JP2006512204A - 生体模倣膜 - Google Patents

Abstract

コポリマー・マトリックス内に生体膜タンパク質を組み込むことによって幅広い種類の機能を有する膜が形成される。本発明の１つの形態では、光から電気を生じる２種類の膜が複合膜に組み込まれている。別の形態では、水精製が可能となるように、輸送タンパク質が膜内に組み込まれている。

Description

発明の詳細な説明

本出願は、米国仮特許出願第６０／３９８７８４号（出願日：２００２年７月２９日）および仮特許出願第６０／４３８７８４号（出願日：２００３年１月９日）に基づくパリ条約上の優先権を主張する。当該出願に開示された内容は全て、この引用により、本明細書に含まれるものとする。

発明の背景
本発明は、生体膜および膜タンパク質の特性および機能を有する人工デバイスを形成する方法、ならびにかかるデバイスの構造に関する。

生体膜タンパク質は多くの種々の機能を有しており、特に、ポンプ、チャンネル、バルブ、エネルギー変換器、機械センサー、熱センサーおよび電気センサー等として生体膜タンパク質は機能する。このようなタンパク質はナノメートルのサイズであり、非常に効率の良いものであるので、人工デバイスに使用するのに非常に魅力的である。しかしながら、それらの天然脂質膜環境は、強度が低いという欠点があり、また、水性環境を必要とし、化学的または生物的に劣化しやすいという問題点があった。

発明の要旨
手短に言えば、本発明の１つの要旨において、天然の膜タンパク質または遺伝子操作された膜タンパク質がブロックコポリマー・マトリックス内に組み込まれており、流体間で化合物を選択的に透過および／または濾過する等の種々の固有の機能を有するように膜が形成されている。特定の性質を有するタンパク質が選択されることによって、静電気力、電磁気力および化学的な力で分子スケールの処理することにより特定の機能を有する膜を作ることができる。

本発明のブロックコポリマーは、必要に応じて次のような機能を有するように設計および形成することができる。例えば、所望の厚さの膜を形成する機能、所望の化学組成物から成る膜を形成する機能、高い強度を有する膜を形成する機能、予め形成されている膜の強度を随意に増加させる機能などである。このような膜の最も重要な特性の１つは、機能的な状態で天然の生体膜タンパク質を収納できることであり、得られる複合膜が丈夫で耐久性を有することである。なぜなら、生体膜タンパク質をかかるポリマー膜に挿入することによって、タンパク質の特性および機能を有するデバイスが得られるからである。膜タンパク質の上半分と下半分（底側半分）とを分ける膜であって、タンパク質が適当に配向される際にタンパク質の天然の機能を損なうことなくタンパク質を容易に挿入できる天然の脂質膜に似た膜を形成できるポリマーが適当である。このような条件を満たすポリマーとしては、親水性外側ブロックおよび疎水性内側ブロックの一般的な性質を有するトリブロックコポリマーが含まれる。

本発明の１つの要旨は、２種類の異なるタンパク質を含む複合膜の形成に関しており、協働して機能して光から電気を生じるデバイス（「バイオソーラーセル」）を形成する複合膜に関している。本発明の別の要旨として、水輸送タンパク質が、任意の水源を浄水（水精製）できるように利用されている。以下において、上述の要旨の説明を行う。

技術革新に伴うデバイスの小型化によって電子機器が小型化・軽量化・高効率化しているものの、それらのデバイスに対する電源はそれほど急速には進展していない。２１世紀の電源は、サイズおよび重量が減少しているにも関わらず増加するデバイス数に対してエネルギーを供給しなければならないという課題に直面している。更に、ナノテクノロジーおよびバイオテクノロジーを用いた未来の製品には、形状または機能の点で現在使用されているものとは似ても似つかぬ電力供給が必要とされるであろう。

新たに現れる種々の広範な用途に対して、より軽量でコンパクトな電源が早急に求められている。そのような電源は、電力密度を最大限にして、所定の電力を得るのに必要とされる重量を最小限にするので、現在の電池技術で達成し得る多くの目的を果たすことになるであろう。従来の燃料源では、燃料源がデバイスの近くになければならず、流動性を有する場合では移動しなければならないため、重量条件はシビアである。また、燃料の排出が考えられるので、燃料供給を補充しなければならない。このため、ユーザーの範囲および移動が制限されることになる。

現代の科学では、ナノバイオテクノロジーの開発で裏付けされた興味深い可能性が示されている。無駄な原子を含まない要素が用いられるデバイスを製造すると、最高のレベルの効率化および小型化がもたらされる。電源に関する最近の技術開発は期待されているものの、既存の技術に付加的な改良が行われているにすぎない。次世代のデバイスに理想的に適する電源には、その機能にナノバイオテクノロジーが用いられており、高レベルの性能となるように現世代のデバイスに電力を供給することが可能となるであろう。

最近になって、第１ナノテクノロジー・デバイスを開発するのに必要な技術および知識が利用されるようになってきており、生化学燃料ＡＴＰによってエネルギーが供されるナノメートル・スケールの有機／無機ハイブリッド・デバイスの技術および構成に関して報告がされている（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２９０巻、第１５５５頁〜第１５５８頁、２０００年（ソーオング・アール・ケイ（Ｓｏｏｎｇ，Ｒ．Ｋ．）、バチャンド・ジー・ディー（Ｂａｃｈａｎｄ，Ｇ．Ｄ．）、ネベス・エイチ・ピー（Ｎｅｖｅｓ，Ｈ．Ｐ．）、オルクホベツ・エー・ジー（Ｏｌｋｈｏｖｅｔｓ，Ａ．Ｇ．）、クライグヘッド・エイチ・ジー（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｈ．Ｇ．）、モンテマグノ・シー・ディー（Ｍｏｔｅｍａｇｎｏ，Ｃ．Ｄ．））。このようなデバイスに使用されるＡＴＰを発生させることや、このようなデバイスを他の機器に電力を供するように用いることは、マクロ・スケールとナノメートル・スケールとの間での電力移送や、異なる種類のエネルギーへの相互変換に関心が向けられている。

本発明の別の要旨では、電子／プロトンの輸送で電気的なエネルギーと化学的なエネルギーとの間の変換が可能となるように、種々の機能を有する他のタンパク質を用いることができ、そのようなタンパク質を機械バルブおよびセンサーとして機能させることができる。

本発明の好ましい態様では、バイオソーラーを動力源とした材料およびファブリック（ｆａｂｒｉｃ）を供するために膜が用いられている。バイオソーラーを動力源とした材料およびファブリックは、光エネルギーを電気エネルギーに変化して、その電気エネルギーを外部加重に送るようなバクテリオロドプシン（または細菌ロドプシン）およびシトクロムオキシダーゼ（またはシトクロム酸化酵素）という２つのエネルギー変換タンパク質が埋め込まれた生体適合性ポリマー膜を含む薄い構造から成っている。薄いポリマー膜（１μｍよりも薄いポリマー膜）が使用されており、電源で燃料を運ぶ必要がないため、重量が大きく軽減される。従って、ありふれた材料から成る生地およびその表面内に組み込むことができるシステムを開発することが可能であり、それによって、ソーラー・セルで達成できる以上の効率を有しつつエネルギー源の重量が効果的に減じられることになる（即ち、１ｋｇ／ｍ^２より少ない重量）。従って、バイオソーラーを動力源とした材料を用いることによって、光からエネルギーを得るハイブリッド有機／無機電源が形成されることになる。

本発明の方法は、光エネルギーを電気エネルギーに変換して、そのエネルギーを外部荷重に送るバクテリオロドプシンおよびシトクロムオキシダーゼという２種類のエネルギー変換タンパク質が埋設された生体適合性ポリマーから成る薄いファブリックの製造に関する。このようなタンパク質は、光エネルギーおよび電気エネルギーを電気化学エネルギーに変換するように、何百万年以上にも及ぶ自然淘汰（または自然選択）によって分離され最適化されたものである。そのようなタンパク質がデバイスに組み込まれると、制限なく有益な量の電力が生じることになる。そのようなデバイスは、十分に軽量で小型であり、厳しい環境および穏やかな環境で高い移動性が必要とされる用途に対しても耐久性を有している。

バクテリオロドプシンは、光を吸収した際に、細胞膜を通してプロトン（または陽子）を輸送させる細菌タンパク質である。シトクロムオキシダーゼは、高エネルギー電子を使用してプロトンを移送させる膜タンパク質である。これらのタンパク質が組み合わせて用いられることによって、光エネルギーが電気化学的プロトン勾配に変換され、その電気化学的なプロトン勾配が外部に仕事を行う起電力に変換される。デバイスは常套的なソーラーセル（または太陽電池）の生物学的なタイプであるので、電源（または電力供給）と共に「燃料」を用いずに済み、電力密度が相当に増加することになる。更に、太陽が出ている限りは又はデバイスが作動する限りは、かかるデバイスから理論的に取り出すことが可能な最大限のエネルギーに制限はない。最終的なデバイスの質量密度は１００ｇ／ｃｍ^２より小さいと見積もられるので、ソーラーセルで達成できる効率以上の効率を有しつつエネルギー源の重量を効率的に減らしている。このようなバイオソーラーセルの材料組成および寸法は、最終的に電源密度が大きくなり（２５０Ｗ／ｋｇより大きい電源密度）、エネルギー密度も大きいので（３時間では８００Ｗｈｒ／ｋｇ、３日では９５００Ｗｈｒ／ｋｇ、１０日では３２０００Ｗｈｒ／ｋｇとなるエネルギー密度）、体積および重量を事実上ほとんど占めることなく多くの機器に電力供給するには十分である。更に、バイオソーラーセルの作動に起因した音特性、熱特性および電子特性は極わずかな程度である。

本発明の電源と従来のソーラーセルとの間には重要な違いがある。なぜなら、本発明の電源は、量産されたタンパク質および通常のポリマーから形成されるので軽量で可撓性かつ耐久性に富んでおり、低コストな大量生産が可能となっているからである。このデバイスに関連する長さスケールとしては、パッケージングの厚さが１μｍよりも小さい。このような酵素が通常存在する膜は、５ｎｍ厚さを有している。バイオソーラーセルが積層したシートは、何れにせよ、すり減らされることになるから重量コストがかからないように生地および他の表面に組み込むことができる。ファブリック内に発電セルが適当にモジュール設計されることによって、電力源を有するファブリックが損害を被った場合でも機能を依然保持できることになる。電気エネルギーと生物化学エネルギーとを相互に変換する性能に起因して、生物化学燃料を電気へと変換することができ、電力を供給するバイオ・デバイスが形成される。電気形態、生物化学形態および光形態と任意の形態間でエネルギーが変換されることに起因して、入力エネルギーの種類によっては制限を受けないナノバイオ・デバイスを設計および製造することが可能となる。

本発明の上述の目的、特徴および利点、ならびに付加的な目的、特徴および利点は、添付の図面を参照することによって、以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明から理解されよう。

好ましい形態の説明
本発明の１つの形態において、バクテリオロドプシンとシトクロムオキシダーゼとが組み合わされることによって、微少形成された電極と接触した生体適合性ポリマー膜を得ることができる。バクテリオロドプシン、シトクロムオキシダーゼおよびそれらが脂質膜およびポリマー膜に組み込まれることを理解すると、提案されたデバイスの動作（または操作）をより良く理解することができる。バクテリオロドプシン、シトクロムオキシダーゼおよびそれらが脂質膜およびポリマー膜に組み込まれることは、広く研究されており、それらの合成および機能に関しては多数の文献が存在する。

バクテリオロドプシン（ＢＲ）は、最も広く研究されているイオン輸送タンパク質である。バクテリオロドプシン（図１の１０で示される）は、分子量２６ｋＤのプロトン輸送体であって、明るく光に照らされた塩水および湿地で成長するハロバクテリウム属サリナリウム（即ち、好塩性古細菌）の細胞膜内で見られるものである。ＢＲによってハロバクテリウム属サリナリウムは嫌気性環境でも生存することができる。つまり、呼吸プロセスに不十分な酸素量であっても、ＢＲがその代わりになる役割を果たす。図２に示すように、ＢＲ１２の細胞は、プロトン１４を細胞膜１６を通るように輸送させており、緑色光（λ＝５００〜６５０ｎｍ）の光子１８を吸収すると細胞から汲み出すようにプロトンを輸送させる。各々のＢＲ分子は、光学的に励起されるので種々の電子中間状態を経ることによってプロトンを輸送させている。ＢＲが元の初期状態に戻るのに要する時間の総計は、３ミリ秒のオーダーであり、エネルギー移送にとっては最も短い時間スケールとなっている。

プロトン１４が細胞１２から汲み出されるので、電荷およびｐＨの勾配（低Ｈ＋〜高Ｈ＋）が細胞膜１６に形成され、電気化学ポテンシャルが形成されることになる。このようなポテンシャルによって、ＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰアーゼ）に電力を供するエネルギーが生じることになる（２０で示される）。プロトン１４が膜を戻るように通って移送される際に、ＡＴＰシンターゼは電気化学エネルギーを使用して、アデノシン三リン酸フォスフォターゼ（ＡＴＰ）を図２の２２で生成することになる。ＡＴＰは一般的な生物燃料であり、生命に不可欠な細胞プロセスの大部分にエネルギーを供給する。このような天然の生体系は、脂質小胞内にＢＲとＡＴＰアーゼから成る系を構成することによって実験室において複製されてきた（イウ・ジェイ・バイオケム（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）第２３５巻、第７６９頁〜第７８８頁、１９９６年（ピタード・ビー（Ｐｉｔａｒｄ，Ｂ．）、リチャード・ピー（Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｐ．）、ドゥナーチ・エム（Ｄｕｎａｒｃｈ，Ｍ．）およびリガード・ジェイ（Ｒｉｇｕａｒｄ，Ｊ．））。文献によると、４０℃の温度でＢＲを作り、小胞境界で１．２５のｐＨ差となるように維持することが可能である。また、２０℃では、△ｐＨ＝２を得ることができる。プロトン勾配に起因してＢＲがフィードバック阻害されることによって、より高いｐＨ差は達成されない。更に、プロトン勾配は、ＡＴＰを発生させるのに用いられており、系内の酵素の性能を測定するのに用いられている。このような研究では、リポソーム膜内に負に帯電したリン脂質が添加されると、ＢＲとＡＴＰアーゼとの間のカップリング効率が増加することが示されている。

ＢＲは、デバイスに組み込むのに理想的な物質である。なぜなら、タンパク質が細胞膜内で２次元的な結晶として高い濃度で存在することができるからである。これは、レチナールタンパク質の中でも独特な性質である。このような形態は「紫膜」と呼ばれ、脂質２５％に対してタンパク質７％の質量比（タンパク質当たり１０より少ない脂質分子）を有している。このような紫膜の小径のサイズは、０．５μｍ以上であることが確認されている。このようなタンパク質凝集体は、高い濃度で安定に存在するので（また、自然に存在するので）、エネルギー収量が増加し、余剰分がデバイスに供給され、工学的には安全となる。更に、ハロバクテリウム属サリナリウムは、長時間、大きい光束の下、高い温度で操作することが可能であるので、ハロバクテリウム属サリナリウムを進化させることによってＢＲの機能が最適化される。

上記で引用したピタードらの研究では、小さい脂質膜（１５０ｎｍ）で相当に希釈されたＢＲが使用されており、ＡＴＰ生成速度がＢＲ／脂質質量比に反比例することが示されている。紫膜のＢＲ／脂質質量比のデータによると、ＢＲ１ｍｇ当たり１分間にＡＴＰが３２０ｎｍｏｌ生成することが推定される。ＡＴＰアーゼによってＡＤＰ（図２の２４で示す）からＡＴＰが合成され、無機リン酸塩（３５ｋＪ／ｍｏｌのエネルギーを有する）が増加することになる。紫膜および脂質のみの質量を考慮すると、光を動力源としたＡＴＰ合成系は、１４０Ｗ／ｋｇの密度で電力を供給する。ＡＴＰシンターゼがＢＲと同じぐらい迅速にプロトンを汲み出す場合、生じる電力は１８０〜２８０Ｗ／ｋｇにまで増えることになる。

ＢＲ、そのロバストネスおよび寿命に関する多くの知見により、ＢＲを能動的な光デバイスの光要素として用いる開発やコンピューターメモリー用途に用いる開発に多くの関心が集まっており、それについて多くの取り組みがなされている。紫膜は、光照射によって、活性を何年もの間有することが示されており、有機溶剤の存在下、０〜１２のｐＨ値で１８０℃までの温度のポリマー・マトリックス（十分に脱水されている場合）で安定に存在する（ブセボロドヴ・エヌ（Ｖｓｅｖｏｌｏｄｏｖ，Ｎ．）、１９９８年、バイオモレキュラー・エレクトロニクス（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）：アン・イントロダクション・ビア・フォトセンシティブ・プロテインズ（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉａ Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、第１２５頁、バァーカウサー（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）、ボストン）。科学協会および工学協会が注目する結果、ハロバクテリウム属サリナリウムの余剰に生産された菌株でＢＲの生成および単離を行うプロトコルが開発された（ローバー・ビー（Ｌｏｒｂｅｒ，Ｂ．）およびデルカス・エル・ジェイ（ＤｅＬｕｃａｓ，Ｌ．Ｊ．）、１９９０年、エフ・イー・ビー・エス・レット（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）２６１巻、第１４頁〜第１８頁））。抽出および精製の手法、ならびに紫膜を多量に処理およびハンドリングする手法は公知である（例えば、スチュアート・ジェイ・エイ（Ｓｔｕａｒｔ，Ｊ．Ａ．）；ボウト・ビー・ダブリュ（Ｖｏｕｇｈｔ，Ｂ．Ｗ．）；シュミド・イー・ジェイ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．Ｊ．）；グロス・アール・ビー（Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．Ｂ．）；タレント・ジェイ・アール（Ｔａｌｌｅｎｔ，Ｊ．Ｒ．）；ディウェイ・ティー・ジー（Ｄｅｗｅｙ，Ｔ．Ｇ．）；バージ・アール・アール（Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．Ｒ．）、近刊のアイ・イー・イー・イー・イー・エム・ビー・エス（ＩＥＥＥ ＥＭＢＳ））。非生物材料と組み合わせた実験では、ＢＲを、ポリ（ビニルアルコール）およびポリ（アクリルアミド）などの一般のポリマーに対して使用するのに適していることが示されている（バージ・アール（Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．）、ジレスピー・エヌ（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｎ．）、イザグイアレ・イー（Ｉｚａｇｕｉｒｒｅ，Ｅ．）、クスネトゾウ・エー（Ｋｕｓｎｅｔｚｏｗ，Ａ．）、ローウレンス・エー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ａ．）、シング・ディー（Ｓｉｎｇｈ，Ｄ．）、ソング・ダブリュ（Ｓｏｎｇ，Ｗ．）、シュミッド・イー（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．）、スチュアート・ジェイ（Ｓｔｕａｒｔ，Ｊ．）、シーサラマン・エス（Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ，Ｓ．）、ワイス・ケイ（Ｗｉｓｅ，Ｋ．）、１９９９年、ジェイ・フィズ・ケム・ビー１０３（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０３）、第１０７４６頁〜第１０７６６頁）。

第２酵素であるシトクロムオキシダーゼ（ＣＯＸ）は、電子およびプロトンの輸送タンパク質であり、呼吸を引き起こす４つの酵素のうちの最後の酵素である。図３Ａの３０は、ＣＯＸの主鎖のリボン構造から成る膜を示している。図３Ｂは、「孔」またはプロトン輸送チャンネルを領域３４として星印で図示した細胞質を示している。呼吸に際して、ＮＡＤＨ（最初はグルコースの酸化によって生じる）の高エネルギー電子がＯ_２に移送され、Ｏ_２が還元されるのでＨ_２Ｏが生じることになる。

ＣＯＸは、呼吸プロセスの前段階からシトクロムｃによって運ばれる電子を受容し、その電子を２つの内部のヘムグループ（鉄イオンおよび銅イオンを含む）に移動させる。ヘムグループは、シトクロムｃからの電子によって還元され、一方のヘムに結合するＯ_２分子へと電子が移動した後で脱酸素化されることになる。電子が加えられたＯ_２は、周りのプロトンとの水性反応に対してターゲットになり、その反応後にヘムから解放されることになる。これらの高エネルギー電子は輸送されるので、４６０ｍＶの電圧降下によって得られるエネルギーが、ミトコンドリアのスペースにプロトンを輸送するのに用いられる（ニコルス・ディー（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｄ．）、１９８２年、バイオエナジェティックス（Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）：アン・イントロダクション・トゥー・ザ・ケミオズモティック・セオリー（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｏｓｍｏｔｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ）第１２３頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン））。なお、１つのプロトンと輸送される１つの電子とが典型的な比になるように、プロトンがミトコンドリアのスペースに輸送される（リー・エイチ（Ｌｅｅ，Ｈ．）、ダス・ティー（Ｄａｓ Ｔ．）、ロウセアウ・ディー（Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｄ．）、ミルズ・ディー（Ｍｉｌｌｓ Ｄ．）、ファーグソン−ミラー・エス（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．）、ジェニス・アール（Ｇｅｎｎｉｓ，Ｒ．）、２０００年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻、第２９８９頁〜第２９９６頁）。また、１つのプロトンと輸送される１つの電子との他の比についても論じられており（（パパ・エス（Ｐａｐａ．Ｓ．）、ロルッソ・エム（Ｌｏｒｕｓｓｏ，Ｍ．）、キャピタニオ・エヌ（Ｃａｐｉｔａｎｉｏ，Ｎ．）、１９９４年、ジェイ・バイオエネーグ・バイオメンブル（Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．）第２６巻、第６０９頁〜第６１７頁；ミシェル・エイチ（Ｍｉｃｈｅｌ，Ｈ．）、ベハァ・ジェイ（Ｂｅｈｒ，Ｊ．）、ハレンガ・エイ（Ｈａｒｒｅｎｇａ，Ａ．）およびカント・エイ（Ｋａｎｎｔ，Ａ．）、１９９８年、アン・レブ・バイオフィズ・バイオモル・ストラクト（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．）２７巻、第３２９頁〜第３５６頁）、一般的に膜電位の機能が論じられている（マーフィー・エム（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．）およびブランド・エム（Ｂｒａｎｄ，Ｍ．）、１９８８年、イウ・ジェイ・バイオケム第１７３巻、第６４５頁〜第６５１頁）。

プロトンがミトコンドリアのマトリックスから汲み出されるので、電気化学的なプロトン勾配が形成される。このプロトン勾配は、ＡＴＰアーゼによって使用されてＡＴＰを生じることになる。ＢＲとＣＯＸとは、プロトン勾配が結果的に生じるという点で相互に似ている。ＢＲの場合では、光によってプロトン勾配が形成され、ＣＯＸの場合では、化学エネルギーによってプロトン勾配が形成されることになる。このことは図２に示されており、ＢＲ１２の代わりにＣＯＸを用いる場合では、緑色光の光子１８の代わりにシトクロムｃからの高エネルギー電子が用いられ、酸素から水への還元が加えられることになる。実際、ＢＲとＣＯＸとがハロバクテリウム属サリナリウムにおいて同じ目的のために用いられており、呼吸に必要な酸素および有機体に有益なＣＯＸが十分に存在していないハロバクテリウム属サリナリウムではＢＲが用いられている。

図４Ａおよび図４Ｂで示されるように、固体基質が支持されている脂質膜４０にＣＯＸが組み込まれることは、電子輸送の測定が可能であると共に、プロトン輸送の電気的制御が可能であることを示している（ナウマン・アール（Ｎａｕｍａｎｎ，Ｒ．）、シュミッド・イー（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．）、ジョンクジク・エー（Ｊｏｎｃｚｙｋ，Ａ．）、フェンドラー・ケイ（Ｆｅｎｄｌｅｒ，Ｋ．）、カデンバッヒ・ビー（Ｋａｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．）、レーバーマン・ティー（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｔ．）、オフェンハウザー・エー（Ｏｆｆｅｎｈａｕｓｓｅｒ，Ａ．）、クノール（Ｋｎｏｌｌ）、１９９９年、バイオセンサー・アンド・バイオエレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｅｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）１４巻、第６５１頁〜第６６２頁）。このような実験では、金フィルム４４に取り付けられたチオール化ペプチド鎖４２を、ジミリスチルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）から成る脂質膜単層４６に対する基質として機能するように用いている。ＣＯＸおよびシトクロムｃがリポソーム小胞４８内に取り込まれており、図４Ａの５０で示されるペプチド表面上に融合することになる。電気測定では、電子が金基質からＣＯＸを介するように輸送されたり、ＣＯＸを介して金基質へと輸送されたりすることが示され、加えられた電流によりプロトンの輸送が制御されることが示される。

インビトロ実験では、膜に結合したタンパク質の自然な環境が最大限に正確に再現されているものの、そのような条件は、他の細胞プロセスによって分かりにくくされ得る現象の測定または実験の時間スケールで希に生じる現象の測定にはあまり寄与しない。更に、タンパク質を能動素子として使用する有益なデバイスの製作では、使用および製造を容易にしつつ、タンパク質を変性させずにできる限り試験管内のタンパク質に似たタンパク質の機能を維持するサポートが容易に製造できて維持される必要がある。実験室での試験では、好都合な実験回数に対して酵素機能が維持されるような状態で多くの生物酵素が人工脂質膜に組み込まれている。本発明は、脂質膜とポリマー膜との双方を使用して光を動力源としたＢＲ／ＣＯＸデバイスを形成することを対象としている。

ホスファチジルコリンまたはＤＭＰＥから形成される人工脂質膜は、天然の細胞膜の両親媒性組成が反復して形成されたものである。トリトン−Ｘまたは硫酸ドデシルナトリウム等の界面活性剤を添加することによって膜タンパク質を可溶化させており、タンパク質／脂質溶液を穏やかに音波処理することによって膜タンパク質をリポソーム内に組み込んでいる。リポソームは、小胞形態で維持することができる（ピタードら、１９９６年）。あるいは、リポソームは、フラットな基質の存在下で平らな面状に形成することも可能である（ナウマンら、１９９９年、およびスタインバーグ−ユフラフ・ジー（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ−Ｙｆｒａｃｈ，Ｇ．）、リガウド・ジェイ（Ｒｉｇａｕｄ，Ｊ．）、デュランティニ・イー（Ｄｕｒａｎｔｉｎｉ，Ｅ．）、ムーア・エイ（Ｍｏｏｒｅ，Ａ．）、ガスト・ディー（Ｇｕｓｔ，Ｄ．）、ムーア・ティー（Ｍｏｏｒｅ，Ｔ．）、１９９８年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３９２巻、第４７９頁〜第４８２頁）。タンパク質の生物学的機能は維持されており、試験管内での濃度よりも数千倍高いタンパク質濃度を得ることができるので、実験感度および実験精度が良くなっている。また、高いタンパク質濃度は、個々の分子事象の集合効果を利用する電源およびセンサーの形成には必要である。

ＢＲの特性を考慮すると、ＢＲおよびＣＯＸを利用して電気を発生させるデバイスから得られる電力を見積もることができる。１秒間で地球表面１ｍ^２当たりおよそ７．５×１０^２０個の緑領域の太陽光子が入射している。即ち、ＢＲ分子の面積（２５ｎｍ^２）当たり１．９×１０^４個の緑領域の太陽光子が入射することになる。ＢＲの吸収係数は、６６０００／モル／ｃｍであり（ブセボロドヴ・エヌ、１９９８年、バイオモレキュラー・エレクトロニクス：アン・イントロダクション・ビア・フォトセンシティブ・プロテインズ、第１２５頁、バァーカウサー、ボストン）、ＢＲの単層当たり約４．４×１０^−４である。ＢＲの量子効率は、０．７であり、３．０８×１０^−４のプロトン輸送確率がもたらされることになる。それゆえ、日光の照射では、ＢＲ１分子当たり１秒間で約５．８輸送事象を予想することができる。

１ｍ^２の面積では、ＢＲ：ＣＯＸ比が５７：１であれば、プロトン（１つ）が定常状態のプロトン移送速度となる。このような比では、単層１ｍ^２当たり３．９×１０^１６のＢＲが存在することになる。ＣＯＸでは１つのプロトン当たり１つの電子が輸送されるので、単層１ｍ^２当たり３７ｍＡの電流が得られることになる。単層が１０００個積層したものは、光の３６％だけしか利用できないものの、電流が７６０ｍＶで３７Ａ／ｍ^２まで増加し、２８Ｗ／ｍ^２が得られることになる。このような電流レベルおよび電圧レベルは全デバイスに対しては適当となり得ないものの、デバイスの電気出力を高く設定することができるので、いずれの電気出力に対しても電圧と電流との広範な組合せが可能となる。この系でのタンパク質および脂質（または同等物）の質量は、２．３ｇ／ｍ^２である。金電極およびポリビニルアルコールから成る同じ厚さ（５ｎｍ）のポリマー層では、１０５．３ｇ／ｍ^２の質量密度が得られ、２６５Ｗ／ｋｇを超える電力密度が得られることになる。このようなデバイスから得られるエネルギーは３時間で７９５Ｗｈｒ／ｋｇであり、３日間で９５４０Ｗｈｒ／ｋｇであり、１０日間で３１８００Ｗｈｒ／ｋｇである。エネルギーは日光から得られるので、取り出されるエネルギーは、日光に照射される継続時間に直接的に比例して増加する。

このような電力密度およびエネルギー密度は、電極材料およびポリマー材料を代替的に取り替えることによって増加し得るが、層厚さを種々に選択すると付加的な重量および光散乱によって減少することになる。電極材料およびポリマー材料に起因する光散乱効果は、以下の理由から無視してもよい：（１）使用されるポリマーは、λ＝５００〜６５０ｎｍと僅かな活性を有するように選択されている；（２）金属電極は、デバイスの最初の層を透過しなかった僅かな光でも吸収することがなく、仮にそのような光が電極と相互作用する場合であってもデバイス内で単に反射し、最終的にはＢＲによって吸収される。

上述のように、ＢＲおよびＣＯＸは双方ともプロトン輸送体であり、それぞれ光および高エネルギー電子からのエネルギーをプロトン勾配へと変換しており、それによってＡＴＰアーゼおよびＡＴＰの生成が促進されることになる。ＣＯＸを逆に作用するように用いると、プロトン勾配を起電力（ＥＭＦ）に変換することができ、エネルギーが電子に伝えられることになる。酸素およびシトクロムｃが排除され、それらが外部加重に接続された電極と置き換えられることによって、仕事を行うようにＥＭＦを形成することができる。電極が重ねられた膜にＢＲおよびＣＯＸを組み合わすことによって、図５に示すようなプロセスおよび構造が得られる。なお、図５では、緑色光の光子６８を吸収すると、バクテリオロドプシン６２がプロトン６４をポリマー膜６６を通過するように輸送させるバイオソーラーセル６０が模式的に示されている。このため、膜の上側７０のプロトン濃度は増加し、シトクロムオキシダーゼ（黄色）７２が逆に作用することになる。その結果、下側７４に輸送されるプロトン６４から電気化学エネルギーが得られ、そのエネルギーによって、膜の上側の上方電子７８から膜の下側の下方電子８０へと電子７６が輸送されることになり、電極に起電力が生じることになる。なお、起電力は、外部の仕事をするのに用いられることになる。

電子の移送が完了すると、系はその初期状態に戻る（即ち、ＣＯＸが還元されて再度酸化される。また、ポリマー膜６６の両側のプロトン濃度が変化しない。更に、電極が正味荷電を得たり消費したりすることがない）。ＥＭＦは外部に対して仕事を行い、光子が吸収されることになる。系は、次の光子の光エネルギーを電気エネルギーに変化する準備が整うことになる。

プロトン駆動力を起電力に変換させるのに中心となるプロセスは、逆向きにＣＯＸ７２が作用することを経ることになる。Ｆ_０Ｆ_１−ＡＴＰアーゼおよびイオン輸送体等の可逆エネルギー変換タンパク質に関しては多くの例が文献に記載されている。Ｆ_０Ｆ_１−ＡＴＰアーゼに関する文献としては、ハンメス・ジー（Ｈａｍｍｅｓ，Ｇ）のトレンズ・バイオケム・サイ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．）第８巻の第１３１頁〜第１３４頁（１９８３年）があり、イオン輸送体に関する文献としては、ニコルス・ディー（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｄ）のバイオエナジェティックス：アン・イントロダクション・ツー・ザ・ケミオズモティック・セオリーの第１２３頁（ロンドンのアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））がある。しかしながら、逆向きに作用しないエネルギー変換タンパク質も存在する。例えば、バクテリオロドプシンは、プロトン勾配に応じて緑色光を発することはない。

ウィクストロム（ウィクストロム・エム（Ｗｉｋｓｔｏｒｍ，Ｍ）、１９８１年、プロク・ナトル・アカド・サイ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第７８巻、第４０５１頁〜第４０５４頁）の研究では、ＡＴＰが添加されたミトコンドリアでは、ＣＯＸにおいて電子の一部が逆に流れることが確認されている。Ｆ_０Ｆ_１−ＡＴＰアーゼは、可逆プロトン・ポンプであり、ＡＴＰの形成の際にＡＴＰアーゼが外部のプロトンをミトコンドリア・マトリックスに移送したり、逆にＡＴＰを消費してプロトンを汲み出すことができるような機能を有している。ウィクストロームによって説明されているように、ＡＴＰが添加されると、ＡＴＰアーゼによって、ＣＯＸと同時に、プロトンが膜を横切るように移送することになる。このような反応によって、膜の外側でプロトン濃度が高くなり、ＣＯＸに逆向きの電子−膜プロトン圧力勾配が形成されることになる。このような条件が生じると、吸収スペクトルのシフトが観察され、典型的なプロセスとは逆で水からヘムへと電子が移送することが示されることになる。このような現象が生じる理由は、次の解析で例示される。

電気化学において、反応の進行に伴うエネルギーの余剰分または不足分は、次の式で示される（例えば、デ・バウト・ディー（Ｄｅ Ｖａｕｌｔ Ｄ．）のバイオチミ・バイフィズ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）、公式記録２２６、第１９３頁〜第１９９頁（１９７１年）を参照）：
−△Ｅ＝△Ｇ／ｎＦ
ここで、△Ｅは電子供与の前後のレドックス電位の変化、△Ｇは反応の自由エネルギー変化、ｎは移送される電子の数、およびＦはファラデー定数である。ＣＯＸによって電子がシトクロムｃ（還元電位＝＋２２０ｍＶ）から移送されるに際して、電子は連続的にその自由エネルギーを減少させ、最終的には、Ｏ_２（還元電位＝＋８６０ｍＶ）を還元してＨ_２Ｏを生成する。移送される１つの電子当たりの自由エネルギーは、−１４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌである。このエネルギーは、プロトンを移送させ、電気化学的勾配を形成するのに用いられる。ウィクストロムは、外部プロトン濃度を十分に増加させており、△ＧがＣＯＸの通常の作用に対して正になるので、プロトンの前方向へのポンピング（または輸送）では、Ｏ_２の還元が供し得るよりも多くのエネルギーが必要とされる。「還元緩衝」を用いることによって、シトクロムｃの還元電位が一定に維持される。これは、△Ｇが変化するにつれ、Ｈ_２Ｏ／Ｏ_２の還元電位が変化することを示唆している。外側のプロトン濃度が十分に高くなるので、電子の移送が逆方向に進行し、水から電子が受容されて、ＣＯＸにその電子が供与されることになる。しかしながら、Ｏ_２が生じないので、電子の逆方向の移送が十分とはなっていない。

本発明の系では、図５に示すように、ＣＯＸは、初期の電子供与体、シトクロムｃ、最終的な電子受容体、またはウィクストロームによって説明される系のＯ_２の何れも有していない。電子源は水でなく電極７８なので、Ｈ_２Ｏの８２０ｍＶと比較して電子を取り出すコストは最小限となっている。電子は、ヘムａ_３に到達すると＋３８０ｍＶと正の還元電位を経ることになり、それによって、外部に対して仕事が行われることになる。この電位は、ヘムに向かって１４０ｍＶ〜＋２４０ｍＶ減少しており、プロトン勾配からのエネルギー入力を必要とする。電位は更に銅ａ（Ｃｕａ）に向かって５０ｍＶ〜＋１９０ｍＶ減少し、最終的には０Ｖにおいて電極８０に移送される（これもまた、エネルギーの入力を必要とする）。初期電極７８からヘムａ_３への電子の移送は、還元電位が増加（自由エネルギーが減少）するので、このような反応が自発的に生じることになる。ａ_３から対電極への電子の移送は、３８０ｍＶと還元電位が減少するので、外部からエネルギーが入力されなければならない（即ち、プロトン駆動力が必要とされる）。ＢＲ６２を使用し、膜６６を適当にドープで処理すると、プロトン駆動力をより大きく形成することができる。電極が電子供与体であるので、電極から電子を得ることは、Ｈ_２Ｏから電子を得るよりも相当に容易であって、水と酸素との間の化学中間体が回避されている。

膜の表面上ではイオンの拡散が大きくなっており、膜組成物を適当に選択することによってイオンの拡散をより大きくすることができるので、膜表面自体は、バイオソーラーセルの優れた機能が必要とされる（ピタードら（１９９６年））。膜４０または多くの生体適合性ポリマー・マトリックスから成る膜等の脂質膜は、タンパク質を含んでおり、タンパク質バリアーとして機能している。このようなポリマー・マトリックスは、非常に一般的であって、
（ａ）タンパク質の上半分と下半分を分ける膜を形成すること、
（ｂ）タンパク質を適当な方向で膜内に容易に挿入することができるように、天然脂質膜に十分に類似する環境を形成すること、
（ｃ）タンパク質が受けるポリマー膜の局所的な化学環境に起因してタンパク質が広がり変形し、それによってタンパク質の天然の作用が損なわれることがないこと
が求められる。このような条件を満たすポリマーには、限定するわけではないが、外側に親水性ブロックおよび内側に疎水性ブロックから成る一般的な性質を有するトリブロックコポリマーが含まれる。ＢＲ６２およびＣＯＸ７２は、ポリマー膜６６内で方向付けられて組み合わされることになり、膜が電極７８および８０で覆われることになる。

図２には、Ｆ１−ＡＴＰアーゼを動力源としたナノ機構のデバイスに燃料を連続的に供給することができる光駆動ＡＴＰ生成系の構成が示されており、その実施および評価も示されている。図５に示されるように、本発明は、緑色光からのエネルギーを用いてＡＤＰからＡＴＰが連続的に生じるように配向されたＢＲおよびＡＴＰアーゼを含んだリポソーム小胞６６の構成に関している。バクテリオロドプシン（ＢＲ）の大量生産および精製する系は、過剰生成するハロバクテリウム属とは切り離されており、ゲル濾過クロマトグラフィー（図６の曲線９０）を用いて精製が行われることになる。

本発明では、上記で説明した手法（ピタードら（１９９６年））に従って、精製されたホスファチジルコリン、ホスファチジン酸およびコレステロールを用いることによって、リポソームを再構成した。リポソームは、溶液中に２００ｎｍよりも小さいリポソームが残されるように、０．４５μｍおよび０．２μｍのフィルターを用いてサイズを順次選択した。ＡＴＰアーゼおよびＢＲの組込みは、トリトンＸ−１００の存在下で行った。確実にリポソームが形成されるように、ｐＨ検知計として、蛍光顕微鏡検査法を用いて視覚的に評価するピラニンを組み込んだ。これによって、２０℃において１．５という大きいｐＨ勾配が達成されることが示された（図７の線９２および９４を参照）。図７では、バクテリオロドプシンを含むリポソーム（線９２）およびバクテリオロドプシンを含まないリポソーム（線９４）によって３０分後にｐＨ勾配が形成されることが示されている。

分析により、図８の９６で示されるように、リポソームによるＡＴＰの生成が示された。図８では、種々の量のＢＲおよびＦ_０Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを含むリポソームによって生じるＡＴＰに起因してルシフェリンが発光することが示されている。リポソームは、ＡＤＰを溶液に加える前に光の下で２．５時間培養された。その目的は、定常状態のＡＴＰ生成速度が上述のレベル（ピタードら（１９９６年））にまで増加するように、電気化学的勾配を最適化するためである。

原子的に鋭い先端を有する中空シリンダー（「ナノシリンジ」）のアレイは、上述のナノスケールのハイブリッド分子デバイスを生きている細胞に注入するのに用いられてきた。このプロセスの第１工程は、中空となっていないナノシリンジを形成することである。図９は、直径が約１μｍのシャフト１０４および直径１０ｎｍよりも小さい先端１０２を含むシリコンチップ・アレイ１００の一部の顕微鏡写真である。このようなアレイ１００は、種々の分子デバイスのサポートとして機能するナノメートルのスケールのニッケル・ドットのアレイを電気化学的に配置するための電極として用いられる。また、このようなアレイによって、ミクロスケールまたはナノスケールの電極をタンパク質が埋め込まれた膜上に直接的に配置することが可能となる。

ＢＲの生成および合成は、常套的な操作で行われる。ハロバクテリアを５０リットルのバッチ内で発酵させ、発酵後、処理および精製することによって、１００ｍｇよりも多くの紫膜が形成される。これは、およそ６０ｍ^２のタンパク質単層面積に相当し、プロトタイプのデバイスにとっては十分な量である。

プロト・エクスプル・アンド・パー（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．，ａｎｄ Ｐｕｒ．）第１３巻第３２６頁〜第３３６頁（ゼーン・ワイ（Ｚｈｅｎ，Ｙ．）、クイアン・ジェイ（Ｑｉａｎ，Ｊ．）、フォルマン・ケイ（Ｆｏｌｌｍａｎｎ，Ｋ．）、ハイワード・ティー（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｔ．）、ニルソン・ティー（Ｎｉｌｓｏｎ，Ｔ．）、ダーン・エム（Ｄａｈｎ，Ｍ．）、ヒルミ・ワイ（Ｈｉｌｍｉ，Ｙ．）、ハマー・エイ（Ｈａｍｅｒ，Ａ．）、ホスラー・ジェイ（Ｈｏｓｌｅｒ，Ｊ．）およびファーグソン−ミラー・エス（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．）、１９９８年）に記載されているプロトコルは、ＣＯＸの生成（ゼーンら（１９９８年））に使用される。この方法は、図１０の９０で示すように、ロドバクター・スフェロイデスからのＣＯＸの過剰発現および精製に関している。過剰発現プラスミドｐＲＫ−ｐＹＪ１２３Ｈの形成手法は、図示するように、ｐＪＳ２−Ｘ６Ｈ２のＳｍａＩサイトを用いてロドバクター・スフェロイデスからｐＵＣ１９へとシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＩ遺伝子（ｃｏｘ１）をサブクローニングして、ｐＪＳ３−ＳＨを形成することを含んでいる。Ｈｉｓ−ｔａｇと名付けられた６個のヒスチジンが連なったものが、ｃｏｘ１のＣ末端に配置されており、ｐＪＳ３−ＳＨにてｐＹＪ１００から特異なＰｓｔＩサイトへとＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントを付けることによってｐＹＪ１２４Ｈが形成される。引き続いて、３つのサブユニット遺伝子は、ＥｃｏＲＩサイトおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトを用いて発現ベクターｐＲＫ４１５−１内に配置される。このような手法では、１０Ｌ培養物当たり過剰発現プラスミドｐＲＫ−ｐＹＪ１２３Ｈが６１ｍｇと多量に生じ、それに伴って単層面積も大きくなっている。

ＢＲ、およびＢＲが組み込まれたリポソーム小胞の生成ならびに合成は、常套的な操作で行われる。脂質に挿入する前に電場を一様に加えてＢＲを配向させることは、球形の小胞では困難となるものの、平面対称性を有する膜では極めて容易となる。図１１の１２０で示されるような測定装置は、インピーダンス分光法に用いられる電気化学セルであり、電子輸送、およびプロトン輸送から生じる電位を測定するように設計されており、平面的な膜に対して用いられる。更に、膜／タンパク質複合体に対しては電場が容易に適用される。このセルは、ナウマンに関して説明したように、ストッパー１２１、Ａｇ／ＡｇＣｌ／飽和ＫＣｌ参照電極１２２、液体出口１２３、テフロン・スペーサー１２４、ゴルフ・サポート１２５、液体入口１２６および白金対電極１２７を含んでいる。

紫膜およびＢＲの配向に関して多くの技術が開示されている。例えば、静電気的に層単位でアッセンブリすること、電場を高くしてランブミュラ−ブロジェット・フィルムを形成すること、空気コンデンサーの電場でＢＲを配向すること、懸濁液に電場を直接的に適用すること、および電場と磁場を組み合わせること等が挙げられる。これらの方法の大部分は、天然の恒久的なＰＭの大きい電気双極子モーメント（直径１μｍ粒子に対して１０^６デバイ）を利用している。この大きいモーメントは、個々のＢＲモーメントが合わさることによって生じる（理論的な計算では５７０デバイと見積もられており、実験では５５デバイと見積もられている）。膜に対して垂直に加えられる強度が僅か２０Ｖ／ｃｍ未満の電場は、ＢＲを配向させるのに十分であり、容易に得ることができる。

ＣＯＸの双曲子モーメントは、シトクロムｃの結合が高められるように、十分に大きくされる。ＢＲと同様に、ＣＯＸは、膜を介してプロトンを引き寄せたり、はじいたりするのにＣＯＸの内部の双曲子を使用する。ＣＯＸの細胞質タンパク質が親水性であるために、脂質での回転を妨げるバリアーを酵素が有することになる。また、矩形のタンパク質も、そのような動きを妨げることになる。それゆえ、ＣＯＸが脂質膜内へ取り込まれる前にＣＯＸを方向付ける必要がある。ＣＯＸの後にＰＭを加えると、配向のための場が相当に低下し、その結果、ＣＯＸの配向が乱されなくなる。ＣＯＸを配向させるのに、他の部分（脂質膜、ＢＲ、または水の加水分解など）に対して適合性を有さない電圧が必要とされる場合、対電極は近づくように移動し、加えられる電圧が安全なレベルとなるので、プロセスが乱されることなく、必要な場が確実に形成されることになる。

上述の装置は、リポソーム膜内でＰＭおよびＣＯＸを個々に配向させるために用いられるものであり、ＢＲでのプロトン輸送およびＣＯＸによる電子輸送を測定するためにも用いられる。

リポソーム膜内に配向されて組み込まれたＢＲのみを用いる初期の実験を、図５で説明したような構造を用いて実施した。膜を通るようにプロトンが移動するので、検知可能な信号を容易に得ることができる。このような実験は、ＣＯＸを用いて繰り返し行った。

図５の装置の電極７８および８０の役割は、デバイスには存在しないシトクロムｃおよびＯ_２に代わりになるように、電子を供給したり減らしたりすることである。ＣＯＸ７２に起因してプロトンが移動して電流が流れるためにプロトンの流束の測定が困難になることがあるので、リポソームＢＲと共に上述の実験で使用されたのと同様のｐＨ検知蛍光指示計を用いた。ＣＯＸと接触する電極の性能は、脂質膜にのみタンパク質を配置することによって評価された。上述のＢＲのプロトン移動をモニターする方法（ナウマンら（１９９９年））と同様の方法を用いることによって、取り付けられた電極から輸送される電子を用いてプロトンを移動させるというＣＯＸの性能を調べた。方向づけられた電場を用いた実験とそのような電場を用いていない実験との双方の実験によって、配向が満足のいくものであることが示された。電気的に誘発されたプロトン移動に主に起因して、ＡＴＰアーゼをＣＯＸと共に脂質膜内に組み込むことが可能となる。ＣＯＸを活性化させることによって、プロトン勾配が生じるので、ＡＴＰを生じるようにＡＴＰアーゼを用いることができる。このことは、ＡＴＰが電気的に合成されることを示しており、生物学にとって画期的なことであり、ＡＴＰを動力源にしたナノデバイスの更なる開発にとっては大きな意義を有している。

膜スペースの一方の側を他方の側よりも酸性にして人工的なｐＨ勾配を形成することによって、酵素の逆の作用が調べられる。プロトン輸送の測定によってＣＯＸの配向が変化すると、プロトン流れが逆方向になるので、ＣＯＸを流れる電流および電圧が測定されることになる。このような電子流れは、電極が図１１に示すような構成になっている場合（即ち、上方電極が膜の上面に近接して配置されている場合）では、生じないことがある。

電極をタンパク質により近づける方法が多く存在する。電極グリッドは、電気測定用に外部に接続される薄いワイヤーメッシュの形態で脂質の上部に直接的に配置してもよい。上面の上方の脂質を取り除いた後、アルミニウムまたはニッケルから成る薄い透明な層を膜に直接的に配置して対電極を形成してもよい。別法にて、図９に示す先端のアレイをラスタライズすることによって、電極を脂質表面に電気化学的に配置してもよい。このような配置では、膜の上面において何百万ものナノスケールのワイヤーが得られることになる。上述の工程を繰り返し、組み合わせることによって、脂質膜内に含まれるＣＯＸおよびＢＲが方向付けられることになる。

ＢＲおよびＣＯＸを配向させるには２つのシナリオが考えられる。１つは平行双極子配向であり、もう１つは非平行双極子配向である。双極子が平行である場合、単一の磁界を用いて、ＢＲとＣＯＸとの配向を同時に達成できる。双極子が平行でない場合、ＰＭの双極子モーメントの大きい塊が用いられる。高い磁界でＣＯＸをまず配向した後、ＣＯＸの摂動を回避すべく十分に小さい磁界であるものの、ＰＭフラグメントを操作するのには十分大きい磁界においてＰＭを配向することによって、適当な配向が達成されることになる。

電圧測定によって、ＢＲが適当に機能しており、プロトン勾配が形成されていることが示される必要がある。この勾配からもたらされる膜透過電圧は、数１００ｍＶであると考えられている。引き続いて電流を測定すると、本発明の概念の成功が示されることになり、膜の電極によって達成される僅かな機能性ＣＯＸタンパク質が見積もられることになる。

ＣＯＸによってプロトンが逆に移送されるので、ＢＲによって供されるプロトン濃度によって電流が左右され、電流が光量（または光度）に比例することになる。また、ＣＯＸ分子がリポソーム膜内で平行になるように配置されているので、全電流は機能性ＣＯＸ分子の数に比例することになる。上述したように、生じる電圧は一定であり、２００ｍＶよりも大きいものである。そのため、光量、および適当な方向に配向されたＣＯＸの正味の数によって、生じる電力が減少することになる。

電力を最大限にする方法は、ＣＯＸの配向の最適化、ならびに膜層の適当な選択および変更に重点が置かれる。例えば、高い強度と低い強度とで連続的に照光することや、周期的に照光する等して種々の照光をデバイスに行うと電力が生じることになる。

ポリマー膜が使用されることが望ましい。なぜなら、ポリマー膜は脂質膜よりも耐用期間が長いからである。また、ポリマー膜は丈夫であって、電子伝導性、イオン伝導性および透過性等の点で期待どおりの性質を有しているからである。そのような膜の内部は、疎水性かつ弾力性を有するので、天然のタンパク質環境にできるだけ近づくように模倣（シミュレート）することが可能である。

幅広い種類の生体適合性ポリマーが存在しており、特に、光吸収性、極性、電気伝導性およびイオン伝導性等の幅広い性質を有している。本発明のソーラーセルの特性を高めるポリマーは、タンパク質および電極と適合性を有している必要がある。また、プロトンを通さない性質も重要である。ポリマーの表面をドープできるということは、プロトン伝導性および膜コンダクタンスの点で重要な役割を果たすことになるので重要となる。ポリマーの寿命とポリマー内に含まれるタンパク質の寿命とは関連性があり、選択する際のファクターとなる。短い寿命であるものの性能が高いポリマーの選択は、特別な用途で有用となり得る。

生物学的要素から成る太陽光電源を効率的かつ生産的に形成する上述の方法では、エネルギー変換生体タンパク質と外部デバイスとが一体化することが示されており、種々のデバイスに電力を供給することができるバイオソーラーセルの大量生産が可能となる方向性が示されている。

本発明の別の要旨において、タンパク質のアクアポリン・ファミリーをトリブロックコポリマー膜内に組み込んで使用することによって、水のみを通過させる安定なフィルムを製造することができる。そのようなフィルムは、水のみを通過させるので、透析によって、水精製、脱塩および分子レベルの濃縮が容易となる。バクテリア、ウィルス、ミネラル、タンパク質、ＤＮＡ、塩、界面活性剤（または洗剤）、溶存ガス、および水溶液から生じるプロトンを含む全ての汚染物質は、アクアポリンを通過することができないが、アクアポリン分子は、その構造に起因して水を移送させることができる。図１２に模式的に示すように、アクアポリン１３０はいずれも、膜内にタンパク質を繋ぎ止める６個の膜アルファヘリカル領域１３２〜１３７、およびタンパク質の中心にて頂点同士が一体となった２つの高度に保存されたＮＰＡループ１３８，１４０から成っており、砂時計のような形状を有している。このような砂時計の狭くなっている箇所では、図１３の１４２で示すように、水分子が一列となって膜を実際に通過することができるようになっている。水の動きが対称的であり、いずれの方向にでも進行できることが示されている。この事実は、このプロセスがエネルギーを消費しないので重要である。水は、水圧または浸透圧に起因して特定の方向に膜を通過することになる。図１４に示すように、硬い膜１５６（その膜の中心はアクアポリンが充填されている）で分けられたチャンバー１５２および１５４と２つのチャンバーを有するデバイス１５０が用いられることによって、水精製／脱塩を達成することができる。この膜自体は、水を通さない性質を有しており、チャンバー１５４内の精製した水１６０とチャンバー１５２内の汚染された水とを分けている。純粋な水だけが２つのチャンバー間を移動することができる。従って、適当な圧力の下、膜の一方の側に海水または他の汚染された水１５８が配置されると、純粋な水が他方のチャンバー１５４内に自然に流れることになる。従って、飲用に適さない源から精製した水が得られることになる。または、源水が重要な化学物質を含んでいる場合、水が選択的に取り除かれることによって、流入チャンバーで所望の化学物質が高い濃度で得られることになる。しかしながら、重要なことには、アクアポリンは、水に対して排他的な選択を有しているという理由以外の理由でも本発明に適している。このタンパク質ファミリー（例えばアクアポリンＺ（ＡｑｐＺ））から成る多くの膜は、非常に丈夫であり、機能が損なわれることなく、汚染された源水の厳しい条件に耐えることができる。アクアポリンＺは、酸、電圧、界面活性剤および熱に曝されることに起因した変性または分解に対して耐性を有している。従って、別の膜を塞いだり破壊したりするような物質で汚染された源水を精製するために本発明のデバイスを用いることができ、また、連続して高温となる領域に本発明のデバイスを用いることができる。

アクアポリンＺは変性しやすいものである。このようなタンパク質は、その最終的な形状および機能に影響を与える遺伝子の配列に基づいて宿主細菌で特に発現されるので、その遺伝子コードを容易に変更させてタンパク質の特性を変えることができる。それゆえ、タンパク質の元の機能とは異なるタンパク質を設計して所望の用途を果たすことができる。例えば、システインに対して図１３に示す水チャンネル１４２の中心付近の特定のアミノ酸残基を単に変えることによって、得られるアクアポリンが溶液中で遊離水銀と結合することになるので、閉塞により水を輸送しなくなる。従って、膜デバイスに使用される変異タンパク質は、毒性物質の濃度が高くなり過ぎた場合、単に透過性を有さなくなるので水サンプル中の水銀汚染の検知が可能となる。

本発明の好ましい形態は、常套的なフィルターディスクの形態を有している。なぜなら、そのようにすると最も容易に機能性を評価できるからである。ディスク状にするために、合成トリブロック・コポリマーおよびタンパク質の厚さ５ｎｍの単層が、ラングミュラー−ブロジェット法を用いて２５ｍｍの市販の限外濾過ディスクの表面に配置される。そして、ディスク上の単層を２５４ｎｍの紫外線光に曝してポリマーを架橋させることによって、耐久性を増加させる。最後に、２２０ｎｍの孔サイズのＰＶＤＦ膜をエポキシ樹脂でディスク表面に接着させることによって、安全な操作がもたらされることになり、エッジでのリークが防止されることになる。

図１４に示すように、加圧により源水が膜を通るようにチャンバー内にデバイスが取り付けられることによって検定が行われることになる。純水のみが膜の一方の側面から通り抜け、汚染溶質が元のチャンバーで濃縮するような場合ではデバイスが機能的であるとされる。純水の自然な傾向に打ち勝って、より多くの溶存粒子を有するチャンバー内に汚染された溶質を移動させるために、汚染された溶質を加圧しなければならない。アクアポリンＺ膜は、逆浸透によって汚染溶質から純粋な水を分離する効果を有する。システムのこのような傾向または浸透圧は、ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）で表すことができる。例えば、海水の浸透圧は約３６０ｐｓｉである。

このような圧力に耐えることができるようにデバイスを用いる方法は幾つか存在する。種々のポリマーは、他のポリマーよりも固有的に耐久性があり、紫外線光で架橋させて、特別に硬くすることができる。別の方法は、無毒で容易に除去できる高濃度の溶質をフレッシュウォーター・チャンバーに加えて、膜に及ぶ通常の浸透を促進させつつ、チャンバーの加圧によって逆浸透をもたらしている。複数のアクアポリンＺデバイスを、封止され接続された一連のチャンバー（汚染物の濃度は徐々に小さくなっている）に用いることによって、逆浸透に必要な圧力を減じることができる。対を成す各々のチャンバーにおいて水の精製に必要な圧力は、逆浸透に必要とされる全圧力の一部となる。それゆえ、各々の膜は小さい圧力にのみ耐えればよく、膜が損なわれる可能がより低くなる。各々のチャンバー対の間の濃度差が１００％でなく、僅か１０％である場合、上述の高い圧力の１０％が各々の連結部分で源水を精製するのに必要となる。最終的なチャンバーでは、一定の圧力および流れを有する純水が連続的に生じることになる。

アクアポリン逆浸透膜では、単一の工程で種々の汚染物質を含む水を精製することができる。図１５の１７０で示すような常套的な高純度なシステムでは、軟水装置１７２、カーボン・フィルター、イオン交換体、紫外線殺菌装置または化学殺菌装置１７４、および２つの通路を有する逆浸透フィルター・セット１７６（連結して使用して水（アクアポリンで精製された水ほどきれいではない水）を生成することができる）を含む幾つかの要素が必要とされる。このような精巧なセットアップでは、アクアポリン膜のようには、源水から１５０ダルトンよりも少ない溶存ガスまたは物質を除去することができない。更に、全ての要素はメンテナンスを必要とする。紫外線バルブは取り替えを要し、エネルギーを必要とする。イオン交換体は、それが一杯になった場合に化学的に再生させる必要がある。軟水装置は塩を必要とする。カーボン・カートリッジおよび逆浸透カートリッジは、汚れると取り替えなければならない。単一工程のデバイスは、典型的な精製デバイスよりもスペースを要さず、軽量である。従って、本発明のアクアポリン水精製デバイスは持ち運びが可能である。

また、アクアポリン膜は、従来のシステムよりも迅速に機能する。従来の高速逆浸透ユニットでは、１分間に約２８．４リットル（７．５ガロン）のきれいな水を生成することができる。アクアポリンＺで飽和した脂質膜（０．０１７７ｍｍ^２）を水分子が５４μモル／秒の速度で通過することができることが現在の研究で明らかにされている（ポール・ピー（Ｐｏｈｌ，Ｐ．）、サパロブ・エス・エム（Ｓａｐａｒｏｖ，Ｓ．Ｍ．）、ボーグニア・エム・ジェイ（Ｂｏｒｇｎｉａ，Ｍ．Ｊ．）およびアグレ・ピー（Ａｇｒｅ，Ｐ．）、２００１年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）第９８巻、第９６２４頁〜第９６２９頁）。従って、１．０ｍ^２の表面積を有する理論上のアクアポリンＺ逆浸透膜は１分間に３２９５リットルの水を濾過することができる。この速度は、通常の精製器よりも１１６倍以上速いものである。

新しいタンパク質ベースの膜は、高価な製造法を用いなくてもよい。プロセスの中心となるアクアポリンＺは、人工的に作り出された大腸菌株からミリグラム単位の量で容易に得られる。平均して、純粋なタンパク質は、それを生じる培養菌（または培養株）１リットルにつき２．５ｍｇ得ることができる。約５ドルの培養基から１０ｍｇのタンパク質を生成することができる。それは、幾つかの実物大程度のデバイスにとっては十分な量のタンパク質である。また、各々のデバイスに対して、アクアポリンＺが組み込まれるポリマーは、安価な化学品が生成される実験室と同じような実験室で形成することができる。アクアポリンＺ逆浸透膜は、効率的に水を精製する新規で安価な手段である。

従って、生物学的要素を利用して、汚れた水、塩を含んだ水または別法にて汚染された水から完全に純粋な水を効率よく得る方法および装置を開示した。本発明では、水輸送生物タンパク質と外部デバイスとの組合せが示されており、水精製デバイスの大量生産を可能にする方向性が示されている。

好ましい態様に関して本発明を説明してきたものの、特許請求の範囲に記載されたような本発明の概念および範囲から逸脱することなく、本明細書で開示された方法およびデバイスを種々に変更できることを理解されよう。

図１は、バクテリオロドプシンの主鎖のリボン構造を簡単に示した模式図であり、中央の内部チャンネルを介してプロトンが膜を横断するように移送される。 図２は、ハロバクテリウム属サリナリウムにおいて、緑色光の光子が吸収されると、ＢＲがプロトンをバクテリアから排出して、電気化学的勾配が形成されるプロセスを示しており、ＡＴＰシンターゼがプロトンを細胞内に戻し、その電気化学エネルギーを使用してＡＤＰからＡＴＰを形成することによって、最終的には光エネルギーから化学エネルギーへとエネルギー変換が行われている。 図３Ａは、膜の図であって、ＣＯＸの主鎖のリボン構造を示している。 図３Ｂは、細胞質の図であって、プロトン輸送チャンネルとしての特性を有する「孔」と見なされる３つの領域が星印で示されている。 図４Ａは、平面的な固体で支持された脂質二重層内にリポソームが取り込まれる態様を示している。 図４Ｂは、小胞がＣＯＸと共に平面的な膜に取り込まれて合わさる態様を示している。 図５は、本発明のバイオソーラーセルを模式的に示したものである。 図６は、精製されたバクテリオロドプシンのクロマトグラムである。 図７は、バクテリオロドプシンを含むリポソーム（σ）およびバクテリオロドプシンを含まないリポソーム（□）によって３０分後に形成されたｐＨ勾配をグラフで示している。 図８は、種々の量のバクテリオロドプシンおよびＦ_０Ｆ_１−ＡＴＰアーゼを含んだリポソームによって生じるＡＴＰに起因したルシフェリン発光を示している。 図９は、シリコンチップ（１０ｎｍ未満のチップ、１μｍ未満のシャフトを有する）のアレイのＳＥＭ写真である。 図１０は、ＣＯＸの過剰発現および精製のプロセスを模式的に示している。 図１１は、ＣＯＸに起因したプロトンおよび電子の輸送を測定および制御する装置の一部断面を模式的に示している。 図１２は、アクアポリン・タンパク質の概略図である。 図１３は、図１２のタンパク質の一部の拡大図である。 図１４は、アクアポリンが組み込まれた膜が用いられた水精製セルを示している。 図１５は、従来の水精製システムの概略図である。

Claims (30)

1. 天然生体膜および天然タンパク質の環境を模倣したブロックコポリマー・マトリックス、および
   膜／タンパク質複合体を形成するように前記マトリックス内に組み込まれた膜タンパク質
   を有して成る生体模倣膜。
2. 膜／タンパク質複合体は、組み込まれた膜タンパク質の機能を有するデバイスを構成する、請求項１に記載の膜。
3. タンパク質の機能には、バルブ、チャンネル、センサー、検出器、ポンプおよびエネルギー変換器が含まれる、請求項２に記載の膜。
4. 前記膜タンパク質は、水分子のみを輸送するように選択されており、そのため、前記生体模倣膜が水フィルターとなる、請求項１に記載の膜。
5. 前記膜タンパク質はタンパク質のアクアポリンファミリーから選択されている、請求項４に記載の膜。
6. 前記マトリックスはトリブロックコポリマーから形成されている、請求項５に記載の膜。
7. 前記マトリックスは不透水性であり、前記膜タンパク質が、加圧下で水分子を通すことができるように選択されている、請求項５に記載の膜。
8. 前記マトリックスが水精製デバイス内で支持され、前記デバイスが第１チャンバーと第２チャンバーとに分けられており、前記膜タンパク質によって、前記チャンバー間で水だけが流れることができる、請求項７に記載の膜。
9. 前記膜タンパク質はアクアポリンである、請求項８に記載の膜。
10. 前記マトリックスは、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）およびゾル−ゲルから選択される生体適合性ポリマーである、請求項９に記載の膜。
11. 前記膜タンパク質は、天然の生体タンパク質である、請求項１に記載の膜。
12. ２種類の異なる膜タンパク質が、前記マトリックス内に組み込まれている、請求項１１に記載の膜。
13. 前記膜タンパク質が、エネルギー変換タンパク質である、請求項１２に記載の膜。
14. 前記マトリックスは、薄いファブリック内に組み込まれている、請求項１に記載の膜。
15. 前記膜タンパク質は、光エネルギーが電気エネルギーに変換されるように、前記マトリックス内に埋設されたバクテリオロドプシンおよびシトクロムオキシダーゼを含む、請求項１４に記載の膜。
16. 前記マトリックスは、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）およびゾル−ゲルから選択される生体適合性ポリマーである、請求項１５に記載の膜。
17. 前記電気エネルギーを受けるように、前記ファブリックの対向する面に第１電極および第２電極を更に含む、請求項１５に記載の膜。
18. 前記マトリックスは、バイオソーラーセルが形成されるように、配向されたバクテリオロドプシンおよびシトクロムオキシダーゼを受容している、請求項１に記載の膜。
19. 前記マトリックスの対向する側面に電極を更に含む、請求項１８に記載の膜。
20. 前記マトリックスは、プロトンに対して不透性を有する生体適合性ポリマーである、請求項１８に記載の膜。
21. コポリマー・マトリックス、および
    前記マトリックスに埋設された相互に異なる第１膜タンパク質および第２膜タンパク質
    を有して成るハイブリッド有機／無機電源。
22. 薄いファブリック材料を更に含んでおり、前記マトリックスが前記ファブリック内に埋設されている、請求項２１に記載の電源。
23. 前記膜タンパク質は、天然の生体タンパク質である、請求項２２に記載の電源。
24. 前記タンパク質は、光エネルギーが電気エネルギーに変換されるように、バクテリオロドプシンおよびシトクロムオキシダーゼを含んで成る、請求項２３に記載の電源。
25. 前記電気エネルギーを受けるように、前記ファブリックの対向する面に電極を更に含む、請求項２４に記載の電源。
26. 生体膜を形成する方法であって、
    ブロックコポリマー・マトリックスを形成すること、および
    前記マトリックスに、天然の膜タンパク質または遺伝子操作された膜タンパク質を挿入すること
    を含んで成る方法。
27. 前記膜タンパク質を前記マトリックス内で配向させることを更に含む、請求項２６に記載の方法。
28. 対応する膜機能が生じるように、前記タンパク質を選択することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記マトリックス内に２種類の異なる膜タンパク質を挿入することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
30. 前記マトリックスに光を当て、電気エネルギーを前記マトリクスに発生させることを更に含む、請求項２９に記載の方法。
    

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