１５５ｍｌ／ｍ２の膜ＴＭＣ－Ｉｓｏｐａｒを片方の端に加え、３０秒間穏やかに前後に揺り動かす。
ｈ）リザーバーからガラスプレートを取り外し、Ｎ２で１０～１５秒間乾燥させる。
ａ）ＭＰＤをＭｉｌｌｉＱ水中に溶解して、２．５％（Ｗ／Ｗ）濃度にする。以下を参照。
ｂ）ＴＭＣをアイソパー中に溶解し、最終濃度を０．１５％Ｗ／Ｖにする。
ｃ）長方形の膜（例えば、ＭＰＤ溶液の約２０ｍｌ／ｍ２の膜を備えた５．５ｃｍ×１１ｃｍのメンブラナ１ＦＰＨ ＰＥＳ膜）をカバーして、穏やかに攪拌しながら３０秒間放置する。
ｄ）ラボの乾燥紙（キムワイプなど）で非アクティブな面（裏面）を５～１０秒間乾燥させる。
ｅ）膜をガラスプレート上に置き、表面が光沢から薄暗くなるまでＮ２で穏やかに乾燥させる。
ｆ）膜の端の周りにテープを貼る（≒１ｍｍ）。
ｇ）テープが貼られた膜の付いたガラスプレートをガラスまたは金属製の容器中に入れ、約１５５ｍｌ／ｍ２の膜ＴＭＣ－Ｉｓｏｐａｒを片方の端に加え、３０秒間穏やかに前後に揺り動かす。
ｈ）リザーバーからガラスプレートを取り外し、Ｎ２で１０～１５秒間乾燥させる。
テープを取り除いた後、新しく形成されたアクティブな面を上にして膜をＭｉｌｌｉＱに移し、必要に応じて後続の工程での処理中に湿らせておく。
ＭＰＤ溶液の計算：
１．０５ ｇのＭＰＤを量り取り、３５ｍｌのＭｉｌｌｉＱに溶解する。例１で説明したように調製した７ｍｌの液体ＡＱＰＺ組成物を追加する。不活性ガス（ＡｒまたはＮ２）をできるだけ多く入れて溶液を保つ。
１．０５ ｇのＭＰＤを量り取り、３５ｍｌのＭｉｌｌｉＱに溶解する。例１で説明したように調製した７ｍｌの液体ＡＱＰＺ組成物を追加する。不活性ガス（ＡｒまたはＮ２）をできるだけ多く入れて溶液を保つ。
次に、５．５ｃｍ×１１ｃｍサイズの液体ＡＱＰＺ配合のＴＦＣ膜を、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ ＣＦ０４２ ＦＯセル（www.sterlitech.com）に取り付け、そして、脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ）をフィードとして使用して１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を吸引および供給として使用して２６８ｍｌ／ｍｉｎの吸引速度を使用するＦＯモードで、６０分のテスト（５膜）と９００分のテスト（４膜）の持続時間にかけた。
結果を表４に示す。
例３
手作りＴＦＣ ＦＯ（正浸透）ろ過膜の調製
手作りＴＦＣ ＦＯ（正浸透）ろ過膜の調製
膜は、以下に概説する手順に従って作成した。
ａ）サポート膜を提供する。例えば、指のような構造のＰＥＳ不織布、サイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍ。
ｂ）３ｗｔ％ＭＰＤを、３ｗｔ％ ε－カプロラクタム、０．５ｗｔ％ＮＭＰ、９３．５ｗｔ％ＤＩ水と混合して溶液を得る。
ｃ）懸濁液を得るために、０．１ｍｇ／ｍｌの実施例１の液体ＡＱＰＺ製剤を加える。
ｄ）ｃ）の懸濁液を２時間インキュベートする。
ｅ）０．０９ｗｔ％ＴＭＣ、０．９ｗｔ％アセトン、９９．０１ｗｔ％Ｉｓｏｐａｒから、ＴＭＣ溶液を調製。
ｆ）懸濁液ｄ）中にサポート膜（支持膜）を３０秒間ディップコートする。
Ｇ）エアナイフで乾燥させる。
ｈ）界面重合のためにｅ）からのＴＭＣ溶液を追加する。
ｉ）ドラフト内で２分間乾燥する。
３枚の膜を作成し、Sterlitech CF042 ROセル（www.sterlitech.com）に取り付けた。６０分間フィードとして５００ｐｐｍ ＮａＣｌを使用して５ｂａｒで操作した。
ａ）サポート膜を提供する。例えば、指のような構造のＰＥＳ不織布、サイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍ。
ｂ）３ｗｔ％ＭＰＤを、３ｗｔ％ ε－カプロラクタム、０．５ｗｔ％ＮＭＰ、９３．５ｗｔ％ＤＩ水と混合して溶液を得る。
ｃ）懸濁液を得るために、０．１ｍｇ／ｍｌの実施例１の液体ＡＱＰＺ製剤を加える。
ｄ）ｃ）の懸濁液を２時間インキュベートする。
ｅ）０．０９ｗｔ％ＴＭＣ、０．９ｗｔ％アセトン、９９．０１ｗｔ％Ｉｓｏｐａｒから、ＴＭＣ溶液を調製。
ｆ）懸濁液ｄ）中にサポート膜（支持膜）を３０秒間ディップコートする。
Ｇ）エアナイフで乾燥させる。
ｈ）界面重合のためにｅ）からのＴＭＣ溶液を追加する。
ｉ）ドラフト内で２分間乾燥する。
３枚の膜を作成し、Sterlitech CF042 ROセル（www.sterlitech.com）に取り付けた。６０分間フィードとして５００ｐｐｍ ＮａＣｌを使用して５ｂａｒで操作した。
結果を表５に示す。
実施例４
ＦＯ（正浸透）膜の調製
ＦＯ（正浸透）膜の調製
ＡｑｐＺを組み込んだ小胞は、最初に膜貫通タンパク質の水溶液（上記で調製したアクアポリンＺストック溶液）をポリエーテルアミン（１５ｍｇ／ｍｌＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５）と混合して、最終濃度が１／２００ ＡＱＰＺ／ポリマーモルタンパク質比になるように調製した。続いて、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ水溶液（ＰＢＳ中に分子量５８００Ｄａを有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３を最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまで添加）を加え、当該混合物を室温で毎分１７０回転で一晩攪拌する。
このように調製された小胞は、多孔性支持体上での界面重合により、ポリアミド薄膜複合（ＴＦＣ）膜に組み込まれた。小胞混合物（上記で調製した混合物６ｍｌ）およびｍ－フェニレンジアミン溶液（１．５ｇのＭＰＤを５２．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱに溶解することにより調製した）を含む水溶液を調製した。当該有機溶液は、０．１５％Ｗ／Ｖの濃度の塩化トリメソイル（ＴＭＣ）とＩｓｏｐａｒＴＭＥで構成された。
上記で詳述したように、コーティングプロトコールは、多孔質支持体を水溶液に浸し、続いてその過剰を穏やかに除去することを含んでいた。続いて、有機溶液を塗布し、ポリアミド層を形成し、過剰の有機溶液を穏やかに乾燥させた。膜はテスト前にミリＱ水中に保存した。
小胞の特性：Ｋｉ１４１２ｓ－１、ｐＨ９．８３、ゼータ電位－０．３３９（平均）、サイズ：２０４ｎｍ（平均）、個体１００％。押し出された小胞の寸法（流体力学的直径）は、ZetaSizer NanoZs from Malvernを使用した動的光散乱によって決定された。ＡＱＰチャネルを通る水流束は、Bio-Logic SFM 300ストップトフローデバイスを使用して、５１７ｎｍのモノクロメーターと５３０ｎｍのカットオフフィルターを使用してテストされた。個々のストップトフローテストでは、０．１３ｍｌの押し出しポリマーソームまたはＡＱＰ挿入ポリマーソームを０．１３ｍｌのＮａＣｌ ０．５Ｍとすばやく混合し、小胞からの水の流出を引き起こして小胞の収縮を引き起こした。速度論的データに二重指数方程式を当てはめ、高分子膜を通る水流束に直接比例する速度定数（ｓ－１）を求めた。
テストは、１Ｍの塩をドローソリューション（溶液）として、５μＭのカルセインをフィードとして使用して、正浸透セットアップで行った。膜の活性面が供給溶液に面するように、ドローおよび供給溶液を向流でポンプで送った。結果を下の表６に示す。
ＡｑｐＺタンパク質を組み込んだアミノ修飾小胞を含む膜は、小胞のない膜と比較してパフォーマンスが向上した。カルセインの拒絶反応（Ｒ）は同等のレベル（Ｒ＞９９％）を維持しながら、膜を通過する平均水流束（Ｊｖ）は８４％改善された（Ｊｖ＝１１．１７±１．６１Ｌｍ－２ｈ－１対Ｊｖ＝４．８５±１．０２Ｌｍ－２ｈ－１）。小胞を組み込んだ場合、逆塩フラックスは平均５０％増加した（Ｊｓ＝１．２３±０．２５ｇｍ－２ｈ－１対Ｊｓ＝０．８２±０．７４ｇｍ－２ｈ－１）にもかかわらず、特定の塩フラックスＪｓ／Ｊｖによる全体的なパフォーマンスは同等のレベルのままであった（小胞のない膜の０．１５±０．１０と比較して、小胞のある膜の０．１４±０．０２）。
データは、アクアポリンタンパク質を組み込んだアミノ装飾小胞が、ＡｑｐＺタンパク質をポリアミド膜中に組み込む効率的な方法であり、特定の塩フラックスを損なうことなく、水のフラックスを改善することを示している。特定の理論に縛られるつもりはないが、反応性アミン基の存在が理由で、表面にアミン基を含む小胞が物理的に組み込まれるだけでなく、さらに、ＴＦＣ膜のポリアミド層に化学的に結合することが、説明できる。これらのアミン基は、塩化アシルとの界面重合反応に参加して、層に共有結合している小胞を得る。共有結合により、小胞の配合が高くなり、膜を通過する水の流束が増える可能性が広がる。
例５
真空媒介コーティング
多孔性支持体を、活性層が上を向くように吸引セルに取り付け、真空ポンプをその下に適用し、不活性層に面した。ＴＦＣ層に使用される支持体は、Membrana GmbHのMicroPES 1F PH微多孔質支持体である。ＭＰＤおよび製剤１０－２－１０を含むＲＯ水溶液５０ｍｌを吸引セルに注いで、多孔質支持体を覆った。その後、１００ミリバールの吸引力を５分間適用し、ＭＰＤおよび製剤を支持体上に吸引した。真空を止め、ＴＭＣおよびＩｓｏｐａｒ－Ｅを含む５０ｍｌの有機溶液を適用し、界面重合を促進するために１分の反応時間を与えた。次に有機溶液を洗い流し、膜を３分間放置して乾燥させ、ＱＣテストの準備ができるまでＲＯ水を入れたペトリ皿に移した。
真空媒介コーティング
多孔性支持体を、活性層が上を向くように吸引セルに取り付け、真空ポンプをその下に適用し、不活性層に面した。ＴＦＣ層に使用される支持体は、Membrana GmbHのMicroPES 1F PH微多孔質支持体である。ＭＰＤおよび製剤１０－２－１０を含むＲＯ水溶液５０ｍｌを吸引セルに注いで、多孔質支持体を覆った。その後、１００ミリバールの吸引力を５分間適用し、ＭＰＤおよび製剤を支持体上に吸引した。真空を止め、ＴＭＣおよびＩｓｏｐａｒ－Ｅを含む５０ｍｌの有機溶液を適用し、界面重合を促進するために１分の反応時間を与えた。次に有機溶液を洗い流し、膜を３分間放置して乾燥させ、ＱＣテストの準備ができるまでＲＯ水を入れたペトリ皿に移した。
製剤１０－２－１０：１０ｍｇ／ｍｌプルロニックｆ１２７（ポロキサマー４０７）－２ｍｇ／ｍｌジェファミンＭ２００５－１０ｍｇ／ｍｌアクアポリンストック溶液。ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）中で。
水フラックスとカルセイン拒絶は対照クーポンと実質的に異ならなかったが、塩フラックスは、製剤なしのＴＦＣ層でコーティングされた対照とは対照的に、製剤を含む溶液でコーティングされたクーポンで有意に低かった。これは、製剤の存在が塩フラックスを減少させた（したがって塩拒絶を増加させた）ことを示している。学生の対応のないｔ検定では、対照膜の塩フラックスと製剤を比較すると強い傾向が見られ、ｐ値は０．０５３１９１（２％）から０．０５３３８６（１０％）の範囲であった。コーティングに使用される水溶液中の製剤のパーセントごとの濃度の増加は、塩除去（塩拒絶）のレベルに影響を与えるとは思われなかった。
実施例６
膜貫通タンパク質を組み込んだアミノ装飾小胞
膜貫通タンパク質を組み込んだアミノ装飾小胞
アクアポリンＺを組み込んだ小胞の調製方法：
１．ポリマーをＰＢＳに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにすることによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３の新鮮な溶液を調製する。
２．フラスコ中で重量１５ｍｇ／ｍｌ Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５を量る。
３．アクアポリンＺストック溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５ボトルに追加して、最終濃度が１／２００ ＡＱＰＺ／Ｐ－１２３－Ｊｅｆｆａｍｉｎｅモルタンパク質比になるようにする。
４．工程１で調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５とＡｑｕａｐｏｒｉｎ Ｚの混合物に追加して、９．９ｍｇ／ｍｌにする。
５．室温で、毎分１７０回転（２０時間以下）で混合物を一晩攪拌する。
６．翌朝、手順１～５の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
１．ポリマーをＰＢＳに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにすることによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３の新鮮な溶液を調製する。
２．フラスコ中で重量１５ｍｇ／ｍｌ Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５を量る。
３．アクアポリンＺストック溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５ボトルに追加して、最終濃度が１／２００ ＡＱＰＺ／Ｐ－１２３－Ｊｅｆｆａｍｉｎｅモルタンパク質比になるようにする。
４．工程１で調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５とＡｑｕａｐｏｒｉｎ Ｚの混合物に追加して、９．９ｍｇ／ｍｌにする。
５．室温で、毎分１７０回転（２０時間以下）で混合物を一晩攪拌する。
６．翌朝、手順１～５の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
アクアポリンＺを含まないコントロール（対照）小胞の調製方法：
１．ポリマーをＰＢＳに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにすることによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３の新鮮な溶液を調製する。
２．フラスコ中で重量１５ｍｇ／ｍｌ Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５を量る。
４．工程１で調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５の混合物に追加して、９．９ｍｇ／ｍｌにする。
５．室温で、毎分１７０回転（２０時間以下）で混合物を一晩攪拌する。
６．翌朝、手順１～５の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
１．ポリマーをＰＢＳに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにすることによって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３の新鮮な溶液を調製する。
２．フラスコ中で重量１５ｍｇ／ｍｌ Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５を量る。
４．工程１で調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ－１２３溶液をＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍ－２００５の混合物に追加して、９．９ｍｇ／ｍｌにする。
５．室温で、毎分１７０回転（２０時間以下）で混合物を一晩攪拌する。
６．翌朝、手順１～５の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
小胞製剤は、サイズ、透水性およびゼータ電位の観点について、ＤＬＳ、ゼータ電位、および０．５Ｍ ＮａＣｌでのストップトフロー測定の両方についてテストされた。
小胞の特徴付け：
小胞の寸法（流体力学的直径）は、ZetaSizer Nano ZS from Malvernを使用した動的光散乱によって決定される。小胞膜を通過する水の流束は、Bio-Logic SFM 300ストップトフロー（ＳＦ）デバイスを使用して、５１７ｎｍのモノクロメーターと５３０ｎｍのカットオフフィルターを使用してテストされる。個々のＳＦテストでは、０．１３ｍｌのポリマーソームまたはＡｑｐＺを埋め込んでいるポリマーソームのサンプルを、０．１３ｍｌのＮａＣｌ０．５Ｍとすばやく混合すると、小胞からの水の流出が起こり、小胞の収縮が起こった。
小胞の寸法（流体力学的直径）は、ZetaSizer Nano ZS from Malvernを使用した動的光散乱によって決定される。小胞膜を通過する水の流束は、Bio-Logic SFM 300ストップトフロー（ＳＦ）デバイスを使用して、５１７ｎｍのモノクロメーターと５３０ｎｍのカットオフフィルターを使用してテストされる。個々のＳＦテストでは、０．１３ｍｌのポリマーソームまたはＡｑｐＺを埋め込んでいるポリマーソームのサンプルを、０．１３ｍｌのＮａＣｌ０．５Ｍとすばやく混合すると、小胞からの水の流出が起こり、小胞の収縮が起こった。
表８に、アクアポリンＺを組み込んだ小胞とブランクの小胞の、ストップトフロー光散乱結果の指数関数的成長に基づいて計算された浸透係数ｋｉを示す。指数関数的成長の分析は、最も急速な収縮を示す構造の最初の個体で行われる。浸透係数ｋｉ（ｓ－１）は、高分子膜を通過する水流束に直接比例し、小胞内のアクアポリンの存在が高分子膜を通過する水流束を大幅に増加させることが結果で示されている。小胞の他の特性は、アクアポリンＺの存在によって実質的に影響を受けない。つまり、流体力学的直径、ゼータ電位、およびｐＨは同じレベルのままである。
実施例７
アクアポリンＺを再構成する小胞を組み込んだＴＦＣ ＦＯ膜の調製方法：
ａ）サポート膜を提供する。例えば、指のような構造のＰＥＳ不織布、サイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍ。
ｂ）ＭｉｌｉＱ水中のＭＰＤ溶液を調製し、２．５％（Ｗ／Ｗ）濃度を得る。アクアポリンを膜に組み込む場合は、小胞の溶液を追加する。ＭＰＤ溶液の最終濃度は、１０ｇ／Ｌから１００ｇ／Ｌの小胞溶液を含むことができる。
ｃ）Ｉｓｏｐａｒ Ｅ中のＴＭＣ溶液を調製し、０．１５％（Ｗ／Ｖ）を得る。
ｄ）ＭＰＤ溶液中に長方形の膜を浸し、膜の表面を完全に覆う
ｅ）ＭＰＤ溶液から長方形の膜を移して、ラボの乾燥紙（Ｋｉｍ－Ｗｉｐｅなど）の非アクティブな面になる側を５～１０秒間乾燥させる。
ｆ）膜をガラスプレート上に置き、表面が光沢から薄暗くなるまでＮ２で穏やかに乾燥させる。
ｇ）膜の端の周りにテープを貼る（≒１ｍｍ）。
ｈ）テーピングされた膜のあるガラスプレートをガラスコンテナーに移し、ＴＭＣ溶液で膜を覆い、膜の表面を完全に覆う
ｉ）リザーバーからガラスプレートを取り外し、表面が光沢に変わり暗くなるまでＮ２で乾燥させる。
ｊ）膜をガラス板上に水平位置で約１０秒間置き、テープをはがする
ｋ）ＭｉｌｌｉＱを満たした最初の容器に５分間膜を移す
ｌ）次の工程で説明する事前のテストのために、膜を２番目にＭｉｌｌｉＱを満たした容器に移して保管する。
アクアポリンＺを再構成する小胞を組み込んだＴＦＣ ＦＯ膜の調製方法：
ａ）サポート膜を提供する。例えば、指のような構造のＰＥＳ不織布、サイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍ。
ｂ）ＭｉｌｉＱ水中のＭＰＤ溶液を調製し、２．５％（Ｗ／Ｗ）濃度を得る。アクアポリンを膜に組み込む場合は、小胞の溶液を追加する。ＭＰＤ溶液の最終濃度は、１０ｇ／Ｌから１００ｇ／Ｌの小胞溶液を含むことができる。
ｃ）Ｉｓｏｐａｒ Ｅ中のＴＭＣ溶液を調製し、０．１５％（Ｗ／Ｖ）を得る。
ｄ）ＭＰＤ溶液中に長方形の膜を浸し、膜の表面を完全に覆う
ｅ）ＭＰＤ溶液から長方形の膜を移して、ラボの乾燥紙（Ｋｉｍ－Ｗｉｐｅなど）の非アクティブな面になる側を５～１０秒間乾燥させる。
ｆ）膜をガラスプレート上に置き、表面が光沢から薄暗くなるまでＮ２で穏やかに乾燥させる。
ｇ）膜の端の周りにテープを貼る（≒１ｍｍ）。
ｈ）テーピングされた膜のあるガラスプレートをガラスコンテナーに移し、ＴＭＣ溶液で膜を覆い、膜の表面を完全に覆う
ｉ）リザーバーからガラスプレートを取り外し、表面が光沢に変わり暗くなるまでＮ２で乾燥させる。
ｊ）膜をガラス板上に水平位置で約１０秒間置き、テープをはがする
ｋ）ＭｉｌｌｉＱを満たした最初の容器に５分間膜を移す
ｌ）次の工程で説明する事前のテストのために、膜を２番目にＭｉｌｌｉＱを満たした容器に移して保管する。
ＴＦＣ ＦＯ膜のテスト
次に、サイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍのアクアポリンＺ配合のＴＦＣ ＦＯ膜を、Sterlitech CF042 FOセル（www.sterlitech.com）にマウントし、供給として脱イオン（ＭｉｌｌｉＱ）水中の５μＭのカルセインを使用して、ドローおよび供給として１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を使用して、５０ｍｌ／分のドロー速度を使用して、ＦＯモードで２００分間の試験を行った。
次に、サイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍのアクアポリンＺ配合のＴＦＣ ＦＯ膜を、Sterlitech CF042 FOセル（www.sterlitech.com）にマウントし、供給として脱イオン（ＭｉｌｌｉＱ）水中の５μＭのカルセインを使用して、ドローおよび供給として１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を使用して、５０ｍｌ／分のドロー速度を使用して、ＦＯモードで２００分間の試験を行った。
表９は、アクアポリンＺタンパク質を組み込んだ小胞を組み込んだ膜を用いたＦＯ実験の結果と、ブランクのもの（対照膜）との比較を示している。アクアポリンＺを組み込んだ小胞が組み込まれることによって、Ｊｖが増加し、Ｊｓ／Ｊｖは同じレベルのままであると結論付けることができる。
Claims (33)
- 分離膜の薄膜複合層に組み込むためのアクアポリン膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞であって、小胞形成材料が、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルアミンの混合物を含む、前記の小胞。
- ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、１，０００Ｄａから１５，０００Ｄａの間の平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項１に記載の小胞。
- ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、２，５００Ｄａから１０，０００Ｄａの間の重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項１または２に記載の小胞。
- ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、下記の化学式を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の小胞：
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す。 - ｘは１５～２５の整数を示す、
ｙは６０～８０の整数を示す、
ｚは１５～２５の整数を示す、
請求項４に記載の小胞。 - ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の小胞：
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～ら５０の整数である、
Ｒ＝ＣＨ３である - ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比が、５対１である、請求項１～６のいずれか一項に記載の小胞。
- 膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項１から７のいずれか一項に記載の小胞。
- 膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の小胞。
- 洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の小胞。
- 膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法であって、下記の工程：
ａ．アクアポリン膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
ｂ．水溶液として、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）を、工程ａで調製された混合物に添加すること、
ｃ．工程ｂで得られた溶液を攪拌すること、
ｄ．分離膜の多孔質支持体上に、工程ｃの溶液を塗布すること、
を含む、前記の方法。 - ７～９の範囲のｐＨを有する緩衝液の添加をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
- 工程ｃにおける撹拌が１２～１６時間継続される、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、１，０００Ｄａから１５，０００Ｄａの平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、２，５００Ｄａから１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）が、下記の化学式を有する、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法：
ｘは１０～３０の整数を示す、
ｙは５０～１００の整数を示す、
ｚは１０～３０の整数を示す。 - ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法：
ｍは１～１５の整数である、
ｎは５～５０の整数である、
Ｒ＝ＣＨ３である。 - ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とポリエーテルアミンとの間の重量比率が、５対１である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の小胞を含む分離膜。
- 分離膜が、小胞を組み込んだ活性層および多孔質支持膜を含む、請求項２２に記載の分離膜。
- 活性層が、多孔質基質膜上に形成された薄膜複合層に組み込まれた小胞を含む、請求項２２または２３のいずれか一項に記載の分離膜。
- 小胞を組み込んだ活性層が、交互積層法により形成される、請求項２２に記載の分離膜。
- 多孔質基質膜上に膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を固定化した薄膜複合層を調製する方法であって、下記の工程：
ａ．請求項１１～２１のいずれかに従って調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
ｂ．工程ａの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
ｃ．ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
ｄ．当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること、
を含む、前記の方法。 - ジアミン化合物が１，３－ジアミノベンゼンである、請求項２６に記載の方法。
- ジアミンまたはトリアミン化合物とハロゲン化アシル化合物との重量比が、重量で１：１～３０：１である、請求項２６または２７に記載の方法。
- 前記多孔性支持膜が、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンポリマーによって形成される、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
- 多孔性支持膜が中空繊維である、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
- ハウジング内に中空繊維の束を組み立てることにより中空繊維モジュールを製造する更なる工程を含み、第１の溶液を通すための入口が、一端で中空繊維の内腔に接続され、出口が、他端で当該内腔に接続され、そして、入口は、ハウジングに接続された出口に第２の溶液を通過させるためにハウジング内に設けられる、請求項３０に記載の方法。
- 多孔質支持膜が平坦なシートである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
- 平シート膜を巻き付けることによって、らせん巻き膜モジュールを製造する更なる工程を含む、請求項３２に記載の方法。
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