KR101749132B1 - 탄자와익산(tanzawaic acid) 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염증, 항당뇨 또는 항비만 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양 진균 Penicillium sp. SF-6013의 추출물로부터 분리된 항염증, 항당뇨 또는 항비만 효과를 갖는 탄자와익산 유도체를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Penicillium sp. SF-6013 유래 탄자와익산 유도체는 전염증 매개체의 생성 억제 및 단백질 타이로신 포스파타제 1B(PTP1B)의 활성을 저해하므로 항염증, 항당뇨 또는 항비만 조성물로 유용하다.

Description

탄자와익산(tanzawaic acid) 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Inflammatory Diseases Comprising Tanzawaic Acid}
본 발명은 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염증, 항당뇨 또는 항비만 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양 진균 Penicillium sp. SF-6013의 추출물로부터 분리된 항염증, 항당뇨 또는 항비만 효과를 갖는 탄자와익산 유도체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 방사선조사, 물리적 손상 및 신진대사 과부하 등의 다양한 자극에 대한 신체방어 메커니즘이지만(Anderson et al., Pharmacol . Rev. 60:311357, 2008), 조절완화(deregulated) 또는 만성적인 염증반응은 관절염, 간염, 패혈성 쇼크 및 신경병성 장애 등을 포함하는 다양한 질병을 유발할 수 있다(Chung et al., Clin . Rheumatol . 26:1228-1233,2007). 대식세포는 여러 염증반응에서 중요한 역할을 하며(Mayeux et al., J. Toxicol . Environ. Health. 51:415-435,1997), LPS는 산화질소(NO), 프로스타글라딘 E2(PGE2) 등의 염증 매개체 및 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β) 등의 염증성 사이토카인을 생산하는 대식세포를 활성화시킨다(Takeuchi et al., J. Biol . Chem . 281:21362-21368, 2006). 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)는 염증성 질환으로 발전할 수 있는 과도한 산화질소의 형성을 촉진하며(Nathan et al., Curr . Opin . Immunol. 3:65-70, 1991), 사이클로옥시제나제-2(COX-2)는 PGE2의 합성을 위한 염증 자극과 반응에 의해 유도된다(Yoon et al., J. Biosci . Bioeng . 107:429-438,2009). 따라서, iNOS와 COX-2에 의한 NO와 PGE2의 과발현은 염증반응 조절에 중요한 역할을 한다.
해양 환경의 고유한 특성으로, 해양 진균은 다양한 신규 이차 대사산물의 잠재적 원천이다(D'Orazio, N. et al., Mar. Drugs 10:812-833, 2012; Senthilkumar, K. et al., Evid . Based Complement Alternat . Med . 2013:572-859, 2013; Fenical, W. et al., Nat. Chem . Biol . 2:666-673, 2006; Bugni, T.S. et al., Nat. Prod. Rep. 21:143-163, 2004). 진균속 페니실리늄(Penicillium)은 맥각알칼로이드(ergot alkaloids), 디케토피페라진(diketopiperazines), 벤조디아제핀(benzodiazepines), 퀴놀린(quinolines), 퀴나졸린(quinazolines) 및 폴리케티드(polyketides) 등을 포함하는 다양한 종류의 화학구조를 가지는 이차대사산물(Kozlovskii et al., Appl . Biochem. Microbiol . 49:1, 2013)을 생산하는 것으로 알려진 300개 이상의 종을 포함한다(Kirk et al., Dictionary of the Fungi, 10th ed.; CABI: Europe-UK, 2008). 해양 유래 진균류로부터 생리활성 이차대산산물을 탐색(Quang et al., Korean Chem . Soc . 34:3109, 2013; Lee et al., Mar. Drugs 11:4510, 2013)하는 과정에서, 여러가지 해양 진균에서 분리된 생리활성 이차 대사산물로부터 그 효과를 조사하였다
이에, 본 발명자들은 해양 진균 유래의 생리활성 이차대사산물을 이용한 염증성 질환, 당뇨 또는 비만의 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 해양으로부터 분리한 Penicillium sp. SF-6013에서 추출된 화합물의 구조 및 화학적 성질을 조사하여 탄자와익산 유도체인 것을 규명한 후, 상기 탄자와익산 유도체의 항염증, 항당뇨 및 항비만 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Penicillium sp. SF-6013 유래의 추출물에서 분리한 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 탄자와익산 유도체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015050257582-pat00001
.
본 발명은 또한, (a) Penicillium sp. SF-6013을 에틸아세테이트로 추출하는 단계; (b) (a) 단계에서 수득된 Penicillium sp. SF-6013 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 메탄올 수용액에서 용출하는 단계; (c) (b) 단계에서 용출된 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 제1용매에서 용출하는 단계; 및 (d) (c) 단계에서 용출된 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 제2용매에서 용출시켜 탄자와익산 유도체를 함유하는 분획을 수득하는 단계를 포함하는 화학식 1 내지 3으로 구성되는 군에서 선택되는 탄자와익산 유도체의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015050257582-pat00002
[화학식 2]
Figure 112015050257582-pat00003
[화학식 3]
Figure 112015050257582-pat00004
상기 화학식에서 R은 수소 또는 수산기이고, R1은 CO2 -M+ 또는 CO2H이고, R2는 수소 또는 수산기이다.
본 발명은 또한, 화학식 1 내지 3으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나의 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 1 내지 3으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나의 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 1 내지 3으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나의 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 개선 또는 완화용 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 1 내지 3으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나의 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 Penicillium sp. SF-6013 유래 탄자와익산 유도체는 전염증 매개체의 생성 억제 및 단백질 타이로신 포스파타제 1B(PTP1B)의 활성을 저해하므로 항염증, 항당뇨 또는 항비만 조성물로 유용하다.
도 1은 Penicillium sp. SF-6013에서 추출한 탄자와익산 유도체 1-5의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 253K 및 298K에서 획득한 CD3OD에서 탄자와익산 유도체 1의 1H NMR 스펙트럼의 지역 확장을 나타낸 결과이다.
도 3은 탄자와익산 유도체 1의 선별된 HMBC 및 COSY의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 4는 LPS에 의해 유도되는 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현에 대한 탄자와익산 유도체 2의 영향을 확인한 결과이다. (A) RAW264.7 세포, (B) BV2 세포.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 Penicillium sp . SF-6013를 성게 Brisaster latifrons로부터 분리하고, 한국생물자원센터에 균주를 기탁하였다(기탁번호 KCTC 12811BP). 또한, Penicillium sp . SF-6013의 추출물로부터 탄자와익산 유도체를 분리하여, RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에서 산화질소, PGE2, IL-1β의 생성 억제 및 iNOS, COX-2의 발현 억제를 확인하여 항염증 조성물로의 효과를 규명하였으며, PTP1B 활성 저해를 확인하여 항당뇨 또는 항비만의 조성물로의 효과를 규명하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 화학식 1로 표시되는 탄자와익산 유도체에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112015050257582-pat00005
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 탄자와익산 유도체는 분자식 C18H22O3의 2E,4Z-탄자와익산 D 또는 그의 염인 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) Penicillium sp. SF-6013을 에틸아세테이트로 추출하는 단계; (b) (a) 단계에서 수득된 Penicillium sp. SF-6013 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 메탄올 수용액에서 용출하는 단계; (c) (b) 단계에서 용출된 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 제1용매에서 용출하는 단계; 및 (d) (c) 단계에서 용출된 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 제2용매에서 용출시켜 탄자와익산 유도체를 함유하는 분획을 수득하는 단계를 포함하는 화학식 1 내지 3으로 구성되는 군에서 선택되는 탄자와익산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112015050257582-pat00006
[화학식 2]
Figure 112015050257582-pat00007
[화학식 3]
Figure 112015050257582-pat00008
상기 화학식에서 R은 수소 또는 수산기이고, R1은 CO2 -M+ 또는 CO2H이고, R2는 수소 또는 수산기이다.
본 발명에 있어서, Penicillium sp. SF-6013의 에틸아세테이트로 추출물은 역상 C18, 실리카 겔 분취 TLC 및 반분취 HPLC 등의 여러 단계 크로마토그래피를 실시하여 탄자와익산 유도체를 분리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 크로마토그래피는 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 또는 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(sephadex LH-20)인 것이 바람직하며, 상기 (d) 단계의 크로마토그래피는 분취 TLC(preparative TLC) 또는 반분취 고속 액체 크로마토그래피(semi-preparative HPLC)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 제1용매는 메탄올 수용액 또는 CH2Cl2/MeOH인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20-100%(v/v)의 메탄올 수용액 또는 20:1의 CH2Cl2/MeOH인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 제2용매는 n-헥산-에틸아세테이트 또는 0.1% 포믹산이 포함된 메탄올 수용액인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1:6 또는 2:3의 n-헥산-에틸아세테이트 또는 0.1% 포믹산이 포함된 80-100%(v/v) 메탄올 수용액인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Penicillium sp. SF-6013 (KCTC 12811BP)는 성게 Brisaster latifrons로부터 분리한 곰팡이 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탄자와익산 유도체는 2E,4Z-탄자와익산 D, 탄자와익산 A, 탄자와익산 B, 탄자와익산 D, 탄자와익산 E 및 이들의 염으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 약제학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과 함께 약제학적으로 허용가능한 산의 염을 형성하거나, 또는 소듐, 포타슘 등의 알칼리 금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2E,4Z-탄자와익산 D는 다른 탄자와익산 유도체들과 상이하게 C-4 위치에서 Z 구조를 갖는 유일한 탄자와익산계 대사산물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2E,4Z-탄자와익산 D 및 탄자와익산 D는 n-헥산-에틸아세테이트(1:6)를 이용한 분취 TLC로 수득되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 탄자와익산 E는 n-헥산-에틸아세테이트(2:3)를 이용한 분취 TLC로 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탄자와익산 A 및 B는 0.1% 포믹산이 포함된 80-100%(v/v) 메탄올을 이용하여 반분취 HPLC로 각각 t R =24.7분 및 t R =26.3분에 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 Penicillium sp. SF-6013의 추출물에서 분리한 탄자와익산 유도체의 산화질소, PGE2, IL-1β의 생성 억제, iNOS, COX-2의 발현 억제 및 PTP1B 활성 저해를 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에서 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 염증성 질환의 개선 또는 완화용 식품에 관한 것이다.
본 발명의 탄자와익산 유도체는 항염증 및 항신경염증 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 상기 퇴행성 신경염증은 알츠하미어병, 파킨슨병, HIV-관련 치매(HAD), 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트 야콥병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 탄자와익산 유도체는 산화질소(NO), 프로스타그란딘 E2(PGE2), 인터루킨-1β(IL-1; interleukin-1β)의 생성 억제 및 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제의 특성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 및 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.001~100㎍/kg으로, 바람직하게는 0.01~10㎍/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 염증성 질환, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 라말린을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 메틸-페니시놀린(Methyl-penicinoline)을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로써 기능성 식품, 영양보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 라말린을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112015050257582-pat00009
[화학식 2]
Figure 112015050257582-pat00010
[화학식 3]
Figure 112015050257582-pat00011
상기 화학식에서 R은 수소 또는 수산기이고, R1은 CO2 -M+ 또는 CO2H이고, R3는 수소 또는 수산기이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 탄자와익산 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 염증성 질환, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "염증"이란, 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조식의 증식등이 보여진다.
본원에서 "산화질소"는 세포 내 염증반응 유발시 산화질소 합성효소에 의해 생성량이 증가하는 물질로, 염증반응의 지표가 되는 분자이다. 신경계에서 산화질소는 신경세포에 존재하는 신경계 산화질소 합성효소(NOS)에 의하여 합성된다. 상기 합성된 산화질소는 뇌세포에서 cGMP의 생성을 증가시키고, 이로 인하여 외부로부터 인지한 정보를 오랫동안 저장하는 기능을 수행한다. 산화질소(NO)는 자유 라디칼로 생리학적, 병리학적 과정에 관련된 것으로 알려져 있다. NO는 산화질소 합성효소에 의해 엘-아르기닌(L-Arginine) 산화에 의해 합성된다(Atkan, et al., 75: 639-653, 2004).
본원에서 "COX-2"는 염증반응과 관련된 단백질인 프로스타그란딘을 생성하는데 관여하는 효소로, 세포내 COX-2 발현 수준의 증가는 염증반응이 진행되고 있음을 나타내는 지표가 될 수 있다.
"프로스타그란딘 E2(PGE2)"는 프로스타그란딘 엔도페록시드 합성효소라고 불리는 COX-2에 의해 염증 부위에서 생성되는 다른 염증 매개체이다. PGE2는 많은 심장혈관 질환, 관절염, 염증성 장 질환 및 만성 위궤양을 포함하는 만성 염증성 질환과 관련되어 있다(St-Onge, M. et al., Biochim.Biophys.Acta. 1771:1235-1245, 2007; Turini, M.E. et al., Annu.Rev.Med. 53:35-57, 2002; Rocca, B. et al., Int.Immunopharmacol. 2: 603-630, 2002; Singh, V.P. et al., Pharmacology 72:77-84, 2004).
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 해양진균의 분리 및 확인
Penicillium sp. SF-6013은 2009년 1월에 오호츠크해(N 53°22.626' E 144°24.200')에서 채집한 성게 Brisaster latifrons로부터 분리하였다.
샘플 1g을 막자사발과 막자로 분쇄하여 멸균 해수 10mL과 혼합한 후, 샘플의 일부(0.1 mL)를 해수를 함유하는 PDA(potato dextrose agar) 배지에 도말하고 25℃에서 14일간 배양하였다. 분리된 균주를 여러번 계대배양 후, 최종 순수 배양 균주를 선택하여 -70℃에 보관하였다.
리보솜 RNA(rRNA)염기서열 분석에 기초하여 SF-6013 균주를 확인하였으며, SF-6013의 28S rRNA 유전자(GenBank accession number KF745793)를 사용하여 GeneBank 검색을 한 결과, Penicillium steckii (HM469415), Penicillium chrysogenum (FJ890400) 및 Penicillium paxilli (FJ890408)와 각각 99.63%, 98.64% 및 98.02%의 상동성을 나타냈다. 따라서, 해양진균 유래의 SF-6013은 Penicillium sp.의 하나인 것을 확인할 수 있었으나, 명확한 종은 확인되지 않았다. Penicillium sp. SF-6013은 한국생물자원센터에 균주를 기탁하였다(기탁번호: KCTC 12811BP).
실시예 2: 탄자와익산 유도체의 분리
해양 진균 Penicillium sp. SF-6013을 3%(w/v) NaCl이 포함된 PDA 배지에서 25℃로 10일간 배양한 후, 배지를 에틸아세테이트로 추출하여 추출물을 진공 농축하였다. 대사산물 탄자와익산 유도체 1-5(도 1)를 수득하기 위해, 에틸아세테이트 추출물을 역상 C18, 실리카 겔 분취 TLC 및 반분취 HPLC 등의 여러 단계 크로마토그래피를 실시하였다. 구체적으로 살펴보면, 메틸케톤 2L와 SF-6013을 배양한 배지의 혼합물로부터 유기상을 추출하여 진공농축으로 510mg의 건조 추출물을 수득한 후, C18 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(5 x 26cm)를 수행하여 20, 40, 60, 80 및 100%(v/v)의 메탄올(각각 500ml)로 단계적으로 용출시켜서 분획 6013-1-6을 분리하였다. 분획중 49mg의 6013-4를 RP C18 HPLC를 이용하여 20-100%(v/v)의 메탄올로 50분간 용출시켜, 하위 8개의 분획 6013-4-1-8을 분리하였다. 6.0mg의 하위분획 6013-4-5을 n-헥산-에틸아세테이트(1:6)를 사용하여 분취 TLC로 화합물 1(2.0mg) 및 화합물 3(1.0mg)을 수득하였으며, 3.3mg의 하위분획 6013-4-6을 n-헥산-에틸아세테이트(2:3)를 사용하여 분취 TLC로 화합물 4(1.0 mg)를 수득하였다. 분획중 110mg의 6013-5를 Sephadex LH-20 컬럼을 이용하여 CH2Cl2/MeOH (20:1)로 용출시켜, 하위 5개의 분획 6013-5-1-5을 분리하였다. 9.5mg의 하위분획 6013-5-4을 0.1% 포믹산이 포함된 80-100%(v/v) 메탄올로 60분 동안 농도구배를 주고 반분취 HPLC를 이용하여 화합물 2(1.5mg, t R =24.7분) 및 화합물 5(2.0mg, t R =26.3분)를 수득하였다.
실시예 3: 탄자와익산 유도체의 구조결정
실시예 2에서 분리한 대사산물 화합물의 NMR, MS 및 광회전분산 결과를 비교한 결과, 화합물 2, 3 및 5는 각각 알려진 탄자와익산 유도체 A, D 및 B인 것으로 확인되었다(Kuramoto et al., Lett. 26:885, 1997).
3-1: 화합물 1의 구조결정
화합물 1은 무색의 점성 오일로 분리되었으며, NMR 및 HRESIMS 분석에 의해 m/z 285.1481 [M-H]-에서 가분자(pseudomolecular) 이온 피크가 관찰되어 분자식은 C18H22O3로 확인되었다. 화합물 1은 2E,4Z-탄자와익산 D로 표 1에 나타낸 바와 같이, [α]D23 +100.8 (c = 0.25, MeOH); HR-ESIQTOFMS (negative mode): m/z 285.1481 [M-H]- (calcd. for C18H22O3, 285.1491); 1H (CD3OD, 600 MHz) 및 13C NMR data (CD3OD,150 MHz)로 표시된다.
더욱 자세히 살펴보면, 1H NMR 스펙트럼(298K, CD3OD)는 2개의 지방족 이중결합 [δH 6.00 (d, J = 15.2 Hz, H-2), 6.80 (br, H-3), 6.40 (br, H-4), 6.71 (d, J = 11.2 Hz, H-5)], 2개의 방향족 양성자 [δH 6.89 (d, J = 7.6 Hz, H-13) and 6.95 (d, J = 7.6 Hz, H-14)], 3개의 메틸그룹 [δH 2.13 (s, H3-16), 1.11 (br, H3-17), 1.33 (s, H3-18)]에 대한 신호 및 지방족 양성자[δH 3.15 (br, H-8), 2.07 (m, H-9a), 1.61 (dd, J = 5.2, 14.4 Hz, H-9b), 2.84 (d, J = 15.6 Hz, H-11a), 및 2.67 (d, J = 15.6 Hz, H-11b)]에 대한 신호를 보여준다(표 1).
Figure 112015050257582-pat00012
화합물 1의 298K, CD3OD에서 획득한 1H NMR 스펙트럼의 신호가 저조하여 253K, CD3OD에서 1H NMR 스펙트럼을 조사한 결과, 1.0:0.8 비율의 선명한 공명 쌍으로 나뉜 신호가 표시 되었다(표 1 및 도 2). 또한, 13C NMR 및 DEPT스펙트럼(253K)은 2세트의 카보닐 탄소, 10개의 sp2 탄소, 4개의 sp3 탄소(2개의 메틸렌, 1개의 메틴 및 1개의 산소화된 4차 탄소) 및 3개의 메틸 그룹을 포함하는 36개의 탄소 신호를 나타낸다(표 1). 이러한 결과는 화합물 1이 298K의 NMR 시간 규모에서 중간의 구조변화율을 나타내는 반면, 구조적 평형은 253K의 낮은 온도에서 느린 변화체제로 전환된다는 것을 보여준다. DMSO-δ6 293K에서 넓은 범프의 1H NMR 스펙트럼이 DMSO-δ6 328K의 높은 온도에서 선명한 시그널로 전화되는 것이 관찰되어, 분자가 빠른 교환체제에 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, 253K CD3OD에서 획득한 1D 및 2D NMR 결과의 분석으로 화합물 1의 구조를 결정하였다. 2개의 형태이성질체에 대한 NMR 결과로 각각은 개별적인 것으로 간주되며, 두 이성질체의 양성자 및 탄소에 대한 COSY 및 HMBC의 상관관계는 동일한 것으로 관찰되었다(도 3).
서로 ortho-결합(J = 7.8 Hz)된 방향족 양성자의 신호 및 이러한 양성자에서 방향족 탄소로의 HMBC 연관의 관찰 신호로 인해 1,2,3,4-삼 치환 벤젠 잔기의 존재한다는 것을 분명히 알 수 있다. H-16에서 C-6, C-14, C-15로 및 H-14에서 C-16으로의 HMBC 상관관계를 기반으로, 아릴메틸 C-16은 C-15에 위치한다. 1H NMR 스펙트럼은 2세트의 2개의 이중결합의 존재를 보여주며[이성질체 A (major): δH 5.95 (d, 15.6 Hz, H-2), 6.76 (dd, J = 10.8, 15.6 Hz, H-3), 6.37 (t, J = 10.8 Hz, H-4) 및 6.71 (d, 10.8 Hz, H-5); 이성질체 B (minor): δH 5.99 (d, 15.6 Hz, H-2), 6.86 (dd, J = 10.8 Hz, 15.6, H-3), 6.47 (t, J = 10.8 Hz, H-4) 및 6.71 (d, J = 10.8 Hz, H-5)](표 1), C2-C3 및 C4-C5 사이 이중결합의 J값은 15.6Hz 및 10.8Hz인 형태이성질체로 두 이성질체의 이중결합의 구성은 2E 및 4Z로 정해졌다.
벤젠고리의 C6에 2세트의 펜타-2,4-디엔산 곁사슬(C1-C5)이 존재한다는 것은 H-2/H-3, H-3/H-4 및 H-4/H-5 사이의 COSY 상관관계와 H-2, H-3에서 C-1으로 및 H-5에서 C-6, C-7, C-15로의 HMBC 상관관계에 의해 지지된다(도 3). 2세트의 CH3(17)-CH(8)-CH2(9) 단편의 존재는 H3-17/H-8와 H-8/H2-9 사이의 COSY 상관관계에 의해 밝혀졌다. 이 단편은 H3-18에서 C-9, C-10 및 C-11로의 HMBC 상관관계를 기반으로 하여 C17-C8-C9-C10(C18)-C11 단위로 추가 확장되었다. H2-11에서 C-7, C-12, C-13으로, H3-17에서 C-7으로 및 H-13에서 C-7, C-11으로의 HMBC 상관관계는 C7C8 및 C11C12의 연결을 표시하는 화합물 1의 테트라하이드로나프탈렌 잔기를 제공한다.
따라서, 화합물 1의 이러한 NMR 결과의 비교 분석으로 화합물 1인 탄자와익산 D6의 평면구조가 결정되었다. 화합물 1의 상대적인 구조는 관련 대사산물의 알려진 구조와 비교하여 NOESY 스펙트럼 분석에 의해 결정되었다(Kuramoto et al., Lett. 26:885, 1997; El-Neketi et al., Nat. Prod. 76;1099, 2013). H3-17/H-11a, H3-17/H-9b, H-11a/H3-18 및 H3-18/H-9b 사이의 NOESY 상관관계는 H3-17과 H3-18이 분자의 같은 면에 위치한다는 것을 알려주며, 결과적으로 화합물 1의 구조는 2E,4Z-탄자와익산 D라는 것을 확인하였다.
화합물 1은 C-4 위치에서 Z 구조를 갖는 유일한 탄자와익산계 대사산물이고, 이러한 구조적 차이가 다른 탄자와익산 유도체들과의 차이점이다. 탄자와익산 D의 295 K에서 획득한 1H NMR 스펙트럼 결과는 C-4에 4E 구조를 제외하고 화합물 1과 거의 동일하다. 상온에서 화합물 1의 형태이성질체 간의 형태교환 중간 범위로 화합물 1의 4Z 구조가 나타난다. 또한, 두 이성질체 간에 C-3 (ΔδC = + 0.9), C-4 (ΔδC = + 1.9), C-7 (ΔδC = + 1.1) 및 C-17 (ΔδC = + 1.0) 위치에서 중요한 탄소 화학적 이동의 차이를 발견하였다. 이러한 결과는 화합물 1의 구조가 C-8의 메틸그룹에 의한 펜타-2E,4Z-디엔산 곁사슬의 부자유회전에 의한 것이다.
3-2: 화합물 4의 구조결정
화합물 4는 무색의 점성 고무질로 분리되었으며, 탄자와익산 E의 염으로 표 2에 나타낸 바와 같이, [α]D23 +74.2 (c = 0.25, MeOH); HR-ESIQTOFMS (negative mode): m/z 289.1786 [M]- (calcd. for C18H25O3, 289.1804); 1H (DMSO-δ6, 400 MHz) 및 13C NMR data (DMSO-δ6,100 MHz)로 표시된다.
더욱 자세히 살펴보면, 1H NMR 스펙트럼은 6개의 올레핀 양성자 [δH 5.67 (d, J = 15.2 Hz, H-2), 6.67 (dd, J = 10.8, 15.2 Hz, H-3), 6.01 (dd, J = 10.8, 15.2 Hz, H-4), 5.86 (dd, J = 10.4, 15.2 Hz, H-5), 5.35 (d, J = 9.6 Hz, H-13), 5.56 (m, H-14)] 및 3개의 메틸그룹 [δH 0.90 (d, J = 6.8 Hz, H3-16), 0.86 (d, J = 6.4 Hz, H3-17), 1.07 (s, H3-18)]에 대한 대한 신호를 보여준다(표 2).
Figure 112015050257582-pat00013
13C NMR 및 DEPT스펙트럼은 1개의 카보닐 탄소, 6개의 sp2 탄소, 8개의 sp3 탄소(2개의 메틸렌, 5개의 메틴 및 1개의 산소화된 4차 탄소) 및 3개의 메틸 그룹을 포함하는 18개의 탄소 신호를 나타낸다(표 2).
1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼의 분석은 화합물 4의 펜타 2,4-디엔산의 존재를 보여주며, H-2/H-3 및 H-4/H-5 사이의 큰 결합상수(15.2 Hz)는 δ2 ,3 및 δ4 ,5의 이중결합을 위한 트랜스 구조를 나타낸다. 펜타 2,4-디엔산은 H-5 및 H-6 사이의 COSY 상관관계를 기반으로 C-6에 위치하며, HMQC, COSY 및 HMBC의 상세한 상관관계 분석에 의해 하위구조 C6C15의 위치를 결정하였다.
화합물 4은 1H 및 13C NMR 비교 결과, 곁사슬의 이동차이를 제외하고는 구조가 Penicillium steckii로부터 분리된 12개의 자유 카르복실산을 가지는 탄자와익산 E와 유사한 것을 밝혔다. 두 화합물 모두 C-2 및 C-4에 2개 올레핀 구조의 트랜스이지만, 각각 곁사슬의 1H 및 13C NMR 결과는 매우 다르므로 [화합물 4: δC 170.6 (C-1), δH 5.67/δC 132.0 (C-2), δH 6.67/δC 135.7 (C-3), δH 6.01/δC 127.7 (C-4) 및 δH 5.86/δC 141.9 (C-5) vs 탄자와익산 E: δC 167.8 (C-1), δH 5.80/δC 119.9 (C-2), δH 7.22/δC 144.8 (C-3), δH 6.22/dC 126.4 (C-4) 및 δH 6.34/dC 150.0 (C-5)], 화합물 4는 카르복실산 염으로 수득된다(표 2).
비록, 화합물 4의 ESIMS 결과로 양이온 수를 확인하지는 못했지만, 0.1N HCl 처리에 의해 화합물 4를 자유 카르복실산 형태(4a)로 전환시킴에 따라 카르복시산염 이온의 존재를 확인하였다. 화합물 4를 산성화시키기 위해. 1mg의 화합물 4를 0.1N HCl 수용액 5ml에 용해시켜 50℃에서 30분간 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 분주하여, 에틸아세테이트 층을 진공농축시켜 0.7mg의 화합물 4a를 수득하였다. 이후, 1H (DMSO-δ6, 400 MHz) 및 13C NMR data (DMSO-δ6,100 MHz)로 분석하여, 탄자와익산 E와 일치하는 것을 확인하였다(Malmstrom et al., Phytochemistry 54:301, 2000). 즉, 화합물 4와 4a의 유사한 특정 광회전분산 값은 [화합물 4: [α]D23 +74.2° (c = 0.12, MeOH); 화합물 4a: [α]D23 +51.8°(c = 0.06, MeOH)]이며, 화합물 4와 탄자와익산 E는 동일한 절대 구조를 공유하는 것을 알 수 있다(Malmstrom et al., Phytochemistry 54:301, 2000). 따라서, 화합물 4는 탄자와익산 E의 염으로 확인되었다.
실시예 4: 탄자와익산 유도체의 함염증 효과
4-1: 탄자와익산 유도체의 NO 생성 억제
LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포는 염증성 매개물질 방출하고, 일반적으로 대식세포 활성화 연구에 사용된다. 미세아교 BV2 세포 및 불멸화된 미세아교세포주도 신경염증 반응 연구의 모델로 사용된다. 따라서, LPS로 유도된 RAW264.7 세포 및 BV2 세포의 NO 생성에 대한 분리된 화합물의 저해 효과를 확인하였다.
그 결과, 분리된 화합물 중 RAW264.7 세포에서는 화합물 2가 27.0μM의 IC50값을 나타내어, 중간 정도의 NO 생성 억제효과를 보였다. 반면, BV2 세포에서는 화합물 1,2 및 5가 각각 38.8μM, 7.1μM 및 42. 5μM의 IC50값을 나타냈다.
따라서, 이후 실시예에서는 LPS로 유도된 RAW264.7 세포 및 BV2 세포에서 iNOS 및 COX-2 발현억제에 대한 화합물 2의 효과를 측정하였다.
4-2: 탄자와익산 유도체의 iNOS 및 COX-2 억제
2μM LPS로 유도된 RAW264.7 세포 및 BV2 세포에 화합물 2를 처리한 후, iNOS 및 COX-2의 발현을 웨스턴블롯으로 확인하였다.
그 결과, 화합물 2의 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 4). 대조군으로는 β-엑틴의 발현을 확인하였다.
또한, LPS로 유도된 RAW264.7 세포 및 BV2 세포에서 PGE2 생산에 대한 화합물 2의 IC50값은 각각 17.5μM 및 15.7μM로, PGE2 생산에도 상당한 억제 효과를 나타냈다. 또한, 화합물 2의 IL-1β 생산 억제는 BV2 세포에서 IC50값 21.9μM로 측정되었다.
이러한 결과는 화합물 2의 소염제로서의 효과를 나타낸다.
실시예 5: 탄자와익산 유도체의 PTP1B 억제 효과
PTP1B(protein tyrosine phosphatase 1B)는 인슐린 및 렙틴 신호 캐스케이드의 주요 음성 조절자이므로, PTP1B는 인슐린 저항성, 당뇨 및 비만 치료를 위한 약물개발의 타겟이다(Liu et al., Curr . Opin . Invest. Drugs 3:1608, 2002).
탄자와익산 유도체들의 PTP1B 활성억제 효과를 측정한 결과, 화합물 2 및 5가 IC50값 8.2μM의 PTP1B 억제 효과를 나타냈다. 반면, 화합물 1 및 3은 IC50값 30μM 수준에서 27.3% 및 24.1%의 억제효과를 나타냈으며, 화합물 4a는 동일한 수준에서 활성이 없었다.
이러한 유사한 구조의 화합물들이 상이한 PTP1B 활성억제 효과를 나타내는 것은, 탄자와익산 유도체 C-10의 하이드록시기가 PTP1B 활성억제 효과를 감소시키는 주요 구조적 특징이 될 수 있다.
탄자와익산 A-D는 1997년에 Penicillium citrinum으로부터 처음 분리되었으며(Kuramoto et al., Chem . Lett . 26:885-6, 1997), 다른 Penicillium citrinum으로부터 12개의 유도체가 확인되었다(El-Neketi et al., Nat. Prod. 76:1099, 2013; Malmstrom et al., Phytochemistry 54:301, 2000; Sandjo et al., J. Org . Chem . 10:251, 2014). 이러한 탄자와익산 유도체 중, 탄자와익산 D, E, G는 C-10 위치에 하이드록시기가 존재하며, 다른 탄자와익산 유도체들은 C-10 및 C-14 위치에 카르복시기, 옥시메틸렌 및 메틸기 등의 다른 작용기가 존재한다. 따라서, 여러 탄자와익산 유도체에 대한 PTP1B 활성 분석을 통해 대사산물의 구조와 그 활성간의 관계를 규명할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12811BP 20150512

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