JP2014504209A - 水抽出に適した液膜 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図10
Description
a)ある量の本明細書に開示するアクアポリン含有−液膜マトリックスを濾過デバイスのフィルターチャンバーに入れ、このチャンバーは液膜マトリックスのものより低いかまたは等しい浸透圧を有する供給溶液として作用する第1水性液体と制御接続し、さらにマトリックスのものより高い浸透圧を有する抜取溶液(draw solution)として作用する第2水性液体と制御接続し、これにより第1液体と第2液体の間に浸透圧ポテンシャルを形成する;
b)浸透圧勾配が存在する限り、マトリックスにアクアポリン水チャネルを通して第1液体から純水を吸収させ、これにより純水フラックスを第2液体中へ仲介させる;
c)場合により、抽出した純水を第2液体から分離する。
a)ガラスバイアルまたはガラス分液ろうと内で、油/水 v/v比0.25が得られるように非イオン界面活性剤の約100mg/mLの水溶液と油成分とを混合し、界面活性剤−対−タンパク質のモル比1:50〜1:400が得られる量のアクアポリンタンパク質水溶液を添加し、その際、タンパク質は蛍光標識を保有することができる;
b)a)からの組み合わせた混合物を回転装置内において室温で一夜回転させてエマルジョンを得る;
c)b)からのエマルジョンを、液膜マトリックスを含むクリーム相または拡張した(extended)油−水−中間相を含む個別の液相に分離するのに十分な時間放置する;
d)エマルジョンのクリーム相のマトリックス試料を、濾過デバイスに注入するために、たとえば図4に示すように注射器で取り出す;そして
e)場合により、アクアポリンタンパク質が液膜マトリックスに適正に挿入されたことを立証するために、形成されたマトリックスの、使用した蛍光標識と適合する吸収スペクトルを求める。
i)本明細書に記載する超純水の調製は、患者血漿の含水率を回復するために現在必要なきわめて複雑な水精製システムの代替となることができる;
ii)透析液を調製する際に用いる正浸透プロセスに伴って、患者の血漿に由来する大量の水が同時に取り出され、これを本明細書に記載するいずれかの方法でアクアポリン液膜を用いて抽出することができる。
液−液抽出という用語は、液膜を用いる分離プロセスについて用いられる。本発明においては水が液膜内へ抽出されるので、これは液−水抽出である。
本発明のアクアポリン含有−液膜マトリックスの使用は、供給塩類溶液、たとえば海水からの脱塩により純水または淡水を調製する際に特に有利であり、その際、アクアポリン水チャネルの特異的な純水輸送およびクロリド拒絶の特性がユニークなプロセス条件を提供する。本発明の興味深い態様は、淡水調製のための正浸透プロセスにおけるアクアポリン液膜マトリックスの使用であり、その際、塩水が供給溶液であり、CO2/NH3を含有する水溶液が約58℃の加熱により溶存ガスを容易に除去できる利点をもつ抜取溶液である;参照:McGinnis and Elimelech, Desalination, 207 (2007) 370-382; およびQuirin Schiermeier, “Purification with a pinch of salt”, Nature, 452, 20 March 2008。
図1は、本発明の実験に用いる簡単な濾過デバイスの2部品の断面図および上面図を示す。
正浸透圧バッチセルユニットを通るフラックスの測定および拒絶率の計算に次式を使用できる:
Π=cRT[chapt 2.11, ‘Quantities, Units and Symbols in Physical Chemistry,’ INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY, 1993]
c:個別に移動する溶質のモル濃度
R:気体定数,0.08206L・atm・mol−1・K−1
T:絶対温度
理想から逸脱した溶質については、上記の式は下記のようになる:
Π=фcRT
ここで、фは浸透係数である。摂氏25度の0.15Mショ糖溶液について、ф=1,01[Sten-Knudsen, ‘Stoftransport, membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner’ Akademisk Forlag 1995]。фは特定溶液についての浸透圧測定から決定できる。
周囲温度摂氏22度摂氏の0.2Mソルビトール(D−ソルビトール)の浸透圧(バール):
Π=фcRT〜1・0,2mole・L−1・0.08206L・atm・mol−1・K−1・295K・1,01325bar・atm−1
=9.9bar
ここで、фは約1と仮定される。
完全にイオン化した強電解質を含有する抜取溶液および供給溶液の使用により、導電率κはここでは単純な濃度測定値として用いられる。抜取溶液の導電率の上昇は、抜取溶液体積中へ希釈された透過液体積Q(t)中の透過イオンの量を反映する(V0は初期の抜取溶液体積である):
精製Aqp−Zを下記の方法に従って得た。あるいは、たとえばMaria Karlsson et al. (FEBS Letters 537 (2003) 68-72)に記載された方法に従って得られるSoPIP2;1を使用できる。
BASFから入手できる非イオン界面活性剤PluronicF68
13mg/mLのアクアポリンZ(Aqp−Z)バッチ(あるいはSoPIP2;1)
PBS緩衝液(Sigma P5368):0.01Mリン酸緩衝化生理食塩液(NaCl 0.138M;KCl−0.0027M);pH7.4,25℃
Milli−Q水
油相成分,スクアレン
分液ろうと/ガラスバイアル
気密ガラス注射器
抜取/供給溶液(1M NaCl/Milli−Q水)
本明細書中の図1、4および5による原型クロスフローチャンバーアセンブリー
LabRoller(商標)回転器(Labnet International,Inc.)
下記の条件のmLサイズaqp−Z液膜マトリックスの調製:
非イオン界面活性剤:アクアポリンのモル比200を使用;油−対−水体積比0.25を使用;Aqp−Zバッチ10.6mg/mLを使用(合計2mg);油(または油相成分)は純スクアレン;および下記の工程を使用:
1. 4mLの4mL丸底ガラスバイアルまたはガラス分液ろうと(3mL)に下記のものを添加する:
i)PBSまたは他の適切な緩衝液中100mg/mLの非イオン界面活性剤溶液、室温
ii)タンパク質(189μLのAqpZ)を1527μLの非イオン界面活性剤に添加する、最後に
iii)572μLのスクアレン
2.ピペットチップ(1000μLのピペット)で穏やかに吸引/排出することにより試料を混和する;
3.場合により:バイアルに蓋をして閉じる前に窒素流により試料を穏やかにフラッシュする;
4.試料をLabRoller上、室温で一夜回転させる。回転させた後、試料を1時間放置した後に使用する;
5.エマルジョン−水の境界に近い350μLのエマルジョン‘クリーム’層の試料を、下記の追加工程を用いるクロスフローセル(図1、2、3を参照)内への注入のために、500μLの気密ガラス注射器(側口付きの26ゲージのブラントエンド注射針)で取り出す:
1.BLMキャビティ内の封入フィルターおよびガスケット(3個)を備えたクロスフローセルを組み立てる;
2.注射針を試料区画内へ挿入できるようにする;
3.試料を含む注射針を、射出口を試料区画の開放容積へ向けて挿入し、そしてセルを閉じる;
4.最高で約350μLの試料を徐々に注入する;
5.注射器を抜き出し、セルのねじを完全に閉める。
細菌性アクアポリンZ(AqpZ)を、大腸菌株BL21(DE3)培養において、タバコエッチウイルス(tobacco etch virus)切断部位を含むHisタグ付きタンパク質として過剰産生させた。この融合タンパク質は264個のアミノ酸および27,234DaのMwをもつ。大腸菌DH5α由来のゲノムDNAをAqpZ遺伝子増幅のための供給源として用いた。このAqpZ遺伝子を、遺伝子特異的プライマーを用い、タバコエッチウイルス切断部位(TEV);ENLYFQSNをAqpZのN末端に付加して増幅させた。増幅したAqpZを酵素NdeIおよびBamHIで消化し、次いで同様に消化した6−Hisタグ付き発現pET28bベクターDNAにライゲートさせた。陽性クローンをPCRスクリーニングにより検証した。次いで構築体の確実性をDNA配列決定により確認した。
本発明のBLM調製物は、濃度推進による液−液質量移動のために設計された中空モジュール、たとえばManuel Aguilar & Jose Luis Cortina “Solvent Extraction and Liquid Membranes”, CRC Press, 2008のセクション4.21に記載され、図4.1(b)(その内容を本明細書に援用する)に示された液体セル−エキストラフロー10×28コンタクターに適切に組み込むことができる。本発明の液膜エマルジョンを微孔質中空繊維膜に組み込み、供給溶液としての塩水および適切な濃度の抜取溶液を用いて、純水または脱塩水を塩水供給溶液から抽出することができる。
組み立てたユニットに、2枚のAlfa Laval精密濾過膜、Alfa Laval−FSM 0.15 PPを、濾過区画の液膜マトリックスの支持体として用いる。抜取溶液としては、0.8Mソルビトール(D−ソルビトール,85529 Sigma BioUltra)を使用できる。試料体積は挟まれた液膜マトリックス500μLである。リン酸緩衝化生理食塩(PBS)液、Sigma P−5368(0.138MのNaCl,0.0027MのKCl,0.01Mの一塩基性および二塩基性リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウム)を供給溶液として用いる。あるいは、MilliQ水/1M NaClの供給溶液/抜取溶液の組合わせを使用できる。
ホウレンソウアクアポリンSoPIP2;1タンパク質をProfessor Per KjellbomおよびUrban Johansson(The Department of Biochemistry, Lund University, スウェーデン)から入手し、Toernroth-Horsefield et al. 2006(Susanna Toernroth-Horsefield et al. 2006. Structural mechanism of plant aquaporin gating, vol 439, Nature, pp.688-694)に従って発現させ、精製した。
アクアポリン膜貫通タンパク質であるホウレンソウアクアポリンSoPIP2;1または大腸菌AqpZを、badan(商標)で標識した。badan(商標)誘導体化タンパク質の合成および取扱いは薄暗い光の下で実施された。この反応を実施するために、SoPIP2;1に対して10倍モル過剰のbadan(商標)をbadan(商標)の20mM原液(ジメチルホルムアミドに溶解)から10mg/mlのタンパク質溶液に。4℃で20時間、回転させながら反応を行なわせた。反応混合物を、SoPIP2;1についてはPBS、1%のOG、1%のグリセロール、pH7.4中へ、Aqp−Zについては20mMのTris、30mMのOG、pH8中へ、ポリアクリルアミドゲルEcono−Pac 10DG脱塩カラム(Bio−Rad)で脱塩した。得られた蛍光標識アクアポリン類を使用するまで4℃に保存した。badan(商標)標識したSoPIP2;1またはAqpZを、実施例1に従って調製した液膜マトリックス中へ、非イオン界面活性剤−対−タンパク質モル比1:200で再構成した。
Varian Cary Eclipse蛍光分光計(Varian Inc.,米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてλex(励起波長)380nmで蛍光分光測定を実施し、400〜700nmで発光を記録した。badan(商標)標識したアクアポリンSoPIP2;1およびAqpZの蛍光発光特性は、蛍光プローブbadan(商標)の局所環境の極性に対して感受性である。プローブ周囲の局所環境がより疎水性または親水性になれば、それぞれbadan(商標)の蛍光最大発光収率はブルーシフトまたはレッドシフトする。飽和量のSDSは、最大発光収率のレッドシフトを引き起こす。badan(商標)標識アクアポリンのシフトおよび非シフト蛍光強度ピークについての一般偏光(generalized polarization)(GP)値と比較して、発光スペクトル変化を定量することができる。GP値を下記により計算した:GP=Ib−Ig/Ib+Ig;ここで、IbおよびIgは、それぞれ発光スペクトルのブルー辺縁およびグリーン辺縁における強度に相当する。Varian Cary Eclipse蛍光分光計(Varian Inc.,米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてλex(励起波長)400nmで蛍光分光測定を実施し、425〜700nmで発光を記録した。IbおよびIgは、蛍光共焦点顕微鏡画像作成のために適用したバンドパスフィルター範囲に相当する発光スペクトルから計算された。
フゾバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)の主要な外膜タンパク質FomAはトリマー型タンパク質であり、他の腸内細菌の拡散(チャネル)ポリン類のものと類似する透過性を示す。各FomAモノマーは、拡散(チャネル)ポリン類に典型的な、16の逆平行ベータ鎖からなるベータ−バレルモチーフを示す。FomAポリン類は電圧依存性チャネルタンパク質として機能する。機能性脂質膜に取り込まれたFomAチャネルを含む液膜マトリックスは、前記の実施例1に従って調製できる。
腎臓は、脊椎動物および若干の無脊椎動物をも含めた多くの動物において重要な機能をもつ臓器である。それらの機能は血液から老廃物を除去することであり、したがって天然の血液フィルターである。尿を生成する際、腎臓は尿素およびアンモニアなどの老廃物を排出する;腎臓は水、グルコースおよびアミノ酸の再吸収にも関与する。毎日180Lの水が腎臓に入り、その水の体積のほとんど全部が再利用される(約0.5Lが排出される)。尿の塩類濃度は血液の4倍も高くなる可能性がある。水の再利用および尿中の塩類濃度上昇の理由は、腎臓の構造およびアクアポリンの機能に関係する。腎臓は高性能の正浸透システムとして機能する。腎臓において、細い上行脚、太い上行脚および遠位尿細管は高度に水不透過性であり、一方、他のセグメントは水透過性である。これは腎臓における塩類勾配を形成し、これが正常な腎機能に必要な浸透プロセスの推進力となる。
1.本明細書に記載する超純水の調製は、血液透析に現在用いられているきわめて複雑な水精製システムの代替となることができる;
2.患者の血漿に由来する多量の水が同時に除去される前記の正浸透プロセスに続いて、これを本明細書に記載するいずれかの方法でアクアポリン液膜を用いて抽出することができる。この目的のために、本発明の液膜を介して正常な腎機能を模倣した塩類勾配および向流を形成し、次いでこれが正浸透プロセスに必要な推進力を構成するであろう。これによって患者自身の血漿水の再利用が確保され、いかに精製されたとしても外部からの水中に存在する夾雑物によるリスクが除かれる。
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WO/1987/002380 “Production of Low-Ethanol Beverages by Membrane Extraction”, Publication Date: 23.04.1987, Inventor: MATSON, Stephen, L, Applicant: SEPRACOR, INC. [US/US]; 33 Locke Drive, Marlborough, MA 01752(US).
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Claims (26)
- 内側水相、外側油相、およびセル間境界層であって膜貫通タンパク質チャネルが取り込まれた非イオン界面活性剤を含む層を有するセル構造からなる、液膜マトリックス。
- 油相が、ステロール、スクアレン、スクアラン、アルファ−トコフェロール、ホパノイド類、イソプレン類であって、エステル化されたドリコール、グリセロール、ユビキノン、ホホバ油、軽油、アマニ油、ダイズ油、ラッカセイ油、リン脂質安定化スクアレン、またはダイズ油、リン脂質およびグリセロールのエマルジョン、ならびにアルカン類、たとえばデカン、ウンデカン、ドデカン;ならびにその混合物を含むものからなる群から選択される成分を含む、請求項1に記載の液膜マトリックス。
- 界面活性剤が、非イオン界面活性剤、たとえば親水基−疎水基−親水基(A−B−A)型ポロキサマーから選択される、請求項1または2に記載の液膜マトリックス。
- ポロキサマーが、(PEO)A−(PPO)B−(PEO)Aコポリマーであって、Aの範囲60〜85およびBの範囲25〜35を有し、好ましくはAが約76の平均値であり、Bが約30の平均値であるものから選択される、前記請求項のいずれか1項に記載の液膜マトリックス。
- 両親媒性脂質成分をさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載の液膜マトリックス。
- 脂質成分が、DOPC、DPhPC、DOPS、または天然脂質抽出物、たとえば大腸菌(E. coli)総脂質抽出物、またはダイズ混合リン脂質、またはその組合わせもしくは混合物から選択される、請求項5に記載の液膜。
- タンパク質チャネルがアクアポリンまたはアクアグリセロポリンの水チャネルである、前記請求項のいずれか1項に記載の液膜マトリックス。
- タンパク質チャネルが、約1:50から約1:400までの範囲のタンパク質−対−両親媒性界面活性剤モル比で存在する、前記請求項のいずれか1項に記載の液膜マトリックス。
- 膜貫通タンパク質が、ベータ−バレルポア、たとえばアルファ−ヘモリジンおよびOmpG、FomA、およびVDAC;ロドプシン類、たとえばバクテリオロドプシン、または膜貫通ペプチドポア、たとえばアラメチシン、バリノマイシン、およびグラミシジンA、ならびにその誘導体および合成の膜貫通ペプチド;イオンチャネル、またはイオン選択的イオノホアからなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の液膜マトリックス。
- おおよその最大直径が最高1000μmであるセルを有し、大部分のセルが好ましくは約20〜約50μmの範囲にある、前記請求項のいずれか1項に記載の液膜マトリックス。
- 下記の工程:
a)ある量の請求項7、8または10のいずれか1項に記載の液膜マトリックスをフィルターチャンバーに入れ、これは液膜マトリックスのものより低いかまたは等しい浸透圧を有する第1水性液体(供給溶液)と制御接続し、さらにマトリックスのものより高い浸透圧を有する第2水性液体(抜取溶液)と制御接続して、第1液体と第2液体の間に浸透圧ポテンシャルを形成する;
b)浸透圧勾配が存在する限り、マトリックスに第1液体から純水を吸収させ、純水フラックスを第2液体中へ仲介させる;
c)場合により、抽出した純水を第2液体から分離する;
を含む、水性液体から水を抽出する方法。 - 第1水性液体が、いずれかのタイプの天然水源、たとえば海水、河川水、湖水、汽水、雨水、アクアポリン水チャネルに対して有毒でない廃水、下記を含めた生物性流体:ワイン、果実および野菜のジュース、ミルク、全血、血漿、尿、唾液、汗、ホモジナイズした組織などからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 方法が、海水の脱塩に使用され、その際、塩水が供給溶液または第1水性液体であり、CO2/NH3を含有する水溶液が抜取溶液または第2水性液体である、請求項11または12に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の1以上の液膜マトリックスを含む、水性液状媒体から純水を抽出するための装置。
- 装置が、2モジュール型の中空繊維支持−液膜コンタクターモジュールまたは液−液セル膜コンタクターである、請求項14に記載の装置。
- 正浸透作用を用いて液状媒体から水を抽出するのに適した液膜マトリックスを調製する方法であって、非イオン界面活性剤の水溶液と緩衝化した水性アクアポリンタンパク質調製物および油とを混和し、続いて回転混合し、生成したエマルジョンを分離させ、生成する拡張した油/水−中間相を抜き出し、これが液膜マトリックスを構成することを含む方法。
- 下記の工程:
a)ガラスバイアルまたはガラス分液ろうと内で、油/水 v/v比0.25が得られるように非イオン界面活性剤の約100mg/mLの水溶液と油成分とを混合し、界面活性剤−対−タンパク質のモル比1:50〜1:400が得られる量の膜貫通タンパク質水溶液を添加し、その際、タンパク質は蛍光標識を保有することができる;
b)a)からの組み合わせた混合物を回転装置内において室温で一夜回転させてエマルジョンを得る;
c)b)からのエマルジョンを、液膜マトリックスを含むクリーム相または拡張した油−水−中間相を含む個別の液相に分離するのに十分な時間放置する、
d)エマルジョンのクリーム相のマトリックス試料を、濾過デバイスに注入するために注射器で取り出す;そして
e)場合により、膜貫通タンパク質が液膜マトリックスに適正に挿入されたことを立証するために、形成されたマトリックスの、使用した蛍光標識と適合する吸収スペクトルを求める;
を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の1以上の液膜マトリックスを調製する方法。 - 界面活性剤が、ABA型ポロキサマーおよびその両親媒性誘導体から選択されるブロックコポリマーである、請求項16または17に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質が、アクアポリン類、たとえばAqy1、SoPIP2;1およびAqpZ;ならびに膜貫通タンパク質、たとえばFomAから選択される、請求項17〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 標識が、ナフタレン誘導体、たとえば明細書中の表3に挙げるもの、またはその蛍光機能性誘導体である、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- ナフタレン誘導体が6−ブロモアセチル−2−ジメチルアミノナフタレンである、請求項20に記載の方法。
- 工程a)において、DOPCもしくはDPhPCもしくはDOPS、または天然脂質抽出物、たとえば大腸菌(E. coli)総脂質抽出物、またはダイズ混合リン脂質、またはその組合わせもしくは混合物から選択される両親媒性脂質を添加することをさらに含む、請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 正浸透作用により純水を抽出するための、請求項17および19〜22のいずれか1項に記載の方法に従って調製した液膜マトリックスの使用。
- 血液透析により失われた患者血漿から純水を再抽出するための、請求項17および19〜22のいずれか1項に記載の方法に従って調製した液膜マトリックスの使用。
- 実質的に平坦な多孔質フィルター材料が請求項1〜10のいずれか1項に記載の液膜マトリックスの層の両側の支持を提供し、これにより層を固定化した、閉鎖サンドイッチ構造を有する支持体付き液膜マトリックス。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のアクアポリン含有−液膜マトリックスの層を、限外濾過膜および精密濾過膜から選択されるフィルター材料の間に挟むことにより作製された、複合フィルター膜またはディスク。
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