KR102411580B1 - 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중불포화지방산을 기질로 하는 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 및 이를 이용한 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생산 방법에 관한 것으로, 상기 효소는 다중불포화지방산을 기질로 이용하여 단 한번의 반응으로 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생산해 낼 수 있는 효과가 있어서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생체 외 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 효소로부터 생성된 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 포함하는 조성물은 콜라겐 생성을 촉진하는 효과가 있어서 피부 노화나 주름을 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING MONO-HYDROXY OR DI-HYDROXY DERIVATIVES OF POLYUNSATURATED FATTY ACID}

본 발명은 다중불포화지방산으로부터 이들의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소와 이를 이용하여 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

염증 반응은 병원균의 감염 및 각종 독성물질에 대한 인체의 일차적인 방어 수단으로서 중요한 역할을 하지만, 동시에 다양한 만성질환을 유발하는 기저 요인으로 작용할 수 있기 때문에, 체내의 정교한 조절 기작에 의해 엄격히 조절되어야 하는 생리 현상이다.

오메가-6 다중불포화지방산에 해당하는 아라키돈산(arachidonic acid, C20: 4n-6)의 유도체인 프로스타글란딘(prostaglandin) 혹은 류코트리엔(leukotriene)은 대표적인 염증반응 개시 신호물질로서, 체내에서 다양한 만성질환을 유발할 수 있는 염증반응의 불균형을 유도한다. 일반적으로, 염증반응 반응의 종결은 염증반응 개시 신호물질이 생성되지 않으면, 염증반응은 자연스럽게 종결되는 것으로 인식되어 상기 물질의 생성을 저해하는 다양한 스테로이드 또는 비스테로이드 계열의 항염증 치료제들이 개발되었다. 그러나 최근 염증반응의 종결 기작도 정교한 조절 과정에 의해 이루어지고, 그 과정에 오메가-3 다중불포화지방산 도코사헥사노엔산(docosahexaenoic acid; DHA, C22: 6n-3) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid; EPA, C20: 5n-3)의 수산화 유도체가 상기 염증 반응의 종결 기작에 작용하는 신호물질로서의 역할로 작용할 수 있음이 확인되었다. 이렇게 염증 반응의 종결 기작의 신호물질로 작용하는 것들을 SPM(specialized proresolving mediators; resolvins, protectins, maresins)이라고 명명하였는데, 이들은 기존의 항염증 치료제인 코르티코스테로이드(corticosteroids) 및 NSAID(non-steroid anti-inflammatory drug) 아스피린에 비해 월등한 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 SPM은 주로 염증 반응 개시 신호물질의 생성 억제를 유도하는 기존의 스테로이드 또는 비스테로이드 계열 항염증 치료제와 달리 염증 반응 전(全)단계에 걸쳐 효능을 보이는 장점이 있다. 이에, 상기 SPM을 이용하여 각종 만성염증 질환(혈관, 심근경색, 뇌졸중, 치매, 골관절염, 천식을 비롯한 폐질환, 위장관염, 치주염, 안구 건조증, 지방간 등 각종 만성염증 질환), 감염 패혈증, 화상, 창상 회복, 통증, 암, 당뇨 등과 같은 다양한 질환에 대한 치료 효능의 존재 여부에 대해 연구가 활발하게 진행 중이다.

한편, 생체 내 염증반응 종결 신호 물질 SPM은 오메가-3 다중불포화지방산에 하이드록시기가 2개 혹은 3개가 삽입된 구조로, 두 가지 이상의 효소들의 연속적인 작용을 통해 매우 극미량 생성되는 것으로 알려져 있다. 이에, 염증반응 종결 신호물질의 효능 및 치료제 개발을 위하여 충분한 SPM을 생성하기 위하여, 유기합성 공정을 통하여 제조하기 위한 노력이 지속되고 있으나(비특허문헌 1 참고), 그 공정이 매우 복잡하다는 한계점이 존재한다.

이에, 생체 외 효소 반응을 통하여 오메가-3 다중불포화지방산을 이용하여 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 효율적으로 생산할 수 있는 기술 개발의 필요성이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

비특허문헌 1: Ogawa et al., J. Org. Chem., 82(4), 2032-2039 (2017)

본 발명의 일 목적은 다중불포화지방산으로부터 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소와, 이를 이용하여 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro) 내에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1 또는 서열번호 2과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 모노-하이드록시(mono-hydroxy) 또는 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 다중불포화지방산과 반응시키는 단계를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자가 형질도입된 형질전환체를, 다중불포화지방산의 존재 하에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 배양물에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 분리하는 단계를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 효소는 다중불포화지방산을 기질로 이용하여 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 단 한 번의 반응으로 생산해 낼 수 있는바, 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생체 외 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(A)과 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(B)의 과발현 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 도코사헥사노엔산(DHA)의 반응 생성물을 대상으로 순상 HPLC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 도코사헥사노엔산(DHA)의 반응 생성물을 대상으로 순상 HPLC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K1)과 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질(K2)에 대하여, 유사한 활성을 갖는 리폭시게나아제 효소인 인간 5LOX(AAA36183), 인간 12LOX(AAA51533), 인간 15LOX(AAA36183), 콩 15LOX(AAA33986), 감자 LOX(AAB81595) 및 홍조류 PhLOX2(AGN54275)와 각각 아미노산 서열의 상동성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인간 진피 섬유아세포에 대한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 1)와 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 2)의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 각질형성세포에 대한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 1)와 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 2)의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 인간 각질형성세포에 대하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 1)와 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 2)의 TNF-α 발현 억제 활성(도 7) 및 IL-6 발현 억제 활성(도 8)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 인간 진피 섬유아세포에 대하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 1)와 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 2)의 콜라겐 생성 향상 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 인간 진피 섬유아세포에 대하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 1)와 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 생성된 하이드록시 유도체(SPM 2)의 콜라겐 분해효소 생성 저해 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 (mono- hydroxy ) 또는 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소

본 발명의 일 측면은 다중불포화지방산의 모노-하이드록시(mono-hydroxy) 또는 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은, 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소에 포함되는, 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되고, 서열번호 2의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 다중불포화지방산에 2개의 수산기가 도입된 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생성할 수 있는 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(도 2, 3 참고).

2. 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 발현 벡터 및 형질전환체

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자를 포함한다.

상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.

상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 유전자(서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 유전자)를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.

3. 인 비트로( in vitro )에서 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법

본 발명의 또 다른 측면은 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법은 상기 "1. 다중불포화지방산의 모노-하이드록시(mono-hydroxy) 또는 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소 " 항목에서 설명한 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소와 다중불포화지방산을 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 다중불포화지방산은 탄소 간의 이중결합이 3개 이상 포함되어 있는 지방산으로, 오메가-3 지방산일 수 있으며, 보다 구체적으로는 도코사헥사노엔산 또는 에이코사펜타엔산일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 이와 같이, 상기 다중불포화지방산을 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 기질로 이용하는 경우, 기질 내 하이드록시기가 도입될 수 있는 이중 결합을 다수 포함하고 있는바, 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성이 달성될 수 있다.

본 발명의 상기 인 비트로(in vitro)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법은, 상기 효소와 다중불포화지방산의 반응물로부터 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 회수하는 단계를 더 포함한다.

상기 회수는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시함으로써 달성될 수 있고, 통상의 방식으로 정제하는 과정을 추가적으로 수행함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 정제하는 과정은 용매 침전, 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합하여 수행할 수 있다.

상기 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소와 다중불포화지방산을 반응시키는 단계는 10℃ 내지 40℃의 온도 범위, 바람직하게는 15℃ 내지 35℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 반응시키는 단계는 pH 4 내지 pH 10의 범위, 바람직하게는 pH 7 내지 pH 9의 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 온도 및 pH의 범위에서 수행하는 경우, 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 활성이 최대가 됨으로써 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 더욱 효율적으로 생산해 낼 수 있다.

4. 인 비보( in vivo ) 내에서 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법

본 발명의 다른 측면은 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 인 비보(in vivo)에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 생산 방법은 상기 “2. 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소의 발현 벡터 및 형질전환체 ” 항목에서 설명한 형질전환체를 다중불포화지방산의 존재 하에서 배양하는 단계 및 상기 배양된 배양물에서 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 분리하는 단계를 포함한다.

상기 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체에서는 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소가 발현될 수 있기 때문에, 상기 형질전환체 내에 존재하는 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소에 대해서는 상기 "1. 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 (mono- hydroxy ) 또는 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 한다.

상기 형질전환체는 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소가 발현되기 때문에, 이를 이용하면 다중불포화지방산을 기질로 포함하는 배양 배지에서 배양시킴으로써, 효소를 분리하는 별도의 과정 없이도 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 생산할 수 있다.

상기 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소 칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.

또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

5. 피부 노화 및 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

한편, 본 발명의 또 다른 측면은 피부 노화 및 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 피부 노화 및 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은, 다중불포화지방산을 상기 "1. 다중불포화지방산의 모노- 하이드록시 (mono- hydroxy ) 또는 디-하이드록시(di-hydroxy) 유도체 생성용 효소 " 항목에서 설명한 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소와 반응시켜 얻어지는, 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 유효성분으로 포함한다.

상기 다중불포화지방산은 탄소 간의 이중결합이 3개 이상 포함되어 있는 지방산으로, 오메가-3 지방산일 수 있으며, 보다 구체적으로는 도코사헥사노엔산 또는 에이코사펜타엔산일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 중에서도, 특히 본 발명의 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성용 효소를 다중불포화지방산과 반응시켜 얻어지는 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는, 진피 섬유아세포에 작용하여 염증 반응을 억제하는 한편, 콜라겐의 합성을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 도코사헥사노엔산을 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 반응하여 얻은 반응 생성물을 인간 진피 섬유아세포에 처리한 결과, UV 조사에 의해 증가된 염증 인자들의 발현을 억제되는 한편, 프로콜라겐의 합성이 향상되는 것을 확인하였다(도 6 내지 도 8 참고).

상기 피부의 노화는 피부의 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발되는 내인성 노화와 외인성 노화를 모두 포함한다. 특히, 상기 피부 노화는 광노화일 수 있고, 상기 광노화는 피부가 자외선에 반복적으로 또는 장기간 노출될 때 발생하는 피부 손상을 의미한다.

또한, 상기 주름은 안면을 포함하는 모든 신체 부위에서 발생하는 주름을 의미하고, 정적인 주름(static rhytides)과 동적인 주름(dynamic rhytides)을 모두 포함하는 것이다.

한편, 상기 피부 노화 및 주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용할 수 있다.

상기 조성물이 화장료 조성물로 활용되는 경우, 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예컨대 황산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 유탁액, 페이스트, 젤, 마스크, 팩, 분말, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누 형태인 경우에는 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수연화제 등을 포함하여 제조될 수 있으며, 상기 비누의 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 올리브유, 팜핵유, 호오바유 등의 식물유지나 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물 유지가 사용될 수 있고, 보습제로서는 글리세린, 데티프리톨, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 헥실 글리콜, 이소프로필미리스테이트, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 유화제로서 천연오일, 왁스, 탄화수소류 등이 사용 가능하며, 경수 연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 비누에는 첨가제로서 항균제, 거품억제제, 용매, 부식방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있으나, 이는 화장료 조성물이 제조되는 형태에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 적용 용량에 따라 달라지는 것이므로, 이에 한정되지 않는다.

상기 조성물이 약학적 조성물로 활용되는 경우, 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 외에, 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.

상기 '약학적으로 허용가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.

본 발명의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체, 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 조성물이 식품 조성물로 이용되는 경우, 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

상기 '기능성 식품'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '건강기능식품'이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 유방암 줄기세포 성장 억제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물에서, 상기 조성물 내의 상기 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다. 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 구체적으로는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프록토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 구체적으로는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또한, 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. 생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로카테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다. 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 약 0.0005 중량％ 내지 약 0.5 중량％ 범위를 의미한다. 사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

서열번호 1, 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 제조

[1-1] 단백질의 발현용 벡터 제작

서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산을 각각 암호화하는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 ㈜바이오니아社 에 의뢰하여 각각 합성하였고, 상기 합성된 각각의 염기서열을 주형으로 서열번호 5 내지 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분 동안 전변형(pre-denaturation) 시킨 다음, 94℃에서 30초, 61℃에서 30초, 72℃에서 2분 동안 반응시키는 사이클을 20회 반복하는 PCR을 수행함으로써 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 유전자를 각각 증폭하였다.

단백질	프라이머 염기서열(5’->3’)		서열번호
서열번호 1의 아미노산	정방향	CATATGATGTTTGGCATCTTCGACAAGG	5
	역방향	CTCGAGTTAGATAGAGATACTGTTCGGGATCCCC	6
서열번호 2의 아미노산	정방향	CATATGATGACAGGTGGGATGTTTGGAC	7
	역방향	CTCGAGTTAGATGGAAATACTGTTGGGAATTCCTTTG	8

상기와 같이 증폭된 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 각각의 PCR 산물을 플라스미드 벡터 pET28a(+)(Novagen, 미국)에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였고, 염기 서열 분석(Solgent)을 통해 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였다.

[1-2] 단백질의발현 및 정제

상기 실시예 [1-1]에서 제조된 각각의 재조합 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 각각의 형질전환체를 3㎖의 LB 배지에 접종하고 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃에서 종균 배양하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액을 500㎖의 LB 배지에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 과발현을 유도하는 과정에서, IPTG를 첨가하기 전에는 배양 온도를 37℃로 유지하였고, IPTG를 첨가한 후에는 배양 온도를 20℃로 낮추었다.

상기 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하고, 상등액을 분리해 낸 펠렛에서 형질전환체의 세포를 파쇄하여 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)을 수득하였다.

상기와 같이 수득된 세포 용해물 100㎕를 대상으로 SDS-PAGE를 수행한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 약 96.9KDa의 크기를 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질(도 1의 (A))과 약 96.8KDa의 크기를 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질(도 1의 (B))이 과발현된 것을 확인하였다.

상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되어 있는 것으로 확인된 세포 용해물을 대상으로, Ni-NTA 흡착 크로마토그래피를 이용하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였다.

단백질의 활성 확인 - 모노- 하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체 생성 활성의 확인

상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단배질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대하여, 이들 각각의 단백질 6KU 또는 10KU와 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid; DHA) 100 μM을 pH 7, 실온에서 30분 동안 반응 시키고, 최종 농도가 50 mM이 되도록 1 M의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 첨가하여 반응 산물을 환원시킨 뒤, 5 ㎕/ml의 아세트산을 첨가하여 상기 반응을 종료시켰다.

고체상 카트리지(SPE, C18 500mg)를 이용하여 상기 반응 산물을 정제한 뒤, 순상 HPLC(Normal phase HPLC) 를 이용하여 상기 반응 생성물 내의 화합물의 종류를 분석하였다.

구체적으로, 상기 순상 HPLC 분석은 supelcosil LC-Diol컬럼(Supelco, 25cm×3mm, 5㎛)에, 95% n-헵탄, 5% 이소프로판올, 0.1% 아세트산, 0.1% 2,2-디메톡시프로판으로 구성된 이동상을 유량 0.5ml/min의 속도로, 40분 동안 20㎖ 전개하였으며, DAD(Diode Array Detector)를 이용하여 반응 산물 내의 화합물을 최종적으로 검출하는 방법으로 수행되었다.

그 결과, 도 2, 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 모두 DHA로부터 17S-모노하이드록시-DHA, 7S,17S-디-하이드록시-DHA(resolvin D5), 10S,17S-디하이드록시-DHA(protectin DX)를 생성할 수 있는 것으로 확인되었고, 각각의 경우에 위 3가지 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체의 함량이 각각 아래 표 3에 기재된 바와 같은 비율로 존재하는 것으로 확인되었다.

효소	2차 구조	함량(비율)
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의해 생성된 유도체	17S-모노하이드록시-DHA	1.03㎎ (25.06%)
	7S,17S-디-하이드록시-DHA (resolvin D5)	2.43㎎ (59.04%)
	10S,17S-디하이드록시-DHA (protectin DX)	0.66㎎ (15.98%)
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의해 생성된 유도체	17S-모노하이드록시-DHA	0.53㎎ (20.98%)
	7S,17S-디-하이드록시-DHA (resolvin D5)	1.79㎎ (71.45%)
	10S,17S-디하이드록시-DHA (protectin DX)	0.19㎎ (7.44%)

단백질의 아미노산 서열 분석

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 대상으로, 인간 5LOX(AAA36183), 인간 12LOX(AAA51533), 인간 15LOX(AAA36183), 콩 15LOX(AAA33986), 감자 LOX(AAB81595) 및 홍조류 PhLOX2(AGN54275)와 대비하여, 아미노산 서열의 상동성 분석 및 계통 분석을 수행하였다.

그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 도 4에 도시된 바와 같이, 인간 5LOX(AAA36183), 인간 12LOX(AAA51533), 인간 15LOX(AAA36183), 콩 15LOX(AAA33986), 감자 LOX(AAB81595) 및 홍조류 PhLOX2(AGN54275)와 매우 낮은 서열 상동성을 나타내는 것으로 확인되었다.

또한, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 모두 막지질과의 결합을 수행하는 N-말단 영역이 존재하고, C-말단 영역에서 높은 유사성을 보이는 것으로 확인되었다. 특히, 철 이온과 결합하는 잔기인 His, His, His 및 Asn/Ser, 말단 아미노산이 존재하였고(붉은색으로 표시), 효소의 수산화 특성과 밀접하게 관계가 있는 Ala이 존재하는 것으로 확인되었다(녹색으로 표시).

또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 2차 구조를 분석한 결과, α-헬릭스, 확장된 가닥 및 랜덤 코일이 각각 아래 표 3에 기재된 바와 같은 비율로 존재하는 것으로 확인되었다.

효소	2차 구조	비율
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질	α-헬릭스	33.14%
	확장된 가닥	26.33%
	랜덤 코일	40.53%
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질	α-헬릭스	31.83%
	확장된 가닥	29.17%
	랜덤 코일	39.00%

본 발명의 단백질의 효소 활성에 의해 생성된 반응 생성물의 효과 확인- 피부 노화 및 주름 개선 억제

상기 실시예 2에서와 같이, 도코사헥사엔산을, 본 발명의 서열번호 1을 갖는 단백질과 반응시켜 얻은 생성물(SPM 1)과 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 반응시켜 얻은 생성물(SPM 2)을 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast)에 처리하여 세포 독성, MMP-1 발현 및 프로콜라겐 합성 효과를 확인하였고, 인간 각질형성세포(human keratinocyte)에 처리하여 세포 독성, TNF-α 발현 및 IL-6 발현의 변화를 확인하였다.

[4-1] 세포 독성 확인

인간 진피 섬유아세포와 인간 각질형성세포에 상기 SPM 1과 SPM 2를 각각 0.001, 0.01, 0,1 및 1ppm의 농도로 처리하여 세포의 생존률(cell viability)을 확인하였다.

그 결과, 도 5와 도 6에 도시된 바와 같이, 두 반응 생성물(SPM 1, SPM 2) 모두 모든 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었고, 이로부터 본 발명의 단백질에 의해 DHA로부터 생성되는 생성물은 모두 세포 독성이 없음을 알 수 있다.

[4-2] TNF-α 및 IL-6의 발현 억제능 향상 효과 확인

인간 각질형성세포를 48웰 플레이트에 4x10⁴개/웰의 농도로 분주하고 5% CO₂,37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 DMEM Serum Free media로 기아 상태를 24시간 동안 유지하였다.

상기 SPM 1 및 SPM 2를 DMEM(FBS 2%)으로 희석하여 1ppm으로 만들고, 이를 순차적으로 희석하여 0.1, 0.01 및 0.001ppm으로 만든 다음, 상기와 같이 배양되어 배지가 제거된 인간 각질형성세포에 1시간 동안 처리하였다. 그런 다음, TNF-α또는 IL-6 발현을 위해 배지를 250㎕의 DPBS(WelGENE)로 교환하고 160mJ/㎠의 UVB를 조사한 뒤, 다시 SPM 1 및 SPM 2를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 그리고 배지를 수거한 뒤, Human TNF-α DuoSet ELISA(R&D system)를 사용하여 TNF-α의 양을, 그리고 Human IL-6 DuoSet ELISA(R&D system)를 사용하여 IL-6의 양을 각각 측정하고, 바닥에 부착되어 있는 세포를 DPBS로 세척한 후, 1N NaOH로 용해시켜 BCA 분석을 통해 단백질 양을 측정하여 일정 단백질당 TNF-α 또는 IL-6의 합성량을 측정하였다. 이때, 아무 것도 처리하지 않은 경우를 음성 대조군으로, 그리고 10ppm의 덱사메타손(dexamethasone)을 처리한 경우를 양성 대조군으로 하여, 두 반응 생성물 SPM 1, SPM 2의 효과를 확인하였다.

먼저, TNF-α의 경우, 도 7에 도시된 바와 같이, UVB를 조사함으로써 TNF-α의 발현이 약 2배 정도 증가하였고, 이렇게 증가된 TNF-α의 발현은 10ppm의 덱사메타손을 처리함에 따라 약 35% 정도 감소되는 한편, 1ppm의 SPM 1에 의해 약 24% 정도, 그리고 1ppm의 SPM 2에 의해 약 56% 정도 감소되었으며, 이러한 TNF-α의 발현 억제 효과는 SPM 1, 2의 처리 농도에 의존적인 경향을 나타내었다.

다음으로, IL-6의 경우, 도 8에 도시된 바와 같이, UVB를 조사함으로써 IL-6의 발현이 약 1.6배 정도 증가하였고, 이렇게 증가된 IL-6의 발현은 10 ppm의 덱사메타손을 처리함에 따라 약 88% 정도 감소되는 한편, 1ppm의 SPM 1에 의해 약 35% 정도, 그리고 1ppm의 SPM 2에 의해 약 92% 정도 감소되었으며, 이러한 IL-6의 발현 억제 효과 역시 SPM 1, 2의 처리 농도에 의존적인 경향을 나타내었다.

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 단백질에 의해 DHA로부터 생성되는 생성물은 모두 염증을 종결시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

[4-3] 프로콜라겐(procollagen) 합성능 향상 효과 확인

세포외기질의 주요 구성 성분인 콜라겐은 프로콜라겐이라는 전구 물질의 형태로 합성된다. 상기 프로콜라겐은 중합 반응이 일어날 때 콜라겐 분자로부터 절단, 분리되는 것으로 알려져 있는바, 프로콜라겐의 양을 측정함으로써 세포 내에서의 콜라겐 생합성 정도를 가늠할 수 있다.

인간 진피 섬유아세포에 상기 SPM 1과 SPM 2를 각각 0.01, 0,1 및 1ppm의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 다음, 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen typeI c-peptide (PIP) EIA 키트(TAKARA, MK101)로 프로콜라겐의 양을 측정하였다. 이때, 아무 것도 처리하지 않은 경우를 음성 대조군으로, 그리고 26.2ppm의 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate)를 처리한 경우를 양성 대조군으로 하여, 두 반응 생성물 SPM 1, SPM 2의 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 두 반응 생성물(SPM 1, 2) 모두 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군에 비해 더 많은 양의 프로콜라겐이 확인되었다. 특히 SPM 2의 경우 0.1ppm 이상의 농도에서 양성 대조군(26.2ppm의 레티닐 팔미테이트)에 비해, 더 많은 양의 프로콜라겐이 확인되었다. 이로부터 본 발명의 단백질에 의해 DHA로부터 생성되는 생성물은 모두 프로콜라겐의 합성능을 향상시킴을 알 수 있다.

[4-4] 콜라겐분해효소(MMP-1) 발현 억제능 향상 효과 확인

MMPs(matrix metalloproteinases)는 단백질 분해 활성을 갖는 효소로, 세포외기질을 구성하는 단백질들을 분해하여 세포외기질을 구성하는 단백질과 세포의 결합에 중요한 영향을 미치게 된다. MMPs는 28개의 타입으로 존재하며, 이 중 MMP-1은 콜라겐을 분해하는 효소로 본 실시예에서는 세포 내 MMP-1의 발현 정도를 확인하였다.

인간 진피 섬유아세포를 24시간 동안 배양한 다음 배지를 250㎕/웰 농도의 DPBS(WelGENE)로 교환하고 100mJ/㎠의 UVB를 조사한 뒤, 상기 SPM 1과 SPM 2가 각각 0.01, 0,1 및 1ppm의 농도로 희석된 DMEM(2% FBS)을 처리하여 48시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 수거한 뒤 human total MMP-1 ELISA kit(R&D systems, DY901)를 사용하여 MMP-1 양을 측정하였다. 이때, 아무 것도 처리하지 않은 경우를 음성 대조군으로, 그리고 6ppm의 레티노산(retinoic acid)를 처리한 경우를 양성 대조군으로 하여, 두 반응 생성물 SPM 1, SPM 2의 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, UVB를 조사함으로써 MMP-1의 발현이 약 2배 정도 증가하였고, 이렇게 증가된 MMP-1의 발현은 6ppm의 레티노산을 처리함에 따라 약 70% 정도 감소되는 한편, SPM 1을 처리한 경우에는 0.1ppm과 1ppm에서 각각 17.2%, 80.1% 감소되었고, SPM 2를 처리한 경우에는 0.01ppm에서 11.4%, 0.1ppm에서 26.1%, 그리고 1ppm에서 63.3% 감소되었으며, 이러한 MMP-1의 발현 억제 효과 역시 SPM 1, 2의 처리 농도에 의존적인 경향을 나타내었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> METHOD FOR PRODUCING MONO-HYDROXY OR DI-HYDROXY DERIVATIVES OF POLYUNSATURATED FATTY ACID <130> 2018DPA2674 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 727 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme (K1) <400> 1 Met Ser Val Ser Leu Met Gln Ala Tyr Thr Val Met Asn Ser Ala Thr 1 5 10 15 Val Lys Lys Thr Leu Leu Asn Leu Tyr Lys Leu Val Val Thr Ile Arg 20 25 30 Lys Gly Leu Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Tyr Asn Tyr Asn Tyr Ile Pro 35 40 45 Pro Leu Ala Met Thr Glu Gly Pro Pro Leu Leu Asp Ser Gly Leu His 50 55 60 Leu Pro Leu Glu Glu Leu Pro Asn Pro Lys Trp Ile Phe Leu Val Leu 65 70 75 80 His Lys Leu Ala Val Ile Thr Val Asn Lys Ala Ile Gly Lys Leu Val 85 90 95 Thr Glu Gly Ser Glu Leu Val Ser Phe Ser Val Thr Glu Gly Pro Glu 100 105 110 Ala Asp Ile Asp Leu Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Gln Gln Ile Gln Ser Ala Asp Ser Glu Gln Asp Leu Glu Gln Val 130 135 140 Ala Leu Gln Leu Ala Ala Leu Thr Arg Glu Ile Ser Asp Glu Leu Asp 145 150 155 160 Pro Val Asp Ser Ser Ser Val Ser Phe Asp Ile Ser Ser Ala Pro Glu 165 170 175 Ser Glu Leu Glu Ala Gln Ile Arg Glu Ile Asp Glu Gln Val Ala Ser 180 185 190 Ser Glu Glu Val Ser Phe Ser Val Pro Ser Gly Thr Glu Glu Ser Glu 195 200 205 Gly Ile Ser Asp Ser Leu Leu Ala Ala Phe Arg Glu Ala Ile Thr Ser 210 215 220 Ser Gly Lys Leu Ile Glu Leu Asp Glu Gln Gln Ala Thr Ser Gly Glu 225 230 235 240 Val Ser Phe Ser Val Asp Ser Phe Ala Ala Ala Pro Ser Leu Glu Asp 245 250 255 Tyr Asn Lys Leu Phe Thr Arg Ile Ser Leu Pro Lys Ile Ser Ala Arg 260 265 270 Phe Gln Glu Asp Gln Val Phe Ala Tyr Met Gln Val Ala Gly Pro Asn 275 280 285 Ala Val Met Leu Glu Gln Val Ala Glu Gly Asp Pro Phe Val Val Arg 290 295 300 Leu Thr Gln Glu Leu Pro Glu Gly Gly Tyr Ala Lys Ile Ile Gly Thr 305 310 315 320 Gly Asp Ser Leu Ala Ala Ala Val Lys Glu Gly Arg Val Tyr Lys Ala 325 330 335 Asp Tyr Ser Leu Leu Glu Gly Met Glu Asn Gly Thr Phe Pro Asp Gln 340 345 350 Gln Lys Tyr Thr Tyr Ala Pro Leu Gly Leu Phe Ala Val Pro Pro Gln 355 360 365 Gly Cys Ser Ser Arg Asn Leu Leu Pro Val Ala Ile Gln Cys Gln Pro 370 375 380 Gly Ala Asp Cys Thr Gly Pro Val Phe Thr Pro Leu Lys Gly Glu Ser 385 390 395 400 Trp Met Val Ala Lys Thr Ile Leu Gln Met Ala Asn Val Asn Tyr Leu 405 410 415 Glu Leu Val Ser His Leu Gly Gln Thr His Leu Val Ile Glu Pro Phe 420 425 430 Val Leu Ala Thr Lys Arg Ile Leu Pro Arg Thr His Arg Leu Arg Leu 435 440 445 Leu Leu Asp Pro His Phe Glu Gly Thr Val Leu Ile Asn Tyr Gly Ala 450 455 460 His Lys Thr Leu Ile Ala Pro Gly Trp Asp Val Asp Lys Leu Leu Ala 465 470 475 480 Ser Thr Ile Glu Asn Asp Gly Leu Ile Ala Val Lys Gly Ala Gln Ser 485 490 495 His Leu His Asn Phe Asn Glu Val Ser Phe Pro Lys Leu Leu Ala Ser 500 505 510 Arg Gly Val Thr Asn Ser Ala Gln Leu Pro Glu Tyr Pro Tyr Arg Asp 515 520 525 Asp Gly Leu Leu Ile Trp Asn Ala Leu His Glu Trp Val Ser Asp Tyr 530 535 540 Leu Arg Leu Cys Tyr Thr Ser Asp Ala Gln Ile Val Ala Asp Ala Asp 545 550 555 560 Leu Gln Ser Trp Ala Lys Glu Leu Val Ser Asp Ala Gly Gly Arg Leu 565 570 575 Lys Asn Phe Gly Glu Asp Ser Ser Gly Ala Ile Lys Thr Leu Asp Tyr 580 585 590 Leu Ile Asp Thr Val Cys Ser Val Ile Phe Ile Ala Ser Ala Gln His 595 600 605 Ala Ala Met Asn Phe Pro Gln Asn Glu Leu Met Thr Tyr Ala Pro Ala 610 615 620 Phe Pro Leu Ala Val Tyr Ser Pro Ala Pro Thr Asn Pro Asp Glu Ser 625 630 635 640 Met Asp Trp Met Glu Trp Leu Pro Ser Leu Glu Lys Ala Glu Asn Gln 645 650 655 Val Lys Val Cys Tyr Leu Leu Gly Ala Val Tyr Tyr Thr Gln Leu Gly 660 665 670 Gly Tyr Gly Lys Lys Gln Phe Thr Asp Ser Lys Val Lys Ala Ala Leu 675 680 685 Gly Lys Phe Gln Asn Arg Leu Lys Asp Ile Glu Lys Glu Ile Thr Lys 690 695 700 Lys Asn Ser Ser Arg Ile Met Pro Tyr Lys Phe Leu Leu Pro Ser Gln 705 710 715 720 Ile Pro Gln Ser Ile Asn Ile 725 <210> 2 <211> 571 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme (K2) <400> 2 Met Val Asp Asn Met Lys Pro Ser Leu Pro Gln Asp Asp Pro Asn Gln 1 5 10 15 Glu Gln Arg Lys Asp Ser Leu Asn Arg Gln Gln Gln Ala Tyr Gln Phe 20 25 30 Asp Tyr Glu Ser Leu Ser Pro Leu Ala Leu Leu Lys Asn Val Pro Ala 35 40 45 Val Glu Asn Phe Ser Ser Lys Tyr Ile Gly Glu Arg Ile Leu Ala Thr 50 55 60 Ser Glu Leu Pro Ala Asn Met Leu Ala Ala Asp Ser Arg Thr Phe Leu 65 70 75 80 Asp Pro Leu Asp Glu Leu Gln Asp Tyr Glu Asp Phe Phe Thr Leu Leu 85 90 95 Pro Leu Pro Ala Val Ala Lys Ile Tyr Gln Thr Asp Arg Ser Phe Ala 100 105 110 Glu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Asn Pro Met Val Leu Arg Leu Leu Asp 115 120 125 Ala Gly Asp Pro Arg Ala Gln Thr Leu Ala Gln Ile Ser Ser Phe His 130 135 140 Pro Leu Phe Asp Leu Gly Gln Glu Leu Gln Gln Lys Asn Ile Tyr Val 145 150 155 160 Ala Asp Tyr Thr Gly Thr Asp Glu His Tyr Arg Ala Pro Ser Lys Ile 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Tyr Glu Lys Gly Arg Lys Phe Leu Pro Lys Pro Arg 180 185 190 Ala Phe Phe Ala Trp Arg Trp Thr Gly Ile Arg Asp Arg Gly Glu Met 195 200 205 Thr Pro Ile Ala Ile Gln Leu Asp Pro Thr Pro Asp Ser His Val Tyr 210 215 220 Thr Pro Phe Asp Pro Pro Val Asp Trp Leu Phe Ala Lys Leu Cys Val 225 230 235 240 Gln Val Ala Asp Ala Asn His His Glu Met Ser Ser His Leu Gly Arg 245 250 255 Thr His Leu Val Met Glu Pro Ile Ala Ile Val Thr Ala Arg Gln Leu 260 265 270 Ala Gln Asn His Pro Leu Ser Leu Leu Leu Lys Pro His Phe Arg Phe 275 280 285 Met Leu Thr Asn Asn Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Leu Ile Ala Pro Gly 290 295 300 Gly Pro Val Asp Glu Leu Leu Gly Gly Thr Leu Pro Glu Thr Met Glu 305 310 315 320 Ile Ala Arg Glu Ala Cys Ser Thr Trp Ser Leu Asp Glu Phe Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Glu Leu Lys Asn Arg Gly Met Asp Asp Thr Asn Gln Leu Pro 340 345 350 His Tyr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Leu Leu Leu Trp Asp Ala Ile Glu 355 360 365 Thr Phe Val Ser Gly Tyr Leu Lys Phe Phe Tyr Pro Thr Glu Ile Ala 370 375 380 Ile Val Gln Asp Val Glu Leu Gln Thr Trp Ala Gln Glu Leu Ala Ser 385 390 395 400 Asp Arg Gly Gly Lys Val Lys Gly Met Pro Pro Arg Ile Asn Thr Val 405 410 415 Glu Gln Leu Ile Lys Ile Val Thr Thr Ile Ile Phe Thr Cys Gly Pro 420 425 430 Gln His Ser Ala Val Asn Phe Pro Gln Tyr Glu Tyr Met Ser Phe Ala 435 440 445 Ala Asn Met Pro Leu Ala Ala Tyr Arg Asp Ile Pro Lys Ile Thr Ala 450 455 460 Ser Gly Asn Leu Glu Val Ile Thr Glu Lys Asp Ile Leu Arg Leu Leu 465 470 475 480 Pro Pro Tyr Lys Arg Ala Ala Asp Gln Leu Lys Ile Leu Phe Thr Leu 485 490 495 Ser Ala Tyr Arg Tyr Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Asp Lys Ser Phe Arg 500 505 510 Glu Leu Tyr Arg Met Ser Phe Asp Glu Val Phe Ala Gly Thr Pro Ile 515 520 525 Gln Leu Leu Ala Arg Gln Phe Gln Gln Asn Leu Asn Met Ala Glu Gln 530 535 540 Lys Ile Asp Ala Asn Asn Gln Lys Arg Val Ile Pro Tyr Ile Ala Leu 545 550 555 560 Lys Pro Ser Leu Val Ile Asn Ser Ile Ser Met 565 570 <210> 3 <211> 2580 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme (K1) <400> 3 atgacaggtg ggatgtttgg acgtaagggg cagaagatta aggggacagt ggtattgatg 60 cctaagaatg tgttggattt caacgccata acctccgtcg gcaagggcag tgctaaggac 120 accgccaccg atttcttggg caagggcttg gacgcactgg gtcacgcagt tgatgccctc 180 actgccttcg ctggccacag catctccttg cagcttatct cggctactca gactgatggt 240 agtggaaaag gtaaagttgg aaacgaagcc tatttggaaa agcatcttcc gaccttgcct 300 acgctgggag cgcgccagga agcgttcgat attaactttg aatgggatgc gagttttgga 360 attccaggag cattttacat caaaaatttt atgacggatg agtttttcct cgtctctgtt 420 aaattagagg acattccgaa ccatggaacc attaacttcg tttgtaactc atgggtttat 480 aacttcaaat cttacaagaa gaatcgcatt ttctttgtca atgataccta tctaccgtcc 540 gcgacgccag gcccactagt taagtacaga caggaagaat tggaggtttt acggggcgat 600 ggcacgggga agcgtcgcga ctttgaccgg atctatgatt atgatatcta caatgatttg 660 ggcaatccag atggtggtga tccgcgccca atcattgggg gcagcagcaa ctatccttac 720 cctcgccgtg ttcggaccgg tagagaaaag accaggaaag accccaacag tgagaaacca 780 ggcgagatat atgttccgcg cgatgaaaac ttcggtcact taaagtcatc tgatttcctt 840 acgtacggga tcaagtcctt atctcagaac gtgattcctt tgttcaaatc tataatactg 900 aacttacgag tcacatcgtc ggagttcgat tcgttcgacg aagtgcgtgg tctctttgaa 960 ggtggaatca agctgccaac aaatatactg agccaaatta gcccattacc ggtcctcaag 1020 gaaatcttcc gcactgatgg tgaaaatacc cttcaatttc caccgccgca tgtaatccga 1080 gttagtaaat ctggatggat gactgacgac gagtttgcca gagaaatgat tgctggtgta 1140 aatcccaatg 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ctgaacttca agcatggtgg aaagaagtag tggagaaggg tcatggtgac 2040 ttaaaagata agccttggtg gcctaaatta cagactgtgg aagatctcat tcaatcctgc 2100 tctataatta tatggacagc ttcggctctc cacgcagctg tcaattttgg ccaatacccc 2160 tatggcggtt atatcgtgaa ccgtccaacc cttgcacgta ggtttatccc agaagaagga 2220 accaaagaat atgatgagat ggtgaaagat cctcagaagg catatctgag aacaatcaca 2280 cccaagttcg agacccttat tgacatttca gtgatagaga tattatcacg gcacgcttct 2340 gatgaagtct atctgggcca acgtgataat ccaaattgga ctacggattc aaaggcactg 2400 gaagctttca aaaagtttgg aaacaaactg gccgaaattg agggaaaaat cacacagcgg 2460 aacaatgatc caagtctgaa aagccgacat gggccagttc agcttccata cacgttgctg 2520 catcgttcaa gcgaagaagg gatgagtttc aaaggaattc ccaacagtat ttccatctaa 2580 2580 <210> 4 <211> 2595 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme (K2) <400> 4 atgtttggca tcttcgacaa ggggcagaag ataaagggga ccgtggtgtt gatgccgaag 60 aacgtgttgg acttcaacgc cataacctcc atcggtaaag gtggtgttat tgacacagcc 120 accggcatct taggccaggg cgttagctta gttggtggag taattgatac cgccacttcc 180 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acggtgaaaa tgttcttcag tttccacctc cacatgtagc caaagtttcc 1080 aagtctgggt ggatgactga tgaggaattt gctcgtgagg tgattgccgg cgtaaaccca 1140 aatgtcatcc gtcggcttca ggaattcccg ccaaagagca cacttgatcc cacactctat 1200 ggtgatcaga ccagcaccat aacaaaagaa cagttggaaa ttaacatggg tggggtcaca 1260 gtagaagagg cgcttagtac ccagcggtta ttcatactgg actatcaaga tgcatttatc 1320 ccatatttga cgcggataaa cagcctacct actgcaaaag cgtatgccac aaggacaatc 1380 ctgttcttga aagacgatgg cactttgaag ccattagcta tcgaattaag caaaccacat 1440 ccagatggag ataatttggg tcctgagtcg atagtggtgc tgcctgcaac ggaaggtgtt 1500 gatagtacca tctggctatt ggccaaggct catgttattg tgaatgactc tggttatcac 1560 cagctggtaa gccattggtt aaacactcat gcagtgatgg aaccatttgc cattgcaacc 1620 aataggcacc tcagtgtgct ccaccctatt tataaacttt tgtatcctca ctaccgcgac 1680 accataaata ttaatggctt ggctcgccag tccctgatta atgcggatgg cattatcgaa 1740 aaatcatttt tgcccggaaa gtactccatt gagatgtctt catcagtcta caaaaattgg 1800 gtttttactg accaggcatt accagccgat ctggtcaagc gaggattggc aattgaagat 1860 ccctctgcac cccatggcct tcgccttgtg atagaggact acccttatgc tgttgatgga 1920 cttgaaatat gggatgctat taagacatgg gttcatgaat atgtctcctt gtattaccca 1980 acagatgcag ccgttcaaca ggacactgaa ctacaagcat ggtggaagga agcggtggag 2040 aagggtcacg gtgacctgaa agaaaagcct tggtggccta aaatgcagac aacggaagat 2100 ctgattcaat catgttctat tatcgtttgg acagcttcgg ctctccatgc tgcggttaat 2160 tttggacaat atccttacgg gggcttaatc ctgaaccgtc caactctagc ccgccgtttt 2220 atcccagcgg agggaacccc agagtatgat gaaatggtga agaatcctca aaaagcttat 2280 ctgcgaacaa tcacacccaa gtttgagacc ctgattgatt tatcggtaat tgaaatattg 2340 tcacgacatg cttctgatga gatatacctg ggagagcgcg aaaccccaaa ttggacgact 2400 gataagaagg cattagaagc attcaaacgt tttggcagca aactgactgg tattgaagga 2460 aaaatcaatg cgaggaacag tgatccgagt cttagaaacc ggacggggcc agttcagctg 2520 ccatatactt tgctccatcg ttcatcggag gaagggttga ctttcaaggg gatcccgaac 2580 agtatctcta tctaa 2595 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for K1 <400> 5 catatgatgt ttggcatctt cgacaagg 28 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for K1 <400> 6 ctcgagttag atagagatac tgttcgggat cccc 34 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for K1 <400> 7 catatgatga caggtgggat gtttggac 28 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for K2 <400> 8 ctcgagttag atggaaatac tgttgggaat tcctttg 37

Claims (15)

1. 도코사헥사노엔산(DHA)의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 유효성분으로 포함하고,
   상기 도코사헥사노엔산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체(mono-hydroxy or di-hydroxy derivatives) 생성용 효소와 반응하여 생성되는 것인 피부 노화 또는 주름의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 도코사헥사노엔산(DHA)의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체를 유효성분으로 포함하고,
   상기 도코사헥사노엔산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 다중불포화지방산의 모노-하이드록시 또는 디-하이드록시 유도체(mono-hydroxy or di-hydroxy derivatives) 생성용 효소와 반응하여 생성되는 것인 피부 노화 또는 주름의 개선용 화장료 조성물.
   
   
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