WO2019203540A2 - 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생산 방법 - Google Patents

다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중불포화지방산으로부터 멀티-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 신규 효소 및 이를 이용한 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 효소는 다중불포화지방산을 기질로 이용하여 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체를 단 한번의 반응으로 생산해 낼 수 있는바, 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생체 외 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생산 방법
본 발명은 다중불포화지방산로부터 이들의 멀티-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소와 이를 이용하여 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
염증 반응은 병원균의 감염 및 각종 독성물질에 대한 인체의 일차적인 방어 수단으로서 중요한 역할을 하지만, 동시에 다양한 만성질환을 유발하는 기저 요인으로 작용할 수 있기 때문에, 체내의 정교한 조절 기작에 의해 엄격히 조절되어야 하는 생리 현상이다.
오메가-6 다중불포화지방산에 해당하는 아라키돈산(arachidonic acid, C20: 4n-6)의 유도체인 프로스타글란딘(prostaglandin) 혹은 류코트리엔(leukotriene)은 대표적인 염증반응 개시 신호물질로서, 체내에서 다양한 만성질환을 유발할 수 있는 염증반응의 불균형을 유도한다. 일반적으로, 염증반응 반응의 종결은 염증반응 개시 신호물질이 생성되지 않으면, 염증반응은 자연스럽게 종결되는 것으로 인식되어 상기 물질의 생성을 저해하는 다양한 스테로이드 또는 비스테로이드 계열의 항염증 치료제들이 개발되었다. 그러나 최근 염증반응의 종결 기작도 정교한 조절 과정에 의해 이루어지고, 그 과정에 오메가-3 다중불포화지방산 도코사헥사노엔산(docosahexaenoic acid; DHA, C22: 6n-3) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid; EPA, C20: 5n-3)의 수산화 유도체가 상기 염증 반응의 종결 기작에 작용하는 신호물질로서의 역할로 작용할 수 있음이 확인되었다. 이렇게 염증 반응의 종결 기작의 신호물질로 작용하는 것들을 SPM(specialized proresolving mediators; resolvins, protectins, maresins)이라고 명명하였는데, 이들은 기존의 항염증 치료제인 코르티코스테로이드(Corticosteroids) 및 NSAID(non-steroid anti-inflammatory drug) 아스피린에 비해 월등한 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 SPM은 주로 염증 반응 개시 신호물질의 생성 억제를 유도하는 기존의 스테로이드 또는 비스테로이드 계열 항염증 치료제와 달리 염증 반응 전(全)단계에 걸쳐 효능을 보이는 장점이 있다. 이에, 상기 SPM을 이용하여 각종 만성염증 질환(혈관, 심근경색, 뇌졸중, 치매, 골관절염, 천식을 비롯한 폐질환, 위장관염, 치주염, 안구 건조증, 지방간 등 각종 만성염증 질환), 감염 패혈증, 화상, 창상 회복, 통증, 암, 당뇨 등과 같은 다양한 질환에 대해 치료 효능의 존재 여부에 대해 연구가 활발하게 진행 중이다.
한편, 생체 내 염증반응 종결 신호 물질 SPM은 오메가-3 다중불포화지방산에 하이드록시기가 2개 혹은 3개가 삽입된 구조로, 두 가지 이상의 효소들의 연속적인 작용을 통해 매우 극미량 생성되는 것으로 알려져 있다. 이에, 염증반응 종결 신호물질의 효능 및 치료제 개발을 위하여 충분한 SPM을 생성하기 위하여, 유기합성 공정을 통하여 제조하기 위한 노력이 지속되고 있으나(비특허문헌 1 참고), 그 공정이 매우 복잡하다는 한계점이 존재한다.
최근 콩 15-리폭시게나아제(15-lipoxygenase) 효소 또는 감자 리폭시게나아제, 해조류 리폭시게나아제를 이용하여 오메가-3 다중불포화지방산의 모노-하이드록시(mono-hydroxy) 혹은 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체를 생성할 수 있음에 대해 보고되었다(비특허문헌 2 내지 비특허문헌 4 참고).
그러나 위와 같은 효소들 외에도 SPM을 생성할 수 있는 새로운 효소들에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.
(선행기술문헌)
(비특허문헌 1) Ogawa et al., J. Org. Chem., 82(4), 2032-2039 (2017)
(비특허문헌 2) Dobson et al., Journal of Lipid Research, 54, 1439-1447 (2013)
(비특허문헌 3) Butovich et al., Lipids, 40(3), 249-257 (2005)
(비특허문헌 4) Zhu et al., PLOS ONE, 10(2), e0117351 (2015)
본 발명은 다중불포화지방산으로부터 멀티-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소와, 이를 이용하여 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro) 내에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체를 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시(tri-hydroxy) 또는 테트라-하이드록시(tetra-hydroxy) 유도체 생성용 효소를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 또는 상기 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소를 다중불포화지방산, 예컨대 도코사헥사노엔산과 반응시키는 단계를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 또는 상기 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자가 형질도입된 형질전환체를, 다중불포화지방산, 예컨대 도코사헥사노엔산의 존재 하에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 배양물에서 멀티-하이드록시 유도체를 분리하는 단계를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 효소는 다중불포화지방산을 기질로 이용하여, 디-하이드록시, 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 등과 같은 멀티-하이드록시 유도체를 단 한 번의 반응으로 생산해 낼 수 있는바, 멀티-하이드록시 유도체의 생체 외 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K9V_A296G)의 과발현 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K9V)의 과발현 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K9V_A296G)을 리놀레산과 반응시킨 반응 생성물을 대상으로, 순상 HPLC 분석 및 키랄-HPLC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K9V)의 반응 생성물을 대상으로, 순상 HPLC 분석 및 키랄 HPLC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 2a 및 도 2b에서 9R-HODE는 9R-하이드록시-옥타데카디엔산(9R-hydroxy-octadecadienoic acid)을, 13S-HODE는 13S-하이드록시-옥타데카디엔산(13S-hydroxy-octadecadienoic acid)를 각각 의미한다.
도 3a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물을 대상으로 역상 HPLC와 질량분석을 수행하여, 상기 반응 생성물에 존재하는 수산화 유도체를 분석한 결과 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물을 대상으로 역상 HPLC와 질량분석을 수행하여, 상기 반응 생성물에 존재하는 수산화 유도체를 분석한 결과 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 4c 내지 도 4e는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물에 대한 NMR 분석 결과 확인된 유도체들의 화학 구조를 나타낸 것으로서, 도 5a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 디-하이드록시 유도체의 화학 구조식을, 그리고 도 5b는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 모노-하이드록시 유도체의 화학 구조식을 각각 나타낸 것이다. 그리고, 도 5c 내지 도 5e는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물들에 대한 NMR 분석 결과 확인된 유도체들의 화학 구조를 나타낸 것으로서, 도 5c는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 테트라-하이드록시 유도체의 화학 구조식을, 도 5d는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 모노-하이드록시 유도체의 화학 구조식을, 그리고 도 5e는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 디-하이드록시 유도체의 화학 구조식을 각각 나타낸 것이다.
도 6은 대조군인 콩 15-LOX 효소를 도코사헥사노엔산과 반응시킨 반응 생성물을 대상으로 순상 HPLC 분석을 수행하여, 상기 반응 생성물에 존재하는 수산화 유도체를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K9V_A296G) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K9V)에 대하여, 유사한 활성을 갖는 리폭시게나아제 효소인 인간 5LOX, 인간 12LOX, 인간 15LOX, 콩 15LOX, 감자 LOX, 홍조류 PhLOX와 각각 아미노산 서열의 상동성을 분석한 결과를 바탕으로, 계통 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 효소 활성에, pH가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 8b는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 효소 활성에, pH가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 효소 활성에, 온도가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 9b는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 효소 활성에, 온도가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 디-하이드록시 유도체가 암 세포와 암 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 10b는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 트리-하이드록시 유도체가 암 세포와 암 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
1. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소
본 발명의 일 측면은 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서는 다중불포화지방산의 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소, 및 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시(tri-hydroxy) 또는 테트라-하이드록시(tetra-hydroxy) 유도체 생성용 효소, 및 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하고, 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소 및 이들의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 디-하이드록시 유도체 생성용 효소에 포함되는, 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 3의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소에 포함되는, 서열번호 2의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 4의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 역시 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1a 및 도 1b 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 다중불포화지방산에 2개의 수산기가 도입된 디-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였고(도 3a 참고), 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(도 3b 참고).
2. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생성용 효소의 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자, 또는 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자, 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소, 또는 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소를 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자, 또는 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자, 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소, 또는 원래 형태의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 유전자(서열번호 3의 염기서열을 포함하는 유전자)와 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자(서열번호 4의 염기서열을 포함하는 유전자)를 각각 플라스미드 벡터인 pRL2(Seo et al., Biotechnol. Lett., 2009, 31:877-881)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pRL2 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 유도체 생성용 효소 유전자, 또는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자, 또는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 미세조류, 조류(algae), 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자, 또는 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이거나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소, 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.
3. 인 비트로( in vitro )에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법, 보다 구체적으로는 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체의 생산 방법과, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법은 상기 "1. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소 " 항목에서 설명한 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소와 다중불포화지방산을 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 다중불포화지방산은 탄소 간의 이중결합이 3개 이상 포함되어 있는 지방산으로, 바람직하게는 오메가-3 지방산일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도코사헥사노엔산 또는 에이코사펜타엔산일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 이와 같이, 상기 다중불포화지방산을 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 기질로 이용하는 경우, 기질 내 하이드록시기가 도입될 수 있는 이중 결합을 다수 포함하고 있는 바, 디-하이드록시 유도체 생성이 달성될 수 있다. 또한, 상기 다중불포화지방산을 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 기질로 이용하는 경우, 기질 내 하이드록시기가 도입될 수 있는 이중 결합을 다수 포함하고 있는 바, 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성이 달성될 수 있다.
상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 상기 다중불포화지방산을 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소와 다중불포화지방산을 반응시키는 단계는 0℃ 내지 50℃의 온도 범위, 바람직하게는 15℃ 내지 35℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 반응시키는 단계는 pH 4 내지 pH 10의 범위, 바람직하게는 pH 7 내지 pH 9의 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 온도 및 pH의 범위에서 수행하는 경우, 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 상기 다중불포화지방산을 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소의 활성이 최대가 됨으로써 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체나 다중불포화지방산을 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 더욱 효율적으로 생산해 낼 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소로서의 활성을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 20℃ 및 pH 8.0에 가까운 조건에서 최적의 효소 활성을 나타냄을 확인하고(도 8a 및 도 9a 참고), 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소로서의 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 30 ℃ 및 pH 8.0에 가까운 조건에서 최적의 효소 활성을 나타냄을 확인하였다(도 8b 및 도 9b 참고).
본 발명의 상기 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법은, 상기 효소와 다중불포화지방산의 반응물로부터 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 회수하는 단계를 더 포함한다.
상기 회수는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시함으로써 달성될 수 있고, 통상의 방식으로 정제하는 과정을 추가적으로 수행함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 정제하는 과정은 용매 침전, 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합하여 수행할 수 있다.
4. 인 비보( in vivo )에서 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체의 생산 방법
본 발명의 다른 측면은 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법, 보다 구체적으로는 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체의 생산 방법과, 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법은 상기 "2. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생성용 효소의 발현 벡터 및 형질전환체 " 항목에서 설명한 형질전환체를 다중불포화지방산의 존재 하에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 배양물에서 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체에서는 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소가 발현될 수 있기 때문에, 이를 이용하면 다중불포화지방산을 기질로 포함하는 배양 배지에서 배양시킴으로써, 효소를 분리하는 별도의 과정 없이도 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 생산할 수 있다.
상기 형질전환체 내에 존재하는 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생성용 효소에 대해서는 상기 "1. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소" 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 한다.
상기 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코오스를 탄 소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소 칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
5. 도코사헥사노엔산의 신규 멀티-하이드록시 유도체
본 발명의 다른 측면은 도코사헥사노엔산의 신규 멀티-하이드록시 유도체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 도코사헥사노엔산의 신규 멀티-하이드록시 유도체는 도코사헥사노엔산의 13번의 위치와 20번의 위치에 수산기가 도입된 신규 디-하이드록시 유도체일 수 있고, 구체적으로는 하기 화학식 1과 같은 화학 구조를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019004583-appb-I000001
특히, 상기 도코사헥사노엔산의 신규 디-하이드록시 유도체는 도코사헥사노엔산을 본 발명의 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소와 반응시켜 얻어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발며의 다른 구현예에서, 상기 도코사헥사노엔산의 신규 멀티-하이드록시 유도체 중 다른 하나는 도코사헥사노엔산의 7번, 15번, 16번 및 17번의 위치에 수산기가 도입된 신규 테트라-하이드록시 유도체일 수 있고, 구체적으로는 하기 화학식 2와 같은 화학 구조를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019004583-appb-I000002
특히, 상기 도코사헥사노엔산의 신규 테트라-하이드록시 유도체는 도코사헥사노엔산을 본 발명의 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소와 반응시켜 얻어지는 것일 수 있다.
6. 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물
한편, 본 발명의 또 다른 측면은 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물은, 다중불포화지방산을 상기 "1. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소 " 항목에서 설명한 디-하이드록시 유도체 생성용 효소와 반응시켜 얻어지는, 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체를 유효성분으로 포함한다. 또한, 상기 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물은, 상기와 같은 반응 과정에서 생성되는 중간 생성물인 모노-하이드록시 유도체를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물은, 다중불포화지방산을 상기 "1. 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소 " 항목에서 설명한 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소와 반응시켜 얻어지는, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 유도체를 유효성분으로 포함한다. 또한, 상기 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물은, 상기와 같은 반응 과정에서 생성되는 중간 생성물인 모노-하이드록시 유도체나 디-하이드록시 유도체, 또는 상기 트리-하이드록시 유도체와 함께 생성될 수 있는 테트라-하이드록시 유도체를 더 포함할 수 있다.
상기 다중불포화지방산은 탄소 간의 이중결합이 3개 이상 포함되어 있는 지방산으로, 오메가-3 지방산일 수 있으며, 보다 구체적으로는 도코사헥사노엔산 또는 에이코사펜타엔산일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 중에서도, 특히 본 발명의 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 다중불포화지방산과 반응시켜 얻어지는 디-하이드록시 유도체나, 본 발명의 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체 생성용 효소를 다중불포화지방산과 반응시켜 얻어지는 트리-하이드록시 유도체, 또는 이들 모두를 포함하는 조성물은, 암 줄기세포에 특이적으로 작용하여, 그 증식을 억제하는 효과가 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 도코사헥사노엔산을 서열번호 1을 갖는 단백질과 반응하여 얻은 화학식 1의 화학 구조를 갖는 디-하이드록시 유도체를 포함하는 조성물을 인간 유방암 세포와 인간 유방암 유래의 암 줄기세포에 처리한 결과, 인간 유방암 유래의 암 줄기세포에 특이적으로 그 증식이 억제되는 것을 확인하였고(도 10a 참고), 도코사헥사노엔산을 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 반응하여 얻은 트리-하이드록시 유도체를 포함하는 조성물을 인간 유방암 세포와 인간 유방암 유래의 암 줄기세포에 처리한 결과, 인간 유방암 유래의 암 줄기세포에 특이적으로 그 증식이 억제되는 것을 확인하였다(도 10b 참고).
상기 '암'은 일반적으로 비 조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하고, 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다.
상기 '암 줄기세포'는 다양한 암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 상기 암으로는 결장암 및 직장암을 포함하는 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 또는 뇌하수체선종일 수 있고, 특별히 제한되지는 않지만, 상기 암 줄기세포는 유방암 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포인 유방암 줄기세포일 수 있다.
상기 '암 줄기세포 증식 억제'는 암 줄기세포 유지(maintenance) 억제, 암 줄기세포 악성화(malignance) 억제, 암 줄기세포 이동 및 암 줄기세포 침윤활성(invasive) 억제를 포함하는 의미이다.
한편, 상기 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용할 수 있다.
상기 조성물이 약학적 조성물로 활용되는 경우, 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 외에, 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 또는 상기 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 유도체는 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 또는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 유도체와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 디-하이드록시 유도체 또는 트리-하이드록시 유도체, 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 또는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 유도체는 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 또는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 유도체는 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 조성물이 식품 조성물로 이용되는 경우, 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 '기능성 식품'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '건강기능식품'이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 유방암 줄기세포 성장 억제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물에서, 상기 조성물 내의 상기 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체 또는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 유도체는 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다. 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 구체적으로는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 구체적으로는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥글레, 댓잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또한, 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형 상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알코올, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. 생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로카테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다. 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 약 0.0005 중량％ 내지 약 0.5 중량％ 범위를 의미한다. 사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[실시예 1] 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 제조
[1-1] 단백질의 발현용 벡터 제작
서열번호 1의 아미노산을 각각 암호화하는 서열번호 3의 염기 서열과, 서열번호 2의 아미노산을 각각 암호화하는 서열번호 4의 염기 서열을 ㈜바이오니아社에 의뢰하여 합성하였고, 상기 합성된 염기서열을 주형으로 서열번호 5, 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초 동안 전 변형(pre-denaturation) 시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 5분 동안 반응시키는 사이클을 12회 반복하는 PCR을 수행함으로써 상기 서열번호 2의 유전자를 증폭하였다.
단백질 프라이머 염기서열(5'->3') 서열번호
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 정방향 ACTAGTATGGTAGACAATATGAAACCG 5
역방향 ACGCGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATACTGATGCTATTGATTACC 6
상기와 같이 증폭된 서열번호 3의 염기 서열과 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을 각각 플라스미드 벡터 pRL2(Seo et al., Biotechnol. Lett., 2009, 31:877-881)에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(Solgent)을 통해 상기 서열번호 3의 염기 서열과 서열번호 4의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였다.
[1-2] 단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 제조된 재조합 발현 벡터를 대장균 DH5a에 형질전환하고, 형질전환체를 3 ㎖의 LB 배지에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃에서 종균 배양하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액을 500 ㎖의 LB 배지에 첨가하여 24시간 동안 본 배양을 실시하였다.
상기와 같은 본 배양에 의해 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하고, 상등액을 분리해 낸 펠릿에서 형질전환체의 세포를 파쇄하여 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)을 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 대상으로 SDS-PAGE를 수행한 결과, 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 약 65 KDa의 크기를 갖는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현된 것을 확인하였다(도 1a 및 도 1b 참고).
상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되어 있는 것으로 확인된 세포 용해물을 대상으로, Ni-NTA 흡착 크로마토그래피를 이용하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고, 상기와 같이 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되어 있는 것으로 확인된 세포 용해물을 대상으로, Ni-NTA 흡착 크로마토그래피를 이용하여, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였다.
[실시예 2] 단백질의 활성 확인
[2-1] 수산화 활성의 확인
상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 각각에 대하여, 상기 단백질 10 KU/ml 와 리놀레산 100 μM을 pH 7, 실온에서 30분 동안 반응시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/ml의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다.
고체상 카트리지(SPE, C18 500mg)를 이용하여 상기 반응 산물을 정제한 뒤, 순상 HPLC(Normal phase HPLC) 및 키랄 HPLC(Chiral HPLC)를 이용하여 상기 반응 생성물 내의 화합물의 종류를 분석하였다.
구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 생성된 반응 생성물 내의 화합물에 대한 순상 HPLC 분석은 supelcosil LC-Diol컬럼(Supelco, 25 cm × 3 mm, 5 ㎛)에, 94.8% n-헵탄, 5% 이소프로판올, 0.1% 아세트산, 0.1% 2,2-디메톡시프로판으로 구성된 이동상을 유량 0.5ml/min의 속도로, 40분 동안 20 ㎖ 전개하였으며, DAD(Diode Array Detector)를 이용하여 반응 산물 내의 화합물을 최종적으로 검출하는 방법으로 수행되었고, 키랄-HPLC 분석은 supelcosil LC-Diol 컬럼(Supelco, 25 cm × 3 mm, 5 ㎛)에, 94.9% n-헵탄, 5% 이소프로판올, 0.1% 아세트산, 0.1% 2,2-디메톡시프로판으로 구성된 이동상을 유량 0.5㎖/min의 속도로, 40분 동안 40 ㎖ 전개시켰으며, DAD(Diode Array Detector)를 이용하여 반응 산물 내의 화합물을 최종적으로 분석하는 방법으로 수행되었다.
그리고 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 생성된 반응 생성물 내의 화합물에 대한 순상 HPLC 분석은supelcosil LC-Diol컬럼(Supelco, 25 cm X 3 mm, 5 ㎛)에, 95 % n-헵탄, 5 % 이소프로판올, 0.1 % 아세트산, 0.1 % 2,2-디메톡시프로판으로 구성된 이동상을 유량 0.5 ml/min의 속도로, 40분 동안 20 ml 전개시켰으며, DAD(Diode Array Detector)를 이용하여 반응 산물 내의 화합물을 최종적으로 검출하는 방법으로 수행되었고, 키랄 HPLC 분석은 supelcosil LC-Diol 컬럼(Supelco, 25 cm ×× 3 mm, 5 ㎛)에, 95 % n-헵탄, 5% 이소프로판올, 0.1% 아세트산, 0.1% 2,2-디메톡시프로판으로 구성된 이동상을 유량 0.5 ml/min의 속도로, 40분 동안 20 ml 전개시켰으며, DAD(Diode Array Detector)를 이용하여 반응 산물 내의 화합물을 최종적으로 분석하는 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 2a에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 생성된 반응 생성물에 대해서는, 순상 HPLC 및 키랄 HPLC 모두에서 9R-하이드록시-옥타데카디엔산(9R-hydroxy-octadecadienoic acid, 9R-HODE) 및 13S-하이드록시-옥타데카디엔산(13S-hydroxy-octadecadienoic acid, 13S-HODE)을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2b에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 생성된 반응 생성물에 대해서는, 순상 HPLC 및 키랄 HPLC 모두에서 13S-하이드록시-옥타도데카디엔산(13S-hydroxy-octadecadienoic acid; 13S-HODE)와 동일한 피크가 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 리놀레산을 9R-하이드록시-옥타데카디엔산과 13S-하이드록시-옥타데카디엔산으로 수산화시킬 수 있는 활성을 가지고 있고, 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 리놀레산을 13-하이드록시-옥타도데카디엔산으로 수산화시킬 수 있는 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.
[2-2] 멀티-하이드록시 유도체 생성 활성의 확인
상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대하여, 상기 단백질 단백질 2, 6, 10 KU/ml과 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA) 100 μM을 pH 7, 실온에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/㎖의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시킨 후 반응 생성물 내의 화합물의 종류를 분석하였다.
그 결과, 도 3a에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 DHA에, 1개의 수산기가 도입된 모노-하이드록시 유도체뿐만 아니라, 2개의 수산기가 도입된 디-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 것으로 확인되었다.
그리고 상기 반응 생성물들을 대상으로 NMR 분석을 수행하였다. 구체적으로, 도코엑사노엔산으로부터 전환된 모노- 또는 디-하이드록시 유도체는 C, O, H로 이루어진 유기물로서, 이 화학종들 간의 chemical shift 값을 측정하여 구조를 분석하기 위해 800MHz NMR (Bruker)을 사용하였다. NMR 측정 용매로는 수소가 중수소(deuterium)로 치환되어 있는 D4-메탄올을 사용하였으며, 절대온도 298K에서 측정하였다. 1D NMR(1H, 13C), 2D NMR (1H-1H COSY, Edited-QC, HMBC, TOCSY, ROESY)법을 사용하여 위와 같은 모노- 또는 디-하이드록시 유도체를 구성하고 있는 수소와 탄소를 측정하였다(도 4a 및 도 4b).
그 결과 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 DHA의 13번 위치와 20번 위치에 수산기를 도입하여 디-하이드록시 유도체(도 5a)를 생성한 것으로 확인되었고, 그 과정에서 중간 생성물로서 13번 위치에 수산기가 도입된 모노-하이드록시 유도체(도 5b)도 함께 존재하는 것으로 확인되었다.
상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대하여, 이 단백질 2, 6, 10 KU/ml과 도코사헥사노엔산(docosahexaenoic acid; DHA) 100 μM을 pH 7, 실온에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/ml의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시킨 후 반응 생성물 내의 화합물의 종류를 분석하였다.
그 결과, 도 3b에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 DHA에, 1개의 수산기가 도입된 모노-하이드록시 유도체, 2개의 수산기가 도입된 디-하이드록시 유도체뿐만 아니라, 3개의 수산기가 도입된 트리-하이드록시 유도체와 4개의 수산기가 도입된 테트라-하이드록시 유도체까지도 생성할 수 있는 것으로 확인되었다.
그리고 상기 반응 생성물들을 대상으로 NMR 분석을 수행하였다. 구체적으로, 도코헥사노엔산으로부터 전환된 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-하이드록시 유도체는 C, O, H로 이루어진 유기물로서, 이 화학종들 간의 chemical shift 값을 측정하여 구조를 분석하기 위해 800MHz NMR (Bruker)을 사용하였다. NMR 측정 용매로는 수소가 중수소(deuterium)로 치환되어 있는 D4-메탄올을 사용하였으며, 절대온도 298K에서 측정하였다. 1D NMR(1H, 13C), 2D NMR (1H-1H COSY, Edited-QC, HMBC, TOCSY, ROESY)법을 사용하여 위와 같은 모노-, 디- 또는 테트라-하이드록시 유도체를 구성하고 있는 수소와 탄소를 측정하였다(도 4c 내지 도 4e).
그 결과 도 5c 내지 도 5e에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 DHA의 7번, 15번, 16번 및 17번의 위치에 수산기를 도입하여 테트라-하이드록시 유도체(도 5c)를 생성하는 것으로 확인되었고, 그 과정에서 중간 생성물로서 17번 위치에 수산기가 도입된 모노-하이드록시 유도체(도 5d)와 7번과 17번 위치에 수산기가 도입된 디-하이드록시 유도체(도 5e)도 함께 존재하는 것으로 확인되었다.
그에 반해, 콩 15LOX의 경우에는, 도 6에 도시된 바와 같이, 도코사헥사노엔산에 1개 또는 2개의 수산기만을 도입할 수 있을 뿐이고, 3개 또는 4개의 수산기가 도입된 유도체는 생성하지 못하는 것으로 확인되었다.
[실시예 3] 단백질의 아미노산 서열 분석
상기 실시예 2에서 효소로서의 활성이 확인된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 대상으로, 비슷한 활성을 가지고 있는 리폭시게나아제 효소인 인간 12LOX, 인간 15LOX, 인간 5LOX, 감자 LOX, 콩 15LOX 및 홍조류 PhLOX와 대비하여, 아미노산 서열의 상동성 분석 및 계통 분석을 수행하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 콩 15LOX와 21%; 인간 5LOX와 26%; 인간 12LOX와 23%; 인간 15LOX와 25%; 감자 LOX와 23%; 홍조류 PhLOX와 21%;의 서열 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다. 그리고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 콩 15LOX와 21%; 인간 5LOX와 26%; 인간 15LOX와 25%; 감자 LOX와 23%; 홍조류 PhLOX와 21%;의 서열 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다. 그리고 이를 바탕으로 계통 분석을 해 본 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 도 7에 도시된 바와 같이 상기 인간 15LOX, 인간 5LOX, 감자 LOX, 콩 15LOX 및 홍조류 PhLOX 등과는 전혀 다른 계통인 것으로 분류되었다.
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에서는 막지질과의 결합을 수행하는 N-말단 영역이 결실되어 있는 반면, C-말단 영역은 일반적인 리폭시게나아제와 높은 유사성을 보이는 것으로 확인되었는데, 철 이온과 결합하는 잔기인 His, His, His 및 Asn/Ser, 말단 아미노산이 존재하였고, 효소의 수산화 특성과 밀접하게 관계가 있는 Ala 이 존재하는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 2차 구조를 분석한 결과, α-헬릭스, 확장된 가닥 및 랜덤 코일이 각각 아래 표 2에 기재된 바와 같은 비율로 존재하는 것으로 확인되었다.
효소 2차 구조 비율
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 α-헬릭스 41.68%
확장된 가닥 6.66%
랜덤 코일 51.66%
한편, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에서는 막지질과의 결합을 수행하는 N-말단 영역이 결실되어 있음을 확인하였다. 반면, 상기 C-말단 영역에서는 철 이온과 결합하는 잔기인 His, His, His 및 Asn/Ser, 말단 아미노산이 존재하였고, 효소의 수산화 특성과 밀접하게 관계가 있는 Ala이 존재하는 것으로 확인되었다.또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 2차 구조를 분석한 결과, α-헬릭스, 확장된 가닥 및 랜덤 코일이 각각 아래 표 3에 기재된 바와 같은 비율로 존재하는 것으로 확인되었다.
효소 2차 구조 비율
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 α-헬릭스 41.68%
확장된 가닥 6.66%
랜덤 코일 51.66%
[실시예 4] 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건 확인
상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 대상으로, 각각의 단백질들이 갖는 효소 활성에 영향을 미치는 조건들을 확인하였다.
[4-1] pH의 영향
pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 10 KU/ml와 리놀레산 100 μM을 pH 7 내지 pH 11, 25℃의 온도에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/㎖의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다. 이때, 상기 pH 7.0의 경우 50mM 인산 나트륨 완충용액(Sodium phosphate buffer), pH 8.0의 경우 50mM Tris-HCl 완충용액 및 pH 9.0 내지 pH 11.0의 경우 50 mM 붕산 나트륨 완충용액(Sodium borate buffer)를 각각 이용하였다.
그리고 상기 실시예 [3-1]에서와 동일한 방식으로 상기 반응 생성물 내의 존재하는 13S-하이드록시-옥타데카디엔산의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 도 8a에 도시된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 pH 8.0에 가까울수록 그 효소 활성이 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 10 KU/ml와 리놀레산 100 μM을 pH 6 내지 pH 11, 25 ℃의 온도에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/ml의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다. 이때, 상기 pH 7.0의 경우 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(Sodium phosphate buffer), pH 8.0의 경우 50 mM Tris-HCl 버퍼 및 pH 9.0 내지 pH 11.0의 경우 50 mM 소디움 보레이트 버퍼(Sodium borate buffer)를 각각 이용하였다.
그리고 상기 실시예 [3-1]에서와 동일한 방식으로 상기 반응 생성물 내의 존재하는 13S-하이드록시-옥타도데카디엔산의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 도 8b에 도시된 바와 같이, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 pH 8.0에 가까울수록 더욱 그 효소 활성이 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
[4-2] 온도의 영향
온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 50KU와 리놀레산 100 μM을 pH 7, 20℃ 내지 50℃의 온도에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/㎖의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다.
그리고 상기 실시예 [3-1]에서와 동일한 방식으로 상기 반응 생성물 내의 존재하는 13S-하이드록시-옥타데카디엔산의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 도 9a에 도시된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 20℃에 가까울수록 그 효소 활성이 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 10 KU/ml 와 리놀레산 100 μM을 pH 7, 20 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/ml의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다.
그리고 상기 실시예 [3-1]에서와 동일한 방식으로 상기 반응 생성물 내의 존재하는 13S-하이드록시-옥타도데카디엔산의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 도 9b에 도시된 바와 같이, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 30 ℃에 가까울수록 그 효소 활성이 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
[4-3] 최적의 조건에서 반응속도
상기 [4-1] 및 [4-2]에서 확인한 최적의 조건에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 K m 및 K cat 값을 조사하였다. 즉, 서열번호 1의 아미노산을 갖는 단백질을 pH 8.0 및 20℃의 환경에서 반응을 진행하였고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대하여 pH 7.0 및 30 ℃의 환경에서 반응을 진행하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
단백질 Km(μM) Kcat(min-1)
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 46.82 ± 1.0 23.52 ± 1.0
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 79.43 ± 0.8 0.4 ± 0.02
[실시예 5] 본 발명의 단백질의 효소 활성에 의해 생성된 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 암 줄기세포 증식 억제 효과 확인
상기 실시예 [3-2]에서 도코사헥사엔산을 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 수산화시켜 얻어진 디-하이드록시 유도체와, 도코사헥사노엔산을 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 수산화시켜 얻어진 트리-하이드록시 유도체를, 각각 분리 및 정제하여, 인간 유방암 세포와 인간 유방암 유래의 암 줄기세포에 처리하여 그 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 먼저, 인간 유방암 세포 MDA-MB-231(ATCC)를 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone사), 100U/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 10 cm 배양 접시에서 세포수 1x106의 밀도로 배양하였다(이산화탄소 5%, 37도).
4 ㎍/㎖의 헤파린, 0.48 ㎍/㎖의 하이드로코르티손, 100 U/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 첨가된 Complete MammoCultTM 배지(StemCell Technologies, 캐나다) 2 ㎖를 함유하는 ultra-low attachment 6-well plate에서 인간 유방암 세포 MDA-MB-231를 세포수 0.5~1×104의 밀도로 배양하여(이산화탄소 5%, 37도), 인간 유방암 유래의 암 줄기세포 맘모스페어(mammospheres)를 형성하였다.
상기와 같이 얻어진 인간 유방암 세포 MDA-MB-231와 인간 유방암 세포 유래의 암 줄기세포 맘모스페어에, 상기 실시예 [3-2]에서 도코사헥사엔산을 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 수산화시켜 얻어진 디-하이드록시 유도체, 또는 도코사헥사노엔산을 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 수산화시켜 얻어진 트리-하이드록시 유도체 각각을, 0~60 μM의 농도로 처리하여 세포의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 10a에서 보인 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 도코사헥사엔산을 수산화시켜 얻은 디-하이드록시 유도체에 의해, 유방암 유래의 암 줄기세포인 맘모스페어는 그 증식이 억제되는데 반해, 동일 농도의 디-하이드록시 유도체임에도 불구하고 유방암 세포의 증식에는 아무런 영향이 없는 것으로 확인되었다. 그리고, 도 10b에서 보인 바와 같이, 40 μM 이상의 농도에서, 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로 도코사헥사엔산을 수산화시켜 얻은 트리-하이드록시 유도체에 의해, 유방암 유래의 암 줄기세포인 맘모스페어는 그 증식이 억제되는데 반해, 동일 농도의 트리-하이드록시 유도체에도 불구하고 유방암 세포의 증식에는 아무런 영향이 없는 것으로 확인되었다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소.
  2. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 멀티-하이드록시 유도체는 디-하이드록시 유도체인, 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소.
  3. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 멀티-하이드록시 유도체는 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체인, 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소는 기질이 도코사헥사노엔산(DHA) 또는 에이코사펜타엔산(EPA)인, 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시(multi-hydroxy) 유도체 생성용 효소.
  5. 청구항 1의 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 3의 염기 서열, 또는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 유전자.
  7. 청구항 5의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  8. 청구항 7의 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  9. 청구항 1의 효소를 다중불포화지방산과 반응시키는 단계;를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 효소와 다중불포화지방산의 반응물로부터 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 회수하는 단계;를 더 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 반응은 0℃ 내지 50℃ 및 pH 4 내지 pH 10의 조건에서 진행하는, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법.
  12. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중불포화지방산은 도코사헥사노엔산(DHA) 또는 에이코사펜타엔산(EPA)인, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법.
  13. 청구항 8의 형질전환체를 다중불포화지방산의 존재 하에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 배양물에서 다중불포화지방산의 디-하이드록시 유도체나, 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시 유도체를 분리하는 단계;를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 다중불포화지방산은 도코사헥사노엔산(DHA) 또는 에이코사펜타엔산(EPA)인, 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 멀티-하이드록시 유도체의 생산 방법.
  15. 화학식 1의 화학 구조를 갖는 도코사헥사노엔산의 디-하이드록시 유도체:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019004583-appb-I000003
    .
  16. 화학식 2의 화학 구조를 갖는 도코사헥사노엔산의 테트라-하이드록시 유도체:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019004583-appb-I000004
    .
  17. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소에 의해 생성되는 다중불포화지방산의 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시 또는 테트라-하이드록시(tetra-hydroxy) 유도체 생성용 효소에 의해 생성되는 다중불포화지방산의 트리-하이드록시(tri-hydroxy) 유도체 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 다중불포화지방산은 도코사헥사노엔산(DHA)인, 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물.
  19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    상기 암 줄기세포는 인간 유방암 유래인, 암 줄기세포의 증식 억제용 조성물.
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