JP2024029151A - 多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】多価不飽和脂肪酸からマルチヒドロキシ誘導体を生成することができる新規酵素、及びこれを用いた多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。【効果】本発明酵素は、多価不飽和脂肪酸を基質として用いて、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体をただ1度の反応で生産することができるので、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生体外生産に非常に有用に用いられ得る。【選択図】図3a
Description
本発明は、多価不飽和脂肪酸からこれらのマルチヒドロキシ誘導体を生成できる酵素と、これを用いて多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体を生産する方法に関する。
炎症反応は、病原菌の感染及び各種毒性物質に対する人体の一次的な防御手段として重要な役割をするが、同時に多様な慢性疾患を誘発する基底要因として作用することがあるので、体内の精巧な調節機作により厳格に調節されなければならない生理現象である。
オメガ-6多価不飽和脂肪酸に該当するアラキドン酸(arachidonic acid、C20:4n-6)の誘導体であるプロスタグランジン(prostaglandin)あるいはロイコトリエン(leukotriene)は、代表的な炎症反応開始信号物質であって、体内で多様な慢性疾患を誘発し得る炎症反応の不均衡を誘導する。一般的に、炎症反応の反応の終結は、炎症反応開始信号物質が生成されなければ、炎症反応は自然に終結されるものと認識され、前記物質の生成を阻害する多様なステロイドまたは非ステロイド系列の抗炎症治療剤が開発された。しかし、最近、炎症反応の終結機作も精巧な調節過程によりなされ、その過程にオメガ-3多価不飽和脂肪酸ドコサヘキサエン酸(docosahexaenoic acid;DHA、C22:6n-3)及びエイコサペンタエン酸(eicosapentaenoic acid;EPA、C20:5n-3)の水酸化誘導体が前記炎症反応の終結機作に作用する信号物質としての役割に作用できることが確認された。このように炎症反応の終結機作の信号物質として作用するものをSPM(specialized proresolving mediators;resolvins、protectins、maresins)と名付けたが、これらは既存の抗炎症治療剤であるコルチコステロイド (Corticosteroids)及
びNSAID(non-steroid anti-inflammatory drug)アスピリンに比べて数段の効果を発揮するものと確認された。
びNSAID(non-steroid anti-inflammatory drug)アスピリンに比べて数段の効果を発揮するものと確認された。
また、前記SPMは、主に炎症反応開始信号物質の生成抑制を誘導する既存のステロイドまたは非ステロイド系列抗炎症治療剤と異なり、炎症反応の前段階にわたり効能を示すという長所がある。よって、前記SPMを用いて、各種の慢性炎症疾患(血管、心筋梗塞、脳卒中、痴呆、骨関節炎、喘息を含めた肺疾患、胃腸肝炎、歯周炎、ドライアイ、脂肪肝などの各種慢性炎症疾患)、感染敗血症、火傷、創傷回復、痛症、癌、糖尿などのような多様な疾患について治療効能の存在可否に対する研究が活発に進められている。
一方、生体内の炎症反応終結信号物質SPMは、オメガ-3多価不飽和脂肪酸にヒドロキシ基が2個あるいは3個が挿入された構造であって、2つ以上の酵素の連続的な作用を介して非常に極微量生成されるものと知られている。よって、炎症反応終結信号物質の効能及び治療剤開発のために十分なSPMを生成するため、有機合成の工程を介して製造するための努力が持続されているが(非特許文献1参考)、その工程が非常に複雑であるという限界点が存在する。
最近、大豆15-リポキシゲナーゼ(15-lipoxygenase)酵素またはジャガイモリポキシゲナーゼ、海藻類リポキシゲナーゼを用いてオメガ-3多価不飽和脂肪酸のモノヒドロキシ(mono-hydroxy)あるいはジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体を生成することができることに対して報告された(非特許文献2から非特許文献4参考)。
しかし、前記のような酵素の他にも、SPMを生成することができる新たな酵素に対する研究が持続的に進められている。
Ogawa et al., J.Org. Chem.,82(4), 2032-2039(2017)
Dobson et al., Journal of Lipid Research,54, 1439-1447(2013)
Butovich et al., Lipids、40(3), 249-257(2005)
Zhu et al., PLOS ONE,10(2),e0117351(2015)
本発明は、多価不飽和脂肪酸からマルチヒドロキシ誘導体を生成できる酵素と、これを用いてインビボ(in vivo)またはインビトロ(in vitro)内で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体を生産することができる方法を提供する。
前記目的を達成するために、本発明の一側面は、配列番号1のアミノ酸配列を含む多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体生成用酵素を提供する。
また、本発明の他の側面は、配列番号2のアミノ酸配列を含む多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ(tri-hydroxy)またはテトラヒドロキシ(tetra-hydroxy)誘導体生成用酵素を提供する。
また、本発明のまた他の側面は、前記ジヒドロキシ誘導体生成用酵素または前記トリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素を多価不飽和脂肪酸、例えば、ドコサヘキサエン酸と反応させる段階を含む、インビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。
また、本発明のまた他の側面は、前記ジヒドロキシ誘導体生成用酵素または前記トリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子が形質導入された形質転換体を、多価不飽和脂肪酸、例えば、ドコサヘキサエン酸の存在下で培養する段階及び前記培養された培養物からマルチヒドロキシ誘導体を分離する段階を含む、インビボ(in vivo)におけるマルチヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。
本発明の酵素は、多価不飽和脂肪酸を基質として用いて、ジヒドロキシ、トリヒドロキシまたはテトラヒドロキシなどのようなマルチヒドロキシ誘導体をたった1度の反応で生産することができるところ、マルチヒドロキシ誘導体の生体外生産に非常に有用に用いられ得る。
但し、本発明の効果は、前記で言及した効果に制限されず、言及されなかったまた他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解されるべきである。
以下本発明を具体的に説明する。
1.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素
本発明の一側面は、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素を提供する。
本発明の一側面は、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素を提供する。
本発明の一具現形態では、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体生成用酵素、及び前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子を提供する。
また、本発明の他の具現形態としては、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ(tri-hydroxy)またはテトラヒドロキシ(tetra-hydroxy)誘導体生成用酵素、及び前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子を提供する。
本発明の前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素は、配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素は、配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素または前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の機能に影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換またはこれらの組み合わせにより異なる配列を有するアミノ酸の変異体、または断片であってよい。前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素または前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチド水準でのアミノ酸交換は当該分野に公知されている。場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)などに変形されてよい。したがって、本発明は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質及びこの変異体ま
たはこの活性断片を含む。前記実質的に同一のタンパク質とは、90%以上、好ましくは93%以上、最も好ましくは95%以上のアミノ酸配列の相同性を有するものなどを意味するが、これに限定されず、90%以上のアミノ酸配列の相同性を有して同一の酵素活性を有するのであれば本発明の範囲に含まれる。
たはこの活性断片を含む。前記実質的に同一のタンパク質とは、90%以上、好ましくは93%以上、最も好ましくは95%以上のアミノ酸配列の相同性を有するものなどを意味するが、これに限定されず、90%以上のアミノ酸配列の相同性を有して同一の酵素活性を有するのであれば本発明の範囲に含まれる。
前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子は、配列番号3の塩基配列からなるのが好ましく、前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子は、配列番号4の塩基配列からなるのが好ましい。しかし、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素及びこれらの変異体またはこの活性断片を暗号化する遺伝子は、暗号化領域から発現される前記酵素及びこの変異体またはこの活性断片のアミノ酸配列を変化させない範囲内で暗号化領域に多様な変形がなされてもよく、暗号化領域を除外した部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変異がなされてもよく、このような変異遺伝子もやはり本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明は、配列番号3または配列番号4の遺伝子と実質的に同一の塩基配列からなる遺伝子及び前記遺伝子の断片を含む。前記実質的に同一の塩基配列からなる遺伝子とは、80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは5%以上の配列相同性を有するものなどを意味するが、これに限定されるのではなく、80%以上の配列相同性を有して暗号化されたタンパク質が同一の酵素活性を有するのであれば本発明に含まれる。前記のように、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子は、これと同等な活性を有するタンパク質を暗号化することができる限り、1つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせにより変異されてよく、これらもまた本発明の範囲に含まれる。
前記ジヒドロキシ誘導体生成用酵素に含まれる、配列番号1のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号3の塩基配列からなる遺伝子により暗号化されるが、本発明はこれに限定されず、同一のアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質を暗号化することができる限り、配列番号3の塩基配列と実質的に同一の他の塩基配列からなる遺伝子により暗号化されてもよい。このような塩基配列は、一本鎖または二本鎖であってよく、DNA分子またはRNA分子であってよい。
前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素に含まれる、配列番号2のアミノ酸配列は好ましくは配列番号4の塩基配列からなる遺伝子により暗号化されるが、本発明はこれに限定されず、同一のアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質を暗号化することができる限り、配列番号4の塩基配列と実質的に同一の他の塩基配列からなる遺伝子により暗号化されてもよい。このような塩基配列はまた一本鎖または二本鎖であってよく、DNA分子またはRNA分子であってよい。
本発明の具体的な実施形態で、本発明者らは、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を究明するために、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質を分離及び精製し(図1a及び図1b参考)、その活性を研究した結果、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質が多価不飽和脂肪酸に2個の水酸基が導入されたジヒドロキシ誘導体を生成できる酵素としての活性を有するということを確認し(図3a参考)、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質が多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を生成できる酵素としての活性を有するということを確認した(図3b参考)。
2.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体生成用酵素の発現ベクター及び形質転換
体
本発明のまた他の側面は、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子、または本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子が含まれた組換え発現ベクター及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
体
本発明のまた他の側面は、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子、または本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子が含まれた組換え発現ベクター及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
本発明の組換え発現ベクターは、前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子、または、前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子を含む。
前記発現ベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに限定されない。
前記組換え発現ベクターは、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素、または本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素を生産しようとする宿主細胞の種類により、プロモーター(promoter)、ターミネーター(terminator)、エンハンサー(enhancer)などのような発現調節配列、または分泌のための配列などを適切に目的により組み合わせることができる。
前記発現ベクターは、ベクターが導入された宿主細胞を選択するための選択マーカーをさらに含んでよく、複製可能な発現ベクターである場合、複製起点を含んでよい。
また、前記組換え発現ベクターは、発現タンパク質の精製を容易に行うための配列を含んでよく、具体的に、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子、または本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子に作動可能なように分離精製用タグを暗号化する遺伝子が連結されてよい。このとき、前記分離精製用タグは、GST、poly-Arg、FLAG、ヒスチジンタグ(His-tag)及びc-mycなどが単独で用いられるか、これらのうち2つ以上を順次に連結して用いられてもよい。
前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子または前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子は、制限酵素切断位置を介してクローニングされてよく、前記ベクターにタンパク質切断酵素認識部位を暗号化する遺伝子が用いられた場合には、前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子、または前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子とフレームが合うように(in frame)連結され、前記酵素を収得した後、タンパク質切断酵素で切断時、本来の形態の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素、または本来の形態の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素が生産されるようにできる。
本発明の具体的な実施形態では、本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素遺伝子(配列番号3の塩基配列を含む遺伝子)と本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子(配列番号4の塩基配列を含む遺伝子)をそれぞれプラスミドベクターであるpRL2(Seo et al.,Biotechnol. Lett.,2009、31:877-881)に挿入することで組換えクローニングベクターを製造した。前記クローニングベクターの製造に用いられたpRL2以外にも多様な原核細胞用ベクターまたは真核細胞用(pPIC及びpPICZなど)ベクターが知られているので、発現の目的により前記ベクター以外の多様な発現ベクターを用いることができる。
本発明の前記組換え発現ベクターは、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素遺伝子、または多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子が含まれており、これを生産することができるベクターとして有用に用いられ得る。
また、本発明の形質転換体には、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子、または多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子を含む組換え発現ベクターが導入される。
本発明による前記組換え発現ベクターを、発現の目的によりバクテリア、酵母、大膓菌、真菌類、微細藻類、藻類(algae)、植物細胞及び動物細胞からなる群から選択されるいずれか1つの適切な宿主細胞に形質転換させることにより形質転換体を製造することができる。例えば、前記宿主細胞は、大膓菌(E.coli BL21(DE3)、DH5αなど)または酵母細胞 (Saccharomyces属、Pichia属など)などであってよい。このとき、宿主細胞の種類により適切な培養方法及び培地要件などは当該分野の公知技術から当業者が容易に選択することができる。
本発明の形質転換体の製造のための組換え発現ベクターの導入方法は、公知の技術、すなわち、熱衝撃法、電気衝撃法などを用いてよい。
本発明の具体的な実施形態で、大膓菌を宿主細胞として本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子、または本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の遺伝子を含む組換え発現ベクターを大膓菌に形質転換させて形質転換体を製造した。
前記形質転換体から発現されたタンパク質は、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素の活性を有する新規の配列のタンパク質であるか、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の活性を有する新規の配列のタンパク質なので、前記形質転換体を大量培養して前記遺伝子を発現させることにより、前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素、または前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の大量生産を容易に行える。
3.インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法
本発明のまた他の側面は、インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法、より具体的には、インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体の生産方法と、インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。
本発明のまた他の側面は、インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法、より具体的には、インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体の生産方法と、インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。
本発明のインビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法は、前記「1.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素」項目で説明した多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素と多価不飽和脂肪酸を反応させる段階を含む。前記多価不飽和脂肪酸は、炭素間の二重結合が3個以上含まれている脂肪酸であって、好ましくはオメガ-3脂肪酸であってよく、さらに好ましくはドコサヘキサエン酸またはエイコサペンタエン酸であってよいが、これに限定されない。このように、前記多価不飽和脂肪酸をジヒドロキシ誘導体生成用酵素の基質として用いる場合、基質内のヒドロキシ基が導入され得る二重結合を多数含んで
いるので、ジヒドロキシ誘導体の生成が達成され得る。また、前記多価不飽和脂肪酸をトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の基質として用いる場合、基質内のヒドロキシ基が導入され得る二重結合を多数含んでいるので、トリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体の生成が達成され得る。
いるので、ジヒドロキシ誘導体の生成が達成され得る。また、前記多価不飽和脂肪酸をトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の基質として用いる場合、基質内のヒドロキシ基が導入され得る二重結合を多数含んでいるので、トリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体の生成が達成され得る。
前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、前記多価不飽和脂肪酸をトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素と多価不飽和脂肪酸を反応させる段階は、0℃から50℃の温度範囲、好ましくは15℃から35℃の温度範囲で行われてよいが、これに限定されない。また、前記反応させる段階は、pH4からpH10の範囲、好ましくはpH7からpH9の範囲で行われてよいが、これに限定されない。前記温度及びpHの範囲で行われる場合、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、前記多価不飽和脂肪酸をトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素の活性が最大になることで多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や多価不飽和脂肪酸をトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体をさらに効率的に生産することができる。
本発明の具体的な実施形態では、前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素としての活性を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質は、20℃及びpH8.0に近い条件で最適の酵素活性を示すことを確認し(図8a及び図9a参考)、前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素としての活性を有する配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質は、30℃及びpH8.0に近い条件で最適の酵素活性を示すことを確認した(図8b及び図9b参考)。
本発明の前記インビトロ(in vitro)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法は、前記酵素と多価不飽和脂肪酸の反応物から多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を回収する段階をさらに含む。
前記回収は、遠心分離、濾過など当該分野で通常行われる方法を実施することにより達成されてよく、通常の方式に精製する過程をさらに行うことで達成されてよい。例えば、前記精製する過程は、溶媒沈澱、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーなどの技法を単独または組み合わせて行われてよい。
4.インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体の生産方法
本発明の他の側面は、インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法、より具体的には、インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体の生産方法と、インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。
本発明の他の側面は、インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法、より具体的には、インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体の生産方法と、インビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体の生産方法を提供する。
本発明のインビボ(in vivo)での多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法は、前記「2.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体生成用酵素の発現ベクター及び形質転換体」の項目で説明した形質転換体を多価不飽和脂肪酸の存在下で培養する段階、及び前記培養された培養物から多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を分離する段階を含む。
前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を暗号化する遺伝子が含まれた組換え発現ベクターが導入された形質転換体では、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素が発現し得るため、これを用いれば多価不飽和脂肪酸を基質として含む培養培地で培養させるこ
とにより、酵素を分離する別途の過程がなくとも多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を生産することができる。
とにより、酵素を分離する別途の過程がなくとも多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を生産することができる。
前記形質転換体内に存在する多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体生成用酵素に対しては、前記「1.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素」項目の説明を援用して詳細な説明は省略する。
前記形質転換体の培養は、本技術分野に知られた適当な培地と培養条件によりなされてよい。通常の技術者であれば、選択される形質転換体の種類により培地及び培養条件を容易に調整して用いることができる。培養方法は、回分式、連続式、流加式、またはこれらの組み合わせ培養を含んでよい。
前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素の成分を含んでよい。
前記炭素源は、例えば、ブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエチルアルコールのようなアルコール、酢酸のような有機酸、またはこれらの組み合わせを含んでよい。前記培養は、グルコースを炭素源として行われてよい。前記窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液(CSL)及び大豆乳のような有機窒素源、及びヨウ素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源、またはこれらの組み合わせを含んでよい。前記培地は、リンの供給源であって、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び相応するナトリウム含有塩、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでよい。
また、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが培地に含まれてよい。前記培地または個別成分は、培養液に回分式または連続式に添加されてよい。
また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。
5.ドコサヘキサエン酸の新規マルチヒドロキシ誘導体
本発明の他の側面は、ドコサヘキサエン酸の新規マルチヒドロキシ誘導体を提供する。
本発明の他の側面は、ドコサヘキサエン酸の新規マルチヒドロキシ誘導体を提供する。
本発明の一具現形態で、前記ドコサヘキサエン酸の新規マルチヒドロキシ誘導体は、ドコサヘキサエン酸の13番の位置と20番の位置に水酸基が導入された新規ジヒドロキシ誘導体であってよく、具体的には、下記化学式1のような化学構造を有する化合物であってよい。
特に、前記ドコサヘキサエン酸の新規ジヒドロキシ誘導体は、ドコサヘキサエン酸を本発明の前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素と反応させて得られるものであってよい。
また、本発明の他の具現形態で、前記ドコサヘキサエン酸の新規マルチヒドロキシ誘導体のうち他の1つはドコサヘキサエン酸の7番、15番、16番及び17番の位置に水酸基が導入された新規テトラヒドロキシ誘導体であってよく、具体的には、下記化学式2のような化学構造を有する化合物であってよい。
特に、前記ドコサヘキサエン酸の新規テトラヒドロキシ誘導体は、ドコサヘキサエン酸を本発明の前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素と反応させて得られるものであってよい。
6.癌幹細胞の増殖抑制用組成物
一方、本発明のまた他の側面は、癌幹細胞の増殖抑制用組成物を提供する。
一方、本発明のまた他の側面は、癌幹細胞の増殖抑制用組成物を提供する。
本発明の一具現形態で、前記癌幹細胞の増殖抑制用組成物は、多価不飽和脂肪酸を前記「1.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素」項目で説明したジヒドロキシ誘導体生成用酵素と反応させて得られる、多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体を有効成分として含む。また、前記癌幹細胞の増殖抑制用組成物は、前記のような反応過程で生成される中間生成物であるモノヒドロキシ誘導体をさらに含んでよい。
また、本発明の他の具現形態で、前記癌幹細胞の増殖抑制用組成物は、多価不飽和脂肪酸を前記「1.多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素」項目で説明したトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素と反応させて得られる、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ誘導体を有効成分として含む。また、前記癌幹細胞の増殖抑制用組成物は、前記のような反応過程で生成される中間生成物であるモノヒドロキシ誘導体やジヒドロキシ誘導体、または、前記トリヒドロキシ誘導体と共に生成され得るテトラヒドロキシ誘導体をさらに含んでよい。
前記多価不飽和脂肪酸は炭素間の二重結合が3個以上含まれている脂肪酸であって、オメガ-3脂肪酸であってよく、より具体的には、ドコサヘキサエン酸またはエイコサペンタエン酸であってよいが、これに限定されない。
多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の中でも、特に本発明の多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体生成用酵素を多価不飽和脂肪酸と反応させて得られるジヒドロキシ誘導体や、本発明の多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体生成用酵素を多価不飽和脂肪酸と反応させて得られるトリヒドロキシ誘導体、またはこれら全てを含む組成物は、癌幹細胞に特異的に作用し、その増殖を抑制するという効果がある。
本発明の具体的な実施形態では、ドコサヘキサエン酸を配列番号1を有するタンパク質と反応して得た化学式1の化学構造を有するジヒドロキシ誘導体を含む組成物をヒト乳癌細胞とヒト乳癌由来の癌幹細胞に処理した結果、ヒト乳癌由来の癌幹細胞に特異的にその増殖が抑制されることを確認し(図10a 参考)、ドコサヘキサエン酸を配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質と反応して得たトリヒドロキシ誘導体を含む組成物をヒト乳癌細胞とヒト乳癌由来の癌幹細胞に処理した結果、ヒト乳癌由来の癌幹細胞に特異的にその増殖が抑制されることを確認した(図10b参考)。
前記「癌」は、一般的に非調整された細胞成長の特徴を有する哺乳動物の生理学的状態を意味し、細胞の正常な分裂、分化及び死滅の調節機能に問題が発生し、非正常的に過多増殖して周囲の組織及び臓器に浸潤して塊を形成し、既存の構造を破壊したり変形させたりする状態を意味する。
前記「癌幹細胞」は、多様な癌細胞に分化できる能力を有している未分化細胞であって、前記癌としては、結腸癌及び直膓癌を含む大膓癌、乳癌、子宮癌、子宮頸部癌、卵巣庵、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌腫、黒色腫、骨髓種、白血病、リンパ種、胃癌、肺癌、膵臓癌、肝癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、骨癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、中枢神経系(central nervous system;CNS)腫瘍、1次CNSリンパ種、脊髓腫瘍、 脳幹神経膠腫または脳下
垂体腺腫であってよく、特に制限されないが、前記癌幹細胞は、乳癌細胞に分化し得る能力を有した未分化細胞である乳癌幹細胞であってよい。
垂体腺腫であってよく、特に制限されないが、前記癌幹細胞は、乳癌細胞に分化し得る能力を有した未分化細胞である乳癌幹細胞であってよい。
前記「癌幹細胞増殖抑制」は、癌幹細胞維持(maintenance)抑制、癌幹細胞悪性化(malignance)抑制、癌幹細胞移動及び癌幹細胞浸潤活性(invasive)抑制を含む意味である。
一方、前記癌幹細胞の増殖抑制用組成物は、薬学的組成物または食品組成物として用いられてよい。
前記組成物が薬学的組成物に活用される場合、前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体の他に、薬学的に許容可能な運搬体(carrier)または添加剤をさらに含んでよい。
前記「薬学的に許容可能な」の意味は、有効成分の活性を抑制せず、かつ適用(処方)対象が適応可能である以上の毒性を有していないという意味である。前記「運搬体」は、細胞または組織内への化合物の付加を容易にする化合物として定義される。
本発明の前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体または前記多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ誘導体は、単独でまたはある便利な運搬体などと共に混合して投与されてよく、そのような投与剤形は単回投与または繰り返し投与剤形であってよい。前記薬学組成物は、固形製剤または液状製剤であってよい。固形製剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されるものではない。固形製剤には、運搬体、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれるが、これに限定されるものではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されるものではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分である多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体または多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ誘
導体と乳糖、澱粉、未結晶セルロースなどの薬剤学的に許容可能な適当な運搬体を単純混合することにより製造されてよい。顆粒剤は、本発明の前記ジヒドロキシ誘導体またはトリヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な運搬体及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エチルアルコール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法または圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造されてよい。また、錠剤は、前記顆粒剤をマグネシウムステアレートなどの薬学的に許容可能な適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することにより製造されてよい。
導体と乳糖、澱粉、未結晶セルロースなどの薬剤学的に許容可能な適当な運搬体を単純混合することにより製造されてよい。顆粒剤は、本発明の前記ジヒドロキシ誘導体またはトリヒドロキシ誘導体、薬学的に許容可能な適当な運搬体及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬学的に許容可能な適当な結合剤を混合した後、水、エチルアルコール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法または圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造されてよい。また、錠剤は、前記顆粒剤をマグネシウムステアレートなどの薬学的に許容可能な適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することにより製造されてよい。
本発明の前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体または多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ誘導体は、治療しなければならない疾患及び個体の状態により経口剤、注射剤(例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入(infusion)、皮下注射、インプラント)、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、経皮剤、外用剤などに投与されてよいが、これに限定されるものではない。投与経路により通常用いられ得る非毒性である、薬学的に許容可能な運搬体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット製剤に剤形化されてよい。
本発明の薬学組成物は、毎日約0.0001mg/kgから約10g/kgが投与されてよく、約0.001mg/kgから約1g/kgの1日投与容量で投与されてよい。
しかし、前記投与量は、前記混合物の精製の程度、患者の状態(年齢、性別、体重など)、治療している状態の深刻性などにより多様である。必要に応じて、便利性のために1日総投与量を1日の間何回か分けて投与してよい。
本発明の組成物が薬学組成物として用いられる場合、前記組成物内の前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体または多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ誘導体は、30μM以上、具体的には35μM以上、より具体的には、40μM以上の濃度で含まれてよい。
また、前記組成物が食品組成物に用いられる場合、許容可能な食品補助添加剤を含んでよく、食品の製造に通常用いられる適切な運搬体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでよい。
本発明で食品は、栄養素を1つまたはそれ以上含んでいる天然物または加工品を意味し、具体的にある程度の加工工程を経て直接食べることができる状態となったことを意味し、通常的な意味として、各種食品、機能性食品、飲料、食品添加剤及び飲料添加剤をいずれも含む意味として用いられる。前記食品の例として、各種食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、機能性食品などがある。さらに、本発明の食品には、特殊栄養食品(例、調乳、乳幼児食など)、食肉加工品、魚肉製品、豆腐類、寒天類、麺類(例、ラーメン類、麺類など)、健康補助食品、調味食品(例、醤油、みそ、コチュジャン、混合醤)、ソース類、菓子類(例、スナック類)、乳加工品(例、発酵乳、チーズなど)、その他の加工食品、キムチ、漬物食品(各種キムチ類、醤油漬など)、飲料(例、果実、野菜類飲料、豆乳類、醗酵飲料類、アイスクリーム類など)、天然調味料(例、ラーメンスープなど)、ビタミン複合剤、アルコール飲料、酒類及びその他の健康補助食品類を含むが、これに限定されない。前記機能性食品、飲料、食品添加剤または飲料添加剤は、通常の製造方法で製造されてよい。
前記「機能性食品」とは、食品に物理的、生化学的、生物工学的手法などを用いて、該当食品の機能を特定の目的に作用、発現するように付加価置を付与した食品群や食品組成が有する生体防御リズム調節、疾病防止と回復などに関する体内調節機能を生体に対して充分に発現するように設計して加工した食品を意味し、具体的には健康機能食品であって
よい。
よい。
本発明で用いられる用語「健康機能食品」とは、人体に有用な機能性を有した原料や成分を用いて錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状及び粒などの形態で製造及び加工した食品をいう。ここでの「機能」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の健康機能食品は、当業界で通常用いられる方法により製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記健康機能食品の剤形もまた健康機能食品と認められる剤形であれば制限なく製造されてよい。本発明の食品用組成物は、多様な形態の剤形で製造されてよく、一般薬品とは異なり食品を原料とし、薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないという長所があり、携帯性に優れるので、本発明の健康機能食品は、乳癌幹細胞成長抑制の効果を増進させるための補助剤として摂取が可能である。
また、前記機能性食品には、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含んでよく、機能性食品の製造に通常用いられる適切な運搬体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでよい。
また、前記食品組成物で、前記組成物内の前記多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体または多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ誘導体は、30μM以上、具体的には35μM以上、より具体的には40μM以上の濃度で含まれてよい。
本発明の食品組成物には、その有効成分以外に、甘味剤、風味剤、生理活性成分、ミネラルなどが含まれてよい。甘味剤は、食品が適当な甘口になるような量で用いられてよく、天然の物であるか合成されたものであってよい。具体的には、天然甘味剤を用いる場合であるが、天然甘味剤としては、トウモロコシシロップ固形物、蜂蜜、スクロース、フルクトース 、ラクトース、マルトースなどの糖甘味剤を挙げることができる。風味剤は、
味や香を良くするために用いられるが、天然の物と合成されたものいずれも用いることができる。具体的には、天然の物を用いる場合である。天然の物を用いる場合に、風味以外に栄養強化の目的も並行することができる。天然風味剤としては、りんご、レモン、蜜柑、ぶどう、いちご、桃などで得られたものであるか、緑茶の葉、アマドコロ、竹葉、桂皮、菊葉、ジャスミンなどから得られたものであってよい。また、高麗人参(紅参)、たけのこ、アロエベラ、銀杏などから得られたものを用いてよい。天然風味剤は、液状の濃縮液や固形状の抽出物であってよい。場合によっては、合成風味剤が用いられるが、合成風味剤は、エステル、アルコール、アルデハイド、テルペンなどが用いられてよい。生理活性物質としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンなどのカテキン類や、レチノール、アスコルビン酸、トコフェロール、カルシフェロール、チアミン、リボフラビンなどのビタミン類などが用いられてよい。ミネラルとしては、カルシウム、マグネシウム、クロム、コバルト、銅、フッ素化物、ゲルマニウム、ヨード、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレニウム、ケイ素、ナトリウム、硫黄、バナジウム、亜鉛などが用いられてよい。
味や香を良くするために用いられるが、天然の物と合成されたものいずれも用いることができる。具体的には、天然の物を用いる場合である。天然の物を用いる場合に、風味以外に栄養強化の目的も並行することができる。天然風味剤としては、りんご、レモン、蜜柑、ぶどう、いちご、桃などで得られたものであるか、緑茶の葉、アマドコロ、竹葉、桂皮、菊葉、ジャスミンなどから得られたものであってよい。また、高麗人参(紅参)、たけのこ、アロエベラ、銀杏などから得られたものを用いてよい。天然風味剤は、液状の濃縮液や固形状の抽出物であってよい。場合によっては、合成風味剤が用いられるが、合成風味剤は、エステル、アルコール、アルデハイド、テルペンなどが用いられてよい。生理活性物質としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンなどのカテキン類や、レチノール、アスコルビン酸、トコフェロール、カルシフェロール、チアミン、リボフラビンなどのビタミン類などが用いられてよい。ミネラルとしては、カルシウム、マグネシウム、クロム、コバルト、銅、フッ素化物、ゲルマニウム、ヨード、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレニウム、ケイ素、ナトリウム、硫黄、バナジウム、亜鉛などが用いられてよい。
また、本発明の食品組成物は、前記甘味剤などの他にも、必要に応じて、保存剤、乳化剤、酸味料、増粘剤などを含むことができる。このような保存剤、乳化剤などは、それが添加される用途を達成できる限り、極微量に添加されて用いられるのが好ましい。極微量とは、数値的に表現する際に食品組成物の全重量を基準とすると、約0.0005重量%から約0.5重量%の範囲を意味する。使用できる保存剤としては、ソルビン酸カルシウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、EDTA(エチレンジアミンテトラアセト酸)などを挙げることができる。使用できる乳化剤としては、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、ペクチンなどを挙げることができる。使用できる酸味料としては、クエ
ン酸、りんご酸、フマル酸、アジピン酸、リン酸、グルコン酸、タルタル酸、アスコルビン酸、アセト酸、リン酸などを挙げることができる。このような酸味料は、味を増進させる目的の他に微生物の増殖を抑制する目的で食品組成物が適正酸度になるように添加されてよい。使用できる増粘剤としては、懸濁化具現剤、沈降剤、ゲル形成剤、膨化剤などを挙げることができる。
ン酸、りんご酸、フマル酸、アジピン酸、リン酸、グルコン酸、タルタル酸、アスコルビン酸、アセト酸、リン酸などを挙げることができる。このような酸味料は、味を増進させる目的の他に微生物の増殖を抑制する目的で食品組成物が適正酸度になるように添加されてよい。使用できる増粘剤としては、懸濁化具現剤、沈降剤、ゲル形成剤、膨化剤などを挙げることができる。
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。
但し、下記実施例は、本発明を具体的に例示するものであって、本発明の内容が下記実施例によって限定されはしない。
但し、下記実施例は、本発明を具体的に例示するものであって、本発明の内容が下記実施例によって限定されはしない。
[実施例1]配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質の製造
[1-1]タンパク質の発現用ベクターの製作
配列番号1のアミノ酸をそれぞれ暗号化する配列番号3の塩基配列と、配列番号2のアミノ酸をそれぞれ暗号化する配列番号4の塩基配列を株式会社バイオニア社に依頼して合成し、前記合成された塩基配列を鋳型に配列番号5、6のプライマー対を用いて95℃で30秒間プレ変形(pre-denaturation)させた後、95℃で30秒、55℃で30秒、68℃で5分間反応させるサイクルを12回繰り返すPCRを行うことにより、前記配列番号2の遺伝子を増幅した。
[1-1]タンパク質の発現用ベクターの製作
配列番号1のアミノ酸をそれぞれ暗号化する配列番号3の塩基配列と、配列番号2のアミノ酸をそれぞれ暗号化する配列番号4の塩基配列を株式会社バイオニア社に依頼して合成し、前記合成された塩基配列を鋳型に配列番号5、6のプライマー対を用いて95℃で30秒間プレ変形(pre-denaturation)させた後、95℃で30秒、55℃で30秒、68℃で5分間反応させるサイクルを12回繰り返すPCRを行うことにより、前記配列番号2の遺伝子を増幅した。
前記のように増幅された配列番号3の塩基配列と配列番号4の塩基配列を含むPCR産物をそれぞれプラスミドベクターpRL2(Seo et al.,Biotechno
l.Lett.,2009,31:877-881)に挿入して組換え発現ベクターを製作し、塩基配列分析(sequencing)(Solgent)を介して前記配列番号3の塩基配列と配列番号4の塩基配列が確実に挿入されたことを確認した。
l.Lett.,2009,31:877-881)に挿入して組換え発現ベクターを製作し、塩基配列分析(sequencing)(Solgent)を介して前記配列番号3の塩基配列と配列番号4の塩基配列が確実に挿入されたことを確認した。
[1-2]タンパク質の発現及び精製
前記実施例[1-1]で製造された組換え発現ベクターを大膓菌DH5aに形質転換し、形質転換体を3mlのLB培地に接種して600nmでの吸光度が2.0となるまで37℃で種菌培養した。その後、前記種菌培養された培養液を500mlのLB培地に添加して24時間の間本培養を実施した。
前記実施例[1-1]で製造された組換え発現ベクターを大膓菌DH5aに形質転換し、形質転換体を3mlのLB培地に接種して600nmでの吸光度が2.0となるまで37℃で種菌培養した。その後、前記種菌培養された培養液を500mlのLB培地に添加して24時間の間本培養を実施した。
前記のような本培養により過剰発現が誘導された形質転換体の培養液を遠心分離して上澄み液を分離し、上澄み液を分離したパレットから形質転換体の細胞を破砕して形質転換体の細胞溶解物(cell lysate)を収得した。
前記のように収得された細胞溶解物を対象としてSDS-PAGEを行った結果、図1a及び図1bに示しているとおり、約65KDaの大きさを有する、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質が過剰発現されたことを確認した(図1a及び図1b参考)。
前記のように配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質が過剰発現されているものと確認された細胞溶解物を対象として、Ni-NTA吸着クロマトグラフィーを用いて、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質を分離及び精製し、前記のように配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質が過剰発現されているものと確認された細胞溶解物を対象として、Ni-NTA吸着クロマトグラフィーを用いて、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質を分離及び精製した。
[実施例2]タンパク質の活性の確認
[2-1]水酸化活性の確認
前記実施例[1-2]で、精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質それぞれに対し、前記タンパク質10KU/mlとリノール酸100μMをpH7、室温で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。
[2-1]水酸化活性の確認
前記実施例[1-2]で、精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質それぞれに対し、前記タンパク質10KU/mlとリノール酸100μMをpH7、室温で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。
固相カートリッジ(SPE、C18 500mg)を用いて前記反応産物を精製した後、順相HPLC(Normal phase HPLC)及びキラルHPLC(Chiral HPLC)を用いて前記反応生成物内の化合物の種類を分析した。
具体的に、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質から生成された反応生成物内の化合物に対する順相HPLC分析は、supelcosil LC-Diolカラム(Supelco、25cm × 3mm、5μm)に、94.8%のn-ヘプタン、5%のイソプロパノール、0.1%の酢酸、0.1%の2,2-ジメトキシプロパンから
なる移動相を流量0.5ml/minの速度で、40分間20ml展開し、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に検出する方法で行われ、キラルHPLC分析は、supelcosil LC-Diolカラム(Supelco、25cm × 3mm、5μm)に、94.9%のn-ヘプタン、5%のイソプロパノール、0.1%の酢酸、0.1%の2,2-ジメトキシプロパンからな
る移動相を流量0.5ml/minの速度で、40分間40ml展開させ、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に分析する方法で行われた。
なる移動相を流量0.5ml/minの速度で、40分間20ml展開し、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に検出する方法で行われ、キラルHPLC分析は、supelcosil LC-Diolカラム(Supelco、25cm × 3mm、5μm)に、94.9%のn-ヘプタン、5%のイソプロパノール、0.1%の酢酸、0.1%の2,2-ジメトキシプロパンからな
る移動相を流量0.5ml/minの速度で、40分間40ml展開させ、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に分析する方法で行われた。
そして、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質から生成された反応生成物内の化合物に対する順相HPLC分析は、supelcosil LC-Diolカラム(Supelco、25cm X 3mm、5μm)に、95%のn-ヘプタン、5%のイソプロパノール、0.1%の酢酸、0.1%の2,2-ジメトキシプロパンからなる移
動相を流量0.5ml/minの速度で、40分間20ml展開させ、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に検出する方法で行われ、キラルHPLC分析は、supelcosil LC-Diolカラム(Supelco、25cm × 3mm、5μm)に、95%のn-ヘプタン、5%のイソプロパノール、0.1%の酢酸、0.1%の2,2-ジメトキシプロパンからなる移動相
を流量0.5ml/minの速度で、40分間20ml展開させ、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に分析する方法で行われた。
動相を流量0.5ml/minの速度で、40分間20ml展開させ、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に検出する方法で行われ、キラルHPLC分析は、supelcosil LC-Diolカラム(Supelco、25cm × 3mm、5μm)に、95%のn-ヘプタン、5%のイソプロパノール、0.1%の酢酸、0.1%の2,2-ジメトキシプロパンからなる移動相
を流量0.5ml/minの速度で、40分間20ml展開させ、DAD(Diode Array Detector)を用いて反応産物内の化合物を最終的に分析する方法で行われた。
その結果、図2aに示しているとおり、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質から生成された反応生成物に対しては、順相HPLC及びキラルHPLCの全てにおいて、9R-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(9R-hydroxy-octadec
adienoic acid、9R-HODE)及び13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(13S-hydroxy-octadecadienoic acid、13S-HODE)を確認することができた。また、図2bに示しているとおり、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質から生成された反応生成物に対しては、順相HPLC及びキラルHPLCの全てにおいて、13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(13S-hydroxy-octadecadienoic acid;13S-HODE)と同一のピークが確認された。
adienoic acid、9R-HODE)及び13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(13S-hydroxy-octadecadienoic acid、13S-HODE)を確認することができた。また、図2bに示しているとおり、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質から生成された反応生成物に対しては、順相HPLC及びキラルHPLCの全てにおいて、13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(13S-hydroxy-octadecadienoic acid;13S-HODE)と同一のピークが確認された。
前記のような結果から、本発明の配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質は、リノール酸を9R-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸と13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸に水酸化させることができる活性を有しており、本発明の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質は、リノール酸を13-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸に水酸化させることができる活性を有していることが分かる。
[2-2]マルチヒドロキシ誘導体生成活性の確認
前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質に対し、前記タンパク質2、6、10KU/mlとドコサヘキサエン酸(docosahexaenoic acid、DHA)100μMをpH7、室温で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させ、反応生成物内の化合物の種類を分析した。
前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質に対し、前記タンパク質2、6、10KU/mlとドコサヘキサエン酸(docosahexaenoic acid、DHA)100μMをpH7、室温で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させ、反応生成物内の化合物の種類を分析した。
その結果、図3aに示しているとおり、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質はDHAに、1個の水酸基が導入されたモノヒドロキシ誘導体だけではなく、2個の水酸基が導入されたジヒドロキシ誘導体を生成することができるものと確認された。
そして、前記反応生成物を対象としてNMR分析を行った。具体的に、ドコサヘキサエン酸から転換されたモノまたはジヒドロキシ誘導体は、C、O、Hからなる有機物であって、この化学種間の化学シフト(chemical shift)値を測定して構造を分析するために800MHz NMR(Bruker)を用いた。NMR測定溶媒には、水
素が重水素(deuterium)で置換されているD4-メタノールを使用し、絶対温度298Kで測定した。1D NMR(1H、13C)、2D NMR(1H-1H C
OSY、Edited-QC、HMBC、TOCSY、ROESY)法を用いて前記のようなモノまたはジヒドロキシ誘導体をなしている水素と炭素を測定した(図4a及び図4b)。
素が重水素(deuterium)で置換されているD4-メタノールを使用し、絶対温度298Kで測定した。1D NMR(1H、13C)、2D NMR(1H-1H C
OSY、Edited-QC、HMBC、TOCSY、ROESY)法を用いて前記のようなモノまたはジヒドロキシ誘導体をなしている水素と炭素を測定した(図4a及び図4b)。
その結果、図5a及び図5bに示しているとおり、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質は、DHAの13位と20位に水酸基を導入してジヒドロキシ誘導体(図5a)を生成したものと確認され、その過程で中間生成物として13位に水酸基が導入されたモノヒドロキシ誘導体(図5b)も共に存在するものと確認された。
前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に対し、このタンパク質2、6、10KU/mlとドコサヘキサエン酸(docosahexaenoic acid;DHA)100μMをpH7、室温で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させ、反応生成物内の化合物の種類を分析した。
その結果、図3bに示しているとおり、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質はDHAに、1個の水酸基が導入されたモノヒドロキシ誘導体、2個の水酸基が導入
されたジヒドロキシ誘導体だけでなく、3個の水酸基が導入されたトリヒドロキシ誘導体と4個の水酸基が導入されたテトラヒドロキシ誘導体までも生成することができるものと確認された。
されたジヒドロキシ誘導体だけでなく、3個の水酸基が導入されたトリヒドロキシ誘導体と4個の水酸基が導入されたテトラヒドロキシ誘導体までも生成することができるものと確認された。
そして、前記反応生成物を対象としてNMR分析を行った。具体的に、ドコサヘキサエン酸から転換されたモノ、ジ、トリまたはテトラヒドロキシ誘導体はC、O、Hからなる有機物であって、この化学種間の化学シフト(chemical shift)値を測定して構造を分析するために800MHz NMR(Bruker)を用いた。NMR測定溶媒には、水素が重水素(deuterium)で置換されているD4-メタノールを使用し、絶対温度298Kで測定した。1D NMR(1H、13C)、2D NMR(1H-1H COSY、Edited-QC、HMBC、TOCSY、ROESY)法を用いて前記のようなモノ、ジまたはテトラヒドロキシ誘導体をなしている水素と炭素を測定した(図4cから図4e)。
その結果、図5cから図5eに示しているとおり、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質は、DHAの7位、15位、16位及び17位に水酸基を導入してテトラヒドロキシ誘導体(図5c)を生成するものと確認され、その過程で中間生成物として17位に水酸基が導入されたモノヒドロキシ誘導体(図5d)と7位と17位に水酸基が導入されたジヒドロキシ誘導体(図5e)も共に存在するものと確認された。
その反面、大豆15LOXの場合には、図6に示しているとおり、ドコサヘキサエン酸に1個または2個の水酸基のみを導入することができるだけで、3個または4個の水酸基の導入された誘導体は生成することができないものと確認された。
[実施例3]タンパク質のアミノ酸配列の分析
前記実施例2で酵素としての活性が確認された配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質を対象として、類似の活性を有しているリポキシゲナーゼ酵素であるヒト12LOX、ヒト15LOX、ヒト5LOX、ジャガイモLOX、大豆15LOX及び紅藻類 PhLOXと対比して、アミノ酸配列の相同性分析及び系統分析を行った。
前記実施例2で酵素としての活性が確認された配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質を対象として、類似の活性を有しているリポキシゲナーゼ酵素であるヒト12LOX、ヒト15LOX、ヒト5LOX、ジャガイモLOX、大豆15LOX及び紅藻類 PhLOXと対比して、アミノ酸配列の相同性分析及び系統分析を行った。
その結果、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質は、大豆15LOXと21%;ヒト5LOXと26%;ヒト12LOXと23%;ヒト15LOXと25%;ジャガイモLOXと23%;紅藻類PhLOXと21%;の配列相同性を表すものと確認された。そして、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質は、大豆15LOXと21%;ヒト5LOXと26%;ヒト15LOXと25%;ジャガイモLOXと23%;紅藻類PhLOXと21%;の配列相同性を表すものと確認された。そして、これに基づいて系統分析をしてみた結果、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質は、図7に示しているとおり、前記ヒト15LOX、ヒト5LOX、ジャガイモLOX、大豆15LOX及び紅藻類PhLOXなどとは全く異なる系統であるものとして分類された。
また、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質では、膜脂質との結合を行うN-末端領域が欠失されている反面、C-末端領域は一般的なリポキシゲナーゼと高い類似性を表すものと確認されたところ、鉄イオンと結合する残基であるHis、His、His及びAsn/Ser、末端アミノ酸が存在し、酵素の水酸化特性と密接に関係があるAlaが存在するものと確認された。
また、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質の2次構造を分析した結果、α-ヘリックス、拡張された鎖及びランダムコイルがそれぞれ下記表2に記載されたとお
りの比率で存在するものと確認された。
りの比率で存在するものと確認された。
一方、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質では、膜脂質との結合を行うN-末端領域が欠失されていることを確認した。一方、前記C-末端領域では、鉄イオンと結合する残基であるHis、His、His及びAsn/Ser、末端アミノ酸が存在し、酵素の水酸化特性と密接に関係があるAlaが存在するものと確認された。また、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質の2次構造を分析した結果、α-ヘリックス、拡張された鎖及びランダムコイルがそれぞれ下記表3に記載されたとおりの比率で存在するものと確認された。
[実施例4]タンパク質の酵素活性に影響を及ぼす条件の確認
前記実施例[1-2]で精製及び分離した、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質を対象として、それぞれのタンパク質が有する酵素活性に影響を及ぼす条件を確認した。
前記実施例[1-2]で精製及び分離した、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質を対象として、それぞれのタンパク質が有する酵素活性に影響を及ぼす条件を確認した。
[4-1]pHの影響
pHが及ぼす影響を確認するために、前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質10KU/mlとリノール酸100μMをpH7からpH11、25℃の温度で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。このとき、前記pH7.0の場合、50mMのリン酸ナトリウム緩衝溶液(Sodium phosphate buffer)、pH8.0の場合、50mM Tris-HCl緩衝溶液、及びpH9.0からpH11.0の場合、50mMのホウ酸ナトリウム緩衝溶液(Sodium borate buffer)をそれぞれ用いた。
pHが及ぼす影響を確認するために、前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質10KU/mlとリノール酸100μMをpH7からpH11、25℃の温度で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。このとき、前記pH7.0の場合、50mMのリン酸ナトリウム緩衝溶液(Sodium phosphate buffer)、pH8.0の場合、50mM Tris-HCl緩衝溶液、及びpH9.0からpH11.0の場合、50mMのホウ酸ナトリウム緩衝溶液(Sodium borate buffer)をそれぞれ用いた。
そして、前記実施例[3-1]と同一の方式で前記反応生成物内の存在する 13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸の濃度を測定し、その相対値を比べた。
その結果、図8aに示しているとおり、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質
は、pH8.0に近いほど、その酵素活性がさらに優れているものと確認された。
は、pH8.0に近いほど、その酵素活性がさらに優れているものと確認された。
また、前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質10KU/mlとリノール酸100μMをpH6からpH 11、25℃の温度で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。このとき、前記pH7.0の場合、50mMのリン酸ナトリウム緩衝溶液(Sodium phosphate buffer)、pH8.0の場合、50mM Tris-HCl緩衝溶液、及びpH9.0からpH11.0の場合、50mMのホウ酸ナトリウム緩衝溶液(Sodium borate buffer)をそれぞれ用いた。
そして、前記実施例[3-1]と同一の方式で前記反応生成物内の存在する 13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸の濃度を測定し、その相対値を比べた。
その結果、図8bに示しているとおり、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質は、pH8.0に近いほど、その酵素活性がさらに優れているものと確認された。
[4-2]温度の影響
温度が及ぼす影響を確認するために、前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質50KUとリノール酸100μMをpH7、20℃から50℃の温度で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。
温度が及ぼす影響を確認するために、前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質50KUとリノール酸100μMをpH7、20℃から50℃の温度で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。
そして、前記実施例[3-1]と同一の方式で前記反応生成物内の存在する 13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸の濃度を測定してその相対値を比べた。
その結果、図9aに示しているとおり、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質は、20℃に近いほど、その酵素活性がさらに優れているものと確認された。
また、前記実施例[1-2]で精製及び分離した配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質10KU/mlとリノール酸100μMをpH7、20℃から50℃の温度で30分間反応させ、最終濃度が50mMとなるように1Mの水素化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)を添加して反応産物を還元させた後、5μl/mlの酢酸を添加して前記反応を終了させた。
そして、前記実施例[3-1]と同一の方式で前記反応生成物内の存在する 13S-ヒドロキシ-オクタデカジエン酸の濃度を測定してその相対値を比べた。
その結果、図9bに示しているとおり、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質は、30℃に近いほど、その酵素活性がさらに優れているものと確認された。
[4-3]最適の条件での反応速度
前記[4-1]及び[4-2]で確認した最適の条件で、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質のKm及びKcat値を調査した。すなわち、配列番号1のアミノ酸を有するタンパク質をpH8.0及び20℃の環境で反応を進め、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に対してpH7.0及び30℃の環境で反応を進め、その結果を表4に示した。
前記[4-1]及び[4-2]で確認した最適の条件で、前記配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質と、前記配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質のKm及びKcat値を調査した。すなわち、配列番号1のアミノ酸を有するタンパク質をpH8.0及び20℃の環境で反応を進め、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に対してpH7.0及び30℃の環境で反応を進め、その結果を表4に示した。
[実施例5]本発明のタンパク質の酵素活性により生成された多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の癌幹細胞増殖抑制効果の確認
前記実施例[3-2]でドコサヘキサエン酸を本発明の配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたジヒドロキシ誘導体と、ドコサヘキサエン酸を本発明の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたトリヒドロキシ誘導体を、それぞれ分離及び精製し、ヒト乳癌細胞とヒト乳癌由来の癌幹細胞に処理してその効果を確認した。
前記実施例[3-2]でドコサヘキサエン酸を本発明の配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたジヒドロキシ誘導体と、ドコサヘキサエン酸を本発明の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたトリヒドロキシ誘導体を、それぞれ分離及び精製し、ヒト乳癌細胞とヒト乳癌由来の癌幹細胞に処理してその効果を確認した。
より具体的に、先ず、ヒト乳癌細胞MDA-MB-231(ATCC)を10%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone社)、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンが添加されたDMEM培地で10cm培養皿で細胞数1x106の密度で培養した(二酸化炭素5%、37度)。
4μg/mlのヘパリン、0.48μg/mlのヒドロコルチゾン、100u/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンが添加されたComplete Mammo CultTM培地(Stem Cell Technologies、カナダ
)2mlを含有する超低接着プレート6ウェル(ultra-low attachment 6-well plate)でヒト乳癌細胞MDA-MB-231を細胞数0.5~1×104の密度で培養し(二酸化炭素5%、37度)、ヒト乳癌由来の癌幹細胞マンモスフェア(mammospheres)を形成した。
)2mlを含有する超低接着プレート6ウェル(ultra-low attachment 6-well plate)でヒト乳癌細胞MDA-MB-231を細胞数0.5~1×104の密度で培養し(二酸化炭素5%、37度)、ヒト乳癌由来の癌幹細胞マンモスフェア(mammospheres)を形成した。
前記のように得られたヒト乳癌細胞MDA-MB-231とヒト乳癌細胞由来の癌幹細胞マンモスフェアに、前記実施例[3-2]でドコサヘキサエン酸 を本発明の配列番号
1のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたジヒドロキシ誘導体、またはドコサヘキサエン酸を本発明の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたトリヒドロキシ誘導体それぞれを、0~60μMの濃度で処理して細胞の増殖の程度を確認した。
1のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたジヒドロキシ誘導体、またはドコサヘキサエン酸を本発明の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質に水酸化させて得られたトリヒドロキシ誘導体それぞれを、0~60μMの濃度で処理して細胞の増殖の程度を確認した。
その結果、図10aに示されているとおり、本発明の配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質にドコサヘキサエン酸を水酸化させて得たジヒドロキシ誘導体により、乳癌由来の癌幹細胞であるマンモスフェアはその増殖が抑制されるのに反し、同一濃度のジヒドロキシ誘導体にもかかわらず、乳癌細胞の増殖には何ら影響がないものと確認された。そして、図10bに示されているとおり、40μM以上の濃度で、本発明の配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質にドコサヘキサエン酸を水酸化させて得たトリヒドロキシ誘導体により、乳癌由来の癌幹細胞であるマンモスフェアはその増殖が抑制されるのに反し、同一濃度のトリヒドロキシ誘導体にもかかわらず、乳癌細胞の増殖には何ら影響がないものと確認された。
前記では、本発明の好ましい実施例を例示的に説明したが、本発明の範囲は前記のような特定の実施例にのみ限定されず、当該分野で通常の知識を有する者であれば、本発明の特許請求の範囲に記載された範疇内で適切に変更が可能なはずである。
実施態様を挙げれば以下の通りである。
1. 配列番号1のアミノ酸配列または配列番号2のアミノ酸配列を含む、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
2. 配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記マルチヒドロキシ誘導体はジヒドロキシ誘導体である、項1に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
3. 配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記マルチヒドロキシ誘導体はトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体である、項1に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
4. 前記酵素は、基質がドコサヘキサエン酸(DHA)またはエイコサペンタエン酸(EPA)である、項1から3のいずれか一項に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
5. 項1に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子。
6. 前記遺伝子は、配列番号3の塩基配列、または配列番号4の塩基配列からなる、項5に記載の遺伝子。
7. 項5に記載の遺伝子を含む、組換え発現ベクター。
8. 項7に記載の組換え発現ベクターが宿主細胞に導入された、形質転換体。
9. 項1に記載の酵素を多価不飽和脂肪酸と反応させる段階;を含む、インビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
10. 前記酵素と多価不飽和脂肪酸の反応物から多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を回収する段階;をさらに含む、項9に記載のインビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
11. 前記反応は、0℃から50℃及びpH4からpH10の条件で進行する、 項8
に記載のインビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
12. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはエイコサペンタエン酸(EPA)である、項9から11のいずれか一項に記載のインビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
13. 項8に記載の形質転換体を多価不飽和脂肪酸の存在下で培養する段階;及び
前記培養された培養物から多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を分離する段階;を含む、インビボ(in vivo)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
14. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはエイコサペンタエン酸(EPA)である、項13に記載のインビボ(in vivo)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
15. 化学式1の化学構造を有するドコサヘキサエン酸のジヒドロキシ誘導体:
16. 化学式2の化学構造を有するドコサヘキサエン酸のテトラヒドロキシ誘導体:
17. 配列番号1のアミノ酸配列を含む多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体生成用酵素により生成される多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体、配列番号2のアミノ酸配列を含む多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ(tetra-hydroxy)誘導体生成用酵素により生成される多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ(tri-hydroxy)誘導体またはこれらの組み合わせを有効成分として含む、癌幹細胞の増殖抑制用組成物。
18. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)である、項17に記載の癌幹細胞の増殖抑制用組成物。
19. 前記癌幹細胞は、ヒト乳癌由来である、項17または18に記載の癌幹細胞の増殖抑制用組成物。
実施態様を挙げれば以下の通りである。
1. 配列番号1のアミノ酸配列または配列番号2のアミノ酸配列を含む、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
2. 配列番号1のアミノ酸配列を含み、前記マルチヒドロキシ誘導体はジヒドロキシ誘導体である、項1に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
3. 配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記マルチヒドロキシ誘導体はトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体である、項1に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
4. 前記酵素は、基質がドコサヘキサエン酸(DHA)またはエイコサペンタエン酸(EPA)である、項1から3のいずれか一項に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
5. 項1に記載の多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体生成用酵素を暗号化する遺伝子。
6. 前記遺伝子は、配列番号3の塩基配列、または配列番号4の塩基配列からなる、項5に記載の遺伝子。
7. 項5に記載の遺伝子を含む、組換え発現ベクター。
8. 項7に記載の組換え発現ベクターが宿主細胞に導入された、形質転換体。
9. 項1に記載の酵素を多価不飽和脂肪酸と反応させる段階;を含む、インビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
10. 前記酵素と多価不飽和脂肪酸の反応物から多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を回収する段階;をさらに含む、項9に記載のインビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
11. 前記反応は、0℃から50℃及びpH4からpH10の条件で進行する、 項8
に記載のインビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
12. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはエイコサペンタエン酸(EPA)である、項9から11のいずれか一項に記載のインビトロ(in vitro)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
13. 項8に記載の形質転換体を多価不飽和脂肪酸の存在下で培養する段階;及び
前記培養された培養物から多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ誘導体や、多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ誘導体を分離する段階;を含む、インビボ(in vivo)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
14. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはエイコサペンタエン酸(EPA)である、項13に記載のインビボ(in vivo)で多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ誘導体の生産方法。
15. 化学式1の化学構造を有するドコサヘキサエン酸のジヒドロキシ誘導体:
16. 化学式2の化学構造を有するドコサヘキサエン酸のテトラヒドロキシ誘導体:
17. 配列番号1のアミノ酸配列を含む多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体生成用酵素により生成される多価不飽和脂肪酸のジヒドロキシ(di-hydroxy)誘導体、配列番号2のアミノ酸配列を含む多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシまたはテトラヒドロキシ(tetra-hydroxy)誘導体生成用酵素により生成される多価不飽和脂肪酸のトリヒドロキシ(tri-hydroxy)誘導体またはこれらの組み合わせを有効成分として含む、癌幹細胞の増殖抑制用組成物。
18. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸(DHA)である、項17に記載の癌幹細胞の増殖抑制用組成物。
19. 前記癌幹細胞は、ヒト乳癌由来である、項17または18に記載の癌幹細胞の増殖抑制用組成物。
Claims (1)
- 配列番号1のアミノ酸配列または配列番号2のアミノ酸配列を含む、多価不飽和脂肪酸のマルチヒドロキシ(multi-hydroxy)誘導体生成用酵素。
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