JP2021501053A - 膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を含む分離膜、および、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を多孔質基質膜上に固定化した薄膜複合層を調製する方法に関する。
ポリマーソームまたはポリマー小胞は、適切な溶媒(水など)で両親媒性ブロックコポリマーによって形成される自己組織化構造であり、膜貫通タンパク質などのさまざまな構造を組み込むことができる二重層壁に囲まれた内部の空の空洞を提供する。ポリマー小胞の安定性は、形成するポリマーの分子量および親水性対疎水性比の増加に伴うそれらの透過性とともに増加している。疎水性に対する低い親水性比の値を持つポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン(PEO−PPO−PEO)のブロックコポリマー(一般にPluronic(プルロニック)として知られている)は、小胞を形成できるため、透過膜を得るのに適している。残念ながら、それらは直接溶解によって自己組織化するのは容易ではない。マイクロ流体デバイスでの組み立てがより適している(Debora F. do Nascimento et al, Microfluidic Fabrication of Pluronic Vesicles with Controlled Permeability Langmuir 2016, 32, 5350-5355)。さらに、PPO/PEO比が非常に高い(例えば68/10)プルロニックは、100nm前後の小胞構造に自己組織化することが知られており、それはあまり安定していない。重合したペンタエリスリトールテトラアクリレート(PETA)の永続的な相互侵入ネットワーク(IPN)を介して安定化した場合でも、保存期間は1か月以下である。(Feng Li, Pluronic polymersomes stabilized by core cross-linked polymer micelles, Soft Matter, 2009, 5, 4042-4046.)
本発明は、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞に関し、小胞膜形成材料は、ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ−(エチレングリコール)およびポリエーテルアミンの混合物を含む。
xは10〜30の整数を示す、
yは50〜100の整数を示す、
zは10〜30の整数を示す
mは1〜15の整数である、
nは5〜50の整数である、
RはCH3である。
a.膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
b.水溶液として、ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ−(エチレングリコール)を、工程aで調製された混合物に添加すること、
c.工程bで得られた溶液を攪拌すること。
xは10〜30、好ましくは15〜25の整数を表す。
yは、50〜100、好ましくは60〜80の整数を表す。そして
zは、10〜30、好ましくは15〜25の間の整数を表す。
mは1〜15の整数であり、
nは5〜50の整数であり、
R=CH3である。
a.上記のように調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
b.工程aの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
c.ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
d.当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること。
概して、本発明は、ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)およびポリエーテルアミンの混合物を使用して、アクアポリン水チャネルなどの膜貫通タンパク質を持つ自己組織化小胞を形成することに関する。次いで、膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞は、例えば、水分子が膜を通過することを可能にするために、膜貫通タンパク質が組み込まれているかまたは固定化されている分離膜の製造に使用され得る。例えば、膜貫通タンパク質を含む分離膜の製造のために、小胞は、ジアミンまたはトリアミンなどの芳香族アミンを含む水性液体組成物に添加されてもよい。例えば、多孔性支持構造の表面に1,3−ジアミノベンゼン(MPD)を適用し、有機溶媒中の酸塩化物の溶液と接触させると、界面重合反応に参加して、アクティブまたは選択的な薄膜複合体を前記支持体上に形成し、このようにして分離膜を形成し、そこでは前記小胞は固定化または組み込まれている。
Pluronic(登録商標)P−123トリブロックコポリマー(ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)Mn5800Da)および公称2000分子量のJeffamine(登録商標)M−2005(ポリエーテルアミン)からの小胞の調製、および前記小胞を用いた水膜の調製。
分子量5800DaのPEG20−PPO70−PEG20の組成を持つPluronic(登録商標)P−123トリブロックコポリマー(ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール))は、Sigma Aldrichから購入し、受け取ったまま使用された。
1.ポリマーをPBSに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を10mg/mlにすることによって、Pluronic(登録商標)P−123の新鮮な溶液を調製する。
2.フラスコ中に15mg/mlのJeffamine(登録商標)M−2005の重量を量る。
3.アクアポリンZストック溶液を、最終濃度が1/200のAQPZ/ポリマーモルタンパク質比になるように追加する。ここで、ポリマーはPluronic(登録商標)P−123とJeffamine M−2005の合計量である。
4.工程1で調製したPluronic(登録商標)P−123溶液をJeffamine(登録商標)M−2005とAquaporin Zの混合物に追加して、9.9mgにする。
5.室温で、毎分170回転で混合物を一晩攪拌する(20時間以下)。
6.翌朝、手順1〜5の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
BWRO(汽水逆浸透)膜の調製
a)MPDをMilliQ水中に溶解して、2.5%(W/W)濃度にする。以下を参照。
b)TMCをアイソパー中に溶解し、最終濃度を0.15%W/Vにする。
c)長方形の膜(例えば、MPD溶液の約20ml/m2の膜を備えた5.5cm×11cmのメンブラナ1FPH PES膜)をカバーして、穏やかに攪拌しながら30秒間放置する。
d)ラボの乾燥紙(キムワイプなど)で非アクティブな面(裏面)を5〜10秒間乾燥させる。
e)膜をガラスプレート上に置き、表面が光沢から薄暗くなるまでN2で穏やかに乾燥させる。
f)膜の端の周りにテープを貼る(≒1mm)。
g)テープが貼られた膜の付いたガラスプレートをガラスまたは金属製の容器中に入れ、約155ml/m2の膜TMC−Isoparを片方の端に加え、30秒間穏やかに前後に揺り動かす。
h)リザーバーからガラスプレートを取り外し、N2で10〜15秒間乾燥させる。
1.05 gのMPDを量り取り、35mlのMilliQに溶解する。例1で説明したように調製した7mlの液体AQPZ組成物を追加する。不活性ガス(ArまたはN2)をできるだけ多く入れて溶液を保つ。
手作りTFC FO(正浸透)ろ過膜の調製
a)サポート膜を提供する。例えば、指のような構造のPES不織布、サイズ5.5cm×11cm。
b)3wt%MPDを、3wt% ε−カプロラクタム、0.5wt%NMP、93.5wt%DI水と混合して溶液を得る。
c)懸濁液を得るために、0.1mg/mlの実施例1の液体AQPZ製剤を加える。
d)c)の懸濁液を2時間インキュベートする。
e)0.09wt%TMC、0.9wt%アセトン、99.01wt%Isoparから、TMC溶液を調製。
f)懸濁液d)中にサポート膜(支持膜)を30秒間ディップコートする。
G)エアナイフで乾燥させる。
h)界面重合のためにe)からのTMC溶液を追加する。
i)ドラフト内で2分間乾燥する。
3枚の膜を作成し、Sterlitech CF042 ROセル(www.sterlitech.com)に取り付けた。60分間フィードとして500ppm NaClを使用して5barで操作した。
FO(正浸透)膜の調製
真空媒介コーティング
多孔性支持体を、活性層が上を向くように吸引セルに取り付け、真空ポンプをその下に適用し、不活性層に面した。TFC層に使用される支持体は、Membrana GmbHのMicroPES 1F PH微多孔質支持体である。MPDおよび製剤10−2−10を含むRO水溶液50mlを吸引セルに注いで、多孔質支持体を覆った。その後、100ミリバールの吸引力を5分間適用し、MPDおよび製剤を支持体上に吸引した。真空を止め、TMCおよびIsopar−Eを含む50mlの有機溶液を適用し、界面重合を促進するために1分の反応時間を与えた。次に有機溶液を洗い流し、膜を3分間放置して乾燥させ、QCテストの準備ができるまでRO水を入れたペトリ皿に移した。
膜貫通タンパク質を組み込んだアミノ装飾小胞
1.ポリマーをPBSに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を10mg/mlにすることによって、Pluronic(登録商標)P−123の新鮮な溶液を調製する。
2.フラスコ中で重量15mg/ml Jeffamine(登録商標)M−2005を量る。
3.アクアポリンZストック溶液をJeffamine(登録商標)M−2005ボトルに追加して、最終濃度が1/200 AQPZ/P−123−Jeffamineモルタンパク質比になるようにする。
4.工程1で調製したPluronic(登録商標)P−123溶液をJeffamine(登録商標)M−2005とAquaporin Zの混合物に追加して、9.9mg/mlにする。
5.室温で、毎分170回転(20時間以下)で混合物を一晩攪拌する。
6.翌朝、手順1〜5の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
1.ポリマーをPBSに溶解して、ガラスシリンダー内で最終濃度を10mg/mlにすることによって、Pluronic(登録商標)P−123の新鮮な溶液を調製する。
2.フラスコ中で重量15mg/ml Jeffamine(登録商標)M−2005を量る。
4.工程1で調製したPluronic(登録商標)P−123溶液をJeffamine(登録商標)M−2005の混合物に追加して、9.9mg/mlにする。
5.室温で、毎分170回転(20時間以下)で混合物を一晩攪拌する。
6.翌朝、手順1〜5の手順で得られた小胞製剤を取り出し、それを保存フラスコに移して室温に保つ。
小胞の寸法(流体力学的直径)は、ZetaSizer Nano ZS from Malvernを使用した動的光散乱によって決定される。小胞膜を通過する水の流束は、Bio-Logic SFM 300ストップトフロー(SF)デバイスを使用して、517nmのモノクロメーターと530nmのカットオフフィルターを使用してテストされる。個々のSFテストでは、0.13mlのポリマーソームまたはAqpZを埋め込んでいるポリマーソームのサンプルを、0.13mlのNaCl0.5Mとすばやく混合すると、小胞からの水の流出が起こり、小胞の収縮が起こった。
アクアポリンZを再構成する小胞を組み込んだTFC FO膜の調製方法:
a)サポート膜を提供する。例えば、指のような構造のPES不織布、サイズ5.5cm×11cm。
b)MiliQ水中のMPD溶液を調製し、2.5%(W/W)濃度を得る。アクアポリンを膜に組み込む場合は、小胞の溶液を追加する。MPD溶液の最終濃度は、10g/Lから100g/Lの小胞溶液を含むことができる。
c)Isopar E中のTMC溶液を調製し、0.15%(W/V)を得る。
d)MPD溶液中に長方形の膜を浸し、膜の表面を完全に覆う
e)MPD溶液から長方形の膜を移して、ラボの乾燥紙(Kim−Wipeなど)の非アクティブな面になる側を5〜10秒間乾燥させる。
f)膜をガラスプレート上に置き、表面が光沢から薄暗くなるまでN2で穏やかに乾燥させる。
g)膜の端の周りにテープを貼る(≒1mm)。
h)テーピングされた膜のあるガラスプレートをガラスコンテナーに移し、TMC溶液で膜を覆い、膜の表面を完全に覆う
i)リザーバーからガラスプレートを取り外し、表面が光沢に変わり暗くなるまでN2で乾燥させる。
j)膜をガラス板上に水平位置で約10秒間置き、テープをはがする
k)MilliQを満たした最初の容器に5分間膜を移す
l)次の工程で説明する事前のテストのために、膜を2番目にMilliQを満たした容器に移して保管する。
次に、サイズ5.5cm×11cmのアクアポリンZ配合のTFC FO膜を、Sterlitech CF042 FOセル(www.sterlitech.com)にマウントし、供給として脱イオン(MilliQ)水中の5μMのカルセインを使用して、ドローおよび供給として1M NaCl水溶液を使用して、50ml/分のドロー速度を使用して、FOモードで200分間の試験を行った。
Claims (33)
- 膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞であって、小胞形成材料が、ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)およびポリエーテル−アミンの混合物を含む、前記の小胞。
- ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)が、約1,000Daから約15,000Daの間の平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項1に記載の小胞。
- ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ−(エチレングリコール)が、約2,500Daから約10,000Daの間の重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項1または2に記載の小胞。
- ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)が、下記の化学式を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の小胞:
xは10〜30の整数を示す、
yは50〜100の整数を示す、
zは10〜30の整数を示す。 - xは15〜25の整数を示す、
yは60〜80の整数を示す、
zは15〜25の整数を示す、
請求項4に記載の小胞。 - ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、請求項1から5のいずれか一項に記載の小胞:
mは1〜15の整数である、
nは5〜ら50の整数である、
R=CH3である - ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)とポリエーテルアミンとの間の重量比が、5対1である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の小胞。
- 膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項1から7のいずれか一項に記載の小胞。
- 膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の小胞。
- 洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)、オクチルグルコシド(OG)、ドデシルマルトシド(DDM)またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の小胞。
- 膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を調製する方法であって、下記の工程:
a.膜貫通タンパク質とポリエーテルアミンの水溶液を混合すること、
b.水溶液として、ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ−(エチレングリコール)を、工程aで調製された混合物に添加すること、
c.工程bで得られた溶液を攪拌すること、
を含む、前記の方法。 - 7〜9の範囲のpHを有する緩衝液の添加をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 工程cにおける撹拌が12〜16時間継続される、請求項11または12のいずれか一項に記載の方法。
- ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)が、約1,000Daから約15,000Daの平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)が、約2,500Daから約10,000Daの重量平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。。
- ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)が、下記の化学式を有する、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法:
xは10〜30の整数を示す、
yは50〜100の整数を示す、
zは10〜30の整数を示す。 - ポリエーテルアミンが、下記の一般構造のものである、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法:
mは1〜15の整数である、
nは5〜50の整数である、
R=CH3である。 - ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(プロピレングリコール)−ブロック−ポリ(エチレングリコール)とポリエーテルアミンとの間の重量比率が、5対1である、請求項11〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 膜貫通タンパク質が洗浄剤中に可溶化されている、請求項11〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄剤が、ラウリルジメチルアミンN−オキシド(LDAO)、オクチルグルコシド(OG)、ドデシルマルトシド(DDM)またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項11〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の小胞を含む分離膜。
- 分離膜が、小胞を組み込んだ活性層および多孔質支持膜を含む、請求項22に記載の分離膜。
- 活性層が、多孔質基質膜上に形成された薄膜複合層に組み込まれた小胞を含む、請求項22または23のいずれか一項に記載の分離膜。
- 小胞を組み込んだ活性層が、交互積層法により形成される、請求項22に記載の分離膜。
- 多孔質基質膜上に膜貫通タンパク質を組み込んだ小胞を固定化した薄膜複合層を調製する方法であって、下記の工程:
a.請求項11〜21のいずれかに従って調製された小胞およびジアミンまたはトリアミン化合物を含む水溶液を提供すること、
b.工程aの水溶液で多孔性支持膜の表面を覆うこと、
c.ハロゲン化アシル化合物を含む疎水性溶液を適用すること、及び
d.当該水溶液と当該疎水性溶液に界面重合反応を行わせて、薄膜複合層を形成すること、
を含む、前記の方法。 - ジアミン化合物が1,3−ジアミノベンゼンである、請求項26に記載の方法。
- ジアミンまたはトリアミン化合物とハロゲン化アシル化合物との重量比が、重量で0:1〜30:1である、請求項26または27に記載の方法。
- 前記多孔性支持膜が、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンポリマーによって形成される、請求項26から28のいずれか一項に記載の方法。
- 多孔性支持膜が中空繊維である、請求項26から29のいずれか一項に記載の方法。
- ハウジング内に中空繊維の束を組み立てることにより中空繊維モジュールを製造する更なる工程を含み、第1の溶液を通すための入口が、一端で中空繊維の内腔に接続され、出口が、他端で当該内腔に接続され、そして、入口は、ハウジングに接続された出口に第2の溶液を通過させるためにハウジング内に設けられる、請求項30に記載の方法。
- 多孔質支持膜が平坦なシートである、請求項26から31のいずれか一項に記載の方法。
- 平シート膜を巻き付けることによって、らせん巻き膜モジュールを製造する更なる工程を含む、請求項26から32のいずれか一項に記載の方法。
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